EA020145B1

EA020145B1 - Гидролазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

Info

Publication number: EA020145B1
Application number: EA201170388A
Authority: EA
Inventors: Нельсон Р. Бартон; Аналиа Буэно; Джослин Куэнка; Тим Хитчмэн; Кэти А. Клайн; Джонатан Лайон; Марк Л. Миллер; Марк А. Уолл; Кристофер Л.Г. Дейтон
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2014-09-30
Also published as: CA3060541A1; MX2011002297A; KR20110050703A; US20160108383A1; US20180057803A1; CN102197043A; US9238804B2; AR073942A1; ES2714673T3; EA020145B9; US20120227120A1; US8198062B2; EP2328907A4; CA3060541C; BRPI0918265A2; US20100055085A1; EP2328907A2; CA2735230C; CA2735230A1; WO2010025395A3

Abstract

В изобретении предлагаются гидролазы, включающие липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы и кодирующие их полинуклеотиды, а также способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Дополнительно предлагаются полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, и способы получения масел низкой насыщенности или имеющих низкое содержание жирных транс-кислот, таких как животные или растительные масла низкой насыщенности, или имеющие низкое содержание жирных транс-кислот, например масло сои или канолы.

Description

В настоящем документе предлагаются полипептиды, обладающие гидролазной активностью, включая липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, кодирующие их полинуклеотиды и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В настоящем описании предлагаются также пептиды и полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, и способы обработки жиров и масел такими пептидами и полипептидами для получения продуктов гидролизованных масел, таких как животные или низконасыщенные растительные масла, например масла сои или канолы, продуктов масел, обработанных таким образом, и продуктов, включающих такие обработанные масла.

Известный уровень техники

Основные виды промышленного применения гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, включают пищевую промышленность и производство напитков, применение в качестве агентов против черствости хлебобулочных изделий и для получения маргарина и других бутербродных паст с отдушками природных масел; применение в системах отходов и в фармацевтической промышленности, где они используются в качестве средств, способствующих усваиванию.

Бакалейные масла и жиры являются главным компонентом пищевых продуктов, пищевых добавок и средств приготовления пищи, а также представляют собой важное возобновляемое сырье для химической промышленности. Они доступны в больших количествах в результате обработки семян масличных культур таких растений, как рис, отруби, кукуруза, рапс, канола, подсолнечник, олива или соя. Другие источники ценных масел и жиров включают рыбу, ресторанные отходы и животные топленые жиры. Эти жиры и масла представляют собой смесь триацилглицеридов или липидов, т.е. жирных кислот (ЖК), этерифицированных на каркасе глицерина. Каждое масло или жир содержит большое разнообразие различных липидных структур, определяемых по содержанию ЖК и по их региональному химическому распределению на остове глицерина. Эти свойства индивидуальных липидов определяют физические свойства чистого триацилглицерида. Следовательно, содержание триацилглицеридов в жире или масле в высокой степени определяет физические, химические и биологические свойства масла. Ценность липидов существенно возрастает в зависимости от их чистоты. Высокая чистота может быть достигнута с помощью фракционной хроматографии или перегонки, отделения желаемого триацилглицерида из смешанного окружения источника жира или масла. Однако это дорого, и выход часто ограничивается низкими уровнями, в которых триацилглицерид находится в природе. Кроме того, легкость очистки продукта часто осложняется присутствием многих структурно и физически или химически сходных триацилглицеридов в масле.

Альтернативой очистке триацилглицеридов или других липидов из природного источника является синтез липидов. Продукты таких способов называют структурными липидами, потому что они содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на остове глицерина. Ценность липидов также существенно возрастает при контролировании содержания и распределения жирных кислот в липиде. Удаление из триглицеридов, жиров или масел нежелательных ЖК или замена ЖК с нежелательными свойствами на жирные кислоты с лучшими или более желательными химическими, физическими или биологическими свойствами повышает ценность липидов. В частности, существует потребность в липазах, которые могут гидролизовать, например избирательно гидролизовать, насыщенную жирную кислоту (сатураза), или в тех, которые, в частности, могут гидролизовать, например избирательно гидролизовать, пальмитиновую кислоту (пальмитаза) или стеариновую кислоту (стеаратаза) на остове глицерина. Липазы, такие как сатуразы, например пальмитазы и/или стеаратазы, могут быть использованы для осуществления такого контроля, когда ЖК, предназначенные для удаления, добавления или замены, представляют собой насыщенные жирные кислоты, например пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагаются полипептиды, обладающие гидролазной активностью, включая липазную активность. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются новые классы липаз, обозначаемые как сатуразы, пальмитазы и стеаратазы. Предлагаются также полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, обладающие сатуразной, например пальмитазной и/или стеаратазной активностью, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью,

- 1 020145 обладающие термостабильной и/или термоустойчивой ферментативной (каталитической) активностью. Типы ферментативной активности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем документе, включают (включают или состоят из) сатуразную активность или липазную активность, включая гидролиз липидов, реакции кислотного гидролиза (например, замены этерифицированной жирной кислоты свободной жирной кислотой), реакции трансэтерификации (например, обмена жирными кислотами между триацилглицеридами), синтез сложных эфиров, реакции взаимопревращений сложных эфиров и активность ацилгидролазы липидов (ЬЛН). В другом аспекте предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды используются для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов.

Предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть использованы в разнообразных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных целях, включая производство косметики и пищевых продуктов. Кроме того, предлагаемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть использованы в приготовлении пищи, пивоварении, в качестве добавок в ванну, в получении спирта, пептидном синтезе, энантиоселективности, получении шкур в кожевенной промышленности, в управлении отходами и разрушении животных отходов, в регенерации серебра в фотографической промышленности, медицинском лечении, отварке шелка, деградации биологических пленок, превращении биомассы в этанол, биологической защите, противомикробных агентах и дезинфицирующих средствах, в индивидуальном уходе и косметике, биотехнологических реагентах, для повышения выхода крахмала из кукурузы мокрого помола и в качестве фармацевтических агентов, таких как средства, способствующие усваиванию, и противовоспалительные (антивоспалительные) агенты.

В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагаются композиции (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) и способы получения низконасыщенных масел, например масел с содержанием жирных кислот более низкой насыщенности, включая масла с низким содержанием производных жирных кислот, пальмитата, стеарата, миристата, лаурата или бутирата и/или каприловой кислоты (октановой кислоты). Любое растительное масло, например масло канолы, масло сои или животное масло или жир, например сало, может быть обработано с помощью предлагаемых в настоящем описании композиции или способа. Любые пищевые продукты, съедобные изделия или продукты хлебопечения, обжаривания или кулинарии (например, соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпечки, майонез, кулинарные масла, салатные масла, густые или жидкие подливы и тому подобное, и продукты, приготовленные с ними) могут включать растительное масло или животный жир, которые обработаны с помощью предлагаемых в настоящем описании композиции или способа. Растительные масла, модифицированные для получения масел с более низкой насыщенностью, могут быть использованы в любых пищевых продуктах, съедобных изделиях или продуктах хлебопечения или кулинарии, например соусах, маринадах, приправах, распыляемых маслах, маргаринах, маслах для выпечки, майонезе, кулинарных маслах, салатных маслах, густых или жидких подливах и тому подобном. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагаются масла, такие как растительные масла, например масло канолы или масло сои, и пищевые продукты или продукты хлебопечения или кулинарии, включая соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, майонез, масла для выпечки, кулинарные масла, масла для жарения, салатные масла, густые или жидкие подливы и тому подобное, где масло или пищевой продукт либо продукт хлебопечения или кулинарии модифицирован с использованием предлагаемого в настоящем изобретении фермента. В одном аспекте эти растительные масла, например масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, масло кориандра, кукурузное масло, хлопковое масло, масло фундука, конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, косточковое пальмовое масло, арахисовое масло, масло семян рапса, масло отрубей риса, сафлоровое масло, масло горной камелии, соевое масло, масло семян подсолнечника, 1а11 масло, 15иЬак1 масло, разнообразные природные масла, обладающие измененными составами жирных кислот из-за генетически модифицированных организмов (ГМО) или традиционные сорта, такие как с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты, или низконасыщенные масла (масло канолы с высоким содержанием олеиновой кислоты, соевое масло с низким содержанием линоленовой кислоты или масла подсолнечника с высоким содержанием стеариновой кислоты), животные жиры (сало, шпик, полутвердый жир и жир цыплят), масла рыб (масло талеихтиса, рыбий жир, масло хоплостета, масло сардин, масло сельди и масло американской сельди) или смеси любых из указанных выше, и пищевые продукты или продукты хлебопечения, жарения или кулинарии включают масла с более низким содержанием насыщенных жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановой кислоты) и т.п., обработанные с использованием композиции или способа, предлагаемых в настоящем изобретении.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются полипептиды, например ферменты и каталитические антитела, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая термостабильную и термоустойчивую ферментативную активность, и специфическую для жирных кислот или избирательную для жирных кислот активность, и устойчивые к низкому или высокому рН ферментативные активности, и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включая векторы, клетки-хозяева, трансгенные растения и животные, не являющиеся

- 2 020145 человеком, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов.

В другом аспекте в настоящем изобретении предлагаются выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие:

(a) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, где нуклеиновая кислота включает последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности:

(1) с 8Е0 ГО N0:1, 8ЕС) ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:13, 8Е0 ГО N0:15, 8ЕС) ГО N0:17, 8ЕО ГО N0:19, 8ЕС) ГО N0:22 или 8ЕО ГО N0:23 или (ίί) с нуклеиновой кислотой 8Е0 ГО N0:1, имеющей одну или более замен нуклеотидов (или их эквивалентов), кодирующих одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одну, двадцать две, двадцать три, двадцать четыре или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, где нуклеиновая кислота по (ί) или (ίί) кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или кодирует полипептид или пептид, способный индуцировать образование антитела, специфичного для гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) (полипептид или пептид, который действует в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков или полной длины кДНК, транскрипта (мРНК) или гена;

(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а) или (Ь), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм ВЬА8Т версии 2.2.2, где установка фильтрации берется как Ь1аь1а11 -р Ь1а§1р -б пг ра!аа -Е Е и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(б) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид или пептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где нуклеиновая кислота включает последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нуклеиновой кислотой по (а), (Ь) или (с), где жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;

(е) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает последовательность 8Е0 ГО N0:2 или ее ферментативно активный фрагмент, имеющие по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одну, двадцать две, двадцать три, двадцать четыре или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23;

(I) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает последовательность 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8ЕС) ГО N0:10, 8ЕС) ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:14, 8ЕС) ГО N0:16, 8ЕО ГО N0:18 или 8ЕО ГО N0:20 или их ферментативно активные фрагменты;

(д) (А) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из от (а) по (1) и кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере одной консервативной заменой аминокислот и сохраняющий свою гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, или (В) нуклеиновую кислоту по (д) (А), где по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты включает замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками; или консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком; или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком;

(II) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(д), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности;

(ί) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(1), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, дополнительно включающий гетерологичную последовательность;

- 3 020145 (ί) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (ί), где гетерологичная последовательность включает или состоит из последовательности, кодирующей (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, определяемую часть или фермент; или (к) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), полностью (целиком) комплементарную последовательности по любому из (а».

В одном аспекте выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или пептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, который является термостабильным. Полипептиды и пептиды, кодируемые предлагаемыми в настоящем описании нуклеиновыми кислотами, или любой полипептид или пептид, предлагаемый в настоящем документе, могут сохранять ферментативную или связывающую способность (например, связывание субстрата) в условиях, включающих диапазон температур от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более. В настоящем описании предлагаются термостабильные полипептиды, которые сохраняют гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, при температуре в описанных выше диапазонах при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН

10.5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании полипептиды могут быть термоустойчивыми и могут сохранять гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, после экспозиции с температурой в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

В некоторых вариантах осуществления термостабильные полипептиды сохраняют гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность, после экспозиции с температурой в описанных выше диапазонах при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН

3.5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.

В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты включают последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой, например с предлагаемой в настоящем описании иллюстративной нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, как показано в 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:3, + +) ΙΌ N0:5, 8Ер ГО N0:7, 8Ер ГО N0:9, + +) ГО N0:11, + +) ГО N0:13, + +) ГО N0:15, + +) ГО N0:17, 8ЕО ГО N0:19, 8Е0 ГО N0:22 или 8Е0 ГО N0:23, или с последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:1, имеющей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков (модифицированные последовательности 8Е0 ГО N0:1), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их фрагментами или подпоследовательностями, и последовательностями, (полностью) комплементарными им. В одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью. Нуклеиновая кислота

- 4 020145 может иметь по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков в длину или полную длину гена или быть транскриптом, включающим 8ЕО ΙΌ N0:1, и обладать последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ N0:1, имеющей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков (модифицированные аминокислотные последовательности) в 8Е0 ΙΌ N0:1, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и последовательностями, (полностью) комплементарными им. В одном аспекте жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин.

