ES2714673T3 - Hidrolasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para hacerlas y usarlas - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende (a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y que tiene uno o más cambios de nucleótidos que codifican un cambio de aminoácido D61A o D61E, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de la palmitasa, (b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimáticamente activos, y que tiene al menos un cambio de aminoácido D61A o D61E, (c) el ácido nucleico de (a) o (b) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, que comprende actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia señal, (d) el ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa que además comprende una secuencia heteróloga, (e) el ácido nucleico de (d), en donde la secuencia heteróloga comprende, o consiste en una secuencia que codifica: (A) una secuencia señal heteróloga, (B) la secuencia de (A), en donde la secuencia señal heteróloga deriva de una enzima heteróloga, o, (C) un marcador, un epítopo, un péptido de direccionamiento, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima, o (f) una secuencia de ácido nucleico totalmente complementaria a la secuencia de cualquiera de (a) a (e).

Description

DESCRIPCION
Hidrolasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para hacerlas y usarlas
Referencia a la lista de secuencias enviada por EFS-WEB
La lista de secuencias se identifica en el archivo de texto archivado electronicamente de la siguiente manera:
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Campo de la invencion
Se proporcionan en la presente memoria polipeptidos que tienen actividad de hidrolasa, que incluyen actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, polinucleotidos que los codifican y metodos para hacer y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. Tambien se proporcionan en la presente memoria peptidos y polipeptidos, p. ej., enzimas que tienen una actividad de hidrolasa, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, y metodos para el tratamiento de grasas y aceites con dichos peptidos y polipeptidos para preparar productos de aceite hidrolizado tales como aceites animales o vegetales con bajo contenido saturado, p. ej., aceites de soja o canola, los productos de aceite asf tratados, y los productos que comprenden dichos aceites tratados.
Antecedentes
Las principales aplicaciones industriales para hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, incluyen la industria de alimentos y bebidas, como agentes antienranciamiento para productos de panadena, y en la produccion de margarina y otros productos para untar con sabores naturales de mantequilla; en sistemas de residuos; y en la industria farmaceutica donde se usan como ayudantes de la digestion.
Los aceites y grasas procesados son un componente importante de alimentos, aditivos alimentarios y auxiliares de procesamiento de alimentos, y tambien son importantes materias primas renovables para la industria qmmica. Estan disponibles en grandes cantidades a partir del procesamiento de semillas oleaginosas de plantas como el salvado de arroz, mafz, colza, canola, girasol, oliva, palma o soja. Otras fuentes de aceites y grasas valiosas incluyen el pescado, residuos de restaurantes y grasas animales fundidas. Estas grasas y aceites son una mezcla de triacilgliceridos o lfpidos, es decir, acidos grasos (FA) esterificados en una estructura de glicerol. Cada aceite o grasa contiene una amplia variedad de estructuras lipfdicas diferentes, definidas por el contenido de FA y su distribucion regioqmmica en la cadena principal de glicerol. Estas propiedades de los lfpidos individuales determinan las propiedades ffsicas del triacilglicerido puro. Por lo tanto, el contenido de triacilgliceridos de una grasa o aceite determina en gran medida las propiedades ffsicas, qmmicas y biologicas del aceite. El valor de los lfpidos aumenta enormemente en funcion de su pureza. La pureza alta se puede lograr mediante cromatograffa fraccionada o destilacion, separando el triacilglicerido deseado del entorno mixto de la fuente de grasa o aceite. Sin embargo, esto es costoso y los rendimientos a menudo estan limitados por los niveles bajos en los cuales se encuentra el triacilglicerido de forma natural. Ademas, la facilidad de purificacion del producto a menudo se ve comprometida por la presencia de muchos triacilgliceridos estructural y ffsica o qmmicamente similares en el aceite.
Una alternativa a la purificacion de triacilgliceridos u otros lfpidos de una fuente natural es sintetizar los lfpidos. Los productos de dichos procedimientos se denominan lfpidos estructurados porque contienen un conjunto definido de acidos grasos distribuidos de manera definida en la cadena principal de glicerol. El valor de los lfpidos tambien aumenta mucho al controlar el contenido y distribucion de acidos grasos dentro del lfpido. La eliminacion de trigliceridos, grasas o aceites de FA indeseables, o la sustitucion de FA con propiedades indeseables por acidos grasos con propiedades qmmicas, ffsicas o biologicas mejores o mas deseables, aumenta el valor de los lfpidos. En particular, existe la necesidad de lipasas que puedan hidrolizar, p. ej., hidrolizar selectivamente, un acido graso saturado (una "saturasa"), o los que en particular, puedan hidrolizar, p. ej., hidrolizar selectivamente, un acido palmftico (una "palmitasa") o un acido estearico (una "estearatasa") de la cadena principal de glicerol. Las lipasas, tales como las saturasas, p. ej., palmitasas y/o estearatasas, se pueden usar para efectuar dicho control cuando los FA que se eliminan, anaden o sustituyen son acidos grasos saturados, p. ej., acido palmitatico o acido estearico. Resumen
Se proporcionan en la presente memoria polipeptidos que tienen actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de lipasa. Se proporcionan tambien en la presente memoria nuevas clases de lipasas denominadas "saturasas", "palmitasas" y "estearatasas". Tambien se proporcionan polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad de saturasa, p. ej., palmitasa y/o estearatasa, y metodos para hacer y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. Se proporcionan en la presente memoria polipeptidos, p. ej., enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa que tienen actividad enzimatica (catalftica) termoestable y/o termotolerante. Las actividades enzimaticas de los polipeptidos y peptidos proporcionados en la presente memoria incluyen (comprenden o consisten en) una actividad de saturasa o una actividad de lipasa, que incluye la hidrolisis de lfpidos, reacciones de acidolisis (p. ej., para sustituir un acido graso esterificado por un acido graso libre), reacciones de transesterificacion (p. ej., intercambio de acidos grasos entre triacilgliceridos), smtesis de ester, reacciones de intercambio de ester y actividad de acil hidrolasa lipfdica (LAH). Los polipeptidos proporcionados en la presente memoria se pueden usar para sintetizar productos quirales enantiomericamente puros.
Los polipeptidos proporcionados en la presente memoria se pueden usar en una variedad de contextos farmaceuticos, agncolas e industriales, que incluyen la fabricacion de cosmeticos y nutraceuticos. Ademas, los polipeptidos proporcionados en la presente memoria se pueden usar en el procesamiento de alimentos, elaboracion de cerveza, aditivos para banos, produccion de alcohol, smtesis de peptidos, enantioselectividad, preparacion de pieles en la industria del cuero, gestion de residuos y degradacion de residuos animales, recuperació dne plata en la industria fotografica, tratamiento medico, desgomado de la seda, degradacion de biopelmulas, conversion de biomasa en etanol, biodefensa, agentes antimicrobianos y desinfectantes, productos para el cuidado personal y cosmeticos, reactivos biotecnologicos, para aumentar el rendimiento de almidon de la molienda humeda de mafz, y como productos farmaceuticos como ayudantes de la digestion y agentes antiinflamatorios (antiflogfsticos).
En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria composiciones (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) y metodos para producir aceites con bajo contenido de saturados, p. ej., aceites con un menor contenido de acidos grasos saturados, que incluyen aceites con bajo contenido en acidos grasos de palmitato, estearato, miristato, laurato o butirato y/o acido capnlico (acido octanoico). Cualquier aceite vegetal, p. ej., aceite de canola, aceite de soja o aceite o grasa animal, p. ej., sebo, se puede tratar con una composicion, o por un metodo, como se proporciona en la presente memoria. Cualquier alimento, artmulos comestibles, o productos horneados, fritos o cocidos (p. ej., salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, aceites para hornear, mayonesa, aceites de cocina, aceites para ensaladas, aderezos para servir con cuchara y vertibles y similares, y productos hechos con los mismos) puede comprender un aceite vegetal o grasa animal que se ha tratado con una composicion o por un metodo proporcionado en la presente memoria. Los aceites vegetales modificados para ser aceites con menor contenido de saturados se pueden usar en cualquier alimento, artmulo comestible o producto horneado o cocinado, p. ej., salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, aceites para hornear, mayonesa, aceites de cocina, aceites para ensaladas, aderezos para servir con cuchara y vertibles y similares. En una realizacion, se proporcionan en la presente memoria aceites, tales como aceites vegetales, p. ej., aceite de canola o aceite de soja, y alimentos o productos horneados o cocinados, que incluyen salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, mayonesa, aceites para hornear, aceites de cocina, aceites para frem, aceites para ensaladas, aderezos para servir con cuchara y vertibles y similares, en donde el aceite o alimento, producto horneado o cocinado se ha modificado usando una enzima como se proporciona en la presente memoria. Estos aceites vegetales, p. ej., aceite de canola, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de avellana, aceite de canamo, aceite de linaza, aceite de semilla de Limnanthes, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cartamo, aceite de sasanqua, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de resina, aceite de tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (aceite de canola alto oleico, aceite de soja bajo linoleico o aceites de girasol alto estearico), grasas animales (sebo, manteca de cerdo, grasa de mantequilla y grasa de pollo), aceites de pescado (aceite de eulachon, aceite de tngado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque y aceite de lacha), o mezclas de cualquiera de los anteriores, y alimentos o productos horneados, fritos o cocinados, comprenden aceites con un contenido menor de acido graso saturado, incluyendo aceites bajos en acido palmttico, acido minstico, acido laurico, acido estearico, acido capnlico (acido octanoico) etc., procesados usando una composicion o metodos proporcionados en la presente memoria.
Se proporcionan en la presente memoria polipeptidos, por ejemplo, enzimas y anticuerpos cataltticos, que tienen una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, que incluyen actividades enzimaticas termoestables y termotolerantes, y actividades espedficas de acidos grasos y selectivas de acidos grasos y actividades enzimaticas tolerantes a pH bajo o alto, y polinucleotidos que codifican estos polipeptidos, incluyendo vectores, celulas hospedantes, plantas transgenicas y animales no humanos, y metodos para hacer y usar estos polinucleotidos y polipeptidos.
En un aspecto, se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos recombinantes, sinteticos o aislados que comprenden
(a) un acido nucleico (polinucleotido) que codifica al menos un polipeptido, en donde el acido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia o completa (100%), con la SEQ ID NO: 1, y que tiene uno o mas cambios de nucleotidos (o su equivalente) que codifica un cambio de aminoacido (o su equivalente) D61A o D61E, en donde el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de la palmitasa,
(b) un acido nucleico (polinucleotido) que codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende una actividad de palmitasa, en donde el polipeptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimaticamente activos, y que tiene al menos un cambio de aminoacido D61A o D61E,
(c) el acido nucleico (polinucleotido) de cualquiera de (a) o (b) que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa, que comprende una actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia senal,
(d) el acido nucleico (polinucleotido) de cualquiera de (a) a (c) que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende una actividad de palmitasa que ademas comprende una secuencia heterologa,
(e) el acido nucleico (polinucleotido) de (d), en donde la secuencia heterologa comprende, o consiste en una secuencia que codifica: (A) una secuencia senal heterologa, (B) la secuencia de (A), en donde la secuencia senal heterologa deriva de una enzima heterologa, o, (C) un marcador, un epftopo, un peptido dirigido, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima, o
(f) una secuencia de acido nucleico (polinucleotido) totalmente (completamente) complementaria a la secuencia de cualquiera de (a) a (e).
El acido nucleico aislado, sintetico o recombinante codifica un polipeptido o peptido que tiene una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, que es termoestable. Los polipeptidos y peptidos codificados por acidos nucleicos proporcionados en la presente memoria, o cualquier polipeptido o peptido proporcionado en la presente memoria, pueden retener actividad enzimatica o de union (p. ej., union a sustrato) en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura entre aproximadamente -100°C a aproximadamente -80°C, de aproximadamente -80°C a aproximadamente -40°C, de aproximadamente -40°C a aproximadamente -20°C, de aproximadamente -20°C a aproximadamente 0°C, de aproximadamente 0°C a aproximadamente 5°C, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 45°C, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 70°C, de aproximadamente 70°C a aproximadamente 75°C, de aproximadamente 75°C a aproximadamente 85°C, de aproximadamente 85°C a aproximadamente 90°C, de aproximadamente 90°C a aproximadamente 95°C, de aproximadamente 95°C a aproximadamente 100°C, de aproximadamente 100°C a aproximadamente 105°C, 5 aproximadamente 105°C a aproximadamente 110°C, de aproximadamente 110°C a aproximadamente 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o mas. Se proporcionan en la presente memoria polipeptidos termoestables que retienen la actividad de una hidrolasa, p. ej. actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, a una temperatura en los intervalos descritos antes, a aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5,0, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9,0, aproximadamente pH 9,5, aproximadamente pH 10,0, aproximadamente pH 10,5, aproximadamente pH 11,0, aproximadamente pH 11,5, aproximadamente pH 12,0 o mas.
Los polipeptidos proporcionados en la presente memoria pueden ser termotolerantes y pueden retener actividad de hidrolasa, p. ej. actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, despues de exposicion a una temperatura en el intervalo de aproximadamente -100°C a aproximadamente -80°C, de aproximadamente -80°C a aproximadamente -40°C, de aproximadamente -40°C a aproximadamente -20°C, de aproximadamente -20°C a aproximadamente 0°C, de aproximadamente 0°C a aproximadamente 5°C, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 15°C, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 45°C, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 70°C, de aproximadamente 70°C a aproximadamente 75°C, de aproximadamente 75°C a aproximadamente 85°C, de aproximadamente 85°C a aproximadamente 90°C, de aproximadamente 90°C a aproximadamente 95°C, de aproximadamente 95°C a aproximadamente 100°C, de aproximadamente 100°C a aproximadamente 105°C, de aproximadamente 105°C a aproximadamente 110°C, de aproximadamente 110°C a aproximadamente 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o mas.
Los polipeptidos termotolerantes retienen una actividad de hidrolasa, p. ej. actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa,, despues de exposicion a una temperatura en los intervalos descritos antes, a aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5,0, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9,0, aproximadamente pH 9,5, aproximadamente pH 10,0, aproximadamente pH 10,5, aproximadamente pH 11,0, aproximadamente pH 11,5, aproximadamente pH 12,0 o mas.
Los acidos nucleicos aislados, sinteticos o recombinantes comprenden una secuencia que se hibrida en condiciones restrictivas con un acido nucleico proporcionado en la presente memoria, p. ej., un acido nucleico de ejemplo como se proporciona en la presente memoria que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos (modificaciones de secuencia respecto a SEQ ID NO: 1) expuestos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus fragmented o subsecuencias, y sus secuencias (completas) complementarias. En un aspecto, el acido nucleico codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. El acido nucleico puede tener al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas restos de longitud o la longitud completa de un gen o transcrito que comprende la SEQ ID NO: 1, y que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de restos (modificaciones en la secuencia de aminoacidos) respecto a la SEQ ID NO: 1 expuestos en la Tabla 3, Tabla 4 , Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y las secuencias (completas) complementarias de las mismas. En un aspecto, las condiciones restrictivas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65°C durante aproximadamente 15 minutos.
Una sonda de acido nucleico, p. ej., una sonda para identificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa, p. ej. actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende una sonda que comprende o consiste en al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas, bases consecutivas de una secuencia como se proporciona en la presente memoria, o sus fragmentos o subsecuencias, en donde la sonda identifica el acido nucleico por union o hibridacion. La sonda puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente de 10 a 50, aproximadamente de 20 a 60, aproximadamente de 30 a 70, aproximadamente de 40 a 80, o aproximadamente de 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia como se proporciona en la presente memoria, o sus fragmentos o subsecuencias. La sonda puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente de 10 a 50, aproximadamente de 20 a 60, aproximadamente de 30 a 70, aproximadamente de 40 a 80, o aproximadamente de 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, o una de sus subsecuencias.
Una pareja de secuencias de cebadores de amplificacion para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende una pareja de cebadores que comprende o consiste en una pareja de cebadores capaz de amplificar un acido nucleico que comprende una secuencia como se proporciona en la presente memoria, o sus fragmentos o subsecuencias. Uno o cada uno de los miembros de la pareja de secuencias de cebadores de amplificacion puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente de 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia.
Los metodos para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende la amplificacion de un acido nucleico molde con una pareja de secuencias de cebadores de amplificacion capaz de amplificar una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, o sus fragmentos o subsecuencias.
En una realizacion, los casetes de expresion comprenden un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o una subsecuencia del mismo. El casete de expresion puede comprender el acido nucleico que esta operativamente unido a un promotor. El promotor puede ser un promotor vmco, bacteriano, de mairnfero o planta. El promotor de la planta puede ser un promotor de patata, arroz, mafz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. El promotor puede ser un promotor inducible. El promotor puede ser un promotor espedfico de tejido o un promotor regulado por el medio ambiente o un promotor regulado por el desarrollo. Por lo tanto, el promotor puede ser, p. ej., un promotor espedfico de semilla, espedfico de hoja, espedfico de rafz, espedfico de tallo o inducido por la abscision. En un aspecto, el casete de expresion puede comprender ademas un vector de expresion de planta o virus de planta.
En una realizacion, los vehteulos de clonacion comprenden un casete de expresion (p. ej., un vector) como se proporciona en la presente memoria o un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. El vehteulo de clonacion puede ser un vector vmco, un fago, un fagemido, un cosmido, un fosmido, un bacteriofago o un cromosoma artificial. El vector vmco puede comprender un vector adenovirus, un vector retrovirus o un vector vmco adenoasociado. El vehteulo de clonacion puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plasmido, un vector derivado de bacteriofago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de m ai^ero (MAC).
En una realizacion, las celulas transformadas comprenden un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o un casete de expresion (p. ej., un vector) como se proporciona en la presente memoria, o un vehteulo de clonacion como se proporciona en la presente memoria. En una realizacion, la celula transformada puede ser una celula bacteriana, una celula de mai^ero, una celula fungica, una celula de levadura, una celula de insecto o una celula de planta. En una realizacion, la celula de planta puede ser una celula de patata, trigo, arroz, mafz, tabaco o cebada. La celula transformada puede ser cualquiera de las celulas hospedantes familiares para el experto en la tecnica, que incluyen celulas procariotas, celulas eucariotas, tales como celulas bacterianas, celulas fungicas, celulas de levadura, celulas de marnffero, celulas de insecto o celulas de planta. Los ejemplos de celulas bacterianas incluyen cualquier especie dentro de los generos Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas y Staphylococcus, que incluyen, p. ej., Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Las celulas fungicas de ejemplo incluyen cualquier especie de Aspergillus. Las celulas de levadura de ejemplo incluyen cualquier especie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe. Las celulas de insecto de ejemplo incluyen cualquier especie de Spodoptera o Drosophila, incluyendo Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las celulas animales de ejemplo incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier lrnea de celulas de raton o humanas.
En una realizacion, las plantas transgenicas comprenden un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o un casete de expresion (p. ej., un vector) como se proporciona en la presente memoria. La planta transgenica puede ser una planta de mafz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco.
En una realizacion, las semillas transgenicas comprenden un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o un casete de expresion (p. ej., un vector) como se proporciona en la presente memoria. La semilla transgenica puede ser arroz, una semilla de mafz, una semilla de trigo, una semilla oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soja, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de sesamo, una semilla de planta de cacahuete o de tabaco.
En un aspecto, se proporciona en la presente memoria un polipeptido aislado, sintetico o recombinante que comprende una secuencia
(a) que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, o mas identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimaticamente activos, y que tienen al menos un cambio de resto de aminoacido D61A o D61E, en donde el polipeptido tiene una actividad de hidrolasa que comprende la actividad de palmitasa;
(b) el polipeptido de (a), que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia senal;
(c) el polipeptido de (a) o (b) que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa y que comprende ademas una secuencia heterologa;
(d) el polipeptido de (c), en donde la secuencia heterologa comprende, o consiste en (A) una secuencia senal heterologa, (B) la secuencia de (A), en donde la secuencia senal heterologa deriva de una enzima heterologa, y/o, (C) un marcador, un epftopo, un peptido de direccionamiento, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima;
(e) que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por el acido nucleico de la reivindicacion 1;
(f) el polipeptido de cualquiera de (a) a (e), en donde el polipeptido esta glicosilado o comprende al menos un sitio de glicosilacion, en donde opcionalmente la glicosilacion es una glicosilacion unida a N y opcionalmente el polipeptido se glicosila despues de ser expresado en una P. pastoris o una S. pombe; o
(g) el polipeptido de cualquiera de (a) a (f), en donde el polipeptido esta inmovilizado, en donde opcionalmente el polipeptido se inmoviliza en una celula, un metal, una resina, un poftmero, una ceramica, un vidrio, un microelectrodo, una partfcula grafftica, una perla, un gel, una placa, una matriz o un tubo capilar.
En un aspecto, se proporciona en la presente memoria un polipeptido aislado, sintetico o recombinante que comprende una secuencia:
(a) que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, de identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimaticamente activos, y que tienen al menos uno, del cambio de resto de aminoacido D61A o D61E en donde el polipeptido tiene una actividad de hidrolasa que comprende una actividad de palmitasa;
(b) el polipeptido de (a) que tiene una actividad de hidrolasa, que comprende una actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia senal;
(c) el polipeptido de cualquiera de (a) o (b) que tiene una actividad de hidrolasa, que comprende una actividad de palmitasa que comprende ademas una secuencia heterologa;
(d) el polipeptido de (c), donde la secuencia heterologa comprende, o consiste en: (A) una secuencia senal heterologa, (B) la secuencia de (A), donde la secuencia senal heterologa deriva de una enzima heterologa, y/o, (C) un marcador, un epftopo, un peptido de direccionamiento, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima; o
(e) que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por cualquier secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria.
Las secuencias de polipeptido o peptido de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria incluyen la SEQ ID NO: 2 y sus subsecuencias y sus variantes, p. ej., al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o mas restos de longitud, o toda la longitud de una enzima, teniendo todas uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de restos de aminoacidos (modificaciones de la secuencia de aminoacidos respecto a SEQ ID NO: 2) expuestos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23,. Las secuencias de polipeptido o peptido de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria incluyen secuencia codificada por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. Las secuencias de polipeptido o peptido de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria incluyen polipeptidos o peptidos unidos espedficamente por un anticuerpo como se proporciona en la presente memoria. Un polipeptido como se proporciona en la presente memoria tiene al menos una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. La actividad es una actividad regioselectiva y/o quimioselectiva.
En un aspecto, el polipeptido aislado, sintetico o recombinante puede comprender el polipeptido como se proporciona en la presente memoria que carece de una secuencia de senal (peptido), p. ej., carece de su secuencia senal homologa, y en un aspecto, comprende una secuencia senal heterologa (peptido). En un aspecto, el polipeptido aislado, sintetico o recombinante puede comprender el polipeptido como se proporciona en la presente memoria que comprende una secuencia senal heterologa, tal como una secuencia senal de hidrolasa o no hidrolasa heterologa (p. ej., no lipasa, no saturasa o no palmitasa). Las protemas quimericas comprenden un primer dominio que comprende una secuencia senal como se proporciona en la presente memoria y al menos un segundo dominio. La protema puede ser una protema de fusion. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, u otra hidrolasa.
La actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una actividad espedfica a aproximadamente 37°C en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de protema. La actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), comprende una actividad espedfica de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 unidades por miligramo de protema. Alternativamente, la actividad de hidrolasa comprende una actividad espedfica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de protema. La actividad de hidrolasa comprende una actividad espedfica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de protema. La termotolerancia comprende retencion de al menos la mitad de la actividad espedfica de la hidrolasa a 37°C despues de ser calentada a una temperatura elevada. Alternativamente, la termotolerancia puede comprender una retencion de actividad espedfica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de protema despues de ser calentada a una temperatura elevada.
En una realizacion, los polipeptidos aislados, sinteticos o recombinantes como se proporcionan en la presente memoria, comprenden al menos un sitio de glucosilacion. En un caso, la glucosilacion puede ser glucosilacion unida por N. En un aspecto, el polipeptido se puede glucosilar despues de ser expresado en una P. pastoris o una S. pombe, o en plantas, tal como plantas productoras de aceite, p. ej., soja, canola, arroz, girasol, o variantes geneticamente modificadas (OGM) de estas plantas.
El polipeptido puede retener la actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4,0 o inferior. En otro aspecto, el polipeptido puede retener la actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12,0 o mas.
En una realizacion, las preparaciones de protemas comprenden un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, en donde la preparacion de protema comprende un lfquido, un solido o un gel.
Los heterodfmeros como se proporcionan en la presente memoria comprenden un polipeptido y un segundo dominio. En algunos aspectos, el segundo dominio puede ser un polipeptido y el heterodfmero puede ser una protema de fusion. El segundo dominio puede ser un epftopo o un marcador. Los homodfmeros como se proporcionan en la presente memoria comprenden un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Los polipeptidos inmovilizados como se proporcionan en la presente memoria tienen actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en donde el polipeptido comprende un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, o un polipeptido que comprende un polipeptido como se proporciona en la presente memoria y un segundo dominio. En una realizacion, un polipeptido como se proporciona en la presente memoria se puede inmovilizar en una celula, una vesmula, un liposoma, una pelmula, una membrana, un metal, una resina, un polfmero, un material ceramico, un vidrio, un microelectrodo, una partmula grafttica, una perla, un gel, una placa, un cristal, un comprimido, una pfldora, una capsula, un polvo, un aglomerado, una superficie, una estructura porosa, una matriz o un tubo capilar, o materiales tales como granos, cascaras, corteza, piel, cabello, esmalte, hueso, concha y materiales derivados de los mismos. Los polinucleotidos, polipeptidos y enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden formular en una forma solida, tal como un polvo, una preparacion liofilizada, granulos, un comprimido, una barra, un cristal, una capsula, una pfldora, un pelet, o una forma lfquida tal como una solucion acuosa, un aerosol, un gel, una pasta, una suspension, una emulsion acuosa/aceite, una crema, una capsula, o una suspension vesicular o micelar.
En una realizacion, los complementos alimenticios para un animal comprenden un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, p. ej., un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. El polipeptido en el complemento alimenticio se puede glucosilar. Las matrices de suministro de enzimas comestibles comprenden un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, p. ej., un polipeptido codificado por el acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. La matriz de suministro comprende un pelet. El polipeptido se puede glucosilar. La actividad de hidrolasa es termotolerante. La actividad de hidrolasa es termoestable.
Los metodos de aislamiento o identificacion de un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), comprenden las etapas de: (a) proporcionar un anticuerpo como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar una muestra que comprende polipeptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) en condiciones en donde el anticuerpo se puede unir espedficamente al polipeptido, aislando o identificando asf un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa).
Los metodos para hacer un anticuerpo anti-hidrolasa comprenden administrar a un animal no humano un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o un polipeptido como se proporciona en la presente memoria o sus subsecuencias, en una cantidad suficiente para generar una respuesta humoral inmunitaria, haciendo asf un anticuerpo anti-hidrolasa. Se proporcionan en la presente memoria metodos para hacer un anticuerpo anti-hidrolasa que comprende administrar a un animal no humano un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o un polipeptido como se proporciona en la presente memoria o sus subsecuencias, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria.
En una realizacion, los metodos para producir un polipeptido recombinante comprenden las etapas de: (a) proporcionar un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria operativamente unido a un promotor; y (b) expresar el acido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresion del polipeptido, produciendo asf un polipeptido recombinante. En una realizacion, el metodo puede comprender ademas transformar una celula hospedante con el acido nucleico de la etapa (a) seguido de expresion del acido nucleico de la etapa (a), produciendo asf un polipeptido recombinante en una celula transformada.
Se proporcionan metodos para identificar un polipeptido que tiene actividad de una hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido como se proporciona en la presente memoria; o un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un sustrato de hidrolasa; y (c) poner en contacto el polipeptido o uno de sus fragmentos o variantes de la etapa (a) con el sustrato de la etapa (b) y detectar una disminucion de la cantidad de sustrato o un aumento de la cantidad de un producto de reaccion, en donde una disminucion de la cantidad del sustrato o un aumento de la cantidad del producto de reaccion detecta un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa).
Se describen metodos para identificar un sustrato de hidrolasa que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido como se proporciona en la presente memoria; o un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un sustrato de ensayo; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con el sustrato de ensayo de la etapa (b) y detectar una disminucion de la cantidad de sustrato o un aumento de la cantidad de un producto de reaccion, en donde una disminucion de la cantidad del sustrato o un aumento de la cantidad del producto de reaccion identifica el sustrato de ensayo como un sustrato de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa).
Se describen metodos para determinar si un compuesto de ensayo se une espedficamente a un polipeptido, que comprenden las siguientes etapas: (a) expresar un acido nucleico o un vector que comprende el acido nucleico en condiciones permisivas para la traduccion del acido nucleico en un polipeptido, en donde el acido nucleico comprende un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, o proporcionar un polipeptido como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipeptido con el compuesto de ensayo; y (d) determinar si el compuesto de ensayo de la etapa (b) se une espedficamente al polipeptido.
Se describen metodos para identificar un modulador de una actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido como se proporciona en la presente memoria o un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con el compuesto de ensayo de la etapa (b) y medir una actividad de la hidrolasa, en donde un cambio en la actividad de hidrolasa medida en presencia del compuesto de ensayo comparada con la actividad en ausencia del compuesto de ensayo, proporciona una determinacion de que el compuesto de ensayo modula la actividad de hidrolasa. En un aspecto, la actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) se puede medir proporcionando un sustrato de hidrolasa y detectando una disminucion de la cantidad del sustrato o un aumento de la cantidad de un producto de reaccion, o un aumento en la cantidad del sustrato o una disminucion en la cantidad de un producto de reaccion. Una disminucion de la cantidad del sustrato o un aumento de la cantidad de un producto de reaccion con el compuesto de ensayo comparado con la cantidad de sustrato o producto de reaccion sin el compuesto de ensayo, identifica al compuesto de ensayo como un activador de actividad de hidrolasa. Un aumento de la cantidad del sustrato o una disminucion de la cantidad del producto de reaccion con el compuesto de ensayo comparado con la cantidad de sustrato o producto de reaccion sin el compuesto de ensayo, identifica al compuesto como un inhibidor de actividad de hidrolasa.
Se describen sistemas informaticos que comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos ha almacenado en el mismo una secuencia de polipeptido o una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria (p. ej., un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria). El sistema informatico puede comprender ademas un algoritmo de comparacion de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia almacenada en el mismo. El algoritmo de comparacion de secuencias comprende un programa informatico que indica polimorfismos. El sistema informatico puede comprender ademas un identificador que identifica una o mas caractensticas en dicha secuencia. Los medios legibles por ordenador tienen almacenada en los mismos una secuencia de polipeptido o una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria.
Se describen metodos para identificar una caractenstica en una secuencia que comprenden las etapas de: (a) leer la secuencia usando un programa informatico que identifica una o mas caractensticas en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia de polipeptido o una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; y (b) identificar una o mas caractensticas en la secuencia con el programa informatico.
En la presente memoria tambien se proporcionan metodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia que comprende las etapas de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia usando un programa informatico que compara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipeptido o una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa informatico. La etapa de determinacion de las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede comprender ademas la etapa de identificar polimorfismos. El metodo puede comprender ademas un identificador que identifica una o mas caractensticas en una secuencia. El metodo puede comprender leer la primera secuencia usando un programa informatico e identificar una o mas caractensticas en la secuencia.
Se describen metodos para aislar o recuperar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de una muestra, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar una pareja de secuencias de cebadores de amplificacion para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa, en donde la pareja de cebadores es capaz de amplificar un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) aislar un acido nucleico de la muestra o tratar la muestra de modo que el acido nucleico de la muestra sea accesible para la hibridacion con la pareja de cebadores de amplificacion; y (c) combinar el acido nucleico de la etapa (b) con la pareja de cebadores de amplificacion de la etapa (a); y amplificar el acido nucleico de la muestra, aislando o recuperando asf un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa de una muestra. La muestra es una muestra ambiental, p. ej., una muestra de agua, una muestra lfquida, una muestra de suciedad, una muestra de aire o una muestra biologica, o p. ej., una celula bacteriana, una celula protozoaria, una celula de insecto, una celula de levadura, una celula de planta, una celula fungica o una celula de mairnfero. Uno o cada uno de los miembros de la pareja de secuencias de cebadores de amplificacion puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente de 10 a 50 o mas bases consecutivas de una secuencia como se proporciona en la presente memoria.
Se describen metodos para aumentar la termotolerancia o termoestabilidad de un polipeptido hidrolasa que comprenden glucosilar un polipeptido hidrolasa, en donde el polipeptido comprende al menos treinta aminoacidos contiguos de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria; o un polipeptido codificado por una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, de modo que se aumente la termotolerancia o termoestabilidad del polipeptido hidrolasa. La actividad espedfica de hidrolasa puede ser termoestable o termotolerante a una temperatura en el intervalo de mas de aproximadamente 37°C a aproximadamente 95°C.
Se describen metodos para sobreexpresar una polipeptido hidrolasa recombinante (p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en una celula, que comprenden expresar un vector que comprende un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria o una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, en donde las identidades de secuencias se determinan por analisis con un algoritmo de comparacion de secuencias o por inspeccion visual, en donde la sobreexpresion se lleva a cabo usando un promotor de actividad alta, un vector dicistronico o por amplificacion genica del vector.
En una realizacion, las composiciones de detergentes que comprenden un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, o un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, comprenden una actividad de hidrolasa, p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. La hidrolasa puede ser una hidrolasa no tensioactiva. La hidrolasa puede ser una hidrolasa tensioactiva.
Se describen metodos para lavar un objeto que comprenden la etapa de: (a) proporcionar una composicion que comprende un polipeptido que tiene actividad de hidrolasa, p. ej. lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en donde el polipeptido comprende: un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, o un polipeptido codificado por un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) en condiciones en las que la composicion puede lavar el objeto.
Se describen metodos para hacer una planta transgenica que comprenden las siguientes etapas: (a) introducir una secuencia de acido nucleico heterologa en una celula vegetal, en donde la secuencia de acido nucleico heterologa comprende una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, produciendo asf una celula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgenica a partir de la celula transformada. La etapa (a) puede comprender ademas introducir la secuencia de acido nucleico heterologa por electroporacion o microinyeccion de protoplastos de la celula vegetal. La etapa (a) puede comprender ademas introducir la secuencia de acido nucleico heterologa directamente en el tejido de la planta por bombardeo de partmulas de ADN. Alternativamente, la etapa (a) puede comprender ademas introducir la secuencia de acido nucleico heterologa en el ADN de la celula vegetal usando un hospedante Agrobacterium tumefaciens. En un caso, la celula vegetal puede ser una celula de patata, mafz, arroz, trigo, tabaco o cebada.
Los metodos de expresion de una secuencia de acido nucleico heterologa en una celula vegetal comprenden las siguientes etapas: (a) transformar la celula vegetal con una secuencia de acido nucleico heterologa operativamente unida a un promotor, en donde la secuencia de acido nucleico heterologa comprende un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria; (b) cultivar la planta en condiciones en donde la secuencia de acido nucleico heterologa se expresa en la celula vegetal.
Se describe un primer metodo para la smtesis biocatalftica de un ftpido estructurado que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar una composicion que comprende un triacilglicerido (TAG); (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido hidroliza un resto acilo en la posicion Sn2 del triacilglicerido (TAG), produciendo asf un 1,3-diacilglicerido (DAG) ; (d) proporcionar un ester R1; (e) proporcionar una hidrolasa espedfica de R1, y (f) poner en contacto el 1,3-DAG de la etapa (c) con el ester R1 de la etapa (d) y la hidrolasa espedfica de R1 de la etapa (e) en condiciones en las que la hidrolasa espedfica de R1 cataliza la esterificacion de la posicion Sn2, produciendo asf el ftpido estructurado. La hidrolasa como se proporciona en la presente memoria puede ser una lipasa espedfica de Sn2. El ftpido estructurado puede comprender una alternativa de manteca de cacao (CBA), una manteca de cacao sintetica, una manteca de cacao natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1 -palmitilo-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (Om M).
Tambien se describe un segundo metodo para la smtesis biocatalftica de un ftpido estructurado que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar una composicion que comprende un triacilglicerido (TAG); (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido hidroliza un resto acilo en la posicion Sn1 o Sn3 del triacilglicerido (TAG), produciendo asf un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover la migracion de acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) en condiciones cineticamente controladas, produciendo asf una composicion que comprende un 1,3-DAG.
Este segundo metodo puede comprender ademas proporcionar un ester R1 y una lipasa espedfica de R1, y poner en contacto el 1,3-DAG de la etapa (d) con el ester R1 y la lipasa espedfica de R1 en condiciones en las que la lipasa espedfica de R1 cataliza la esterificacion de la posicion Sn2, produciendo asf un ftpido estructurado. La hidrolasa, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa como se proporciona en la presente memoria puede ser una enzima espedfica de Sn1 o Sn3. El ftpido estructurado puede comprender cualquier aceite vegetal, p. ej., un aceite de soja, un aceite de canola, una alternativa a la manteca de cacao (CBA), una manteca de cacao sintetica, una manteca de cacao natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM).
El ester R1 puede comprender un resto de saturacion menor que el resto acilo hidrolizado, en cuyo caso el ftpido estructurado asf producido es una grasa o aceite saturado mas bajo que el TAG original. El ester R1 puede comprender uno o mas de un acido graso omega-3, un acido graso omega-6, un acido graso monoinsaturado, un acido graso poliinsaturado, un grupo fosfoso, un ester de fitosterol y oryzanol. Mas espedficamente, el ester R1 puede comprender un resto seleccionado del grupo que consiste en acido alfa-linolenico, acido eicosapentaenoico, acido docosahexaenoico, acido gamma-linolenico, acido dihomo-gamma-linolenico, acido araquidonico, acido oleico, acido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol, cumestrol, dietilestilbestrol y oryzanol.
En este segundo metodo, la etapa (d) comprende ademas el uso de resinas de intercambio ionico. Las condiciones cineticamente controladas pueden comprender condiciones de no equilibrio que dan como resultado la produccion de un producto final que tiene una relacion mayor de 2:1 de 1,3-DAG a 2,3-DAG. La composicion de la etapa (b) puede comprender un acido graso (FA) fluorogenico. La composicion de la etapa (b) puede comprender un ester de FA de umbeliferilo. El producto final puede ser enantiomericamente puro.
Un metodo para hacer una grasa o aceite saturado inferior comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido (una hidrolasa, p. ej., una lipasa, saturasa, palmerasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un aceite o grasa, y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con el aceite o grasa de la etapa (b) en condiciones en las que la hidrolasa puede modificar el aceite o grasa, p. ej., eliminar al menos una acido graso saturado, p. ej., acido palmftico, estearico, laurico, acido capnlico (acido octanoico) y similares. La modificacion puede comprender una hidrolisis catalizada por hidrolasa de la grasa o aceite. La hidrolisis puede ser una hidrolisis completa o parcial de la grasa o aceite. El aceite hidrolizado puede comprender un ester de glicerol de un acido graso poliinsaturado que puede reemplazar el acido graso saturado eliminado, o un aceite de pescado, animal o vegetal. El aceite vegetal puede comprender un aceite de oliva, canola, girasol, palma, soja o laurico o aceite de salvado de arroz o una combinacion de los mismos.
Un metodo para hacer una grasa o aceite saturado inferior, que puede incluir acidos grasos esenciales, comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar una composicion que comprende un triacilglicerido (TAG); (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido hidroliza un resto acilo en la posicion Sn1 o Sn3 del triacilglicerido (TAG), produciendo asf un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover la migracion de acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) en condiciones cineticamente controladas, produciendo asf un 1,3-DAG.
El metodo puede comprender ademas proporcionar un ester R1 y una lipasa espedfica de R1, y poner en contacto el 1,3-DAG de la etapa (d) con el ester R1 y la lipasa espedfica de R1 en condiciones en las que la lipasa espedfica de R1 cataliza la esterificacion de la posicion Sn2, produciendo asf un ftpido estructurado. El ester R1 puede comprender un resto de saturacion mas baja que el resto acilo hidrolizado, en cuyo caso el ftpido estructurado asf producido es una grasa o aceite saturado mas bajo que el TAG original. El ester R1 puede comprender un acido graso omega-3 (alfa-linolenico, eicosapentaenoico (EPA), docosahexaenoico (DHA)), un acido graso omega-6 (gamma-linolenico, dihomo-gama-linolenico (DGLA), o araquidonico), un acido graso monoinsaturado (oleico, palmoleico y similares), grupos fosfo (colina y serina), esteres de fitosterol (beta-sitosterol, cumestrol, y dietilestilbestrol) y oryzanol. La hidrolasa, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa como se proporciona en la presente memoria puede ser una enzima espedfica de Sn1 o Sn3. La grasa o aceite saturado inferior se puede obtener por la hidrolisis descrita anteriormente de cualquier aceite de algas, aceite vegetal o grasa o aceite animal, p. ej., aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornmutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de especies de Nannochloris, aceite de especies de Spirulina, aceite de Chlorophycease (algas verdes) y aceite de Bacilliarophy aceite de canola, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de avellana, aceite de canamo, aceite de linaza, aceite de semilla de Limnanthes, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cartamo, aceite de sasanqua, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de resina, aceite de tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (aceite de canola alto oleico, aceite de soja bajo linoleico o aceites de girasol alto estearico), grasas animales (sebo, manteca de cerdo, grasa de mantequilla y grasa de pollo), aceites de pescado (aceite de eulachon, aceite de hftgado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque y aceite de lacha), o mezclas de cualquiera de los anteriores. La grasa o aceite saturado inferior asf hecho se puede usar en alimentos o productos horneados, fritos o cocinados que comprenden aceites o grasas con un contenido menor de acidos grasos, incluyendo aceites bajos en acido palmftico, acido oleico, acido laurico, acido estearico, acido capnlico (acido octanoico) etc., procesados usando una composicion o metodo proporcionado en la presente memoria.
Un metodo para refinar un lubricante comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composicion que comprende una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar un lubricante; y (c) tratar el lubricante con la hidrolasa en condiciones en las que la hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria puede hidrolizar selectivamente aceites en el lubricante, refinandolo de ese modo. El lubricante puede ser un aceite hidraulico.
Un metodo para tratar una tela comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composicion que comprende una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, en donde la hidrolasa puede hidrolizar selectivamente esteres carboxflicos; (b) proporcionar una tela; y (c) tratar la tela con la hidrolasa en condiciones en las que la hidrolasa puede hidrolizar selectivamente los esteres carboxflicos tratando asf la tela. El tratamiento de la tela puede comprender la mejora del tacto y cafda de la tela final, tincion, obtencion de retardante de llama, obtencion de repelencia al agua, obtencion de brillo optico u obtencion de un acabado de resina. La tela puede comprender algodon, viscosa, rayon, lyocell, lino, lino, ramio, todas sus mezclas, o mezclas de los mismos con poliesteres, lana, poliamidas acnlicos o poliacnlicos. Una tela, hebra o fibra que comprende una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede adsorber, absorber o inmovilizar en la superficie de la tala, hebra o fibra.
Un metodo para eliminar o disminuir la cantidad de una mancha de alimento o aceite comprende poner en contacto una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria con la mancha de alimento o aceite en condiciones en las que la hidrolasa puede hidrolizar el aceite o grasa en la mancha. La hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria puede tener una estabilidad mejorada respecto a la desnaturalizacion por tensioactivos y a la desactivacion por calor. La hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria puede tener un detergente o una solucion de lavado.
Una composicion dietetica comprende una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria. La composicion dietetica puede comprender ademas una base nutricional que comprende una grasa. La hidrolasa puede ser activada por una sal biliar. La composicion dietetica puede comprender ademas una formula infantil basada en leche de vaca. La hidrolasa puede hidrolizar acidos grasos de cadena larga.
Un metodo para reducir el contenido de grasa en la leche o en composiciones dieteticas de base vegetal comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composicion que comprende una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) proporcionar una composicion que comprende una leche o un aceite vegetal, y (c) tratar la composicion de la etapa (b) con la hidrolasa en condiciones en las que la hidrolasa puede hidrolizar el aceite o la grasa en la composicion. Una composicion dietetica para un ser humano o para animales no rumiantes, comprende una base nutricional, en donde la base comprende una grasa y no comprende o comprende poca hidrolasa, y una cantidad eficaz de una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, para aumentar la absorcion de grasa y el crecimiento de seres humanos o animales no rumiantes.
Se describe un metodo para catalizar una reaccion de interesterificacion para producir nuevos triacilgliceridos que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composicion que comprende un polipeptido (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, en donde el polipeptido puede catalizar una reaccion de interesterificacion; (b) proporcionar una mezcla de triacilgliceridos y acidos grasos libres; (c) tratar la mezcla de la etapa (b) con el polipeptido en condiciones en las que el polipeptido puede catalizar el intercambio de acidos grasos libres con los grupos acilo de los triacilgliceridos, produciendo asf nuevos triacilgliceridos enriquecidos en los acidos grasos anadidos. El polipeptido puede ser una lipasa espedfica de Sn1,3. Se describe un metodo de interesterificacion para preparar un aceite que tiene un contenido bajo de acido trans y un contenido bajo de acidos grasos de cadena intermedia, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una mezcla de reaccion de interesterificacion que comprende un material fuente de acido estearico seleccionado del grupo que consiste en acido estearico, monoesteres de acido estearico y alcoholes monolddricos de bajo peso molecular, y mezclas de los mismos, (b) proporcionar un aceite vegetal lfquido; (c) proporcionar un polipeptido (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, en donde el polipeptido comprende una actividad de lipasa espedfica para 1,3; (d) interesterificar el material fuente de acido estearico y el triacilglicerido de aceite vegetal, (e) separar los componentes de acidos grasos libres interesterificados de los componentes gliceridos de la mezcla de interesterificacion para proporcionar un producto de aceite de margarina interesterificado y una mezcla de acidos grasos que comprende acidos grasos, monoesteres de acidos grasos o mezclas de los mismos liberados del aceite vegetal, y (f) hidrogenar la mezcla de acidos grasos. En el metodo de interesterificacion, la reaccion de interesterificacion puede continuar hasta que haya un equilibrio sustancial de los grupos ester en las posiciones 1, 3 del componente glicerido con componentes de acido graso no gliceridos de la mezcla de reaccion.
Se describe un metodo para hacer una composicion que comprende 1-palmitoil-3-estearoil-2-monolema (POSt) y 1,3-distearoil-2-monolema (StOSt) que comprende proporcionar un polipeptido (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria, en donde el polipeptido es capaz de interesterificacion catalizada por lipasa espedfica 1,3 de 1,3-dipalmitoil-2-monolema (POP) con acido estearico o triestearina, y poner en contacto dicho polipeptido con una composicion que comprende dicho POP en presencia de una fuente de estearina tal como acido estearico o tritearina para preparar un producto enriquecido en la 1 -palmitoil-3-estearoil-2-monolema (POSt) o 1,3-diestearoil-2-monolema (StoSt).
Un metodo para mejorar o prevenir la toxicidad mediada por lipopolisacaridos (LPS) comprende administrar a un paciente una composicion farmaceutica que comprende una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria. Un metodo para detoxificar una endotoxina puede comprender poner en contacto la endotoxina con una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria. Un metodo para desacilar una cadena de acido graso 2' o 3' de un ftpido A puede comprender poner en contacto el ftpido A con un polipeptido como se proporciona en la presente memoria.
En una realizacion, los metodos para alterar la especificidad de sustrato o la preferencia de sustrato de una enzima lipasa parental (hidrolasa de acido graso) que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 2, comprenden la etapa de generar (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de restos de aminoacidos en la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, La Tabla 10, la Tabla 11, la Tabla 16 o la Tabla 23, generando de este modo una nueva enzima hidrolasa que tiene una secuencia de aminoacidos modificada y una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alterada en comparacion con la enzima lipasa parental (hidrolasa de acido graso) de SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de acido graso) comprende la hidrolisis preferencial o mayor de acido palmftico de un aceite, o la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de acido graso) comprende la hidrolisis preferencial o mayor de acido estearico de un aceite.
En una realizacion, un polipeptido aislado, sintetico o recombinante como se proporciona en la presente memoria, comprende ademas uno o mas de los cambios de restos de aminoacidos R72E, R72K, E116A, E116Q, E116R, E116T, E116V, S133A, I151G, I151A, V163R o D164R.
Tambien se describe una secuencia de aminoacidos modificada (en comparacion con la SEQ ID NO: 2 "parental") que comprende al menos una modificacion de aminoacido A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o su equivalente, o una de sus combinaciones, y/o en donde un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos como se ha expuesto antes comprende ademas al menos una modificacion de codon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (Ac C)188(Ac G), o su equivalente, o una de sus combinaciones, y la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de acido graso) comprende la hidrolisis preferente o mayor de acido palmftico de un aceite. La secuencia de aminoacidos modificada (en comparacion con la SEQ ID NO: 2 "parental") puede comprender I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una de sus combinaciones, y la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de acido graso) comprende la hidrolisis preferencial o incrementada de acido estearico de un aceite.
Se describen metodos para hacer una enzima que tiene una especificidad de sustrato o una preferencia de sustrato que comprende hidrolisis preferente o mayor de acido palmftico de un aceite, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende hidrolisis preferencial del acido palmftico de un aceite, en donde la enzima hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tiene una secuencia como se proporciona en la presente memoria; y (b) hacer al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas modificaciones de restos de aminoacidos en la hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) enzima, en donde las modificaciones de restos de aminoacidos corresponden a mutaciones de la secuencia de aminoacidos respecto a la SEQ ID NO: 2, como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, generando asf una enzima que tiene especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferente o mayor del acido palmftico de un aceite.
Tambien se describen metodos para preparar una enzima que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende hidrolisis preferente o mayor del acido estearico de un aceite, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, enzima palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferencial del acido estearico de un aceite, en donde la enzima hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tiene una secuencia como se proporciona en la presente memoria; y (b) hacer al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas modificaciones de restos de aminoacidos en la enzima hidrolasa parental (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en donde las modificaciones de restos de aminoacidos corresponden a las mutaciones de la secuencia de aminoacidos respecto a la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, generando asf una enzima que tiene especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferente o mayor del acido estearico de un aceite.
Tambien se describen metodos para hacer una enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferencial de un acido graso particular, que comprende las etapas de (a) proporcionar una secuencia de enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) generar (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de restos de bases en el acido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a los cambios de secuencia expuestos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) ensayar la actividad de la enzima recien generada para una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferencial de un acido graso particular, haciendo asf la nueva enzima hidrolasa de acidos grasos (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende hidrolisis preferencial de un acido graso particular. La enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2. El acido graso puede ser acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico o acido estearico.
En una realizacion, los metodos para hacer una enzima hidrolasa de acidos grasos (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferencial de un acido graso particular, y comprenden las etapas de (a) proporcionar una secuencia de acido nucleico que codifica una enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria; (b) generar (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de restos de bases en el acido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a los cambios de secuencia expuestos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) expresar el acido nucleico generado para producir la nueva enzima hidrolasa de acidos grasos (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), que tiene especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende la hidrolisis preferente de un acido graso particular.
La secuencia que codifica la enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se describe comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1. El acido graso puede ser acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico o acido estearico. La especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima hidrolasa de acido graso (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) es el acido palmftico en comparacion con una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato del acido estearico para la enzima hidrolasa de acido graso parental (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), o la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva hidrolasa de acidos grasos (p. ej., lipasa, saturasa, y/o estearatasa) es el acido estearico en comparacion con una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato del acido palmftico para la enzima hidrolasa de acido graso parental (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa).
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una palmitasa que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 2, pero que tambien comprende
a) al menos la modificacion del resto de aminoacido D61E, R72K y V163R;
b) al menos la modificacion del resto de aminoacido D61E, R72K y V163R y al menos una modificacion de resto de aminoacido A48C, R85Y, E95K, E116I, E116L, E116N, A144I, E149H, A150I, P162G, P162K, R172H, R172L o A225S, o una de sus combinaciones;
c) la palmitasa de cualquiera de (a) o (b), en donde un acido nucleico que codifica una palmitasa de acuerdo con a) o b) comprende ademas comprender al menos una modificacion de codon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG), o una de sus combinaciones. Tambien se describen lipasas que comprenden una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 2 pero que tambien comprenden al menos la modificacion del resto de aminoacido A48C; d49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o su equivalente, o una de sus combinaciones, y/o donde un acido nucleico que codifica una lipasa como se ha expuesto anteriormente comprende ademas al menos una modificacion de codon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (g Tg )183(g Tt ); (ACC)188(ACG), o su equivalente, o una de sus combinaciones. Las lipasas pueden comprender una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 2, pero que tambien comprende al menos la modificacion de resto de aminoacido I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una de sus combinaciones.
En un aspecto, la especificidad de sustrato o la preferencia de sustrato de la nueva lipasa comprende una hidrolisis preferente o mayor de un acido graso de un aceite en comparacion con la SEQ ID NO: 2 "parental". El acido graso puede ser acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico o acido estearico. En un aspecto, el acido graso es el acido palmftico.
Los detalles de una o mas realizaciones como se proporcionan en la presente memoria se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuacion. Otras caractensticas, objetos y ventajas proporcionadas en la presente memoria seran evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Descripcion de los dibujos
Los siguientes dibujos son ilustrativos de realizaciones como se proporcionan en la presente memoria y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujo(s) en color seran proporcionadas por la Oficina, previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema informatico.
La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un procedimiento para comparar una nueva secuencia de nucleotidos o protema con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homologfa entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos.
La figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un procedimiento en un ordenador para determinar si dos secuencias son homologas.
La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso de identificador 300 para detectar la presencia de una caractenstica en una secuencia.
La figura 5 ilustra un metodo de ejemplo como se proporciona en la presente memoria que comprende el uso de lipasas como se proporciona en la presente memoria para procesar un lfpido, p. e., un lfpido de un aceite de soja, para hidrolizar selectivamente un acido palmttico para producir un "aceite de soja reducido en palmttico".
La figura 6a ilustra los efectos de las mutaciones de la palmitasa GSSMsm de ejemplo en la hidrolisis de palmitato y estearato en relacion con la SEQ ID NO: 2 parental, como se describe en detalle en el ejemplo 4, a continuacion. La figura 6b ilustra los efectos de mutaciones de la estearatasa GSSMsM de ejemplo en la hidrolisis de palmitato y estearato en relacion con la SEQ ID NO: 2 parental como se describe en detalle en el ejemplo 4, a continuacion. La figura 7 muestra la SEQ ID NO: 2, con las posiciones particulares de mutaciones de palmitato y estearato mencionadas en negrita de una fuente mas grande. Las mutaciones subrayadas (p. ej., 61A, E) son posiciones alternativas de restos de aminoacidos (secuencias alternativas para realizaciones alternativas) para mejorar la hidrolisis del palmitato. Las mutaciones en cursiva (p. ej., 20L) son posiciones alternativas de restos de aminoacidos (secuencias alternativas para realizaciones alternativas) para mejorar la hidrolisis del estearato. La posicion 116 es una posicion alternativa de mutacion de resto de aminoacido (una secuencia alternativa para una realizacion alternativa) para mejorar la hidrolisis tanto del palmitato como del estearato.
La figura 8 muestra los datos del ensayo de aceite de soja de confirmacion para clones seleccionados de la biblioteca de palmitasa.
Los sfmbolos de referencia similares en los diferentes dibujos indican elementos similares.
Descripcion detallada
Realizaciones alternativas comprenden polipeptidos, que incluyen lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, polinucleotidos que los codifican y metodos para fabricar y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. Realizaciones alternativas comprenden polipeptidos, p. ej., enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, que incluye actividad de hidrolasa termoestable y termotolerante, y polinucleotidos que codifican estas enzimas, y que la fabricacion y uso de estos polinucleotidos y polipeptidos. Las actividades de hidrolasa de los polipeptidos y peptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen actividad de lipasa (hidrolisis de lfpidos), reacciones de interesterificacion, smtesis de ester, reacciones de intercambio de ester, actividad de acil hidrolasa lipfdica (LAH) y actividad enzimatica relacionada. Para los propositos de esta solicitud de patente, las reacciones de interesterificacion pueden incluir reacciones de acidolisis (que implican la reaccion de un acido graso y un triacilglicerido), alcoholisis (que implica la reaccion de un alcohol y un triacilglicerido), glicerolisis (que implica la reaccion de un glicerol y triacilgliceridos) y reacciones de transesterificacion (que implican la reaccion de un ester y un triaciglicerido). Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en una variedad de contextos farmaceuticos, agncolas e industriales, que incluyen la fabricacion de cosmeticos y nutraceuticos. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se usan para sintetizar productos quirales enantiomericamente puros.
