JPS63240787A - ウシホスホリパ−ゼａ↓２を暗号化するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 聚匪Δ艷沃 ボスホリバーセＡｆｆｉ（ＥＣ３，１，１，４Ｘ以下Ｐ
Ｌ　Ａ　ｘと略す）は、Ｉ、２−ジアシルグリセロリン
脂質のＣ−２位の脂肪酸エステルを特異的に加水分解し
、リゾグリセロリン脂質と脂肪酸とを生成する酵素であ
る。本酵素は動物の膵臓や、ヘビ毒、ハチ毒などの毒液
中に細胞外酵素として比較的多ｆｆｋニ存在するほか、
おもに細胞内酵素として、高等動物から微生物に至るま
で生物界に広く存在している。

ＰＬＡ、はその酵素反応の特異性を利用したＣ−２位脂
肪酸エステルを脱アシル化したリン脂質の調製や、研究
用の試薬として利用されている［小林；　蛋白質核酸酵
素３１５）１６６１〜Ｉ６６７（１９８６）］。

ウシＰＬＡｘを初めとして、各種ＰＬ、Ａｔのアミノ酸
配列は公知である［Ｓ　ｌｏｔｂｏｏｍら、ホスホリビ
ッド（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）Ｈａｗｔｈｏｒｎ
ｅら１，３５９−４３　４　、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　　Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｐｒｅｓｓ（１９８２）コ。

また、イヌおよびラットＰ　Ｌ　Ａ　ｔを暗号化するＤ
Ｎ　Ａ　［Ｏｈａｒａら、ジャーナル・才ブ・バイオケ
ミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｆｏｃｈｅｍ、）￥Ｌ７°３
３−７３９（１９８６）］、ブタおよびヒトｐＬＡｔを
暗号化するＤ　Ｎ　Ａ　［Ｓ　ｅｌｈａｍｅｒら、ＤＮ
Ａ　　５　５１９−５２７（１９８６）］は知られてい
る。しかしながら、ウシＰＬＡＩＧ暗号化するＤＮＡに
ついては知られていなかった。

ウシＰＬＡ！は、公知の方法［Ｄｕｔｉｌｈら、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５３　９１−９７（１９７
５）］に従い、ウシ膵臓より脂肪分を除いた後ホモジナ
イズし、これを熱処理、脱脂肪、硫安分画して得た粗酵
素液を、さらにＣＭ−カラムクロマトグラフィー、ＤＥ
八八−カラムクロマトグラフィーにかけることにより、
純粋な標品として得ることができる。しかし、ウシＰ　
Ｌ　Ａ　ｔを暗号化するＤＮＡを取得し、これに遺伝子
操作技術を適用すれば、該酵素を多量に生産し、より容
易に純粋な標品を得ることができると期待される。

発明の目的 本発明者らは、ウシの臓器、特に膵臓からポリＡ“ＲＮ
Ａを分取し、得られたＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作製し
、これをプラスミドに組み込み、このプラスミドにより
大腸菌を形質転換し、形質転換菌を増殖させてＤＮＡを
単離し、その塩基配列を決定することにより、ウシＰＬ
Ａｚを暗号化するＤＮＡを同定することに成功した。即
ち本発明は、以下の式（■）： ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣＡＡＣＧＧＣ
ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧＴＧＣＡＡＧ　　ＡＴＣＣＣＣ
ＡＧＣＡＧＴ　　Ｇ八人　ＣＣＡ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ
ＧＡＴ　ＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴ　ＧＧＣＴＧＣＴＡ
Ｔ　ＴＧＴ　ＧＧＣＣＴＧ　　ＧＧＴ　　ＧＧＡ　　Ｔ
ＣＡ　　ＧＧＧ　　ＡＣＣＣＣＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＴ
　　ＣＡＴＣＴ（１；　　ＧＡＣＡＧＯＴＯＯＴＯＣＧ
ＡＧ　　ＡＧＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣ
ＴＣＣＴＡＣＴＣＡ　　ＴＧＴ　　ＴＣＴ　　ＡＡＣＡ
ＡＴＧＡＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＡΔ
ΔＣＡＡＴ　ＧＣＣ５ｔｌ ＴＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧ　ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧ
　ＧＡＣ＾ΔＧ１１ｇ１八１ ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＧＣ ［塩基配列の下に代表的な制限酵素部位を示したコで示
される、ウシＰＬＡ、を暗号化するＤＮＡ配列を提供す
るものである。

上記のＤＮＡが暗号化するアミノ酸配列は、Ｆｌｅｅｒ
らが報告しているウシＰ　Ｌ　Ａ　ｔのアミノ酸配列［
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｅｕｒ、　Ｊ　、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）　８２　２６
１−２６９．１９７８］と、Ｃ末端から２番目のアミノ
酸残基が相違している。