В одном осуществлении зонд нуклеиновой кислоты, например зонд для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включает зонд, включающий или состоящий по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательных оснований предлагаемой в настоящем описании последовательности или ее фрагментов или подпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту с помощью связывания или гибридизации. Зонд может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательных оснований последовательности, включающей последовательность, предлагаемую в настоящем описании, или ее фрагменты или подпоследовательности. Зонд может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательных оснований предлагаемой в настоящем описании последовательности нуклеиновой кислоты или ее подпоследовательности.

В одном варианте осуществления последовательности пары амплификационных праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включает пару праймеров, включающих или состоящих из пары праймеров, способных амплифицировать нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, предлагаемую в настоящем описании, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательности пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 оснований последовательности.

В одном варианте осуществления методы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включают амплификацию матрицы нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары амплификационных праймеров, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или ее фрагменты либо подпоследовательности.

В одном варианте осуществления экспрессионные кассеты включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или ее подпоследовательность. В одном аспекте экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может быть вирусным, бактериальным промотором, промотором млекопитающих или растительным промотором. В одном аспекте растительный промотор может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конституционный промотор. Конституционный промотор может включать СаМУ358. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцируемый промотор. В одном аспекте промотор может являться тканеспецифическим промотором или промотором, регулируемым факторами внешней среды или регулируемым факторами развития. Таким образом, промотор может являться, например, промотором, специфическим для семян, специфическим для корней, специфическим для ствола или индуцируемым опадением листьев. В одном аспекте экспрессионная кассета может дополнительно включать растительный экспрессионный вектор или экспрессионный вектор вирусов растений.

В одном варианте осуществления носители для клонирования включают экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемую в настоящем описании, или предлагаемую в настоящем описании нуклеиновую кислоту. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор. Носитель для клонирования может включать бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, происходящий из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).

В одном варианте осуществления трансформированные клетки включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемые в настоящем описании, или носитель для клонирования, предлагаемый в настоящем описании. В одном аспекте трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопи

- 5 020145 тающих, клетку грибов, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Трансформированная клетка может быть любой из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области техники, включая клетки прокариот, клетки эукариот, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примеры бактериальных клеток включают любые штаммы в пределах родов ЕксНеНсЫа, Вас111ик, 81тер1отусек, 8а1топе11а, Ркеиботопак и 81арйу1ососсик, включая, например, ЕксНепсЫа сой, ЬасЮсоссик 1ас11к, ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтипит, Ркеиботопак Диогексепк. Примеры клеток грибов включают любые виды ЛкретдШик. Примеры клеток дрожжей включают любые виды РюЫа, 8ассйаготусек, 8с1п/окасс11аготусек или 8с1таппютусек, включая Рю1па райопк, 8ассйатотусек сетеуШае или 8с1ихокассйатотусек ротЬе. Примеры клеток насекомых включают любые виды 8робор1ега или ИгокорШа, включая ИгокорЫ1а 82 и 8робор1ега 819. Примеры клеток животных включают линии СНО, СО8 или меланому Во\\ек либо любые клеточные линии мыши или человека.

В одном варианте осуществления трансгенные растения включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемую в настоящем описании. Трансгенное растение может представлять собой растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака.

В одном варианте осуществления трансгенные семена включают нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или экспрессионную кассету (например, вектор), предлагаемую в настоящем описании. Трансгенные семена могут представлять собой рис, семена кукурузы, зерно пшеницы, семена масличной культуры, семена рапса, семена сои, зерно пальмы, семена подсолнечника, семена кунжута, арахис или семена растения табака.

В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные полипептиды обладают гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или полипептиды способны вызывать иммунный ответ, специфичный для гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы (например, как эпитоп); и в альтернативных аспектах пептиды и полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, включают последовательность:

(a) обладающую по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо 100% (полной) идентичностью последовательности:

(ί) с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2 или ее ферментативно активными фрагментами и имеющей по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более или все аминокислотные замены (или их эквиваленты), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или (ίί) с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:4, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕС ГО N0:10, 8ЕС ГО N0:12, 8ЕС ГО N0:14, 8ЕС ГО N0:16, 8ЕС ГО N0:18 или 8ЕС ГО N0:20, где полипептид или пептид по (ί) или (ίί) обладает гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или полипептид или пептид способен индуцировать образование антитела, специфичного для гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) (полипептид или пептид, который действует в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) полипептида или пептида по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков либо на протяжении полной длины полипептида или пептида либо фермента и/или их ферментативно активных подпоследовательностей (фрагментов);

(c) полипептида или пептида по (Ь), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм ВЬА8Т версии 2.2.2, где установка фильтрации берется как Ь1ак1а11 -р Ь1ак1р -б пг ра1аа -Г Г, и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(б) аминокислотную последовательность, кодируемую предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой, где полипептид обладает (ί) гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, или (ίί) обладает иммуногенной активностью, в том плане, что он способен индуцировать выработку антитела, которое специфически связывается с полипептидом, обладающим последовательностью по (а) и/или их ферментативно активными подпоследовательностями (фрагментами);

(е) аминокислотную последовательность по любому из (а)-(б), включающую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка, и полипептид или пептид сохраняет гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность;

(1) аминокислотную последовательность по (е), где консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком; или замену

- 6 020145 ароматического остатка другим ароматическим остатком либо их сочетание;

(д) аминокислотную последовательность по (ί), где алифатический остаток включает аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислый остаток включает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, включающий амидную группу, включает аспарагин, глутамин или их синтетический эквивалент; основной остаток включает лизин, аргинин, гистидин или их синтетический эквивалент или ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин, триптофан или их синтетический эквивалент;

(11) полипептида по любому из (α)-(ί), обладающего гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, но лишенного сигнальной последовательности;

(ί) полипептида по любому из (а)-(1), обладающего гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, дополнительно включающего гетерологичную последовательность;

(ί) полипептида по (ί), где гетерологичная последовательность включает или состоит из (А) гетерологичной сигнальной последовательности, (В) последовательности по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, и/или (С) метки, эпитопа, направляющего пептида, расщепляемой последовательности, определяемой части или фермента; или (т) включающую аминокислотную последовательность, кодируемую любой последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании.

Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают 8ЕО ΙΌ N0:2, ее подпоследовательности и ее варианты, например по меньшей мере приблизительно из 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более остатков в длину или на протяжении полной длины фермента, все обладающие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 или более либо всеми заменами аминокислотных остатков (модифицированные аминокислотные последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2), как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23. Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают последовательность, кодируемую предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой. Иллюстративные последовательности полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают полипептиды или пептиды, специфически связывающиеся с антителом, предлагаемым в настоящем описании. В одном аспекте полипептид, предлагаемый в настоящем описании, обладает по меньшей мере одной гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью. В одном аспекте активность представляет собой региоселективную и/или химиоселективную активность.

В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид, предлагаемый в настоящем описании, лишенный сигнальной (пептидной) последовательности, например, лишенный его гомологичной сигнальной последовательности, и в одном аспекте он включает гетерологичную сигнальную (пептидную) последовательность. В одном аспекте выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид, предлагаемый в настоящем описании, включающий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность гидролазы или не гидролазы (например, не липазы, не сатуразы или не пальмитазы). В одном аспекте слитые белки включают первый домен, включающий сигнальную последовательность, предлагаемую в настоящем описании, и, по меньшей мере, второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может включать фермент. Фермент может представлять собой гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании, или другую гидролазу.

В одном аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность включает специфичную активность при приблизительно 37°С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка. В другом аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность включает специфичную активность от приблизительно 500 до приблизительно 750 ед/1 мг белка. Альтернативно, гидролазная активность включает специфичную активность при 37°С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка. В одном аспекте гидролазная активность включает специфичную активность при 37°С в диапазоне от приблизительно 750 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка. В другом аспекте термоустойчивость включает сохранение, по меньшей мере, половины специфической активности гидролазы при 37°С после нагревания при повышенной температуре. Альтернативно, термоустойчивость может включать сохранение специфической активности при 37°С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка после нагревания при повышенной температуре.

В одном варианте осуществления выделенные синтетические или рекомбинантные полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, включают по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой Ν-связанное гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в Р. ра81от18 или 8. ротЬе или в растениях, таких как растения, продуцирующие масла, например соя, канола, рис, подсолнечник или генетически модифицированные (ГМО) варианты этих растений.

- 7 020145

В одном аспекте полипептид может сохранять гидролазную (например, липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную) активность в условиях, включающих приблизительно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4,0 или ниже. В другом аспекте полипептид может сохранять гидролазную (например, липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную) активность в условиях, включающих приблизительно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12,0 или выше.

В одном варианте осуществления препараты белка включают предлагаемый в настоящем описании полипептид, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель.

В одном аспекте гетеродимеры, предлагаемые в настоящем описании, включают полипептид и второй домен. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте гомодимеры, предлагаемые в настоящем описании, включают предлагаемый в настоящем описании полипептид.

В одном варианте осуществления иммобилизованные полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, обладают гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью, где полипептид включает предлагаемый в настоящем описании полипептид, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании, или полипептид, включающий предлагаемый в настоящем описании полипептид и второй домен. В одном аспекте полипептид, предлагаемый в настоящем описании, может быть иммобилизован на клетке, пузырьке, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, кристалле, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре, матрице или капиллярной трубке или таких материалах, как зерна, шелуха, кора, кожа, волос, кость, оболочка, и происходящих от них материалах. Полинуклеотиды, полипептиды и ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть составлены в виде твердой формы, такой как порошок, лиофилизованный препарат, гранулы, таблетка, брусок, кристалл, капсула, пилюля, шарик, или в виде жидкой формы, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, суспензия, эмульсия воды в масле, крем, капсула или везикулярная либо мицеллярная суспензия.

В одном варианте осуществления пищевые добавки для животного включают полипептид, предлагаемый в настоящем описании, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании. В одном аспекте полипептид в пищевой добавке может быть гликозилирован. В одном варианте осуществления матрицы для доставки пригодного в пищу фермента включают полипептид, предлагаемый в настоящем описании, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании. В одном аспекте матрица для доставки включает гранулу. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован. В одном аспекте гидролазная активность является термоустойчивой. В другом аспекте гидролазная активность является термостабильной.

В одном варианте осуществления методы выделения или идентификации полипептида, обладающего гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью, включают следующие стадии: (а) обеспечение антитела, предлагаемого в настоящем описании; (Ь) обеспечение образца, включающего полипептиды; и (с) контактирование образца со стадии (Ь) с антителом со стадии (а) в условиях, когда антитело может специфически связываться с полипептидом, тем самым достигая выделения или идентификации полипептида, обладающего гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью.

В одном варианте осуществления методы получения антитела против гидролазы включают введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индукции гуморального иммунного ответа, тем самым создавая выработку антитела против гидролазы. В настоящем описании предлагаются методы получения антитела против гидролазы, включающие введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, или полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа.

В одном варианте осуществления методы получения рекомбинантного полипептида включают следующие стадии: (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, функционально связанной с промотором, и (Ь) экспрессия нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, тем самым получая рекомбинантный полипептид. В одном аспекте метод может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), тем самым получая рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.

В одном варианте осуществления методы идентификации полипептида, обладающего гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью, включают следующие стадии: (а) обеспечение полипептида, предлагаемого в настоящем описании; или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение субстрата гидролазы; (с) контактирование полипептида или его фрагмента либо варианта со стадии (а) с субстратом со стадии (Ь) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение

- 8 020145 количества субстрата или рост количества продукта реакции указывает на полипептид, обладающий гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью.

В одном варианте осуществления методы идентификации субстрата гидролазы включают следующие стадии: (а) обеспечение полипептида, предлагаемого в настоящем описании; или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение субстрата гидролазы; (с) контактирование полипептида со стадии (а) с тестируемым субстратом со стадии (Ь) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат как субстрат гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы).

В одном варианте осуществления методы определения, будет ли тестируемое соединение специфически связываться с полипептидом, включают следующие стадии: (а) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, включающего нуклеиновую кислоту, в условиях, пермиссивных для трансляции нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота включает нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или нуклеиновую кислоту, обеспечивающую предлагаемым в настоящем описании полипептидом; (Ь) обеспечение тестируемого соединения; (с) контактирование полипептида с тестируемым соединением и (б) определение, будет ли тестируемое соединение со стадии (Ь) специфически связываться с полипептидом.