En ciertas realizaciones, las enzimas como se proporcionan en la presente memoria pueden ser catalizadores altamente selectivos. Pueden tener la capacidad de catalizar reacciones con estereo-, regio- y quimio-selectividades que no son posibles en la qmmica sintetica convencional. Las enzimas que se proporcionan en la presente memoria pueden ser versatiles. Pueden funcionar en disolventes organicos, operar a pH extremos (p. ej., pH altos y pH bajos), temperaturas extremas (por ejemplo, temperaturas altas y bajas), niveles de salinidad extrema (por ejemplo, alta salinidad y baja salinidad), y catalizan reacciones con compuestos que no estan relacionados estructuralmente con sus sustratos fisiologicos, naturales.
Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria comprenden hidrolasas que tienen actividad lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa y se puden usar, p. ej., en la smtesis biocatalttica de lfpidos estructurados (lfpidos que contienen un conjunto definido de acidos grasos distribuidos de una manera definida en la cadena principal de glicerol), que incluyen cualquier aceite vegetal, p. ej., canola, soja, alternativas a aceite de soja, alternativas de manteca de cacao, i,3-diacilgliceridos (DAG), 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG), tales como 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (StoSt), i-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POSt) o 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM), acidos grasos poliinsaturados (PUFA), acidos grasos poliinsaturados de cadena larga tales como el acido araquidonico, acido docosahexaenoico (DHA) y acido eicosapentaenoico (EPA).
Las enzimas y los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para eliminar, anadir o intercambiar cualquier acido graso de una composicion, p. ej., hacer un aceite con un contenido mas bajo de acidos grasos saturados (p. ej., un aceite de "bajo saturado") o un contenido diferente de acidos grasos (p. ej., convertir un aceite que comprende acidos grasos "saturados" en un aceite que comprende acidos grasos "insaturados" alternativos).
Los ejemplos de acidos grasos saturados que se pueden eliminar, anadir o "reordenar" en un lfpido, p. ej., un aceite, usando una enzima o mediante la practica de un metodo como se proporciona en la presente memoria incluyen: Acetico: CH3COOH
Butrnco: CH3(CH2)2COOH
Caproico: CH3(CH2)4COOH
Capnlico: CH3(CH2)aCOOH
Caprico: CH3(CH2)8COOH
Undacanoico: CH3(CH2)gCOOH
Laurico: (acido dodecanoico): CH3(CH2)ioCOOH
Minstico: (acido tetradecanoico): CH3(CH2)i2COOH
Pentadecanoico: CH3(CH2)i3COOH
Palmftico: (acido hexadecanoico): CH3(CH2)i4COOH
Margarico: CH3(CH2)i5COOH
Estearico (acido octadecanoico): CH3(CH2)i6COOH
Araqrndico (acido eicosanoico): CH3(CH2)i8COOH
Behenico: CH3(CH2)2oCOOH
Los ejemplos de acidos grasos insaturados omega-3 que se pueden eliminar, anadir o "reordenar" en un lfpido, p. ej., un aceite, usando una enzima o mediante la practica de un metodo como se proporciona en la presente memoria incluyen:
a-linolenico (ALA): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
estearaiadonico (octadecatetraenoico): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4COOH eicosapentaenoico (EPA): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH docosahexaenoico (DHA) CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)2COOH Los ejemplos de acidos grasos insaturados omega- 6 que se pueden eliminar, anadir o "reordenar" en un lfpido, p. ej., un aceite, usando una enzima o mediante la practica de un metodo como se proporciona en la presente memoria incluyen:
Linoleico (acido 9,i2-octadecadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
Gamma-linolenico (acido 6,9,i2-octadecatrienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4COOH Eicosadienoico (acido ii,i4-eicosadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)9COOH
Dihomo-gamma-linolenico (acido 8,ii,i4-eicosatrienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)6COOH Araquidonico (acido 5,8,ii,i4-eicosatetraenoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH
Docosadienoico (acido i3,i6-docosadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)iiCOOH
i6
Adrenico (acido 7,10,13,16-docosatetraenoico): CHa(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)5COOH Docosapentaenoico (acido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico): CHa(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)2COOH
Los ejemplos de acidos grasos insaturados omega-9 que se pueden eliminar, anadir o "reordenar" en un ftpido, p. ej., un aceite, usando una enzima o mediante la practica de un metodo como se proporciona en la presente memoria incluyen:
Oleico (acido 9-octadecenoico): CH3(CH2)yCH=CH(CH2)yCOOH
Eicosenoico (acido 11-eicosenoico) CH3(CH2)yCH=CH(CH2)gCOOH
Aguamiel (acido 5,8,11-eicosatrienoico): CH3(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH
Eurico (acido 13-docosenoico): CH3(CH2)yCH=CH(CH2)nCOOH
Nervonico (15-tetracosenoic acid): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)i3COOH.
Palmitoleico: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)5COOH
Se proporcionan en la presente memoria nuevas clases de lipasas denominadas "saturasas", p. ej., "palmitasas" y "estearatasas". El termino "saturasa", como se ha usado previamente en la bibliograffa, describe una enzima que lleva a cabo la saturacion de enlaces espedficos en una ruta metabolica, p. ej., la hidrogenacion de un enlace doble (Moise, et al., J Biol Chem, 2005, 280(30):27815-27825). Sin embargo, en la presente memoria se proporcionan "saturasas" nuevas y no descritas previamente, en donde las saturasas descritas en la presente memoria hidrolizan esteres de acidos grasos saturados, en donde los esteres hidrolizados pueden ser esteres de acidos grasos saturados y glicerol, umbeliferol u otros alcoholes.
Tambien se proporcionan en la presente memoria "palmitasas" y "estearatasas" no descritas previamente, en donde las palmitasas y estearatasas hidrolizan acido palmftico y acido estearico, respectivamente por ejemplo, de la cadena principal de glicerol. Las "saturasas" descritas en la presente memoria tambien se pueden denominar "hidrolasas de saturados". De manera similar, las "palmitasas" descritas en la presente memoria tambien se pueden denominar "hidrolasas de palmitato" y las "estearatasas" descritas en la presente memoria tambien se pueden denominar "hidrolasas de estearato".
Las saturasas descritas en la presente memoria hidrolizan selectivamente al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos saturados. En otro aspecto, las palmitasas descritas en la presente memoria hidrolizan selectivamente acidos grasos de manera que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos hidrolizados son acido palmftico. En otro aspecto, las estearatasas descritas en la presente memoria hidrolizan selectivamente acidos grasos de manera que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos hidrolizados son acido estearico.
En un aspecto, como se ilustra en la figura 5, los metodos para usar una enzima como se proporciona en la presente memoria pueden procesar un ftpido, p. ej., un ftpido de un aceite de soja u otro aceite vegetal, para hidrolizar selectivamente un acido graso saturado, p. ej., un acido palmftico o estearico, (p. ej., de un aceite que contiene estos acidos grasos saturados) para producir un "aceite bajo en saturado (o inferior)", p. ej., un "aceite reducido en palmftico", tal como un "aceite vegetal reducido en palmftico", p. ej., un "aceite de soja reducido en palmftico". Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar para hidrolizar selectivamente cualquier acido graso, en particular acidos grasos saturados, de una cadena principal de glicerol para producir un "aceite bajo en saturado (o inferior)", que incluye hidrolizar selectivamente un acido graso saturado, p. ej., un acido palmftico o un acido estearico, de una posicion Sn1 o Sn2 de una cadena principal de glicerol, ademas de la hidrolisis de una posicion Sn3 (p. ej., hidrolisis de acido palmftico de la posicion Sn3 ilustrada en la figura 5).
Se proporciona una smtesis de ejemplo de trigliceridos, aceites o grasas bajos en saturados. Esta smtesis de ejemplo puede usar acidos grasos libres o esteres de acidos grasos, dependiendo de la enzima utilizada. Las hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, como se proporciona en la presente memoria, se usan para eliminar o hidrolizar acidos grasos saturados, tales como acido acetico, acido butftico, acido caproico, acido capnlico, acido caprico, acido undecanoico, acido laurico, acido minstico, acido pentadecanoico, acido palmftico, acido margarico, acido estearico, acido addico o acido behenico de un triglicerido, aceite o grasa. Por ejemplo, los acidos grasos eliminados o hidrolizados se sustituyen por acidos grasos con mejores beneficios para la salud (tales como una menor correlacion con la enfermedad cardiovascular), o mejores propiedades qrnmicas (tales como la estabilidad o reactividad oxidativa) o mejores propiedades ffsicas (tales como el punto de fusion o la sensacion en la boca). Por ejemplo, los acidos grasos anadidos son acidos grasos insaturados omega-3, tales como el acido a-linolenico, acido estearidonico, acido eicosapentaenoico (EPA) o acido docosahexaenoico (DHA), o PUFA o acidos grasos de aceite de pescado. Por ejemplo, los acidos grasos anadidos son acidos grasos insaturados omega-6, tales como acido linoleico, acido gamma-linoleico, acido eicosadienoico, acido dihomo-gamma-linoleico, acido araquidonico, acido docosadienoico, acido adrenico o acido docosapentaenoico. Por ejemplo, los acidos grasos anadidos son acidos grasos insaturados omega-9, tales como acido oleico, acido eicosenoico, acido de aguamiel, acido erucico, acido nervonico o acido palmitoleico. Los acidos grasos anadidos (p. ej., omega-3, omega-6, u omega-9) se pueden anadir por reaccion de acidos grasos con los trigliceridos, aceite o grasa despues de la eliminacion o hidrolisis de acidos grasos saturados por las hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, como se proporcionan en la presente memoria. Los acidos grasos anadidos (p. ej., omega-3, omega-6 u omega-9) se pueden anadir por reaccion de esteres de acidos grasos, que incluyen esteres de glicerol, o esteres de etilo o metilo, con trigliceridos, aceite o grasa despues de la eliminacion o hidrolisis de acidos grasos saturados por las hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, como se proporcionan en la presente memoria. La reaccion para anadir acidos grasos (p. ej., omega-3, omega-6 u omega-9) puede ser catalizada por una hidrolasa o lipasa, tal como una lipasa no espedfica (incluyendo no regiospedfica y no espedfica de acidos grasos), o una lipasa espedfica de Sn1,3, o una lipasa espedfica de Sn1, o una lipasa espedfica de Sn3, o una lipasa espedfica de Sn2, o una lipasa espedfica de acido graso.
Los metodos y composiciones (hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en la produccion de productos nutraceuticos (p. ej., acidos grasos poliinsaturados y aceites), diversos alimentos y aditivos alimentarios (p. ej., emulsionantes, sustitutos de la grasa, margarinas y productos para untar), cosmeticos (p. ej., emulsionantes, cremas), productos farmaceuticos y agentes de suministro de farmacos (p. ej., liposomas, comprimidos, formulaciones) y aditivos para piensos animales (p. ej., acidos grasos poliinsaturados, tales como los acidos linoleicos).
Las lipasas como se proporcionan en la presente memoria pueden actuar sobre los esteres de acido graso fluorogenico (FA), p. ej., esteres de FA y umbeliferilo. Los perfiles de especificidades de FA de lipasas hechas o modificadas por los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden obtener midiendo sus actividades relativas en una serie de esteres de FA y umbeliferilo, tales como esteres de palmitato, estearato, oleato, laurato, PUFA o butirato.
En un aspecto, un polipeptido (p. ej., anticuerpo o enzima, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria para estas reacciones, se inmoviliza, p. ej., como se describe a continuacion. En aspectos alternativos, los metodos proporcionados en la presente memoria no requieren un disolvente organico, pueden proceder con velocidades de reaccion relativamente rapidas. Vease, p. ej., patente de EE.UU. n° 5.552.317; 5.834.259.
Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hidrolizar (incluyendo hidrolizar selectivamente) aceites, tales como aceites de pescado, animales y vegetales, y lfpidos, tales como acidos grasos poliinsaturados. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para producir aceites bajos en saturados, p. ej., eliminando (hidrolizando) al menos un acido graso de un aceite; y la hidrolisis puede ser una hidrolisis selectiva, p. ej., eliminando solo un acido graso particular, tal como un acido graso palmftico, estearico u otro acido graso saturado, o eliminando solo un acido graso de una posicion, p. ej., Sn1, Sn2 o Sn3. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se usan para procesar acidos grasos (tales como acidos grasos poliinsaturados), p. ej., acidos grasos de aceite de pescado, p. ej., para uso en o como alimento o aditivo para alimentos, o para aceite para cocinar, frefr, hornear o comestible. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hidrolizar selectivamente esteres saturados frente a esteres insaturados en acidos o alcoholes. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para tratar latex para una variedad de propositos, p. ej., para tratar latex usados en composiciones fijadoras del cabello para eliminar olores desagradables. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar en el tratamiento de deficiencia de una lipasa en un animal, p. ej., un mairnfero, tal como un ser humano. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar para preparar lubricantes, tales como aceites hidraulicos. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para fabricar y usar detergentes. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar en procedimientos para el acabado qmmico de telas, fibras o hilos. Los metodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para obtener la resistencia a la llama en una tela usando, p. ej., un acido carboxflico sustituido con halogeno o un ester del mismo, es decir, un acido carboxflico fluorado, clorado o bromado, o un ester del mismo. Se proporcionan los metodos de generacion de lipasas a partir de bibliotecas ambientales.
Las "hidrolasas" como se proporcionan en la presente memoria abarcan polipeptidos (p. ej., anticuerpos, enzimas) y peptidos (p. ej., "sitios activos") que tienen cualquier actividad de hidrolasa, es decir, los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden tener cualquier actividad de hidrolasa, incluyendo p. ej., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. Las "hidrolasas" como se proporcionan en la presente memoria incluyen todos los polipeptidos que tienen cualquier actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo la smtesis de ftpidos o la actividad de hidrolisis de ftpidos, es decir, los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden tener cualquier actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. Las lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas como se proporcionan en la presente memoria incluyen enzimas activas en la bioconversion de ftpidos por catalisis de reacciones de hidrolisis, alcoholisis, acidolisis, esterificacion y aminolisis. Por ejemplo, las hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria pueden hidrolizar emulsiones de ftpidos. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria pueden actuar preferentemente en los enlaces Sn-1, Sn-2 y/o Sn-3 de los triacilgliceridos para liberar uno o mas acidos grasos de la cadena principal de glicerol. Por ejemplo, la actividad de hidrolasa, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluye la smtesis de manteca de cacao, acidos grasos poliinsaturados (PUFA), 1,3-diacilgliceridos (DAG), 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG). La actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria tambien comprende la produccion de aceites bajos en saturados, p. ej., aceite de soja o canola, eliminando un acido graso, p. ej., un acido palmftico, oleico, laurico o estearico. En aspectos alternativos, las enzimas como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden hidrolizar y/o isomerizar enlaces a altas temperaturas, bajas temperaturas, pH alcalinos y a pH acidos. La hidrolasa, p. ej., la lipasa, como se proporciona en la presente memoria, es una saturasa que cataliza reacciones de hidrolisis, alcoholisis, acidolisis, esterificacion y aminolisis donde el acido carboxflico o graso en la molecula formada o que ha reaccionado es un acido graso saturado tal como el acido acetico, acido butftico, acido laurico, acido minstico, acido palmftico, acido estearico o acido araquidonico. En un aspecto, la hidrolasa, p. ej., lipasa o saturasa, como se proporciona en la presente memoria, es una palmitasa que cataliza reacciones de hidrolisis, alcoholisis, acidolisis, esterificacion y aminolisis donde el acido carboxflico o graso en la molecula formada o que ha reaccionado es un acido palmftico. La hidrolasa, p. ej., lipasa o saturasa, como se proporciona en la presente memoria, es una estearatasa que cataliza reacciones de hidrolisis, alcoholisis, acidolisis, esterificacion y aminolisis donde el acido carboxflico o graso en la molecula formada o que ha reaccionado es un acido estearico.
En la presente memoria se proporcionan enzimas que comprenden variantes de hidrolasa (p. ej., "variante de lipasa", "variante de saturasa", "variante de palmitasa" o "variante de estearatasa") de las enzimas como se proporciona en la presente memoria; estas enzimas pueden tener una secuencia de aminoacidos que deriva de la secuencia de aminoacidos de un "precursor". El precursor puede incluir hidrolasa natural y/o una hidrolasa recombinante. La secuencia de aminoacidos de la variante de hidrolasa "deriva" de la secuencia de aminoacidos de la hidrolasa precursora por sustitucion, eliminacion o insercion de uno o mas aminoacidos de la secuencia de aminoacidos precursora. Dicha modificacion es de la "secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de aminoacidos de la lipasa precursora en lugar de la manipulacion de la enzima hidrolasa precursora per se. Los metodos adecuados para dicha manipulacion de la secuencia de ADN precursora incluyen los metodos descritos en la presente memoria, asf como metodos conocidos por los expertos en la tecnica.
Generacion y manipulacion de acidos nucleicos
Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos, que incluyen casetes de expresion tales como vectores de expresion, que codifican los polipeptidos (p. ej., hidrolasas, tales como lipasas saturasas, palmitasas y/o estearatasas y anticuerpos). Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 y que tienen al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de restos de bases descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o sus equivalentes). Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2 y que tienen al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de restos de aminoacidos descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o sus equivalentes).
SEQ ID NO: 1
ATGCTGAAACCGCCTCCCTACGGACGCCTGCTGCGCGAACTGGCCGATATCCCGG CCATCGTGACGGCACCGTTCCGGGGCGCTGCGAAAATGGGCAAACTGGCGGATG GCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCCGACGACAACGCCACCTCGGT GCTGCGCAAGACCTTCGATGTCGCGGGCTTTGCCTGTTCGGGCTGGGAACGCGGC TTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCGTGGACCGGCTGGTCGACCGGCTGCGGG CGGT GTCGGAGGCGGCCGGTGGT C AGA AGGT GATCGTGGT CGGCT GGAGCCTCG GCGGCCTCTATGCGCGCGAGCTGGGCCACAAGGCGCCCGAACTGATCCGGATGG TCGTCACGCTCGGCAGTCCGTTCGCGGGCGACCTCCACGCCAACCATGCGTGGAA GATCTACGAGGCGATCAACAGCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGGTCGA TTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCGCACCATCGCGGTGTGGTCGCCGCTCGACGGG GTGGTGGCGCCGGAGACCTCGGAAGGCTCGCCCGAGCAGTCGGACGAGCGGCTA GAGCTGGCGGTGACCCACATGGGCTTTGCCGCATCGAAGACCGGGGCCGAGGCT GTGGTCCGGCTGGTCGCGGCGCGGCTCTAG
SEQ ID NO: 2 (codificada por SEQ ID NO: 1):
código de 1 letra:
MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATSVLR KTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRAVSEAAGGQKVIVVGWSLGGL YARELGHKAPEL1RMVVTLGSPFAGDLHANHAWKIYEA1NSHTVDNLPIPVDFQ1KPP VRTIAVWSPLDGVVAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAEAVVRLVAAR
L-
código de 3 letras:
Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu Ala Asp
lie Pro Ala lie Val Thr A la Pro Phe Arg Gly A la Ala Lys Met Gly
Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe Leu Ala
Asp Asp Asn Ala Thr Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val A la Gly
Phe Ala Cys Scr Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly lie Arg Gly
Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser Glu Ala
Ala Gly Gly Gin Lys Val He Val Val Gly Trp Scr Leu Gly Gly Leu
Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu lie Arg Met Val
Val Thr Leu Gly Scr Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn His Ala
Trp Lys lie Tyr Glu A la lie Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro
lie Pro Val Asp Phe Gin lie LyLs Pro Pro Val Arg Thr lie Ala Val
Trp Scr Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Scr Glu Gly Scr
Pro Glu Gin Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly
Phe Ala A la Scr Lys Thr Gly A la Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala
Ala Arg Leu
SEQ ID NO: 3:
ATGGCCGGCCACCAGGGCGCGCGGGGCCCCAAAGACGGTCCGCCGGCGATGGTG ATCCCGGGCTTCCTCGCCCACGACAGGCACACGACACGATTGCGCCGGGAACTC GCCGAGGCGGGGTTCAGGGTTCACCCCTGGCGGCAGGGCTGGAACATGGGAGCG CGTGCCGACACGCTCGAGAAATTGAAGCGGGCAGTGGACCAGTGCGGTCATGAC GAGCCGATCCT GCT GGTCGGCT GGAGT CT GGGC GGGCTCT ACGCGAGGGAGGT C GCGCGCGCCGAGCCGGATCAGGTGCGGGCGGTGGTCACTCTTGGTTCCCCGGTGT CGGGCGACCGGCGCCGCTACACCAACGTGTGGAAGCTGTACGAATGGGTGGCGG GTCACCCGGTGGACGACCCGCCGATCCCCGACAAGGAGGAAAAGCCGCCGGTGC CGACCCTGGCTTTGTGGTCGGCGGATGACGGGATCGTCGGCGCCCCGTCGGCGCG CGGGACTCAGTTATCTCACGACAAGGCGGTCGAGATGCGAACGAGCCACATGGG CTTTGCCATGTCGGCGAAGAGCGCACGCTTTGTTGTCGCCGAGATCGTGAAGTTC CTGAAGAAAACCGAAGGTTCCGAGTCGCACGATTGA
SEQ ID NO: 4 (codificada por SEQ ID NO: 3):
MAGHQGARGPKDGPPAMVIPGFLAHDRHTTRLRRELAEAGFRVHPWRQGWNMGA RADTLEKLKRAVDQCGHDEPILLVGWSLGGLYAREVARAEPDQVRAVVTLGSPVSG DRRRYTNVWKLYEWVAGHPVDDPPIPDKEEKPPVPTLALWSADDGIVGAPSARGTQ LSHDKAVEMRTSHMGFAMSAKSARFVVAEIVKFLKKTEGSESHD
SEQ ID NO: 5:
GTGAGCGAGAAAGGCGCACCCAAGGGAAGGCAGCGGCTGAAGGAGATCGGCGC GCTTCTGTTCCACGCGCCTCGCAGCTTGGGCCATCTGGGCGCGCGCGGCCCCAAG GACGGTCCTCCGGTGATGGTCATCCCGGGATTCCTCGCGCACGACTTGCATACGA CGCAGTTGCGCCGGGCGCTCGCGAAGGCAGGCTTCCGAGTGCATCCGTGGCGGC AGGGGATGAACCTTGGAGCGCGCGCCGATACGCTCGAAATTCTGAAGCGCGCGG TGGATTCCTGCGGCTCGAGCGAGCCGATGCTGCTCGTCGGCTGGAGCCTGGGCGG TCTCTATGCCCGGGAGATCGCGCGTGCGGAGCCGGACCGGGTGCGGGCGGTGGT GACGATGGGATCGCCGGTGTGGGGCGACCGCAGGCGCTACACCAACGTGTGGAA GCTGTACGAACGGATTGCCGGCCATCCGGTCGACAAGCCGCCGATCCCGGACAA GAGCC AGAAGCCGCCGGT GCCG ACTCTGGCTTT GT GGTCGC AGCAT GAT GGCAT C GTCGGCGCGCCCTCGGCGAGAGGGACGAAGAAGACCCGCGACAAGGCGGTCGC CATCGACACGACTCACATGGGGTTTGCCATGTCGCCCAAGACGACGCGCGCGGC
AGTGCGTGAGATCGTGGGCTTTTTGAATGAAGTCGAAGGCGGTTCGTCACCCCGG GCGTGA
SEQ ID NO: 6 (codificada por SEQ ID NO: 5):
MSEKGAPKGRQRLKEIGALLFHAPRSLGHLGARGPKDGPPVMVTPGFLAHDLHTTQL RRALAKAGFRVHPWRQGMNLGARADTLEILKRAVDSCGSSEPMLLVGWSLGGLYA REIARAEPDRVRAVVTMGSPVWGDRRRYTNVWKLYERJAGHPVDKPPIPDKSQKPP VPTLALWSQHDGIVGAPSARGTKKTRDKAVAIDTTHMGFAMSPKTTRAAVRETVGF LNEVEGGSSPRA
SEQ ID NO: 7:
ATGAGGCTGCGCGAGGGGGGCGCGCTCGTATCGCGGGCCTATCGCGCCTTCGGG CGCCTCGGCGAGCGCGGCCCGGCGGACGGGCCGCCGCTGATGGTGATCCCGGGC TTCCTCGCCACCGATCGCACCACTTTGGGGCTGCAGCGGGCGCTGGCCAAGGGCG GCTACAAGGTGACCGGATGGGGCATGGGCCTCAACAGCGGCGTCACCGAAGACA T AGTCGACCGC ATCGCCGCTCGGGTCG A A AGGTTTGGA GCCGGC CGC A A AGTG A TCCTCGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGACTCTACGCGCGCGTGGTCGCGCAGGAGC GGCCGGATCTCGTCGACAAGGTGGTCACGCTCGGCTCGCCCTTTTCGGGCGACAG GCGCCGCAACAACAATGTCTGGCGGCTCTACGAGTTCGTC GCCGGCCATCCGGTCAACAGCCCGCCGATCGACAAGGACCCCGAGGTGAAGCCG CCGGTGCCGACGCTCGCTATCTGGTCGCGGCGCGACGGCATCGTCTCTCCGGCGG GCGCGCGCGGGCGGGAGGGAGAGCGCGACGCCGAGCTCGAGCTCGACTGCAGC CACATGGGCTTTGCGGTCAGCGCCAGGGCTTATCCCAAGATCGTGGAGGCGGTG CGGGCGTTTCCGGAAAACATCCGTTCGCGCTGA
SEQ ID NO: 8 (codificada por SEQ ID NO: 7):
MRLREGGALVSRAYRAFGRLGERGPADGPPLMVIPGFLATDRTTLGLQRALAKGGY KVTGWGMGLNSGVTEDIVDRIAARVERFGAGRKVILVGWSLGGLYARVVAQERPD LVDKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEFVAGHPVNSPP1DKDPEVKPPVPTLAIWSR RDGIVSPAGARGREGERDAELELDCSHMGFAVSARAYPKIVEAVRAFPENIRSR
SEQ ID NO: 9:
ATGAAGCCGCCGCCCGGATGGATGAAGATCCGGGAGGCGGGCTCGCTCCTCGCG CGCTTCTACCGCGCGTTCGGCAAGCTCGAGCCGCGCGGGCCGGCGGACGGGCCG AAGCTGAT GGTGATCC CGGGTTT COT CGCGGGCGACAGGACGACGCTCGGGCTG CAGCGAGCGCTGGCCGGCGGCGGCTACCGGGTCGCCGGCTGGGGGCTGGGGGTG AACCGCGGCGTTTCGGAGGACGTGGTCGACCGGATCGGCCAGCAAGTCGCGCGG TTCGGGGCGGGCGAGAAGGTGATCCTGGTCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCGCGCGTGGTGGCGCAGGAGCGGCCCGACCTCGTCGAGAAGGTGGTGACCTTG GGCTCGCCGTTTTCGGGCGACCGGCGGCGCAACAACAATGTGTGGCGGCTCTATG AGTGGGTGGCTGGGCATCCGGTGAACGATCCGCCGATCGACAAGGACCCGGCGA AGAAGCCCCCGGTGCCGACGCTCGCGATCTGGTCGCGGCGTGATGGGATCGTGG CGGTCGAAGGCGCGCGGGGGCGGCCGGAGGAGCGGGATGCCGAGCTGGAGATC GATTGC AGCCACATGGGGTTT GGGGTCAGCGGCAAGGCGTTTCCCCGAAT CGT A GAGGCGGTGAAGGGGTTCTAA
SEQ ID NO: 10 (codificada por SEQ ID NO: 9):
MRPPPGWMKiREAGSLLARFYRAFGKLEPRGPADGPKLMVlPGFLAGDRTTLGLQR ALAGGGYRVAGWGLGVNRGVSEDVVDRIGQQVARFGAGEKVILVGWSLGGLYAR
VVAQERPDLVEKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEWVAGHPVNDPPIDKDPAKKPP VPTLA1WSRRDG1VAVEGARGRPEERDAELE1DCSHMGFGVSGKAFPRIVEAVKGF
SE ID NO: 11:
GTGTTGGTGCTGCCGGCGTTCCTCGCCAACGACCTTCCCACTTCGCTTCTCCGCAG GACGCTGAAGGCGAACGGGTTTCGCCCGTTCGGCTGGGCGAACGGTTTCAACTTA GGTGCACGGCCGGACACGCTCCAGCGCCTGAGCGCACGGCTCGATGCGGTGGTT CAGGAAGCGGGCAGGCCGGTTGCATTGATCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCCCGAGAGCTGGCGAAACGCAGGTCGGCTGAGGTGTCGGCAGTGATCACGCTC GGCACGCCCTTCTCGGTTGACCTCAGACGCAACAACGCCTGGAAGCTGTACGAG CTCATCAACGATCATCCTGTCGATGCCCCTCCCTTGGATGTTCAGGTCGACGCGA AGCCACCCGTCCGAACCTTCGCTTTGTGGTCGCGTCGCGACGGGATCGTAGCGCC CGCGAGCGCGCACGGCATGGAGGGCGAGTTCGACCAGGCGATCGAGCTGCAGTG CACGCACAACGAGATGGTCAGTGATCCGGAGGCCCTCTCCACGATCGTTACCTTG CTGCGGGAAAATGTTGGCTCCTGA
SEQ ID NO: 12 (codificada por SEQ ID NO: 11):
MLVLPAFLANDLPTSLLRRTLKANGFRPFGWANGFNLGARPDTLQRLSARLDAVVQ EAGRPVALIGWSLGGLYARELAKRRSAEVSAVITLGTPFSVDLRRNNAWKLYELIND HPVDAPPLDVQVDAKPPVRTFALWSRRDGIVAPASAHGMEGEFDQAIELQCTHNEM VS DP EAL STIVTLLRENVGS
SEQ ID NO: 13:
GTGAATACAGCCGACCTATTGAAGCCACCACCCGCAAGCATGACAGTTCTCGAG GCGAGAGCGCTGCTGGACATATGCAAGATGAGCGCCCCATTGGCGCGCTTGCTA TTCAAAAAGAACTCGCCCTGGCGCAAACAACGGGTTCTCGTAATACCTGGCTTTG GCGCTGATGATCGCTACACCTGGCCGTTGCGCAATTTCGTCCAGGCACAGGGCTA TGCCACGACTGGCTGGGGCCTGGGCACCAACAAGGCAGGTCTCAATATGCCGCA TCAACTATCCGACGTCCACCCCAGATGGAAGCTAAAACCCAAGACGCCGTACCG TGGTGAGGCGGGCGTACCTTACGTGATTGACCGCTTGATCGAACGGTTTGACGAA TTGGCATCGACGGATCCGCAACCCATCGCACTTATAGGTTGGAGTCTGGGTGGTT TCATGGCCCGTGAAGTTGCCCGAGAGCGCCCAAACCAGGTGAGTCAGGTTATTA CCCTCGGTTCTCCTGTCATCGGAGGCCCAAAATACACCCTCGCTGCATCGGCTTT CATCCGGCGCAAATACGATTTGGACTGGGTGGAGCAAGTGATCGCGGAGCGGGA AGATCGCCCCATTACTGTTCCTATTACAGCAATAGTCAGCCAGTCTGATGGCATC GTCGGATATTCAGCGGCAATCGATCACCACAGTCCC'GCTGTGCAGCATTTACATA TGGATGTTGCCCATTTGGGCTTTCCTTACAACACGAGGGTTTGGTCAGAAATCGC C AAT G CGCTCAACTCTTTAG AGGTGG AG AAGG AGCGT GTTT AG
SEQ ID NO: 14 (codificada por SEQ ID NO: 13):
MNTADLLKPPPASMTVLEARALLDICKMSAPLARLLFKKNSPWRKQRVLVIPGFGA DDRYTWPLRNFVQAQGYATTGWGLGTNKAGLNMPHQLSDVHPRWKLKPKTPYRG EAGVPYV1DRLIERFDELASTDPQPIALTGWSLGGFMAREVARERPNQVSQVITLGSPV IGGPKYTLAASAFIRRKYDLDWVEQVIAEREDRPITVPITAIVSQSDGIVGYSAAIDHH SPAVQHLHMDVAHLGFPYNTRVWSETANALNSLEVEKERV
SEQ ID NO: 15:
ATGGAGCTCGCCAAGGTCACCGCCCTGATGAAGGCCACCGCCCTCGAGATCGCG ATCCTC'ACCGGCCACCTCGTCCTCTACCCCTCCGGGATCGTGGCCGAGCGCCTCG
CGGCCGCCCCCTCTTCACCGTCCTCCCCGTCCGCGGGCCCGACGGGCCGACGTCC GGTCGTCCTGCTGCACGGTTTCGTGGACAACCGCTCGGTCTTCGTCCTGCTGCGC CGTGCCCT C ACCCGG AGCGGCCGTG ACT GCGT CG AGTCGCT C A ACT ACT CGCC GC TCACCTGCGACCTGCGGGCCGCCGCCGAACTGCTGGGGCGCCGGGTGGACGAGA TCCGCGCCCGGACCGGACACGCCGAGGTCGACATCGTCGGCCACAGCCTGGGCG GGCTCATCGCCCGTTATTACGTACAGCGTCTCGGCGGTGACAGCCGGGTGCGCAC CCTGGTCATGCTCGGCACCCCGCACTCCGGCACCACCGTGGCCCGGCTCGCCGAC GCGCATC'CGCTGGTGCGGCAGATGCGGCCGGGTTCGGAGGTGCTGCGGGAGCTC GCCGCGCCCTCGCCCGGCTGCCGTACCCGGTTCGTGAGCTTCTGGAGCGACCTC GACCAGGTGATGGTGCCGGTGGACACGGCCTGCCTGGACCACCCCGACCTGCTG GTGCACAACGTCCGGGTCAGCGGGATCGGTCATCTCGCGCTGCCGGTCCATCCCA CGGTGGCGGCCGGGGTCCGGGAGGCCCTCGACGCGAGCGGCGCGGGGGTCCCGG GGGTGCGGGAGGAGGGGCCCGGCGCCGGCGCCGTGGCGTGA
SEQ ID NO: 16 (codificada por SEQ ID NO: 15):
MELAKVTALMKATALEIAILTGHLVLYPSGIVAERLAAAPSSPSSPSAGPTGRRPW L LHGFVDNRSVFVLLRRALTRSGRDCVESLNYSPLTCDLRAAAELLGRRVDEIRARTG HAEVDIVGHSLGGLIARYYVQRLGGDSRVRTLVMLGTPHSGTTVARLADAHPLVRQ MRPGSEVLRELAAPSPGCRTRFVSFWSDLDQVMVPVDTACLDHPDLLVHNVRVSGI GHLALPVHPTVAAGVREALDASGAGVPGVREEGPGAGAVA
SEQ ID NO: 17:
GTGGCCGCCGCGGACAGCGGGACGGCGGAAGGGCAAAGGCTTCGGCCGCCGAG
CCTGTTCCTGATGCTGGCCGAGGCGAGGGGCTTGCTCGAACTGAACTCGAGCCTG TTGTTGTCGCCGCTGTTGTTGCGGGCGCCGAAGGGCGACGGACATCCGGTGCTGG CGCTGCCGGGCTTTCTCGCCAGCGATCTGTCGATGGCGCCGATGCGGCGCTATCT GAAAGAACTCGGCTACGATGCCCATGCGTGGAACATGGGCCGCAATCTCGGCGG CGTCGCGTCCAAGCGCGAAGCCTTGCGCGACCTGTTGCGGCGCATTTACAGCCAG ACGGGCCGCAAGGTCAGCCTGGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGC GATCTCGCTTTGCAGGCGCCCGACATGGTGCGTTCCGTGATCACGCTCGGCAGTC CGTTTGCCAGCGACATCAGGGCGACCAACGCCACGCGGCTCTACGAGGCGCTGT CGGGAGAAAGGGTCGACGACAATCCGGAGTTAACAGCGGCGATCGCCGGCGACC T GCCGGT GCCGGCGACCTCGATCTATTCCCGT ACCGACGGT AT CGT GAACTGGC A CACCAGCCTGCTGCGTCCTTCCGCAACGGCTGAAAACATCGAGGTTTACTTCGCC AGCCATATCGGGCTCGGCGTCAACCCGGCAGCGCTGTGGGCGGTGGCCGACCGC CTGGCGCAGCCCGAGGGGGAATTTAAGCATTTTGACCGGTCGGGTCCCTTTGCCA TTGCCTATGGCCCCCCTGAAAATGCACAATCCTGA
SEQ ID NO: 18 (codificada por SEQ ID NO: 17):
MAAADSGTAEGQRLRPPSLFLMLAEARGLLELNSSLLLSPLLLRAPKGDGHPVLALP GFLASDLSMAPMRRYLKELGYDAHAWNMGRNLGGVASKREALRDLLRRIYSQTGR KVSLVGWSLGGVYARDLALQAPDMVRSVITLGSPFASDIRATNATRLYEALSGERV DDNPELTAA1AGDLPVPATSIYSRTDGIVNWHTSLLRPSATAENIEVYFASHIGLGVNP
AALWAVADRLAQPEGEFKHFDRSGPFAIAYGPPENAQS
SEQ ID NO: 19:
ATGCCGGAGCGAAACGAAGCGCAGGCCCCGCCGCGTCTTCGTCCGCCGGGGCTC GGGCTGTTCCTCGCCGAAGCGCGGGGCATTTTCGAGCTCAACGCGAGCCTGTTGC
TGTCGCCGCTTCTGTTGCGCGCGCCGCGCGGCGACGGCCATCCGGTGCTGGCGTT GCCGGGCTTTCTTGCCAGTGATCTATCGATGGCGCCGTTGCGCCGCTACCTCACC GAGCTCGGCTACGACACCCACGCCTGGCGCATGGGCCGCAATGTCGGCGGCATC GCGAAGATGCGGATCGCGCTGCTCGAGCGGCTCACGCAGATCCATGCCGAGTGC GGCCGCAAGGTCTCGATTGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGCGACC TCGCGTTGCAGGCGCCCGAGATGGTGCGCTACGTCGTCACCCTCGGCAGCCCCTT CGCCAGCGACGTCCGCGCCACCAATGCGACGCGGCTCTATGAGGCGATGTCGGG CGAAACGGTCGGCGACAATGTCGACCTCGTGCAGGCGATTGCCGGCGACCTGCC GGTTCCCGTGACCTCGATCTATTCGAAGAGCGACGGCATCGTGAACTGGCGGACC TGCCTGCTGCGCCCGTCCGCGACCGCCGAGAATATCGAGGTCTATTTCGCGAGCC ATGTCGGCATCGGCGTCAATCCGGCCGCGCTGTGGGCGATCGCGGACCGGCTGG CCCAGCGGGAAGGCGAATTCCGCCCCTTCGACCGGTCCGGTCCTTTTGCCATTGC CTACGCGCCCCCGGAACAGGCACAATCGATCTGA
SEQ ID NO: 20 codificada por SEQ ID NO: 19):
MPERNEAQAPPRLRPPGLGLFLAEARGIFELNASLLLSPLLLRAPRGDGHPVLALPGF LASDLSMAPLRRYLTELGYDTHAWRMGRNVGGIAKMRIALLERLTQIHAECGRKVS TVGW SLGGVYARDLALQAPEMVRYWTLGSPFASDVRATNATRLYEAMSGETVGD NVDLVQAIAGDLPVPVTSIYSKSDGIVNWRTCLLRPSATAENIEVYFASHVGIGVNPA ALWAIADRLAQREGEFRPFDRSGPFAIAYAPPEQAQSI
Se proporcionan en la presente memoria metodos para descubrir nuevas secuencias de hidrolasa usando los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria. Tambien se proporcionan metodos para modificar los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria mediante, p. ej., las tecnologfas GSSMsm y GeneReassemblySM. Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se pueden preparar, aislar y/o manipular mediante, p. ej., clonacion y expresion de bibliotecas de ADNc, amplificacion de ADN mensajero o genomico por PCR, y similares.
La fuente inicial de polipeptidos y acidos nucleicos de ejemplo seleccionados son:
Figure imgf000025_0001
En la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria, se pueden modificar genes homologos por manipulacion del acido nucleico molde, como se describe en la presente memoria. La materia objeto reivindicada se puede poner en practica junto con cualquier metodo o protocolo o dispositivo conocido en la tecnica, que estan bien descritos en la bibliograffa cientifica y de patentes.
Tecnicas generales
Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos que incluyen ARN, ARNi (p. ej., ARNip, ARNim), acido nucleico de sentido contrario, ADNc, ADN genomico, vectores, virus o sus tnbridos, acidos nucleicos aislados de una variedad de fuentes, modificados geneticamente, amplificados y/o expresados/generados de forma recombinante. Los polipeptidos recombinantes generados a partir de estos acidos nucleicos se pueden aislar individualmente o clonar y ensayar una actividad deseada (p. ej., hidrolasa, tal como, p. ej., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa). Se puede usar cualquier sistema de expresion recombinante, incluyendo sistemas de expresion de celula bacteriana, de mairnfero, levadura, insecto o planta.
Alternativamente, estos acidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro por tecnicas de smtesis qmmica bien conocidas, como se describe en, p. ej., Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886­ 7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett.
22:1859; patente de EE.UU. n° 4.458.066.
Las tecnicas para la manipulacion de acidos nucleicos, tales como, p. ej., subclonacion, sondas de marcaje (p. ej., marcaje de cebador aleatorio usando polimerasa Klenow, traslado de corte, amplificacion), secuenciacion, hibridacion y similares, estan bien descritas en la bibliograffa cientffica y de patentes, vease, p. ej., p. ej., Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Otro medio util de obtencion y manipulacion de acido nucleicos usado para la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria, es clonar a partir de muestras genomicas y, si se desea cribar y volver a clonar insertos aislados o amplificados, p. ej. de clones genomicos o clones de ADNc. Las fuentes de acido nucleico usadas en los metodos como se proporcionan en la presente memoria incluyen bibliotecas genomicas o de ADNc contenido, p. ej., en cromosomas artificiales de marnffero (MAC), vease, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 5.721.118; 6.025.155; cromosomas artificiales humanos, vease, p. ej., Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; cromosomas artificiales de levadura (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC); cromosomas artificiales P1, vease, p. ej., Woon (1998) Genomics 50:306-316; vectores derivados de P1 (PAC), vease, p. ej., Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; cosmidos, virus recombinantes, fagos o plasmidos.
Las frases "acido nucleico" o "secuencia de acido nucleico" pueden incluir un oligonucleotido, nucleotido, polinucleotido o un fragmento de cualquiera de estos, ADN o ARN (p. ej., ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genomico o sintetico, que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una cadena paralela o antisentido, un acido nucleico peptfdico (PNA), o cualquier material similar al ADN o similar al ARN, de origen natural o sintetico, incluyendo, p. ej., ARNi (ARN "interferente" bicatenario), ribonucleoprotemas (p. ej., iRNP). El termino abarca acidos nucleicos, es decir, oligonucleotidos, que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales. El termino tambien abarca estructuras similares a acidos nucleicos con cadenas principales sinteticas, vease, p. ej., Mata (1997) Toxicol. Apl. Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156.
Como se usa en la presente memoria, el termino "promotor" incluye todas las secuencias capaces de conducir la transcripcion de una secuencia codificante en una celula, p. ej., una celula de planta. Por lo tanto, los promotores usados en las construcciones como se proporcionan en la presente memoria incluyen elementos de control de la transcripcion que actuan en cis y secuencias reguladoras que estan implicadas en la regulacion o modulacion del tiempo y/o velocidad de transcripcion de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripcion que actua en cis, que incluye un potenciador, un promotor, un terminador de transcripcion, un origen de replicacion, una secuencia de integracion cromosomica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intronica, que estan implicados en la regulacion transcripcional. Estas secuencias que actuan en cis tipicamente interaccionan con protemas u otras biomoleculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripcion. Los promotores "constitutivos" son los que dirigen la expresion continuamente en la mayona de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciacion celular. Los promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresion del acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripcion por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobicas, temperatura elevada, seqrna o la presencia de luz.
Los promotores "espedficos de tejido" son elementos de control de la transcripcion que solo son activos en celulas o tejidos u organos particulares, p. ej., en plantas o animales. La regulacion espedfica de tejido se puede lograr mediante ciertos factores intrmsecos que aseguran que los genes que codifican protemas espedficas de un tejido dado son expresados. Se sabe que dichos factores existen en mamferos y plantas para permitir el desarrollo de tejidos espedficos.
El termino "planta" incluye plantas enteras, partes de plantas (p. ej., hojas, tallos, flores, rames, etc.), protoplastos de plantas, semillas y celulas de plantas y la progenie de las mismas. La clase de plantas que se pude usar en el metodo como se proporciona en la presente memoria es en general tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles de tecnicas de transformacion, que incluyen las angiospermas (plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas), asf como las gimnospermas. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidia, incluyendo estados poliploides, diploides, haploides y hemocigotos. Como se usa en la presente memoria, la expresion "planta transgenica" incluye plantas o celulas vegetales en las que se ha insertado una secuencia de acido nucleico heterologa, p. ej., los acidos nucleicos y varias construcciones recombinantes (p. ej., casetes de expresion) como se proporcionan en la presente memoria.
Un acido nucleico que codifica un polipeptido como se proporcionan en la presente memoria, se ensambla en una fase adecuada con una secuencia ftder capaz de dirigir la secrecion del polipeptido traducido o su fragmento.
Se describen en la presente memoria protemas de fusion y acidos nucleicos que las codifican. Un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, se puede fusionar con un peptido o polipeptido heterologo, tal como peptidos de identificacion N-terminal que imparten caractensticas deseadas, tales como mayor estabilidad o purificacion simplificada. Los peptidos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria, tambien se pueden sintetizar y expresar como protemas de fusion con uno o mas dominios adicionales unidos a los mismos, p. ej., para producir un peptido mas inmunogeno, para aislar mas facilmente un peptido sintetizado de forma recombinante, para identificar y aislar anticuerpos y linfocitos B que expresan anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la deteccion y purificacion incluyen, p. ej., peptidos queladores de metales tales como tramos de polihistidina y modulos de histidina-triptofano que permiten la purificacion con metales inmovilizados, dominios de protema A que permiten la purificacion con inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio usado en el sistema de purificacion por extension/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). La inclusion de una secuencia conectora escindible tales como Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificacion y el peptido o polipeptido que comprenden el motivo, puede facilitar la purificacion. Por ejemplo, un vector de expresion puede incluir una secuencia de acido nucleico que codifica el epftopo conectada a seis restos de histidina seguido de un sitio de escision por una tiorredoxina y una enteroquinasa (vease p. ej., Williams (1995) Biochemistry 34:1787­ 1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Los restos de histidina facilitan la deteccion y purificacion, mientras que el sitio de escision de enteroquinasa proporciona un medio para la purificacion del epftopo del resto de la protema de fusion. La tecnologfa relativa a los vectores que codifican protemas de fusion y la aplicacion de las protemas de fusion estan bien descritas en la bibliograffa cientffica y de patentes, vease, p. ej., Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.
Secuencias de control de la transcripcion y traduccion
Se proporcionan en la presente memoria secuencias de acido nucleico (p. ej., ADN, ARNi) operativamente unidas a secuencia(s) de control de la expresion (p. ej., transcripcion o traduccion), p. ej., promotores o potenciadores, para dirigir o modular la smtesis/expresion de ARN. La secuencia de control de la expresion puede estar en un vector de expresion. Los promotores bacterianos de ejemplo incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotas de ejemplo incluyen el temprano inmediato de CMV, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardfo, LTR de retrovirus, y metalotionema de raton.
Los promotores adecuados para expresar un polipeptido en bacterias incluyen promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacl, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda Pr , el promotor lambda PL, promotores de operones que codifican enzimas glucolfticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), y el promotor de la fosfatasa acida. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV, promotores de choque termico, el promotor temprano y tardrn de SV40, LTR de retrovirus, y el promotor de metalotioneina-l de raton. Tambien se pueden usar otros promotores conocidos para el control de la expresion de genes en celulas procariotas o eucariotas o sus virus.
Promotores de plantas espedficos de tejido
Se proporcionan en la presente memoria casetes de expresion que se pueden expresar de una manera espedfica de tejido, p. ej., que puede expresar una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, de una manera espedfica de tejido. Se proporcionan tambien en la presente memoria plantas o semillas que expresan una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria de una manera espedfica para el tejido. La especificidad de tejido puede ser espedfica de semilla, espedfica de tallo, espedfica de hoja, espedfica de rafz, espedfica de la fruta y similares.
Se puede usar un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S para la expresion en partes espedficas de la planta o semilla o en toda la planta. Por ejemplo, para la sobreexpresion de una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, se puede usar un fragmento de promotor de planta que dirigira la expresion de un acido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, p. ej., una planta regenerada. Dichos promotores "constitutivos" son activos en la mayona de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciacion celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la region de inicio de la transcripcion 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' o 2' derivado de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de inicio de la transcripcion de diferentes genes de plantas conocidos por los expertos. Dichos genes incluyen, p. ej., ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank N° U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); el gen que codifica la protema transportadora de estearoilo-acilo desaturasa de Brassica napus (Genbank N° X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176); GPc1 de mafz (GenBank N° X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208: 551-565); el Gpc2 de mafz (GenBank N° U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); promotores de plantas descritos en las patentes de EE.UU. n° 4.962.028; 5.633.440.
Se proporcionan en la presente memoria promotores constitutivos o espedficos de tejido derivados de virus que pueden incluir, p. ej., el promotor subgenomico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679­ 1683; el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV), que se multiplica solo en celulas de floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que dirige la expresion fuerte del gen indicador espedfico de floema; el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CVMV), con la mayor actividad en elementos vasculares, en celulas de mesofila de la hoja, y en las puntas de las rafces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139).
Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresion de un acido nucleico que expresa hidrolasa en un tejido, organo o tipo celular espedfico (es decir, promotores espedficos de tejido) o por otra parte puede estar bajo un control ambiental o de desarrollo mas preciso o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripcion incluyen condiciones anaerobicas, temperatura elevada, la presencia de luz o pulverizacion con productos qmmicos/hormonas. En la presente memoria se proporcionan promotores de mafz inducibles por seqrna (Busk (1997) vease antes); el promotor inducible por frio, seqrna y alta salinidad de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897909).
Los promotores espedficos de tejido pueden promover la transcripcion solo dentro de un determinado marco de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Vease, p. ej., Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Vease tambien Cardon (1997) Plant J 12:367-77, que describe el factor de transcripcion SPL3, que reconoce un motivo de secuencia conservada en la region promotora del gen AP1 de identidad de meristemo floral de A. Thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, vol. 29, pag.
995-1004, que describe el promotor de meristemo eIF4. Se pueden usar promotores espedficos de tejido que son activos a lo largo de todo el ciclo de vida de un tejido particular. Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria estan operativamente unidos a un promotor activo principalmente solo en celulas de fibra de algodon. Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria estan operativamente unidos a un promotor activo principalmente durante las etapas de elongacion celular de la fibra de algodon, p. ej., como describe Rinehart (1996), vease antes. Los acidos nucleicos pueden estar operativamente unidos al promotor del gen Fbl2A para ser expresados con preferencia en celulas de fibra de algodon (Ibid.). Vease tambien, John (1997) Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 5769-5773; John, et al., patentes de EE.UU. N° 5.608.148 y 5.602.321, que describen promotores espedficos de fibra de algodon y metodos para la construccion de plantas de algodon transgenicas. Tambien se pueden usar promotores espedficos de rafz para expresar los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria. Los ejemplos de promotores espedficos de rafz incluyen el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60). Otros promotores que se pueden usar para expresar los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria incluyen, p. ej., promotores espedficos de ovulo, espedficos de embrion, espedficos de endospermo, espedficos de integumento, espedficos de la cubierta de la semilla, o alguna combinacion de los mismos; un promotor espedfico de hoja (vease, p. ej., Busk (1997) Plant J. 11: 1285 1295, que describe un promotor espedfico de la hoja en el mafz); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que presenta una alta actividad en las rafces, vease, p. ej., Hansen (1997), vease antes); un promotor espedfico de polen de mafz (vease, p. ej., Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168); se puede usar un promotor de tomate activo durante la maduracion de la fruta, senescencia y abscision de las hojas y, en menor medida, de las flores (vease, p. ej., Blume (1997) Plant J. 12:731 746); un promotor espedfico del pistilo del gen SK2 de la patata (vease, p. ej., Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425431); el gen Blec4 del guisante, que es activo en el tejido epidermico de los apices de brotes vegetativos y florales de alfalfa transgenica, lo que lo convierte en una herramienta util para dirigir la expresion de genes extranos a la capa epidermica de brotes o fibras en crecimiento activo; el gen BEL1 espedfico del ovulo (vease, p. ej., Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank N° U39944); y/o, el promotor en Klee, patente de Estados Unidos N° 5.589.583, que describe una region de promotor de plantas que es capaz de conferir niveles altos de transcripcion en tejido meristematico y/o celulas que se dividen rapidamente. Alternativamente, los promotores de plantas que son inducibles tras exposicion a hormonas de plantas, tales como auxinas, se usan para expresar los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan promotores que comprenden el fragmento del promotor E1 de elementos de respuesta a auxina (AuxRE) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); el promotor GsT6 de Arabidopsis sensible a la auxina (que tambien es sensible al acido salidlico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10 955-966); el promotor de parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913); un elemento de respuesta de biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y, el promotor sensible a la hormona del estres acido absdsico (Sheen (1996) Science 274:1900-1902).
Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden unirse operativamente a promotores de plantas que son inducibles tras la exposicion a reactivos qmmicos que se pueden aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibioticos. Por ejemplo, se puede usar el promotor In2-2 de mafz, activado por protectores del herbicida de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicacion de diferentes protectores de herbicidas induce distintos patrones de expresion genica, que incluyen la expresion en la rafz, hidatodos y el meristema apical del brote. Las secuencias codificantes pueden estar bajo el control de, p. ej., un promotor inducible por tetraciclina, p. ej., como se describe con plantas de tabaco transgenicas que contienen el gen de arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o, un elemento sensible al acido salidlico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324). Usando promotores inducidos qmmicamente (p. ej., hormonas o pesticidas), es decir, un promotor sensible a un producto qmmico que se puede aplicar a la planta transgenica en el campo, se puede inducir la expresion de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria en una etapa particular de desarrollo de la planta. En la presente memoria se proporcionan plantas transgenicas que contienen un gen inducible que codifica polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria cuya variedad de hospedantes se limita a especies de plantas objetivo, tales como mafz, arroz, cebada, trigo, patata u otros cultivos, inducible en cualquier etapa del desarrollo del cultivo.
Los promotores de plantas espedficos de tejido pueden dirigir la expresion de secuencias operativamente unidas en tejidos distintos del tejido objetivo. Por lo tanto, un promotor espedfico de tejido es uno que dirige la expresion con preferencia en el tejido o tipo de celula objetivo, pero tambien puede dirigir a cierta expresion en otros tejidos.
Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden unirse operativamente a promotores de plantas que son inducibles tras la exposicion a reactivos qmmicos. Estos reactivos incluyen, p. ej., herbicidas, auxinas sinteticas o antibioticos que se pueden aplicar, p. ej., pulverizados, sobre plantas transgenicas. La expresion inducible de los acidos nucleicos productores de hidrolasa como se proporcionan en la presente memoria permitira al productor seleccionar plantas con la proporcion optima de almidon:azucar. Asf se puede controlar el desarrollo de las partes de la planta.
En la presente memoria se proporcionan medios para facilitar la recoleccion de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, se pude usar el promotor In2-2 del mafz, activado por los protectores de herbicidas de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicacion de diferentes protectores de herbicidas induce distintos patrones de expresion genica, que incluye expresion en la rafz, hidatodos y meristema apical del brote. Las secuencias codificantes como se proporcionan en la presente memoria tambien estan bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, p. ej., como se describe con las plantas de tabaco transgenicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento sensible al acido salidlico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324).
Si se desea la expresion adecuada del polipeptido, se debe incluir una region de poliadenilacion en el extremo 3' de la region codificante. La region de poliadenilacion puede derivar del gen natural, de una variedad de genes de otras plantas o de genes en el ADN-T de Agrobacterial.
Vectores de expresion y vedculos de clonacion.