朕凱ム脱服 ウシＰＬＡ、は不活性型として細胞外に分泌されたあと
、プロセシングを受け、活性のあるＰＬＡ、に変換され
るが、本発明のＤＮＡは、活性のあるＰＬＡ、を暗号化
するものである。本発明のＤＮＡにおいて、その５′末
端に（５′）ＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＣＴＣＧ　
ＡＧＧ　（３’　）の塩基配列を付加したときは不活性
型ウシＰＬＡ！を暗号化するＤＮＡとして用いることが
できる。さらにその５′末端に（５”）　ＡＴＧ　ＡＧ
Ａ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＧＧＣＴ　ＧＣＴ　Ｃ
ＴＧ　ＣＴＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＧＣＧＣＴ　ＧＧＣ（
３’　）の塩基配列を付加したものは、動物細胞などを
用いて本ＤＮＡを発現させるのに好適である。

本発明のＤＮＡは、次のようにして製造することができ
る。

（イ）　ウシ臓器、好ましくは膵臓から常法によりポリ
Ａ”ＲＮＡを分取する。

（ロ）　（イ）で取得したＲＮＡを用いて、例えばＧｕ
ｂｌｅｒの方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）２５　２６３−２
６９（１９８３）］によりｃＤＮＡを作製しプラスミド
に組み込む。

（ハ）（ロ）で得たプラスミドにより大腸菌を形質転換
し、菌を増殖させ、前記配列式で示されるＤＮＡを単離
し、塩基配列を決定する。

ここで得られたＤＮＡを用い、遺伝子操作の手法を利用
して、ウシＰＬＡ、の生産系を構築することができる。

遺伝子操作の手法を用いて物質生産を行うには、大腸菌
、酵母、ま、たは動物細胞を用いた系のいずれを使用し
てもよい［日本生化学全編“遺伝子研究法■”ｐｐ１２
６〜Ｉ、５０、ｐｐ１７０〜２０４、（１９８６月。例
えば大腸菌を宿主としてウシＰ　Ｌ　Ａ　ｔを生産する
には、前記のＤＮＡ配列の前後に翻訳開始と終止の信号
であるＡＴＧ、ＴＡＧコドンをそれぞれ付与し、さらに
その旧に発現のための制御部位、例えばトリプトファン
オペロンのプロモーターとＳＤ配列を付加したＤＮＡ配
列を、ｐＢＲ３２２などのベクターＤＮＡに連結し、大
腸菌に導入すれば良い。酵母や動物細胞を宿主とする場
合にはＡＴＧコドンを含む分泌シグナルをウシＰＬＡ、
を暗号化するＤＮＡの前につけてやれば、培養液中にウ
シＰＬＡ、を回収できる。酵母を宿主とする場合、発現
の制御部位としては、抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子
やグリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子のプロモーターなどが知られており、酵母内での複製
オリジンとしては２μｍプラスミド由来、酵母染色体由
来のものを用いるとよい。動　　　　□物細胞を宿主と
する場合には、発現制御部位として、ＳＶ４０プロモー
ターや、ＨＢウィルス遺伝子のプロモーターなどが知ら
れており、複製開始点としてはＳＶ４０やポリオーマウ
ィルスのものを用いるとよい。本発明のウシＰＬＡ、遺
伝子を暗号化するＤＮＡを利用して上記のように発現系
を構成すれば、ウシＰＬＡ、を大量に生産することがで
きる。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

尖巖剋土 （１）ポリＡ”ＲＮＡの分離 ウシ膵臓の全ＲＮＡは公知の方法（量定：細胞工学又６
’ｌ　６−６２６（１９８３））に準じて分離した。す
なわちと殺場から購入したウシ膵臓１０９に、６Ｍグア
ニジウムチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム、
０．５％サルコシルナトリウム、０．ＩＭβ−メルカプ
トエタノールを含む液５０ｘ（ｌを加え、ホモジナイズ
した。低速遠心分離により不溶物を除いた後、このウシ
膵臓抽出液１５ｍ（ｌを、５．７Ｍ　Ｃ５ＣＱ、０．１
Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，６）を
含む液１５ｚ（７に重層し、５ＲＰ−２８Ａローター（
日立王様）を用いて、２５０００回転、２０℃で２４時
間遠心分離した。得られた沈澱を０　、５　ｘ（ｌの８
Ｍグアニジン塩酸、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ
ジチオスライトールに溶解した後、０．５容のエタノー
ルを加え、沈澱を遠心分離により回収した。さらに沈澱
を２ｘＱのＴＥ、！新液（１０ｍｌｖｆトリスー塩酸（
ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、再度エタ
ノール沈澱を行い遠心分離によりＲＮＡを得た。全ＲＮ
Ａ画分として５Ｒ９のＲＮＡを分離した。次にオリゴｄ
Ｔセルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ社、Ｔｙｐｅ３）を用いるアフィニティークロ
マトグラフィーによりポリＡ′″ＲＮＡを分離した。１
０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＩ−１７，５）、ＩｍＭＥＤＴ
Ａ、０．５Ｍ　ＮａＣρを含む緩衝液で平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラム（ベッド容積０．５１のに、同
じ緩衝液に溶解した全ＲＮＡを供給し、カラムを洗浄し
た後、ＴＥＩ衝液を用いて、ポリＡ”ＲＮＡを回収した
。