В одном варианте осуществления методы идентификации модулятора гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активности включают следующие стадии: (а) обеспечение полипептида, предлагаемого в настоящем описании, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение тестируемого соединения; (с) контактирование полипептида со стадии (а) с тестируемым соединением со стадии (Ь) и измерение активности гидролазы, где изменение активности гидролазы, измеренное в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения, указывает на то, что тестируемое соединение модулирует активность гидролазы. В одном аспекте гидролазная (например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная) активность может быть измерена с помощью предоставления субстрата гидролазы и определения снижения количества субстрата, или роста количества продукта реакции, или повышения количества субстрата, или снижения количества продукта реакции. Снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции под действием тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как активатор гидролазной активности. Повышение количества субстрата или снижение количества продукта реакции под действием тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как ингибитор гидролазной активности.

В одном варианте осуществления компьютерные системы включают процессор и устройство накопления данных, где в устройстве накопления данных сохраняются предлагаемые в настоящем описании полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты (например, полипептид, кодируемый предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой). В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать алгоритм сравнения последовательностей и устройство накопления данных, имеющее по меньшей мере одну сохраняемую на нем реперную последовательность. В другом аспекте алгоритм сравнения последовательностей включает компьютерную программу, которая указывает на полиморфизмы. В одном аспекте компьютерная система может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует одну или более характеристик в указанной последовательности. В одном варианте осуществления полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании, сохраняются на носителях программ компьютера.

В одном варианте осуществления методы идентификации характеристики последовательности включают стадии (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует одну или более характеристик последовательности, где последовательность включает полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании; и (Ь) идентификации одной или более характеристик последовательности с помощью компьютерной программы.

В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются методы сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающие стадии (а) считывания первой последовательности и второй последовательности с помощью использования компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность включает полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании; и (Ь) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать стадию идентификации полиморфизмов. В одном аспекте метод может дополнительно включать идентификатор, который идентифицирует одну или более характеристик последовательности. В другом аспекте метод может включать считывание первой после

- 9 020145 довательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одной или более характеристик последовательности.

В одном варианте осуществления методы выделения или получения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной (например, липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной) активностью из образца, включают стадии (а) обеспечения последовательностей пары амплификационных праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, предлагаемую в настоящем описании; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработки образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце становится доступной для гибридизации с парой амплификационных праймеров; и (с) объединения нуклеиновой кислоты со стадии (Ь) с парой амплификационных праймеров со стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, тем самым выделяя или получая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью из образца. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец из окружающей среды, например образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец, например бактериальную клетку, клетку простейших, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений, клетку грибов или клетку млекопитающих. Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, включающий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательных оснований последовательности, предлагаемой в настоящем описании.

В одном варианте осуществления методы повышения термоустойчивости или термостабильности гидролазного полипептида включают гликозилирование гидролазного полипептида, где полипептид включает по меньшей мере тридцать последовательных аминокислот полипептида, предлагаемого в настоящем описании; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, тем самым повышая термоустойчивость или термостабильность гидролазного полипептида. В одном аспекте специфическая гидролазная активность может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне выше чем от приблизительно 37 до приблизительно 95°С.

В одном варианте осуществления методы гиперэкспрессии рекомбинантного гидролазного полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) в клетке включают экспрессию вектора, включающего нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании, или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем описании, где идентичности последовательностей определяют путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования, где гиперэкспрессия достигается использованием высокоактивного промотора, двухцистронного вектора или генной амплификации вектора.

В одном варианте осуществления композиции детергентов, включающие полипептид, предлагаемый в настоящем описании, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании, включают гидролазную активность, например липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В одном аспекте гидролаза может представлять собой не поверхностноактивную гидролазу. В другом аспекте гидролаза может представлять собой поверхностно-активную гидролазу.

В одном варианте осуществления методы мытья объекта включают следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, где полипептид включает полипептид, предлагаемый в настоящем описании, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение объекта; (с) контактирование полипептида со стадии (а) и объекта со стадии (Ь) в условиях, когда композиция может мыть объект.

В одном варианте осуществления методы получения трансгенного растения включают следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку растения, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем описании, тем самым получая трансформированную клетку растения; и (Ь) получение трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты с помощью электропорации протопластов клеток растения или микроинъекции в них. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты прямо в ткань растения с помощью бомбардировки частичками ДНК. Альтернативно, стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК растительной клетки с использованием хозяина АдгоЬас1епит 1итеГас1еп8. В одном аспекте растительная клетка может представлять собой клетку картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя.

В одном варианте осуществления методы экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительной клетке включают следующие стадии: (а) трансформация растительной клетки гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промо

- 10 020145 тором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты включает нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем описании; (Ь) выращивание растения в условиях, когда гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в растительной клетке.

В одном варианте осуществления первый метод биокаталитического синтеза структурного липида включает следующие стадии: (а) обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (Ь) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (ТАС); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (Ь) в условиях, когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении 8п2 триацилглицерида (ТАС), тем самым продуцируя 1,3-диацилглицерид (ЭАС); (б) обеспечение сложного эфира К1; (е) обеспечение К1-специфичной гидролазы и (ί) контактирование 1,3-ЭАС со стадии (с) со сложным эфиром К1 со стадии (б) и К1-специфичной гидролазой со стадии (е) в условиях, когда К1-специфичная гидролаза катализирует этерификацию положения 8п2, тем самым продуцируя структурный липид. Гидролаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой 8п2-специфичную гидролазу. Структурный липид может включать альтернативу масла какао (СВА), синтетическое масло какао, природное масло какао, 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (РОР), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (808), 1пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерин (РО8) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерин (ОММ).

В одном варианте осуществления второй метод биокаталитического синтеза структурного липида включает следующие стадии: (а) обеспечение гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (ТАС); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (Ь) в условиях, когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении 8п1 или 8п3 триацилглицерида (ТАС), тем самым продуцируя 1,2-ЭАС или 2,3-ЭАС; и (б) стимуляция миграции ацила в 1,2-ЭАС или 1,3-ЭАС со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, тем самым получая композицию, включающую

1.3- ЭАС.

Этот второй метод может дополнительно включать обеспечение сложного эфира К1 и К1специфичной липазы и контактирование 1,3-ЭАС со стадии (б) со сложным эфиром К1 и К1специфичной липазой в условиях, когда К1-специфичная гидролаза катализирует этерификацию положения 8п2, тем самым продуцируя структурный липид. Гидролаза, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой 8п1- или 8п3специфичный фермент. Структурный липид может включать любое растительное масло, например масло сои, масло канолы, альтернативу маслу какао (СВА), синтетическое масло какао, природное масло какао,

1.3- дипальмитоил-2-олеоилглицерин (РОР), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (808), 1-пальмитоил-2олеоил-3-стеароилглицерин (РО8) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерин (ОММ).

Сложный эфир К1 может включать часть с более низким насыщением, чем гидролизованный ацильный остаток, в этом случае структурный липид, полученный таким образом, является жиром или маслом с более низкой насыщенностью, чем исходный ТАС. Сложный эфир К1 может включать одну или более омега-3-жирных кислот, омега-6-жирных кислот, мононенасыщенных жирных кислот, полиненасыщенных жирных кислот, фосфогруппу, фитостероловый сложный эфир и оризанол. Более конкретно, сложный эфир К1 может включать часть, выбранную из группы, состоящей из альфалиноленовой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, гамма-линоленовой кислоты, дигомо-гамма-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмолеиновой кислоты, холина, серина, бета-ситостерола, кумэстрола, диэтилстильбэстрола и оризанола.

В одном аспекте этого второго метода стадия (б) дополнительно включает использование ионообменных смол. Кинетически контролируемые условия могут включать неравновесные условия, приводящие к продукции конечного продукта, обладающего отношением 1,3-ЭАС к 2.3-ЭАС более чем 2:1. Композиция на стадии (Ь) может включать флуорогенную жирную кислоту (ЖК). Композиция на стадии (b) может включать умбеллифериловый сложный эфир ЖК. Конечный продукт может быть энантиомерно чистым.

В одном варианте осуществления метод получения жира или масла с более низкой насыщенностью включает следующие стадии: (а) обеспечение полипептида (гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (Ь) обеспечение масла или жира;

(c) контактирование полипептида со стадии (а) с маслом или жиром со стадии (Ь) в условиях, когда гидролаза может модифицировать масло или жир, например удалить по меньшей мере одну насыщенную жирную кислоту, например пальмитиновую, стеариновую, лауриновую, каприловую кислоту (октановую кислоту) и тому подобное. Модификация может включать катализируемый гидролазой гидролиз жира или масла. Гидролиз может быть полным или частичным гидролизом жира или масла. Гидролизованное масло может включать сложный эфир глицерина и полиненасыщенной жирной кислоты, который может заменять удаленную насыщенную жирную кислоту, или масло рыб, животных или растительное масло. Растительное масло может включать оливковое масло, масло канолы, подсолнечное, пальмовое, соевое или лауриновое масло либо масло отрубей риса или их сочетание.

В одном варианте осуществления метод получения жира или масла более низкой насыщенности, которые могут включать незаменимые жирные кислоты, включает следующие стадии: (а) обеспечение

- 11 020145 полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании; (Ь) обеспечение композиции, включающей триацилглицерид (ТАС); (с) контактирование полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (Ь) в условиях, когда полипептид гидролизует ацильный остаток в положении 8и1 или 8п3 триацилглицерида (ТАС), тем самым продуцируя 1,2-ЭАС или

2,3-ЭАС; и (б) стимуляция миграции ацила в 1,2-ЭАС или 1,3-ЭАС со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, тем самым получая 1,3-ЭАС.

Метод может дополнительно включать обеспечение сложного эфира Я1 и К1-специфичной липазы и контактирование 1,3-ЭАС со стадии (б) со сложным эфиром К1 и К1-специфичной липазой в условиях, когда К1-специфичная липаза катализирует этерификацию положения 8и2, тем самым продуцируя структурный липид. Сложный эфир К1 может включать часть более низкой насыщенности, чем гидролизованный ацильный остаток, в этом случае структурный липид, полученный таким образом, является жиром или маслом с более низкой насыщенностью, чем исходный ТАС. Сложный эфир К1 может включать омега-3-жирную кислоту (альфа-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозагексаеновую кислоту (ОНА), омега-6-жирную кислоту (гамма-линоленовую, дигомо-гамма-линоленовую кислоту (ОСЬА) или арахидоновую), мононенасыщенную жирную кислоту (олеиновую, пальмолеиновую и тому подобное), фосфогруппы (холин и серин), фитостероловые сложные эфиры (бета-ситостерол, кумэстрол и диэтилстильбэстрол) и оризанол. Гидролаза, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза, предлагаемая в настоящем описании, может представлять собой 8п1- или 8п3-специфичный фермент. Жир или масло более низкой насыщенности могут быть получены с помощью описанного выше гидролиза любого масла водорослей, растительного масла или животного жира либо масла, например масла ЫеосЫопз о1еоаЬипбаиз, масла 8сепебезтиз бтотрйиз, масла Еид1епа дтасШз, масла Рйаеобас1у1нт [псогптиШт, масла Р1еигосйтуз1з сайетае, масла Ртутпезшт ратуит, масла Те1газе1т1з с1ий. масла Те1газе1т1з зиесюа, масла 1зосйтуз1з да1Ьаиа, масла МапиосЫогорз1з зайпа, масла Войуососсиз Ьтаипй, масла ОипайеПа 1ег11о1ес(а, масла ЫаииосШопз зрешез, масла 8риийпа зрешез, масла СИоторйу сеазе (зеленой водоросли) и масла Васййаторйу, масла канолы, касторового масла, кокосового масла, масла кориандра, кукурузного масла, хлопкового масла, масла лещины рогатой, льняного масла, масла пенника лугового, оливкового масла, пальмового масла, масла пальмовых зерен, арахисового масла, масла семян рапса, масла отрубей риса, масла сафлора красильного, масла горной камелии, соевого масла, масла семян подсолнечника, таллового масла, масла йиЬакк разнообразных природных масел, обладающих измененными составами жирных кислот из-за генетически модифицированных организмов (ГМО) или традиционных сортов, таких как с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты, или низконасыщенных масел (масла канолы с высоким содержанием олеиновой кислоты, соевого масла с низким содержанием линоленовой кислоты или масел подсолнечника с высоким содержанием стеариновой кислоты); животных жиров (сала, шпика, полутвердого жира и жира цыплят), масел рыб (масла талеихтиса, рыбьего жира, масла хоплостета, масла сардин, масла сельди и масла американской сельди) или смесей любых из указанных выше. Жир или масло с более низкой насыщенностью, полученные таким образом, могут быть использованы в пищевых продуктах или в продуктах хлебопечения, жарения или кулинарии, включающих масла или жиры с более низким содержанием жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, олеиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановой кислоты) и т.д., обработанные с использованием композиции или способа, предлагаемых в настоящем изобретении.