Se proporcionan en la presente memoria vectores de expresion, casetes de expresion y vedculos de clonacion que comprenden acidos nucleicos, p. ej., secuencias que codifican las hidrolasas y anticuerpos. Los vectores de expresion y vedculos de clonacion como se proporcionan en la presente memoria comprenden padculas vmcas, baculovirus, fago, plasmidos, fagemidos, cosmidos, fosmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN vmco (p. ej., virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en P1, plasmidos de levaduras, cromosomas artificiales de levaduras, y cualesquiera otros vectores espedficos para hospedantes espedficos de interes (tales como bacilos, Aspergillus y levaduras). Los vectores como se proporcionan en la presente memoria pueden incluir secuencias de a Dn cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas. Los expertos en la tecnica conocen un gran numero de vectores adecuados, y estan disponibles en el mercado. Los vectores de ejemplo incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plasmidos pBLUESCRIPT™, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRlT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro plasmido u otro vector con la condicion de que se puedan replicar y sean viables en el hospedante. Se pueden usar vectores de numero de copias bajo o numero de copias alto.
Un “casete de expresion” como se proporciona en la presente memoria, comprende una secuencia de nucleotidos que es capaz de afectar a la expresion de un gen estructural (es decir, una secuencia codificante de protema, tal como una hidrolasa como se proporcionan en la presente memoria) en un hospedante compatible con dichas secuencias. El casete de expresion incluye al menos un promotor operativamente unido con la secuencia codificante del polipeptido; y, opcionalmente con otras secuencias, p. ej., senales de terminacion de la transcripcion. Tambien se pueden usar factores adicionales necesarios o utiles para realizar la expresion, p. ej., potenciadores. “Operativamente unido” como se usa en la presente memoria, se refiere a la union de un promotor en la direccion 5' de una secuencia de ADN de modo que el promotor media la transcripcion de la secuencia de ADN. Por lo tanto, los casetes de expresion tambien incluyen plasmidos, vectores de expresion, virus recombinantes, cualquier forma de vector de “ADN desnudo” recombinante, y similares. Un "vector" comprende un acido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una celula. Se reconocera que un vector puede ser un acido nucleico desnudo, o un acido nucleico en complejo con protema o lfpido. El vector comprende opcionalmente acidos nucleicos vmcos o bacterianos y/o protemas y/o membranas (p. ej., una membrana celular, una envuelta lipfdica de virus, etc.). Los vectores incluyen, pero no se limitan a replicones (p. ej., replicones de ARN, bacteriofagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y ser replicados. Por lo tanto, los vectores incluyen, pero no se limitan a a Rn , ADN o ARN lineal o circular de autorreplicacion autonomo (p. ej., plasmidos, virus y similares, vease, p. ej., patente de EE.UU. n° 5.217.879), e incluye plasmidos tanto de expresion como no de expresion. Cuando se describe un microorganismo recombinante o cultivo celular como hospedante, un "vector de expresion" de este incluye tanto ADN lineal y circular extracromosomico como ADN que se ha incorporado en el(los) cromosomas del hospedante. Cuando un vector es mantenido por una celula hospedante, el vector puede ser replicado establemente por las celulas durante la mitosis como una estructura autonoma, o es incorporado dentro del genoma del hospedante. El vector de expresion puede comprender un promotor, un sitio de union al ribosoma para el inicio de la traduccion y un terminador de la transcripcion. El vector tambien puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresion. Los vectores de expresion de mairnferos pueden comprender un origen de replicacion, cualesquiera sitios de union al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilacion, sitios de donador y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminacion de la transcripcion, y secuencias no transcritas flanqueadoras 5'. Las secuencias de ADN pueden derivar de los sitios de corte y empalme y poliadenilacion de SV40 y se pueden usar para proporcionar los elementos geneticos no transcritos requeridos.
Los vectores de expresion pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables para permitir la seleccion de celulas hospedantes que contienen el vector. Dichos marcadores seleccionables incluyen genes que codifican la dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a la neomicina para cultivo de celulas eucariotas, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli y gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.
Los vectores para la expresion del polipeptido o fragmento del mismo en celulas eucariotas tambien pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresion. Los potenciadores son elementos que actuan en cis del ADN, normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pb de longitud que actuan en un promotor para aumentar su transcripcion. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardm del origen de replicacion de 100 a 270 pb, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardm del origen de replicacion, y los potenciadores de adenovirus.
Una secuencia de ADN se puede insertar en un vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga en la posicion deseada en el vector despues de digestion del inserto y el vector con las endonucleasas de restriccion adecuadas. Alternativamente, se pueden ligar extremos romos tanto en el inserto como en el vector. Se conocen una variedad de tecnicas de clonacion en la materia, p. ej., como se describe en Ausubel y Sambrook. Dichos procedimientos y otros se considera que estan dentro del alcance de los expertos en la tecnica.
El vector puede estar en forma de un plasmido, una partmula vmca o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas, derivados de SV40; plasmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plasmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fago, ADN vmco tal como de virus vaccinia, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Se describe una variedad de vectores de clonacion y expresion para usar con hospedantes procariotas y eucariotas, p. ej., en Sambrook.
Los vectores bacterianos particulares que se pueden usar incluyen plasmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos geneticos del vector de clonacion conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1tm (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 Pbluescript II KStM, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector con la condicion de que se pueda replicar y sea viable en la celula hospedante.
Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se pueden expresar en casetes de expresion, vectores o virus y se pueden expresar de forma transitoria o estable en celulas y semillas de plantas. Un ejemplo de sistema de expresion transitoria usa sistemas de expresion episomal, p. ej., ARN vmco del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) generado en el nucleo por transcripcion de un minicromosoma episomal que contiene ADN superenrollado, vease, p. ej., Covey (1990) Proc. Natl Acad Sci. USA 87:1633-1637. Alternativamente, las secuencias codificantes, es decir, todas o sub-fragmentos de secuencias como se proporcionan en la presente memoria se pueden insertar en el genoma de una celula hospedante de planta convirtiendose en una parte integral del ADN cromosomico del hospedante. Los transcritos de sentido paralelo o antisentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprende las secuencias (p. ej., promotores o regiones codificantes) de acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria, puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en una celula de planta o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, en particular resistencia a antibioticos, tal como resistencia a kanamicina, G4l8, bleomicina, higromicina o herbicida, tal como resistencia a clorosulfuron o Basta.
Los vectores de expresion capaces de expresar acidos nucleicos y protemas en plantas son bien conocidos en la tecnica, y pueden incluir, p. ej., vectores de Agrobacterium spp., virus X de patata (vease, p. ej., Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684), virus del mosaico del tabaco (vease, p. ej., Casper (1996) Gene 173:69-73), virus de la malformacion del arbusto del tomate (vease, p. ej., Hillman (1989) Virology 169:42-50), virus del grabado del tabaco (vease, p. ej., Dolja (1997) Virology 234:243-252), virus del mosaico dorado en judfa (vease, p. ej., Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476), virus del mosaico de la coliflor (vease, p. ej., Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transponible Ac/Ds del mafz (vease, p. ej., Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294­ 6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), y el elemento transponible supresor-mutador del mafz (Spm) (vease, p. ej., Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725); y sus derivados.
Alternativamente, el vector de expresion puede tener dos sistemas de replicacion para permitir que se mantenga en dos organismos, por ejemplo en celulas de mairnferos, levaduras, hongos o insectos para la expresion y en un hospedante procariota para la clonacion y amplificacion. Ademas, para integrar vectores de expresion, el vector de expresion puede contener al menos una secuencia homologa al genoma de la celula hospedante. Puede contener dos secuencias homologas que flanquean la construccion de expresion. El vector integrador se puede dirigir a un locus espedfico en la celula hospedante seleccionando la secuencia homologa adecuada para su inclusion en el vector. Los constructos para la integracion de vectores son bien conocidos en la tecnica.
Los vectores de expresion como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de cepas bacterianas que se han transformado, p. ej., genes que hacen que las bacterias sean resistentes a farmacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables tambien pueden incluir genes biosinteticos, como los de las rutas biosinteticas de histidina, triptofano y leucina.
Celulas hospedantes y celulas transformadas
Se proporcionan en la presente memoria celulas transformadas que comprenden una secuencia de acido nucleico, p. ej., una secuencia que codifica una hidrolasa o un anticuerpo, o un vector como se proporcionan en la presente memoria. La celula hospedante puede ser cualquiera de las celulas hospedantes conocidas para los expertos en la tecnica, incluyendo celulas procariotas, celulas eucariotas, tales como celulas bacterianas, celulas fungicas, celulas de levadura, celulas de mai^ero, celulas de insecto o celulas vegetales.
Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden expresar en cualquier celula hospedantes, p. ej., cualquier celula bacteriana, cualquier celula de levadura, cualquier Saccharomyces o Schizosaccharomyces spp., cualquier Pichia spp., p. ej., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Las celulas bacterianas de ejemplo incluyen cualquier Streptomyces o Bacillus spp., p. ej., E. coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, o cualquier especie dentro de los generos Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus. Las celulas de insecto de ejemplo incluyen Drosophila S2 y Spopoptera Sf9. Las celulas animales de ejemplo incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier lmea celular de raton o humana. La seleccion de un hospedante adecuado se basa en la capacidad de los expertos en la tecnica. Las tecnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la bibliograffa tecnica y cientffica. Vease, p. ej., Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, patente de Estados Unidos N° 5.750.870.
El vector se puede introducir en las celulas hospedantes usando cualquiera de una variedad de tecnicas, que incluyen transformacion, transfeccion, transduccion, infeccion vmca, pistolas genicas, o transferencia de genes mediada por Ti. Los metodos particulares incluyen transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-Dextrano, lipofeccion o electroporacion (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Cuando sea adecuado, las celulas hospedantes geneticamente modificadas se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados como sea adecuado para la activacion de promotores, seleccion de transformantes o amplificacion de genes como se proporcionan en la presente memoria. Despues de la transformacion de una cepa de hospedante adecuado y cultivo de la cepa de hospedante hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se puede inducir por medios adecuados (p. ej., cambio de temperatura o induccion qmmica) y las celulas se pueden cultivar durante un periodo adicional para permitir que produzcan el polipeptido deseado o fragmento del mismo.
Los acidos nucleicos o vectores como se proporcionan en la presente memoria se introducen en las celulas para el cribado, por lo tanto, los acidos nucleicos entran en las celulas de una manera adecuada para la expresion posterior del acido nucleico. El metodo de introduccion es dictado en gran medida por el tipo de celula objetivo. Los metodos de ejemplo incluyen la precipitacion con CaPO4, fusion de liposomas, lipofeccion (p. ej., LIPOFECTIN™), electroporacion, infeccion vffica, etc. Los acidos nucleicos candidatos se pueden integrar de manera estable en el genoma de la celula hospedante (por ejemplo, con introduccion retrovmca) o pueden existir de forma transitoria o estable en el citoplasma (es decir, mediante el uso de plasmidos tradicionales, usando secuencias reguladoras estandar, marcadores de seleccion, etc.). Alternativamente, se proporcionan vectores retrovmcos capaces de transfectar dichas dianas (p. ej., celulas de mairnferos, humanas) porque, p. ej., muchos cribados farmaceuticamente importantes requieren objetivos de celulas humanas o de mai^ero modelo.
Las celulas se pueden recoger por centrifugacion, alterar por medios ffsicos o qmmicos, y el extracto bruto resultante se retiene para la purificacion adicional. Las celulas microbianas usadas para la expresion de protemas se pueden alterar por cualquier metodo conveniente, que incluyen ciclos de congelacion-descongelacion, ultrasonidos, alteracion mecanica, o uso de agentes de lisis celular. Dichos metodos son bien conocidos para los expertos en la tecnica. El polipeptido expresado o fragmento del mismo se puede recuperar y purificar de los cultivos de celulas recombinantes por metodos que incluyen precipitacion con sulfato amonico o etanol, extraccion con acido, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa de fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxilapatito y cromatograffa de lecitina. Se pueden usar etapas de replegado de protemas s,egún sea necesario, para completar la configuracion del polipeptido. Si se desea, se puede usar cromatograffa ffquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificacion finales. Tambien se pueden usar diferentes sistemas de cultivos de celulas de mamffero para expresar la protema recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresion de marnfferos incluyen las lmeas COS-7 de fibroblastos de rinon de mono y otras lmeas celulares capaces de expresar protemas de un vector compatible, tales como las lmeas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.
Las construcciones en celulas hospedantes se pueden usar de una forma convencional para producir el producto genico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedante usado en el procedimiento de produccion recombinante, los polipeptidos producidos por las celulas hospedantes que contienen el vector se pueden glucosilar o pueden no glucosilarse. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden incluir o no un resto de aminoacido metionina inicial.
Los sistemas de traduccion sin celulas tambien se pueden usar para producir un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Los sistemas de traduccion sin celulas pueden usar ARNm transcritos a partir de una construccion de ADN que comprende un promotor operativamente unido a un acido nucleico que codifica el polipeptido o fragmento del mismo. La construccion de ADN se puede linearizar antes de llevar a cabo una reaccion de transcripcion in vitro. El ARNm transcrito despues se incuba con un extracto de traduccion sin celulas adecuado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipeptido deseado o fragmento del mismo.
Los vectores de expresion pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenoffpico para la seleccion de celulas hospedantes transformadas tales como resistencia a la dihidrofolato reductasa o noemicina para el cultivo de celulas eucariotas, o tal como resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli.
Amplificacion de acidos nucleicos
Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos que codifican los polipeptidos, o acidos nucleicos modificados, que se pueden reproducir, p. ej., por amplificacion. Se proporcionan en la presente memoria parejas de cebadores de amplificacion para amplificar acidos nucleicos que codifican una hidrolasa, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, donde las parejas de cebadores son capaces de amplificar secuencias de acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria. Un experto en la tecnica puede disenar parejas de secuencias de cebadores de amplificacion para cualquier parte de o la longitud total de estas secuencias.
Las reacciones de amplificacion tambien se pueden usar para cuantificar la cantidad de acido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), marcar el acido nucleico (p. ej., para aplicarlo a una matriz o una transferencia), detectar el acido nucleico, o cuantificar la cantidad de un acido nucleico espedfico en una muestra. Como se proporciona en la presente memoria, se amplifica el mensaje aislado de una celula o una biblioteca de ADNc. El experto en la tecnica puede seleccionar y disenar cebadores de amplificacion de oligonucleotidos adecuados. Los metodos de amplificacion tambien son bien conocidos en la tecnica e incluyen, p. ej., la reaccion en cadena de la polimerasa, PCR (ver, p. ej., PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y pCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (vease, p. ej., Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificacion de la transcripcion (vease, p. ej., Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); y, replicacion de secuencia autosostenida (vease, p. ej., Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificacion de replicasa Q Beta (vease, p. ej., Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477­ 1491), ensayo automatizado de amplificacion de replicasa Q-beta (vease, p. ej., Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras tecnicas mediadas por la ARN polimerasa (p. ej., NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); vease tambien Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patentes de EE.UU. n° 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.
Se proporcionan en la presente memoria parejas de cebadores de amplificacion, que comprenden secuencias como se proporcionan en la presente memoria, por ejemplo, en donde la pareja de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se expone por aproximadamente los primeros (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o mas restos de un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se expone por aproximadamente los primeros (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o mas restos de la cadena complementaria del primer miembro.
Determinacion del grado de identidad de secuencia
En la presente memoria se proporcionan acidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia al menos de acido nucleico, o completa (100%) con un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, p. ej., un acido nucleico de ejemplo como se proporciona en la presente memoria (p. ej., que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:1 modificada para codificar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varios) o todas las variaciones de la base descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes); y polipeptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas, o completa (100%) con un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, p. ej., un polipeptido de ejemplo que tiene una secuencia como se expone en la Se Q ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, s Eq ID NO:8, SEQ iD NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:2 que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis , siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes. Alternativamente, la identidad de secuencia puede estar sobre una region de al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas restos consecutivos, o la longitud total del acido nucleico o polipeptido. La extension de la identidad de secuencia (homologfa) se puede determinar usando cualquier programa de ordenador y parametros asociados, que incluyen los descritos en la presente memoria, tales como BLAST 2.2.2. o FASTA version 3.0t78, con los parametros por defecto. Como se usa en la presente memoria, los terminos "ordenador", "programa informatico" y "procesador" se usan en sus contextos generales mas amplios e incorporan todos dichos dispositivos, como se describe en detalle a continuacion.
La tabla a continuacion describe las caractensticas seleccionadas de los acidos nucleicos y polipeptidos de ejemplo como se proporciona en la presente memoria, que incluyen la comparacion de la identidad de secuencia de las secuencias de ejemplo con las bases de datos publicas para identificar la actividad de enzimas como se proporciona en la presente memoria por analisis de homologfa (identidad de secuencia). Todas las secuencias descritas en la tabla (todas las secuencias de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria) se sometieron a una busqueda de BLAST (como se describe en detalle a continuacion) frente a dos conjuntos de bases de datos. El primer conjunto de bases de datos esta disponible a traves del NCBI (Centro Nacional de Informacion Biotecnologica). Todos los resultados de las busquedas frente a estas bases de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripcion de NR", "Codigo de acceso de NR", "ValorE de NR" u "Organismo de NR". "NR" se refiere a la base de datos de nucleotidos no redundantes mantenida por el NCBI. Esta base de datos esta compuesta por GenBank, actualizaciones de GenBank y actualizaciones de EMBL. Las entradas en la columna "Descripcion de NR" se refieren a la lmea de definicion en cualquier registro de NCBI dado, que incluye una descripción de la secuencia, tal como el organismo fuente, nombre del gen/nombre de la protema, o alguna descripción de la funcion de la secuencia, identificando asf una actividad de las enzimas de ejemplo citadas como se proporciona en la presente memoria por analisis de homologfa (identidad de secuencia). Las entradas en la columna "Codigo de acceso de NR" se refieren al identificador unico dado a un registro de secuencia. Las entradas en la columna "ValorE de NR" se refieren al valor esperado (ValorE), lo que representa la probabilidad de encontrar una puntuacion de alineamiento tan buena como la encontrada entre la secuencia de consulta (las secuencias como se proporcionan en la presente memoria) y una secuencia de la base de datos en el mismo numero de comparaciones entre secuencias aleatorias como se realizo en la presente busqueda de BLAST. Las entradas en la columna "Organismo de NR" se refieren al organismo fuente de la secuencia identificada como el acierto BLAST mas cercano (homologfa de secuencia). El segundo conjunto de bases de datos se conoce colectivamente como la base de datos GENESEQ™, que esta disponible a traves de Thomson Derwent (Philadelphia, PA). Todos los resultados de las busquedas en esta base de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripcion de protema de GENESEQ™", "Codigo de acceso de protema de GENESEQ™", "ValorE de protema de GENESEQ™", "Descripcion de ADN de GENESEQ™", "Codigo de acceso de ADN de GENESEQ™" o "ValorE de ADN de GENESEQ™". La información encontrada en estas columnas es comparable a la información encontrada en las columnas de NR descritas anteriormente, excepto que se obtuvo de busquedas de BLAST frente a la base de datos GENESEQ™ en lugar de las bases de datos de NCBI. Las columnas "Longitud de ADN de consulta" y "Longitud de protema de consulta" se refieren al numero de nucleotidos o al numero de aminoacidos, respectivamente, en la secuencia que se proporciona en la presente memoria que se busco o se consulto frente a las bases de datos de NCBI o Ge NeSeQ™. Las columnas "GENESEQ™ o Longitud de ADN de NR" y "Longitud de protema de GENESEQ™ o NR" se refieren al numero de nucleotidos o al numero de aminoacidos, respectivamente, en la secuencia de coincidencia superior de la busqueda de BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas son de la busqueda que dio el ValorE inferior, ya sea de las bases de datos de NCBI o la base de datos de Geneseq. Las columnas "GENESEQ™/NR% ID Protema" y "GENESEQ™/NR% ID ADN" se refieren al porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia como se proporciona en la presente memoria y la secuencia de la mayor coincidencia de BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas provienen de la busqueda que dio el ValorE inferior, ya sea de las bases de datos de NCBI o la base de datos de GENESEQ™.
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Las secuencias homologas tambien incluyen secuencias de ARN en las que uridinas sustituyen a las timinas en las secuencias de acido nucleico. Las secuencias homologas se pueden obtener usando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria o pueden ser resultado de la correccion de un error de secuenciacion. Se apreciara que las secuencias de acido nucleico como se exponen en la presente memoria se pueden representar en el formato de un solo caracter tradicional (vease, p. ej., Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., W. H Freeman & Co., New York) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleotidos en una secuencia.
Se pueden usar varios programas de comparacion de secuencias identificados en la presente memoria y conocidos para el experto en la tecnica para la comparacion de secuencias. Las identidades (homologfas) de secuencias de protemas y/o acidos nucleicos se pueden evaluar usando cualquiera de la variedad de algoritmos de comparacion de secuencias y programas conocidos en la tecnica. Dichos algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993).
La homologfa o identidad se puede medir usando software de analisis de secuencias (p. ej., Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Dichos programas emparejan secuencias similares asignando grados de homologfa a diferentes eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones. Los terminos “homologfa” e “identidad” en el contexto de dos o mas secuencias de acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales cuando se comparan y alinean para la maxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparacion o region designada medida usando cualquier numero de algoritmos de comparacion de secuencias o por alineamiento manual e inspeccion visual. Para la comparacion de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de acido nucleico o polipeptido de ejemplo como se proporciona en la presente memoria) con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, posteriormente se designan coordenadas, si es necesario, y se designan parametros al programa de algoritmo de secuencia. Se pueden usar los parametros del programa por defecto, o se pueden designar parametros alternativos. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias con respecto a la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa.
Una “ventana de comparacion” como se usa en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del numero de restos contiguos. Por ejemplo, se comparan restos contiguos en el intervalo en cualquier sitio desde 20 a la longitud entera de una secuencia de polipeptido o acido nucleico de ejemplo con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que se hayan alineado de forma optima las dos secuencias. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida respecto a una secuencia de polipeptido o acido nucleico de ejemplo, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% , 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77 %, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o identidad de secuencia completa (100%) con una secuencia de polipeptido o acido nucleico de ejemplo como se proporciona en la presente memoria, esa secuencia esta dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria. Alternativamente, se comparan subsecuencias en el intervalo de aproximadamente 20 a 600, de aproximadamente 50 a 200, y de aproximadamente 100 a 150 con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de haber alineado de forma optima las dos secuencias. Los metodos de alineamiento de secuencias para la comparacion son bien conocidos en la tecnica. El alineamiento optimo de las secuencias para la comparacion se puede llevar a cabo, p. ej., por el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, por el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, por la busqueda por el metodo de similitudes de Person y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de programas de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspeccion visual. Otros algoritmos para determinar la homologfa o identidad incluyen, por ejemplo, ademas de un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALiGn , AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUsTa L V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, Mb Lk N, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. Dichos programas de alineamiento tambien se pueden usar para cribar bases de datos genomicas para identificar secuencias de polinucleotidos que tienen secuencias sustancialmente identicas. Estan disponibles una serie de bases de datos genomicas, por ejemplo, esta disponible una parte sustancial del genoma humano del Proyecto de Secuenciacion del Genoma Humano (Gibbs, 1995). Se han secuenciado varios genomas, p. ej., M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levaduras (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000). Tambien se ha hecho un avance importante en la secuenciacion de genomas de organismos modelo, tal como raton, C. elegans, y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen información genomica anotada con alguna información funcional son mantenidas por diferentes organizaciones, y son accesibles via internet.
Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2 tambien se usan. Se describen, p. ej., en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para llevar a cabo los analisis BLAST esta a disposicion del publico a traves del Centro Nacional para la Investigacion Biotecnologica. Este algoritmo implica primero identificar parejas de secuencias de alta puntuacion (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuacion umbral T de valor positivo, cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuacion de la palabra vecina (Altschul (1990), vease antes). Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP mas largas que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuacion de alineacion acumulativa se pueda incrementar. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para una pareja de restos que coinciden; siempre > 0). Para secuencias de aminoacidos, se emplea una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulativa. La extension de los aciertos de palabras en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa disminuye en una cantidad X desde su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulacion de una o varias alineaciones de restos con puntuacion negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915), alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparacion de ambas cadenas. El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, p. ej., Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873). Una medicion de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad con la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos se producina por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia, si la menor probabilidad de suma en una comparacion del acido nucleico del ensayo con el acido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, o alternativamente menor de aproximadamente 0,01 o alternativamente menor de aproximadamente 0,001.
Las homologfas de secuencia de acidos nucleicos y protemas se evaluan usando la herramienta Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"). Por ejemplo, se pueden usar cinco programas BLAST espedficos para realizar la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoacidos de consulta frente a una base de datos de secuencias de protemas; (2) BLASTN compara una secuencia de nucleotidos de consulta frente a una base de datos de secuencias de nucleotidos; (3) BLASTX compara los productos de traduccion conceptual de seis marcos de lectura de una secuencia de nucleotidos de consulta (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de protemas; (4) TBLASTN compara una secuencia de protema de consulta frente a una base de datos de secuencias de nucleotidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); y (5) TBLASTX compara las traducciones de los seis marcos de lectura de una secuencia de nucleotidos de consulta frente a las traducciones de seis marcos de lectura de una base de datos de secuencias de nucleotidos.
Los programas BLAST identifican secuencias homologas identificando segmentos similares, que se denominan en la presente memoria “parejas de segmentos de alta puntuacion” entre una secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos de consulta y una secuencia de ensayo que alternativamente se obtiene de una base de datos de secuencias de protemas o acidos nucleicos. Las parejas de segmentos de alta puntuacion se pueden identificar alternativamente (es decir, se alinean) mediante una matriz de puntuacion, muchas de las cuales son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la matriz de puntuacion usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443­ 1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). Tambien se pueden usar las matrices PAM o PAM250 (vease, p. ej., Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
Para determinar si un acido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para estar dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria, se usa el programa de NCBI BLAST 2.2.2, opciones por defecto de blastp. Hay aproximadamente 38 opciones de ajuste en el programa BLAST 2.2.2. Por ejemplo, se usan todos los valores por defecto excepto el ajuste de filtracion por defecto (es decir, todos los parametros ajustados por defecto excepto filtracion que se ajusta a OFF); en su lugar se usa en ajuste "-F F", que desactiva la filtracion. El uso de la filtracion por defecto a menudo produce violaciones de Karlin-Altschul debido a la longitud corta de la secuencia:
Los valores por defecto usados en este ejemplo, como se proporcionan en la presente memoria, incluyen.
“Filtrado para complejidad baja: Activado (ON)
Tamano de palabra: 3
Matriz: Blosum62
Coste por hueco: existencia: 11
Extension: 1”
Otros ajustes por defecto son: filtro para complejidad baja desactivado (OFF), tamano de palabra 3 para protema, matriz BLOSUM62, penalizacion por existencia de hueco -11 y una penalizacion por extension de hueco de -1. La opcion por defecto de “-W” es 0. Esto significa que, si no se ajusta el tamano de la palabra por defecto es 3 para protemas y 11 para nucleotidos.
Sistemas informaticos y productos de programas informaticos.
Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologfas estructurales, motivos y similares in silico, la secuencia como proporciona en la presente memoria se puede almacenar, grabar y manipular en cualquier medio que pueda ser lefdo y al que se pueda acceder mediante un ordenador. En la presente memoria se proporcionan ordenadores, sistemas informaticos, medios legibles por ordenador, productos de programas informaticos y similares, que contienen en los mismos (que comprenden) secuencias de acidos nucleicos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria registradas o almacenadas en los mismos. Como se usa en la presente memoria, las palabras "grabado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio informatico. Un experto en la tecnica puede adoptar facilmente cualquier metodo conocido para registrar informacion en un medio legible por ordenador para generar productos que comprenden una o mas de las secuencias de acidos nucleicos y/o polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria.
Tambien se proporciona en la presente memoria un medio legible por ordenador que tiene registrado en el mismo al menos una secuencia de acido nucleico y/o polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Los medios legibles por ordenador incluyen medios magneticamente legibles, medios opticamente legibles, medios electronicamente legibles y medios magneticos/opticos. Por ejemplo, los medios legibles por ordenador pueden ser un disco duro, un disquete, una cinta magnetica, un CD-ROM, un disco digital versatil (DVD), una memoria de acceso aleatorio (RAM) o una memoria de solo lectura (ROM), asf como otros tipos de otros medios conocidos por los expertos en la tecnica.
Tambien se proporcionan en la presente memoria sistemas (p. ej., sistemas basados en internet), particularmente sistemas informaticos, que almacenan y manipulan las secuencias y la información de secuencias descritas en la presente memoria. Un ejemplo de un sistema informatico 100 se ilustra en forma de diagrama de bloques en la figura 1. Como se usa en la presente memoria, "un sistema informatico" se refiere a los componentes de hardware, componentes de software y componentes de almacenamiento de datos usados para analizar una secuencia de nucleotidos o polipeptido como se proporciona en la presente memoria. El sistema informatico 100 puede incluir un procesador para procesar, acceder y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo conocido de unidad central de procesamiento, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines. El sistema informatico 100 es un sistema de proposito general que comprende el procesador 105 y uno o mas componentes de almacenamiento de datos internos 110 para almacenar datos, y uno o mas dispositivos de recuperació dne datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente que cualquiera de los sistemas informaticos actualmente disponibles es adecuado.
El sistema informatico 100 incluye un procesador 105 conectado a un bus que esta conectado a una memoria principal 115 (alternativamente implementada como RAM) y uno o mas dispositivos de almacenamiento de datos internos 110, tales como un disco duro y/u otro medio legible por ordenador que tienen datos grabados en los mismos. El sistema informatico 100 puede incluir ademas uno o mas dispositivos de recuperació dne datos 118 para leer los datos almacenados en los dispositivos de almacenamiento de datos internos 110. El dispositivo de recuperació dne datos 118 puede representar, p. ej., una unidad de disquete, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnetica, o un modem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (p. ej., a traves de Internet), etc. El dispositivo de almacenamiento de datos interno 110 puede ser un medio legible por ordenador extrafble, tal como un disquete, un disco compacto, una cinta magnetica , etc. que contiene controlador logico y/o datos grabados en el mismo. El sistema informatico 100 puede incluir ventajosamente o ser programado por un software adecuado para leer el controlador logico y/o los datos del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperació dne datos. El sistema informatico 100 incluye una pantalla 120 que se usa para mostrar la salida a un usuario del ordenador. Tambien se debe indicarse que el sistema informatico 100 se puede vincular a otros sistemas informaticos 125a-c en una red o red de area amplia para proporcionar acceso centralizado al sistema informatico 100. El software para acceder y procesar las secuencias de nucleotidos o aminoacidos como se proporcionan en la presente memoria puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecucion. El sistema informatico 100 puede comprender ademas un algoritmo de comparacion de secuencias para comparar una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. El algoritmo y la(s) secuencia(s) se pueden almacenar en un medio legible por ordenador. Un "algoritmo de comparacion de secuencias" se refiere a uno o mas programas que se implementan (local o remotamente) en el sistema informatico 100 para comparar una secuencia de nucleotidos con otras secuencias de nucleotidos y/o compuestos almacenados dentro de un medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparacion de secuencias puede comparar las secuencias de nucleotidos almacenadas en un medio legible por ordenador con respecto a secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por ordenador para identificar homologfas o motivos estructurales.
Los parametros usados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y el grado de homologfa estudiado. Los parametros pueden ser los parametros predeterminados usados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleotidos o protema con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homologfa entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema informatico 100, o una base de datos publica como GENBANK que esta disponible a traves de Internet. El proceso 200 comienza en un estado de inicio 201 y despues pasa a un estado 202 en donde la nueva secuencia que se va a comparar se almacena en una memoria en un sistema informatico 100. Como se ha descrito anteriormente, la memoria puede ser cualquier tipo de memoria, incluyendo RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. El proceso 200 despues pasa a un estado 204 en donde se abre una base de datos de secuencias para analisis y comparacion. El proceso 200 despues pasa a un estado 206 en donde la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. Despues se realiza una comparacion en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante tener en cuenta que este paso no se limita a realizar una comparacion exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Los expertos en la tecnica conocen metodos bien conocidos para comparar dos secuencias de nucleotidos o protemas, incluso aunque no sean identicas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en una secuencia con el fin de elevar el nivel de homologfa entre las dos secuencias ensayadas. Los parametros que controlan si los huecos u otras caractensticas se introducen en una secuencia durante la comparacion, normalmente los introduce el usuario del sistema informatico. Una vez que se ha realizado una comparacion de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinacion en un estado de decision 210 si las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el termino "igual" no se limita a secuencias que son absolutamente identicas. Las secuencias que estan dentro de los parametros de homologfa introducidos por el usuario se marcaran como "iguales" en el proceso 200. Si se determina que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 pasa a un estado 214 en donde se muestra el nombre de la secuencia de la base de datos al usuario. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre mostrado cumple las restricciones de homologfa que se introdujeron. Una vez que el nombre de la secuencia almacenada se muestra al usuario, el proceso 200 pasa a un estado de decision 218 en donde se determina si existen mas secuencias en la base de datos. Si no existen mas secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado final 220. Sin embargo, si existen mas secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 pasa a un estado 224 en donde un puntero se mueve a la siguiente secuencia en la base de datos de modo que pueda ser comparada con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia en la base de datos. Hay que indicar que, si se hubiera hecho una determinacion en el estado de decision 212 de que las secuencias no eran homologas, entonces el proceso 200 pasana inmediatamente al estado de decision 218 para determinar si hay otras secuencias disponibles en la base de datos para la comparacion. Por consiguiente, en la presente memoria se proporciona un sistema informatico que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenado en el una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria y un comparador de secuencias para llevar a cabo la comparacion. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homologfa entre las secuencias comparadas o identificar motivos estructurales, o puede identificar motivos estructurales en secuencias que se comparan con estos códigos de acidos nucleicos y códigos de polipeptidos. La figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realizacion de un proceso 250 en un ordenador para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 comienza en un estado de inicio 252 y despues pasa a un estado 254 en donde se almacena en una memoria una primera secuencia que se va a comparar. La segunda secuencia que se va a comparar se almacena despues en una memoria en un estado 256. El proceso 250 despues pasa a un estado 260 en donde se lee el primer caracter de la primera secuencia y despues a un estado 262 en donde se lee el primer caracter de la segunda secuencia. Debe entenderse que si la secuencia es una secuencia de nucleotidos, entonces el caracter normalmente sena A, T, C, G o U. Si la secuencia es una secuencia de protema, entonces puede ser un código de aminoacidos de una sola letra para que la primera secuencia y las secuencias se puedan comparar facilmente. Despues se determina en un estado de decision 264 si los dos caracteres son iguales. Si son iguales, despues, el proceso 250 pasa a un estado 268 en donde se leen los siguientes caracteres de la primera y la segunda secuencia. Despues se determina si los siguientes caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continua este bucle hasta que dos caracteres no sean iguales. Si se determina que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 se mueve al estado de decision 274 para determinar si hay mas caracteres o secuencia para leer. Si no hay mas caracteres para leer, entonces el proceso 250 pasa a un estado 276 en donde se muestra al usuario el nivel de homologfa entre la primera y la segunda secuencia. El nivel de homologfa se determina calculando la proporcion de caracteres entre las secuencias que eran iguales respecto al numero total de secuencias en la primera secuencia. Por lo tanto, si cada caracter en una primera secuencia de 100 nucleotidos se alinea con un caracter en una segunda secuencia, el nivel de homologfa sena 100%.
Alternativamente, el programa informatico puede comparer una secuencia de referencia con una secuencia como se proporciona en la presente memoria para determinar si las secuencias difieren en una o mas posiciones. El programa puede registrar la longitud y la identidad de los nucleotidos o restos de aminoacidos insertados, eliminados o sustituidos con respecto a la secuencia de referencia o una secuencia como se proporciona en la presente memoria. El programa informatico puede ser un programa que determina si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de nucleotido unico (SNP) con respecto a una secuencia como se proporciona en la presente memoria, o si una secuencia como se proporciona en la presente memoria comprende un SNP de una secuencia conocida. Por lo tanto, el programa informatico puede ser un programa que identifique SNP. El metodo puede ser implementado por los sistemas informaticos descritos antes y el metodo se ilustra en la figura 3. El metodo se puede llevar a cabo leyendo una secuencia como se proporciona en la presente memoria y las secuencias de referencia mediante el uso del programa informatico, e identificando diferencias con el programa informatico.
El sistema basado en ordenador puede comprender un identificador para identificar caractensticas dentro de un acido nucleico o polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Un "identificador" se refiere a uno o mas programas que identifican ciertas caractensticas dentro de una secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de acido nucleico. La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso de identificador 300 para detectar la presencia de una caractenstica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado de inicio 302 y despues pasa a un estado 304 en donde una primera secuencia de la que se deben comprobar las caractensticas se almacena en una memoria 115 en el sistema informatico 100. El proceso 300 despues pasa a un estado 306 en donde se abre la base de datos de caractensticas de secuencias. Dicha base de datos incluina una lista de los atributos de cada caractenstica junto con el nombre de la caractenstica. Por ejemplo, un nombre de caractenstica podna ser "Codon de inicio" y el atributo sena "ATG". Otro ejemplo sena el nombre de la caractenstica "TAATAA Box" y el atributo de la caractenstica sena "TAATAA". Un ejemplo de dicha base de datos lo produce el Grupo de Computacion de Genetica de la Universidad de Wisconsin. Alternativamente, las caractensticas pueden ser motivos de polipeptidos estructurales tales como helices alfa, laminas beta o motivos de polipeptidos funcionales tales como sitios activos enzimaticos, motivos de helice-giro-helice u otros motivos conocidos por los expertos en la tecnica. Una vez que la base de datos de caractensticas se abre en el estado 306, el proceso 300 pasa a un estado 308 en donde se lee la primera caractenstica de la base de datos. Despues, se hace una comparacion del atributo de la primera caractenstica con la primera secuencia en un estado 310. Despues se hace una determinacion en un estado de decision 316 de si ha encontrado el atributo de la caractenstica en la primera secuencia. Si se ha encontrado el atributo, entonces el proceso 300 pasa a un estado 318 en donde el nombre de la caractenstica encontrada se muestra al usuario. El proceso 300 despues pasa a un estado de decision 320 en donde se determina si existen caractensticas de movimiento en la base de datos. Si no existen mas caractensticas, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen mas caractensticas en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente caractenstica de secuencia en un estado 326 y vuelve al bucle al estado 310 en donde el atributo de la siguiente caractenstica se compara con la primera secuencia. Si el atributo de caractenstica no se encuentra en la primera secuencia en el estado de decision 316, el proceso 300 pasa directamente al estado de decision 320 para determinar si existen mas caractensticas en la base de datos. Por lo tanto, un programa informatico que identifica marcos de lectura abiertos (ORF).
Una secuencia de polipeptido o acido nucleico como se proporciona en la presente memoria se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de textos, tal como MICROSOFTWORD™ o WORDPERFECT™ o como un archivo ASCII en una variedad de programas de base de datos que son familiares para los expertos en la tecnica, tales como DB2, SYBASE o ORACLE™. Ademas, muchos programas informaticos y bases de datos se pueden usar como algoritmos de comparacion de secuencias, identificadores o fuentes de secuencias de nucleotidos de referencia o secuencias de polipeptidos que se van a comparar con una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. Los programas y las bases de datos pueden comprender: MACPATTERN™ (EMBL), DISCOVERYBASE™ (Molecular Applications Group), GENEMiNe ™ (Molecular Applications Group), LOOK™ (Molecular Applications Group), Ma ClOOK™ (Molecular Applications Group), BLAST y BLAST2 (NCBI), BLASTN y BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB™ (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), CATALYST™ (Molecular Simulations Inc.), CATALYST™/SHAPE™ (Molecular Simulations Inc.), CERIUS2.DBACCESS™ (Molecular Simulations Inc.), HYPOGEN™ (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), DISCOVER™ (Molecular Simulations Inc.), CHARMm™ (Molecular Simulations Inc.), FELIX™ (Molecular Simulations Inc.), DELPHI™s (Molecular Simulations Inc.), QUa Nt EMM™, (Molecular Simulations Inc.), HOMOLOGY™ (Molecular Simulations Inc.), MODELER™ (Molecular Simulations Inc.), ISIS™ (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), GENE EXPLORER™ (Molecular Simulations Inc.), SEQFOLD™ (Molecular Simulations Inc.), la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos Derwent's World Drug Index, la base de datos BioByteMasterFile, la base de datos Genbank database, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos senan evidentes para un experto en la tecnica dada la presente descripción.
Los motivos que se pueden detectar usando los programas anteriores incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de helice-giro-helice, sitios de glicosilacion, sitios de ubiquitinacion, helices alfa y laminas beta, secuencias senal que codifican peptidos senal que dirigen la secrecion de las protemas codificadas, secuencias implicadas en la regulacion de la transcripcion, tales como homeobox, tramos acidos, sitios enzimaticos activos, sitios de union al sustrato y sitios de escision enzimatica.
Hibridacion de acidos nucleicos
En la presente memoria se proporcionan acidos nucleicos aislados, sinteticos o recombinantes que hibridan en condiciones restrictivas con el acido nucleico proporcionado en la presente memoria, p. ej., una secuencia de ejemplo proporcionada en la presente memoria, p. ej., una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:1 modificada para codificar una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de bases descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes, y sus subsecuencias y secuencias complementarias, o un acido nucleico que codifica un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Las condiciones rigurosas pueden ser condiciones restrictivas altas, condiciones restrictivas medias, condiciones restrictivas bajas, incluyendo las condiciones restrictivas altas y reducidas descritas en la presente memoria.
"Hibridacion" se refiere al proceso por el cual una cadena de acido nucleico se une con una cadena complementaria por el emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridacion pueden ser sensibles y selectivas de modo que se pueda identificar una secuencia particular de interes incluso en muestras en las que esta presente en concentraciones bajas. Las condiciones restrictivas se pueden definir, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridacion e hibridacion, o por la temperatura de hibridacion, y son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede aumentar la restriccion reduciendo la concentracion de sal, aumentando la concentracion de formamida o elevando la temperatura de hibridacion, alterando el tiempo de hibridacion, como se describe en detalle a continuacion. Alternativamente, los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria, se definen por su capacidad para hibridar en diferentes condiciones restrictivas (p. ej., altas, medias o bajas), como se expone en la presente memoria.
Alternativamente, los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria definidos por su capacidad para hibridar en condiciones restrictivas pueden estar entre aproximadamente cinco restos y la longitud completa del acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, p. ej., pueden ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas, restos de longitud. Tambien estan incluidos los acidos nucleicos mas cortos que la longitud completa. Estos acidos nucleicos pueden ser utiles, p. ej., como sondas de hibridacion, sondas de marcaje, sondas de oligonucleotidos de PCR, ARNi, secuencias antisentido o secuencias que codifican peptidos de union a anticuerpos (epftopos), motivos, sitios activos y similares.
Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se definen por su capacidad para hibridar con restriccion alta que comprende condiciones de formamida aproximadamente al 50%, de aproximadamente 37°C a 42°C. Por ejemplo, los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de restriccion reducida que comprenden condiciones de formamida aproximadamente de 35% al 25%, de a aproximadamente 30°C a 35°C.
Alternativamente, los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de restriccion alta que comprenden condiciones a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, SDS al 0,3% y una secuencia repetitiva que bloquea el acido nucleico, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmon (p. ej., 200 ug/ml de ADN de esperma de salmon fraccionado y desnaturalizado). Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se definen por su capacidad para hibridar en condiciones restrictivas reducidas que comprenden formamida al 35%, a una temperatura reducida de 35°C.
Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por encima del 25% de formamida y condiciones "bajas" por debajo del 25% de formamida. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo con formamida al 30%. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion de "restriccion baja" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo con formamida al 10%.
El intervalo de temperatura que corresponde a un nivel particular de restriccion se puede estrechar adicionalmente calculando la relacion de purina a pirimidina del acido nucleico de interes y ajustando la temperatura en consecuencia. Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria tambien se definen por su capacidad para hibridar en condiciones restrictivas altas, medias y bajas como se expone en Ausubel y Sambrook. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la tecnica. Las condiciones de hibridacion se discuten mas, a continuacion.
El procedimiento anterior se puede modificar para identificar acidos nucleicos que tienen niveles decrecientes de homologfa con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener acidos nucleicos de homologfa decreciente con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos restrictivas. Por ejemplo, la temperatura de hibridacion se puede disminuir en incrementos de 5°C de 68°C a 42°C en un tampon de hibridacion que tiene una concentracion de Na+ de aproximadamente 1 M. Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 2X SSC, SDS al 0,5% a la temperatura de hibridacion. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por encima de 50°C y condiciones "bajas" por debajo de 50°C. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo a 55°C. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion de "restriccion baja" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo a 45°C.
Alternativamente, la hibridacion se puede llevar a cabo en tampones, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentracion de formamida en el tampon de hibridacion se puede reducir en incrementos de 5% desde 50% a 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homologfa con la sonda. Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por encima del 25% de formamida y condiciones "bajas" por debajo de 25% de formamida. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo con formamida al 30%. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion de "restriccion baja" es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo con formamida al 10%.
Sin embargo, la seleccion de un formato de hibridacion no es cntica, es la restriccion de las condiciones de lavado las que establecen las condiciones que determinan si un acido nucleico esta dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria. Las condiciones de lavado usadas para identificar los acidos nucleicos dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria incluyen, por ejemplo: una concentracion de sal de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C; o, una concentracion de sal de NaCl aproximadamente 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos; o, una concentracion de sal de aproximadamente 0.2X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50°C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C durante de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridacion se lava dos veces con una solucion con una concentracion de sal de aproximadamente 2X SsC que contiene SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y despues se lava dos veces con 0,1X SSC que contiene SDS al 0,1% a 68°C durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Vease Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del tampon SSC y condiciones equivalentes.
Estos metodos se pueden usar para aislar acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria.
Sondas de oligonucleotidos y metodos para usarlas.
En la presente memoria se proporcionan sondas de acido nucleico para identificar acidos nucleicos que codifican un polipeptido con una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. La sonda puede comprender al menos 10 bases consecutivas de un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. Alternativamente, una sonda como se proporciona en la presente memoria puede ser de al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100. 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o mas, o de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, bases consecutivas de una secuencia como se expone en un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria. Las sondas identifican un acido nucleico mediante union y/o hibridacion. Las sondas se pueden usar en matrices como se proporcionan en la presente memoria, vease la discusion a continuacion, que incluyen, p. ej., matrices capilares. Las sondas como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar para aislar otros acidos nucleicos o polipeptidos.
Las sondas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para determinar si una muestra biologica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria (p. ej., un acido nucleico que codifica hidrolasa) o un organismo del cual se ha obtenido el acido nucleico. En dichos procedimientos, se obtiene una muestra biologica que potencialmente alberga el organismo a partir del cual se ha aislado el acido nucleico y se obtienen acidos nucleicos de la muestra. Los acidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda hibride espedficamente con cualquier secuencia complementaria presente en la muestra. Donde sea necesario, las condiciones que permiten que la sonda hibride espedficamente con secuencias complementarias se pueden determinar poniendo la sonda en contacto con secuencias complementarias de muestras que se sabe que contienen la secuencia complementaria, asf como secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridacion, tales como la concentracion de sal del tampon de hibridacion, la concentracion de formamida del tampon de hibridacion o la temperatura de hibridacion, se pueden variar para identificar las condiciones que permiten que la sonda hibride espedficamente con acidos nucleicos complementarios (vease la descripción sobre condiciones de hibridacion espedficas).
Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se ha aislado el acido nucleico, entonces se detecta la hibridacion espedfica de la sonda. La hibridacion se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable tal como un isotopo radioactivo, un colorante fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formacion de un producto detectable. Muchos metodos para usar las sondas marcadas para detectar la presencia de acidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los expertos en la tecnica. Estos incluyen transferencias Southern, transferencias Northern, procedimientos de hibridacion de colonias y transferencias en mancha. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook.
Alternativamente, se puede usar mas de una sonda (al menos una que es capaz de hibridar espedficamente con cualquier secuencia complementaria que este presente en la muestra de acidos nucleicos) en una reaccion de amplificacion para determinar si la muestra contiene un organismo que contiene una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria (p. ej., un organismo del que se aislo el acido nucleico). Las sondas comprenden oligonucleotidos. La reaccion de amplificacion puede comprender una reaccion de PCR. Se describen protocolos de PCR en Ausubel y Sambrook (vease la descripción sobre las reacciones de amplificacion). En dichos procedimientos, los acidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas, se lleva a cabo la reaccion de amplificacion, y se detecta cualquier producto de amplificacion resultante. El producto de amplificacion se puede detectar llevando a cabo electroforesis en gel de los productos de reaccion y tincion del gel en un intercalador tal como bromuro de etidio. Alternativamente, se pueden marcar una o mas de las sondas con un isotopo radiactivo y se puede detectar la presencia de un producto de amplificacion radiactivo por autorradiograffa despues de electroforesis en gel.
Las sondas derivadas de secuencias cerca de los extremos 3' o 5' de una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, tambien se pueden usar en procedimientos de paseo cromosomico para identificar clones que contienen secuencias adicionales, p. ej., genomicas. Dichos metodos permiten el aislamiento de genes que codifican protemas adicionales de interes de un organismo hospedante.
Las secuencias de acidos nucleicos como se proporciona en la presente memoria se usan como sondas para identificar y aislar acidos nucleicos relacionados. Los acidos nucleicos relacionados asf identificados pueden ser ADNc o ADN genomico de organismos distintos del que se aislo primero el acido nucleico. En dichos procedimientos, una muestra de acido nucleico se pone en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda hibride espedficamente con secuencias relacionadas. La hibridacion de la sonda con los acidos nucleicos del organismo relacionado se detecta entonces usando cualquiera de los metodos descritos antes.
En las reacciones de hibridacion de acidos nucleicos, las condiciones usadas para lograr un nivel particular de restriccion variaran, dependiendo de la naturaleza de los acidos nucleicos que van a hibridar. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composicion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., contenido de GC frente a AT) y tipo de acido nucleico (p. ej. ARN frente a ADN) de las regiones de hibridacion de los acidos nucleicos se pueden considerar en la seleccion de las condiciones de hibridacion. Una consideracion adicional es si uno de los acidos nucleicos se inmoviliza, por ejemplo, sobre un filtro. La hibridacion se pude llevar a cabo en condiciones de restriccion baja, restriccion moderada o restriccion alta. Como un ejemplo de hibridacion de acido nucleico, primero se prehibrida una membrana de polfmero que contiene acidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45°C en una solucion que consiste en NaCl 0,9 M, NaH2PO450 mM, pH 7,0, Na2EDTA 5,0 mM, SDS al 0,5%, 10X solucion de Denhardt, y acido polirriboademlico 0,5 mg/ml. Se pueden anadir aproximadamente 2 x 107 cpm (actividad espedfica de 4 a 9 x 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleotido marcada en el extremo con 32P a la solucion. Despues de aproximadamente 12-16 horas de incubacion, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (T.a.) en 1X SET (NaCl 150 mM, hidrocloruro de Tris 20 mM, pH 7,8, Na2EDTA 1 mM) que contiene SDS al 0,5%, seguido de un lavado de 30 minutos en 1X SET de nueva aportacion a Tm-10°C para la sonda de oligonucleotido. La membrana se puede exponer a pelfcula autorradiografica para la deteccion de senales de hibridacion.
Variando la restriccion de las condiciones de hibridacion usadas para identificar acidos nucleicos, tales como ADNc o ADN genomicos, que hibridan con la sonda detectable, se pueden identificar y aislar acidos nucleicos que tienen diferentes niveles de homologfa con la sonda. La restriccion se puede variar llevando a cabo la hibridacion a diferentes temperaturas por debajo de las temperaturas de fusion de las sondas. La temperatura de fusion, Tm, es la temperatura (a una fuerza ionica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia objetivo hibrida con una sonda perfectamente complementaria. Se seleccionan condiciones muy restrictivas para que sean iguales a o aproximadamente 5°C inferiores a la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusion de la sonda se puede calcular usando las siguientes formulas de ejemplo. Para sondas entre 14 y 70 nucleotidos de longitud la temperatura de fusion (Tm) se calcula usando la formula: Tm=81,5+16,6(log [Na+])+0,41(fraccion de G+C)-(600/N) donde N es la longitud de la sonda. Si la hibridacion se lleva a cabo en una solucion que contiene formamida, la temperatura de fusion se puede calcular usando la ecuacion: Tm=81,5+16,6(log [Na+])+0,41(fraccion de G+C)-(formamida al 0,63%)-(600/N) donde N es la longitud de la sonda. La prehibridacion se puede llevar a cabo en 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado 100 |jg o 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado 100 jg, formamida al 50%. Las formulas para SSC y solucion de Denhardt y otras soluciones se citan, p. ej., en Sambrook.
La hibridacion se lleva a cabo anadiendo la sonda detectable a las soluciones de prehibridacion citadas antes. Cuando la sonda comprende ADN bicatenario, se desnaturaliza antes de la adicion a la solucion de hibridacion. El filtro se pone en contacto con la solucion de hibridacion durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la sonda hibride con ADNc o ADN genomicos que contienen secuencias complementarias a la misma u homologas a la misma. Para sondas de mas de 200 nucleotidos de longitud, la hibridacion se puede llevar a cabo a 15-25°C por debajo de la Tm. Para sondas mas cortas, tales como sondas de oligonucleotidos, la hibridacion se puede llevar a cabo a 5-10°C por debajo de la Tm. Las hibridaciones en 6X SSC se llevan a cabo a aproximadamente 68°C. Las hibridaciones en soluciones que contienen formamida al 50% se llevan a cabo a aproximadamente 42°C. Todas las hibridaciones anteriores se consideranan que estan en condiciones de restriccion alta.
Despues de hibridacion, el filtro se lava para eliminar cualquier sonda detectable unida de forma no espedfica. La restriccion usada para lavar los filtros tambien se puede variar dependiendo de la naturaleza de los acidos nucleicos que se esten hibridando, la longitud de los acidos nucleicos que se esten hibridando, el grado de complementariedad, la composicion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., contenido de GC frente a AT), y tipo de acido nucleico (p. ej., ARN frente a ADN). Los ejemplos de lavados en condiciones de restriccion progresivamente mayores, son los siguientes: 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos (restriccion baja); 0,1X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (restriccion moderada); 0,1X s Sc , SDS al 0,5% durante 15 a 30 minutos a entre la temperatura de hibridacion y 68°C (restriccion alta); y NaCl 0,15 M durante 15 minutos a 72°C (restriccion muy alta). Se puede llevar a cabo un lavado de restriccion baja en 0,1X SSC a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son simplemente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden usar para lavar filtros. Un experto en la tecnica sabra que hay numerosas recetas para diferentes lavados de restriccion.
Los acidos nucleicos que han hibridado con la sonda se pueden identificar por autorradiograffa u otras tecnicas convencionales. El procedimiento anterior se puede modificar para identificar acidos nucleicos que tienen niveles decrecientes de homologfa con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener acidos nucleicos de homologfa decreciente con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos restrictivas. Por ejemplo, la temperatura de hibridacion se puede disminuir en incrementos de 5°C de 68°C a 42°C en tampon de hibridacion que tiene una concentracion de Na+ de aproximadamente 1 M. Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 2X SSC, SDS al 0,5% a la temperatura de hibridacion. Estas condiciones se considera que son condiciones “moderadas” por encima de 50°C y condiciones “bajas” por debajo de 50°C. Un ejemplo de condiciones de hibridacion “moderadas” es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo a 55°C. Un ejemplo de condiciones de hibridacion de “restriccion baja” es cuando la hibridacion se lleva a cabo a 45°C.
Alternativamente, la hibridacion se lleva a cabo en tampones, tales como 6X SSC, que contiene formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentracion de la formamida en el tampon de hibridacion se puede reducir en incrementos de 5% desde 50% a 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homologfa con la sonda. Despues de hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones “moderadas” por encima de formamida al 25% y condiciones “bajas” por debajo de formamida al 25%. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion “moderadas” es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo en formamida al 30%. Un ejemplo espedfico de condiciones de hibridacion de “restriccion baja” es cuando la hibridacion anterior se lleva a cabo en formamida al 10%.
Estas sondas y metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para aislar, o identificar (p. ej., usando una matriz) acidos nucleicos que tienen una secuencia con al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas de identidad de secuencia con una secuencia de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria que comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas de sus bases consecutivas, y las secuencias complementarias de la misma. La homologfa se puede medir usando un algoritmo de alineamiento, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, los polinucleotidos homologos pueden tener una secuencia codificante que es una variante alelica que se encuentra de forma natural de una de las secuencias codificantes descritas en la presente memoria. Dichas variantes alelicas pueden tener una sustitucion, eliminacion o adicion de uno o mas nucleotidos cuando se compara con los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria.