得られたポリ八〇ＲＮＡは２４μ９であった。

（２）ＣＤＮＡライブラリーの作製 （１）で得られたポリＡ”ＲＮＡ５μ２を材料に、市販
のｃＤＮＡ合成キット（アマジャムシ千パン社）を用い
てｃＤＮＡを合成した。

得られたｃＤＮＡ約０．８４μ９を、０．１Ｍカコジル
酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．２ｍＭ　ＤＴＴ。

２ｍＭ　Ｃｏ（Ｊ！ｔ、０．１ｍＭ　ｄＣＴＰを含む溶
液２００μｅにとかし、４０単位のターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ファルマシア社）
を加え、３０℃で５分間反応させた。反応液１００μｇ
をとり、フェノール抽出およびエーテル処理した後、ｒ
ｄＧ　ｔａｉｌｅｄ　ｐＢ　Ｒ３２２Ｊ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
で市販）３μ２を加え、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収した。

得られたＤＮＡを、ＩＯｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７。

４）、１００ｍＭ　ＮａＣ１０，２５ｍＭ　ＥＤＴＡを
含む溶液４００μｅに溶解し、６５℃で５分間加熱した
後、湯浴につけたまま一夜放置し、アニーリングを行っ
た。

次に、このＤＮＡを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２か
ら誘導されたＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６，Ｉ　［Ｃａ５
ａｄａｂａｎら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂ　ｉｏｌ、）　Ｉ　：ロ
ー１７９−２０７（１９８０）］を常法に従い形質転換
した。（量定、細胞工学２　６１６−６２６（１９８３
））。テトラサイクリン３μ９／村を含むＬＢ寒天培地
（バクトドリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ
Ｑｏ、５％（ｐＨ７、１）、寒天１．５％）で増殖する
形質転換株を約３万株得た。

（３）ウシＰＬＡ！を暗号化するＤＮＡの調製（２）で
得られた形質転換株を同じ寒天培地にレプリカし、３７
℃で５時間保温後、ワットマン５４１フイルターに増殖
したコロニーを移し取った。

次にこのフィルターをクロラムフェニコール２００μ９
／１１（ｌを含むり、Ｂ寒天培地上にのせ、３７℃で一
夜保温し、翌日そのフィルターを用い常法に従って、コ
ロニーハイブリダイゼーションを行った［Ｇｅｒｇｅｎ
ら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｆ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）７　２　１　１　５〜
２　１　３　６（夏９７９）コ。プローブとしては、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて常法に従い５′末
端をラベル化した［Ｍａｎｉａｔｆｓら、モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ
）ｐｉ　２２、Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ−Ｉａｒｂ
ａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）コＤＮＡオリ
ゴマー： （５’　）ＴＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＴＴＣ
ＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＴＴＡＧ（３
’　） を用いた。ＤＮＡオリゴマー合成はホスホアミダイド法
で行った。コロニーハイブリダイゼーションは、６ＸＳ
ＳＣ（ＩＸｓｓｃ：　　０．１５Ｍ　Ｎａ０１１５ｍＭ
　クエン酸ナトリウム（ｐｌ（７，０）、０゜１％ドデ
シル硫酸ナトリウム、　Ｉ　ｘ　Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ’
　ｓ（モレキュラー・クローニング、ｐ３２７）、２５
μｇ／１１ａのオートクレーブしたサケＤＮＡに、前記
のプローブを３　、８　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ／ｉｉ２と
なるように加え、４０℃、−夜保温することにより行っ
た。その後５０℃で２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを含む
溶液、および２ＸＳＳＣの溶液を用いて、フィルターを
洗った後、室温でフィルターを乾燥させ、オートラジオ
グラフィーを行った。得られた陽性クローンについて、
再度、先に示したＤＮＡオリゴマーおよび （５’　）ＣＧＴＴＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＧ
ＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＴＴ（３
’　） のＤＮＡオリゴマーをプローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーションを行い、８株の陽性クローンを得た。得
られたクローンのうち代表２株について、プラスミドＤ
ＮＡを単離、精製し、制限酵素切断点を確認した。これ
らのプラスミドは挿入断片にＰｓｔｌ、ＸｈｏＩ、Ｐｖ
ｕＩｌ、５ｔｕＩ、Ｈｉｎｆｌ、５ａｕ３Ａ１などの切
断点を有し、同一の構造を持っていた。次にこれらの制
限酵素部位を利用し、Ｍ夏３−ジデオキシ法［Ｓａｎｇ
ｅｒら、プロナス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７４５４６３〜５４６
７（１９７７月により塩基配列を決定し、前記式（１）
に示すウシＰＬＡ、を暗号化するＤＮＡを得た。

このＤＮＡを含むｃＤＮＡ断片を有するプラスミドＤＮ
ＡをｐＢＰＬＡ、−１８，３と命名した。

更に、このプラスミドをＥ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１０６１
に導入し、形質転換株Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１０６１（
ｐＢＰＬＡ、−１８，３）を得た。この菌株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−９２
９８で寄託されている（寄託日：昭和６２年３月１９日
）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の式： 【遺伝子配列があります】 で示される、ウシホスホリパーゼＡ＿２を暗号化するＤ
   ＮＡ。