В одном варианте осуществления метод очистки смазочного агента включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей гидролазу, (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемой в настоящем описании; (Ь) обеспечение смазочного агента; (с) обработка смазочного агента гидролазой в условиях, когда гидролаза, (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может избирательно гидролизовать масла в смазочном агенте, тем самым очищая его. Смазочный агент может представлять собой смазочное масло для гидравлических систем.

В одном варианте осуществления метод обработки ткани включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемой в настоящем описании, где гидролаза может избирательно гидролизовать сложные эфиры карбоновой кислоты; (Ь) обеспечение ткани; (с) обработка ткани гидролазой в условиях, когда гидролаза может избирательно гидролизовать сложные эфиры карбоновой кислоты, тем самым осуществляя обработку ткани. Обработка ткани может включать улучшение ткани на ощупь и исправление складок конечной ткани, окраску, получение огнезащитного состава, получение гидрофобности, получение оптической яркости или получение прорезиненной обработки. Ткань может включать хлопок, вискозу, искусственный шелк, лиоцелл, льняное полотно, льняную ткань, волокно рами, все их сочетания или их сочетания с полиэфирами, шерстью, полиамидными акриловыми волокнами или полиакриловыми волокнами. В одном варианте осуществления гидролаза, предлагаемая в настоящем описании, включаемая в ткань, пряжу или волокно, может быть адсорбирована, абсорбирована или иммобилизована на поверхности ткани, пряжи или волокна.

В одном варианте осуществления метод удаления или снижения количества пищевых или масляных

- 12 020145 пятен включает контактирование гидролазы, (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании, с пищевыми или масляными пятнами в условиях, когда гидролаза может гидролизовать масло или жир в пятне. Гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может иметь повышенную стабильность в отношении денатурации под действием поверхностно-активных веществ и тепловой инактивации. Гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемая в настоящем описании, может содержаться в детергенте или растворе для стирки.

В одном варианте осуществления диетическая композиция включает гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании. Диетическая композиция может дополнительно включать питательную основу, включающую жир. Гидролаза может быть активирована с помощью соли желчной кислоты. Диетическая композиция может дополнительно включать состав для детей на основе коровьего молока. Гидролаза может гидролизовать длинноцепочечные жирные кислоты.

В одном варианте осуществления метод снижения содержания жира в молоке или диетических композициях на основе растений включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемый в настоящем описании; (Ь) обеспечение композиции, включающей молоко или растительное масло; (с) обработка композиции со стадии (Ь) гидролазой в условиях, когда гидролаза может гидролизовать масло или жир в композиции. В одном варианте осуществления диетическая композиция для человека и нежвачных животных включает питательную основу, где основа включает жир и немного гидролазы или ее отсутствие, и эффективное количество гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании, для увеличения всасывания жира и роста человека или нежвачного животного.

В одном варианте осуществления метод катализа реакции переэтерификации для получения новых триглицеридов включает следующие стадии: (а) обеспечение композиции, включающей полипептид (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемый в настоящем описании, где полипептид может катализировать реакцию переэтерификации; (Ь) обеспечение смеси триацилглицеридов и свободных жирных кислот; (с) обработка смеси со стадии (Ь) полипептидом в условиях, когда полипептид может катализировать обмен свободных жирных кислот с ацильными группами триацилглицеридов, тем самым продуцируя новые триацилглицериды, обогащенные добавленными жирными кислотами. Полипептид может представлять собой 8и1,3-специфичную липазу.

В одном варианте осуществления метод переэтерификации для получения масла, имеющего низкое содержание транс-кислот и низкое содержание жирных кислот с промежуточными цепями, включает следующие стадии: (а) обеспечение смеси для реакции переэтерификации, включающей материал источника стеариновой кислоты, выбранный из группы, состоящей из стеариновой кислоты, моноэфиров стеариновой кислоты с одноатомными спиртами низкой молекулярной массы и их смесями; (Ь) обеспечение жидкого растительного масла; (с) обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании, где полипептид включает 1,3-специфичную липазную активность; (ά) переэтерификация материала источника стеариновой кислоты и триацилглицерида растительного масла; (е) отделение компонентов переэтерифицированных свободных жирных кислот от компонентов триглицеридов смеси для переэтерификации с получением переэтерифицированного продукта маргаринового масла и смеси жирных кислот, включающей жирные кислоты, моноэфиры жирных кислот или их смеси, выделенной из растительного масла; (ί) гидрогенизация смеси жирных кислот. В одном варианте осуществления метода переэтерификации реакция переэтерификации продолжается до тех пор, пока существует достаточное равновесие эфирных групп в 1-, 3-положениях глицеридного компонента с неглицеридными компонентами жирных кислот реакционной смеси.

В одном варианте осуществления метод получения композиции, включающей 1-пальмитоил-3стеароил-2-моноолеин (ΡΟδΐ) и 1,3-дистеароил-2-моноолеин (δΐΟδΐ), включает обеспечение полипептида (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемого в настоящем описании, где полипептид как 1,3-специфичная липаза способен катализировать переэтерификацию 1,3-дипальмитоил2-моноолеина (ΡΟΡ) со стеариновой кислотой или тристеарином, и контактирование указанного полипептида с композицией, включающей указанный ΡΟΡ, в присутствии источника стеарина, такого как стеариновая кислота или тристеарин, с получением продукта, обогащенного 1-пальмитоил-3-стеароил-2моноолеином (ΡΟδΐ) или 1,3-дистеароил-2-моноолеином (δΐΟδΐ).

В одном варианте осуществления метод ослабления или предотвращения токсичности, опосредованной липополисахаридом (ЬР8), включает введение больному фармацевтической композиции, включающей гидролазу (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), предлагаемую в настоящем описании. В одном варианте осуществления метод детоксикации эндотоксина включает контактирование эндотоксина с гидролазой (например, липазой, сатуразой, пальмитазой и/или стеаратазой), предлагаемой в настоящем описании. В одном варианте осуществления метод дезацетилирования 2'- или 3'цепи жирной кислоты в липиде А включает контактирование липида А с полипептидом, предлагаемым в настоящем описании.

- 13 020145

В одном варианте осуществления методы изменения субстратной специфичности или субстратной предпочтительности фермента родительской липазы (гидролазы жирных кислот), обладающей аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2, включают стадию создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более мутаций аминокислотных остатков в 8Е0 ΙΌ N0:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, создавая тем самым новый гидролазный фермент, обладающий модифицированной аминокислотной последовательностью и измененной субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью по сравнению с родительской липазой (гидролазой жирных кислот), ферментом с 8Е0 ΙΌ N0:2. В одном аспекте субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла или субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла.

В одном аспекте модифицированная аминокислотная последовательность (по сравнению с родительской 8Е0 ΙΌ N0:2) включает модификацию по меньшей мере одной аминокислоты А48С; Ό49Κ.; Ό61Α; Ό61Ε; В72Е; К.72К; У83М; Κ.85Υ; Е95К; Е116А; Ε116Ι; Е116Ь; Е116^ Е116р; Е116В; Е116Т; Е116У; 8133Α; Α144Ι; Е149Н; Α150Ι; Ι1516; Ι151Α; Р162О; Р162К; У163В; Ό164Β; К.172Н; В172Ь или Α2258 либо их эквивалентов или их сочетаний и/или модификацию по меньшей мере одного кодона (ОСО) 35(6СТ); (600)45(60Α); (ОСО)92(ОСТ), (ОТО)102(ОТТ); (ΑΟΟ)108(ΑΟΤ); (СТ6)117(СТТ); (СТ6)124(ТТ6); ^6Ο)126(Α6Ο); (ОТС)128(ОТО); ^61)133^01); (ТТС)135(ТТТ); (ОТО)183(ОТТ); (ЛСС.')188(ЛСС) или их эквивалентов либо их сочетаний, и субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла. В одном аспекте модифицированная аминокислотная последовательность (по сравнению с родительской 8Е0 ΙΌ N0:2) включает Ι20Ε; У628; 677Р; У83С; Ό88Η; Υ1136; Е116Т; Е1166; Н140К; К1468; Ι1678; Ь180Е; Е194М; Α211Ρ; 8212Υ; 6215С; 6215У; С215\У; А218Н; Α2188; Υ223Α; А225М; Α225Ρ или их сочетание, и субстратная специфичность или предпочтение субстратов нового фермента липазы (гидролазы жирных кислот) включает предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла.

В одном варианте осуществления методы получения фермента, обладающего субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, включают стадии (а) обеспечения фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, где фермент родительская гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) обладает последовательностью, предлагаемой в настоящем описании; и (Ь) создания по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), где модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, создавая тем самым фермент, обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла.

В одном варианте осуществления методы получения фермента, обладающего субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла, включают стадии (а) обеспечения фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз стеариновой кислоты из масла, где фермент родительская гидролаза (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) обладает последовательностью, предлагаемой в настоящем описании; и (Ь) создания по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), где модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, как представлено в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, создавая тем самым фермент, обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный или повышенный гидролиз стеариновой кислоты из масла.

В одном варианте осуществления методы получения фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, включают стадии (а) обеспечения последовательности фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемой в настоящем описании; (Ь) создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более мутаций остатков оснований в нуклеиновой кислоте, где мутации соответствуют тем изменениям последовательностей, которые представлены в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и (с) тестирования активности вновь полученного фермента на субстратную специфичность или субстратную предпочтительность, включающие предпоч

- 14 020145 тительный гидролиз конкретной жирной кислоты, тем самым получая новый фермент гидролазу жирных кислот (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты. В одном аспекте фермент гидролаза жирных кислот (например, липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза) включает последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0:2. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.

В одном варианте осуществления методы получения фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), обладающей субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, включают стадии (а) обеспечения кодирующей фермент последовательности нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании; (Ь) создания (вставки) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более мутаций остатков оснований в нуклеиновой кислоте, где мутации соответствуют тем изменениям последовательностей, которые представлены в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и (с) экспрессии полученной нуклеиновой кислоты для получения нового фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), тем самым получая фермент гидролазу жирных кислот (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), обладающий субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающими предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты.

В одном аспекте последовательность, кодирующая фермент гидролазу жирных кислот (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), включает последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:1. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту. В одном аспекте специфическим субстратом или предпочтительным субстратом нового фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) является пальмитиновая кислота по сравнению с субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью в отношении стеариновой кислоты у родительского фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) или специфическим субстратом или предпочтительным субстратом нового фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) является стеариновая кислота по сравнению с субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью в отношении пальмитиновой кислоты у родительского фермента гидролазы жирных кислот (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы).

В одном варианте осуществления липазы включают аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:2, но включают также модификацию, по меньшей мере, аминокислотного остатка А48С; Ό49Β; Ό61Α; Ό61Ε; В72Е; В72К; У83М; Β85Υ; Е95К; Е116А; Ε116Ι; Е116Ь; Ε116Ν; Е116Ц; Е116В; Е116Т; Е116У; 8133Α; Α144Ι; Е149Н; Α150Ι; 11510; Ι151Α; Р162О; Р162К; У163В; Ό164Β; К472Н; К172Ь или Α2258 либо его эквивалента или их сочетаний и/или модификацию по меньшей мере одного кодона (ОСО)35(ОСТ); (600)45(60Α); (ОСО)92(ОСТ), (ОТО)102(ОТТ); (ΑΟΟ)108(ΑΟΤ); (СТ0)117(СТТ); (СТО)124(ТТО); ^60)126(Α60); (ОТС)128(ОТО); (Α6Γ)133(ΤΟΤ); (ТТС)135 (ТТТ); (ОТО)183(ОТТ); (АСС)188(ΑС6) или его эквивалента либо их сочетания. В одном варианте осуществления липазы включают аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:2, но включают также модификацию, по меньшей мере, аминокислотного остатка 120Ь; У628; О77Р; У83С; Ό88Η; Υ1130; Е116Т; Е1160; Н140К; К1468; Ι1678; Ь180Е; Е194М; Л211Ц; 8212Υ; О215С; О215У; О215№; А218Н; Α2188; У223Α; А225М; Α225Ρ или их сочетания.

В одном аспекте субстратная специфичность или субстратная предпочтительность новой липазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз жирной кислоты из масла по сравнению с родительской 8Е0 ΙΌ N0:2. В одном аспекте жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.

Подробности предлагаемых в настоящем описании одного или более вариантов осуществления представлены на сопровождающих чертежах и описании ниже. Другие предлагаемые в настоящем описании черты, цели и преимущества должны быть ясны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения.

Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности ОеиВаик и депозиты АТСС, цитируемые в настоящем описании, включены, таким образом, определенно в качестве ссылки для всех целей.