Ademas, las sondas y metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para aislar, o identificar (p. ej., usando una matriz), acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas de identidad de secuencia (homologfa) con un polipeptido como se proporciona en la presente memoria que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 o mas de sus aminoacidos consecutivos determinado usando un algoritmo de alineamiento de secuencias, p. ej., tal como el algoritmo FASTA version 3.0t78 con los parametros por defecto, o un programa BLAST 2.2.2 con los ajustes de ejemplo expuestos en la presente memoria.
Inhibicion de la expresion de hidrolasas
Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos complementarios (p. ej., secuencias de sentido contrario) a los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., secuencias que codifican hidrolasas. Las secuencias de sentido contrario son capaces de inhibir el transporte, corte y empalme o transcripcion de genes que codifican hidrolasas. La inhibicion se puede llevar a cabo dirigiendose al ADN genomico o ARN mensajero. La inhibicion se puede llevar a cabo usando ADN, p. ej., una ribozima inhibidora, o un ARN, p. ej., un ARNi bicatenario, que comprende una secuencia como se proporciona en la presente memoria. La transcripcion o funcion del acido nucleico objetivo se puede inhibir, por ejemplo, por hibridacion y/o escision. Se proporcionan en la presente memoria conjuntos particularmente utiles de inhibidores que comprenden oligonucleotidos capaces de unirse a genes y/o mensajeros de hidrolasa, en cualquiera de los casos previniendo o inhibiendo la produccion o funcion de la enzima hidrolasa. La asociacion puede ser por hibridacion espedfica de secuencia. Otra clase util de inhibidores incluye oligonucleotidos que producen inactivacion o escision del mensajero de hidrolasa. El oligonucleotido puede tener actividad enzimatica que produce dicha escision, tal como ribozimas. El oligonucleotido se puede modificar qmmicamente o conjugar con una enzima o composicion capaz de escindir el acido nucleico complementario. Se pueden cribar de un conjunto de muchos de dichos oligonucleotidos diferentes, aquellos con la actividad deseada. Oligonucleotidos de sentido contrario
Se proporcionan en la presente memoria oligonucleotidos de sentido contrario capaces de unirse a mensajero de hidrolasa que pueden inhibir la actividad de hidrolasa dirigiendose al ARNm o ADN genomico. Las estrategias para disenar oligonucleotidos de sentido contrario estan bien descritas en la bibliograffa cientifica y de patentes, y el experto en la tecnica puede disenar dichos oligonucleotidos de hidrolasa usando los nuevos reactivos como se proporcionan en la presente memoria. Por ejemplo, los protocolos de paseo genico/cartograffa de ARN para cribar oligonucleotidos de sentido contrario eficaces son bien conocidos en la tecnica, vease, p. ej., Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, que describe un ensayo de cartografiado de ARN, que se basa en tecnicas moleculares estandar para proporcionar un metodo sencillo y fiable para la seleccion potente de secuencias de sentido contrario. Vease tambien, Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198.
Los acidos nucleicos generados de forma recombinante o que se encuentran de forma natural aislados se usan como oligonucleotidos de sentido contrario. Los oligonucleotidos de sentido contrario pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, los oligonucleotidos de sentido contrario tienen entre aproximadamente 5 a 100, de aproximadamente 10 a 80, de aproximadamente 15 a 60, de aproximadamente 18 a 40. Los oligonucleotidos de sentido contrario pueden ser ARN o ADN monocatenario o bicatenario. La longitud optima se puede determinar por cribado rutinario. Los oligonucleotidos de sentido contrario pueden estar presentes en cualquier concentracion. La concentracion optima se puede determinar por cribado rutinario. Se conoce una amplia variedad de analogos de nucleotidos y acidos nucleicos sinteticos, no naturales que pueden abordar este potencial problema. Por ejemplo, se pueden usar acidos nucleicos peptfdicos (PNA) que contienen cadenas principales no ionicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil)glicina. Los oligonucleotidos de sentido contrario que tienen enlaces fosforotioato tambien se pueden usar, como se describe en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl. Pharmacol. 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Se proporcionan en la presente memoria oligonucleotidos de sentido contrario que tienen analogos de cadena principal de ADN sinteticos, que tambien pueden incluir acidos nucleicos fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquilfosfotriester, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen(metilimino), 3'-N-carbamato, y morfolino carbamato, como se ha descrito antes.
Se puede usar metodologfa de qmmica combinatoria para crear un gran numero de oligonucleotidos de los que se pueden cribar rapidamente los oligonucleotidos espedficos que tienen afinidades de union y especificidades adecuadas hacia cualquier objetivo, tal como las secuencias de hidrolasa homosentido y de sentido contrario (vease, p. ej., Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).
Ribozimas inhibidoras
Se proporcionan en la presente memoria ribozimas capaces de unirse al mensajero de hidrolasa que pueden inhibir la actividad de hidrolasa dirigiendose al ARNm. Las estrategias para disenar ribozimas y seleccionar la secuencia de sentido contrario espedfica de hidrolasa estan bien descritas en la bibliograffa cientffica y de patentes, y el experto en la tecnica puede disenar dichas ribozimas usando los nuevos reactivos descritos en la presente memoria. Las ribozimas actuan uniendose a un ARN objetivo por la parte de union al ARN objetivo de un ribozima que se mantiene muy cerca de una parte enzimatica del a Rn que escinde el ARN objetivo. Por lo tanto, la ribozima reconoce y se une al ARN objetivo por emparejamiento de bases complementarias, y una vez unida en el sitio correcto, actua enzimaticamente para escindir e inactivar el ARN objetivo. La escision de un ARN objetivo de dicha forma destruira su capacidad para dirigir la smtesis de una protema codificada si la escision se produce en la secuencia codificante. Despues de que una ribozima se haya unido y escindido su ARN objetivo, tfpicamente es liberada de ese ARN y por lo tanto puede unirse y escindir nuevos objetivos repetidamente.
En algunas circunstancias, la naturaleza enzimatica de una ribozima puede ser ventajosa frente a otras tecnologfas, tal como la tecnologfa antisentido (donde una molecula de acido nucleico simplemente se une a un acido nucleico objetivo para bloquear su transcripcion, traduccion o asociacion con otra molecula), ya que la concentracion eficaz de ribozima necesaria para realizar un tratamiento terapeutico puede ser menor que la de un oligonucleotido de sentido contrario. Esta potencial ventaja refleja la capacidad de la ribozima de actuar enzimaticamente. Por lo tanto, una sola molecula de ribozima es capaz de escindir muchas moleculas de ARN objetivo. Ademas, una ribozima tfpicamente es un inhibidor muy espedfico, con la especificidad de la inhibicion que depende no solo del mecanismo de emparejamiento de bases de la union, sino tambien del mecanismo por el cual la molecula inhibe la expresion del ARN al que se une. Es dedr, la inhibicion es causada por la escision del ARN objetivo y por lo tanto la especificidad esta definida como la relacion de la tasa de escision del ARN objetivo frente a la tasa de escision del ARN no objetivo. Este mecanismo de escision depende de factores adicionales a los implicados en el emparejamiento de bases. Por lo tanto, la especificidad de la accion de una ribozima puede ser mayor que la de la union del oligonucleotido de sentido contrario que se une al mismo sitio de ARN.
La molecula de ARN de ribozima enzimatico se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, pero tambien se puede formar en el motivo de una horquilla, virus delta de la hepatitis, intron de grupo I o ARN de tipo RNasaP (asociado con una secuencia grna de ARN). Los ejemplos de dichos motivos de cabeza de martillo los describen Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; los motivos en horquilla Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, y Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; el motivo del virus delta de la hepatitis Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; el motivo de RNasaP Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; y el intron de grupo I Cech patente de EE.UU. n° 4.987.071. La cita de estos motivos espedficos no se pretende que sea limitante; los expertos en la tecnica reconoceran que una molecula de ARN enzimatica tiene un sitio de union del sustrato espedfico complementario a una o mas de las regiones de ARN del gen objetivo, y tiene secuencia de nucleotidos dentro o rodeando ese sitio de union del sustrato que imparte una actividad de escision de ARN a la molecula.
ARN de interferencia (ARNi)
Se proporciona en la presente memoria una molecula inhibidora de ARN, una llamada molecula de “ARNi”, que comprende una secuencia de hidrolasa descrita en la presente memoria. La molecula de ARNi comprende una molecula de ARN bicatenaria (ARNbc), p. ej., ARNip y/o miARN. El ARNi puede inhibir la expresion de un gen o transcrito de hidrolasa, (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa). La molecula de ARNi p. ej., ARNip y/o miARN tiene aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o mas nucleotidos en duplex de longitud. Aunque la descripción no esta limitada a ningun mecanismo de accion particular, el ARNi puede entrar en una celula y causar la degradacion de un ARN monocatenario (ARNmc) de secuencias similares o identicas, incluyendo ARNm endogenos. Cuando una celula se expone al ARN bicatenario (ARNbc), el ARNm del gen homologo se degrada selectivamente por un procedimiento llamado interferencia de ARN (iARN). Un posible mecanismo detras de la iARN es la rotura de un ARN bicatenario (ARNbc) que se corresponde con una secuencia de gen espedfico en trozos cortos llamados ARN de interferencia corto, que produce la degradacion del ARNm que se corresponde con su secuencia.
La iARN se puede usar en productos terapeuticos de silenciamiento de genes, vease, p. ej., Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. Se describen en la presente memoria metodos para degradar el ARN selectivamente usando la iARN. El procedimiento se puede poner en practica in vitro, ex vivo o in vivo. Las moleculas de iARN se pueden usar para generar una mutacion de perdida de funcion en una celula, un organo o un animal. Los metodos para hacer y usar moleculas de iARN para degradar el ARN selectivamente son conocidas en la tecnica, vease, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.
Modificacion de acidos nucleicos
Se proporcionan en la presente memoria metodos de generacion de variantes de acidos nucleicos, p. ej., los que codifican una enzima hidrolasa o un anticuerpo como se proporcionan en la presente memoria. Estos metodos se pueden repetir o usar en diferentes combinaciones para generar hidrolasas o anticuerpos que tienen una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de una hidrolasa o anticuerpo codificado por el acido nucleico molde. Estos metodos tambien se pueden repetir o usar en diferentes combinaciones, p. ej., para generar variaciones en la expresion del gen/mensajero, traduccion del mensajero o estabilidad del mensajero. Se altera la composicion genetica de una celula, p. ej., por modificacion de un gen homologo ex vivo, seguido de su reinsercion en la celula.
El termino "variante" puede incluir polinucleotidos o polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria modificados en uno o mas pares de bases, codones, intrones, exones o restos de aminoacidos (respectivamente) aunque todavfa retienen la actividad biologica de una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Las variantes se pueden producir por una serie de medios que incluyen metodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a error, barajado, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblado, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis en casete, mutagenesis de conjunto recursivo, mutagenesis de conjunto exponencial, mutagenesis espedfica de sitio, reensamblaje de genes, GSSMsm y cualquiera de sus combinaciones. Se incluyen en la presente memoria tecnicas para producir hidrolasas variantes que tienen actividad a un pH o temperatura, por ejemplo que es diferente de una hidrolasa de tipo natural.
Un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria se puede alterar por cualquier medio. Por ejemplo, metodos aleatorios o estocasticos, o no estocasticos, o de “evolucion dirigida”, vease, p. ej., la patente de Ee . UU. No. 6.361.974. Los metodos para la mutacion aleatoria de genes son bien conocidos en la tecnica, vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5.830.696. Por ejemplo, se pueden usar mutagenos para mutar aleatoriamente un gen. Los mutagenos incluyen, p. ej., irradiacion con luz ultravioleta o gamma, o un mutageno qmmico, p. ej., mitomicina, acido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinacion, para inducir roturas de ADN susceptibles de ser reparadas por recombinacion. Otros mutagenos qmmicos incluyen, p. ej., bisulfito de sodio, acido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o acido formico. Otros mutagenos son analogos de precursores de nucleotidos, p. ej., nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina o acridina. Estos agentes se pueden anadir a una reaccion de PCR en lugar del precursor de nucleotidos mutando asf la secuencia. Tambien se pueden usar agentes de intercalacion tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.
Se puede usar cualquier tecnica en biologfa molecular, p. ej., mutagenesis por PCR aleatoria, vease, p. ej., Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; o, mutagenesis de casete multiple combinatoria, vease, p. ej., Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196. Alternativamente, los acidos nucleicos, p. ej., genes, se pueden reensamblar despues de fragmentacion aleatoria o “estocastica”, vease, p. ej., patentes de EE.UU. n° 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. Alternativamente, se introducen modificaciones, adiciones o eliminaciones por PCR propensa a error, barajado, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblado, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis en casete, mutagenesis de conjunto recursivo, mutagenesis de conjunto exponencial, mutagenesis espedfica de sitio, reensamblaje de genes, mutagenesis por saturacion de sitio de gensM (GSSMS ), reensamblaje por ligado sintetico (SLR), recombinacion, recombinacion de secuencias recursivas, mutagenesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagenesis de molde que contiene uracilo, mutagenesis de duplex con huecos, mutagenesis por reparacion de errores puntuales, mutagenesis por cepa de hospedante deficiente en reparacion, mutagenesis qmmica, mutagenesis radiogenica, mutagenesis por eliminacion, mutagenesis por seleccion de restriccion, mutagenesis por purificacion de restriccion, smtesis artificial de genes, mutagenesis de conjunto, creacion de multfmero de acido nucleico quimerico y/o una combinacion de estos y otros metodos.
Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o metodos de recombinacion recursiva que se pueden incorporar en los metodos descritos en la presente memoria: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893­ 896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer'" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Los metodos de mutacion de generacion de diversidad incluyen, por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J.
237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagenesis usando moldes que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; and Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); mutagenesis dirigida por oligonucleotidos (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller y Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagenesis de ADN modificado por fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749­ 8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagenesis usando ADN duplex con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; and Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).
Protocolos adicionales usados en los metodos como se proporcionan en la presente memoria incluyen reparacion de mal apareamiento puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagenesis usando cepas hospedantes deficientes en reparacion (Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res.13: 4431-4443; y Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagenesis por eliminacion (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), seleccion por restriccion, y seleccion por restriccion y purificacion por restriccion (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagenesis por smtesis de gen total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparacion de rotura de doble cadena (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177­ 7181). Se pueden encontrar detalles adicionales de muchos de los metodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, que tambien describe controles utiles para problemas de correccion de errores con varios metodos de mutagenesis.
Protocolos adicionales usados en los metodos como se proporcionan en la presente memoria incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. n° 5.605.793 de Stemmer (25 de Feb., 1997), "Methods for In Vitro Recombination;" patente de EE.UU. n° 5.811.238 de Stemmer et al. (22 de Sep., 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" patente de EE.UU. n° 5.830.721 de Stemmer et al. (3 de Nov., 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" patente de EE.UU. n° 5.834.252 de Stemmer, et al. (10 de Nov., 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" patente de EE.UU. n° 5.837.458 de Minshull, et al. (17 de Nov., 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" WO 96/33207 de Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction;" WO 97/20078 de Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" WO 97/35966 de Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 99/41402 de Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" WO 99/41383 de Punnonen et al. "Antigen Library Immunization;" WO 99/41369 de Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering;" WO 99/41368 de Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" EP 752008 de Stemmer y Crameri , "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" EP 0932670 de Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" WO 99/23107 de Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" WO 99/21979 de Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors;" Wo 98/31837 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" WO 98/27230 de Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" WO 98/27230 de Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection," WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries," WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences," WO 98/42832 de Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers," WO 99/29902 de Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences," WO 98/41653 de Vind, "An in vitro Method for Construction of a DNA Library," WO 98/41622 de Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," y WO 98/42727 de Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination."
Los protocolos que se pueden usar (que proporcionan detalles en relacion con diferentes metodos que generan diversidad) se describen , p. ej., en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie (USSN) 09/407.800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" de Patten et al. presentada el 28 de Sep., 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" de del Cardayre et al., patente de Estados Unidos N° 6.379.964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" de Crameri et al., patentes de Estados Unidos N° 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6.426.224 y PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" de Welch et al., patente de Estados Unidos N° 6.436.675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentada el 18 de enero, 2000, (PCT/US00/01202) y, p. ej. "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentada el 18 de julio, 2000 (EE.UU. N° Ser. 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" de Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero, 2000 (PCT/US00/01138); y "SINGLE­ STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" de Affholter, presentada el 6 de sep., 2000 (EE.UU. N° Ser. 09/656.549); y patentes de Estados Unidos N° 6.177.263; 6.153.410.
Los metodos no estocasticos o de “evolucion dirigida” incluyen, p. ej., mutagenesis por saturacion de sitio genicoSM (GSSMsm), reensamblado por ligado sintetico (SLR o GeneReassembly) o una de sus combinaciones, que se usan para modificar los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria para generar hidrolasas con propiedades nuevas o alteradas (p. ej., actividad en condiciones muy acidas o alcalinas, temperatura alta, y similares). Los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos modificados se pueden cribar de acuerdo con su actividad antes de ensayar la actividad de proteolftica u otra actividad. Se puede usar cualquier modalidad de ensayo o protocolo, p. ej., usando una plataforma de matrices de capilares. Vease, p. ej., patentes de EE.UU. n° 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.
Mutagenesis por saturacion o tecnologfa GSSMsm
Como se proporciona en la presente memoria, la modificacion de genes no estocastica, un "procedimiento de evolucion dirigida” se puede usar para generar hidrolasas con propiedades nuevas o alteradas. Las variaciones de este metodo se han denominado “mutagenesis por saturacion de sitio genico”, “mutagenesis por saturacion de sitio”, “mutagenesis de saturacion”, o simplemente “GSSMSM”. Se puede usar en combinacion con otros procedimientos de mutagenizacion. Se proporcionan en la presente memoria metodos para hacer enzimas y anticuerpos usando la tecnologfa GSSMsm, p. ej., como se describe en la presente memoria y tambien en las patentes de EE.UU. n° 6.171.820; 6.579.258; 6.238.884.
La tecnologfa GSSMsm comprende proporcionar un polinucleotido molde y una pluralidad de oligonucleotidos, en donde cada oligonucleotido comprende una secuencia homologa con el polinucleotido molde, de modo que se dirige a una secuencia especifica del polinucleotido molde, y una secuencia que es una variante del gen homologo; generando polinucleotidos progenie que comprenden variaciones de secuencia no estocasticas por replicacion del polinucleotido molde con los oligonucleotidos, generando asf polinucleotidos que comprenden variaciones de secuencias de genes homologas.
Se usan cebadores de codones que contienen una secuencia degenerada N,N,G/T para introducir mutaciones puntuales en un polinucleotido, de modo que se genere un conjunto de polinucleotidos progenie en el que esta representada una variedad completa de sustituciones de aminoacidos individuales en cada posicion de aminoacido, p. ej., un resto de aminoacido en un sitio activo de enzima o sitio de union de ligando es objetivo para ser modificado. Estos oligonucleotidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia degenerada N,N,G/T, y opcionalmente una segunda secuencia homologa. Los productos de traduccion de progenie en la direccion 3' a partir del uso de dichos oligonucleotidos incluyen todos los posibles cambios de aminoacidos en cada sitio de aminoacido a lo largo del polipeptido, porque la degeneracion de la secuencia N,N,G/T, incluye codones para los 20 aminoacidos. Uno de dichos oligonucleotidos degenerado (compuesto de, p. ej., un casete N,N,G/T degenerado) se usa para someter a cada codon original en un molde de polinucleotido original a una variedad completa de sustitucion de codones. Alternativamente, se usan al menos dos casetes degenerados, sea en el mismo oligonucleotido o no, para someter al menos dos codones originales en un molde de polinucleotido original a una variedad completa de sustitucion de codones. Por ejemplo, un oligonucleotido puede contener mas de una secuencia N,N,G/T, para introducir mutaciones de aminoacidos en mas de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T pueden estar directamente contiguas, o separadas por una o mas secuencias de nucleotidos adicionales. Oligonucleotidos que se pueden usar para introducir adiciones y eliminaciones se pueden usar solos o en combinacion con los codones que contienen una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinacion o permutacion de adiciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoacidos.
La mutagenesis simultanea de dos o mas posiciones de aminoacidos contiguas se hace usando un oligonucleotido que contiene tripletes N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia degenerada (N,N,G/T)n. Se usan casetes degenerados que tienen menos degeneracion que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser conveniente en algunos casos usar (p. ej., en un oligonucleotido) una secuencia triplete degenerada compuesta de un solo N, donde dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posicion del triplete. Se pueden usar cualesquiera otras bases incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas en las dos posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser conveniente en algunos casos usar (p. ej., en un oligo) una secuencia triplete N,N,N degenerada.
El uso de tripletes degenerados (p. ej., N,N,G/T) permite la generacion sistematica y facil de una amplia variedad de posibles aminoacidos naturales (para un total de 20 aminoacidos) en todas y cada una de las posiciones de aminoacidos en un polipeptido (alternativamente, los metodos tambien incluyen la generacion de menos de todas las posibles sustituciones por resto de aminoacido, o codon, posicion). Por ejemplo, para un polipeptido de 100 aminoacidos, se pueden generar 2000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoacidos por posicion X 100 posiciones de aminoacidos). Mediante el uso de un oligonucleotido o conjunto de oligonucleotidos que contienen un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuals pueden codificar los 20 posibles aminoacidos naturales. Por lo tanto, en un recipiente de reaccion en el que una secuencia de polinucleotido original se somete a mutagenesis por saturacion usando al menos uno de dichos oligonucleotidos, se generan 32 polinucleotidos progenie distintos que codifican 20 polipeptidos distintos. En cambio, el uso de un oligonucleotido no degenerado en la mutagenesis dirigida al sitio conduce solo a un producto polipeptido progenie por recipiente de reaccion. Los oligonucleotidos no degenerados se pueden usar opcionalmente en combinacion con cebadores degenerados descritos; por ejemplo, se pueden usar oligonucleotidos no degenerados para generar mutaciones puntuales espedficas en un polinucleotido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas espedficas, mutaciones puntuales que conducen a cambios de aminoacidos correspondientes y a mutaciones puntuales que causan la generacion de codones de parada y la correspondiente expresion de fragmentos de polipeptidos.
Cada recipiente de reaccion de mutagenesis por saturacion contiene polinucleotidos que codifican al menos 20 moleculas polipeptidos progenie (p. ej., hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de modo que los 20 aminoacidos naturales estan representados en la posicion de aminoacido espedfica que corresponde a la posicion del codon mutagenizada en el polinucleotido original (otros casos usan menos de 20 combinaciones naturales). Los polipeptidos progenie degenerados 32 veces de cada recipiente de reaccion de mutagenesis por saturacion se pueden someter a amplificacion clonal (p. ej., clonados en un hospedante adecuado, p. ej., hospedante E. coli, usando, p. ej., un vector de expresion) y someter a cribado de la expresion. Cuando un polipeptido progenie individual se identifica por cribado para presentar un cambio favorable en la propiedad (cuando se compara con el polipeptido original, tal como una mayor selectividad por la hidrolisis de esteres de palmitato frente a la hidrolisis de esteres de oleato), se pude secuenciar para identificar la sustitucion de aminoacido favorable correspondiente contenida en el mismo.
Tras la mutagenizacion en todas y cada una de las posiciones de aminoacidos en un polipeptido original usando mutagenesis por saturacion como se describe en la presente memoria, se pueden identificar cambios de aminoacidos favorables en una o mas posiciones de aminoacidos. Se pueden generar una o mas moleculas progenie nuevas que contienen una combinacion de todas o parte de estas sustituciones de aminoacidos favorables. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios de aminoacidos favorables espedficos en cada 3 posiciones de aminoacidos en un polipeptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posicion (sin cambio del aminoacido original, y cada uno de los dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por lo tanto, hay 3 x 3 x 3 o 27 posibilidades totales, incluyen 7 que se han examinado previamente, 6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de las tres posiciones) y sin cambio en ninguna posicion.
La mutagenesis por saturacion en el sitio se puede usar junto con otro medio estocastico o no estocastico para variar la secuencia, p. ej., reensamblado por ligado sintetico (vease mas adelante), barajado, quimerizacion, recombinacion y otros procedimientos de mutagenia y agentes de mutagenia. Se proporcionan en la presente memoria procedimiento(s) de mutagenia, incluyendo la mutagenesis por saturacion, de una forma iterativa.
Reensamblado por ligado sintetico (SLR)
Se proporciona en la presente memoria un sistema de modificacion de genes no estocastico denominado “reensamblado por ligado sintetico” o simplemente “SLR”, tambien conocido como tecnologfa "GeneReassembly", un “procedimiento de evolucion dirigida”, para generar polipeptidos p. ej., enzimas (tales como hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) o anticuerpos como se proporcionan en la presente memoria, con propiedades nuevas o alteradas. El SLR es un metodo de ligado de fragmentos de oligonucleotidos juntos de forma no estocastica. Este metodo difiere del barajado de oligonucleotidos estocastico en que los bloques estructurales de acido nucleico no estan barajados, concatenados o quimerizados aleatoriamente, sino que se ensamblan de forma no estocastica. Vease, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 6.773.900; 6.740.506; 6.713.282; 6.635.449; 6.605.449; 6.537.776.
El SLR comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polinucleotido molde, en donde el polinucleotido molde comprende la secuencia que codifica un gen homologo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleotidos unidades estructurales, en donde los polinucleotidos unidades estructurales estan disenados para el reensamblaje cruzado con el polinucleotido molde en una secuencia predeterminada, y un polinucleotido unidad estructural comprende una secuencia que es una variante del gen homologo y una secuencia homologa al polinucleotido molde que flanquea la secuencia variante; (c) combinar un polinucleotido unidad estructural con un polinucleotido molde de modo que el polinucleotido unidad estructural se reensamble de forma cruzada con el polinucleotido molde para generar polinucleotidos que comprenden variaciones de secuencia de genes homologas.
El SLR no depende de la presencia de niveles altos de homologfa entre polinucleotidos que se van a reorganizar. Por lo tanto, este metodo se puede usar para generar de forma no estocastica bibliotecas (o conjuntos) de moleculas progenie compuestas de mas de 1010 quimeras diferentes. El SLR se puede usar para generar bibliotecas compuestas de mas de 101000 quimeras progenie diferentes. Se proporcionan en la presente memoria metodos no estocasticos de produccion de un conjunto de moleculas de acido nucleico quimericas finalizadas que tienen un orden de ensamblado general que se eligen por diseno. Este metodo incluye las etapas de generar por diseno, una pluralidad de unidades estructurales de acidos nucleicos espedficos que tienen extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles que se pueden usar, y ensamblar estas unidades estructurales de acidos nucleicos, de modo que se logra un orden de ensamblado general disenado.
Los extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles de las unidades estructurales de acidos nucleicos que se van a ensamblar se considera que “se pueden usar” para este tipo de ensamblado ordenado si permiten que las unidades estructurales se acoplen en ordenes predeterminados. Por lo tanto, el orden de ensamblado general en el que las unidades estructurales de acidos nucleicos se pueden acoplar esta especificado por el diseno de los extremos que se pueden ligar. Si se va a usar mas de una etapa de ensamblado, entonces el orden de ensamblado general en el que se pueden acoplar las unidades estructurales de acidos nucleicos tambien esta especificado por el orden secuencial de la etapa(s) de ensamblado. En un caso, las piezas estructurales asociadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (p. ej., ADN ligasa de T4), para lograr la union covalente de las piezas estructurales.
El diseno de las unidades estructurales de oligonucleotidos se obtiene analizando un conjunto de moldes de secuencias de acidos nucleicos progenitores que sirven como base para producir un conjunto de progenie de polinucleotidos quimericos finalizados. Estos moldes de oligonucleotidos originales sirven por lo tanto como fuente de información de secuencia que ayudan en el diseno de unidades estructurales de acidos nucleicos que se van a mutagenizar, p. ej., quimerizar o barajar. En un aspecto de este metodo, las secuencias de una pluralidad de moldes de acidos nucleicos originales se alinean con el fin de seleccionar uno o mas puntos de demarcacion. Los puntos de demarcacion pueden estar situados en una zona de homologfa y estan compuestos de uno o mas nucleotidos. Estos puntos de demarcacion preferiblemente son compartidos por al menos dos de los moldes progenitores. Los puntos de demarcacion se pueden usar por lo tanto para delinear los lfmites de las unidades estructurales de oligonucleotidos que se van a generar con el fin de reorganizar los polinucleotidos originales. Los puntos de demarcacion identificados y seleccionados en las moleculas progenitoras sirven como potenciales puntos de quimerizacion en el ensamblado de las moleculas progenie quimericas finales. Un punto de demarcacion puede ser una zona de homologfa (compuesta de al menos una base nucleotida homologa) compartida por al menos dos secuencias de polinucleotidos originales. Alternativamente, un punto de demarcacion puede ser una zona de homologfa que es compartida por al menos la mitad de las secuencias de polinucleotidos originales, o puede ser una zona de homologfa que es compartida por al menos dos tercios de las secuencias de polinucleotidos originales. Alternativamente, un punto de demarcacion que se pude usar es una zona de homologfa que es compartida por al menos tres cuartas partes de las secuencias de polinucleotidos originales, o puede ser compartida por casi todas las secuencias de polinucleotidos originales. Un punto de demarcacion es una zona de homologfa que es compartida por todas las secuencias de polinucleotidos originales.
Un procedimiento de reensamblado por ligado se lleva a cabo exhaustivamente con el fin de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleotidos quimericos progenie. En otras palabras, estan representadas todas las posibles combinaciones ordenadas de unidades estructurales de acidos nucleicos en el conjunto de moleculas de acidos nucleicos quimericos finalizados. Al mismo tiempo, en otro caso, el orden de ensamblado (es decir, el orden de ensamblado de cada unidad estructural en la secuencia de 5' a 3 de cada acido nucleico quimerico finalizado) en cada combinacion se disena (o no estocastico) como se ha descrito antes. Se proporcionan en la presente memoria metodos no estocasticos que reducen la posibilidad de productos secundarios no deseados.
El metodo de reensamblado por ligado se lleva a cabo sistematicamente. Por ejemplo, el metodo se lleva a cabo con el fin de generar una biblioteca compartimentalizada sistematicamente de moleculas progenie, con compartimentos que se pueden cribar sistematicamente, p. ej., uno por uno. En otras palabras, este metodo proporciona, mediante el uso selectivo y sensato de unidades estructurales de acidos nucleicos, acoplado con el uso selectivo y sensato de reacciones de ensamblado escalonadas secuencialmente, que se pueda lograr un diseno donde se hagan conjuntos espedficos de productos progenie en cada uno de varios recipientes de reaccion. Esto permite llevar a cabo el analisis sistematico y procedimiento de cribado. Por lo tanto, estos metodos permiten analizar sistematicamente un numero potencialmente muy grande de moleculas progenie en grupos mas pequenos. Debido a su capacidad para llevar a cabo quimerizaciones de una forma que es muy flexible, aunque tambien exhaustiva y sistematica, en particular cuando hay un nivel de homologfa bajo entre las moleculas progenitoras, estos metodos proporcionan la generacion de una biblioteca (o conjunto) compuesto de un gran numero de moleculas progenie. Debido a la naturaleza no estocastica del metodo de reensamblado por ligado presente, las moleculas progenie generadas preferiblemente comprenden una biblioteca de moleculas de acidos nucleicos quimericos finalizados que tienen un orden de ensamblado general que se elige por diseno. Los metodos de mutagenesis por saturacion y de evolucion dirigida optimizada tambien se pueden usar para generar diferentes especies moleculares progenie.
Los metodos proporcionados en la presente memoria proporcionan la libertad de eleccion y control en relacion con la seleccion de puntos de demarcacion, el tamano y numero de unidades estructurales de acidos nucleicos, y el tamano y diseno de los acoplamientos. El requisito de homologfa intermolecular puede ser muy relajado. De hecho, se pueden incluso elegir puntos de demarcacion en zonas de poca o sin homologfa intermolecular. Por ejemplo, debido al balanceo de codones, es decir, la degeneracion de codones, se pueden introducir sustituciones de nucleotidos en unidades estructurales de acidos nucleicos sin alterar el aminoacido codificado originalmente en el molde progenitor correspondiente. Alternativamente, un codon se puede alterar de forma que la codificacion de un aminoacido original se altere. Se pueden introducir sustituciones en la unidad estructural de acido nucleico con el fin de aumentar la incidencia de los puntos de demarcacion homologos intermolecularmente y por lo tanto para permitir que se logre un mayor numero de acoplamientos entre las unidades estructurales, lo que a su vez permite generar un mayor numero de moleculas quimericas progenie.
La naturaleza sintetica de la etapa en la que se generan las unidades estructurales permite disenar e introducir nucleotidos (p. ej., uno o mas nucleotidos, que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias reguladoras) que mas tarde opcionalmente se pueden eliminar en un procedimiento in vitro (p. ej., mutagenesis) o en un procedimiento in vivo (p. ej., usando la capacidad de corte y empalme de genes de un organismo hospedante). Se aprecia que en muchos casos, la introduccion de estos nucleotidos tambien puede ser deseable por muchas otras razones ademas del beneficio potencial de crear un punto de demarcacion que se pueda usar.
Se usa una unidad estructural de acido nucleico para introducir un intron. Por lo tanto, los intrones funcionales se introducen en un gen artificial fabricado de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. El(los) intrones introducidos artificialmente pueden ser funcionales en celulas hospedantes para el corte y empalme de genes en gran medida en la forma en que los intrones que se encuentran de forma natural sirven funcionalmente en el corte y empalme de genes.
Sistema de evolucion dirigida optimizada
Se proporcionan en la presente memoria sistemas de modificacion de genes no estocasticos denominado “sistema de evolucion dirigida optimizada” para generar hidrolasas con propiedades nuevas o alteradas. La evolucion dirigida optimizada se dirige al uso de ciclos repetidos de redistribucion reductora, recombinacion y seleccion que permiten la evolucion molecular dirigida de acidos nucleicos por recombinacion. La evolucion dirigida optimizada permite la generacion de una gran poblacion de secuencias quimericas evolucionadas, en donde la poblacion generada esta enriquecida significativamente en secuencias que tienen un numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento.
Un suceso de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimerica donde se produce un desplazamiento de la secuencia de una variante original a otra variante original. Dicho punto normalmente esta en la union donde los oligonucleotidos de dos progenitores estan ligados entre sf para formar una sola secuencia. Este metodo permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleotidos de modo que la poblacion quimerica final de secuencias este enriquecida para el numero elegido de sucesos de entrecruzamiento. Esto proporciona mas control sobre la eleccion de variantes quimericas que tienen un numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento.
Ademas, este metodo proporciona un medio conveniente para explorar una cantidad tremenda de posibles variantes de protema en comparacion con otros sistemas. Previamente, si se generan, por ejemplo, 1013 moleculas quimericas durante una reaccion, sena extremadamente diffcil ensayar dicho gran numero de variantes quimericas para una actividad particular. Ademas, una parte significante de la poblacion progenie tendna un numero muy grande de sucesos de entrecruzamiento lo cual dana como resultado protemas que es menos probable que tengan mayores niveles de una actividad particular. Usando estos metodos, la poblacion de moleculas quimericas se puede enriquecer para aquellas variantes que tienen un numero particular de sucesos de entrecruzamiento. Por lo tanto, aunque se puedan generar todavfa 1013 moleculas quimericas durante una reaccion, cada una de las moleculas que se elige para el posterior analisis tiene lo mas probablemente, por ejemplo, solo tres sucesos de entrecruzamiento. Debido a que a poblacion progenie se puede sesgar para que tenga un numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento, se reducen los margenes de la variedad funcional entre las moleculas quimericas. Esto proporciona un numero mas manejable de variables cuando se calcula que oligonucleotido de los polinucleotido parentales originales debe ser responsable de afectar a un rasgo particular.
Un metodo para crear una secuencia de polinucleotido progenie quimerica es crear oligonucleotidos que corresponden a fragmentos o porciones de cada secuencia original. Alternativamente, cada oligonucleotido preferiblemente incluye una region unica de solapamiento de modo que la mezcla de los oligonucleotidos entre sf da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleotido ensamblado en el orden correcto. Se pueden encontrar protocolos alternativos para practicar estos metodos como se proporcionan en la presente memoria en las patentes de EE.UU. n° 6.773.900; 6.740.506; 6.713.282; 6.635.449; 6.605.449; 6.537.776; 6.361.974.
El numero de oligonucleotidos generados para cada variante original conlleva una relacion con el numero total de entrecruzamientos en la molecula quimerica que finalmente se crea. Por ejemplo, se pueden proporcionar tres variantes de secuencias de nucleotidos originales para realizar una reaccion de ligado con el fin de encontrar una variante quimerica que tenga, por ejemplo, mayor actividad a temperatura alta. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleotidos que corresponden a cada porcion de cada variante original. Por consiguiente, durante el proceso de reensamblado por ligado podna haber hasta 50 sucesos de entrecruzamiento dentro de cada una de las secuencias quimericas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleotidos quimericos generados contenga oligonucleotidos de cada variante original en orden alternante es muy baja. Si esta presente cada fragmento de oligonucleotido en la reaccion de ligado en la misma cantidad molar, es probable que en algunas posiciones los oligonucleotidos del mismo polinucleotido original liguen uno al lado de otro y por lo tanto no de como resultado un suceso de entrecruzamiento. Si la concentracion de cada oligonucleotido de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligado en este ejemplo, hay 1/3 de probabilidad (suponiendo 3 progenitores) de que un oligonucleotido de la misma variante original lique con la secuencia quimerica y no produzca entrecruzamiento.
Por consiguiente, se puede determinar una funcion de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la poblacion de sucesos de entrecruzamiento que es probable que ocurra durante cada etapa en una reaccion de ligado dado un numero fijo de variantes originales, un numero de oligonucleotidos que corresponden a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reaccion de ligado. El analisis estadfstico y matematico detras de la determinacion de la PDF se describe a continuacion. Usando estos metodos, se puede calcular dicha funcion de densidad de probabilidad, y por lo tanto enriquecer la poblacion progenie quimerica para un predeterminado numero de sucesos de entrecruzamiento que resultan de una reaccion de ligado particular. Ademas, se puede predeterminar un numero objetivo de sucesos de entrecruzamiento, y el sistema despues se puede programar para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleotido original durante cada etapa en la reaccion de ligado para dar una funcion de densidad de probabilidad que se centre en el numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento. Estos metodos se dirigen al uso de ciclos repetidos de redistribucion reductora, recombinacion y seleccion que permiten la evolucion molecular dirigida de un acido nucleico que codifica un polipeptido por recombinacion. Este sistema permite la generacion de una gran poblacion de secuencias quimericas evolucionadas, en donde la poblacion generada esta significativamente enriquecida en secuencias que tienen un numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento. Un suceso de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimerica donde se produce un desplazamiento de la secuencia de una variante original a otra variante original. Dicho punto normalmente esta en la union donde los oligonucleotidos de dos progenitores estan ligados entre sf para formar una sola secuencia. Este metodo permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleotidos de modo que la poblacion quimerica final de secuencias este enriquecida para el numero elegido de sucesos de entrecruzamiento. Esto proporciona mas control sobre la eleccion de variantes quimericas que tienen un numero predeterminado de sucesos de entrecruzamiento.
Determinacion de sucesos de entrecruzamiento
Los aspectos como se proporcionan en la presente memoria incluyen un sistema y software que recibe una funcion de densidad de probabilidad de entrecruzamiento deseada (PDF), el numero de genes originales que se van a reensamblar, y el numero de fragmentos en el reensamblado como entrada de datos. El resultado de este programa es una “PDF de fragmentos” que se puede usar para determinar una receta para producir los genes reensamblados, y la PDF de entrecruzamientos estimada de esos genes. El procesamiento descrito en la presente memoria se lleva a cabo preferiblemente en MATLAB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts) un lenguaje de programacion y entorno de desarrollo para informatica tecnica.
Procedimientos iterativos
Se proporcionan en la presente memoria procedimientos que se pueden repetir de forma iterativa. Por ejemplo, un acido nucleico (o, el acido nucleico) responsable de un fenotipo de hidrolasa o anticuerpo alterado se identifica, reafsla, modifica de nuevo, se ensaya de nuevo la actividad. Este procedimiento se puede repetir de forma iterativa hasta que se modifique geneticamente un fenotipo deseado. Por ejemplo, se pueden modificar geneticamente una ruta anabolica o catabolica bioqmmica entera en una celula, incluyendo la actividad proteolttica.
De forma similar, si se determina que un oligonucleotido particular no tiene ningun efecto en el rasgo deseado (p. ej., un nuevo fenotipo de hidrolasa) se puede eliminar como una variable sintetizando oligonucleotidos originales mas largos que incluyen la secuencia que se va a eliminar. Puesto que incorporar la secuencia dentro de una secuencia mas larga previene cualquier suceso de entrecruzamiento, ya no habra ninguna variacion de esta secuencia en los polinucleotidos progenie. Esta practica iterativa de determinacion de que oligonucleotidos estan mas relacionados con el rasgo deseado, y cuales no estan relacionados, permite una exploracion mas eficaz de todas las posibles variantes de protemas que pueden proporcionar un rasgo o actividad particular.
Barajado in vivo
El barajado de moleculas in vivo se usa en metodos que proporcionan variantes de polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., anticuerpos, hidrolasas, y similares. El barajado in vivo se puede llevar a cabo usando la propiedad natural de las celulas de recombinar multfmeros. Aunque la recombinacion in vivo a proporcionado la ruta natural principal a la diversidad molecular, la recombinacion genetica sigue siendo un procedimiento relativamente complejo que implica 1) el reconocimiento de homologfas; 2) escision de cadena, invasion de cadena, y etapas metabolicas que conducen a la produccion de quiasma recombinante; y finalmente 3) la resolucion de quiasma en moleculas recombinadas discretas. La formacion del quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homologas.
Se proporcionan en la presente memoria metodos para producir un polinucleotido hfbrido a partir de al menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido. Tambien se proporcionan en la presente memoria metodos usados para producir un polinucleotido hfbrido introduciendo al menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido que comparten al menos una region de homologfa de secuencia parcial, en una celula hospedante adecuada. Las regiones de homologfa de secuencia parcial promueven procesos que dan como resultado la reorganizacion de secuencias que producen un polinucleotido hforido. La expresion “polinucleotido hforido” abarca cualquier secuencia de nucleotidos que sea resultado de un metodo como se proporciona en la presente memoria y contenga la secuencia de al menos dos secuencias de polinucleotidos originales. Dichos polinucleotidos hforidos pueden ser resultado de sucesos de recombinacion intermolecular que promueven la integracion de secuencias entre moleculas de ADN. Ademas, dichos polinucleotidos hforidos pueden ser resultado de procesos de redistribucion reductora intramolecular que usan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleotidos dentro de una molecula de ADN.
Produccion de variantes de secuencia
Se proporcionan en la presente memoria metodos para hacer variantes de secuencias de las secuencias de acido nucleico e hidrolasa y anticuerpo como se proporcionan en la presente memoria, o aislar hidrolasas usando los acidos nucleicos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. Se proporcionan en la presente memoria variantes de un gen de hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, que se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, p. ej., metodos aleatorios o estocasticos, o metodos no estocasticos o de “evolucion dirigida”, como se ha descrito antes.
En la presente memoria se proporcionan metodos para generar una variante de un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearasa, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un acido nucleico molde que comprende un acido nucleico acido como se proporciona en la presente memoria; y (b) modificar, eliminar o anadir uno o mas nucleotidos en la secuencia de molde, o una combinacion de los mismos, para generar una variante del acido nucleico molde. El metodo puede comprender ademas expresar la variante de acido nucleico para generar una hidrolasa variante, p. ej., un polipeptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. Las modificaciones, adiciones o eliminaciones se pueden introducir por un metodo que comprende PCR propensa a errores, barajado, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblaje, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis de casete, mutagenesis de conjunto recursivo, mutagenesis de conjunto exponencial, mutagenesis espedfica de sitio, mutacion de saturacion del sitio del genSM (GSSMsm), reensamblaje de la ligadura sintetica (SLR o Gene Reassembly) o una combinacion de los mismos. Las modificaciones, adiciones o eliminaciones se introducen por un metodo que comprende recombinacion, recombinacion de secuencia recursiva, mutagenesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagenesis de molde que contiene uracilo, mutagenesis duplex con huecos, mutagenesis de reparacion de errores de emparejamiento puntuales, mutagenesis de cepa hospedante deficiente en la reparacion, mutagenesis qrnmica, mutagenesis radiogenica, mutagenesis por eliminacion, mutagenesis por seleccion por restriccion, mutagenesis por purificacion por restriccion, smtesis genica artificial, mutagenesis por conjuntos, creacion de multfmeros de acido nucleico quimerico y una combinacion de los mismos.
El metodo se puede repetir de forma iterativa hasta que se produce una hidrolasa, p. ej., una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipeptido codificado por el acido nucleico molde. La variante de hidrolasa, p. ej., polipeptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa es termotolerante, y retiene algo de actividad despues de estar expuesta a una temperatura elevada. Alternativamente, la variante de hidrolasa, p. ej., polipeptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa tiene mayor glicosilacion en comparacion con la hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa codificada por un acido nucleico molde. Alternativamente, la variante de hidrolasa, p. ej., polipeptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa tiene actividad de hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa a alta temperatura, en donde la hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa codificada por el acido nucleico molde no es activa a alta temperatura. El metodo se puede repetir de forma iterativa hasta que se produzca una secuencia codificante de hidrolasa, p. ej., una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa que tenga un uso de codones alterado respecto al del acido nucleico molde. El metodo se puede repetir de forma iterativa hasta que se produce un gen de hidrolasa, p. ej., una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa, que tiene niveles mas altos o mas bajos de expresion de mensajero o estabilidad respecto de los del acido nucleico molde. La formulacion del producto final de hidrolasa, p. ej., el producto de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, permite un aumento o modulacion del rendimiento de la hidrolasa, p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa en el producto.
Las variantes aisladas se pueden encontrar de forma natural. Las variantes tambien se pueden crear in vitro. Las variantes se pueden crear usando tecnicas de ingeniena genetica tales como mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis qrnmica aleatoria, procedimientos de eliminacion por exonucleasa III, y tecnicas de clonacion estandar. Alternativamente, dichas variantes, fragmentos, analogos o derivados se pueden crear usando smtesis qrnmica o procedimientos de modificacion. Otros metodos para hacer variantes tambien son familiares para los expertos en la tecnica. Estos incluyen procedimientos en los que secuencias de acidos nucleicos obtenidas de aislados naturales se modifican para generar acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen caractensticas que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En dichos procedimientos, se generan y caracterizan un gran numero de secuencias variantes que tienen una o mas diferencias de nucleotidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Estas diferencias de nucleotidos pueden producir cambios de aminoacidos con respecto a los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, se pueden crear variantes usando la PCR propensa a error. En la PCR propensa a error, la PCR se lleva a cabo en condiciones donde la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtiene una tasa alta de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR. La PCR propensa a error, se describe, p. ej., en Leung, D.W., et al., Technique, 1:11-15, 1989) y Caldwell, R. C. y Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33, 1992. Brevemente, en dichos procedimientos, los acidos nucleicos que se van a mutagenizar se mezclan con cebadores de la PCR, tampon de reaccion, MgCh, MnCh, polimerasa Taq y una concentracion adecuada de dNTP para lograr una tasa alta de mutacion puntual a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR. Por ejemplo, la reaccion se puede llevar a cabo usando 20 fmoles de acido nucleico que se va a mutagenizar, 30 pmol de cada cebador de la PCR, un tampon de reaccion que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3) y gelatina al 0,01%, MgCh 7 mM, MnCh 0,5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La PCR se puede llevar a cabo durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, y 72° C durante 1 min. Sin embargo, se apreciara que estos parametros se pueden variar sea según adecuado. Los acidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector adecuado y se evaluan las actividades de los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos mutagenizados.
Tambien se pueden crear variantes usando mutagenesis dirigida por oligonucleotidos para generar mutaciones espedficas de sitio en cualquier ADN clonado de interes. La mutagenesis por oligonucleotidos se describe, p. ej., en Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Brevemente, en dichos procedimientos se sintetizan una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios que llevan una o mas mutaciones que se van a introducir en el ADN clonado y se insertan en el ADN clonado que se va a mutagenizar. Se recuperan los clones que contienen el ADN mutagenizado y se evaluan las actividades de los polipeptidos que codifican.
Otro metodo para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de la PCR de una mezcla de fragmentos de ADN pequenos. Se producen en paralelo un gran numero de diferentes reacciones de PCR en el mismo vial, con los productos de una reaccion cebando los productos de otra reaccion. La PCR de ensamblaje se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. n° 5.965.408.
Otro metodo mas de generacion de variantes es la mutagenesis por PCR sexual. En la mutagenesis por PCR sexual, se produce la recombinacion homologa forzada entre moleculas de ADN de secuencias de ADN diferentes pero muy relacionadas in vitro, como resultado de la fragmentacion aleatoria de la molecula de ADN basada en la homologfa de secuencia, seguido de fijacion del entrecruzamiento por extension del cebador en una reaccion de PCR. La mutagenesis por PCR sexual se describe, p. ej., en Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747­ 10751. Brevemente, en dichos procedimientos, una pluralidad de acidos nucleicos que se van a recombinar se digiere con DNasa para generar fragmentos que tienen un tamano medio de 50-200 nucleotidos. Se purifican fragmentos del tamano medio deseado y se vuelven a suspender en una mezcla de PCR. La PCR se lleva a cabo en condiciones que facilitan la recombinacion entre los fragmentos de acidos nucleicos. Por ejemplo, la PCR se puede llevar a cabo por resuspension de los fragmentos purificados a una concentracion de 10-30 ng/l en una solucion de 0,2 mM de cada dNTP, MgCh 2,2 mM, KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9,0, y Triton X-100 al 0,1%. 2,5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de mezcla de reaccion que se anade y la PCR se lleva a cabo usando el siguiente regimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 veces) y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciara que estos parametros se pueden v saergiaúrn sea adecuado. Se pueden incluir oligonucleotidos en las reacciones de PCR. Alternativamente, se puede usar el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en un primer conjunto de reacciones de PCR y se puede usar la polimerasa Taq en un conjunto posterior de reacciones de PCR. Las secuencias recombinantes se afslan y se evaluan las actividades de los polipeptidos que codifican.
Tambien se pueden crear variantes por mutagenesis in vivo. Las mutaciones aleatorias en una secuencia de interes se generan por propagacion de la secuencia de interes en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli que lleva la mutacion en una o mas de las rutas de reparacion del ADN. Dichas cepas “mutadoras” tienen una tasa de mutacion aleatoria mas alta que la de un pariente de tipo natural. La propagacion del ADN en una de estas cepas finalmente generara mutaciones aleatorias en el ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para usar en la mutagenesis in vivo se describen, p. ej., en la publicacion PCT N° WO 91/16427.
Tambien se pueden generar variantes usando mutagenesis de casete. En la mutagenesis de casete, una pequena region de una molecula de ADN bicatenaria se sustituye por un “casete” de oligonucleotido sintetico que difiere de la secuencia natural. El oligonucleotido a menudo contiene la secuencia natural aleatorizada completa y/o parcialmente.
La mutagenesis de ensamblaje recursivo tambien se puede usar para generar variantes. La mutagenesis de ensamblaje recursivo es un algoritmo para la modificacion genetica de protemas (mutagenesis de protemas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes fenotfpicamente relacionados, cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoacidos. Este metodo usa un mecanismo de retroalimentacion para controlar los ciclos sucesivos de mutagenesis de casete combinatoria. La mutagenesis de ensamblaje recursivo se describe p. ej., en Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815.
Las variantes se pueden crear usando la mutagenesis de ensamblaje exponencial. La mutagenesis de ensamblaje exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un porcentaje alto de mutantes unicos y funcionales, en donde grupos pequenos de restos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posicion alterada, aminoacidos que conducen a protemas funcionales. La mutagenesis de ensamblaje exponencial se describe, p. ej., en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552. La mutagenesis aleatoria y dirigida al sitio se describe, p. ej., en Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455.
Las variantes se pueden crear usando procedimientos de barajado en donde partes de una pluralidad de acidos nucleicos que codifican distintos polipeptidos se fusionan entre sf para crear secuencias de acidos nucleicos quimericos que codifican polipeptidos quimericos como se describe, p. ej., en las patentes de EE.UU. n° 5.965.408; 5.939.250.
Se proporcionan en la presente memoria variantes de polipeptidos que comprenden secuencias en las que uno o mas de los restos de aminoacidos (p. ej., de un polipeptido de ejemplo, p. ej., SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varios) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes), se sustituyen por un resto de aminoacido conservado o no conservado (p. ej., un resto de aminoacido conservado) y dicho resto de aminoacidos conservado sustituido puede ser o no uno codificado por el código genetico. Las sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoacido dado en un polipeptido por otro aminoacido de caractensticas similares. Por lo tanto, los polipeptidos descritos en la presente memoria incluyen aquellos con sustituciones conservadoras de secuencias, p. ej., las secuencias de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varios) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes), que incluyen pero no se limitan a las siguientes sustituciones: sustituciones de un aminoacido alifatico tal como alanina, valina, leucina e isoleucina por otro aminoacido alifatico; sustitucion de una serina por una treonina o viceversa; sustitucion de un resto acido tal como acido aspartico y acido glutamico por otro resto acido; sustitucion de un resto que lleva un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro resto que lleva un grupo amida; intercambio de un resto basico tal como lisina y arginina por otro resto basico; y sustitucion de un resto aromático tal como fenilalanina, tirosina o triptofano por otro resto aromático. Otras variantes son aquellas en las que uno o mas de los restos de aminoacidos de los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen un grupo sustituyente.
Otras variantes dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria, son aquellas en las que el polipeptido esta asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipeptido, por ejemplo, polietilenglicol. Variantes adicionales dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria son aquellas en las que se fusionan aminoacidos adicionales al polipeptido, tales como una secuencia lfder, una secuencia secretora, una secuencia de proprotema o una secuencia que facilita la purificacion, enriquecimiento o estabilizacion del polipeptido. Las variantes, fragmentos, derivados y analogos de los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden retener la misma funcion o actividad biologica que los polipeptidos de ejemplo, p. ej., una actividad proteolftica, como se describe en la presente memoria. Alternativamente, la variante, fragmento, derivado o analogo incluye una proprotema, de modo que la variante, fragmento, derivado o analogo se puede activar por escision de la parte de proprotema para producir un polipeptido activo.
Optimizacion de codones para lograr niveles altos de expresion de protemas en celulas hospedantes
Se proporcionan en la presente memoria metodos para modificar acidos nucleicos que codifican hidrolasas para modificar el uso de codones. Se proporcionan en la presente memoria metodos para modificar codones en un acido nucleico que codifica una hidrolasa para aumentar o disminuir su expresion en una celula hospedante, p. ej., una celula bacteriana, de insecto, mairnfero, levadura o planta. Tambien se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos que codifican una hidrolasa modificada para aumentar su expresion en una celula hospedante, la hidrolasa asf modificada, y metodos para hacer las hidrolasas modificadas. El metodo comprende identificar un codon “no preferido” o “menos preferido” en el acido nucleico que codifica la hidrolasa y sustituir uno o mas de esos codones no preferidos o menos preferidos por un “codon preferido” que codifica el mismo aminoacido que el codon sustituido, y al menos un codon no preferido o menos preferido en el acido nucleico se ha sustituido por un codon preferido que codifica el mismo aminoacido. Un codon preferido es un codon representado en exceso en las secuencias codificantes en genes en la celula hospedante y un codon no preferido o menos preferido es un codon subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la celula hospedante.
Las celulas hospedantes para la expresion de acidos nucleicos, expresion de casetes y vectores como se proporcionan en la presente memoria incluyen bacterias, levaduras, hongos, celulas de plantas, celulas de insectos y celulas de mamnferos. Por lo tanto, se proporcionan en la presente memoria metodos para optimizar el uso de codones en todas estas celulas, acidos nucleicos de codones alterados y polipeptidos hechos por los acidos nucleicos de codones alterados. Las celulas hospedantes de ejemplo incluyen bacterias Gram negativas, tales como Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens; bacterias Gram positivas, tales como Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Las celulas hospedantes de ejemplo tambien incluyen organismos eucariotas, p. ej., diferentes levaduras, tales como Saccharomyces sp., que incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, y celulas y lmeas celulares de m ai^ero y celulas y lmeas celulares de insecto. Otras celulas hospedantes de ejemplo incluyen celulas bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium y diferentes especies dentro del genero Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, celulas fungicas, tales como Aspergillus, levaduras tales como cualquier especie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, que incluyen Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe, celulas de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, celulas animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La seleccion de un hospedante adecuado esta en la experiencia de los expertos en la tecnica. Se proporcionan en la presente memoria acidos nucleicos y polipeptidos optimizados para la expresion en estos organismos y especies.