Описание чертежей

Следующие чертежи представляют собой иллюстрацию вариантов осуществления, предлагаемых в настоящем описании, и не предназначены для ограничения объема или формулы изобретения.

Файл патента или заявки содержит по меньшей мере одну фигуру, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветной(ми) фигурой(ами) будут предоставлены учреждением по запросу и при оплате необходимого денежного сбора.

На фиг. 1 представлена блок-схема компьютерной системы.

- 15 020145

На фиг. 2 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей, для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных.

На фиг. 3 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса сравнения в компьютере, для определения, являются ли две последовательности гомологичными.

На фиг. 4 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один аспект процесса идентификации 300, для определения присутствия особенности в последовательности.

На фиг. 5 представлен иллюстративный метод, предлагаемый в настоящем описании, включающий использование липаз, предлагаемых в настоящем описании, для обработки липида, например липида из соевого масла, для избирательного гидролиза пальмитиновой кислоты с получением соевого масла со сниженным содержанием пальмитиновой кислоты.

На фиг. 6а проиллюстрировано влияние иллюстративных мутаций ΟδδΜ^8Μ пальмитазы на гидролиз пальмитата и стеарата относительно родительской 8Ε0 ΙΌ N0:2, как подробно обсуждается в примере 4 ниже. На фиг. 6Ь проиллюстрировано влияние иллюстративных мутаций ΟδδΜ^8Μ стеаратазы на гидролиз пальмитата и стеарата относительно родительской 8ЕЦ ΙΌ N0:2, как подробно обсуждается в примере 4 ниже.

На фиг. 7 представлена 8ЕЦ ΙΌ N0:2 с конкретными положениями мутаций пальмитата и стеарата, представленными жирным шрифтом заглавных букв. Подчеркнутые мутации (например, 61А, Е) представляют собой альтернативные положения аминокислотных остатков (альтернативные последовательности для альтернативных вариантов осуществления) для улучшенного гидролиза пальмитата. Мутации, выделенные курсивом (например, 20Ь), представляют собой альтернативные положения аминокислотных остатков (альтернативные последовательности для альтернативных вариантов осуществления) для улучшенного гидролиза стеарата. Положение 116 представляет собой альтернативное положение мутированного аминокислотного остатка (альтернативная последовательность для альтернативного варианта осуществления) для улучшенного гидролиза как пальмитата, так и стеарата.

На фиг. 8 представлены данные подтверждающего анализа соевого масла для отобранных клонов из пальмитазной библиотеки.

Сходные опорные символы на различных чертежах указывают на сходные элементы.

Подробное описание

Альтернативные варианты осуществления включают полипептиды, включающие липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, кодирующие их полинуклеотиды и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Альтернативные варианты осуществления включают полипептиды, например ферменты, обладающие гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая термостабильную и термоустойчивую гидролазную активность, и кодирующие эти ферменты полинуклеотиды, а также получение и применение этих полинуклеотидов и полипептидов. Гидролазная активность полипептидов и пептидов, предлагаемых в настоящем описании, включает липазную активность (гидролиз липидов), реакции переэтерификации, синтез сложных эфиров, реакции взаимопревращений сложных эфиров, активность ацилгидролазы липидов (ЬАН) и сходную ферментативную активность. Для целей этой патентной заявки реакции переэтерификации могут включать реакции кислотного гидролиза (включающие реакцию жирной кислоты и триацилглицерида), гидролиза спиртов (включающие реакцию спирта и триацилглицерида), гидролиза глицерина (включающие реакцию глицерина и триацилглицерида) и реакции трансэтерификации (включающие реакцию сложного эфира и триацилглицерида). Полипептиды и пептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы в разнообразных вариантах фармацевтической, сельскохозяйственной промышленности и промышленном производстве, включая производство косметики и нутрицевтиков. В другом аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, используются для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов.

В определенных вариантах осуществления ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть высокоселективными катализаторами. Они могут обладать способностью катализировать реакции со стерео-, регио- и химиоселективностью, что невозможно в традиционной синтетической химии. В одном варианте осуществления ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть многофункциональными. В различных аспектах они могут функционировать в органических растворителях, действовать при экстремальных величинах рН (например, высоких рН и низких рН), экстремальных температурах (например, высоких температурах и низких температурах), экстремальных уровнях солености (например, высокой солености и низкой солености) и катализировать реакции с соединениями, которые структурно не родственны их природным, физиологическим субстратам.

В одном аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, включают гидролазы, обладающие липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, и могут быть использованы, например, в биокаталитическом синтезе структурных липидов (липидов, которые содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на остове глицерина), включая любое растительное масло, например масло канолы, соевое масло, альтернативы соевому маслу, альтер

- 16 020145 нативы маслу какао (СВА), 1,3-диацилглицериды (ПАС). 2-моноацилглицериды (МАС) и триацилглицериды (ТАС), такие как 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (РОР), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (81081), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерин (Р081) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерин (ОММ), полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, докозагексаеновая кислота (ОНА) и эйкозапентаеновая кислота (ЕРА).

В определенном варианте осуществления предлагаемые в настоящем описании ферменты и методы могут быть использованы для удаления, добавления или обмена любой жирной кислоты в композиции, например получения масла с более низким содержанием насыщенных жирных кислот (например, масла низкой насыщенности) или с содержанием отличных жирных кислот (например, превращая масло, включающее насыщенные жирные кислоты, в масло, включающее альтернативные ненасыщенные жирные кислоты).

Примеры насыщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или реорганизованы в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают уксусную: СН₃СООН, масляную: СН₃(СН₂)₂С00Н, капроновую: СН₃(СН₂)₄СООН, каприловую: СН₃(СН₂)₆СООН, каприновую: СН₃(СН₂)₈СООН, ундекановую: СН₃ (СН₂)₉СООН, лауриновую (додекановую кислоту): СН₃(СН₂)1₀СООН, миристиновую (тетрадекановую кислоту): СН₃(СН₂)1₂С00Н, пентадекановую: СН₃(СН₂)1₃С00Н, пальмитиновую (гексадекановую кислоту): СН₃(СН₂)1₄СООН, маргариновую: СН₃(СН₂)₁₅СООН, стеариновую (октадекановую) : СН₃(СН₂)₁₆СООН, арахиновую (эйкозановую кислоту): СН₃(СН₂)₁₈С00Н, бегеновую: СН3(СН2)20СООН.

Примеры омега-3-ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или реорганизованы в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают α-линоленовую (АЬА):

СН₃СН₂СН=СНСН₂СН=СНСН₂СН=СН(СН₂)₇СООН, стеараиадоновую (октадекатетраеновую): СН3СН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)4СООН, эйкозапентаеновую (ЕРА):

СН3СН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН (СН2)3СООН, докозагексаеновую (ОНА):

СН3СН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)2СООН.

Примеры омега-6-ненасьщенных жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или реорганизованы в липиде, например масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают линолевую (9,12-октадекадиеновую кислоту):

СН3(СН2) 4СН=СНСН2СН=СН(СН2)7СООН, гамма-линолевую (6,9,12-октадекатриеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)4СООН, эйкозадиеновую (11,14-эйкозадиеновую кислоту): СН3 (СН2) 4СН=СНСН2СН=СН (СН2)9СООН, дигомо-гамма-линоленовую (8,11,14-эйкозатриеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)6СООН, арахидоновую (5,8,11,14-эйкозатетраеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)3СООН, докозадиеновую (13,16-докозадиеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СН(СН2)11СООН, адреналовую (7,10,13,16-докозатетраеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)5СООН, докозапентаеновую (4,7,10,13,16-докозапентаеновую кислоту): СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)2СООН.

- 17 020145

Примеры омега-9-жирных кислот, которые могут быть удалены, добавлены или реорганизованы в липиде, например в масле, с использованием фермента или с помощью применения методов, предлагаемых в настоящем описании, включают олеиновую (9-октадеценовую кислоту):

СН₃(СН₂)₇СН=СН(СН₂)₇СООН, эйкозеновую (11-эйкозеновую кислоту):

СН₃(СН₂)₇СН=СН(СН₂)₉СООН, медовую (5,8,11-эйкозатриеновую кислоту): СНз(СН2)7СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)зСООН, эуриновую (13-докозеновую кислоту):

СНз(СН2)7СН=СН(СН2)_пСООН, ацетэруковую (15-тетракозеновую кислоту):

СНз(СН2)7СН=СН(СН2)1зСООН, пальмитолеиновую:

СН_з(СН₂)₇СН=СН(СН₂)₅СООН.

В одном аспекте в настоящем описании предлагаются новые классы липаз, обозначаемых сатуразами, например пальмитазами и стеаратазами. Термин стеаратаза, как ранее использовалось в литературе, описывает фермент, который осуществляет насыщение конкретных связей в метаболическом пути, например гидрирование двойной связи (Моке, е1. а1., 1. ΒίοΙ. Скет., 2005, 280 (з0):27815-27825). Однако в настоящем описании предлагаются новые, не описанные ранее сатуразы, где сатуразы, описанные в настоящем описании, гидролизуют сложные эфиры насыщенных жирных кислот, где гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов.

В настоящем описании предлагаются также не описанные ранее пальмитазы и стеаратазы, где пальмитазы и стеаратазы гидролизуют пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту соответственно, например, из каркаса глицерина. Описанные в настоящем документе сатуразы могут также обозначаться как гидролазы насыщенных жирных кислот. Сходно, пальмитазы, описанные в настоящем документе, могут также обозначаться как гидролазы пальмитата, и стеаратазы, описанные в настоящем документе, могут также обозначаться как гидролазы стеарата.

В другом аспекте сатуразы, описанные в настоящем документе, избирательно гидролизуют по меньшей мере 60, 61, 62, бз, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7з, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 8з, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 9з, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% насыщенных жирных кислот. В другом аспекте пальмитазы, описанные в настоящем документе, избирательно гидролизуют жирные кислоты, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 6з, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7з, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 8з, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 9з, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту. В другом аспекте стеаратазы, описанные в настоящем документе, избирательно гидролизуют жирные кислоты, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 6з, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7з, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 8з, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 9з, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.

В одном аспекте, как проиллюстрировано на фиг. 5, с помощью методов использования фермента, предлагаемого в настоящем описании, можно обрабатывать липид, например липид из соевого или другого растительного масла, для избирательного гидролиза насыщенной жирной кислоты, например пальмитиновой или стеариновой кислоты (например, из масла, содержащего эти насыщенные жирные кислоты), с получением низко (или более низко) насыщенного масла, например восстановленного пальмитинового масла, такого как восстановленное пальмитиновое растительное масло, например восстановленное пальмитиновое соевое масло. Предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть также использованы для избирательного гидролиза любой жирной кислоты, особенно насыщенных жирных кислот из каркаса глицерина с получением низко (или более низко) насыщенного масла, включая избирательный гидролиз насыщенной жирной кислоты, например пальмитиновой кислоты или стеариновой кислоты, в положениях 8и1 или 8и2 каркаса глицерина в дополнение к гидролизу в положении 8пз (например, гидролиз пальмитиновой кислоты в положении 8пз проиллюстрирован на фиг. 5).

В одном аспекте предлагаются примеры синтеза триглицеридов, масел или жиров низкой насыщенности. В этом примере синтеза могут использоваться либо свободные жирные кислоты, либо сложные эфиры жирных кислот в зависимости от используемого фермента. В одном аспекте гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, предлагаемые в настоящем описании, используются для удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот, таких как уксусная кислота, масляная кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, ундекановая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пентадекановая кислота, пальмитиновая кислота, маргариновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота или бегеновая кислота, из триглицерида, масла или жира. В одном аспекте удаленные или гидролизованные жирные кислоты заменяют жирными кислотами с улучшенными преимуществами для здоровья (такими как пониженная корреляция с сердечно-сосудистым заболеванием) или с улучшенными химическими свойствами (такими как стабильность к окислению или реакци

- 18 020145 онная способность) либо с улучшенными физическими свойствами (такими как точка плавления или вкусовое ощущение). В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-3ненасыщенные жирные кислоты, такие как α-линоленовая кислота, стеаридоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) или докозагексаеновая кислота (ΌΗΑ), или ПНЖК, или жирные кислоты масел рыб. В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-6-ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота, гамма-линолевая кислота, эйкозадиеновая кислота, дигомо-гаммалиноленовая кислота, арахидоновая кислота, докозадиеновая кислота, адреналовая кислота или докозапентаеновая кислота. В одном аспекте добавляемыми жирными кислотами являются омега-9ненасыщенные жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, эйкозеновая кислота, медовая кислота, эуриновая кислота, ацетэруковая кислота, пальмитолеиновая кислота. В одном аспекте добавляемые жирные кислоты (например, омега-3, омега-6 или омега-9) добавляют путем взаимодействия жирных кислот с триглицеридами, маслом или жиром после удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот с помощью гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, предлагаемых в настоящем описании. В одном аспекте добавляемые жирные кислоты (например, омега-3, омега-6 или омега-9) добавляют в результате взаимодействия сложных эфиров жирных кислот или этиловых или метиловых эфиров с триглицеридами, маслом или жиром после удаления или гидролиза насыщенных жирных кислот с помощью гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, предлагаемых в настоящем описании. В одном аспекте взаимодействие с добавляемыми жирными кислотами (например, омега3, омега-6 или омега-9) катализируется с помощью гидролазы или липазы, таких как неспецифичная липаза (включая нерегиоспецифичную и не специфичную для жирных кислот), или 8п1,3-специфичная липаза, или 8п1-специфичная липаза, или 8п3-специфичная липаза, или 8п2-специфичная липаза, или липаза, специфичная для жирных кислот.

Способы и композиции (гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения нутрицевтиков (например, полиненасыщенных жирных кислот и масел), различных пищевых продуктов и пищевых добавок (например, эмульгаторов, заменителей жира, маргаринов и бутербродных паст), косметики (например, эмульгаторов, кремов), фармацевтических агентов и агентов для доставки лекарств (например, липосом, таблеток, составов) и добавок в корма для животных (например, полиненасыщенных жирных кислот, таких как линоленовые кислоты). В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании липазы могут действовать на сложные эфиры флуорогенных жирных кислот (ЖК), например умбеллифериловые сложные эфиры ЖК. В одном аспекте профили специфичности в отношении ЖК липаз, полученных или модифицированных с помощью методов, предлагаемых в настоящем описании, могут быть получены путем измерения их относительных активностей на серии умбеллифериловых сложных эфиров ЖК, таких как пальмитат, стеарат, олеат, лаурат, ПНЖК или бутират.

В одном аспекте полипептид (например, антитело или фермент, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза), предлагаемый в настоящем описании для этих реакций, иммобилизован, например, как описано ниже. В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании методы не требуют органического растворителя, могут протекать с относительно высокими скоростями реакций; см., например, патенты США № 5552317; 5834259.

В определенных вариантах осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для гидролиза (включая избирательный гидролиз) масел, таких как масло рыб, животные и растительные масла, и липидов, таких как полиненасыщенные жирные кислоты. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании полипептиды используются для получения масел низкой насыщенности, например, с помощью удаления (гидролиза) по меньшей мере одной жирной кислоты из масла; и гидролиз может представлять собой избирательный гидролиз, например удаление только конкретной жирной кислоты, такой как пальмитиновая, стеариновая или другая насыщенная жирная кислота, или удаление жирной кислоты именно из одного положения, например 8п1, 8п2 или 8п3. В одном аспекте полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, используются для обработки жирных кислот (таких как полиненасыщенные жирные кислоты), например жирные кислоты масла рыб, например, для применения в пищевых продуктах или пищевых добавках или в виде них, или для кулинарии, жарения, хлебопечения, или в виде пищевого масла. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для избирательного гидролиза насыщенных сложных эфиров по сравнению с ненасыщенными сложными эфирами в кислотах или спиртах. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для обработки латексов для различных целей, например для обработки латексов, используемых в композициях для фиксации волос для удаления неприятных запахов. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для лечения дефицита липазы у животного, например млекопитающего, такого как человек. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения смазочных агентов, таких как

- 19 020145 смазочные масла для гидравлических систем. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения и использования детергентов. В другом варианте осуществления методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы в процессах химической обработки тканей, волокон или пряжи. В одном аспекте методы и композиции (липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для получения огнезащитного состава, используемого в ткани, например галогензамещенной карбоновой кислоты или ее сложного эфира, т.е. фторированной, хлорированной или бромированной карбоновой кислоты или ее сложного эфира. В одном аспекте предлагаются методы создания липаз из библиотек окружающей среды.

В одном варианте осуществления гидролазы, предлагаемые в настоящем описании, охватывают полипептиды (например, антитела, ферменты) и пептиды (например, активные сайты), обладающие какой-либо гидролазной активностью, т.е. полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут иметь любую гидролазную активность, включая, например, липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В другом варианте осуществления гидролазы, предлагаемые в настоящем описании, включают все полипептиды, обладающие какой-либо липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, включая активность синтеза липидов или гидролиза липидов, т.е. полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут иметь любую липазную, сатуразную, пальмитазную и/или стеаратазную активность. В другом варианте осуществления липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, предлагаемые в настоящем описании, включают ферменты, активные в отношении биопревращения липидов путем реакций каталитического гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза. В одном аспекте гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании, могут гидролизовать эмульсии липидов. В одном аспекте ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут действовать предпочтительно на связи 8п1. 8и2 и/или 8и3 триацилглицеридов с высвобождением одной или более жирных кислот из каркаса глицерина. Например, гидролазная, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, включает синтез масла какао, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), 1,3-диацилглицеридов (ΌΑΟ), 2-моноацилглицеридов (МАС) и триацилглицеридов (ТАС). В другом варианте осуществления липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, также включает продукцию масел низкой насыщенности, например масла сои или канолы, путем удаления жирной кислоты, например пальмитиновой, олеиновой, лауриновой или стеариновой кислоты. В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании ферменты могут также гидролизовать и/или изомеризовать связи при высоких температурах, низких температурах, щелочных рН и кислых рН. В одном аспекте гидролаза, например липаза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой сатуразу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой насыщенную жирную кислоту, такую как уксусная кислота, масляная кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или арахиновая кислота. В одном аспекте гидролаза, например липаза или сатураза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой пальмитазу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой пальмитиновую кислоту. В одном аспекте гидролаза, например липаза или сатураза, предлагаемая в настоящем описании, представляет собой стеаратазу, которая катализирует реакции гидролиза, гидролиза спиртов, кислотного гидролиза, этерификации и аминолиза, где карбоновая или жирная кислота в образованной или прореагировавшей молекуле представляет собой стеариновую кислоту.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются ферменты, включающие варианты ферментов гидролаз (например, вариант липазы, вариант сатуразы, вариант пальмитазы или вариант стеаратазы), предлагаемые в настоящем описании; эти ферменты могут иметь аминокислотную последовательность, которая происходит от аминокислотной последовательности предшественника. Предшественник может включать природную гидролазу и/или рекомбинантную гидролазу. Аминокислотная последовательность варианта гидролазы происходит от аминокислотной последовательности предшественника гидролазы в результате замены, делеции или вставки одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность предшественника. Такая модификация осуществляется в последовательности ДНК предшественника, которая кодирует аминокислотную последовательность предшественника липазы, а не за счет манипуляции с самим предшественником фермента гидролазы. Подходящие методы для такой модификации последовательности ДНК предшественника включают методы, раскрытые в настоящем описании, а также методы, известные специалистам в данной области техники.

Получение нуклеиновых кислот и манипуляции с ними.

В одном аспекте в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, включая экспрессион

- 20 020145 ные кассеты, такие как экспрессионные векторы, кодирующие полипептиды (например, гидролазы, такие как липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). В другом аспекте в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, обладающие последовательностью, представленной 8ЕР ΙΌ N0:1, и имеющие по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены остатков оснований, как описано в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23 (или их эквиваленты). В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, обладающие последовательностью, представленной 8ЕР ΙΌ N0:2, и имеющие по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более или все замены аминокислотных остатков, как описано в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23 (или их эквиваленты).

8Ер ΙΌ N0:1

АТССТСАААСССССТСССТАСССАСбССТССТСССССААСТеССССАТАТСССССССА

ТССТСАССССАСССТТССССОССССТСССААААТССССАААСТЗССССАТЗСССАСССССТАС

ТССТССТСССССССТТССТСССССАССАСААССССАССТСССТбСТОСССААСАССТТССАТС

ТСССССССТТТСССТСТТСССССТСССААСССС6СТТСААССТССССАТТССТССССАССТСС

Т6САССЗССТССТССАСССССТССССССССТСТСССАССС6СССССТССТСАСААССТСАТСС

ТССТССССТС6АСССТССССССССТСТАТСССССССАССТСС6ССАСААССССССССААСТСА

ТСССОАТССТССТСАСССТССССАСТСССТТССССССССАССТССАССССААССАТСССТССА

АСАТСТАССАССС6АТСААСАСССАСАСССТССАСААССТССССАТСССССТССАТТТССАСА

ТТААССССССССТССССАССАТСССССТСТССТССССССТССАСССССТ66ТСССССС6САСА

ССТСССААСССТССССССАССАСТСдСАССАСССССТАОАССТСССССТСАСССАСАТСБССТ

ТТСССССАТССААСАСССССССССАСССТСТССТСССССТССТСССССССССССТСТАС

8Ер ΙΌ N0:2 (кодируемая 8Ер ΙΌ N0:1):

1-буквенный код

МЬКРРРУСКЬЬРЕЬАОРРАЬУТАРЕКСААКМСКЬАОСЕРУЬУЬРСГЬАЕОКАТЗУЬКК

ТЕОУАСГАСЗбИЕКСГМЬбЬНСОЬУОРЬУОКЬКАУЗЕААССОКУТУУСИЗЬССЬУАРЕЬСНКА

ΡΕΕΙΚΜννΤΕ(33ΡΓΑΘ0ΕΗΑΝΗΑΜΚΙΥΕΑΙΝ3ΗΤν0ΝΕΡΙΡν0Εζ)ΙΚΡΡνΚΤΙΑννί5ΡΕ0(3νν

АРЕТЗЕСЗРЕСЗОЕКЬЕЬАУТНМСГААЗКТСАЕАУУРЬУААКЬ3-буквенный код

Мер

Ьеи

Ьуз

Рго

Туг

С1у

Агд

Ьеи

Агд

С1и

Ьеи

А1а

Азр

Не

Рго

А1а

Ые

Уа1

ТЬг

А1а

Рго

РЬе

Агд

С1у

А1а

Ьуз

МеЕ

С1у

Ьуз

Ьеи

А1а

Азр

С1у

С1и

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Ьеи

Рго

С1у

РЬе

Ьеи

А1а

Азр

Азп

А1а

ТЬг

Зег

Уа1

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

РЬе

Азр

Уа1

А1а

С1у

РЬе

А1а

Суз

Зег

С1у

Тгр

С1и

Агд

С1у

РЬе

Азп

Ьеи

С1у

Ые

Агд

С1у

Азр

Ьеи

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

Агд

А1а

Уа1

Зег

С1и

А1а

С1у

С1п

Ьуз

Уа1

Ые

Уа1

С1у

Тгр

Зег

Ьеи

С1у

Ьеи

Туг

А1а

Агд

С1и

Ьеи

С1у

ΗΪ3

Ьуз

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ые

Агд

МеЬ

Уа1

\7а1

ТЬг

Ьеи

С1у

Зег

Рго

РЬе

А1а

С1у

Азр

Ьеи

ΗΪ3

А1а

Азп

ΗΪ3

А1а

Тгр

Ьуз

Ые

Туг

С1и

А1а

11е

Азп

Зег

Низ

ТЬг

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Рго

Ые

Рго

Уа1

Азр

РЬе

С1п

Ые

Ьуз

Рго

Уа1

Агд

ТЬг

Ые

А1а

Уа1

Тгр

Зег

Рго

Ьеи

Азр

С1у

Уа1

А1а

Рго

С1и

ТЬг

Зег

С1и

С1у

Зег

Рго

61и

61п

Зег

Азр

С1и

Агд

Ьеи

61и

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

Мер

С1у

РЬе

А1а

Зег

Ьуз

ТЬг

С1у

А1а

С1и

А1а

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

А1а

8Ер ΙΌ N0:3

А1а Агд Ьеи

АТССССССССАССАССССССССССССССССАААСАСССТСССССССССАТССТСАТСС

СССССТТССТСССССАССАСАСССАСАССАСАССАТТССССССССААСТСССССАСССССССТ

ТСАСССТТСАССССТССССССАССССТССААСАТСССАСССССТССССАСАСССТССАОАААТ

ТСААССССССАСТССАССАСТСС6СТСАТСАССАССССАТССТССТССТССССТССАСТСТСЗ

ССССССТСТАССССАСССАССТСССССССССССАСССССАТСАССТССССССССТССТСАСТС

ТТССТТССССССТСТССССССАССССССССССТАСАССААССТСТССААССТСТАССААТССС

ТССССССТСАСССССТССАССАСССССССАТСССССАСААССАССААААССССССССТССССА

СССТСССТТТСТССТССССССАТСАССССАТССТССССССССССТСССССССССССАСТСАСТ

ТАТСТСАССАСААСССССТССАСАТСССААССАСССАСАТССССТТТСССАТСТСССССААСА ССССАСССТТТСТТСТСССССАСАТССТСААСТТССТСААСААААСССААССТТСССАСТССС АССАТТСА

- 21 020145

8Ер ΙΌ N0:4 (кодируемая 8Ер ΙΌ N0:3)