Por ejemplo, los codones de un acido nucleico que codifica una hidrolasa aislados de una celula bacteriana se modifican de modo que el acido nucleico es expresado de forma optima en una celula bacteriana diferente de la bacteria de la que se obtuvo la hidrolasa, una levadura, un hongo, una celula de planta, una celula de insecto o una celula de mairnfero. Los metodos para optimizar codones son bien conocidos en la tecnica, vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Vease tambien Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe la optimizacion de codones en sistemas de raton; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que describe la optimizacion de codones en levaduras; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, que describe la optimizacion de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif.20:252-264, que describe la optimizacion del uso de codones que afecta a la secrecion en E. coli.
Animales no humanos transgenicos
Se proporcionan en la presente memoria animales no humanos transgenicos que comprenden un acido nucleico, un polipeptido (p. ej., una hidrolasa o un anticuerpo como se proporcionan en la presente memoria), un casete o vector de expresion o una celula transfectada o transformada como se proporcionan en la presente memoria. Los animales no humanos transgenicos pueden ser, p. ej., cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprenden los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria. Estos animales se pueden usar, p. ej., como modelos in vivo para estudiar la actividad de hidrolasa o como modelos para cribar agentes que cambian la actividad de hidrolasa in vivo. Las secuencias codificantes de los polipeptidos que se van a expresar en animales no humanos transgenicos se pueden disenar para que sean constitutivas, o esten bajo control de factores reguladores de la transcripcion espedficos, de tejido, espedficos de desarrollo o inducibles. Los animales no humanos transgenicos se pueden disenar y generar usando cualquier metodo conocido en la tecnica; vease, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 6.211.428; 6.187.992; 6.156.952; 6.118.044; 6.111.166; 6.107.541; 5.959.171; 5.922.854; 5.892.070; 5.880.327; 5.891.698; 5.639.940; 5.573.933; 5.387.742; 5.087.571, que describen la fabricacion y uso de celulas y huevos transformados y ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas transgenicos. Vease tambien, p. ej., Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, que describen la produccion de protemas recombinantes en la leche de animales lecheros transgenicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461, que demuestran la produccion de cabras transgenicas. La patente de EE.UU. n° 6.211.428, describe la fabricacion y uso de marnfferos no humanos transgenicos que expresan en sus cerebros una construccion de acido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente de EE.UU. n° 5.387.742, describe la inyeccion de secuencias de ADN sinteticas o recombinantes clonadas en huevos de raton fertilizados, implante de los huevos inyectados en hembras pseudoprenadas y llevar a termino los ratones transgenicos cuyas celulas expresan protemas relacionadas con la patologfa de la enfermedad de Alzheimer. La patente de EE.UU. n° 6.187.992, describe la fabricacion y uso de un raton transgenico cuyo genoma comprende una alteracion del gen que codifica la protema precursora de amiloide (APP).
Tambien se pueden usar “animales con inactivacion genica” para la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria. Por ejemplo, los animales transgenicos o modificados comprenden un “animal con inactivacion genica”, p. ej., un “raton con inactivacion genica”, geneticamente modificados para no expresar un gen endogeno, que se sustituye por un gen que expresa una hidrolasa, o una protema de fusion que comprende una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Como se ha indicado antes, las inactivaciones genicas funcionales tambien se pueden generar usando secuencias de sentido contrario como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., moleculas de ARNi bicatenarias.
Plantas y semillas transgenicas
Se proporcionan en la presente memoria plantas y semillas transgenicas que comprenden un acido nucleico, un polipeptido (p. ej., una hidrolasa o un anticuerpo como se proporcionan en la presente memoria), un casete o vector de expresion o una celula transfectada o transformada como se proporcionan en la presente memoria. La planta transgenica puede ser dicotiledonea (una dicot) o monocotiledonea (una monocot). Se proporcionan en la presente memoria metodos para fabricar y usar estas plantas y semillas transgenicas. La planta o celula de planta transgenica que expresa un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, se puede construir de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6.309.872.
Los acidos nucleicos y construcciones de expresion como se proporcionan en la presente memoria, se pueden introducir en una celula vegetal por cualquier medio. Por ejemplo, los acidos nucleicos o construcciones de expresion se pueden introducir en el genoma de un hospedante vegetal deseado, o los acidos nucleicos o construcciones de expresion pueden ser episomas. La introduccion en el genoma de una planta deseada puede ser de modo que la produccion de hidrolasa por el hospedante este regulada por elementos de control transcripcionales o traduccionales endogenos. Se proporcionan ademas en la presente memoria “plantas con inactivacion genica” donde la insercion de la secuencia genica, p. ej., por recombinacion homologa, ha alterado la expresion del gen endogeno. Los medios para generar plantas “con inactivacion genica” se conocen bien en la tecnica, vease, p. ej., Strepp (1998J Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Vease la discusion sobre plantas transgenicas mas adelante.
Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para conferir rasgos deseados esencialmente a cualquier planta, p. ej., a plantas que contienen semillas oleaginosas, incluyendo salvado de arroz, colza (canola), girasol, oliva, palma o soja, y similares, o en plantas productoras de glucosa o almidon, como mafz, patata, trigo, arroz, cebada y similares. Los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para manipular rutas metabolicas de una planta con el fin de optimizar o alterar la expresion en el hospedante de una hidrolasa o producto de una hidrolasa, p. ej., un aceite, un lfpido, tal como un mono, di o triacilglicerido y similares. Pueden cambiar las proporciones de lfpidos, conversion y renovacion de lfpido en una planta. Esto puede facilitar el procesamiento industrial en una planta. Alternativamente, una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede usar en la produccion de una planta transgenica para producir un compuesto no producido de forma natural por esa planta. Esto puede disminuir los costes de produccion o crear un nuevo producto.
La primera etapa en la produccion de una planta transgenica implica hacer una construccion de expresion para la expresion en una celula vegetal. Estas tecnicas son bien conocidas en la materia. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia codificante para facilitar la union eficaz de ribosomas a ARNm y seleccionar las secuencias terminadoras de genes adecuadas. Un promotor de ejemplo constitutivo es CaMV35s, del virus del mosaico de la coliflor, que en general produce un grado alto de expresion en plantas. Otros promotores son mas espedficos y responden a senales en el entorno interno o externo de la planta. Un promotor inducible por luz de ejemplo es el promotor del gen cab, que codifica la protema de union a la clorofila a/b principal.
El acido nucleico se modifica para lograr mayor expresion en una celula vegetal. Por ejemplo, una secuencia como se proporciona en la presente memoria es probable que tenga mayor porcentaje de pares de nucleotidos A-T comparado con el visto en una planta, algunas de las cuales prefieren las parejas de nucleotidos G-C. Por lo tanto, los nucleotidos A-T en la secuencia codificante se pueden sustituir por nucleotidos G-C sin cambiar significativamente la secuencia de aminoacidos, para potenciar la produccion del producto genico en celulas vegetales.
Se puede anadir gen de marcador seleccionable a la construccion de gen con el fin de identificar celulas vegetales o tejidos que hayan integrado satisfactoriamente el transgen. Esto puede ser necesario porque lograr la incorporacion y expresion de genes en celulas vegetales es un suceso raro, que ocurre en solo un porcentaje pequeno de los tejidos o celulas a los que se dirige. Los genes de marcadores seleccionables codifican protemas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son toxicos para las plantas, tales como antibioticos o herbicidas. Solo las celulas vegetales que han integrado el gen de marcador seleccionable sobreviviran cuando crezcan en un medio que contiene el antibiotico o herbicida adecuado. Como para otros genes insertados, los genes marcadores tambien requieren promotor y secuencias de terminacion para la funcion adecuada.
Hacer plantas o semillas transgenicas comprende incorporar secuencias como se proporcionan en la presente memoria y, opcionalmente, genes de marcadores en una construccion de expresion objetivo (p. ej., un plasmido, un fago), junto con la colocacion del promotor y secuencias terminadoras. Esto puede implicar transferir el gen modificado en la planta por un metodo adecuado. Por ejemplo, se puede introducir una construccion directamente en el ADN genomico de la celula vegetal usando tecnicas tales como electroporacion y microinyeccion de protoplastos de celulas vegetales, o las construcciones se pueden introducir directamente en tejido de planta usando metodos balfsticos, tales como bombardeo de partfculas de ADN. Por ejemplo, vease, p. ej., Christou (1997) Plant Mol. Biol.
35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, que describen el uso de bombardeo de partfculas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) vease antes, para el uso de bombardeo de partfculas para introducir YAC en celulas vegetales. Por ejemplo, Rinehart (1997) vease antes, usaba el bombardeo de partfculas para generar plantas de algodon transgenicas. Se describen aparatos para acelerar partfculas en la patente de EE.UU. n° 5.015.580; y, el instrumento de aceleracion de partfculas BioRad (Biolistics) p DS-2000 disponible en el mercado; vease tambien, John, patente de EE.UU. n° 5.608.148; y Ellis, patente de EE.UU. n° 5.681.730, que describe la transformacion mediada por partfculas de gimnospermas.
Los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar acidos nucleicos, p. ej. una construccion de expresion. Aunque la regeneracion de la planta a partir de protoplastos no es facil con cereales, la regeneracion de la planta es posible en legumbres usando embriogenesis somatica a partir de protoplastos derivados del callo. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo usando una tecnica de pistola genica, donde el ADN se aplica como recubrimiento sobre microproyectiles de tungsteno, disparo de 1/100 del tamano de las celulas, que llevan al ADN profundo en las celulas y los organulos. El tejido transformado se induce despues para la regeneracion, normalmente por embriogenesis somatica. Esta tecnica ha tenido exito en varias especies de cereales que incluyen el mafz y el arroz.
Los acidos nucleicos, p. ej., construcciones de expresion, tambien se pueden introducir en celulas vegetales usando virus recombinantes. Las celulas vegetales se pueden transformar usando vectores vmcos, tales como, p. ej., vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), vease Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants," Mol. Biotechnol. 5:209-221.
Alternativamente, los acidos nucleicos p. ej. una construccion de expresion, se pueden combinar con regiones flanqueadoras de ADN-T adecuadas e introducir en un vector hospedante de Agrobacterium tumefaciens. Las funciones de virulencia en el hospedante Agrobacterium tumefaciens dirigiran la insercion de la construccion y el marcador adyacente en el ADN de la celula vegetal cuando la celula es infectada por las bacterias. Las tecnicas de transformacion mediadas por Agrobacterium tumefaciens, que incluyen desarmado y uso de vectores binarios, estan bien descritos en la bibliograffa cientffica. Vease, p. ej., Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995). El ADN en una celula de A. tumefaciens esta contenido en el cromosoma bacteriano, asf como en otra estructura conocida como el plasmido Ti (inductor tumoral). El plasmido Ti contiene un tramo de ADN denominado ADN-T (~20 kb de longitud) que es transferido a la celula vegetal en el proceso de infeccion y una serie de genes vir (virulencia) que dirigen el proceso de infeccion. A. tumefaciens solo puede infectar una planta a traves de heridas: cuando la rafz o tallo de una planta es danada desprende determinadas senales qmmicas, en respuesta a las cuales, los genes vir de A. tumefaciens son activados y dirigen una serie de sucesos necesarios para la transferencia del ADN-T desde el plasmido Ti al cromosoma de la planta. El ADN-T entra en la celula de la planta a traves de la herida. Una especulacion es que el ADN-T espera hasta que el ADN de la planta se ha replicado o transcrito, despues se inserta el mismo en el ADN de la planta expuesta. Con el fin de usar A. tumefaciens como un vector transgenico, se ha eliminado la seccion de induccion tumoral del ADN-T, mientras que se retienen las regiones del borde del ADN-T y los genes vir. Despues el transgen se inserta entre las regiones borde del ADN-T, donde es transferido a la celula vegetal y queda integrado en los cromosomas de la planta.
Se proporcionan en la presente memoria metodos para la transformacion de plantas monocotiledoneas usando los acidos nucleicos descritos en la presente memoria, que incluyen cereales importantes, vease Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Vease tambien, p. ej., Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) vease antes; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que describen la integracion de ADN-T en ADN genomico. Vease, tambien D'Halluin, patente de EE.UU. n° 5.712.135, que describe un procedimiento para la integracion estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una celula de un cereal u otra planta monocotiledonea.
La tercera etapa puede implicar la seleccion y regeneracion de plantas enteras capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generacion. Dichas tecnicas de regeneracion se basan en la manipulacion de algunas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, basandose tfpicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleotidos deseadas. La regeneracion de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pag. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pag. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneracion tambien se puede obtener de callos, explantes, organos o partes de la planta. Dichas tecnicas de regeneracion se describen en general en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486. Para obtener plantas enteras a partir de tejidos transgenicos tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar en condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un procedimiento conocido como cultivo tisular. Una vez que se han generado plantas enteras y producen semillas, empieza la evaluacion de la progenie.
Despues de que el casete de expresion se incorpora establemente en plantas transgenicas, se puede introducir en otras plantas por cruce sexual. Se puede usar cualquiera de una serie de tecnicas de cruce convencionales, dependiendo de las especies que se van a cruzar. Puesto que la expresion transgenica de los acidos nucleicos descritos en la presente memoria conduce a cambios fenotfpicos, las plantas que comprenden los acidos nucleicos recombinantes, se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por lo tanto, la semilla como se proporciona en la presente memoria se puede obtener de un cruce entre dos plantas transgenicas como se proporciona en la presente memoria, o un cruce entre una planta como se proporciona en la presente memoria y otra planta. Los efectos deseados (p. ej., expresion de los polipeptidos como se proporciona en la presente memoria para producir una planta con el contenido de lfpidos o aceite alterado, aumentado y/o disminuido) se pueden potenciar cuando ambas plantas parentales expresan los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. Los efectos deseados se pueden pasar a las generaciones futuras de plantas por medios de propagacion convencionales.
Los acidos nucleicos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria son expresados o se insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas transgenicas como se proporcionan en la presente memoria pueden ser dicotiledoneas o monocotiledoneas. Los ejemplos de plantas transgenicas monocotiledoneas son hierbas, tales como hierba de pradera (Poa), hierba forrajera tales como festuca, lolium, hierba templada, tales como agrostis, y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y mafz. Los ejemplos de plantas transgenicas dicotiledoneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisantes, judfas y soja, y plantas crudferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana Por lo tanto, las plantas y semillas transgenicas incluyen una amplia variedad de plantas, que incluyen, pero no se limitan a especies de los generos Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.
Alternativamente, los acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria son expresados en plantas que contienen celulas de fibra, que incluyen, p. ej., algodon, arbol de algodon de seda (kapok, ceiba pentandra), sauce del desierto, arbusto de creosota, Krascheninnikovia lanata, balsa, ramio, kenaf, canamo, roselle, yute, abaca sisal y lino. Alternativamente, las plantas transgenicas pueden ser miembros del genero Gossypium, que incluye miembros de cualquiera de las especies Gossypium, tales como G. arboreum; G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.
Las plantas transgenicas de la presente memoria se pueden usar para producir grandes cantidades de los polipeptidos (p. ej., anticuerpos, hidrolasas) como se proporcionan en la presente memoria. Por ejemplo, vease Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que produce protema de la leche humana beta-casema en plantas de patata transgenicas usando un promotor de mannopina sintasa bidireccional (mas1',2') inducible por auxina con metodos de transformacion de disco de hoja mediados por Agrobacterium tumefaciens).
Usando procedimientos conocidos, un experto en la tecnica puede cribar plantas proporcionadas en la presente memoria, detectando el aumento o disminucion del ARNm transgenico o protema en plantas transgenicas. Los medios para detectar y cuantificar los ARNm o protemas son bien conocidos en la tecnica.
Se proporcionan en la presente memoria acidos grasos o derivados de acidos grasos de plantas transgenicas como se proporciona en la presente memoria, p. ej., plantas oleaginosas transgenicas. Se producen plantas oleaginosas transgenicas que comprenden al menos una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. La planta transgenica puede comprender un gen de hidrolasa unido operativamente a un promotor, permitiendo una expresion del gen en compartimentos celulares, extracelulares o de tejidos distintos de aquellos en los que se acumulan los lfpidos de la planta, o permitiendo la induccion exogena de la hidrolasa. Las semillas y/o frutas que contienen los lfpidos de las plantas se recolectan, las semillas y/o las frutas se pueden triturar (si es necesario despues de un tratamiento de induccion genica con hidrolasa (p. ej., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) para poner en contacto los lfpidos y la hidrolasa como se proporciona en la presente memoria contenida en las semillas y/o frutas. Se puede permitir que la mezcla se incube para permitir la hidrolisis enzimatica de los lfpidos del material molido por la accion catalttica de la lipasa, como se proporciona en la presente memoria, contenida en el material triturado. Los acidos grasos formados por la hidrolisis se extraen y/o se convierten con el fin de obtener los derivados de acidos grasos deseados.
Este proceso de hidrolisis enzimatica como se proporciona en la presente memoria usa condiciones de operacion suaves y puede ser a pequena escala y usar instalaciones baratas. Por ejemplo, se induce que la planta como se proporciona en la presente memoria produzca la hidrolasa para la transformacion de los lfpidos de la planta. Usando esta estrategia, se evita que la enzima entre en contacto con los lfpidos almacenados en la planta para evitar asf cualquier riesgo de hidrolisis prematura ("autodegradacion de la planta") antes de la recoleccion. Las unidades de trituracion e incubacion pueden ser ligeras y de pequena escala; muchas son conocidas en la industria agncola y se pueden llevar a cabo en los sitios donde se cosechan las plantas.
Las plantas transgenicas como se proporcionan en la presente memoria se producen por transformacion de plantas oleaginosas naturales. Las plantas transformadas geneticamente como se proporcionan en la presente memoria se reproducen despues sexualmente para producir semillas transgenicas como se proporcionan en la presente memoria. Estas semillas se pueden usar para obtener progenie de plantas transgenicas.
El gen de la hidrolasa esta unido operativamente a un promotor inducible para prevenir cualquier contacto prematuro de la hidrolasa y el lfpido de la planta. Este promotor puede dirigir la expresion del gen en compartimentos distintos de aquellos en los que los lfpidos se acumulan o el promotor puede iniciar la expresion de la hidrolasa en un momento deseado por una induccion exogena.
Polipeptidos y peptidos
En la presente memoria tambien se afslan polipeptidos sinteticos o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (p. ej., al menos 50% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 2 que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o su equivalente. En la presente memoria tambien se proporcionan acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 2 que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o su equivalente.
La identidad de secuencia puede ser a lo largo de la longitud entera del polipeptido, o la identidad puede ser a lo largo de una region de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 15o, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas restos. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden ser mas cortos que la longitud entera de los polipeptidos de ejemplo. Tambien se proporcionan en la presente invencion polipeptidos que comprenden solo una subsecuencia de una secuencia como se proporciona en la presente memoria, las subsecuencias de ejemplo pueden ser de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75. 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas restos. Alternativamente, los polipeptidos (peptidos, fragmentos) pueden variar en tamano entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipeptido, p. ej., una enzima como se proporciona en la presente memoria; siendo los tamanos de ejemplo de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o mas restos, p. ej., restos contiguos de una hidrolasa de ejemplo como se proporciona en la presente memoria. Los peptidos tal como se proporcionan en la presente memoria pueden ser utiles como, p. ej., sondas de marcaje, antfgenos, toleragenos, motivos, sitios activos de hidrolasa.
Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria tambien incluyen anticuerpos capaces de unirse a una hidrolasa tal como se proporciona en la presente memoria.
Los polipeptidos tal como se proporcionan en la presente memoria tambien incluyen secuencias de aminoacidos que son "sustancialmente identicas" a las secuencias como se proporcionan en la presente memoria, incluyendo secuencias que difieren de una secuencia de referencia en una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos conservativas o no conservativas, en particular cuando se produce dicha sustitucion en un sitio que no es el sitio activo de la molecula, y siempre que el polipeptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitucion de aminoacidos conservativa, por ejemplo, sustituye a un aminoacido por otro de la misma clase (p. ej., la sustitucion de un aminoacido hidrofobico, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o la sustitucion de un aminoacido polar) por otro, tal como la sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico o glutamina para la asparagina). Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos, p. ej., de una hidrolasa, dando como resultado la modificacion de la estructura del polipeptido, sin alterar significativamente su actividad biologica. Por ejemplo, se pueden eliminar los aminoacidos amino o carboxilo terminales que no son necesarios para la actividad de la hidrolasa.
“Aminoacido” o “secuencia de aminoacidos” puede incluir un oligopeptido, peptido, polipeptido o secuencia de protema, o un fragmento, porcion o subunidad de cualquiera de ellos, y moleculas que se encuentran de forma natural o sinteticas.
Los terminos “polipeptido” y “protema” pueden incluir aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos o enlaces peptfdicos modificados, es decir, isosteros peptfdicos, y pueden contener aminoacidos modificados distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. El termino “polipeptido” tambien incluye peptidos y fragmentos de polipeptidos, motivos y similares. El termino tambien incluye polipeptidos glucosilados. Los peptidos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria tambien incluyen todas las formas “mimeticas” y “peptidomimeticas” como se describe con mas detalle mas adelante.
Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen hidrolasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen proprotemas antes de la "maduracion" o el procesamiento de secuencias prepro, p. ej., por una enzima procesadora de proprotemas, tal como una proprotema convertasa para generar una protema madura "activa". Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen hidrolasas inactivas por otras razones, p. ej., antes de la "activacion" por un suceso de procesamiento postraduccional, p. ej., una accion de endo o exopeptidasa o proteinasa, un suceso de fosforilacion, una amidacion, una glicosilacion o una sulfatacion, un suceso de dimerizacion, y similares. Los metodos para identificar secuencias de dominio "prepro" y secuencias de senal son bien conocidos en la tecnica, vease, p. ej., Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4 (2): 115-136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la protema se purifica del espacio extracelular y se determina la secuencia N-terminal de la protema y se compara con la forma no procesada.
Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria incluyen todas las formas activas, incluyendo subsecuencias activas, p. ej., dominios cataltticos o sitios activos, de una enzima como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan dominios catalfticos o sitios activos como se expone a continuacion. En la presente memoria tambien se incluyen peptidos o polipeptidos que comprenden o consisten en un dominio de sitio activo como se predice mediante el uso de una base de datos como Pfam (que es una gran coleccion de alineamientos de secuencias multiples y modelos ocultos de Markov que cubren muchas familias de protemas comunes, la base de datos de familias de protemas de Pfam, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall y E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30 (1): 276-280, 2002) o equivalente.
En la presente memoria se proporcionan polipeptidos con o sin una secuencia de senal y/o una secuencia prepro. En la presente memoria se proporcionan polipeptidos con secuencias senal heterologas y/o secuencias prepro. La secuencia prepro (que incluye una secuencia como se proporciona en la presente memoria usada como dominio prepro heterologo) puede encontrarse en el extremo amino terminal o el extremo carboxi terminal de la protema. En la presente memoria se proporcionan secuencias de senales aisladas, sinteticas o recombinantes, secuencias prepro y dominios cataltticos (p. ej., "sitios activos") que comprenden o consisten en secuencias como se proporcionan en la presente memoria. La secuencia senal, los dominios prepro y/o el dominio catalttico como se proporcionan en la presente memoria pueden formar parte de una protema de fusion, p. ej., como un dominio heterologo en una protema quimerica. En la presente memoria se proporcionan acidos nucleicos que codifican estos dominios cataltticos (CD), dominios prepro y secuencias de senales (SP, p. ej., un peptido que tiene una secuencia que comprende/consiste en restos del amino terminal de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria). En la presente memoria se proporcionan secuencias senal que comprenden un peptido que comprende/consiste en una secuencia como se expone en los restos 1a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19 , 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 , 1 a 45, 1 a 46, 1 a 47, 1 a 48, 1 a 49 o 1 a 50, de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria.
Los polipeptidos y peptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden aislar de fuentes naturales, pueden ser polipeptidos sinteticos o generados de forma recombinante. Los peptidos y protemas se pueden expresar de forma recombinante in vitro o in vivo. Los peptidos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden hacer y aislar usando cualquier metodo conocido en la tecnica. Los polipeptidos y peptidos como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden sintetizar, enteros o en parte, usando metodos qmmicos bien conocidos en la tecnica. Vease, p. ej., Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la smtesis de peptidos se puede llevar a cabo usando diferentes tecnicas en fase solida (vease, p. ej., Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y la smtesis automatica se puede lograr usando, p. ej., el sintetizador de peptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Los peptidos y polipeptidos de la invencion tambien se pueden glucosilar. La glucosilacion se puede anadir postraduccionalmente por mecanismos qmmicos o de biosmtesis celular, en donde estos ultimos incorporan el uso de motivos de glucosilacion conocidos, que pueden ser naturales para la secuencia o se pueden anadir como un peptido o anadir en la secuencia codificante de acido nucleico. La glucosilacion puede ser unida a O o unida a N.
Los polipeptidos o protemas "recombinantes" se refieren a polipeptidos o protemas producidos por tecnicas de ADN recombinante, es decir, producidos a partir de celulas transformadas por una construccion de ADN exogena que codifica el polipeptido o protema deseado. Los acidos nucleicos "sinteticos" (incluyendo oligonucleotidos), polipeptidos o protemas como se proporcionan en la presente memoria incluyen los preparados por cualquier smtesis qmmica, p. ej., como se describe a continuacion.
Los "fragmentos", como se usa en la presente memoria, son una porcion de una protema natural que puede existir en al menos dos conformaciones diferentes. Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que la protema natural. Los "fragmentos enzimaticamente activos", como se usa en la presente memoria, son una porcion de una secuencia de aminoacidos (que codifica una protema) que retiene al menos una actividad funcional de la protema con la que esta relacionada. "Sustancialmente la misma" significa que una secuencia de aminoacidos es en gran parte, pero no del todo, la misma, pero conserva al menos una actividad funcional de la secuencia con la que esta relacionada. En general, dos secuencias de aminoacidos son "sustancialmente iguales" o "sustancialmente homologas" si son al menos aproximadamente 85% identicas. Tambien se incluyen los fragmentos que tienen diferentes estructuras tridimensionales de la protema natural. Un ejemplo de esto es una molecula "pro-forma", como una proprotema de baja actividad que se puede modificar por escision para producir una enzima madura con una actividad significativamente mayor.
Los peptidos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria, como se han definido antes, incluyen todas las formas “mimeticas” y “peptidomimeticas”. Los terminos “mimetico” y “peptidomimetico” se refieren a un compuesto qmmico sintetico que tiene sustancialmente la misma estructura y/o caractensticas funcionales de los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. El mimetico puede estar compuesto enteramente por analogos sinteticos, no naturales de aminoacidos, o es una molecula quimerica de aminoacidos peptfdicos parcialmente naturales y analogos parcialmente no naturales de aminoacidos. Los mimeticos tambien pueden incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoacidos naturales con la condicion de que dichas sustituciones no alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimetico. Como con los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria que son variantes conservadoras, la experimentacion rutinaria determinara si un mimetico esta dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria, es decir, que su estructura y/o funcion no esta sustancialmente alterada. Por lo tanto, una composicion de mimetico esta dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria, si tiene una actividad de hidrolasa.
Las composiciones de mimeticos de polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden contener cualquier combinacion de componentes estructurales no naturales. Alternativamente, las composiciones de mimeticos como se proporcionan en la presente memoria incluye uno o todos los tres siguientes grupos estructurales: a) grupos de union de restos distintos de las uniones de enlace amida natural (“enlace peptfdico”); b) restos no naturales en lugar de restos de aminoacidos que se encuentran de forma natural; o c) restos que inducen imitacion estructura secundaria, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, p. ej., una conformacion de giro beta, giro gamma, lamina beta, helice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipeptido como se proporciona en la presente memoria se puede caracterizar como un mimetico cuando todos o algunos de sus restos estan unidos por medios qmmicos distintos de los enlaces peptfdicos naturales. Los restos peptidomimeticos individuales se pueden unir por enlaces peptfdicos, otros enlaces qmmicos o medios de acoplamiento, tales como, p. ej., glutaraldetndo, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de union que pueden ser una alternativa a la uniones por enlace amida tradicional ("enlace peptfdico") incluyen, p. ej., cetometileno (p. ej., -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (c H=CH), eter (CH2-O), tioeter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o ester (vease, p. ej., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pag. 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY).
Un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, tambien se puede caracterizar como un mimetico al contener todos o algunos restos no naturales en el lugar de restos de aminoacidos que se encuentran de forma natural. Los restos no naturales estan bien descritos en la bibliograffa cientifica y de patentes; se describen a continuacion algunas composiciones no naturales de ejemplo utiles como mimeticos de restos de aminoacidos naturales. Los mimeticos de aminoacidos aromáticos se pueden generar sustituyendo por, p. ej., D- o L- nafilalanina; D- o L- fenilglicina; D- o L-2 tienilalanina; D- o L-1, -2, 3-, o 4-pireneilalanina; D- o L-3 tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxibifenilfenilalanina; D- o L-2-indol-(alquil)alaninas; y, D- o L-alquilaininas, donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo, iso-pentilo, sustituidos o no sustituidos, o un aminoacido no acido. Los anillos aromáticos de un aminoacido no natural incluyen, p. ej., anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo.
Los mimeticos de aminoacidos acidos se pueden generar por sustitucion por, p. ej., aminoacidos no carboxilato mientras mantengan una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (p. ej., aspartilo o glutamilo) tambien se pueden modificar selectivamente con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') tales como, p. ej., 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. El aspartilo o glutamilo tambien se pueden convertir en restos asparaginilo y glutaminilo por reaccion con iones amonio. Los mimeticos de aminoacidos basicos se pueden generar por sustitucion con, p. ej., (ademas de lisina y arginina) los aminoacidos ornitina, citrulina, o acido (guanidino)-acetico, o acido (guanidino)alquil-acetico, donde alquilo es como se ha definido antes. Los derivados de nitrilo (p. ej., que contiene el resto CN en lugar de COOH) se pueden sustituir por asparagina o glutamina. Los restos asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los correspondientes restos aspartilo o glutamilo. Los mimeticos de restos arginina se pueden generar haciendo reaccionar arginilo con, p. ej., uno o mas reactivos convencionales, que incluyen, p. ej., fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, o ninhidrina, preferiblemente en condiciones alcalinas. Los mimeticos de restos de tirosina se pueden generar haciendo reaccionar tirosilo con, p. ej., compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Se pueden usar N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar las especies de O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los mimeticos de restos de cistema se pueden generar haciendo reaccionar restos de cisteinilo con, p. ej., alfahalogenoacetatos tales como acido 2-cloroacetico o cloroacetamida y aminas correspondientes; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los mimeticos de restos cistema tambien se pueden generar haciendo reaccionar restos cisteinilo, p. ej., bromo-trifluoroacetona, acido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propionico; cloroacetilfosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil-disulfuro; metil-2-piridil-disulfuro; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Los mimeticos de lisina se pueden generar (y los restos amino terminal se pueden alterar) haciendo reaccionar la lisina con, p. ej., antndrido de acido succmico u otros acidos carboxflicos. Los mimeticos de restos que contiene lisina y otros alfa-amino tambien se pueden generar por reaccion con imidoesteres, tales como picolinimidato de metilo, piridoxal-fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, acido trinitrobencenosulfonico, O-metilisourea, 2,4, pentanediona, y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Los mimeticos de metionina se pueden generar por reaccion con, p. ej., metionina-sulfóxido. Los mimeticos de prolina incluyen, p. ej., acido pipecolico, acido tiazolidina-carboxflico, 3- o 4-hidroxi-prolina, deshidroprolina, 3- o 4-metilprolina, o 3,3,-dimetilprolina. Los mimeticos de resto histidina se pueden generar haciendo reaccionar histidilo con, p. ej., procarbonato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo. Otros mimeticos incluyen, p. ej., los generados por hidroxilacion de prolina y lisina; fosforilacion de los grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo; metilacion de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilacion de la amina N-terminal; metilacion de la cadena principal de restos amida o sustitucion con N-metilaminoacidos; o amidacion de grupos carboxilo C-terminales.
Un resto, p. ej., un aminoacido, de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria tambien se puede sustituir por un aminoacido (o resto peptidomimetico) de quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoacido que se encuentra de forma natural en la configuracion L (que tambien se puede denominar R o S, dependiendo de la estructura de la entidad qmmica) se puede sustituir por el aminoacido del mismo tipo de estructura qmmica o un peptidomimetico, pero de quiralidad opuesta, denominado el aminoacido D, pero tambien se puede denominar como la forma R o S.
Tambien se proporcionan en la presente memoria metodos para modificar los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria por procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional (p. ej., fosforilacion, acilacion, etc.), o por tecnicas de modificacion qmmica, y los polipeptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden producir en cualquier sitio en el polipeptido, incluyendo la cadena principal peptfdica, las cadenas laterales de aminoacidos y el extremo amino o carboxilo. Se apreciara que el mismo tipo de modificacion puede estar presente en el mismo grado o grados variables en varios sitios en un polipeptido dado. Tambien un polipeptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de resto hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lfpido o derivado de lfpido, union covalente de un fosfatidilinositol, ciclacion entrecruzada, formacion de enlace disulfuro, desmetilacion, formacion de entrecruzamientos covalentes, formacion de cistema, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glucosilacion, formacion de anclaje de GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolftico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, selenoilacion, sulfatacion y adicion mediada por ARN de transferencia de aminoacidos a protema tal como arginilacion. Vease, p. ej., Creighton, T.E., Proteins -Structure and Molecular Properties 2a Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983).
Los metodos de smtesis peptfdica qmmica en fase solida tambien se pueden usar para sintetizar los polipeptidos o sus fragmentos como se proporcionan en la presente memoria. Dicho metodo se conoce en la tecnica desde principios de la decada de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (Vease tambien, Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pag. 11-12)) y recientemente se ha usado en el diseno y kits de smtesis de peptidos, de laboratorio disponible en el mercado (Cambridge Research Biochemicals). Dichos kits de laboratorio disponibles en el mercado han usado en general las ensenanzas de H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) y proporcionan la smtesis de peptidos por los extremos de una multitud de “varillas” y “agujas” los cuales estan todos conectados a una placa individual. Cuando se usa dicho sistema, una placa de varillas o agujas se invierte y se inserta en una segunda placa de pocillos o reservorios correspondientes, que contiene soluciones para unir o anclar un aminoacido adecuado al extremo de la aguja o varilla. Repitiendo dicha etapa del procedimiento, es decir, invirtiendo e insertando los extremos de la varilla y aguja en soluciones adecuadas, los aminoacidos construyen los peptidos deseados. Ademas, estan disponibles una serie de sistemas de smtesis de peptidos con FMOC disponibles. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipeptido o fragmento se puede llevar a cabo en un soporte solido que usa un sintetizador de peptidos automatico Applied Biosystems, Inc. Model 431A™. Dicho equipo proporciona acceso facil a los peptidos como se proporcionan en la presente memoria, se por smtesis directa o por smtesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar usando otras tecnicas conocidas.
Enzimas
Se proporcionan en la presente memoria hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, p. ej., protemas que comprenden al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas, o la identidad de secuencia completa (100%), con un polipeptido de ejemplo como se proporciona en la presente memoria (p. ej., SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:2 que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o sus equivalentes, anticuerpos que los unen y metodos para hacerlos y usarlos. Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria pueden tener cualquier actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. Alternativamente, una actividad de una enzima como se proporciona en la presente memoria comprende hidrolisis o smtesis de lfpidos o aceites. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden modificar los aceites por hidrolisis, acidolisis, alcoholisis, glicerolisis, esterificacion, transesterificacion y/o interesterificacion, incluidas las reacciones de "migracion forzada".
Alternativamente, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden tener actividades modificadas o nuevas en comparacion con las hidrolasas de ejemplo o las actividades descritas en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan hidrolasas con y sin secuencias de senal y las propias secuencias de senal. En la presente memoria se proporcionan hidrolasas inmovilizadas, anticuerpos anti-hidrolasa y fragmentos de los mismos. En la presente memoria se proporcionan protemas para inhibir la actividad de hidrolasa, p. ej., anticuerpos que se unen al sitio activo de la hidrolasa. En la presente memoria se proporcionan homodfmeros y heterocomplejos, p. ej., protemas de fusion, heterodfmeros, etc., que comprenden las hidrolasas tal como se proporcionan en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan hidrolasas que tienen actividad en un amplio intervalo de altas y bajas temperaturas y pH (p. ej., condiciones acuosas acidas y basicas).
Una o mas hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se usan para la smtesis biocatalttica de lfpidos estructurados, es decir, Kpidos que contienen un conjunto definido de acidos grasos distribuidos de una manera definida en la cadena principal de glicerol, que incluye alternativas de manteca de cacao, acidos grasos poliinsaturados (PUFA), 1,3-diacilgliceridos (DAG), 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG).
En la presente memoria se proporcionan metodos para generar enzimas que tienen Kcat/Km alterada (superior o inferior). La mutagenesis dirigida al sitio se usa para crear enzimas hidrolasas adicionales con especificidades de sustrato alternativas. Esto se puede hacer, por ejemplo, redisenando la region de union al sustrato o el sitio activo de la enzima. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria son mas estables a altas temperaturas, tales como 80°C a 85°C a 90°C a 95°C, en comparacion con las hidrolasas de organismos convencionales o moderados.
Varias protemas como se proporcionan en la presente memoria tienen una actividad de hidrolasa, p. ej., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en diferentes condiciones. En la presente memoria se proporcionan metodos para hacer hidrolasas con diferentes eficacia catalttica y estabilidades frente a la temperatura, agentes oxidantes y condiciones de pH. Estos metodos pueden usar, p. ej., tecnicas de mutagenesis dirigida al sitio y/o mutagenesis aleatoria. La evolucion dirigida se puede usar para producir hidrolasas con especificidades y estabilidad alternativas.
Las protemas como se proporcionan en la presente memoria se usan en metodos que pueden identificar moduladores de hidrolasa, p. ej., activadores o inhibidores. Brevemente, se anaden muestras de ensayo (p. ej., compuestos, tales como miembros de bibliotecas de peptidos o combinatorias, caldos, extractos y similares) a los ensayos de hidrolasa para determinar su capacidad para modular, p. ej., inhibir o activar, la escision del sustrato. Estos inhibidores se pueden usar en la industria y en la investigacion para reducir o prevenir la isomerizacion no deseada. Los moduladores encontrados usando los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para alterar (p. ej., disminuir o aumentar) el espectro de actividad de una hidrolasa.
En la presente memoria se proporcionan metodos para descubrir hidrolasas usando los acidos nucleicos, polipeptidos y anticuerpos como se proporcionan en la presente memoria. Se criban bibliotecas de fagos lambda para descubrir hidrolasas basadas en la expresion. En la presente memoria se proporcionan bibliotecas de fagos lambda para usar en cribado para permitir la deteccion de clones toxicos; acceso mejorado al sustrato; menor necesidad de disenar un hospedante, evitando la posibilidad de cualquier sesgo resultante de la escision de masa de la biblioteca; y, un crecimiento mas rapido en bajas densidades de clones. El cribado de bibliotecas de fagos lambda puede ser en fase lfquida o en fase solida. En la presente memoria se proporcionan metodos para el cribado en fase lfquida. Esto puede dar una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; flexibilidad de sustrato adicional; mayor sensibilidad para clones debiles; y facilidad de automatizacion frente al cribado en fase solida. En la presente memoria se proporcionan metodos de cribado que usan las protemas y acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria, que implican automatizacion robotica. Esto permite la ejecucion de muchos miles de reacciones biocataltticas y ensayos de cribado en un penodo de tiempo corto, p. ej., por dfa, asf como garantizar un alto nivel de precision y reproducibilidad (vease la descripción de matrices, mas adelante). Como resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en cuestion de semanas.
En la presente memoria se proporcionan enzimas hidrolasas que son hidrolasas no naturales que tienen una actividad de hidrolasa, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o caractensticas de rendimiento diferentes en comparacion con la hidrolasa no natural. Estas hidrolasas tienen una secuencia de aminoacidos que no se encuentra en la naturaleza. Se pueden obtener por sustitucion de una pluralidad de restos de aminoacidos de una hidrolasa precursora con diferentes aminoacidos. La hidrolasa precursora puede ser una hidrolasa natural o una hidrolasa recombinante. Las variantes de hidrolasa abarcan la sustitucion de cualquiera de los L-aminoacidos naturales en las posiciones designadas de restos de aminoacidos.
Secuencias senal de hidrolasa, dominios prepro y cataltticos
En la presente memoria se proporcionan secuencias senal (p. ej., peptidos de senal (SP)), dominios prepro y dominios catalfticos (CD). Los SP, dominios prepro y/o CD como se proporcionan en la presente memoria pueden ser peptidos recombinantes o sinteticos aislados, o pueden ser parte de una protema de fusion, p. ej., como un dominio heterologo en una protema quimerica. En la presente memoria se proporcionan acidos nucleicos que codifican estos dominios catalfticos (CD), dominios prepro y secuencias senal (SP, p. ej., un peptido que tiene una secuencia que comprende/consiste en restos amino terminal de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria). En la presente memoria se proporcionan secuencias senal que comprenden un peptido que comprende/consiste en una secuencia como se expone en los restos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 (o un peptido mas largo) de un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan secuencias senal aisladas, sinteticas o recombinantes que comprenden/consisten en una secuencia senal como se proporciona en la presente memoria derivada de otra enzima como se proporciona en la presente memoria, u otro tipo de enzima o polipeptido.
Las secuencias senal (SP), CD y/o prepro de hidrolasa como se proporcionan en la presente memoria pueden ser peptidos aislados, o secuencias unidas a otra hidrolasa o un polipeptido no hidrolasa, p. ej., como una protema de fusion (quimerica). En la presente memoria se proporcionan polipeptidos que comprenden secuencias de senal de hidrolasa como se proporcionan en la presente memoria. Los polipeptidos que comprenden secuencias senal SP, CD y/o prepro de hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria comprenden secuencias heterologas de hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., una protema de fusion que comprende un SP, CD y/o prepro como se proporciona en la presente memoria y secuencias de otra hidrolasa o una protema no hidrolasa). En la presente memoria se proporcionan hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria con secuencias de SP, CD y/o prepro heterologas, p. ej., secuencias con una secuencia de senal de levadura. Una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria puede comprender un SP y/o prepro heterologo en un vector, p. ej., un vector de serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Las secuencias de SP, CD y/o prepro como se proporcionan en la presente memoria se identifican despues de la identificacion de nuevos polipeptidos de hidrolasa. Las rutas por las que las protemas se clasifican y transportan a su ubicacion celular adecuada a menudo se denominan rutas de direccionamiento de protemas. Uno de los elementos mas importantes en todos estos sistemas de direccionamiento es una secuencia corta de aminoacidos en el extremo amino de un polipeptido recien sintetizado llamado la secuencia senal. Esta secuencia senal dirige una protema a su ubicacion adecuada en la celula y se elimina durante el transporte o cuando la protema llega a su destino final. La mayona de las protemas lisosomales, de membrana o secretadas tienen una secuencia senal amino-terminal que las marca para su translocacion a la luz del retmulo endoplasmico. Las secuencias senal pueden variar en longitud de 13 a 45 o mas restos de aminoacidos. Los expertos en la tecnica conocen diversos metodos de reconocimiento de secuencias senal. Por ejemplo, los nuevos peptidos senal de hidrolasa se identifican por un metodo denominado SignalP. SignalP usa una red neuronal combinada que reconoce los peptidos senal y sus sitios de escision. (Nielsen, et al., "Identificacion de peptidos senal procar y eucarioticos y prediccion de sus sitios de escision". Protein Engineering, vol. 10, no. 1, pag. 1-6 (1997).
Debe entenderse que las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden no tener SP y/o secuencias prepro, y/o dominios cataltticos (CD). En la presente memoria se proporcionan polipeptidos (p. ej., hidrolasas) que carecen de todo o parte de un SP, un CD y/o un dominio prepro. En la presente memoria tambien se proporcionan acidos nucleicos que codifican una secuencia senal (SP), un CD y/o prepro de una hidrolasa operativamente unida a una secuencia de acido nucleico de una hidrolasa diferente u, opcionalmente, se puede desear una secuencia senal (SP) y/o dominio prepro de una protema no hidrolasa.
En la presente memoria se proporcionan polipeptidos aislados, sinteticos o recombinantes que comprenden secuencias senal (SP), dominio prepro y/o dominios cataltticos (CD) como proporciona en la presente memoria y secuencias heterologas. Las secuencias heterologas son secuencias no asociadas naturalmente (p. ej., a una hidrolasa) con un SP, dominio prepro y/o CD. La secuencia a la que el SP, dominio prepro y/o CD no estan naturalmente asociados puede estar en el extremo amino terminal del Sp , dominio prepro y/o CD, el extremo carboxi terminal y/o en ambos extremos del SP y/o CD. En la presente memoria se proporcionan polipeptidos aislados, sinteticos o recombinantes que comprenden (o consisten en) un polipeptido que comprende una secuencia senal (SP), dominio prepro y/o dominio catalttico (CD) como se proporciona en la presente memoria, con la condicion de que no este asociado con ninguna secuencia con la que este asociado de forma natural (p. ej., secuencia de hidrolasa). En la presente memoria se proporcionan acidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipeptidos. Por lo tanto, el acido nucleico aislado, sintetico o recombinante, como se proporciona en la presente memoria, comprende la secuencia codificante de una secuencia senal (SP), dominio prepro y/o dominio catalftico (CD) como se proporciona en la presente memoria y una secuencia heterologa (es decir, una secuencia no asociada naturalmente con una secuencia senal (SP), dominio prepro y/o dominio catalftico (CD) como se proporciona en la presente memoria). La secuencia heterologa puede estar en el extremo terminal 3', el extremo terminal 5' y/o en ambos extremos de la secuencia de codificacion de SP, dominio prepro y/o CD.
En la presente memoria se proporciona la fusion de subsecuencias N-terminal o C-terminal de las enzimas como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., secuencias senal, secuencias prepro) con otros polipeptidos, protemas activas o fragmentos de protemas. La produccion de una enzima como se proporciona en la presente memoria (p. ej., una hidrolasa, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tambien se puede lograr expresando la enzima como una protema de fusion inactiva que despues es activada por un suceso de escision proteolftica (usando una actividad de proteasa endogena o exogena, p. ej., tripsina), que da como resultado la separacion de la pareja de la protema de fusion y la enzima madura, p. ej., hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. La protema de fusion como se proporciona en la presente memoria se expresa a partir de una construccion de nucleotidos hfbrida que codifica un unico marco de lectura abierto que contiene los siguientes elementos: la secuencia de nucleotidos para la protema de fusion, una secuencia de conector (definida como una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos flexible que se une a dos dominios de protemas menos flexibles), el sitio de reconocimiento de escision de proteasas y la secuencia de enzima madura (p. ej., cualquier enzima como se proporciona en la presente memoria) , p. ej., una hidrolasa). Alternativamente, la protema de fusion puede comprender una secuencia de pectato liasa, una secuencia de xilanasa, una secuencia de acido fosfatfdico fosfatasa u otra secuencia, p. ej., una secuencia que se ha mostrado previamente que es sobreexpresada en un sistema de hospedante de interes. Se puede usar cualquier sistema de hospedante (vea la descripción, mas arriba), p. ej., E. coli o Pichia pastoris. La disposicion de las secuencias de nucleotidos en la construccion de nucleotidos quimerica se puede determinar basandose en los niveles de expresion de protemas alcanzados con cada construccion de fusion. Procediendo desde el extremo 5' de la construccion de nucleotidos al extremo de cebador 3' de la construccion, las secuencias de nucleotidos se ensamblan de la siguiente manera: secuencia senal/protema de fusion/secuencia de conector/sitio de reconocimiento de escision de proteasa/enzima madura (p. ej., cualquier enzima como proporciona en la presente memoria, p. ej., una hidrolasa) o secuencia senal/secuencia pro/enzima madura/secuencia de conector/protema de fusion. La expresion de la enzima (p. ej., cualquier enzima como se proporciona en la presente memoria, p. ej., una hidrolasa) como una protema de fusion inactiva puede mejorar la expresion general de la secuencia de la enzima, puede reducir cualquier toxicidad potencial asociada con la sobreproduccion de enzima activa y/o puede aumentar la vida en anaquel de la enzima antes de su uso debido a que la enzima estana inactiva hasta que la protema de fusion, p. ej., pectato liasa, se separe de la enzima, p. ej., hidrolasa como se proporciona en la presente memoria.
En la presente memoria se proporcionan formulaciones espedficas para la activacion de una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, expresada como una protema de fusion. La activacion de la actividad de hidrolasa expresada inicialmente como una protema de fusion inactiva se realiza usando una actividad proteolftica o potencialmente una actividad proteolftica en combinacion con una peptidasa amino terminal o carboxilo terminal (la peptidasa puede ser una enzima como se proporciona en la presente memoria, u otra enzima). Este suceso de activacion se puede realizar de una variedad de maneras y en una variedad de puntos en el proceso de fabricacion/almacenamiento antes de la aplicacion en el desgomado del aceite. Los procesos de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria incluyen: escision por una actividad endogena expresada por el hospedante de fabricacion tras la secrecion de la construccion de fusion en el medio de fermentacion; escision por una actividad de proteasa endogena que se activa o entra en contacto con la construccion de fusion expresada intracelularmente tras la rotura de las celulas hospedantes; el paso de la construccion de fusion bruta o purificada por una columna de actividad de proteasa inmovilizada para lograr la escision y la activacion de la enzima (p. ej., hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) antes de la formulacion de la enzima; tratamiento de la construccion de fusion bruta o purificada con una fuente soluble de actividad proteolftica; activacion de una hidrolasa (p. ej., una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria) en la refinena de petroleo usando una fuente soluble o insoluble de actividad proteolftica inmediatamente antes del uso en el proceso; y/o, la activacion de la actividad de hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa como se proporciona en la presente memoria) haciendo circular continuamente la formulacion de la construccion de fusion a traves de una columna de actividad de proteasa inmovilizada a temperatura reducida (p. ej., entre aproximadamente 4°C y 20°C). Este suceso de activacion se puede realizar antes del suministro en el sitio de uso o puede ocurrir en el sitio en la refinena de petroleo.
Glucosilacion
Los peptidos y polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., hidrolasas, anticuerpos) tambien se pueden glucosilar, por ejemplo, comprenden al menos un sitio de glucosilacion, p. ej., una glucosilacion unida a N o unida a O. El polipeptido se puede glucosilar despues de ser expresado en P. pastoris o S. pombe. La glucosilacion se puede anadir postraduccionalmente por mecanismos qmmicos o biosinteticos celulares, en donde estos ultimos incorporan el uso de motivos de glucosilacion conocidos, que pueden ser naturales para la secuencia o se pueden anadir como un peptido o anadir en la secuencia codificante de acido nucleico.
Hidrolasas Imbridas y bibliotecas de peptidos
En la presente memoria se proporcionan hidrolasas hforidas (p. ej., protemas sinteticas) y protemas de fusion, que incluyen bibliotecas de peptidos, que comprenden secuencias como se proporcionan en la presente memoria. Las bibliotecas de peptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para aislar moduladores de peptidos (p. ej., activadores o inhibidores) de dianas. Las bibliotecas de peptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para identificar parejas de union formales de dianas, tales como ligandos, p. ej., citoquinas, hormonas y similares.
Las protemas de fusion como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., el resto peptfdico) se estabilizan conformacionalmente (con respecto a los peptidos lineales) para permitir una mayor afinidad de union por las dianas. En la presente memoria tambien se proporcionan fusiones de hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria y otros peptidos, incluyendo peptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de tal manera que la estructura de la enzima o el anticuerpo (p. ej., hidrolasa) no se perturbe significativamente y el peptido se estabilice conformacional metabolica o estructuralmente. Esto permite la creacion de una biblioteca de peptidos que se controla facilmente tanto por su presencia dentro de las celulas como por su cantidad.
Las variantes de la secuencia de aminoacidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden caracterizar por una naturaleza predeterminada de la variacion, una caractenstica que las diferencia de una forma natural, p. ej., una variacion alelica o interespecies de una secuencia de hidrolasa. Las variantes como se proporcionan en la presente memoria presentan la misma actividad biologica cualitativa que el analogo natural. Alternativamente, las variantes se pueden seleccionar por tener caractensticas modificadas. Mientras que el sitio o region para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la mutacion en s^ no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se puede realizar una mutagenesis aleatoria en el codon o region diana y las variantes de hidrolasa expresadas se pueden c sreibgaúrn la combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para realizar mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, como se describe en la presente memoria, por ejemplo, mutagenesis del cebador M13 y mutagenesis por PCR. El cribado de los mutantes se puede hacer usando ensayos de actividades proteolfticas. Alternativamente, las sustituciones de aminoacidos pueden ser restos individuales; las inserciones pueden ser del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoacidos, aunque se pueden hacer inserciones considerablemente mas grandes. Las eliminaciones pueden variar desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 restos o mas. Para obtener un derivado final con las propiedades optimas, se pueden usar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas. En general, estos cambios se hacen en unos pocos aminoacidos para minimizar la alteracion de la molecula. Sin embargo, cambios mayores pueden ser tolerados en ciertas circunstancias.
En la presente memoria se proporcionan hidrolasas en las que se ha modificado la estructura de la cadena principal polipeptfdica, la estructura secundaria o terciaria, p. ej., una estructura alfa-helicoidal o de lamina beta. Se ha modificado la carga o hidrofobicidad. Se ha modificado el volumen de una cadena lateral. Se realizan cambios sustanciales en la funcion o en la identidad inmunologica seleccionando sustituciones que son menos conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afectan de manera mas significativa: la estructura de la cadena principal del polipeptfdico en el area de la alteracion, por ejemplo, una estructura alfa-helicoidal o de lamina beta; una carga o un sitio hidrofobo de la molecula, que puede estar en un sitio activo; o una cadena lateral. En la presente memoria se proporcionan protemas que comprenden sustituciones de secuencia como se proporciona en la presente memoria, p. ej., donde (a) un resto hidrofilo, p. ej., serilo o treonilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto hidrofobo, p. ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistema o prolina sustituye a (o se sustituye por) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histidilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, sustituye a (o se sustituye por) una que no tiene una cadena lateral, p. ej., glicina. Las variantes pueden presentar la misma actividad biologica cualitativa (es decir, actividad de hidrolasa), aunque las variantes se pueden seleccionar para modificar las caractensticas de las hidrola sseagsún sea necesario.
Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria comprenden epftopos o marcadores de purificacion, secuencias senal u otras secuencias de fusion, etc. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden fusionar con un peptido aleatorio para formar un polipeptido de fusion. Por "fusionado" o "unido operativamente" en la presente memoria se entiende que el peptido aleatorio y la hidrolasa estan unidos entre sf, de tal manera que se minimice la alteracion de la estabilidad de la estructura de la hidrolasa, p. ej., retiene la actividad de la hidrolasa. El polipeptido de fusion (o polinucleotido de fusion que codifica el polipeptido de fusion) tambien puede comprender componentes adicionales, incluyendo multiples peptidos en multiples bucles.
Los peptidos (p. ej., subsecuencias de hidrolasa) y los acidos nucleicos que los codifican se pueden aleatorizar, ya sea completamente aleatorizados o sesgados en su aleatorizacion, p. ej. en la frecuencia de nucleotidos/restos en general o por posicion. "Aleatorizado" significa que cada acido nucleico y peptido consiste en nucleotidos y aminoacidos, respectivamente, esencialmente aleatorios. Los acidos nucleicos que dan lugar a los peptidos se pueden sintetizar qmmicamente y, por lo tanto, pueden incorporar cualquier nucleotido en cualquier posicion. Por lo tanto, cuando los acidos nucleicos se expresan para formar peptidos, se puede incorporar cualquier resto de aminoacido en cualquier posicion. El procedimiento sintetico se puede disenar para generar acidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formacion de todas o la mayona de las combinaciones posibles a lo largo de la longitud del acido nucleico, formando asf una biblioteca de acidos nucleicos aleatorizados. La biblioteca puede proporcionar una poblacion suficientemente estructuralmente diversa de productos de expresion aleatorizados para afectar a un intervalo probabilfsticamente suficiente de respuestas celulares para proporcionar una o mas celulas que presentan una respuesta deseada. En la presente memoria se proporcionan bibliotecas de interaccion lo suficientemente grandes para que al menos uno de sus miembros tenga una estructura que le de afinidad por alguna molecula, protema u otro factor.