ΜΑΟΗΟσΑΚσΡΚΟΟΡΡΆΜνίΡΘΕΙΑΗΟΚΗΤΤΗΕΚΒΕΕΑΕΑαΓΚνΗΡΜΚΟΘΡίΝΜΟΑΗΑΟΤ ЪЕКЪККАУОСССНОЕРРЪБУОИЗЬСеЪУАКЕУАКАЕРОСУКАУУТБСЗРУЗСОКЕКУТЫУИКБ ΥΕΜνΑΟΗΡνϋΌΡΡΙ РОКЕЕКРРУРТЪАЪИЗАООС1УСАРЗАРСТ0Ь5НОКАУЕМК.ТЗНМСЕАМ 3ΑΚ3ΑΚΕννΑΕΐνΚΕΣΚΚΤΕ03Ε3ΗΌ

8Ер ΙΌ N0:5

СТСАСССАСАААЗССССАСССААСССААСССАОССЗСТСААССАСАТССССССССТТС

ТСТТССАСЗСЗССТСССАССТТССЗССАТСТСЗЗСССССССЗЗССССААЗСАСЗСТССТССЗЗ

ТСАТС8ТСАТССССС8АТТССТС8С8САССАСТТССАТАССАСССАСТТ8СССССССС8СТС6

ССААСССА6ССТТСССАСТССАТСССТСССЗССАЗСССАТСААССТТССАССССССССССАТА

СЗСТССАААТТСТ8АА8С8ССС8СТС8АТТССТ8С88СТССА8С8А8СССАТ8СТССТС8ТСЗ

ССТССАЗССТССССССТСТСТАТСССССССАСАТСЗССССТССССАСССССАССЗбСТСССЗЗ

СС8Т<38ТЗАС8АТ8<ЗСАТС8СС8СТ8Т86С8ССАССССА88С8СТАСАССААС8ТСТС8ААСС

ТСТАССААСЗСАТТСССЗСССАТСССЗТСЗАСААЗССЗСССАТССССЗАСААЗАСССАЗААСС

ССССЗбТЗСССАСТСТСЗСТТТСТЗСТСССАЗСАТЗАТСЗСАТСЗТССССЗСЗСССТСеСССА 8А88САССАА8ААСАССССССАСААС8СССТССССАТС8АСАССАСТСАСАТС8ССТТТ8ССА ТСТСССССААСАСЗАССССССССЗСАСТЗССТЗАСАТССТСЗССТТТТТСААТСААСТССААЗ 8СССТТС8ТСАСССССССССТСА

8Ер ΙΌ N0:6 (кодируемая 8Ер ΙΌ N0:5)

МЗЕК(ЗАРКСР0РЪКЕ1САЬЬЕНАРКЗЬСНЬСАКСРКОСРРУМУ1РСГЬАНОЪНТТСЬН

РАЬАКАСЕК7НРИКССММЪ6АКАОТБЕ1ЪКНА¥ОЗССЗЗЕРМЬЬУСИЗЪССЪУАКЕ1АКАЕРО ΕνΕΑννΤΜσ8ΡνΜΟΟ№ΚΥΤΝνΜΚΕΥΕΚΙΑ6ΗΡνθΚΡΡΙΡΟΚ30ΚΡΡνΡΊΈΑΙΛί5<2ΗΟΟΐνθΑ Ρ3ΑΚ6ΤΚΚΤΚ0ΚΑνΑΙϋΤΤΗΜ0ΕΑΜ3ΡΚΤΤΗΑΑνΚΕΐν0ΕΕΝΕνΕΘ<333ΡΚΑ

8Ер ΙΌ N0:7

АТСАбССТСССССАСССССССССССТССТАТССССССССТАТССССССТТСССССССС

ТСССССАССССССССССССССАССбСССбССЗСТСАТССТСАТСССССССТТССТССССАССС

АТСССАССАСТТТСССССТССАССЗСЗСССТСОССААСССССССТАСААСЗТЗАССССАТССС

ССАТСССССТСААСАССССССТСАСССААСАСАТАСТССАССССАТСбССССТСССбТССААА

СОТТТССАСССССССССАААСТСАТССТССТССССТССАСССТССССССАСТСТАСССССССС ТССТСССССАССАССССССССАТСТССТССАСААССТССТСАСССТССССТСССССТТТТССС СССАСАССССССССААСААСААТСТСТССССЗСТСТАССАСТТССТС

СССССССАТССССТСААСАССССССССАТССАСААССАСССССАССТСААСССССССС

ТССССАСССТСССТАТСТССТСССССССССАССССАТССТСТСТССССССССССССССССССС

СССАСССАСАСССССАСССССАССТССАССТССАСТЗСАСССАСАТССОСТТТССССТСАССС ССАССССТТАТСССААСАТСбТССАСССССТСССССССТТТССССААААСАТССеТТСССеСТ СА

8ЕР ΙΌ N0:8 (кодируемая 8ЕР ΙΌ N0:7)

МКЪНЕССАЬ73Е<АУРАГСКЬСЕНСРА0С;РРЬМУ1РСГЪАТ0КТТЬСЪ(2КАЪАКССУК7

Τ0Ν0ΜεΒΝ35νΤΕΟΐνθΚΙΑΑΚνΕΚΕεΑΟΚΚνΐΕν61Λ?3Α(3Ο1ΥΑΚννΑΏΕΚΡ0Σν0ΚννΤΒ63

ΡΕ300ΚΚΚΝΝΝνΜΚΕΥΕΕνΑ0ΗΡνΝ3ΡΡΙ0Κ0ΡΕνΚΡΡνΡΤ1ΑΙΜ3ΚΚ0σΐν3ΡΑΘΑΗΘΚΕ6Ε

К0АЕЬЕЪ0СЗНМСЕАУЗАКАУРК1УЕА7КАЕРЕМ1К8К

8Ер ΙΌ N0:9

АТСААССССССССССЗСАТССАТСААСАТСССССАСССССССТСССТССТСССССССТ

ТСТАСССС8С8ТТССССАА8СТССАЗСС8С8С8СССС88С8САСС88СССААССТСАТССТ6А

ТССССССТТТССТССССССССАСАССАССАСССТСССССТССАСССАССССТССССССССЗСС

ССТАСССССТСССССССТССССССТСССССТСААССССССССТТТСССАЗЗАССТССТССАСС

ССАТС88ССАССАА8ТС8С8С88ТТСС8ССССС8ССАСАА8СТ8АТССТ8СТС8(ЗСТССАССС

ТТСССССССТТТАТСССССССТССТСССССАССАССССССССАССТССТССАСААСетССТСА

ССТТССССТСССССТТТТСССССЗАССССССЗСССААСААСААТСТСТССССССТСТАТСАСТ

СССТСССТСЗССАТССЗЗТСААССАТССЗСССАТССАСААССАСССССССААСААСССССССС

ТССССАСССТССССАТСТССТСССССССТСАТСССАТССТСССССТССААССССССССССССС ССССССАССАСССССАТССССАЗСТССАСАТССАТТССАСССАСАТССССТТТССССТСАССС 8САА88С8ТТТСССС8ААТС8ТА8А88СС8Т8АА888СТТСТАА

8Ер ΙΌ N0:10 (кодируемая 8Ер ΙΌ N0:9)

МКРРРСИМК1КЕАС8ЬЪАЕЕ¥НАЕСКЬЕРРСРАОСРКЬМ71РСЕЬАСОКТТЬСЬ0КАЬ

Α888ΥΚνΑ0Μ0Ε0νΝΚ6ν8Ε0νν0ΚΙΟ20νΑΚΓ6Α0ΕΚνΐΑν0Μ8100ΑΥΑΚννΑ(2ΕΚΡ0ΑνΕ

ΚννΤΕΟ3ΡΕ8Ο0ΚΚΚΝΝΝνν?ΚΕΥΕΜνΑΟΗΡνΝΟΡΡΙ0ΚΟΡΑΚΚΡΡνΡΤΕΑΙΝ3ΚΚ0εΐνΑνΕ6

АЕСКРЕЕКОАЕЬЕЮСЗНМСЕСУЗСКАЕРБЦУЕАУКСГ

- 22 020145

8Ер ΙΌ N0:11

СТСТТССТССТСССЗСССТТССТССССААССАССТТСССАСТТСССТТСТССССАССА

СССТСААССССААССССТТТССССССТТССССТСССССААСССТТТСААСТТАССТССАСССС

СССАСАСССТССАСССССТСАССССАССССТССАТССССТССТТСАССААСССеССАСССССС

ТТССАТТСАТССССТССАСССТТСССССССТТТАТСССССАСАССТССССАААСССАССТССС

СТСАССТСТССССАСТСАТСАСССТС6ССАСССССТТСТСССТТСАССТСАСАСССААСААСС

ССТССААССТСТАССАССТСАТСААССАТСАТССТеТССАТСССССТСССТТССАТСТТСАСС

ТССАССССААСССАССССТСССААССТТСССТТТСТССТССССТССССАССССАТССТАСССС

СССССАССССССАССССАТССАСССССАСТТССАССАССССАТССАССТССАСТССАСССАСА

АССАСАТС6ТСАСТСАТСС0САСССССТСТССАССАТС6ТТАССТТССТСССССААААТСТТС

ССТССТСА

8Ер ГО N0:12 (кодируемая 8Ер ГО N0:11)

МЬУЬРАЕЬАМОЬРТ5ЬЬКНТЬКАЫСГНРЕСИАМСЕЫЬСАКРОТЬ0КЬЗАНЬОА7У<2ЕА

СКРУАЫСИЗЬССЬУАКЕЪАКККЗАЕУЗАУГТЬСТРГЗУОЬРРМПАИКЬУЕЫЫОНРУОАРРЪ θν0νϋΑΚΡ₽νΗΤΕΑΕΜ3ΚΚΟΘΐνΑΡΑ3ΑΗ6ΜΕ3ΕΕΟ0ΑΙΕΣ0ΟΤΗΝΕΜν3ΟΡΕΑΕ3ΤΐνΤΕΕΚ

ЕЫУЗЗ

8Ер ГО N0:13

СТСААТАСАССССАССТАТТСААСССАССАСССССААССАТСАСАСТТСТССАПСССА

САССССТССТССАСАТАТССААСАТСАСССССССАТТСССССССТТССТАТТСАААААСААСТ

СССССТСССССАААСААССССТТСТССТААТАССТСССТТТСССССТСАТСАТСССТАСАССТ

СССССТТССССААТТТССТССАСССАСАССССТАТСССАССАСТСССТССССССТССССАССА АСААСССАССТСТСААТАТСССССАТСААСТАТСССАССТССАССССАСАТССААССТААААС ССААСАСССССТАСССТССТСАССССССССТАССТТАССТСАТТСАССССТТСАТССААСССТ ТТСАССААТТСССАТССАСССАТССССААСССАТСССАСТТАТАССТТССАСТСТСССТССТТ ТСАТССССССТСААСТТСССС6АСАССССССАААССАССТСАСТСАССТТАТТАСССТСССТТ СТССТСТСАТСССАСССССААААТАСАСССТСССТССАТССССТТТСАТСССССССАААТАСС АТТТССАСТСССТССАССААСТСАТСССССАСССССААСАТССССССАТТАСТСТТССТАТТА САССААТАСТСАСССАСТСТСАТСССАТССТСССАТАТТСАСССССААТССАТСАССАСАСТС ССССТСТССАССАТТТАСАТАТССАТСТТССССАТТТССССТТТССТТАСААСАССАСССТТТ ССТСАСАААТССССААТССССТСААСТСТТТАСАССТССАСААССАСССТСТТТАС

8Ер ГО N0:14 (кодируемая 8Ер ГО N0:13)

МЫТА0ЬЬКРРРАЗМТУЪЕАКАЬЬ01СКМЗАРЬАЕЬЬЕКК№РИРК0Е<УЬУ1РЗЕСА00

ΚΥΤΜΡΕΚΝΕνςΑ03ΥΑΤΤ3^ΘΣ6ΤΝΚΑΘΣΝΜΡΗ0Ε3θνΗΡΡΐίΚΤΚΡΚΤΡΥΚ3ΕΑ3νΡΥνΐΟΚΣ 1ЕКГОЕЬАЗТОР0Р1АЫЗИЗЪЗСГМАКЕУАКЕКРМ0¥ЗСУ1ТЬЗЗР71СЗРКУТЬААЗАЕ1К ΡΚΥΟΕΟΝνΕ0νΐΑΕΡΕΟΡΡΙΤνΡΙΤΑΐν303Ο3ΐν3Υ3ΑΑΙϋΗΗ3ΡΑνζ2ΗΕΗΜθνΑΗ1ΟΕΡΥΝ ΤΚνΝ3ΕΙΑΝΑΕΝ3ΒΕνΕΚΕΡν