Metodologfas de cribado y dispositivos de vigilancia “en lmea”
En la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria, se puede usar una variedad de aparatos y metodologfas junto con los polinucleotidos y acidos nucleicos como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., para cribar en los polipeptidos la actividad de hidrolasa, para cribar compuestos como potenciales activadores o inhibidores de una actividad de hidrolasa (p. ej., para el potenciar cribado de farmacos), para anticuerpos que se unen a un polipeptido como se proporciona en la presente memoria, para acidos nucleicos que hibridan con un acido nucleico como se proporciona en la presente memoria, para cribar celulas que expresan un polipeptido como se proporciona en la presente memoria y similares. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° .
6.337.187.
Matrices capilares
Se pueden usar matrices capilares, tales como GIGAMATRIX™, Diversa Corporation, San Diego, CA, can en los metodos como se proporcionan en la presente memoria. Se pueden inmovilizar acidos nucleicos o polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria o aplicar en una matriz, que incluye matrices capilares. Las matrices se pueden usar para el cribado o vigilancia de bibliotecas de composiciones (p. ej., moleculas pequenas, anticuerpos, acidos nucleicos, etc.) según su capacidad para unirse o modular la actividad de un acido nucleico o un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Las matrices capilares proporcionan otro sistema para mantener y cribar muestras. Por ejemplo, un aparato de cribado de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende al menos una pared que define una luz para retener una muestra. El aparato puede incluir ademas material intersticial dispuesto entre capilares adyacentes en la matriz, y uno o mas indicios de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para cribar una muestra, en donde el capilar esta adaptado para estar unido en una matriz de capilares, puede incluir una primera pared que define una luz para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material filtrante, para filtrar la energfa de excitacion proporcionada a la luz, para excitar la muestra.
Un polipeptido o acido nucleico, p. ej., un ligando o un sustrato, se puede introducir en un primer componente en al menos una parte de un capilar o una matriz de capilares. Cada capilar de la matriz de capilares puede comprender al menos una pared que define una luz para retener el primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detras del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente por la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interes como un primer lfquido marcado con una partfcula detectable en un capilar de una matriz de capilares, en donde cada capilar de la matriz de capilares comprende al menos una pared que define una luz para retener el primer lfquido y la partfcula detectable, y en donde la al menos primera pared esta recubierta con un material de union para la union de la partfcula detectable a la al menos una pared. El metodo puede incluir ademas eliminar el primer lfquido del tubo capilar, en donde la partfcula detectable unida se mantiene dentro del capilar, e introducir un segundo lfquido en el tubo capilar.
La matriz de capilares puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared exterior que define una luz. La pared exterior del capilar puede ser una o mas paredes fusionadas juntas. De forma similar, la pared puede definir la luz que es cilmdrica, cuadrada, hexagonal o de cualquier otra forma geometrica con la condicion de que las paredes formen una luz para la retencion de un lfquido o muestra. Los capilares de la matriz de capilares se pueden mantener muy proximos entre sf para formar una estructura planar. Los capilares pueden estar unidos entre sf, estando fusionados (p. ej., donde los capilares estan hechos de vidrio), pegados, enlazados o sujetados lado a lado. La matriz de capilares puede estar formada por cualquier numero de capilares individuales, por ejemplo, en el intervalo de 100 a 4.000.000 capilares. Una matriz de capilares puede formar una placa de microvaloracion que tiene aproximadamente 100.000 o mas capilares individuales unidos entre sf.
Matrices o “biochips”
Los acidos nucleicos o polipeptidos se pueden inmovilizar o aplicar a una matriz. Las matrices se pueden usar para el cribado o control de bibliotecas de composiciones (p. ej., moleculas pequenas, anticuerpos, acidos nucleicos, etc.) por su capacidad para unirse a o modular la actividad de un acido nucleico o polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Por ejemplo, como se proporciona en la presente memoria, un parametro controlado es la expresion del transcrito de un gen de hidrolasa. Uno o mas, o todos los transcritos de una celula se pueden medir por hibridacion de una muestra que comprende transcritos de la celula, o acidos nucleicos representativos o complementarios de transcritos de una celula, mediante hibridacion con acidos nucleicos inmovilizados en una matriz, o "biochip". Al usar una "matriz" de acidos nucleicos en un microchip, algunos o todos los transcritos de una celula se pueden cuantificar simultaneamente. Alternativamente, se pueden usar matrices que comprenden el acido nucleico genomico para determinar el genotipo de una cepa modificada geneticamente nueva por los metodos como se proporcionan en la presente memoria. Las "matrices de polipeptidos" tambien se pueden usar para cuantificar simultaneamente una pluralidad de protemas. La presente invencion se puede poner en practica con cualquier "matriz" conocida, tambien denominada "micromatriz" o "matriz de acido nucleico" o "matriz de polipeptidos" o "matriz de anticuerpos" o "biochip" o una variacion de la misma. Las matrices son genericamente una pluralidad de "puntos" o "elementos diana", comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de una o mas moleculas biologicas, p. ej., oligonucleotidos, inmovilizados sobre un area definida de una superficie del sustrato para la union espedfica a una molecula de muestra, p. ej., transcritos de ARNm.
Las “matrices” o “micromatrices” o “biochips” o “chips” como se proporcionan en la presente memoria comprenden una pluralidad de elementos diana, donde cada elemento diana puede comprender una cantidad definida de uno o mas polipeptidos (incluyendo anticuerpos) o acidos nucleicos inmovilizados sobre un area definida de una superficie de sustrato.
Las hidrolasas se usan como formas inmovilizadas. Se puede usar cualquier metodo de inmovilizacion, p. ej., inmovilizacion sobre un soporte inerte tal como dietilaminoetilcelulosa, vidrio poroso, quitina o celulas. Las celulas que expresan hidrolasas como se proporciona en la presente memoria se pueden inmovilizar por reticulacion, p. ej., con glutaraldehfdo a una superficie de sustrato.
En la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria, cualquier matriz y/o metodo conocido para hacer y usar matrices se puede incorporar todo o en parte, o sus variaciones, como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; vease tambien, p. ej., WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; vease tambien, p. ej., Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. Vease tambien las solicitudes de patentes de EE.UU. publicadas n° 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Anticuerpos y metodos de cribado basados en anticuerpos
Se proporcionan en la presente memoria anticuerpos sinteticos o recombinantes, aislados, que se unen espedficamente a una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar, identificar o cuantificar la hidrolasa como se proporciona en la presente memoria o polipeptidos relacionados. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar otros polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria u otras hidrolasas relacionadas
"Anticuerpos" como se proporciona en la presente memoria puede comprender peptido(s) o polipeptido(s) derivados de, modelados despues de o sustancialmente codificados por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse espedficamente a un antigeno o epftopo, vease, p. ej., Fundamental Immunology, Tercera Edicion, W.E. Paul, ed., Raven Press, NY (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267 - 273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97. El termino anticuerpo incluye partes de union al antigeno, es decir, "sitios de union al antigeno" (p. ej., fragmentos, subsecuencias, regiones determinantes de la complementariedad (CDR)) que retienen la capacidad para unirse al antfgeno, que incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546 ), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR). Los anticuerpos monocatenarios tambien se incluyen por referencia en el termino "anticuerpo". En la presente memoria se proporcionan anticuerpos, que incluyen sitios de union al antfgeno y anticuerpos monocatenarios que se unen espedficamente a una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. En la practica de los metodos como se proporcionan en la presente memoria, tambien se pueden usar polipeptidos que tienen una actividad de hidrolasa.
Los anticuerpos se pueden usar en inmunoprecipitacion, tincion, columnas de inmunoafinidad y similares. Si se desea, las secuencias de acidos nucleicos que codifican antfgenos espedficos se pueden generar mediante inmunizacion seguida de aislamiento del polipeptido o acido nucleico, amplificacion o clonacion e inmovilizacion de polipeptido en una matriz, como se proporciona en la presente memoria. Alternativamente, los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una celula que se va a modificar, p. ej., una afinidad de anticuerpo se puede aumentar o disminuir. Ademas, la capacidad para hacer o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo geneticamente modificado en una celula por metodos como se proporcionan en la presente memoria
Los metodos de inmunizacion, produccion y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los expertos en la tecnica y se describen en la bibliograffa cientffica y de patentes, vease, p. ej., Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York. Los anticuerpos tambien se pueden generar in vitro, p. ej., usando bibliotecas de presentacion de fagos que expresan el sitio de union del anticuerpo recombinante, ademas de los metodos in vivo tradicionales usando animales. Vease, p. ej. Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45. Los polipeptidos o peptidos se pueden usar para generar anticuerpos que se unen espedficamente a los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. Los anticuerpos resultantes se pueden usar en procedimientos de cromatograffa de inmunoafinidad para aislar o purificar el polipeptido o para determinar si el polipeptido esta presente en una muestra biologica. En dichos procedimientos, una preparacion de protema, tal como un extracto, o una muestra biologica se pone en contacto con un anticuerpo capaz de unirse espedficamente a uno de los polipeptidos como se proporciona en la presente memoria.
En procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte solido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparacion de protema se pone en contacto con el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se une espedficamente a uno de los polipeptidos como se proporciona en la presente memoria. Despues de un lavado para eliminar las protemas no unidas espedficamente, eluyen los polipeptidos unidos espedficamente.
La capacidad de las protemas en una muestra biologica para unirse al anticuerpo se puede determinar usando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la union se puede determinar marcando el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimatico o un radioisotopo. Alternativamente, la union del anticuerpo a la muestra se puede detectar usando un anticuerpo secundario que tenga dicho un marcador detectable en el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos en sandwich, radioinmunoensayos y transferencias Western.
Los anticuerpos policlonales generados contra los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria se pueden obtener mediante inyeccion directa de los polipeptidos en un animal o administrando los polipeptidos a un animal no humano. El anticuerpo asf obtenido se unira al propio polipeptido. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solo un fragmento del polipeptido se puede usar para generar anticuerpos que se pueden unir al polipeptido natural completo. Dichos anticuerpos se pueden usar entonces para aislar el polipeptido de las celulas que expresan ese polipeptido.
Para la preparacion de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier tecnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de lmeas celulares. Los ejemplos incluyen la tecnica de hibridoma, la tecnica de trioma, la tecnica de hibridoma de linfocitos B humanos y la tecnica de hibridoma de EBV (vease, p. ej., Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96).
Las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos monocatenarios (vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios contra los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. Alternativamente, se pueden usar ratones transgenicos para expresar anticuerpos humanizados contra estos polipeptidos o fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos generados contra los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria (incluyendo anticuerpos antiidiotipo) se pueden usar en el cribado de polipeptidos similares de otros organismos y muestras. En dichas tecnicas, los polipeptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipeptidos que se unen espedficamente al anticuerpo. Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se puede usar para detectar la union de anticuerpos.
Hidrolasas inmovilizadas
La hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, se usan como formas inmovilizadas, p. ej., para procesar lfpidos, en la smtesis estructurada de lfpidos, para digerir protemas y similares. Las lipasas inmovilizadas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar, p. ej., para la hidrolisis de triacilgliceridos, diacilgliceridos o esteres o para la esterificacion o transesterificacion de acidos grasos, diacilgliceridos o triacilgliceridos, o en la interesterificacion de grasas. La lipasa puede ser espedfica para la esterificacion de acidos grasos con alcohol, 1,3-espedfica o espedfica para la hidrolisis de gliceridos parciales, esteres o triacilgliceridos. Las lipasas inmovilizadas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en un lecho empaquetado para la transesterificacion continua de grasas exentas de disolventes. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 4.818.695; 5.569.594.
Se puede usar cualquier metodo de inmovilizacion o forma de soporte, p. ej., matrices, perlas, soportes capilares y similares, como se ha descrito antes. La inmovilizacion de hidrolasa puede ocurrir sobre un soporte inerte, tal como dietilaminoetilcelulosa, vidrio poroso, quitina o celulas. Las celulas que expresan hidrolasas como se proporciona en la presente memoria se pueden inmovilizar por reticulacion, p. ej., con glutaraldeddo a una superficie de sustrato. Las hidrolasas inmovilizadas como se proporcionan en la presente memoria, se pueden preparar conteniendo hidrolasa unida a un soporte hidrofobo en partmulas, poroso, seco, con un tensioactivo, tal como un ester de acido graso de sorbitan polioxietilenico o un ester de acido graso y poliglicerol. El soporte puede ser un polfmero oleffnico alifatico, tal como un polietileno o un polipropileno, un homo o copolfmero de estireno o una mezcla de los mismos o un soporte inorganico tratado previamente. Estos soportes se pueden seleccionar de polfmeros oleffnicos alifaticos, polfmeros de oxidacion, mezclas de estos polfmeros o soportes inorganicos pretratados con el fin de hacer estos soportes hidrofobicos. Este tratamiento previo puede comprender silanizacion con un compuesto organico de silicio. El material inorganico puede ser una sflice, una alumina, un vidrio o una ceramica. Los soportes pueden estar hechos de poliestireno, copolfmeros de estireno, polietileno, polipropileno o de copolfmeros derivados de (met)acrilatos. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.773.266.
Las enzimas hidrolasas, fragmentos de las mismas y acidos nucleicos que codifican las enzimas y los fragmentos se pueden fijar a un soporte solido. Esto es a menudo economico y eficiente en el uso de hidrolasas en procesos industriales. Por ejemplo, un consorcio o coctel de enzimas hidrolasas (o fragmentos activos de las mismas), que se usan en una reaccion qdmica espedfica, se pueden unir a un soporte solido y sumergir en una cuba de proceso. La reaccion enzimatica puede ocurrir. Despues, el soporte solido se puede sacar de la cuba, junto con las enzimas fijadas a la misma, para uso repetido. Un acido nucleico aislado como se proporciona en la presente memoria se puede fijar a un soporte solido. Alternativamente, el soporte solido se selecciona del grupo de un gel, una resina, un polfmero, un material ceramico, un vidrio, un microelectrodo y cualquier combinacion de los mismos.
Por ejemplo, los soportes solidos proporcionados en la presente memoria incluyen geles. Algunos ejemplos de geles incluyen SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ), gelatina, glutaraldetndo, glutaraldetndo tratado con quitosano, albumina-glutaraldehndo, quitosano-xantano, gel Toyopearl (gel polimerico), alginato, alginato-polilisina, carragenano, agarosa, glioxil agarosa, agarosa magnetica, dextrano-agarosa, hidrogel de poli(carbamoilsulfonato), hidrogel de BSA-PEG, poli(alcohol vimlico) fosforilado (PVA), monoaminoetil-N-aminoetilo (MANA), amino, o cualquier combinacion de los mismos.
Otros soportes solidos proporcionados en la presente memoria comprenden resinas o polfmeros. Algunos ejemplos de resinas o polfmeros incluyen celulosa, acrilamida, nailon, rayon, poliester, resina de intercambio anionico, AMBERLITE™ XAD-7, AMBERLITE™ XAD-8, AMBERLITE™ IRA-94, AMBERLITE™ IRC-50 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA), polivinilo, poliacnlico, polimetacrilato, o cualquier combinacion de los mismos.
Otro tipo de soporte solido proporcionado en la presente memoria comprende material ceramico. Algunos ejemplos incluyen material ceramico no poroso, material ceramico poroso, SiO2 , AhO3. Otro tipo de soporte solido util en la presente invencion es el vidrio. Algunos ejemplos incluyen vidrio no poroso, vidrio poroso, vidrio aminopropflico o cualquier combinacion de los mismos. Otro tipo de soporte solido que se puede usar es un microelectrodo. Un ejemplo es una magnetita recubierta de polietilenimina. Las partfculas grafticas se pueden usar como soporte solido.
Otro tipo de soporte solido proporcionado en la presente memoria comprende productos de tierra de diatomeas y silicatos. Algunos ejemplos incluyen CELITE®, KENITE®, DIACTIV®, PRIMISIL®, DIAFIL® diatomitas y MICRO-CEL®, CALFLO®, SILASORB™ y CELKATE® (World Minerals Inc., Santa Barbara, CA) silicatos de calcio y magnesio sinteticos.
Otro ejemplo de un soporte solido es o comprende una celula, tal como un globulo rojo.
Kits
Se proporcionan en la presente memoria kits que comprenden las composiciones, p. ej., acidos nucleicos, casetes de expresion, vectores, celulas, semillas transgenicas o plantas o partes de plantas, polipeptidos (p. ej., hidrolasa) y/o anticuerpos como se proporcionan en la presente memoria. Los kits tambien pueden contener material de instrucciones que ensene las metodologfas y usos industriales como se proporcionan en la presente memoria, como se describe en la presente memoria.
Aplicaciones industriales y medicas.
Las hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) proporcionadas en la presente memoria tienen muchos usos industriales y aplicaciones medicas, y algunos usos y composiciones de ejemplo se describen a continuacion. Los procedimientos como se proporcionan en la presente memoria comprenden convertir un fosfolfpido no hidratable en una forma hidratable, desgomado del aceite, procesamiento de alimentos, procesamiento de aceites (p. ej., elaboracion de un aceite saturado bajo) de plantas, peces, algas y similares, por nombrar solo algunas aplicaciones.
Procesamiento de alimentos y piensos
Se describen en la presente memoria procedimientos de fabricacion de queso que usan hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria. Tambien se proporcionan en la presenten memoria quesos que comprenden hidrolasas. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas o una de sus combinaciones) se usan para procesar quesos para mejorar el sabor, aumentar el rendimiento y/o "estabilizar" quesos, p. ej., reduciendo la tendencia a "salir aceite”, o, las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se usan para producir queso a partir de leche de queso. Estos procedimientos como se proporcionan en la presente memoria pueden incorporar cualquier metodo o protocolo, p. ej., como se describe, p. ej., en las patentes de EE.UU. N° 6.551.635 y 6.399.121, WO 03/070013, WO 00/054601. Por ejemplo, las hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria se usan para estabilizar la emulsion de grasa en la leche o composiciones que comprenden leche, p. ej., crema, y se usan para estabilizar composiciones de leche, p. ej., para la fabricacion de cremas o licores cremosos. Se proporciona en la presente memoria un procedimiento para potenciar el sabor de un queso usando al menos una enzima como se proporciona en la presente memoria, comprendiendo el procedimiento incubar una protema, una grasa y una proteasa y una lipasa (p. ej., como se proporciona en la presente memoria) en un medio acuoso en condiciones que producen un sabor mejorado de queso (p. ej., menos amargor), p. ej., como se describe en el documento WO 99/66805. Las lipasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para mejorar el sabor en un queso (p. ej., una cuajada) mezclando con agua, una proteasa y una fosfolipasa a una temperatura elevada, p. ej., entre aproximadamente 75°C y 95°C, como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. N° 4.752.483. Las lipasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para acelerar el envejecimiento del queso mediante la adicion de una enzima como se proporciona en la presente memoria a un queso (p. ej., una leche de queso) antes de anadir un coagulante a la leche, o anadir una enzima (p. ej., una lipasa) como se proporciona en la presente memoria a una cuajada con sal antes de compresion, p. ej., como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. N° 4.707.364. Se usa una lipasa como se proporciona en la presente memoria para degradar un triglicerido en la grasa de la leche para liberar acidos grasos libres, dando como resultado una mejora del sabor. Tambien se puede usar una enzima como se proporciona en la presente memoria en cualquiera de estos procedimientos como se proporciona en la presente memoria, vease, p. ej., Brindisi (2001) J. of Food Sci. 66: 1100­ 1107.
Smtesis estructurada y procesamiento de aceites.
En la presente memoria tambien se proporcionan metodos para la smtesis estructurada de aceites, lfpidos y similares utilizando hidrolasas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporciona en la presente memoria. Los metodos como se proporcionan en la presente memoria comprenden una smtesis biocatalftica de lfpidos estructurados, es decir, lfpidos que contienen un conjunto definido de acidos grasos distribuidos de una manera definida en una cadena principal, p. ej., una cadena principal de glicerol. Los productos generados usando las hidrolasas y practicando los metodos proporcionados en la presente memoria incluyen aceites bajos saturados, p. ej., aceites de vegetales (p. ej., soja, canola), animales, plantas, peces, algas, aceites que se han procesado o tratado con un polipeptido como se proporciona en la presente memoria; y alimentos, piensos, suplementos, productos farmaceuticos y similares que comprenden aceites bajos saturados hechos mediante la practica de los metodos y/o composiciones (p. ej., enzimas) como se proporciona en la presente memoria. Los productos generados usando las hidrolasas y practicando los metodos como se proporcionan en la presente memoria tambien incluyen alternativas a la manteca de cacao, lfpidos que contienen acidos grasos poliinsaturados (PUFA), lfpidos que contienen acidos grasos esenciales, lfpidos que contienen acidos grasos monoinsaturados, lfpidos que contienen fosfo-colina y fosfo-serina, lfpidos que contienen fitoesteroles, 1,3-diacilgliceridos (DAG), 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG).
Los metodos como se proporcionan en la presente memoria permiten la smtesis de lfpidos o acidos grasos con regioselectividades y estereoselectividades definidas. En la presente memoria se proporcionan aceites, lfpidos y similares, y aceites que se pueden usar en alimentos y piensos y materiales de cocina (p. ej., aceites de cocina, aceites para frefr, aceites para hornear, salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, mayonesa, aderezos para servir con cuchara y vertibles, alternativas de manteca de cacao y similares) que se han procesado o tratado con polipeptidos o peptidos (p. ej., hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan productos farmaceuticos, nutraceuticos y cosmeticos que comprenden polipeptidos (p. ej., hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, o peptidos o anticuerpos) como se proporcionan en la presente memoria.
En la presente memoria se proporcionan metodos para procesar (modificar) aceites, lfpidos y similares usando hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria. Los metodos se pueden usar para procesar aceites de plantas, animales, microorganismos. Los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en la smtesis estructurada de aceites similares a los que se encuentran en plantas, animales y microorganismos. Los lfpidos y aceites se pueden procesar para tener una caractenstica deseada. Los lfpidos y aceites que se pueden procesar por los metodos como se proporcionan en la presente memoria (usando las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria) incluyen alternativas a la manteca de cacao, lfpidos que contienen acidos grasos poliinsaturados (PUFA), lfpidos que contienen acidos grasos esenciales, lfpidos que contienen acidos grasos monoinsaturados, lfpidos que contienen fosfocolina y fosfoserina, lfpidos que contienen fitoesteroles, 1,3-diacilgliceridos (DAG), 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG). Los aceites y grasas procesados y sinteticos como se proporcionan en la presente memoria (p. ej., alternativas de mantecas de cacao y aceites vegetales) se pueden usar en una variedad de aplicaciones, p. ej., en la produccion de alimentos (p. ej., confitena, pasteles) y en la formulacion de productos farmaceuticos, nutraceuticos y cosmeticos. En la presente memoria se proporcionan metodos para procesar grasas y aceites, p. ej., semillas oleaginosas, de plantas, que incluyen, p. ej., canola, ricino, coco, cilantro, mafz, semilla de algodon, avellana, semilla de canamo, linaza, Limnanthes, oliva, palma, palmiste, cacahuete, colza, salvado de arroz, cartamo, sasanqua, soja, girasol, resina, tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (canola alto oleico, soja bajo linoleico o girasol alto estearico), o mezclas de cualquiera de los anteriores usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria.
Se proporcionan en la presente memoria metodos de procesamiento de aceites animales, p. ej., de pescado (eulachon, hngado de bacalao, reloj anaranjado, sardina, arenque, lacha y similares), marnfferos (cerdo, vaca y similares) y aves de corral (pollo y similares) usando las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan metodos para la smtesis estructurada de aceites similares a los encontrados en animales, p. ej., peces, aves de corral y marnfferos y microorganismos, usando las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria. Estos aceites sinteticos o procesados se usan como aditivos para piensos, alimentos, como ingredientes en formulaciones farmaceuticas, productos nutraceuticos o en cosmeticos. Por ejemplo, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se usan para hidrolizar acidos grasos de los aceites de pescado, de modo que los acidos grasos se puedan recuperar y usar como un aditivo para piensos. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para procesar aceite de residuos de restaurantes y grasas animales fundidas.
Se proporcionan en la presente memoria metodos de procesamiento de grasas y aceites, p. ej., aceites de algas marinas, que incluyen, p. ej., aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de especies de Nannochloris, aceite de Spirulina species, aceite de Chlorophycease (algas verdes) y aceite de Bacilliarophy, o mezclas de cualquiera de dichas grasas y aceites.
Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria son biocatalizadores versatiles en smtesis organica, p. ej., en la smtesis estructurada de aceites, lfpidos y similares. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria (incluyendo hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) pueden aceptar una amplia variedad de sustratos, que incluyen alcoholes secundarios y terciarios, p. ej., de un producto natural como el alfaterpineol, linalol y similares. Por ejemplo, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria tienen una enantiospecificidad de buena a excelente (p. ej., estereoespecificidad).
En la presente memoria se proporciona un procedimiento de conversion de aceite (p. ej., aceites vegetales, mantecas de cacao y similares) que comprende al menos una enzima (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria. Un procedimiento de conversion de aceite comprende una hidrolisis y acilacion controladas, p. ej., una acilacion de glicerol, que puede dar como resultado una alta pureza para una amplia variedad de productos. Las hidrolasas (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para producir aceites de diacilglicerol y aceites nutricionales estructurados. En la presente memoria se proporcionan procedimientos para la esterificacion de propilenglicol usando una enzima como se proporciona en la presente memoria, p. ej., una lipasa regio y/o quimioselectiva para la esterificacion monosustituida en la posicion Sn-1. Se proporcionan en la presente memoria procedimientos para la smtesis estructurada de aceites con perfiles de acidos grasos saturados o insaturados espedficos usando una enzima como se proporciona en la presente memoria, p. ej., una lipasa regio y/o quimioselectiva para la eliminacion de un acido graso saturado, o para la adicion espedfica de un acido graso a una cadena principal de glicerol.
Los metodos como se proporcionan en la presente memoria comprenden ademas procedimientos para la eliminacion selectiva de acidos grasos (p. ej., acidos grasos no deseables) de los aceites, p. ej., la separacion de acidos grasos saturados y/o insaturados de los aceites, usando una hidrolasa (p. ej., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) como se proporciona en la presente memoria. El procedimiento como se proporciona en la presente memoria puede separar acidos grasos saturados y/o insaturados de cualquier aceite, p. ej., un aceite de soja. La enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva. Estos procedimientos pueden generar grasas y aceites de alta estabilidad, p. ej., aceites para frefr "saludables". Este procedimiento de ejemplo como se proporciona en la presente memoria se puede usar para generar aceites con menos azufre, p. ej., usando un procedimiento que comprende la eliminacion de azufre del aceite bruto. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar en procedimientos de interesterificacion para estos y otros propositos.
Se puede usar una enzima como se proporciona en la presente memoria para generar un aceite graso "no trans". Se puede generar un aceite "no trans" a partir de un aceite parcialmente hidrogenado para producir un aceite solo cis. La enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva.
En la presente memoria tambien se proporcionan procedimientos para modificar mantecas de cacao usando una enzima como se proporciona en la presente memoria. Aproximadamente el 80% de las mantecas de cacao comprenden triacilgliceridos POP, SOS y POS (P es acido graso palmftico, O es acido graso oleico, S es acido graso estearico). La estructura de acidos grasos saturado-insaturado-saturado de las matecas de cacao imparte sus perfiles de fusion caractensticos, p. ej., en chocolates. Los procedimientos sinteticos estructurados y directos como se proporcionan en la presente memoria se usan en mantecas de cacao para reducir las variaciones de la manteca de cacao o para producir mantecas de cacao sinteticas ("alternativas a la manteca de cacao"). Una hidrolasa quimioselectiva y/o enantioselectiva (p. ej., regioselectiva) (p. ej., lipasa o esterasa) como se proporciona en la presente memoria se puede usar para hacer una alternativa a la manteca de cacao, p. ej., un sustituto de la manteca de cacao, un reemplazante de manteca de cacao y/o un equivalente de manteca de cacao. En la presente memoria se proporcionan alternativas a la manteca de cacao, que incluyen sustitutos de manteca de cacao, reemplazantes de manteca de cacao y equivalentes de manteca de cacao y sus productos intermedios de fabricacion que comprenden una enzima como se proporciona en la presente memoria. Un procedimiento como se proporciona en la presente memoria (que usa una enzima como se proporciona en la presente memoria) para hacer alternativas de manteca de cacao puede comprender mezclar un aceite vegetal, p. ej., un aceite de palma, con karite o equivalente, ilipe o equivalente y Sal sterins o equivalente, y tratar los aceites mezclados con los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria. El procedimiento como se proporciona en la presente memoria comprende el uso de interesterificacion. El procedimiento como se proporciona en la presente memoria puede generar formas composicionales o cristalinas que imitan la manteca de cacao "natural".
En la presente memoria se proporcionan procedimientos (que usan una enzima como se proporciona en la presente memoria) para producir un diacilglicerol (DAG), p. ej., 1, 3 diacilglicerol, usando un aceite vegetal, p. ej., un aceite de bajo coste. La enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva. El procedimiento como se proporciona en la presente memoria puede dar como resultado una composicion que comprende DAG que tiene buena estabilidad, larga vida en anaquel y rendimiento a alta temperatura.
Las enzimas (hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria y los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en el tratamiento enzimatico de aceites comestibles, como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. N° 6.025.171. En este metodo de ejemplo, las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se inmovilizan preparando una emulsion que contiene una fase hidrofoba continua, tal como un aceite de trigliceridos, y una fase acuosa dispersa que contiene una enzima anfifflica, tal como lipasa como se proporciona en la presente memoria, y material de vehnculo que esta parcialmente disuelto y parcialmente no disuelto en la fase acuosa, y eliminando el agua de la fase acuosa hasta que la fase se convierte en partfculas vehnculo recubiertas de enzimas solidas. La parte no disuelta del material vehnculo puede ser un material que es insoluble en agua y aceite, o un material soluble en agua en forma no disuelta porque la fase acuosa ya esta saturada con el material soluble en agua. La fase acuosa se puede formar con un ifquido de fermentacion de lipasa bruto que contiene residuos de fermentacion y biomasa que pueden servir como materiales vehnculo. La lipasa inmovilizada es util para la reorganizacion del ester y la desacidificacion en aceites. Despues de una reaccion, la enzima inmovilizada se puede regenerar para una reaccion posterior anadiendo agua para obtener la disolucion parcial del vehnculo, y con la enzima resultante y la fase acuosa que contiene vehnculo disperso en una fase hidrofoba, evaporando agua para formar de nuevo partfculas vetnculo recubiertas con enzima.
Las enzimas (p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria y los metodos como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar para preparar aceites transesterificados, como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. N° 5.288.619. Se proporcionan en la presente memoria metodos para la transesterificacion enzimatica para preparar un aceite de margarina que tiene tanto un contenido bajo de acidos grasos trans como contenido bajo de acidos grasos de cadena intermedia. El metodo incluye las etapas de proporcionar una mezcla de reaccion de transesterificacion que contiene un material fuente de acido estearico y un aceite vegetal lfquido comestible, transesterificar el material fuente de acido estearico y el aceite vegetal usando una lipasa espedfica de posicion 1, 3, y finalmente hidrogenar la mezcla de acidos grasos para proporcionar un material fuente de acido estearico reciclado para una reaccion de reciclado con el aceite vegetal. Se proporciona en la presente memoria un metodo a contracorriente para preparar un aceite transesterificado. El metodo incluye las etapas de proporcionar una zona de reaccion de transesterificacion que contiene una lipasa espedfica de posicion 1, 3, introducir un aceite vegetal en la zona de transesterificacion, introducir un material fuente de acido estearico, llevar a cabo el flujo contracorriente de gas licuado subcntico o gas supercntico, llevar a cabo una reaccion de transesterificacion de la corriente de triacilgliceridos con la corriente de acido estearico o monoester de acido estearico en la zona de reaccion, extraer una corriente de aceite de margarina de triacilgliceridos transesterificados, extraer una fase de fluido contracorriente, hidrogenar el acido estearico o monoester de acido estearico transesterificado para proporcionar un material fuente de acido estearico de reciclaje hidrogenado, e introducir el material fuente de acido estearico de reciclaje hidrogenado en la zona de reaccion.
Para permitir que la enzima como se proporciona en la presente memoria actue, ambas fases, la fase oleosa y la fase acuosa que contiene la enzima, deben mezclarse mtimamente. Puede no ser suficiente simplemente agitarlos. Se ayuda a una buena dispersion de la enzima en el aceite si se disuelve en una pequena cantidad de agua, p. ej., 0,5-5% en peso (con respecto al aceite), y se emulsiona en el aceite en esta forma, para formar gotas de menos de 10 micrometros de diametro (media ponderada). Las gotitas pueden ser mas pequenas que 1 micrometro. La agitacion turbulenta se puede hacer con velocidades radiales superiores a 100 cm/s. El aceite tambien se puede hacer circular en el reactor usando una bomba rotatoria externa. La fase acuosa que contiene la enzima tambien se puede dispersar finamente por medio de una accion de ultrasonidos. Se puede usar un aparato de dispersion.
Una reaccion enzimatica como se proporciona en la presente memoria tiene lugar en la superficie del borde entre la fase oleosa y la fase acuosa. El objetivo de todas estas medidas para el mezclamiento es crear la mayor superficie posible para la fase acuosa que contiene la enzima. La adicion de tensioactivos aumenta la microdispersion de la fase acuosa. En algunos casos, por lo tanto, se anaden tensioactivos con valores de HLB superiores a 9, tales como dodecilsulfato-Na, a la solucion de enzima, como se describe, p. ej., en el documento EP-A 0513709. Un metodo eficaz similar para mejorar la emulsion es la adicion de lisolecitina. Las cantidades anadidas pueden estar en el intervalo de 0,001% a 1%, con referencia al aceite. La temperatura durante el tratamiento con enzimas no es cntica. Se pueden usar temperaturas entre 20°C y 80°C, pero esta ultima solo se puede aplicar durante un tiempo corto. En la presente memoria, se usa una lipasa como se proporciona en la presente memoria que tiene una buena tolerancia a la temperatura y/o al pH bajo. Las temperaturas de aplicacion de entre 30°C y 50°C son optimas. El penodo de tratamiento depende de la temperatura y puede mantenerse mas corto con una temperatura creciente. Por lo general, son suficientes tiempos de 0,1 a 10 horas o de 1 a 5 horas. La reaccion tiene lugar en un reactor, que se puede dividir en etapas. Por lo tanto, es posible la operacion continua, junto con la operacion por lotes. La reaccion se puede llevar a cabo en diferentes etapas de temperatura. Por ejemplo, la incubacion puede tener lugar durante 3 horas a 40°C, despues durante 1 hora a 60°C. Si la reaccion se produce por etapas, esto tambien abre la posibilidad de ajustar diferentes valores de pH en las etapas individuales. Por ejemplo, en la primera etapa, el pH de la solucion se puede ajustar a 7, por ejemplo, y en una segunda etapa a 2,5, mediante la adicion de acido dtrico u otros acidos adecuados. Sin embargo, en al menos una etapa, el pH de la solucion de enzima debe estar por debajo de 4 o por debajo de 3. Si el pH se ajusto posteriormente por debajo de este nivel, se puede encontrar un deterioro del efecto.
Por lo tanto, el acido cftrico se puede anadir a la solucion de la enzima antes de que esta ultima se mezcle con el aceite.
Las enzimas (hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) como se proporcionan en la presente memoria y los metodos como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar para preparar aceites, como se describe, p. ej., en la solicitud de patente de EE. UU. No. 11/567,318, incorporada en la presente memoria por referencia en su totalidad. En la presente memoria se proporcionan procedimientos continuos para el tratamiento enzimatico de lfpidos. El metodo se refiere a un procedimiento y aparato para la interesterificacion enzimatica continua de composiciones que contienen lfpidos usando una pluralidad de reactores de lecho fijo, en donde el flujo de la composicion que contiene lfpidos a traves del aparato puede permanecer sustancialmente constante incluso cuando la actividad enzimatica de un lecho fijo disminuye con el tiempo, e incluso cuando un lecho fijo se saca de lmea, tal como para la reparacion, reemplazo o reposicion.
En la presente memoria tambien se proporciona un metodo para hidrolizar un aceite o grasa haciendo reaccionar el aceite o la grasa con una enzima palmitasa. La hidrolisis se puede llevar a cabo en presencia de un emulsionante que tiene HLB mayor que 12. La enzima palmitasa puede estar codificada por una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 97%, 99%, 99,5% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y que tiene i) un cambio de nucleotido (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacido en la posicion 95 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 9, ii) cambios de nucleotidos (o su equivalente) que codifican los restos de aminoacidos en las posiciones 85 y 172 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleotido (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacido en la posicion 83 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT y 188ACG. En una realizacion, la secuencia de acido nucleico es la secuencia de SEQ ID NO: 1 y tiene i) un cambio de nucleotido (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacido en la posicion 95 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 9 , ii) cambios de nucleotidos (o su equivalente) que codifican los restos de aminoacidos en las posiciones 85 y 172 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleotidos (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacidos en la posicion 83 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT y 188ACG. En una realizacion, la enzima palmitasa tiene un impacto de tolerancia termica 29 como se describe en la Tabla 9, y que tiene i) un cambio de nucleotido (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacido en la posicion 95 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 9, ii) cambios de nucleotidos (o su equivalente) que codifican los restos de aminoacidos en las posiciones 85 y 172 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleotido (o su equivalente) que codifica el resto de aminoacido en la posicion 83 (o su equivalente) como se expone en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT y 188ACG. En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los metodos proporcionados en la presente memoria es la enzima 29 SM con las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT y 188ACG, como se describe en el ejemplo 12.
El emulsionante puede tener un HLB mayor que 12, 14, 16 o 18. El emulsionante se selecciona entre oleato de sodio, oleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, linolenato de sodio, linolenato de potasio, laureato de sodio, laureato de potasio, estearato de sodio, estearato de potasio, palmitato de sodio, palmitato de potasio, oleato de palma de sodio, oleato de palma de potasio o una combinacion de los mismos. La mezcla de reaccion comprende aproximadamente 1 a 20% de agua basado en el peso total de los reaccionantes. En una realizacion, la mezcla de reaccion comprende aproximadamente 1, 3, 5, 7, 10, 15, 17 o 20% de agua basado en el peso total de los reaccionantes.
El aceite o la grasa se mezcla con el emulsionante antes de la adicion de la enzima palmitasa. En ciertas realizaciones, la mezcla de aceite/grasa y emulsionante se homogeneiza antes y/o despues de la adicion de la enzima palmitasa para asegurar una emulsion uniforme.
La reaccion se puede llevar a cabo a aproximadamente 20 a 70°C, por ejemplo, la reaccion se lleva a cabo a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60 o 70°C. En ciertas realizaciones, la enzima palmitasa proporcionada en la presente memoria reduce el contenido de palmitato del aceite/grasa a aproximadamente 5% o menos. En ciertas realizaciones, la enzima palmitasa proporcionada en la presente memoria reduce el contenido de palmitato del aceite/grasa a aproximadamente 5, 4, 3, 2, 1% o menos. En ciertas realizaciones, la reduccion deseada en el contenido de palmitato tiene lugar en aproximadamente o menos de aproximadamente 48 h, 24 h, 20 h, 16 h, 12 h, 10 h, 5 h o 3 h. En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas un tratamiento previo o el aceite/grasa para eliminar la goma y la fase acuosa y reducir los acidos grasos libres. Se puede usar cualquier metodo de tratamiento previo que un experto en la tecnica considere adecuado. En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas la adicion de una base (adicion caustica) para formar jabones.
El aceite usado en la reaccion puede ser aceite refinado o aceite bruto. La reaccion puede comprender ademas la adicion de un fosfolfpido. Cualquier fosfolfpido que un experto en la tecnica considere adecuado se pude usar en las reacciones. El fosfolfpido puede ser lecitina. El aceite usado en las reacciones proporcionadas en la presente memoria puede ser un aceite refinado y la reaccion comprende la adicion de un fosfoifpido.
Productos nutraceuticos
Las composiciones y los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hacer productos nutraceuticos mediante el procesamiento o smtesis de Ifpidos y aceites usando las enzimas como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas como se proporciona en la presente memoria. Los lfpidos o aceites procesados o sintetizados incluyen acidos grasos poliinsaturados (PUFA), diacilgliceridos, p. ej., 1,3-diacilgliceridos (DAG), monoacilgliceridos, p. ej., 2-monoacilgliceridos (MAG) y triacilgliceridos (TAG). Los nutraceuticos se pueden hacer procesando diacilgliceridos, p. ej., 1,3-diacilgliceridos (DAG), monoacilgliceridos, p. ej., 2-monoacilgliceridos (MAG) y/o triacilgliceridos (TAG) de fuentes de plantas (p. ej., semillas oleaginosas) o de animales ( ej., aceite de pescado). En la presente memoria se proporcionan tambien productos nutraceuticos (p. ej., composiciones dieteticas) que comprenden polipeptidos (p. ej., enzimas, peptidos, anticuerpos) como se proporcionan en la presente memoria.
Las composiciones y metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para fortalecer composiciones dieteticas, especialmente productos de leche de vaca, p. ej., formulas infantiles de leche de vaca, con hidrolasas activadas por sales biliares. Las composiciones hechas por los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para alimentar a bebes recien nacidos y prematuros, incluyendo la administracion de una hidrolasa activada por sales biliares como se proporciona en la presente memoria para aumentar la digestion de grasas y, por lo tanto, la tasa de crecimiento. En la presente memoria se proporcionan composiciones y metodos para tratar sujetos de la produccion inadecuada de enzimas pancreaticas por la administracion de hidrolasa activada por sales biliares junto con la ingestion de grasas; vease tambien la descripción, a continuacion.
En la presente memoria se proporcionan composiciones dieteticas que comprenden una hidrolasa, p. ej., hidrolasa activada por sales biliares como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria tambien se proporcionan composiciones dieteticas que comprenden una base nutricional que comprende una grasa y una cantidad eficaz de hidrolasa activada por sales biliares como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan formulas infantiles de leche de vaca que comprenden una hidrolasa, p. ej., hidrolasa activada por sales biliares como se proporciona en la presente memoria. La hidrolasa como se proporciona en la presente memoria puede ser activa en la digestion de acidos grasos de cadena larga, p. ej., C12 a C22, que constituyen un porcentaje muy alto de la mayona de las leches, p. ej., 99% de la leche materna humana. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5.000.975.
En la presente memoria tambien se proporcionan composiciones dieteticas que comprenden una grasa de aceite vegetal y una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria se proporcionan metodos para procesar productos a base de leche y/o composiciones que comprenden aceite vegetal para hacer composiciones dieteticas. Las composiciones procesadas comprenden un aceite de acido laurico, un aceite de acido oleico, un aceite de acido palmftico y/o un aceite de acido linoleico. Se puede usar un aceite de salvado de arroz, aceite oleico de girasol y/o aceite de canola como aceites de acidos oleicos. Las grasas y aceites, p. ej., semillas oleaginosas, de plantas, que incluyen, p. ej., canola, ricino, coco, cilantro, mafz, semilla de algodon, avellana, semilla de canamo, linaza, Limnanthes, oliva, palma, palmiste, cacahuete, colza, salvado de arroz, cartamo, sasanqua, soja, girasol, resina, tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (canola alto oleico, soja bajo linoleico o girasol alto estearico), mezclas de cualquiera de los anteriores para usar en los productos nutraceuticos y composiciones dieteticas, son procesados o se hacen usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 4.944.944.
Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden proporcionar en una forma estable al almacenamiento en la formula y/o en el estomago, pero activas cuando la formulacion alcanza la parte del tracto gastrointestinal donde la formula normalmente se digerina. Las formulaciones (p. ej., microcapsulas) para liberacion en el intestino son bien conocidas en la tecnica, p. ej., polfmeros biodegradables tales como polilactida y poliglicolido, como se describe, p. ej., en la patente de EE. UU. n° 4.767.628; 4.897.268; 4.925.673; 5.902.617.
Confitena, manteca de cacao (cacao) y alimentos
Las composiciones y los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hacer y procesar mantequillas duras, como la manteca de cacao (manteca de coco). Alternativamente, en la presente memoria se proporcionan productos de confitena, manteca de coco y alimentos que comprenden polipeptidos (p. ej., enzimas, peptidos, anticuerpos) como se proporcionan en la presente memoria.
Las composiciones y los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hacer alternativas a la manteca de cacao mediante tecnicas sinteticas "estructuradas" que usan las enzimas, p. ej., hidrolasas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas como se proporciona en la presente memoria. Por ejemplo, los metodos como se proporcionan en la presente memoria procesan o sintetizan triacilgliceridos, diacilgliceridos y/o monoacilgliceridos para usar como, p. ej., alternativas de manteca de cacao. Los metodos como se proporcionan en la presente memoria pueden generar una manteca dura con una "region plastica" definida para mantener una dureza suficiente por debajo o a temperatura ambiente. El lfpido procesado o sintetizado esta disenado para tener una "region plastica" muy estrecha, p. ej., donde se derrite rapidamente a aproximadamente la temperatura corporal. La manteca de cacao natural comienza a ablandarse a aproximadamente 30°C a 32°C, y se derrite completamente a aproximadamente 36°C. La manteca de cacao natural puede contener 70% en peso o mas de tres 1,3-disaturados-2-oleoil-gliceroles, que son 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POSt) y 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (StOSt). Estos tres gliceroles muestran un comportamiento de fusion similar entre sf y son responsables de las propiedades de fusion de la manteca de cacao, presentando una region plastica muy estrecha. En la presente memoria se proporcionan mantecas de cacao sinteticas o mantecas de cacao procesadas (sintetizadas o procesadas usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, todas las posibles composiciones se denominan alternativas de manteca de cacao) con porcentajes variables de 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1 -palmitoil-2-oleoilglicerol (POSt) y 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (StOSt), dependiendo de las propiedades deseadas de la manteca de cacao sintetica y mantecas de cacao sinteticas con mas o menos del 70% en peso de los tres 1,3-disaturados-2-oleoilglicerolew. Las mantecas de cacao sinteticas segun como se proporcionan en la presente memoria pueden reemplazar parcial o completamente las mantecas de cacao naturales o sin procesar y pueden mantener o mejorar las propiedades esenciales de la manteca dura.
En la presente memoria se proporcionan mantecas de cacao sinteticas o mantecas de cacao procesadas (sintetizadas o procesadas usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria) con las propiedades deseadas para su uso en productos de confitena, panadena y farmaceuticos. En la presente memoria tambien se proporcionan productos de confitena, panadena y farmaceuticos, y similares, que comprenden una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Los metodos como se proporcionan en la presente memoria pueden hacer o procesar un lfpido (una grasa) a partir de un dulce (p. ej., un chocolate) o se pueden usar en un dulce. Se puede hacer o procesar un lfpido de modo que el chocolate muestre menos huella dactilar que el chocolate hecho con manteca de cacao natural, mientras que todavfa tiene caractensticas de fusion pronunciadas en la boca. Un lfpido se puede hacer o procesar de modo que se pueda hacer un dulce (p. ej., chocolate) a una temperatura ambiente comparativamente alta, o hacer usando un agua de refrigeracion a una temperatura comparativamente alta. El lfpido se puede hacer o procesar de modo que un dulce (p. ej., chocolate) se pueda almacenar en condiciones relativamente mas calidas, p. ej., condiciones tropicales o semitropicales o en edificios con calefaccion central. Los lfpidos se pueden hacer o procesar de modo que un dulce (p. ej., chocolate) tenga un contenido de lfpidos (grasa) de composicion y calidad uniformes. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para proporcionar una composicion sustituta para la manteca de cacao que puede mejorar significativamente su estabilidad termica, y reemplazarla en una amplia variedad de aplicaciones.
Produccion de margarina y materias grasas
En la presente memoria se proporcionan grasas sinteticas o procesadas, p. ej., margarina y materia grasa, sintetizadas y procesadas usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. En la presente memoria tambien se proporcionan grasas sinteticas o procesadas, p. ej., margarina y materia grasa, que comprenden polipeptidos (p. ej., enzimas, peptidos, anticuerpos) como se proporciona en la presente memoria.
En la presente memoria se proporcionan grasas procesadas que comprenden un aceite vegetal, tal como de canola, ricino, coco, cilantro, mafz, semilla de algodon, avellana, semilla de canamo, linaza, Limnanthes, oliva, palma, palmiste, cacahuete, colza, salvado de arroz, cartamo, sasanqua, sesamo, soja, girasol, resina, tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (canola alto oleico, soja bajo linoleico o girasol alto estearico) tipos de aceites sintetizados o procesados usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Las grasas sinteticas procesadas, p. ej., margarina y materia grasa, se disenan para tener una "plasticidad" deseada. Muchos de los productos grasos plasticos, tales como margarina y matera grasa, se producen a partir de masas duras y aceites lfquidos como materias primas. Por ejemplo, se mezclan aceites lfquidos tales como de canola, ricino, coco, cilantro, mafz, semilla de algodon, avellana, semilla de canamo, linaza, Limnanthes, oliva, palma, palmiste, cacahuete, colza, salvado de arroz, cartamo, sasanqua, sesamo, soja, girasol, resina, tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (canola alto oleico, soja bajo linoleico o girasol alto estearico) se mezclan con sus aceites endurecidos (masas duras), y la mezcla se ajusta para tener una consistencia adecuada (plasticidad). Los productos grasos plasticos, tales como la margarina y materia grasa producidos de esta manera, tienden a causar la formacion de cristales relativamente gruesos porque las grasas y aceites usados como materia prima estan compuestos de acidos grasos que tienen casi la misma longitud de cadena de carbonos. En otras palabras, tienen una composicion altamente unificada de acidos grasos. Por esta razon, la plasticidad de estos productos se puede mantener en un grado apropiado solo dentro de un rango de temperatura estrecho, ya que los aceites lfquidos contenidos en ellos tienen una tendencia a exudar. En la presente memoria se proporcionan metodos para hacer o procesar grasas disenadas de manera que tengan una composicion variada (y definida) de acidos grasos. El aceite resultante, p. ej., margarina o materia grasa, puede tener un intervalo mas amplio de plasticidad.
Los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para hacer o procesar aceites vegetales, tales como de canola, ricino, coco, cilantro, mafz, semilla de algodon, avellana, semilla de canamo, linaza, Limnanthes, oliva, palma, palmiste, cacahuete, colza, salvado de arroz, cartamo, sasanqua, sesamo, soja, girasol, resina, tsubaki, variedades de aceites “naturales” que tienen composiciones de acidos grasos alteradas por organismos geneticamente modificados (OGM) o “cruce” tradicional tal como aceites alto oleico, bajo linoleico o bajos saturados (canola alto oleico, soja bajo linoleico o girasol alto estearico) tipos de aceites usando una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria, incluyendo la interesterificacion y transesterificacion enzimatica, vease, p. ej., la patente de e E.UU. n° 5.288.619 y solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 11/567.318. Los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria en lugar de la interesterificacion aleatoria como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. n° 3.949.105. Los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en la transesterificacion enzimatica para preparar un aceite, p. ej., un aceite de margarina, que tiene tanto bajo contenido en acido trans como bajo en acidos grasos de cadena intermedia.
La estructura simetrica de un aceite, p. ej., aceites de tipo palma o lauricos, se puede modificar, p. ej., en una estructura aleatoria. Por lo tanto, los metodos como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para modificar las propiedades de los productos grasos plasticos. La modificacion de los aceites por los metodos como se proporcionan en la presente memoria se puede disenar para prevenir o retardar el endurecimiento gradual del aceite con el tiempo, en particular cuando los productos se van a almacenar.
Los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria en una mezcla de reaccion de transesterificacion que comprende un material fuente de acido estearico y un aceite vegetal lfquido comestible, que transesterifica el material fuente de acido estearico y el aceite vegetal usando una lipasa espedfica de posiciones 1,3, como se proporciona en la presente memoria, y despues hidrogenar la mezcla de acidos grasos para proporcionar un material de fuente de acido estearico reciclado para una reaccion de reciclado con el aceite vegetal. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.288.619.
Se lleva a cabo una reaccion de interesterificacion con una lipasa como se proporciona en la presente memoria. La lipasa como se proporciona en la presente memoria tiene selectividad para las posiciones 1 y 3 de triacilgliceridos para retardar o inhibir un aumento en la cantidad de triacilgliceridos tri-saturados en el aceite. En esta reaccion como se proporciona en la presente memoria, las deficiencias de la interesterificacion aleatoria convencional y la dificultad de la interesterificacion con una lipasa no espedfica se pueden superar porque la interesterificacion se lleva a cabo mediante una enzima como se proporciona en la presente memoria que tiene especificidad por las posiciones 1 y 3 de los triacilgliceridos. La exudacion de los aceites lfquidos contenidos en los productos se puede ralentizar o prevenirse con un aumento de la temperatura en la reaccion para inhibir un aumento en el punto de fusion causado por un aumento en la cantidad de triacilgliceridos trisaturados. Esto aborda el problema de endurecimiento de productos durante el almacenamiento a largo plazo.
Composiciones farmaceuticas y tratamiento de deficiencias de hidrolasas.
En la presente memoria se proporcionan metodos y composiciones (enzimas como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., esterasas, acilasas, lipasas, fosfolipasas o proteasas como se proporciona en la presente memoria) que se pueden usar en el tratamiento de una deficiencia de hidrolasa en un animal , p. ej., un marnffero, tal como un ser humano. Por ejemplo, los metodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria se usan para tratar pacientes que padecen una deficiencia de una lipasa pancreatica. La lipasa se puede administrar por via oral. Una enzima como se proporciona en la presente memoria se puede suministrar en lugar de o con una preparacion de enzima pancreatica de cerdo.
En la presente memoria se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden polipeptidos (p. ej., enzimas, peptidos, anticuerpos) como se proporciona en la presente memoria. Estas composiciones farmaceuticas pueden estar en forma de comprimidos, pfldoras, geles, capsulas, hidrogeles, pulverizadores, polvos, aerosoles, implantes, liposomas, cremas, pomadas, lfquidos, una microesfera, una partfcula de nucleo multiparticulado, una emulsion, una suspension, nanoestructuras, y similares. Las composiciones farmaceuticas que comprenden polipeptidos (p. ej., enzimas, peptidos, anticuerpos) como se proporcionan en la presente memoria se pueden administrar en cualquier forma, p. ej., por via oral, intradermica, intraperitoneal, por via i.v., topica y similares. Las composiciones farmaceuticas como se proporcionan en la presente memoria se pueden formular para aplicacion topica, sublingual, oral, intravenosa, subcutanea, intramuscular, transdermica, intraarterial, intraarticular o intradermica.
Las composiciones como se proporcionan en la presente memoria usadas para estos tratamientos pueden ser activas en condiciones acidas. Las composiciones como se proporcionan en la presente memoria se pueden administrar por via oral en formulaciones (p. ej., comprimidos, pfldoras, geles, capsulas, hidrogeles, pulverizadores, polvos, aerosoles) que pasan a traves de las regiones acidas del estomago y descargan la enzima solo en el ambiente relativamente alcalino del yeyuno. Una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede formular con un vehfculo tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, derivados de celulosa o gelatina o cualquier otro excipiente de este tipo. Tambien se puede anadir un lubricante como estearato de magnesio, estearato de calcio o cera de polietilenglicol. Se puede anadir una solucion de azucar concentrada, que puede contener aditivos como talco, dióxido de titanio, gelatina la goma arabiga, como un recubrimiento. Se pueden usar capsulas blandas o duras para encapsular una hidrolasa como un lfquido o como una preparacion solida. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.691.181; 5.858.755.
Detergentes
En la presente memoria se proporcionan metodos y composiciones (enzimas, p. ej., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatas saesgún se proporciona en la presente memoria) que se pueden usar para fabricar y usar detergentes. Una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede anadir a, p. ej., mezclar con cualquier composicion detergente conocida, solida o lfquida, con o sin cambiar la composicion de la composicion detergente. Por ejemplo, una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede anadir a cualquier jabon, p. ej., sulfatos alifaticos tales como sulfatos de alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada, amidasulfatos, eter-sulfatos de alquilo o alquenilo que tienen un grupo alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada a los que se anaden uno o mas de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, sulfonatos alifaticos como sulfonatos de alquilo, sulfonatos de amida, sulfosuccinatos de dialquilo, sulfonatos de alfa-olefinas, de olefinas de tipo vinilideno y de olefinas internas, sulfonatos aromáticos tales como bencenosulfonatos de alquilo de cadena lineal o ramificada, eter-carbonatos de alquilo o alquenilo o amidas que tienen un grupo alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada a los que se anade uno o mas de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, o amidas, sales o esteres de acidos alfa-sulfograso, tensioactivos de tipo aminoacido, tensioactivos de fosfato tales como fosfatos acidos de alquilo o alquenilo y fosfatos de alquilo o alquenilo, tensioactivos anfoteros de tipo acido sulfonico, tensioactivos anfoteros de tipo betama, eteres o alcoholes de alquilo o alquenilo que tienen un grupo alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada a los que se anade uno o mas de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, eteres de polioxietilenalquilo y fenilo que tienen un grupo alquilo o alquenilo de cadena lineal o ramificada a los que se anaden uno o mas de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, alcanolamidas de acidos grasos superiores o sus aductos de óxido de alquileno, esteres de acidos grasos y sacarosa, monoesteres de glicerol y acido graso, óxidos de alquil o alquenil-amina, tensioactivos cationicos de tipo sal de tetraalquilamonio, o una combinacion de los mismos. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.827.718.
En la presente memoria se proporcionan composiciones detergentes que comprenden uno o mas polipeptidos (hidrolasas) como se proporcionan en la presente memoria. Se pueden usar formas tensioactivas y/o no tensioactivas. La cantidad de hidrolasa total, tensioactiva y/o no tensioactiva, puede ser de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 1,0%, o de aproximadamente 0,0002% a aproximadamente 0,5%, en peso, de la composicion de detergente. En la composicion de detergente, la hidrolasa tensioactiva puede ser de aproximadamente 5% a aproximadamente 67% y la hidrolasa no tensioactiva es de aproximadamente 33% a aproximadamente 95% de la actividad de hidrolasa total en la mezcla enzimatica. El pH optimo de la mezcla enzimatica total puede estar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10,5.
Las composiciones detergentes como se proporcionan en la presente memoria incluyen hidrolasas alcalinas tal como se proporcionan en la presente memoria que funcionan a valores de pH alcalinos, ya que el pH de una solucion de lavado puede estar en un intervalo de pH alcalino en condiciones de lavado normales. Vease, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5.454.971
Los polipeptidos como se proporcionan en la presente memoria (enzimas como se proporcionan en la presente memoria) se pueden usar en cualquier composicion de detergente, que son bien conocidas en la tecnica, vease, p. ej., patentes de EE.UU. N° 5.069.810; 6.322.595; 6,313,081. Por ejemplo, se proporciona una composicion detergente de lavandena. Puede comprender de 0,8 ppm a 80 ppm de una lipasa como se proporciona en la presente memoria.
Cualquier metodo para hacer y usar composiciones de detergentes se puede usar con enzimas como se proporcionan en la presente memoria, vease, p. ej., las patentes de EE.UU n° 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. Las composiciones de detergentes pueden ser una composicion acuosa de una y dos partes, una composicion lfquida no acuosa, un solido fundido, una forma granular, una forma en partfculas, un comprimido por compresion, una forma de gel, un polvo, un gel, un hidrogel, un liposoma, un aerosol, una pasta y/o una forma de suspension. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria tambien se pueden usar como un producto aditivo de detergente en forma solida o lfquida. Dichos productos aditivos estan destinados a complementar o mejorar el rendimiento de las composiciones de detergentes convencionales y se pueden anadir en cualquier etapa del proceso de limpieza.
En la presente memoria se proporcionan metodos capaces de eliminar manchas grandes de alimentos, pelfculas de restos de alimentos y otras composiciones menores de alimentos usando estas composiciones de detergentes. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden facilitar la eliminacion de manchas mediante hidrolisis catalttica de lfpidos, grasas o aceites. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en detergentes para lavavajillas y en detergentes para lavado de productos textiles.
El contenido de enzima activa real depende del metodo de fabricacion de una composicion de detergente y no es cntico, suponiendo que la composicion detergente tenga la actividad enzimatica deseada. La cantidad de hidrolasas presentes en la composicion final puede variar desde aproximadamente 0,001 mg a 0,5 mg por gramo de la composicion de detergente. La enzima particular elegida para usar en el procedimiento y los productos proporcionados en la presente memoria depende de las condiciones de la utilidad final, que incluyen la forma ffsica del producto, el pH de uso, la temperatura de uso y los tipos de suciedad que se van a degradar o alterar. La enzima se puede elegir para proporcionar una actividad y estabilidad optimas para cualquier conjunto dado de condiciones de utilidad. Las hidrolasas proporcionadas en la presente memoria son activas en los intervalos de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 y en el intervalo de temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C. Los detergentes como se proporcionan en la presente memoria pueden comprender tensioactivos cationicos, no ionicos semipolares o de ion fnbrido; o, mezclas de los mismos.
Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden formular en detergentes en polvo y lfquidos que tienen un pH entre 4,0 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5% (alternativamente de 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes tambien pueden incluir otras enzimas tales como proteasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas, endo-beta.-1,4-glucanasas, beta-glucanasas, endo-beta-1,3(4)-glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectinacetil-esterasas, ramnogalacturonan-acetil-esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectin-liasas, pectin-metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Estas composiciones de detergentes tambien pueden incluir mejoradores y estabilizantes.
La adicion de hidrolasas como se proporciona en la presente memoria a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitacion de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente tambien son adecuados para las composiciones como se proporcionan en la presente memoria siempre que la enzima sea activa o tolerante con el pH y/o la temperatura del uso previsto. Ademas, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en una composicion de limpieza sin detergentes, nuevamente solos o en combinacion con mejoradores y estabilizantes.
En la presente memoria se proporcionan composiciones de limpieza que incluyen composiciones de detergentes para limpiar superficies duras, composiciones de detergentes para limpiar telas, composiciones para lavavajillas, composiciones de limpieza bucal, composiciones de limpieza para dentaduras y soluciones de limpieza para lentes de contacto.
Se proporcionan en la presente memoria metodos para lavar un objeto, que comprenden poner en contacto el objeto con un polipeptido como se proporciona en la presente memoria en condiciones suficientes para el lavado. Una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede incluir como un aditivo de detergente. La composicion de detergente como se proporciona en la presente memoria se puede formular, por ejemplo, como una composicion de detergente para lavado de ropa a mano o a maquina que comprende un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Un aditivo para el lavado de ropa adecuado para el tratamiento previo de telas manchadas puede comprender un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. Una composicion suavizante de telas puede comprender una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria. Alternativamente, una hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede formular como una composicion de detergente para uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras en el hogar. Alternativamente, los aditivos de detergentes y las composiciones de detergentes como se proporcionan en la presente memoria pueden comprender una o mas enzimas diferentes tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra proteasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, p. ej., una lactasa y/o una peroxidasa (vease tambien, mas arriba). Las propiedades de la(s) enzima(s) como se proporciona en la presente memoria se eligen para que sean compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH optimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimaticos y no enzimaticos, etc.) y la(s) enzima(s) estan presentes en cantidades eficaces. Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se usan para eliminar materiales malolientes de telas. Se describen diferentes composiciones de detergentes y metodos para fabricarlas que se pueden usar como se describe, p. ej., en las patentes de EE.UU. N° 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.
Cuando se formulan como composiciones adecuadas para uso en un metodo de lavado de lavadora, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden comprender tanto un agente tensioactivo como un compuesto mejorador. Pueden comprender adicionalmente uno o mas componentes de detergentes, p. ej., compuestos polimericos organicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, supresores de espuma, dispersantes, dispersantes de jabon de cal, agentes de suspension y anti-redeposicion de suciedad e inhibidores de la corrosion. Las composiciones para lavar la ropa como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden contener agentes suavizantes, como componentes de detergentes adicionales. Las composiciones que contienen hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden proporcionar limpieza de telas, eliminacion de manchas, mantenimiento de blancura, suavizado, aspecto de color, inhibicion de la transferencia de colorante e higienizacion cuando se formulan como composiciones detergentes para lavado de ropa.
La densidad de las composiciones detergentes para lavado de ropa como se proporciona en la presente memoria puede estar en el intervalo de aproximadamente 200 a 1500 g/litro, o, de aproximadamente 400 a 1200 g/litro, o, de aproximadamente 500 a 950 g/litro, o, de 600 a 800 g/litro, de composicion; esto se puede medir a aproximadamente 20°C.
La forma "compacta" de las composiciones de detergentes para lavado de ropa como se proporciona en la presente memoria se refleja mejor por la densidad y, en terminos de composicion, por la cantidad de sal de carga inorganica. Las sales de carga inorganica son ingredientes convencionales de composiciones de detergentes en forma de polvo. En composiciones de detergentes convencionales, las sales de carga estan presentes en cantidades sustanciales, tfpicamente de 17% a 35% en peso de la composicion total. En las composiciones compactas, la sal de carga puede estar presente en cantidades que no superen 15% de la composicion total, o que no superen 10%, o que no superen 5% en peso de la composicion. Las sales de carga inorganica se pueden seleccionar de las sales de metales alcalinos y alcalinoterreos de sulfatos y cloruros, p. ej., sulfato de sodio.
Las composiciones de detergentes lfquidas como se proporcionan en la presente memoria tambien pueden estar en una forma concentrada. Las composiciones de detergentes lfquidas pueden contener una cantidad menor de agua, en comparacion con los detergentes lfquidos convencionales. Alternativamente, el contenido de agua del detergente lfquido concentrado es inferior a 40%, o inferior a 30%, o inferior a 20% en peso de la composicion detergente. Los compuestos detergentes como se proporcionan en la presente memoria pueden comprender formulaciones como se describe en el documento WO 97/0l629.
Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden ser utiles para formular diversas composiciones de limpieza. Una serie de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados incluyendo detergentes no ionicos, anionicos, cationicos o de ion hforido, p. ej., como se describe en las patentes de EE. UU. N° 4.404.128; 4.261.868; 5.204.015. Ademas, las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones de jabon lfquido o en barra, formulaciones para el cuidado de platos, soluciones o productos de limpieza de lentes de contacto, hidrolisis de peptidos, tratamiento de residuos, aplicaciones textiles, como enzimas de escision de fusion en la produccion de protemas, y similares. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria pueden proporcionar un mejor rendimiento en una composicion de detergente en comparacion con otra proteasa de detergente, es decir, el grupo de enzimas puede aumentar la limpieza de ciertas manchas sensibles a enzimas tales como hierba o sangre, como se determina por la evaluacion habitual despues de un ciclo de lavado estandar. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden formular en detergentes en polvo y lfquidos conocidos que tienen un pH entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5% (p. ej., de aproximadamente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones de limpieza de detergentes tambien pueden incluir otras enzimas tales como otras esterasas, fosfolipasas, proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, asf como tambien mejoradores y estabilizantes.
Tratamiento de alimentos y procesado de alimentos
Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para la separacion de componentes de materiales de celulas vegetales. Por ejemplo, las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en la separacion de material rico en protemas (p. ej., celulas vegetales) en componentes, p. ej., sacarosa de la remolacha azucarera o almidon o azucares de la patata, pulpa o fracciones de cascara. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para separar cultivos ricos en protemas o ricos en aceite en protemas valiosas y fracciones de aceite y cascara. El procedimiento de separacion se puede llevar a cabo mediante el uso de metodos conocidos en la tecnica.
Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en la preparacion de zumos de frutas o vegetales, jarabes, extractos y similares para aumentar el rendimiento. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en el tratamiento enzimatico (p. ej., hidrolisis de protemas) de diversos materiales derivados de la pared celular de la planta o materiales de desecho, p. ej., de la produccion de vino o zumo, o restos agncolas tales como cascaras de verduras, vainas de judfas, pulpa de la remolacha azucarera, pulpa de oliva, pulpa de patata y similares. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para modificar la consistencia y aspecto de las frutas o verduras procesadas. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para tratar el material vegetal para facilitar el procesamiento del material vegetal, incluidos alimentos, facilitar la purificacion o extraccion de componentes vegetales. Las hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para mejorar el valor de piensos, disminuir la capacidad de union de agua, mejorar la degradabilidad en instalaciones de aguas residuales y/o mejorar la conversion del material vegetal en ensilado, y similares.
Piensos animales y aditivos de alimentos o piensos
En la presente memoria se proporcionan metodos para el tratamiento de piensos animales y alimentos y aditivos de alimentos o piensos usando hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria, incluyendo los animales marnfferos (p. ej., seres humanos), aves, peces y similares. En la presente memoria se proporcionan piensos animales, alimentos, suplementos de piensos y alimenticios, y aditivos que comprenden hidrolasas como se proporcionan en la presente memoria.
En la presente memoria se proporcionan hidrolasas para usar en la modificacion de piensos animales o un alimento, p. ej., para procesar el alimento o pienso ya sea in vitro (modificando componentes del pienso o alimento) o in vivo. La hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se puede suministrar expresando las enzimas directamente en cultivos de piensos transgenicos (como, p. ej., plantas, semillas transgenicas, y similares), tales como mafz, soja, semillas de colza, lupino, y similares. En la presente memoria tambien se proporcionan plantas transgenicas, partes de plantas y celulas vegetales que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido como se proporciona en la presente memoria. El acido nucleico se puede expresar de modo que la hidrolasa como se proporciona en la presente memoria se produzca en cantidades recuperables. La hidrolasa se puede recuperar de cualquier planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipeptido recombinante se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, p. ej., mejorando el valor nutricional, sabrosidad y propiedades reologicas o para destruir un factor antinutritivo.
Interesterificacion
Los metodos y composiciones proporcionados en la presente memoria se pueden usar para modificar las propiedades de mezclas de triacilgliceridos, y su consistencia. Una enzima como se proporciona en la presente memoria se pude usar en presencia de un catalizador tal como sodio metalico o metóxido de sodio para promover la migracion de acilo entre moleculas de glicerido, de modo que los productos consisten en mezclas de gliceridos en las que los restos de acilo grasos se distribuyen aleatoriamente entre las moleculas de glicerido.
Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para producir productos de interesterificacion en condiciones de reaccion en las que se minimiza la hidrolisis de grasa, de modo que la interesterificacion catalizada por lipasa se convierte en la reaccion dominante. Estas condiciones pueden incluir, p. ej., restringir la cantidad de agua en el sistema.
Las enzimas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para catalizar reacciones de interesterificacion usando mezclas de triacilgliceridos y acidos grasos libres, como se describe, p. ej., en el documento EP 0093602 B2. En estos casos, el acido graso libre se puede intercambiar con los grupos acilo de los triacilgliceridos para producir nuevos triacilgliceridos enriquecidos en el acido graso anadido. Las lipasas 1,3-espedficas como se proporcionan en la presente memoria se pueden usar para limitar la reaccion a las posiciones 1 y 3 de los gliceridos, lo que permite obtener una mezcla de triacilgliceridos que no se puede obtener por interesterificacion qrnmica o reaccion con una lipasa no espedfica. Se usan lipasas no espedficas para obtener resultados similares a la interesterificacion qrnmica.
La capacidad de producir nuevas mezclas de triacilgliceridos usando lipasas espedficas de posicion como se proporcionan en la presente memoria es util para la industria de aceites y grasas porque algunas de estas mezclas tienen propiedades valiosas. Un ejemplo es la interesterificacion catalizada por lipasa 1,3-espedfica de 1,3-dipalmitoil-2-monolema (POP), que es el triacilglicerido principal de la fraccion media del aceite de palma, con acido estearico o triestearina para dar productos enriquecidos en la valiosa 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleina (POSt) y 1.3- diestearoil-2-monolema (StOSt), POSt y StoSt son los componentes importantes de la manteca de cacao. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona una reaccion de interesterificacion para producir equivalentes de manteca de cacao a partir de materiales de partida baratos.
En la presente memoria se proporcionan metodos de produccion de un sustituto de grasa dura que usa las lipasas 1.3- espedficas como se proporcionan en la presente memoria. Un sustituto de grasa dura comprende una mezcla de la fraccion media de palma y StOSt, POSt o StOSt/POSt de al menos 85% de pureza.
La invencion se describira adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la invencion no esta limitada a dichos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayos de lipasa-saturasa de ejemplo
El siguiente ejemplo describe ensayos de ejemplo para cribar una hidrolasa, p. ej., actividad de una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa. Estos ensayos de ejemplo se pueden usar como cribados de rutina para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance como se proporciona en la presente memoria. Dichos ensayos incluyen el uso de compuestos indicadores de pH para detectar la escision de acidos grasos de triacilgliceridos, metodos espectrofotometricos, HPLC, GC, MS, TLC y otros. Jaeger (1994) FEMS Microbiol. Rev.
15:29-63; Ader (1997) Methods Enzymol. 286: 351-386; Vorderwulbecke (1992) Enzyme Microb. Tecnol. 14: 631­ 639; Renard (1987) Lipids 22: 539-541.
Cribado de la actividad de lipasa/esterasa
Las colonias se recogen con palillos esteriles y se usan para inocular individualmente cada uno de los pocillos de las placas de microtitulacion de 96 pocillos. Los pocillos conteman 250 pl de medio LB con 100 pg/ml de ampicilina, 80 |jg/ml de meticilina y 10% v/v de glicerol (LB Amp/Meth, glicerol). Las celulas se cultivaron durante la noche a 37°C sin agitacion. Por lo tanto, cada pocillo contema un cultivo madre de celulas de E. coli, cada una de las cuales contema un pBLUESCRIPT™ con un inserto de ADN unico.
Las placas de 96 pocillos se usaron para multiplicar la inoculacion en una placa unica (la "placa condensada") que contema en cada pocillo 200 pl de LB Amp/Meth, glicerol. Esta etapa se llevo a cabo usando la herramienta de replicacion de alta densidad (HDRT) de un BIOMEK™ (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) con un 1% de lejfa, agua, isopropanol, ciclo de esterilizacion con aire seco entre cada inoculacion. Por lo tanto, cada pocillo de la placa condensada contema de 10 a 12 clones de pBLUESCRIPT™ diferentes de cada una de las placas de la biblioteca fuente. La placa condensada se cultivo durante 16 horas a 37°C y despues se uso para inocular dos placas hijas de microtitulacion de 96 pocillos blancas (Polyfiltronics, Inc., Rockland MA) que conteman en cada pocillo 250 |jl de LB Amp/Meth (sin glicerol) . La placa condensada original se almaceno a -80°C. Las dos placas hijas condensadas se incubaron a 37°C durante 18 horas.
La "solucion madre de sustrato 600 |iM" de esterasa de cadena corta se preparo como sigue: se disolvieron 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos en el volumen adecuado de DMSO para dar una solucion 25,2 mM. Los compuestos usados eran propionato de 4-metilumbeliferilo, butirato de 4-metilumbeliferilo y heptanoato de 4-metilumbeliferilo. Se anadieron doscientos cincuenta microlitros de cada solucion de DMSO a aproximadamente 9 ml de tampon HEPES 50 mM, pH 7,5, que contema Triton X-100 al 0,6% y 0,6 mg por ml de dodecil-maltosido (Anatrace, Maumee, OH). El volumen se llevo a 10,5 ml con el tampon HEPES anterior para dar una suspension ligeramente turbia.
La "solucion madre de sustrato 600 jM" de cadena larga se preparo como sigue: se disolvieron 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos en DMSO hasta 25,2 mM como antes. Los compuestos usados eran elaidato de 4-metilumbeliferilo, palmitato de 4-metilumbeliferilo, oleato de 4-metilumbeliferilo y estearato de 4-metilumbeliferilo. Todos requenan un breve calentamiento en un bano a 70°C para lograr la disolucion. Se anadieron doscientos cincuenta microlitros de cada solucion de DMSO al tampon de HEPES y se diluyeron a 10,5 ml como antes. Los siete derivados de umbeliferilo se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Se anadieron cincuenta j l de la "solucion madre de sustrato 600 jM " de esterasa de cadena larga o esterasa de cadena corta a cada uno de los pocillos de una placa condensada blanca usando el BIOMEK™ para dar una concentracion final de sustrato de aproximadamente 100 jM . Los valores de fluorescencia se registraron (excitacion = 326 nm, emision = 450 nm) en un fluorometro de lectura de placa inmediatamente despues de la adicion del sustrato. La placa se incubo a 70°C durante 60 minutos en el caso de los sustratos de cadena larga, y 30 minutos a t.a. en el caso de los sustratos de cadena corta. Los valores de fluorescencia se registraron de nuevo. Los valores iniciales y finales de fluorescencia se compararon para determinar si estaba presente un clon activo.
Para aislar el clon individual que llevaba la actividad, las placas de Source GenBank se descongelaron y los pocillos individuales se usaron para inocular individualmente una nueva placa que contema LB Amp/Meth. Como antes, la placa se incubo a 37°C para hacer crecer las celulas, se anadieron 50 j l de solucion madre de sustrato 600 jM usando el BIOMEK™ y se determino la fluorescencia. Una vez que se identifico el pocillo activo de la placa fuente, las celulas de este pocillo activo se sembraron en rayas en agar con LB/Amp/Meth y se cultivaron durante la noche a 37°C para obtener colonias individuales. Se seleccionaron ocho colonias individuales con un palillo esteril y se usaron para inocular individualmente los pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Los pocillos conteman 250 j l de LB Amp/Meth. Las celulas se cultivaron durante la noche a 37°C sin agitacion. Se retiro una parte alfcuota de 200 j l de cada pocillo y se ensayo con los sustratos de cadena larga o corta adecuados como antes. Se identifico el clon mas activo y los 50 j l restantes de cultivo se usaron para sembrar rayas una placa de agar con LB/Amp/Meth. Se seleccionaron ocho colonias individuales, se cultivaron y se analizaron como antes. El clon mas activo se uso para inocular cultivos de 3 ml de LB/Amp/Meth, que se cultivaron durante la noche. Se aislo el ADN plasirndico de los cultivos y se uso para la secuenciacion.
Ejemplo 2: Protocolos de ejemplo para la determinacion por LCMS del perfil de acidos grasos liberados que resulta de la hidrolisis enzimatica de aceite vegetal
El siguiente ejemplo describe metodos de ejemplo (protocolos) para llevar a cabo la hidrolisis enzimatica de aceite vegetal, tal como aceite de soja (usado en este ejemplo), (que incluye la preparacion de enzimas) usando, p. ej., enzimas como se proporcionan en la presente memoria. Este ejemplo tambien describe metodos (protocolos) de ejemplo para detectar y cuantificar los acidos grasos liberados del aceite. El metodo se describe usando la lipasa de SEQ ID NO: 2, pero es aplicable a otras enzimas, incluidas las enzimas como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., las enzimas de ejemplo que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2 y que tienen una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todas las modificaciones de los restos de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23.
Expresion de protema en placa de 96 pocillos profundos:
1. Se cultivan clones de E. coli de lipasa durante la noche a 30°C en 1 ml de medio TB que contema carbenicilina (100 |ig/ml) en placas de 96 pocillos profundos con registro de ubicacion e identidad de los clones.
2. Se inoculan en nuevas placas de 96 pocillos profundos que contienen medio TB (1 ml; 100 jg/ml de carbenicilina) los cultivos lfquidos (10 jl/pocillo).
3. Se incuba el cultivo durante la noche a 30°C mientras se agita a 200 rpm.
4. Se induce la expresion de protemas por transferencia de 500 j l de cada cultivo de una noche a una nueva placa de 96 pocillos que contiene medio TB (500 jl/pocillo; carbenicilina 100 jg/ml) y tetraciclina anhidra (200 ng/ml). 5. Se incuba a 30°C durante 2 horas con agitacion a 200 rpm.
6. Se recogen las celulas centrifugando cada placa durante 10 minutes a 3000 x g. Se retira el Ifquido sobrenadante. Los sedimentos celulares se pueden usar inmediatamente para los analisis de aceite o se pueden almacenar a -20°C para su uso posterior.
Reaccion enzimatica de hidrolisis de aceite:
1. Se anaden 100 pl de B-PER™ (Pierce Chemical, Rockford, IL) a cada sedimento celular. Si los sedimentos se almacenan a -20°C, dejar descongelar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adicion de B-PER™.
2. Se anaden 400 pl de aceite de soja a cada pocillo de la placa de 96 pocillos profundos.
3. Se anaden varias perlas (vidrio 710-1180 pm) por pocillo. Se sellan las placas con CAPMATS™ (Whatman, Florham Park, NJ).
4. Las celulas se lisan y se genera una emulsion de aceite/enzima/tampon usando un molino mezclador (Retsch Inc., Newtown, PA). Se colocan un par de placas selladas en el molino mezclador y se agita durante 30 segundos a una frecuencia de 30 ciclos/segundo.
5. Se sustituyen los sellados de CAPMATS™ por un sellado permeable al gas.
6. Se incuban las placas durante 2 horas a 37°C mientras se agita a 200 rpm.
Extraccion de acidos grasos:
1. Se anade 1 ml de disolvente de extraccion (CHCl3:MeOH:HCl 4 N (2:1:0,075)) a cada pocillo de la placa de 96 pocillos profundos.
2. Se pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta que parece homogenea.
3. se cubren las placas con un sello de papel de aluminio.
4. Se centrifuga durante 5 minutos a 3000 x g. Se corta el sello para abrir con una cuchilla de afeitar.
5. Se introduce la punta de la pipeta a traves de la fase superior y se transfieren 5 pl de la fase inferior a una nueva placa de 96 pocillos profundos que contiene 995 pl/pocillo de MeOH (es decir, una dilucion 1/200 de la fase inferior). Tenga cuidado de no contaminar con la fase superior. Se almacenan las mezclas de extraccion separadas a 4°C. 6. Se transfieren 150 pl de la dilucion 1/200 de todas las muestras a una placa de poliestireno de 96 pocillos.
7. Para evitar la evaporacion, se sellan las placas con calor. Asegurese de que el sellado no entra en contacto con MeOH ya que esto evitara la adherencia adecuada.
8. Se analizan las muestras por LC/MS.
Analisis de LC/MS:
1. Las muestras enviadas en formato de placa de 96 pocillos se inyectan mediante un inyector automatico HTCPAL™ (LEAP Technologies, Carrboro, NC) en una mezcla isocratica de H2O/MeCN (10/90, v/v) y acido formico al 0,1%, suministrado por las bombas LC-10ADVP™ (Shimadzu, Kyoto, Japon) a 1,2 ml/min.
2. La separacion se logra con una columna SYNERGI MAX-RP™ (Phenomenex, Sutter Creek CA) de 150 x 2.00 mm y deteccion. La cuantificacion se completa con un espectrometro de masas de triple cuadrupolo API 4000™ (Applied Biosystems, Foster, CA) que usa ionizacion por electropulverizacion (ESI) y seguimiento de iones multiples para las masas 277, 279, 281,255, 283 en el modo de ion negativo.
3. El control de la instrumentacion y la generacion de datos se realizan con el software ANALYST 1.3™ (Applied Biosystems, Foster, CA).
4. El LC/MS se calibro para cada acido graso en el intervalo de 0,5 a 50 pg usando muestras de referencia (Sigma). Este intervalo se ajusta mejor a una curva patron de regresion cuadratica que se usa para calcular la cantidad de cada acido graso liberado en las muestras de enzimas.
Ejemplo 3: Protocolos de ejemplo para el cribado de HTP de bibliotecas de evolucion de lipasa para una mayor selectividad para la hidrolisis de esteres de palmitato o estearato frente a los esteres de oleato
El siguiente ejemplo describe metodos de ejemplo (protocolos) para el cribado de alto rendimiento (HTP) de las "bibliotecas de evolucion" de lipasa para una mayor selectividad para la hidrolisis de los esteres de palmitato o estearato frente a esteres de oleato. Este metodo de ejemplo (protocolo/cribado de HTP) describe el cribado de bibliotecas de evolucion de lipasa derivadas de la SEQ ID NO: 2, pero es aplicable a otras enzimas, incluyendo las enzimas como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., las enzimas de ejemplo que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todas las modificaciones de restos de aminoacidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10 Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y este metodo de ejemplo (protocolo) es aplicable a otros tipos de bibliotecas.
Estos cribados de HTP de ejemplo se llevan a cabo usando dos sustratos fluorogenicos: esteres palmitato o estearato de metilumbeliferilo frente a ester oleato de metilumbeliferilo.
Flujo de cribado de HTP:
1. Los clones de la biblioteca se disponen en matrices en placas de microvaloracion y se analizan en cribado de HTP primario.
2. Los clones que se identifica que tienen una selectividad mejorada se designan como aciertos primarios.
3. Los aciertos primarios se vuelven a poner en matriz en placas de microvaloracion y se analizan en un cribado de HTP secundario.
4. Los clones que se confirma que tienen una selectividad mejorada se designan como aciertos secundarios.
5. Los aciertos secundarios se secuencian para identificar las mutaciones de secuencia presentes y se ensayan en aceite (vease el protocolo separado).
Protocolo de ensayo de HTP
1. Etiquetar con código de barras placas de ensayo negras de 384 pocillos; etiquetar con código de barras placas de crecimiento de 384 pocillos y cargar 30 pl/pocillo de medio LB (100 pg/ml de carbenicilina).
2. Escoger o seleccionar clones en placas de crecimiento y cultivar durante la noche a 30°C en una incubadora humidificada.
3. Inducir la expresion de la lipasa mediante la adicion de 30 pl/pocillo de medio LB (100 pg/ml de carbenicilina) que contiene 4 pg/ml de tetraciclina anhidra e incubar 2 horas a 30°C.
4. Lisar las celulas por adicion de 20 pl/pocillo de B-PER™ (Pierce Chemical, Rockford, IL); mantener a temperatura ambiente hasta que se ponga en el robot.
5. Ejecutar el ensayo de actividad de la lipasa en un robot (ver mas abajo).
6. Los clones que se identifica que tienen mayor selectividad para los esteres palmitato o estearato de MeUMB frente al ester oleato de MeUMB se designan como aciertos.
7. Seleccionar los clones de aciertos en placas de 96 pocillos profundos que contengan medio LB (1 ml/pocillo; 100 pg/ml de carbenicilina) y cultivar durante la noche a 30°C.
8. Para los aciertos primarios, volver a disponer en matrices en placas de 384 pocillos y repetir los pasos 1-8 en el cribado secundario; designar los aciertos de clones como aciertos secundarios.
9. Para los aciertos secundarios, despues de la etapa 8 enviar para secuenciacion.
Protocolo de ejemplo de cribado de HTP automatico
1. Albaricoque: mezclar y transferir una parte alfcuota (10 pl) de las celulas lisadas de la "placa de crecimiento" (veanse las etapas 1-4 antes) a cada una de dos placas de ensayo separadas (1 y 2).
2. MULTIDROP™ (Thermo Electron Corporation, Milford, MA): anadir 70 pl de sustrato 1 (UMB-16:0) a la placa de ensayo 1; anadir 70 pl de sustrato 2 (UMB-18:1) a la placa de ensayo 2
3. Incubar las placas de ensayo durante 20 minutos a 37°C.
4. Leer en el fluonmetro: Excitacion a 360 nm y emision a 465 nm
Los clones de aciertos secundarios que se determina que tienen secuencias unicas se ordenan y se cultivan en placas de 96 pocillos y se analizan en aceite de soja (ver mas abajo).
Estructuras de sustratos fluorogenicos usados en el cribado de HTP
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Ejemplo 4: Evolucion de ejemplo de la hidrolisis mejorada de esteres de palmitato o estearato usando tecnolog^a GSSMsm
El siguiente ejemplo describe y resume los resultados de la "evolucion de enzimas" de ejemplo y protocolos de cribado que identificaban enzimas de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., enzimas que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2 pero que tambien tienen una modificacion de restos como se expone en la Tabla 3 o Tabla 4; o enzimas codificadas por un acido nucleico que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 pero que tambien tiene una modificacion de restos como se expone en la Tabla 3 o la Tabla 4. Un ensayo de cribado de ejemplo para identificar estas enzimas de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria usa aceite de soja como sustrato, y los acidos grasos liberados (hidrolizados) del aceite de soja se caracterizaron, p. ej., como acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico o acido estearico.
El aceite de soja tiene la siguiente distribucion de acidos grasos: Linolenico = 8%; Linoleico = 53%; Oleico = 23%; Palmftico = 12%; Estearico = 4%. Por lo tanto, si el porcentaje de acido palmftico liberado (hidrolizado) del aceite de soja por una enzima de ejemplo como se proporciona en la presente memoria es mayor que 12%, entonces esa enzima tiene una preferencia por hidrolizar (liberar) acido palmftico.
Cribado de palmitasa: formacion de una "biblioteca de palmitasa"
Se realizo una biblioteca de palmitasa de variantes de SEQ ID NO: 2 mediante tecnologfa GSSMsM (numero de patente 6.171.820). Se introdujeron mutaciones puntuales usando oligonucleotidos degenerados, una posicion de aminoacido a la vez, de modo que cada codon original se sustituye por cada uno de los 20 aminoacidos codificados de forma natural. Las variantes mutadas se transformaron en el hospedante Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, EE.UU.) para expresion y cribado. La biblioteca se construyo en un vector de expresion pASK-5, que se modifico a partir del vector pASK-IBA (IBA GmbH, Alemania). Para hacer pASK-5, el conector de clonacion original se reemplazo con nuevos sitios de clonacion, espedficamente, la secuencia de XbaI a HindIII de pASK-IBA se reemplazo con la siguiente secuencia:
Figure imgf000090_0002
La expresion de las variantes GSSMsM se indujo con anhidrotetraciclina despues de que se alcanzaron las densidades de celulas hospedantes optimas.
Las enzimas que tienen secuencias de aminoacidos generadas por tecnologfa GSSMsM se cribaron por un protocolo de cribado de alto rendimiento (HTP), p. ej., el protocolo descrito en el ejemplo 3, que determino que acido graso se hidrolizaba preferentemente a partir de una grasa-aceite de soja en este ensayo. El objetivo del proyecto de evolucion era mejorar la selectividad de palmitato de la secuencia parental, SEQ ID NO: 2, sobre el aceite. El ensayo comprendfa poner en contacto la enzima nueva/secuencia modificada con el aceite de soja, que comprende varios acidos grasos, incluyendo el acido linolenico, el acido linoleico, el acido oleico, el acido palmftico y el acido estearico (vease el % de distribucion, citado antes) y medir la cantidad de cada acido graso hidrolizado por cada enzima modificada. Se identifico una "biblioteca" de secuencias que permitfa q una enzima hidrolizar preferentemente un acido palmftico (o un acido estearico, vease a continuacion), del aceite de soja (llamado "biblioteca de palmitato"): - Los cribados primarios y secundarios se llevaron a cabo usando un cribado de HTP, p. ej., el metodo descrito en el ejemplo 3;
- La secuenciacion de aciertos secundarios identificaba mutaciones de aminoacidos que daban como resultado una selectividad mejorada para la hidrolisis de palmitato frente a oleato en el cribado de HTP en comparacion con, p. ej., la secuencia parental, SEQ ID NO: 2.
- Para cada variante de codon que codifica una mutacion de aminoacido, un clon se selecciono un clon y se dispuso en placas de 96 pocillos para el ensayo en aceite;
- A partir de los ensayos de aceite, se obtuvo la selectividad de las enzimas mutantes para palmitato o estearato u otros acidos grasos (Tabla 3).
- El acierto superior produda palmitato como 59% de los acidos grasos liberados (FA) frente (vs) a 43% para la SEQ ID N°: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un aumento en el factor de selectividad de 3,6 a 4,9;
- Varios clones tambien mostraron aumentos en la selectividad de estearato.
La Tabla 1, a continuacion, resume las mutaciones GSSMsm (vease antes) seleccionadas para su inclusion en la "biblioteca de palmitato" para ser combinadas por la tecnologfa GeneReassemblySM (vease el ejemplo 5). En un ensayo de ejemplo, se identificaron catorce (14) mutaciones de aminoacidos individuales que produdan los mayores aumentos en la hidrolisis de palmitato en los ensayos de aceite (vease tambien las Tablas 1, 3 y 4, a continuacion). Los restos se marcan de acuerdo con el orden en que aparecen en la SEQ ID NO: 2 parental (vease la figura 7), entre los restos que producen aumentos significativos en la hidrolisis de palmitato o estearato en los ensayos de aceite. Se dan el "AA original" en la SEQ ID NO: 2 y las mutaciones beneficiosas ("Nuevos aminoacidos"), es decir, las secuencias de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria. Las mutaciones individuales a arginina (R) en las posiciones de restos 163 y 164 se pueden incluir alternativamente de modo que esta biblioteca de ejemplo incluira clones con las secuencias 163V-164D (SEQ ID NO:2), 163R-164D, y 163V-164R, pero no en la secuencia 163R-164R.
Tabla 1
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La figura 6a ilustra los efectos de mutaciones de GSSMsM de palmitasa de ejemplo en la hidrolisis de palmitato y estearato con respecto a la SEQ ID NO: 2 parental. Para cada una de las catorce (14) mutaciones de un solo aminoacido seleccionadas para su inclusion en la biblioteca GeneReassemblySM de la palmitasa, se representa graficamente el cambio en porcentaje en el palmitato y estearato liberados, con respecto a la SEQ ID NO: 2 parental. Muchas de estas mutaciones produdan aumentos significativos en la hidrolisis del palmitato, acompanadas por aumentos de pequenos a significativos en la hidrolisis del estearato. Sin embargo, varias mutaciones producen ligeras disminuciones en la hidrolisis del estearato. Los asteriscos indican mutaciones identificadas como que transmiten selectividad incrementada de tipo saturasa.
Cribado de estearato: formacion de una "biblioteca de estearato (estearatasa)"
Se hizo una biblioteca de estearatasas de variantes de la SEQ ID NO: 2 mediante tecnologfa GSSMsM (numero de patente 6.171.820). Las mutaciones puntuales se introdujeron usando oligonucleotidos degenerados, una posicion de aminoacido a la vez, de modo que cada codon original se podfa sustituir con cada uno de los 20 aminoacidos codificados de forma natural. Las variantes mutadas se transformaron en el hospedante Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, EE.UU.) para expresion y seleccion. La biblioteca se construyo en el vector de expresion pASK-5 (como se ha descrito antes). La expresion de las variantes de GSSMsM se indujeron con anhidrotetraciclina despues de que se alcanzaron las densidades de celulas hospedantes optimas.
Las enzimas que tienen secuencias de aminoacidos generadas por la tecnologfa GSSMsm se seleccionaron mediante un protocolo de cribado de alto rendimiento (HTP), p. ej., el protocolo descrito en el ejemplo 3, que determinaba que acido graso se hidrolizaba preferentemente de una grasa-aceite de soja en este ensayo. El ensayo comprendfa poner en contacto la enzima nueva/de secuencia modificada con el aceite de soja, que comprende varios acidos grasos, incluyendo el acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmttico y acido estearico (vease el % de distribucion, citado antes) y medir la cantidad de cada acido graso hidrolizado por cada enzima modificada. Se identifico una "biblioteca" de secuencias que permitfan a una enzima hidrolizar preferentemente un acido estearico (o un acido palmftico, vease antes), del aceite de soja (la llamada "biblioteca de estearato"):
- Los cribados, cribados primarios y secundarios, se realizaron usando una cribado de HTP, p. ej., el metodo descrito en el ejemplo 3;
- La secuenciacion de aciertos secundarios identifico mutaciones de aminoacidos que daban como resultado una selectividad mejorada para la hidrolisis del estearato frente al oleato en el cribado de HTP en comparacion con, p. ej., la secuencia parental, SEQ ID NO: 2.
- Para cada variante de codon que codifica una mutacion de aminoacido, se selecciono un clon y se dispuso en placas de 96 pocillos para el ensayo en aceite.
- Los ensayos de aceite de los aciertos secundarios secuenciados dieron la selectividad de las enzimas mutantes para palmitato o estearato u otros acidos grasos (Tabla 3).
- El acierto superior produda estearato como 22% de los FA liberados frente a 9% para la SEQ ID NO: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un aumento en el factor de selectividad de 2,3 a 5,5;
- Varios clones tambien mostraron incrementos en la selectividad del palmitato.
La Tabla 2, a continuacion, resume las mutaciones de GSSMsM (vease antes) seleccionadas para su inclusion en la "biblioteca de estearatasa" para combinar mediante la tecnologfa GeneReassemblySM. En un ensayo de ejemplo, se identificaron veintidos (22) mutaciones de aminoacidos individuales que produdan los mayores aumentos en la hidrolisis del estearato en los ensayos de aceite (vease tambien las Tablas 2, 3 y 4, a continuacion). Los restos se marcan de acuerdo con el orden en que aparecen en la SEQ ID NO: 2 "parental", entre los restos que producen aumentos significativos en la hidrolisis de palmitato o estearato en los ensayos de aceite. Se dan el "Aminoacido Original" en la SEQ ID NO: 2 y las mutaciones beneficiosas ("Nuevos aminoacidos"), es decir, las secuencias de ejemplo proporcionadas en la presente memoria. La mutacion individual a alanina (A) en el resto de la posicion 223 se incluye como una mutacion fija de modo que cada clon en esta biblioteca de ejemplo contiene esta mutacion. Tabla 2
Figure imgf000092_0001
La figura 6b (vease tambien antes) ilustra los efectos de doce (12) de las veintidos (22) mutaciones de GSSMsM de estearatasa principales en la hidrolisis de palmitato y estearato en relacion con la SEQ ID NO: 2 parental. Para cada una de las doce (12) mutaciones de aminoacidos individuales dadas en la Figura 6b y seleccionadas para su inclusion en la biblioteca de GeneReassemblySM de estearatasa, se representa graficamente el cambio en porcentaje en palmitato y estearato liberado, con respecto a la SEQ ID NO: 2 parenteral. La mayona de estas mutaciones produdan aumentos significativos en la hidrolisis del estearato, pero disminuciones de leves a significativas en la hidrolisis del palmitato. Los asteriscos indican mutaciones identificadas como que transmiten una mayor selectividad de tipo saturasa, es dedr, aumentos en la selectividad para la hidrolisis de palmitato y estearato frente a la hidrolisis de acidos grasos insaturados en el aceite, p. ej., oleato, linoleato y linolenato.
Resumen
- El cribado de la "biblioteca GSSMsM" (vease antes, donde se describe en detalle la tecnologfa GSSMsm) basado en la SEQ ID NO: 2 parental produda clones de aminoacidos mutantes individuales con mejoras significativas en la selectividad del palmitato y estearato y en selectividad de saturados, es decir, selectividad para la hidrolisis de palmitato y estearato (p. ej., hidrolisis selectiva de palmitato y/o estearato del aceite de soja);
- Se encontraron clones con mejoras significativas en la selectividad del estearato (hidrolisis selectiva del acido estearico frente a otros acidos grasos);
- Se descubrieron mutantes por GSSMsM con mayor selectividad de palmitato (hidrolisis selectiva del acido palmftico frente a otros acidos grasos) con respecto a la enzima SEQ ID NO: 2.
La Tabla 3 y la Tabla 4, a continuacion, describen (resumen, ademas) las secuencias de las enzimas hidrolasas de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria, p. ej., las enzimas de ejemplo que tienen una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 y que tienen al menos uno (uno, varios o todos) de los cambios de restos de aminoacidos descritos en las tablas. La Tabla 3 y la Tabla 4 tambien resumen los datos de actividad para enzimas de ejemplo seleccionadas; incluyendo los datos el emparejamiento de enzimas de ejemplo particulares con su actividad de hidrolasa positiva que comprende la catalisis de hidrolisis de (liberacion de) un acido graso de palmitato o de estearato del aceite de soja, como se identifica por un protocolo de cribado de alto rendimiento (HTP), como se ha descrito antes.
En la Tabla 3 y Tabla 4, el termino "Aminoacido original" indica el resto de aminoacido objetivo (indicado bajo "Resto de aminoacido") en la enzima "parental" de SEQ ID NO: 2 ("objetivo" para el cambio); y el termino "Nuevos aminoacidos" indica el nuevo resto de aminoacido disenado nuevo (que reemplazaba el correspondiente resto "objetivo" en la "secuencia antigua") en la enzima (nueva) de ejemplo como se proporciona en la presente memoria. La lista del "Nuevo aminoacido" reside en la columna "estearato" frente a "palmitato" indica cual de los dos cribados de acidos grasos de alto rendimiento (HTP) (es decir, liberacion de acido palmftico en un cribado y liberacion de acido estearico en el otro cribado, vease el ejemplo 3), se uso para detectar (identificar) una enzima particular con la variacion de resto indicada (secuencia de nueva enzima, reside "aminoacido nuevo").
Por ejemplo, en la primera fila de la Tabla 3, en el resto de aminoacido 7, la tirosina (o "Y") de la enzima "parental" de s Eq ID NO: 2 se reemplaza por un resto de aminoacido arginina (o "R"), y esta nueva enzima (Y7R) tiene una actividad que difiere de la de la enzima parental (vease la Tabla 3); por ejemplo, los "Datos del aceite" resumen la preferencia del sustrato (acido graso) de la nueva enzima (p. ej., la enzima Y7R) citando los acidos grasos liberados (hidrolizados) generados cuando la enzima se expoma al (se poma en contacto con) aceite de soja (ensayos descritos antes), observando que el sustrato de aceite de soja tiene varios posibles grupos constituyentes de acidos grasos hidrolizables, incluyendo acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico, acido estearico. Por ejemplo, en la primera fila, para la enzima Y7R, 8,3% de los acidos grasos liberados (del aceite de soja que ha reaccionado) eran acido linolenico, 22,1% de los acidos grasos liberados eran acido linoleico; 19,7% de los acidos grasos liberados eran acido oleico; 41,5% de los acidos grasos liberados eran acido palmftico; 8,4% de los acidos grasos liberados eran acido estearico (estos cuatro numeros suman hasta 100%).
La columna P S suma los puntos de datos P y S para resumir cuanto del total de acidos grasos liberados eran acido palmftico y acido estearico (41,5% mas 8,4% = 49,9% de los acidos grasos hidrolizados eran acido palmftico y acido estearico, o "P S").
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La tabla 4 es un resumen, o una compilacion adicional, de los datos mostrados en la tabla 3 (antes). Por ejemplo, el termino "posicion" indicaba la posicion del resto de aminoacido en la SEQ ID NO: 2; el termino "Aminoacido original", como en la Tabla 3, indicaba el resto "parental" sin alterar, mientras que el termino "Nuevo aminoacido", como en la Tabla 3, indicaba el resto de aminoacido alterado (nuevo) en esa posicion. Los terminos "WT_P" y "WT_S" indican la preferencia del sustrato (liberacion de acidos grasos) de la enzima "parental", p. ej., SEQ ID NO: 2 para un sustrato particular (acido graso) indicando la cantidad de acido graso liberado (hidrolizado) del aceite de soja (como en la Tabla 3), donde "P" es acido palmftico, y "S" es acido estearico.
Las columnas de "palmitato" y "estearato" indican la cantidad de acido palmftico y acido estearico liberados (por hidrolisis enzimatica) del aceite de soja, que comprende acido linolenico, acido linoleico, acido oleico, acido palmftico, acido estearico, como se ha descrito antes. "P S" muestra las cantidades combinadas de acidos grasos hidrolizados que eran acido palmftico y acido estearico, o "P S". Los terminos "delta_P" y "delta_S" indican el cambio en la preferencia de una enzima de ejemplo como se proporciona en la presente memoria (p. ej., D61A de la primera fila) para hidrolizar acido palmftico y acido estearico, respectivamente, en comparacion con la actividad correspondiente de la SEQ ID NO: 2. El termino "delta P S" indica el cambio total o sumado en la preferencia de una enzima de ejemplo como se proporciona en la presente memoria (p. ej., D61A de la primera fila) para hidrolizar acido palmftico y acido estearico en comparacion con la actividad correspondiente de la SEQ ID NO: 2. La seccion "mutaciones del palmitato" resume las enzimas de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria que tienen una preferencia de actividad (hidrolisis de acidos grasos) para la liberacion de acido palmftico frente a otros acidos grasos. La seccion "mutaciones de estearato" resume la enzima de ejemplo como se proporciona en la presente memoria que tiene una preferencia de actividad para la liberacion de acido estearico frente a otros acidos grasos (del aceite de soja, ensayo descrito antes).
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Ejemplo 5: Evolucion de ejemplo de la hidrolisis mejorada de palmitato usando la tecnolog^a GeneReassemblySM
Se combinaron catorce (14) mutaciones de aminoacidos individuales identificadas a partir del cribado de GSSMsm que cubren siete (7) posiciones de aminoacidos mediante la tecnologfa de GeneReassemblySM (patente de EE.UU. Numero 6.605.449). Las secuencias de acido nucleico de longitud completa generadas a partir de la fase de GeneReassembly se clonaron en un vector de expresion pASK-5 (vease la descripción antes) para la expresion en el hospedante Escherichia coli HMS175 (Novagen, EE.UU.). La expresion de las variantes de GeneReassembly se indujo con anhidrotetraciclina despues de que se lograron las densidades de celulas hospedantes optimas.
Las 14 mutaciones que produdan los mayores aumentos en la hidrolisis del palmitato, identificadas en la Tabla 2, se seleccionaron para su inclusion en una biblioteca de GeneReassembly de palmitasa generada por los metodos descritos anteriormente. Los clones iniciales se cribaron para determinar la actividad en palmitato de umbeliferilo dando aproximadamente 145 clones de secuencia unica, en los que se analizo la actividad en aceite de soja, como se ha descrito anteriormente.
La Figura 8 muestra los datos del cribado primario y secundario para los analisis de aceite de soja en clones seleccionados de la biblioteca de palmitasa. Los clones que produdan palmitato en mas del 70% de los FA hidrolizados en el ensayo primario (bajo las condiciones de velocidad inicial estandar del metodo de ensayo) se seleccionaron para volver a analizar en aceite de soja. Para cada ensayo de aceite de soja, los FA extrafdos se diluyeron 50 veces y 100 veces para el analisis por LCMS o GC. Cuando se encontraron mutaciones adicionales no dirigidas, esto tambien esta indicado. Se presentan las relaciones de hidrolisis de FA detectadas y las cantidades de cada FA detectadas. En la figura, "alto" y "bajo" indican valores que estaban fuera del intervalo de la curva de calibracion. Las filas se clasifican en orden de porcentaje de palmitato liberado en el ensayo secundario y despues por al palmitato total liberado. Varios clones una selectividad (hasta 100%) de palmitato significativamente aumentada en comparacion con el progenitor SEQ ID NO: 2 (61,2%).
Los 25 primeros aciertos de palmitasa seleccionados basandose en el ensayo secundario descrito antes se subclonaron en sistemas de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050130160 y Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050186666). La secuencia de acido nucleico que codifica la enzima o polipeptido se inserto en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050130160) o en el vector pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20080058262) y despues se introdujo en el hospedante Pseudomonas fluorescens por electroporacion. Las celulas transformadas se seleccionaron por crecimiento en medio mmimo para las construcciones pDOW1169 o en medios ricos mas tetraciclina para las construcciones pMYC. La expresion de la enzima o polipeptido se indujo con IPTG despues de alcanzar densidades optimas de celulas hospedantes.
La Tabla 5 muestra datos de ensayos sobre aceite de soja, ejecutados por duplicado, de los 25 aciertos principales expresados en los sistemas de Seudomonas. Los 4 aciertos construidos en el vector pDOW1169 se dan en tipo negrita subrayado y el resto de los aciertos se construyeron en el vector pMYC. La enzima se anadio a 5 g de aceite bruto dando como resultado un contenido final de agua de 20%. La mezcla despues se homogeneizo con una sonda de 7 mm y se incubo durante 40 horas a 25°C con agitacion con barra agitadora. Se sacaron partes alfcuotas y se analizaron los FA por conversion de FA en FAME y la cuantificacion de FAME por GC como se describe en el Ejemplo 8. Las 25 enzimas se cargaron en los 5 g de aceite de soja basado en unidades de actividad de palmitato-UMB iguales. En estas reacciones el palmitato en el aceite se redujo significativamente de 11% en el aceite sin tratar a 5% o menos en aceites tratados con enzimas, indicando una mayor preferencia por la hidrolisis del palmitato comparado con la enzima parental de SEQ ID NO: 2.
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La tabla 6 a continuacion muestra los datos para la termoestabilidad de los 25 aciertos de palmitasa seleccionados basandose en el ensayo secundario descrito anteriormente. Estos datos se obtuvieron usando los aciertos expresados en el hospedante E. coli HMS174. Los clones se dispusieron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (T.a.), 45, 50 o 55°C, despues se analizo a T.a. el palmitato de MeUMB. El porcentaje de actividad residual se determina dividiendo la actividad despues de la incubacion a cada temperatura entre la actividad despues de la incubacion a T.a. Tambien se muestran para cada palmitasa las mutaciones presentes, y ejemplos de selectividad y actividad del palmitato en el aceite de soja. La SEQ ID NO: 2 retema aprox.
15% de actividad despues de incubacion durante 10 min a 50°C, pero no tuvo actividad despues de incubacion a 55°C.
Tabla 6
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Ejemplo 6: Protocolo de laboratorio para la evaluacion de las enzimas candidatas palmitasa, estearatasa o saturasa Las enzimas y polipeptidos de ejemplo como se proporcionan en la presente memoria se expresaron en el sistema de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc., Patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050130160). El acido nucleico que codifica la enzima o polipeptido se inserta en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc., Patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050130160) y despues se introdujo en el hospedante auxotrofico Pseudomonas fluorescens por electroporacion. Las celulas transformadas se seleccionaron por crecimiento en medio mmimo. La expresion de la enzima o polipeptido se indujo con IPTG despues de alcanzar las densidades optimas de celulas hospedantes.
El siguiente procedimiento se va a usar para evaluar la capacidad de una enzima u otro polipeptido como se proporciona en la presente memoria para hidrolizar una muestra de aceite. Se anade enzima palmitasa a 1 kg de aceite bruto dando como resultado un contenido final de agua del 20%. La mezcla despues se homogeneiza con un mezclador de helice y se incuba a temperatura ambiente con mezclamiento constante usando un mezclador de paletas. Se retiraron partes alfcuotas (0,5 ml) a las 0 h, 21 h, 43 h, 65 h y 72 h, y se trataron para la conversion FAME y el analisis de GC como se describe en el ejemplo 8.
El procedimiento anterior se uso con la SEQ ID NO: 2, la muestra de aceite era un aceite de soja bruto. Despues de 72 h, las muestras tanto de aceite no tratado como de aceite tratado con enzima dieron los resultados que se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
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Los resultados muestran una disminucion significativa en la cantidad de acido palmftico (C16:0), considerandose deseable dicha disminucion.
Ejemplo 7: Evaluacion de lipasas, saturasa o palmitasas con homologfa de secuencia con el polipeptido de ejemplo de SEQ ID NO: 2
Se subclonaron varias secuencias de lipasa homologas en el vector pMAL-c2x (New England Biolabs, EE.UU.) por el metodo de clonacion xi (Genlantis, EE.UU.). Las construcciones que contienen la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 se transformaron en el hospedante Escherichia coli de ArcticExpress RP (Stratagene, EE.UU.) para la expresion. La expresion de las lipasas esta bajo el control de un promotor que se induce con IPTG despues de alcanzar las densidades optimas de celulas hospedantes. Se ensayo la selectividad de FA de las enzimas recombinantes en aceite de soja (Tabla 8). Las lipasas que comprendfan la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 se expresaron y escindieron del marcador de fusion MBP usando condiciones estandar. Se inoculo una unica colonia en medio LB que contema 20 |ig/ml de gentamicina y se agito a 200 rpm durante la noche a 30°C. Este cultivo de una noche se inoculo en medio LB de nueva aportacion que contema 20 pg/ml de gentamicina hasta una lectura de DO600 de 0,05. Este cultivo se agito a 200 rpm y 30°C hasta que se obtuvo una lectura de DO600 de 0,5. Los cultivos se transfirieron a 12°C con agitacion a 200 rpm y se dejaron equilibrar a la temperatura mas baja antes de la induccion de la expresion de lipasa por adicion de IPTG 0,5 mM, seguido de un cultivo adicional durante 24 horas. Las celulas se recogieron por centrifugacion, se suspendieron en tampon de Tris a pH 8, que contema NaCl, CaCl2, DNasaI y lisozima, y despues se lisaron por ultrasonidos. Los lisados celulares se clarificaron por centrifugacion. Las enzimas se escindieron de MBP por incubacion de la fusion lipasa-MBP con FactorXa durante 6 horas a temperatura ambiente, seguido de otras 18 horas adicionales a 12°C. Los lisados clarificados con enzimas recombinantes activas, intactas, mostraban todos preferencias similares por la hidrolisis de palmitato frente a otros FA cuando se ensayaban en aceite de soja (tabla 8).
Tabla 8
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Ejemplo 8: Metodo para la conversion de acidos grasos libres o trigliceridos en esteres metilicos de acidos grasos (FAME) y cuantificacion de FAME mediante cromatograffa de gases.
Los acidos grasos liberados de los Ifpidos, trigliceridos, grasas o aceites por accion de las lipasas, p. ej., saturasas, palmitasas y/o estearatasas se pueden cuantificar directamente por LCMS usando el metodo descrito en el ejemplo 2. Alternativamente, estos acidos grasos hidrolizados se pueden convertir en esteres mefflicos de acidos grasos (FAME) usando metanolisis catalizada por acido, y despues cuantificar por cromatograffa de gases (GC). En este ejemplo:
- El aceite despues de la reaccion con lipasas, p. ej. saturasas, palmitasas y/o estearatasas se trata por adicion de 1 ml de disolvente de extraccion (CHCl3:MeOH:HCl 4 N (2:1:0,075)) por 0,5 ml de volumen de reaccion.
- Una parte alfcuota de 45 |jl de aceite extrafdo se transfiere a un vial con tapa de rosca de 4 ml. A cada vial se le anade una pequena barra agitadora, seguido de 2 ml de hexano y 400 j l de MeOH al 20% (v/v) en HCl.
- Los viales despues se sellan y se calientan con agitacion durante 15 minutos. Despues, los viales se retiran del calor y se dejan enfriar antes de anadir 800 j l de H2O.
- La mezcla se agita con vortice y se transfiere una muestra (500 jl) de la capa superior de hexano que contiene FAMES a un vial del inyector automatico para el GC. A cada muestra se anaden 500 j l de FAME C15:00,5 mg/ml como referencia interna.
El FAME sintetizado usando este metodo se analiza despues por cromatograffa de gases usando los siguientes parametros operativos:
- El equipo es un GC Hewlett Packard 6890 Series con inyector automatico.
- La columna usada es una columna capilar de sflice fundida SP-2380 de Supelco 30 m x 0,25 mm y espesor de pelfcula de 0,2 jm
- El inyector y el detector se fijan a 260°C; el flujo de gas portador helio se fija en 0,6 ml/min; el horno se ajusta a una temperatura inicial de 150°C.
- Las muestras (1 ml) se inyectan con una division de inyeccion 10:1. El metodo de GC usado tiene:
- Rampa 1: 4 C/min durante 10 min = 190°C
- Rampa 2: 15 C/min durante 4 min = 250°C
- Mantenimiento: 250°C durante 2 min
Los FA de trigliceridos tambien se puede analizar por conversion en FAME, incluso en presencia de acidos grasos hidrolizados. El uso del metodo anterior y el metodo siguiente en combinacion se pueden usar para determinar la selectividad por los acidos grasos de una lipasa, p. ej., saturasa, palmitasa y/o estearatasa, y el efecto de la enzima en el aceite. El metodo para el analisis de FA unidos a glicerol (u otros alcoholes) usa metanolisis catalizada por base:
- El aceite despues de la reaccion con lipasas, p. ej., saturasas, palmitasas y/o estearatasas se trata por adicion de 1 ml de disolvente de extraccion (CHCh MeOH:HCl 4 N (2:1:0,075)) por 0,5 ml de volumen de reaccion.
- Una parte alfcuota de 45 j l de aceite extrafdo se transfiere a un tubo de microcentfffuga. Se anaden 500 j l de heptano seguido de 50 j l de KOH metanolico 2 N.
- La mezcla se agita con vortice energicamente durante 30 segundos y despues se centrifuga.
- Una affcuota (50 jl) de la capa superior de heptano que contiene FAME se transfiere a un vial del inyector automatico y se combina con 450 j l de hexano que contiene la referencia interna C15:0.
- El analisis de FAME por GC es como se ha indicado antes.
Ejemplo 9: Evolucion de ejemplo para una mejor tolerancia termica de la palmitasa usando la tecnologfa GSSMsm La palmitasa de ejemplo de la invencion que inclrna las mutaciones D61E, R72K y V163R de la SEQ ID NO: 2 (enzima 17, tabla 5, anterior) se eligio como el mutante de selectividad candidato de las rondas de evolucion previas (ejemplos 4 y 5, antes). Se llevo a cabo una evolucion adicional para mejorar la tolerancia termica de la enzima selectiva candidata (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K y V163R) usando tecnologfa GSSM (vease, p. ej., patente de EE.UU. N° 6.171.820).
En resumen, la evolucion de GSSM se llevo a cabo introduciendo mutaciones puntuales usando oligonucleotidos degenerados, una posicion de aminoacido cada vez, de modo que cada codon original podffa sustituirse con cada uno de los 20 aminoacidos codificados de forma natural. La biblioteca se construyo en el vector pDOW-Kan, se analizo mediante gel de agarosa, se trato con DPNI y despues se transformo en celulas componentes de E. coli XL1Blue. Las colonias se cultivaron, seleccionaron y secuenciaron. Las colonias se agruparon y el ADN se preparo usando el kit Qiagen mini-prep (N° de catalogo 27106, Qiagen, Valencia, CA). Despues se transformaron celulas competentes de Pseudomonas fluorescentes con el ADN. El hospedante Pseudomonas fluorescens se obtuvo de Dow Global Technologies Inc. (patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050130160, patente de EE.UU. APP. N° 20050186666 y patente de EE.u U. PUB. APP. N° 20060110747). El vector pDOW-Kan se construyo por adicion de un marcador de resistencia a kanamicina a pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU., PUB. APP. N° 20080058262). Las celulas se cultivaron en medio mmimo M9 (Dow Global Technologies Inc., patente de EE.UU. PUB. APP. N° 20050186666) complementado con uracilo y kanamicina. Todos los ejemplos que siguen que describen el uso del vector pDOW-kan, Pseudomonas fluorescens y medios M9, se refieren al mismo vector pDOW-kan, Pseudomonas fluorescens y medios M9 descritos antes.
La biblioteca GSSM se selecciono en un formato de 384 pocillos. Los cribados de HTP primarios y secundarios se llevaron a cabo usando Palmitato-UMB (como se ha descrito antes en el Ejemplo 3). Con el fin de identificar las mutaciones que mantienen la actividad mientras la enzima esta a una temperatura elevada, el ensayo se realizo incubando el sustrato fluorogenico con el lisado celular completo a 54°C durante 30 minutos, precedido por una incubacion de 30 minutos del lisado celular completo con tampon durante 30 minutos a 54°C para asegurar que la enzima haya alcanzado 54°C antes de la carga del sustrato. Se midio la fluorescencia de cada mutante (vease la columna 2, Tabla 9) y se determino que cualquier mutante con una lectura de fluorescencia de mas de 2 desviaciones estandar por encima del control era un "acierto", es decir, un mutante con una tolerancia termica suficientemente aumentada. Se identificaron 117 aciertos con cambios unicos de aminoacidos a partir del cribado de palmitato-UMB (vease la Tabla 9, a continuacion). Los cambios de aminoacidos en los 117 aciertos de mutaciones individuales ocurrieron en 50 restos; 22% de la protema presentaba cambios de aminoacidos. Se evaluo ademas en los 117 el rendimiento en aceite bruto en ensayos estandar de 5 g (vease el ejemplo 5) a 25°C y 45°C. Los resultados se muestran en la Tabla 10, a continuacion.
Tabla 9:
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Tabla 10
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Un cambio de codon en un resto dado que no da como resultado un cambio de aminoacido se denomina una mutacion silenciosa. Las mutaciones silenciosas se obtienen como aciertos debido a la mayor expresion en relacion con la enzima original, y se observaron en 37 sitios en el cribado de GSSM (Tabla 11, a continuacion).
Tabla 11
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Ejemplo 10: Evolucion de ejemplo para una tolerancia termica mejorada de la palmitasa usando Tecnolog^a de TMCAsm
Las mutaciones de rendimiento superior identificadas durante la evolucion de GSSM (Ejemplo 9, anterior) se evaluaron en ensayos de aceites primarios y secundarios para su inclusion en la evolucion de t McA. Se llevaron a cabo ensayos de aceite bruto de 5 g, como se describe en el ejemplo 5, pero con un contenido de agua del 10%, con los 117 aciertos unicos a 25°C y 45°C. El perfil de aceite se evaluo despues de 24 y 48 horas de reaccion. Los aciertos primarios se sometieron a ensayos de aceite secundario a 25°C, 45°C y 55°C. Se retiraron partes alfcuotas a las 3, 24 y 48 horas para evaluar los perfiles de aceite. Los de rendimiento superior se dan en la Tabla 12 a continuacion, con el palmitato que queda en el aceite dado como un porcentaje del total de acidos grasos unidos. Para evaluar el impacto de un refinado caustico intermedio, los ensayos a 45°C se hicieron por refinado caustico por adicion de NaOH al 11% (calculado para 7% de FFA) y se calentaron con agitacion continua a 60°C. Se anadio enzima reciente al aceite refinado con un contenido de agua del 20%, se homogeneizo y la reaccion del aceite procedio con agitacion durante 24 horas adicionales a 45°C. El contenido final de palmitato en muestras causticas refinadas se muestra en la ultima columna, "CR 24H".
De los rendimientos superiores mostrados en la Tabla 12, se seleccionaron 15 mutantes (que se muestran en negrita y cursiva en la Tabla 12) para la combinacion usando tecnologfa TMCA. La biblioteca TMCA se construyo como se describe en el numero de publicacion PCT WO 2009/018449 y como se describe mas adelante. Esta biblioteca comprendfa 9216 variantes unicas.
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La tecnologfa de ensamblaje combinatorio multi-Sitio personalizada (TMCA), tecnolog^a TMCA (vease la publicacion PCT N° WO 09/018449), comprende un metodo para producir una pluralidad de polinucleotidos progenie que tienen diferentes combinaciones de varias mutaciones en multiples sitios. El metodo se puede llevar a cabo, en parte, mediante una combinacion de al menos una o mas de las siguientes etapas:
Obtencion de información de secuencia de un polinucleotido ("primera" o "molde"). Por ejemplo, la secuencia o la secuencia primera o molde puede ser de tipo natural (p. ej., SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K y V163R) o una secuencia mutada. La información de secuencia puede ser del polinucleotido completo (p. ej., un gen o un marco de lectura abierto) o de regiones parciales de interes, tal como una secuencia que codifica un sitio para la union, especificidad de union, catalisis o especificidad del sustrato.
Identificacion de tres o mas mutaciones de interes a lo largo de la secuencia de polinucleotido primera o molde. Por ejemplo, las mutaciones pueden estar en 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 o mas posiciones dentro de la secuencia primera o molde. Las posiciones se pueden predeterminar por posicion absoluta o por el contexto de restos u homologfa circundantes. Por ejemplo, para TMCA de polipeptidos de palmitasa, los cambios de aminoacidos termotolerantes superiores que daban como resultado un mejor rendimiento de la enzima se incluyeron como mutaciones de interes. Las secuencias que flanquean las posiciones de mutacion en ambos lados pueden ser conocidas. Cada posicion de mutacion puede contener dos o mas mutaciones, tal como para diferentes aminoacidos. Dichas mutaciones se pueden identificar mediante el uso de la tecnologfa de mutagenesis de saturacion del sitio del genSM (GSSMsm), como se describe en la presente memoria y, p. ej., en las patentes de EE.UU. 6.171.820; 6,562,594; y 6.764.835. Proporcionar cebadores (p. ej., oligonucleotidos sinteticos) que comprenden las mutaciones de interes. Se proporciona un cebador para cada mutacion de interes. Por lo tanto, un polinucleotido primero o molde que tiene 3 mutaciones de interes puede usar 3 cebadores en esa posicion. El cebador tambien se puede proporcionar como un conjunto de cebadores que contienen una posicion degenerada, de modo que la mutacion de interes es el intervalo de cualquier nucleotido o aminoacido natural, o un subconjunto de ese intervalo. Por ejemplo, se puede proporcionar un conjunto de cebadores que favorezcan mutaciones para los restos de aminoacidos alifaticos.
Los cebadores se pueden preparar como cebadores directos o inversos, o los cebadores se pueden preparar como al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso. Cuando las mutaciones estan situadas muy cerca entre sf, puede ser conveniente usar cebadores que contengan mutaciones para mas de una posicion o diferentes combinaciones de mutaciones en multiples posiciones.
Proporcionar un polinucleotido que contiene la secuencia molde. El polinucleotido primero o molde puede ser circular, o puede estar superenrollado, tal como un plasmido o vector para clonacion, secuenciacion o expresion. El polinucleotido puede ser monocatenario ("ADNmc"), o puede ser bicatenario ("ADNbc"). Por ejemplo, el metodo de TCMA somete el molde de ADNbc superenrollado ("sc") a una etapa de calentamiento a 95°C durante 1 min (vease Levy, Nucleic Acid Res., 28 (12): e57 (i-vii) (2000)).
Anadir los cebadores al polinucleotido molde en una mezcla de reaccion. Los cebadores y el polinucleotido molde se combinan en condiciones que permiten que los cebadores se reasocien con el polinucleotido molde. Por ejemplo, en el protocolo de TMCA, los cebadores se anaden al polinucleotido en una sola mezcla de reaccion, pero se pueden anadir en multiples reacciones.
Realizacion de una reaccion o de reacciones de extension de polimerasa. Los productos de extension (p. ej., como "progenie" o "polinucleotido extendido modificado") se pueden amplificar por medios convencionales. Se pueden analizar en los productos la longitud, secuencia, propiedades del acido nucleico deseadas, o expresar como polipeptidos. Otros metodos de analisis incluyen la hibridacion in situ, cribado de secuencias o cribado de expresion. El analisis puede incluir una o mas rondas de cribado y seleccion de una propiedad deseada.
Los productos tambien se pueden transformar en una celula u otro sistema de expresion, tal como un sistema sin celulas. El sistema sin celulas puede contener enzimas relacionadas con la replicacion, reparacion, recombinacion, transcripcion o traduccion del ADN. Los hospedantes de ejemplo incluyen celulas y lmeas celulares de bacterias, levaduras, plantas y animales, e incluyen E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pichia pastoris y Aspergillus niger. Por ejemplo, las cepas XL1-Blue o Stb12 de E. coli se pueden usar como hospedantes.
El metodo de la invencion se puede usar con los mismos o diferentes cebadores en diferentes condiciones de reaccion para promover productos que tienen diferentes combinaciones o numeros de mutaciones.
Al llevar a cabo el metodo de ejemplo descrito antes, este protocolo tambien proporciona uno o mas polinucleotidos producidos por este metodo de evolucion de TMCA, que despues se pueden cribar o seleccionar segú unna propiedad deseada. Uno o mas de los polinucleotidos progenie se pueden expresar como polipeptidos, y opcionalmente cribar o seleccionar según una propiedad deseada. Por lo tanto, el protocolo de evolucion de TMCA puede proporcionar polinucleotidos y los polipeptidos codificados, asf como bibliotecas de dichos polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. Esta realización del protocolo de evolucion de TMCA proporciona ademas el cribado de bibliotecas mediante cribado o seleccion de la biblioteca para obtener uno o mas polinucleotidos que codifican uno o mas polipeptidos que tienen la actividad deseada.
El protocolo de evolucion de TMCA descrito en la publicacion PCT N°WO 2009/018449 comprende un metodo para producir una pluralidad de polinucleotidos modificados. Dichos metodos en general incluyen (a) anadir al menos tres cebadores a un polinucleotido molde bicatenario en una sola mezcla de reaccion, en donde los al menos tres cebadores no se superponen, y en donde cada uno de los al menos tres cebadores comprende al menos una mutacion diferente de los otros cebadores, en donde al menos un cebador es un cebador directo que se puede reasociar con una cadena negativa del molde y al menos un cebador es un cebador inverso que se puede reasociar con una cadena positiva del molde, y (b) someter la mezcla reaccion a una reaccion de extension de polimerasa para dar una pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos a partir de al menos tres cebadores.
El protocolo de evolucion TMCA descrito en la publicacion PCT n° WO 2009/018449 comprende un metodo en el que una celula se transforma con la pluralidad de productos extendidos que no se han tratado con una ligasa. La pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos se puede recuperar de la celula. La pluralidad recuperada de polinucleotidos modificados extendidos se puede analizar, por ejemplo, expresando al menos uno de la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos y analizando el polipeptido expresado a partir de los mismos. Se selecciona la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos que comprenden las mutaciones de interes.
En el protocolo de evolucion de TMCA, se puede obtener información de secuencia con respecto al polinucleotido molde, y se pueden identificar tres o mas mutaciones de interes a lo largo del polinucleotido molde. Los productos obtenidos por la extension de la polimerasa se pueden analizar antes de transformar la pluralidad de productos modificados extendidos en una celula.
En el protocolo de evolucion de TMCA, los productos obtenidos por la extension de la polimerasa se tratan con una enzima, p. ej., una enzima de restriccion, tal como una enzima de restriccion Dpnl, destruyendo asf la secuencia del polinucleotido molde. Los productos tratados se pueden transformar en una celula, p. ej., una celula de E. coli.
En el protocolo de evolucion de TMCA, se pueden usar al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro, o al menos cinco, o al menos seis, o al menos siete, o al menos ocho, o al menos nueve, o al menos diez, o al menos once, o al menos doce o mas cebadores. Cada cebador comprende una sola mutacion puntual. Dos cebadores directos o dos inversos comprenden un cambio diferente en la misma posicion en el polinucleotido molde. Al menos un cebador comprende al menos dos cambios en diferentes posiciones en el polinucleotido molde. Al menos un cebador comprende al menos dos cambios en diferentes posiciones y al menos dos cebadores directos o dos inversos comprenden un cambio diferente en la misma posicion en el polinucleotido molde.
En el protocolo de evolucion de TMCA, los cebadores directos se pueden agrupar en un grupo directo y los cebadores inversos se pueden agrupar en un grupo inverso, y los cebadores en el grupo directo y los cebadores en el grupo inverso, independientes entre sf, se normalizan para que sean de la misma concentracion en el grupo correspondiente independientemente de las posiciones en el polinucleotido molde, y en donde despues de la normalizacion se anade una cantidad igual de los cebadores directo e inverso a la reaccion. En este metodo de normalizacion, una combinacion de algunas posiciones puede estar sesgada. El sesgo puede deberse, p. ej., a una concentracion de cebador relativamente baja en una posicion que contiene un solo cebador en comparacion con una posicion que contiene multiples cebadores. "Sesgo posicional" se refiere a los polinucleotidos resultantes que muestran una fuerte preferencia por la incorporacion de cebadores en una sola posicion con respecto a las otras posiciones dentro de su grupo de cebadores directo o inverso. Esto da como resultado una combinacion de polinucleotidos modificados que pueden tener un alto porcentaje de mutaciones dentro de una sola posicion del cebador, pero un bajo porcentaje de mutaciones en otra posicion dentro de su grupo de cebadores directo o inverso. Este sesgo es desfavorable cuando el objetivo de la TMCA es generar polinucleotidos progenie que comprenden todas las combinaciones posibles de cambios en el molde. El sesgo se puede corregir, por ejemplo, normalizando los cebadores como un grupo en cada posicion para que sean iguales.
En el protocolo de evolucion de TMCA, la normalizacion del cebador se puede realizar organizando los cebadores en multiples grupos dependiendo de su ubicacion en el polinucleotido molde, en donde los cebadores que cubren la misma region seleccionada en el molde estan en un grupo; normalizar los cebadores agrupados dentro de cada grupo para que tengan la misma concentracion; agrupando los cebadores directos dentro de un grupo en un grupo directo y normalizando la concentracion entre cada grupo de los cebadores directos para que sean iguales; agrupando los cebadores inversos dentro de un grupo en un grupo inverso y normalizando la concentracion entre cada grupo de los cebadores inversos para que sean iguales; y anadiendo una cantidad igual de los cebadores directos e inversos agrupados en la reaccion. No se ha observado ningun sesgo para las combinaciones de posicion.
En el protocolo de evolucion de TMCA, se puede proporcionar un conjunto de cebadores degenerados que comprenden cada uno una posicion degenerada, en donde la mutacion de interes es un intervalo de diferentes nucleotidos en la posicion degenerada. Se puede proporcionar un conjunto de cebadores degenerados que comprenden al menos un codon degenerado que corresponde a al menos un codon del polinucleotido molde y al menos una secuencia adyacente que es homologa con una secuencia adyacente al codon de la secuencia de polinucleotido molde. El codon degenerado puede ser N,N,N y codifica cualquiera de los 20 aminoacidos naturales. El codon degenerado puede codificar menos de 20 aminoacidos naturales.
El protocolo de evolucion de TMCA descrito en la publicacion PCT N°WO 2009/018449 comprende un metodo para producir una pluralidad de polinucleotidos modificados que comprenden las mutaciones de interes. Dichos metodos en general incluyen (a) anadir al menos dos cebadores a un polinucleotido molde bicatenario en una sola mezcla de reaccion, en donde los al menos dos cebadores no se superponen, y en donde cada uno de los al menos dos cebadores comprende al menos una mutacion diferente del(los) otro(s) cebador(es), en donde al menos un cebador es un cebador directo que se puede reasociar con una hebra negativa del molde y al menos un cebador es un cebador inverso que se puede reasociar con una hebra positiva del molde, (b) someter la mezcla de reaccion a una reaccion de extension de polimerasa para dar una pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos a partir de al menos dos cebadores, (c) tratar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos con una enzima, destruyendo asf el polinucleotido molde, (d) transformar los polinucleotidos modificados extendidos tratados que no se han tratado con una ligada en una celula, (e) recuperar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos de la celula y (f) seleccionar la pluralidad de polinucleoticos modificados extendidos que comprenden las mutaciones de interes.
En este ejemplo, las 15 mutaciones seleccionadas para su inclusion en la biblioteca TMCA con tolerancia termica se muestran en la Tabla 13, a continuacion. Se usaron seis moldes de ADN: SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K y V163R (parental), parental con mutacion E95K, parental con mutacion P162G, parental con mutacion P162K, parental con mutacion E95K y P162G y parental con mutaciones E95K y P162k . Los plasmidos del progenitor con mutacion E95K, progenitor con mutacion P162G, progenitor con mutacion P162K se pasaron a traves de celulas competentes de E. Coli XL1Blue para metilar el ADN. Se realizaron seis evoluciones de TMCA separadas, una para cada uno de los seis moldes en combinacion con los oligonucleotidos dados en la Tabla 14 a continuacion.
Tabla 13:
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Los miembros de la biblioteca se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en celulas competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y secuenciaron. Los resultados de la secuencia indicaban que la mutacion E116L y las mutaciones en los aminoacidos 144, 149 y 150 estaban subrepresentadas en comparacion con el maximo teorico. Por lo tanto, se creo otra biblioteca TMCA usando una mezcla normalizada de los seis moldes. Las reacciones de TMCA se repitieron usando todos los oligonucleotidos citados en la Tabla 14, excepto los de las mutaciones E116I y E116N. La cantidad de cebadores usados para la mutacion E116L y para la region 4 (aminoacidos 144, 149 y 150) se duplico. Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron con gel de agarosa y se trataron con DPNI. La muestra de ADN se transformo en celulas competentes de E. coliXL1Blue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y secuenciaron. La incorporacion de mutaciones en los aminoacidos 144, 149 y 150 mejoro, pero la E116L todavfa estaba subrepresentada en comparacion con el maximo teorico. El ADN de ambas bibliotecas se transformo en celulas competentes de E. coli XL1Blue. Las colonias se agruparon y el ADN se preparo usando el kit Mini-prep de Qiagen. El ADN se uso despues para transformar celulas competentes de Pseudomonas fluorescentes. Las celulas se cultivaron en medio LB complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml). Se obtuvo un numero suficiente de colonias para sobredimensionar la biblioteca en 10 veces. La biblioteca se sobredimensiono por diez para tener en cuenta la subrepresentacion de E116L.
La biblioteca de TMCA termotolerante resultante se cultivo en medio mmimo M9 complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml) y se cribo usando el cribado de HTP descrito en el Ejemplo 3, anterior. La biblioteca se incubo a 60°C durante 30 minutos antes y despues de la adicion de palmitato-UMB. Despues las placas de 384 pocillos se leyeron con excitacion a 365 nm y emision a 460 nm. Cada placa se enfrio rapidamente mediante centrifugacion y el espectrofotometro se precalento para minimizar los artefactos en las lecturas. Se muestran los valores de fluorescencia en cada placa de 384 pocillos. Los aciertos se identificaron como aquellos que teman >2 desviaciones estandar por encima del control positivo (mutacion unica E116L). Un cribado secundario de HTP analizaba los aciertos de HTP primario a dos temperaturas 60°C y 63°C. Los aciertos secundarios se definieron como >4 desviaciones estandar por encima del control positivo promedio en la placa de 63°C y retencion de >50% de la actividad entre 60°C y 63°C.
Se identificaron 318 aciertos de HTP secundario de secuencia unica. Estos aciertos contienen entre 2 y 9 mutaciones. Los ensayos estandar de aceite bruto de 5 g (como se describe en el Ejemplo 5) se llevaron a cabo con lisados clarificados de los 318 aciertos. De los 318 aciertos del HTP secundario, los que redudan el palmitato mas eficazmente a las temperaturas elevadas (45°C o 60°C) que a 25°C en el ensayo de aceite, se eligieron como "aciertos de aceite" de tolerancia termica. Se identificaron 57 aciertos de aceite de tolerancia termica primarios y se identificaron mediante ensayos de aceite adicionales (vease las Tablas 15 y 16, a continuacion). Se realizaron ensayos de aceite adicionales de 5 g y se identificaron 9 aciertos de aceite que teman perfiles de rendimiento de temperatura preferidos ademas de niveles de actividad totales variables (vease la Tabla 17, a continuacion).
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Ejemplo 11: Evolucion de ejemplo para la expresion mejorada de Palmitasa usando la tecnolog^a TMCAsm
Se evaluo la expresion de las 37 mutaciones silenciosas individuales identificadas durante el cribado GSSM (vease la Tabla 11, Ejemplo 9, mas arriba) (vease la Tabla 18, a continuacion). Cultivos de 50 ml se expresaron en medios M9, complementados con uracilo y kanamicina, en matraces de 250 ml. Los aciertos se cultivaron a 30°C durante 16 a 20 horas antes y despues de la induccion con IPTG 0,3 mM. Las celulas se sedimentaron por centrifugacion y se lisaron con B-PER™ (numero de catalogo 78248, Pierce Protein Research Products, Rockford, IL). Una porcion del lisado completo se centrifugo para clarificar. Tanto en el lisado celular completo como en los lisados clarificados se analizo la concentracion de protema total usando el ensayo de protemas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, n° de catalogo 500-0006) basado en el metodo de Bradford y la actividad en el sustrato fluorogenico palmitato-UMB, y por SDS-PAGE. Los valores se normalizaron con el valor parental establecido en 100%. Se identificaron 16 aciertos al demostrar una mayor actividad frente a la parental).
Tabla 18:
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Las 11 mutaciones silenciosas individuales superiores (Tabla 19, a continuacion) se combinaron usando la tecnologfa TMCA, como se describe en el numero de publicacion PCT WO 2009/018449 y se describen mas adelante a continuacion).
Tabla 19:
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Para la evolucion de TMCA, se usaron cuatro moldes de ADN: (1) palmitasa "Parental A" (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K y V163R), (2) Palmitasa "Parental B" (Parental A con mutaciones adicionales (GGC)45(GGA) y (CTG)117(CTT)), (3) Palmitasa "Parental C" (Parental A con mutacion adicional (GGC)45(GGA)), y (4) "Parental D" (Parental A con mutacion adicional (CTG)117(CTT)). Nota: Las mutaciones se citan proporcionando el codon original, seguido del numero de posicion del aminoacido modificado, seguido del nuevo codon. Por ejemplo, (GGC)45(GGA) indica que el codon para el aminoacido en la posicion 45 de la SEQ ID NO: 2 se ha cambiado de (GGC) a (GGA).
Se completo una primera ronda de reacciones de TMCA con cada una de las cuatro moldes de ADN y los cebadores para las regiones 1 y 4 (consulte la Tabla 20 a continuacion; region 1: aminoacido 35; region 4: aminoacidos 183 y 188), creando asf cuatro sub-bibliotecas. Los productos de la sub-biblioteca se purificaron usando el kit de limpieza Qiagen PCR. Cada sub-biblioteca, que contiene una mezcla de productos purificados y, por lo tanto, que contiene multiples moldes, se uso despues en una segunda reaccion de TMCA individual por sub-biblioteca con cebadores para las regiones 2 y 3 (vease la Tabla 21 a continuacion; region 2: aminoacidos 102 y 108; region 3: aminoacidos 124, 126, 128 y 133).
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Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa, se trataron con DPNI y despues se transformaron en celulas competentes de E. coli XLlBlue. Las colonias se cultivaron, seleccionaron y secuenciaron. Las colonias se agruparon y se preparo el ADN para cada sub-biblioteca usando el kit de Qiagen mini­ prep (Catalogo n° 27106, Qiagen, Valencia, CA). Las celulas competentes de Pseudomonas fluorescens se transformaron despues con el ADN. Las celulas se cultivaron en medio LB complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml). Se obtuvo un numero suficiente de colonias para un sobremuestreo de la biblioteca de 7 veces (al menos 14.000 colonias).
La biblioteca se dispuso en matriz, se cultivo en medio mmimo M9 complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml) y se ensayo con palmitato de 4-metilumbeliferilo 400 pM en HEPES 80 mM a pH 7,5. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 54°C antes y despues de la adicion del sustrato. La fluorescencia se leyo en Ex360nm y Em465nm. 46 muestras de mutaciones silenciosas dieron secuencias unicas (vease la Tabla 22, a continuacion). La lectura de fluorescencia para cada una de las 46 muestras de mutaciones silenciosas tambien se da en la Tabla 22, primera columna "Actividad de UMB". Las muestras de mutacion silenciosa 2, 7, 9, 10, 13, 16, 23, 25, 40 y 44 teman cambios de aminoacidos (AA) ademas de las mutaciones silenciosas (vease la Tabla 23, a continuacion).
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Tabla 23
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Las 46 muestras de mutaciones silenciosas unicas se cultivaron en matraces de agitacion de 250 ml. Los lisados clarificados se cuantificaron usando el ensayo de protemas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, n° de catalogo 500­ 0006) basado en el metodo de Bradford y despues se normalizaron respecto a la expresion total de protemas. La expresion se analizo por SDS-PAGE.
El parental (SEQ ID NO: 2 con las mutaciones D61E, R72K y V163R), el control negativo y los 4 aciertos de mutaciones silenciosas superiores se expresaron en una escala de 1 litro. Cada muestra se liso mediante un microfluidizador o en presencia del detergente BPER. La concentracion de protema se cuantifico para los lisados brutos y clarificados usando el ensayo de protemas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, n° de catalogo 500-0006) basado en el metodo de Bradford. Cada banda del gel de SDS-PAGE se cargo entonces con protema total equivalente. Se observaron niveles de palmitasa similares en todas las condiciones de solubilidad y lisis ensayadas. Los aciertos de mutaciones silenciosas 26, 34, 35 y 37 (Tablas 22 y 23, anteriores) presentaban un mayor porcentaje de expresion de la palmitasa, en comparacion con el parental (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61e , R72K y V163R). El acierto de mutacion silenciosa 35 tema el porcentaje mas alto de expresion de palmitasa. El acierto de mutacion silenciosa 35 tema las siguientes mutaciones silenciosas en comparacion con el parental: (GCG)35(GCT), (GTG)102(GTT), (AGC)108(AGT), (CTG)117(CTT), (CGG)126(AGG), (AGT)133(TCT), y (ACC)188(ACG).
Ejemplo 12: Evolucion de ejemplo para la expresion mejorada de palmitasas termotolerantes
Para evaluar la expresion de los 9 candidatos a palmitasas termotolerantes principales (ejemplo 10, Tablas 15, 16 y 17), se incorporaron las 7 mutaciones silenciosas superiores (ejemplo 11) en cada candidato termotolerante como se describe a continuacion. El resultado fue que cada candidato termotolerante (aciertos de termotolerancia 29, 40, 41, 74, 81, 202, 204, 238 y 244) habfa incorporado las siguientes mutaciones silenciosas (35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, 188ACG) en cada uno. Con las mutaciones silenciosas incorporadas, se cambio el nombre de cada candidato termotolerante anadiendo "SM" al final del numero de acierto de termotolerancia. Por ejemplo, el acierto de termotolerancia 29 con las mutaciones silenciosas incorporadas se renombrada como "29 SM". Del mismo modo, el acierto 40 se convirtio en "40 SM", el acierto 41 se convirtio en "41 SM", el acierto 74 se convirtio en "74 SM", el acierto 81 se convirtio en "81 SM", el acierto 202 se convirtio en "202 SM", el acierto 204 se convirtio en "204 SM", el acierto 238 se convirtio en "238 SM" y el acierto 244 se convirtio en "244 SM".
Con el fin de incorporar las 7 mutaciones silenciosas superiores en los 9 candidatos termotolerantes, se uso la tecnologfa TMCA como se describe en el numero de publicacion PCT WO 2009/018449 y se describe con mas detalle mas adelante.
Para la primera ronda de evolucion de TMCA, los 9 candidatos termotolerantes y el candidato de acierto de expresion (acierto de mutacion silenciosa n° 35) se pasaron por celulas competentes E. Coli XL1Blue con el fin de metilar el ADN. El acierto de mutacion silenciosa n° 35 se uso como molde de ADN. Los oligonucleotidos citados en la Tabla 24 a continuacion se usaron para incorporar combinaciones de mutaciones en el molde de ADN.
Tabla 24:
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Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en celulas competentes E. coli XLIBlue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y secuenciaron. La secuenciacion identifico varias combinaciones de mutaciones. Sin embargo, algunas combinaciones estaban subrepresentadas. Por lo tanto, algunas de las nuevas construcciones de la primera ronda de evolucion de TMCA se seleccionaron para usar como moldes para la siguiente ronda de evolucion de TMCA. Los moldes usados se dan en la Tabla 25 a continuacion.
Tabla 25:
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Las combinaciones de moldes y oligonucleotidos usadas en la segunda ronda de evolucion de TMCA se dan en la Tabla 26 a continuacion. Se realizo una reaccion de TMCA separada para cada fila en la Tabla 26, creando una biblioteca individual para cada fila. Por ejemplo, una ejecucion consistfa en el molde F8 y los cebadores 2For y 7 Rev. Una segunda ejecucion consistfa en el molde F8 y los cebadores 2For y 6 Rev. Nota, se usaron varios de los mismos cebadores que en la primera ronda. Se solicitaron dos cebadores adicionales para la segunda ronda de PCR. Estos oligonucleotidos se nombraron 116LF y 162F. El oligonucleotido 116LF tiene la secuencia inversa y complementaria del oligonucleotido 4-Alt2-RevJC. El oligonucleotido 162F tiene la secuencia inversa y complementaria de 5-RevJC.
Tabla 26:
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Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en celulas competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y secuenciaron. La secuenciacion identifico una representacion suficientemente alta de 7 de las 9 construcciones deseadas. Sin embargo, como las otras dos construcciones estaban subrepresentadas, se requirio una ronda adicional de evolucion de TMCA para obtener los candidatos termotolerantes restantes en combinacion con las siete mutaciones silenciosas. Se usaron dos nuevas construcciones como moldes para la tercera ronda de la evolucion de TMCA. Estos moldes se dan en la Tabla 27 a continuacion. Las combinaciones de moldes y oligonucleotidos usados en la tercera ronda se dan en la Tabla 28 a continuacion. Se realizo una reaccion TMCA separada para cada fila en la Tabla 28, creando una biblioteca individual para cada fila. Por ejemplo, una ejecucion consistfa en el molde F3 y los cebadores 162F y 7 Rev. La segunda ejecucion consistfa en el molde B5 y los cebadores 162F y 6 Rev.
Tabla 27:
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Tabla 28:
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Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en celulas competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y secuenciaron. Se obtuvo una representacion suficiente de las dos construcciones restantes. El ADN para todas las construcciones de E. coli XLlBlue deseadas se preparo y transformo en celulas competentes de Pseudomonas fluorescens. Las celulas se cultivaron en medio lB complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml). Las muestras se confirmaron por secuenciacion.
Para el cribado, la biblioteca se cultivo en medio mmimo M9 complementado con uracilo (750 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml). Se llevaron a cabo ensayos de aceite estandar cargando lisados clarificados con un contenido de agua de 10% usando tampon de fosfato en los ensayos de aceite bruto con los niveles de actividad de palmitato-UMB dados en la columna izquierda de la Tabla 29. Los ensayos de aceite se cargaron, homogeneizaron y posteriormente se mezclaron continuamente como para las reacciones estandar, a 25°C, 45°C y 60°C. Se anadieron partes alfcuotas de 50 pl de NaOH al 11% a las 3 y 20 horas para cada reaccion de aceite y despues se homogeneizaron. Se sacaron partes alfcuotas a las 20, 44 y 68 horas y se sometieron a la extraccion con metanol cloroformo estandar y metanolisis total, seguido de un analisis por GC de FAME (como se describe en el ejemplo 8, mas arriba). Se da el palmitato que queda en el aceite para cada parte alfcuota en la Tabla 29. El acierto de mutacion silenciosa termotolerante 29 SM reducfa notablemente el palmitato a lo largo del tiempo a 25°C (Tabla 29).
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Ejemplo 13: La sal de potasio del acido oleico como emulsionante permite que la enzima genere 1% de aceite de palmitato
Se incubaron muestras de aceite con oleato de potasio al 10% para evaluar el impacto de este emulsionante en las reacciones del aceite con la palmitasa. Los lisados clarificados del acierto 29SM o el control negativo se cargaron con contenido de agua de 5% en ensayos de aceite pretratado (A y B) y aceite crudo (C). El tratamiento previo se llevo a cabo mediante tratamiento con enzimas, calentamiento, centrifugacion y despues filtracion del aceite para separar la goma y la fase acuosa y para reducir los acidos grasos libres, como se describe en el Ejemplo 14, para generar un aceite de palmitato exento de goma <5%. El aceite se homogeneizo antes y despues de la adicion de enzimas para asegurar emulsiones uniformes. Se pesaron 0,5 g de sal potasica del acido oleico obtenida comercialmente en 5 g de aceite, se mezclo a 60°C para solubilizar y despues se homogeneizo. La adicion sosa caustica para la neutralizacion de 1% de FFA se anadio a las reacciones citadas como "caustico". Los ensayos de aceite se cargaron con enzimas, se volvieron a homogeneizar y posteriormente se mezclaron continuamente como en las reacciones estandar. Se retiraron partes alfcuotas a las 3, 24, 48, 72 y 120 horas. Las partes alfcuotas se sometieron a extraccion con cloroformo metanol y metanolisis total, seguido de un analisis por GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, mas arriba). Se da el palmitato que queda en el aceite para cada parte alfcuota en la Tabla 30 a continuacion. Los aceites pretratados se llevaron con exito a un nivel de palmitato de 1%.
Tabla 30:
Figure imgf000177_0001
Ejemplo 14: 2 kg de aceite con centrifugacion intermedia y emulsion de oleato logra 1% de aceite de palmitato El impacto combinado del polipeptido, una etapa de filtracion intermedia y la adicion de oleato de potasio para alcanzar 1% de aceite de palmitato se evaluo a escala de laboratorio. Se hicieron reaccionar 2 kg de aceite bruto con 29 SM con contenido de agua de 5%. La reaccion de aceite se homogeneizo durante 1 minuto con una IKA a velocidad 6 alcanzando una temperatura de 25°C. Una mezcladora de helice se equipo con una paleta mezcladora de pintura y se mezclo la reaccion de aceite a 390 rpm. Despues de 1 hora de reaccion, la velocidad de mezclamiento se acelero a 530 rpm. La temperatura de la reaccion se controlo y fluctuo de 21°C a 29°C con calentamiento intermitente de un bloque de calor. Se sacaron muestras para seguir los cambios en el perfil de aceite. Despues de 28 horas, la reaccion del aceite se calento a 66°C y se centrifugo en un GyroTester. La fraccion de aceite se enfrio a temperatura ambiente durante la noche con mezclamiento con paletas y despues se enfrio con un bano de hielo a menos de 10°C. Se anadio tierra de diatomeas y los TAGS y DAGS se separaron de los acidos grasos libres por filtracion a traves de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman.
Se uso 1 kg de este aceite de palmitato reducido para iniciar reacciones con oleato de potasio como emulsionante. Se anadieron 100 g de oleato de potasio al aceite. Las reacciones se calentaron a 60°C con agitacion para asegurar la solubilidad. El aceite se enfrio a 23°C y despues se anadieron 50 ml de enzima para lograr un contenido de agua de 5%. Este aceite se homogeneizo antes y despues de la adicion de la enzima 29 SM para asegurar emulsiones uniformes. Se sacaron partes alfcuotas a las 6, 21, 24, 28, despues de filtracion, despues de adicion de oleato, al inicio del nuevo ensayo y 3, 20 y 22 horas en el segundo ensayo. Las partes alfcuotas se sometieron a extraccion con cloroformo metanol estandar y metanolisis total, seguido de un analisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, mas arriba). Se dan los acidos grasos que quedan unidos en el aceite para cada parte alfcuota en la Tabla 31, a continuacion. El acierto 29 SM era capaz de llevar los niveles de palmitato a 1% en el aceite.
Tabla 31:
Figure imgf000177_0002
Figure imgf000178_0001
Ejemplo 15: La doble centrifugacion y filtracion produce aceite con nivel bajo de palmitato
La capacidad para separar el oleato de potasio despues de las reacciones de aceite se demostro a continuacion. Se hicieron reaccionar 2 kg de aceite bruto con 29 SM con contenido de agua de 5%. La reaccion de aceite se homogeneizo durante 1 minuto con una IKA a velocidad 6 alcanzando una temperature de 25°C. Una mezcladora de helice se equipo con una paleta mezcladora de pintura y se mezclo la reaccion de aceite a 390 rpm. Despues de 1 hora de reaccion, la velocidad de mezclamiento se acelero a 530 rpm. La temperature de reaccion se controlo y fluctuo de 21°C a 29°C con calentamiento intermitente de un bloque de calor. Se sacaron muestras para seguir los cambios en el perfil de aceite. Despues de 28 horas, la reaccion del aceite se calento a 80°C y se centrifugo en un GyroTester. La fraccion de aceite se enfrio a temperatura ambiente durante la noche con mezclamiento con paletas y despues se enfrio con un bano de hielo a menos de 10°C. Se anadio tierra de diatomeas y los TAGS y DAGS se separaron de los acidos grasos libres por filtracion a traves de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman. Se uso 1 kg de este aceite tratado para iniciar reacciones con oleato de potasio como emulsionante. Se anadieron 50 g de oleato de potasio para alcanzar 5%. Esto se mezclo y homogeneizo. Se cargaron 50 ml de enzima para alcanzar un contenido de agua de 5% y se homogeneizo durante 1 minuto al 6 en la IKA, alcanzando 26,6°C. Esta reaccion de aceite se mezclo con una paleta mezcladora de pintura equipada en una mezcladora de helice a 400 rpm. Se utilizo calentamiento intermitente por bloque de calor. Se sacaron partes alfcuotas a las 3, 20, 24 y a las 8, 28 y 48 horas despues del inicio del segundo ensayo. Las partes alfcuotas se sometieron a extraccion con cloroformo metanol estandar y metanolisis total, seguido de un analisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, mas arriba). Se dan los acidos grasos que quedan unidos en el aceite para cada parte alfcuota en la Tabla 32, a continuacion. 29 SM llevo los niveles de palmitato a 1,5%. Este aceite se calento a 85°C y se centrifugo eliminando los restos de protemas. La fraccion de aceite se enfrio a 6°C con mezclamiento con paletas, se anadio tierra de diatomeas y el material se separo sobre un embudo Buchner. La filtracion se continuo a 25°C.
Tabla 32:
Figure imgf000178_0002
Ejemplo 16: Optimizacion de codones
Las versiones de codones optimizados para la expresion en Pseudomonas fluorescens de la mutacion silenciosa termotolerante candidata 29 SM (Ejemplo 12) se disenaron por dos metodos diferentes. La primera version de codones optimizados reemplazo todos los codones en el acierto 29SM por los preferidos por Pseudomonas fluorescens, incluyendo las 7 mejores mutaciones silenciosas incorporadas (Ejemplo 12). Esta version se denomino 29SM-Pf (SEQ ID NO: 22). El uso preferido de codones para Pseudomonas fluorescens se determino por la revision de la Base de Datos de Uso de Codones disponible en lrnea en el sitio web del Instituto de Investigacion de ADN Kazusa (2-6-7 Kazusa-kamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818 JAPON, obtenido en 2009 de Internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html>). En particular, se usaron los patrones de uso de codones para Pseudomonas fluorescens PfO-1 (recuperados en 2009 de Internet <URL:http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=205922>) y Pseudomonas fluorescens Pf-5 (recuperado en 2009 de Internet <URL: http://www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=220664>) en el diseno de la secuencia de codones optimizados, SEQ ID NO:22.
La segunda version de codones optimizados tambien reemplazo todos los codones en el acierto 29SM por los preferidos por Pseudomonas fluorescens, excepto que mantuvo las 7 mutaciones silenciosas candidatas (Ejemplo 11). Esta version se denomino 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23). 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23) es el candidato superior frente a 29SM-Pf (SEQ ID NO: 22).
SEQ ID NO:22:
A TGCTCAA GCCCCCA CCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAA CTGGCTGA TA TCCC GGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCA GA TGGCGAGCCGGTA CTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGA CGA CAA CGCGA
CCA GCGTGCTGCGGAA GA CCTTCGA GGTCGCCGGCTTTGCGTGCA GCGGCTG GGAAAA GGGCTTCAA CCTCGGCA TTCGTG GCGA CCTCA TGGACTACCTGGTCG ACCGCCTGCGCGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTAATCGTGG TCGGCTGGTCCCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGTTGGGCCACAAGGCCCC CGAACTGATCCGTATGGTCGTCACGCTCGGCTCCCCGTTCGCCGGCGACCTCC A CGCGA A CCA TGCCTGGAAGA TCTA CGA GGCCA TCAACTCCCA CA CGGTCGA C A A CCTGCCGA TCCCGCGCGA TTTCCA GA TTAA GCCGCCGGTGCA TA CCA TCGC CGTGTGGA GCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGA GACGAGCGAA GGCA G CCCCGA GCA GA GCGA CGA GCGCTTGGA GC1GGCCGTGA CCCA CA 7 GGGCT17 GCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA
SEQ ID NO:23:
A TGCTCAA GCCCCCACCTTA CGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGA TA TCCC GGCGA TCGTGA CTGCTCCGTTCCGCGGCGCA GCCAAAA TGGGCAAACTGGCT GA TGGCGA GCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGA CGA CAA CGCGA CCA GCGTGCTGCGGAA GA CCTTCGA GGTCGCCGGCTTTGCGTGCA GCGGCTG GGAAAA GGGCTTCAA CCTCGGCA TTCGTGGCGA CCTCA TGGACTACCTGGTCG A CCGCCTGCGCGCCGTGA GCGAGGCCGCGGGGGGGCA GAA GGTTA TCGTGG TCGGCTGGA GTCTCGGCGGCCTCTA CGCCCGGGA GCTTGGCCA CAA GGCCCC CGAACTGATCAGGATGGTCGTCACGCTCGGCTCTCCGTTCGCCGGCGACCTCC A CGCGAA CCA TGCCTGGAA GA TCTACGAGGCCA TCAA CTCCCA CA CGGTCGA C AA CCTGCCGA TCCCGCGCGA TTTCCA GA TTAA GCCGCCGGTGCA TA CCA TCGC CGTGTGGA GCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGA GACGA GCGAA GGCA G CCCCGAGCAGAGCGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTT GCGGCTAGCAA GACCGGGGCGGA GGCA G TGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA
Las secuencias de ambas versiones de codones optimizados del gen se enviaron a DNA 2.0 Incorporated (Menlo Park, CA) para la smtesis de ADN. Los genes se sintetizaron en el vector pJ201 con un sitio de restriccion Spel y Xhol en cada lado del gen. Cuando se entregaron los genes sintetizados, los plasmidos se cortaron con enzimas de restriccion. El ADN del vector pDOW-Kan tambien se corto con las mismas enzimas de restriccion y despues se trato con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (New England Biolabs Producto n° M0290L). Todas las muestras se purificaron en gel y se extrajeron usando el kit de extraccion en gel de QIAquick (Qiagen, Producto n° 28706). Despues, el vector y las inserciones se ligaron usando el kit de Roche Rapid Ligation (Roche, Producto n° 11635379001). Los productos de ligado despues se transformaron en celulas competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se seleccionaron, cultivaron y el ADN se preparo usando el kit de Qiagen mini-prep. Se confirmo la secuencia de las muestras de ADN y despues se uso Ad N para transformar Pseudomonas fluorescens.
Despues, 29SM-Pf (SEQ ID NO: 22), 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23), 29SM, secuencia parental (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K y V163R) y el hospedante/vector de control se cultivaron y se indujeron en matraces de agitacion de 250 ml. La concentracion de protema en los lisados clarificados se cuantifico usando el ensayo de protemas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, catalogo n° 500-0006) basado en el metodo de Bradford y despues se normalizo respecto a la expresion de la protema total. La expresion se analizo por SDS-PAGE, con cada banda del gel de SDS-PAGE cargado con protema total equivalente. 29SM-Pf y 29SM-Pf+SM teman un mayor porcentaje de protema palmitasa expresada en comparacion con 29SM y el parental. 29SM-Pf+SM tema un porcentaje ligeramente mayor de expresion de palmitasa que 29SM-Pf. Por lo tanto, mejora en la expresion era ligeramente mas pronunciada en presencia de las mutaciones silenciosas.
Se han descrito varias realizaciones como se proporcionan en la presente memoria. Sin embargo, se entendera que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del espmtu y el alcance como se proporciona en la presente memoria. Por consiguiente, otras realizaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un acido nucleico aislado, sintetico o recombinante que comprende
(a) un acido nucleico que codifica al menos un polipeptido, en donde el acido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y que tiene uno o mas cambios de nucleotidos que codifican un cambio de aminoacido D61A o D61E,
en donde el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de la palmitasa,
(b) un acido nucleico que codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa, en donde el polipeptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimaticamente activos, y que tiene al menos un cambio de aminoacido D61A o D61E,
(c) el acido nucleico de (a) o (b) que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa, que comprende actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia senal,
(d) el acido nucleico de cualquiera de (a) a (c) que codifica un polipeptido que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa que ademas comprende una secuencia heterologa,
(e) el acido nucleico de (d), en donde la secuencia heterologa comprende, o consiste en una secuencia que codifica: (A) una secuencia senal heterologa, (B) la secuencia de (A), en donde la secuencia senal heterologa deriva de una enzima heterologa, o, (C) un marcador, un epftopo, un peptido de direccionamiento, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima, o
(f) una secuencia de acido nucleico totalmente complementaria a la secuencia de cualquiera de (a) a (e).
2. Un acido nucleico aislado, sintetico o recombinante r laeivindicación 1, que s aedgeúmnas tiene uno o mas cambios de nucleotidos que codifican uno o mas de los cambios de aminoacidos R72E, R72K, E116A, E116Q, E116R, E116T, E116V, S133A, I151G, I151A, V163R o D164R.
3. El acido nucleico aislado, sintetico o recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la actividad de palmitasa
comprende hidrolizar selectivamente acidos grasos de modo que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos hidrolizados son acido palmftico.
4. Un casete de expresion que comprende un acido nucleico que comprende la secuencia de acuerdo con la reivindicacion 1 a 3.
5. Un vehfculo de clonacion que comprende un acido nucleico que comprende la secuencia de acuerdo con la reivindicacion 1 a 3, en donde el vehfculo de clonacion es un vector vmco, un plasmido, un fago, un fagemido, un cosmido, un fosmido, un bacteriofago o un cromosoma artificial.
6. Una celula transformada que comprende un acido nucleico que comprende la secuencia de acuerdo con la reivindicacion 1 a 3, o un casete de expresion de acuerdo con la reivindicac 4,ió on vehfculo de clonacion de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la celula es una celula bacteriana, una celula de mairnfero, una celula fungica, una celula de levadura, una celula de insecto o una celula de planta.
7. Una planta o semilla transgenica que comprende la secuencia de acuerdo con la reivindicac 1ió an la reivindicacion 3, en donde la planta es una planta de mafz, una planta de sorgo, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, una hierba o una planta de tabaco, o en donde opcionalmente, la semilla es arroz, una semilla de mafz, un grano de trigo, una semilla oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soja, un grano de palma, una semilla de girasol, una semilla de sesamo, un arroz, una cebada, un cacahuete o una semilla de planta de tabaco.
8. Un polipeptido aislado, sintetico o recombinante que comprende una secuencia
(a) que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, o sus fragmentos enzimaticamente activos, y que tienen al menos un cambio de resto de aminoacido D61A o D61E, en donde el polipeptido tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa;
(b) el polipeptido de (a), que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa pero que carece de una secuencia senal;
(c) el polipeptido de (a) o (b) que tiene una actividad de hidrolasa que comprende actividad de palmitasa y que comprende ademas una secuencia heterologa;
(d) el polipeptido de (c), en donde la secuencia heterologa comprende, o consiste en (A) una secuencia senal heterologa, (B) la secuencia de (A), en donde la secuencia senal heterologa deriva de una enzima heterologa, y/o, (C) un marcador, un epftopo, un peptido de direccionamiento, una secuencia escindible, un resto detectable o una enzima; o
(e) que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por el acido nucleico de la reivindicacion 1;
(f) el polipeptido de cualquiera de (a) a (e), en donde el polipeptido esta glicosilado o comprende al menos un sitio de glicosilacion, en donde opcionalmente la glicosilacion es una glicosilacion unida a N y opcionalmente el polipeptido se glicosila despues de ser expresado en una P. pastoris o una S. pombe; o
(g) el polipeptido de cualquiera de (a) a (f), en donde el polipeptido se inmoviliza, en donde opcionalmente el polipeptido se inmoviliza en una celula, un metal, una resina, un poftmero, un material ceramico, un vidrio, un microelectrodo, una partmula grafftica, una perla, un gel, una placa, una matriz o un tubo capilar.
9. Un polipeptido aislado, sintetico o recombinante de acuerdo con la reivindicacion 8, que ademas comprende uno o mas de los cambios de restos de aminoacidos R72E, R72K, E116A, E116Q, E1i 6r , E116T, E1l6v, S133A, I151G, I151A, V163R o D164R.
10. El polipeptido aislado, sintetico o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la actividad de palmitasa,
comprende hidrolizar selectivamente acidos grasos de modo que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos hidrolizados son acido palmftico.
11. Una preparacion de protema que comprende el polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 8 a 10, en donde la preparacion de protema comprende un ftquido, un solido o un gel.
12. Un metodo de produccion de un polipeptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proporcionar el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2; y (b) expresar el acido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresion del polipeptido, produciendo asf un polipeptido recombinante.
13. Un metodo para hidrolizar de forma estereoselectiva mezclas racemicas de esteres de acidos 2-sustituidos que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar la palmitasa de acuerdo con la 8 a 10, en donde l rae pivailnmditiacsaac eiósn estereoselectiva; b) proporcionar una composicion que comprende una mezcla racemica de esteres de acidos 2-sustituidos; y c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en donde el polipeptido de la etapa (b) puede hidrolizar los esteres selectivamente.
14. Una composicion que comprende el polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 8 a 10, en donde la composicion es un alimento, pienso, suplemento alimenticio, suplemento de pienso, ayuda dietetica o composicion dietetica.
15. Una palmitasa que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 2, pero que tambien comprende
a) la modificacion del resto de aminoacido D61E, R72K y V163R;
b) la modificacion del resto de aminoacido D61E, R72K y V163R y al menos una modificacion del resto de aminoacido A48C, R85Y, E95K, E116I, E116L, E116N, A144I, E149H, A150I, P162G, P162K, R172H, R172L o A225S,
c) la palmitasa de cualquiera de (a) o (b), en donde una secuencia de acido nucleico que codifica una palmitasa de acuerdo con (a) o (b), comprende ademas al menos una modificacion de codon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); o (ACC)188(ACG).
16. La palmitasa de la re 1iv5i,n ednic daocnidóen la especificidad de sustrato o la preferencia de sustrato de la nueva lipasa comprende la hidrolisis preferencial o mayor de un acido graso en comparacion con la SEQ ID NO: 2, en donde el acido graso es acido palmftico
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