8Ер ГО N0:15

АТеСАССТССССААССТСАССССССТбАТСААССССАССЗСССТССАСАТСЗССАТСС

ТСАССССССАССТССТССТСТАССССТСССССАТССТСССССАСССССТСССССССССССССТ

СТТСАСССТССТССССЗТССЗСЗЗСССССАСЗСЗСССАССТССССТССТССТССТЗСАСССТТ

ТС6ТЗСАСААССЗСТСЗЗТСТТСЗТССТССТССССССТССССТСАСССЗСАСССЗСССТСАСТ

ССЗТСЗАЗТСССТСААСТАСТССССССТСАССТЗСЗАССТЗССЗСССЗССЗССЗААСТССТЗС

СЗСЗССЗССТЗОАСЗАЗАТССЗСЗСССССАСССЗАСАСЗССЗАЗЗТССАСАТСЗТСЗСССАСА

СССТССССССССТСАТССССССТТАТТАССТАСАСССТСТССССССТСАСАЗССЗЗСТССЗСА СССТССТСАТССТСЗССАССССССАСТСССССАССАССЗТЗССССЗССТСССССАСССССАТС СЗСТСЗТЗСЗЗСАЗАТЗССЗССбЗЗТТССЗАЗСТЗСТССЗЗСАЗСТССССССЗСССТСЗСССС ССТСССЗТАСССССТТС6ТСАССТТСТЗСАСССАССТСЗАССАЗСТЗАТСЗТСССС6ТЗСАСА СЗСССТСССТСЗАССАСССССАССТЗСТСЗТЗСАСААСЗТССЗСЗТСА0СЗЗЗАТСЗСТСАТС ТСЗСССТСССЗЗТССАТСССАСЗСТЗЗССЗССЗСЗСТССЗСЗАЗССССТСЗАСССЗАЗСЗССЗ СССЗСЗТСССЗССЗЗТСССССАССАССЗЗССССЗСЗССЗЗССССЗТСЗСЗТСА

8Ер ГО N0:16 (кодируемая 8Ер ГО N0:15)

МЕЪАКУТАЬМКАТАЕЕ1А1ЪТ6НЪ¥ЬУР331УАЕКЬАААРЗЗРЗЗРЗАЗРТСККР7УЬ

ЪНСГУОККЗУГУЪЬККАЬТКЗЗКОСУЕЗЪКУЗРЪТСОЬКАААЕЬЬСРКУОЕТКАКТСНАЕУО!

УСНЗЬССЫАКУУУСКЬССОЗКУКТЪУМЬСТРНЗСТТУАРЪАОАНРЬУКОМКРСЗЕУЪКЕЪАА

РЗРССКТКЕУЗЕИЗРЪОСУМУРУОТАСЪОНРОЪЪУНЫУКУЗСЮНЪАЪРУНРТУААСУКЕАЪО

АЗСАСУРСУКЕЕСРСАСАУА

- 23 020145

81Ю ΙΌ \О:17 еТССССеССОСССАСАСССбСАСбССССААСбССАААбССТТСбССССССОАСССТСТ

ТССТСАТССТСССССАССССАСССССТТССТССААСТСААСТССАСССТСТТСТТСТСССССС

ТСТТОТТССССССССССААСССССАССбАСАТССССТССТСССССТОССССССТТТСТССССА

СССАТСТСТССАТСеСССССАТСССОСССТАТСТСАААСААСТССССТАССАТССССАТСССТ

СбААСАТСССССССААТСТССССССССТСССОТССААСССССААЗССТТССССбАССТСТТСС

СССССАТТТАСАСССАСАССС6ССССААССТСАСССТССТССССТ0САСТСТССССССССТСТ

АТСССССССАТСТСССТТТССАССССССССАСАТССТОССТТСССТСАТСАСССТССССАСТС

ССТТТСССАСССАСАТСАСССССАССААССССАССССОСТСТАССАСССССТСТСОССАСААА

ССОТССАССАСААТССССАСТТААСАССССССАТСОСССОССАССТССССОТСССССССАССТ

ССАТСТАТТССССТАСССАСС6ТАТС0Т6ААСТС0САСАССА6ССТССТСССТССТТСС0САА

ССССТСААААСАТССАССТТТАСТТССССАСССАТАТСССССТСССССТСААССССССАСССС ТОТССССССТСССССАСССССТСССССАСССССАСССССААТТТААССАТТТТСАССССТССС СТСССТТТСССАТТСССТАТССССССССТСААААТССАСААТССТСА

81Ю ΙΌ \О:18 (кодируемая 8Е() Ю КО:17)

МАААОЗСТАЕСОПЬКРРЗЬГЬМЬАЕАКСЕЬЕЕМЗЗЬЕЬЗРЕЬЬКАРКСОСНРУЬАЬРб

ЕЪАЗОЕЗМАРМНКУЪКЕЬбУОАНАИЫМСКМЬСЗУАЗККЕАЬКОЪЬККРУЗОТСРКУЗЬУСИЗЪ

СС¥УАР0ЪАЬ<2АР0МЧР371ТЪС5РЕАЗО1КАТКАТКЪУЕАЪЗСЕВУП0ПРЕЪТАА1АС0ЪР7

ΡΑΤ8Ι Υ3ΚΤΟΟΐνΝΜΗΤ3ΕΕΡΡ8ΑΤΑΕΝΙΕνΥΕΑ3ΗΙ(3Ε3νΝΡΑΑΕΜΑνΑΟΚΕΑ(2ΡΕ3ΕΕΚΗΓ 0Ρ30ΡΕΑΙΑΥ3ΡΡΕΝΑζ)3

8Ер ΙΌ ИО:19

АТЗССЗОАСССАААССААССССАССССССССССССТСТТССТССССССССССТССССС

ТСТТССТССССеААСССССССССАТТТТССАССТСААССССАСССТСТТССТСТСЗССССТТС

ТСТТССССБСОССССбСССССАСССССАТССбеТССТССССТТбССССССТТТСТТСССАСТб

АТСТАТСЗАТСССССССТТСССССССТАССТСАСССАССТССССТАССАСАСССАССССТСЗС

ССАТС6СССССААТСТСССССССАТС6ССААСАТССЗСАТСССССТССТССАСССССТСАСЗС

АСАТССАТЗСССАСТбССЗССОСААССТСТССАТТбТССССТСЗАСТСТССЗСОЗСЗТСТАТС

СССССбАССТССССТТССАСЗСССССЗАСАТЗеТССеСТАССТССТСАСССТССЗСАСССССТ

ТССССАСССАССТСССССССАССААТСССАССССССТСТАТСАССССАТСТСеССССАААССС

ТСООССАСААТСТССАССТСОТССАСеССАТТСССеСССАССТОССОСТТССССТСАССТСОА

ТСТАТТССААСАСССАССССАТССТСААСТСССССАССТСССТССТСССССССТСССССАССЗ

СССАСААТАТСЗАСЗТСТАТТТССССАСССАТСТССССАТСЗСССТСААТСССЗССССССТСТ ЗССССАТСССССАСССССТСССССАСССЗЗААССССААТТСССССССТТССАССССТССЗбТС СТТТТСССАТТСССТАСССССССССССААСАСЗСАСААТССАТСТСА

8ЕР ΙΌ ИО:20 (кодируемая 8Ер ΙΌ ИО:19)

МРЕКЫЕА0АРРКЪКРРСЬСЪЕЬАЕАКС1ГЕЬЫА5ЪЬЬЗРЪЪЬКАРКСОСНР7ЬАЪРСЕ

ЬА5ОЬЗМАРЬККУЬТЕЬСУОТНАИКМеКМ7СС1АКМК1АЬЬЕКЪТ01НАЕС6ККУ51У(ЖЗЕЗ

ЗУУАРОЬАЬОАРЕМУКУУУТЬЗЗРЕАЗОУКАТНАТРЬУЕАМЗСЕТУСОМУОЬУОАТАСОЬРУР νΤ3ΙΥ3Κ303ΐνΝΜΚΤ0ΕΕΕΡ5ΑΤΑΕΝΙΕνΥΓΑ3Ην6Ι6νΝΡΑΑ]Λ?ΑΙΑ0ΚΕΑ(2ΚΕ6ΕΕΕΡΕ0 Ρ33ΡΓΑΙΑΥΑΡΡΕ<2Αζ)5Ι

В настоящем описании предлагаются методы раскрытия новых последовательностей гидролаз с использованием нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании. Предлагаются также методы модификации нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, с помощью, например, методов С88М^8М и СепеКеа88ешЬ1у^8М. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть получены, выделены и/или с ними могут проводиться манипуляции с помощью, например, клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации матрицы или геномной ДНК путем ПЦР и тому подобного.

Исходными источниками отобранных иллюстративных полипептидов и нуклеиновых кислот являются

ЗЕО Ю N0:	Источник
1, 2	Получено из образца окружающей среды
3, 4	Получено из образца окружающей среды
5, 6	Получено из образца окружающей среды
7, 8	Получено из образца окружающей среды
9, 10	Получено из образца окружающей среды
11, 12	Получено из образца окружающей среды
13, 14	Получено из образца окружающей среды
15, 16	Бактерии
17, 18	Получено из образца окружающей среды
19, 20	Получено из образца окружающей среды

При применении предлагаемых в настоящем описании методов гомологичные гены могут быть модифицированы с помощью манипуляций с матричной нуклеиновой кислотой, как описано в настоящем документе. Заявленный предмет изобретения может быть осуществлен на практике в сочетании с любым методом или протоколом, или устройством, известным в данной области техники, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе.

- 24 020145

Общие методы.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, включающие РНК, РНК-ί (например, κί-РНК, Ш1-РНК), антисмысловую нуклеиновую кислоту, кДНК, геномную ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, нуклеиновые кислоты, выделенные из различных источников, созданные с помощью генной инженерии, амплифицированные и/или экспрессированные/созданные с помощью рекомбинации.

Рекомбинантные полипептиды, полученные из этих нуклеиновых кислот, могут быть индивидуально выделены или клонированы и протестированы на желаемую активность (например, гидролазную, такую как, например, липазная, сатуразная, пальмитазная и/или стеаратазная активность). Может быть использована любая рекомбинантная экспрессионная система, включая бактериальную систему, систему млекопитающих, дрожжей, грибов, насекомых или экспрессионные системы растительных клеток.

Альтернативно, эти нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы ίη νίίτο с помощью хорошо известных методов химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) ί. Ат. СИет. §ос. 105:661; Ββίουδον (1997) Ыис1е1с Ас1бк Век. 25:3440-3444; Егепке1 (1995) Ргее ВаШс. ΒίοΙ. Меб. 19:373380; В1оттегк (1994) ВюсйетЫгу 33:7886-7896; Ыагапд (1979) МеШ Еп7уто1. 68:90; ΒΐΌ\νπ (1979) МеШ Еп7уто1. 68: 109; Веаисаде (1981) Те1га. Ьей. 22:1859; патенте США № 4458066.

Способы проведения манипуляций с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, мечение зондов (например, мечение случайных праймеров с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобное, хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, 8атЬгоок, еб., МОЕЕСиЬАВ ΕΈΟΝΙΝΟ: А ЬАВОВАΤΟΒΥ \1АМ/АВ (2ΝΏ ЕБ.), Уок. 1-3, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаШгу, (1989); СИВВЕНГ ΒΗΟΤΟίΌΒδ ΙΝ ХЮВЕСВ'ВАВ ΒΙΟΕΟΟΥ, АикиЬе1, еб. .ίοΐιιι \йеу & 8опк, 1пс., Неи ΥοιΧ (1997); ΕΛΒΟΕΛΤΟΕΥ ТЕСНΝΙΟΒΈδ ΙΝ ΒIΟСНΕМI8ΤΒΥ ΛΝΙ) МΟ^ΕСυ^АΒ ΒΙΟΕΟΟΥ: 1 ΙΥΒΕΙΙίΙ/ΛΤΙΟΝ Χ\ΊΤΙ I М/СВЕ1С АСП) ΡΒΟΒΕ8, Рай I. Τίκοιν апб Шс1ею АОб Ргерага1юп, Н^кеп, ей. Е1кеи1ег, Ν.Υ. (1993).

Другими полезными способами получения и манипуляций с нуклеиновыми кислотами, используемыми для осуществления методов, предлагаемых в настоящем описании, является клонирование из геномных образцов, и, если это желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в методах, предлагаемых в настоящем описании, включают библиотеки геномной или кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см., например, патенты США №№ 5721118; 6025155; искусственные хромосомы человека, см., например, Βοкеηίе1б (1997) №Е СепеЕ 15:333-335; искусственные хромосомы дрожжей ^АС); искусственные хромосомы бактерий (ВАС); искусственные хромосомы Р1, см., например, \νοοπ (1998) Сегют-иск 50:306-316; происходящие от Р1 векторы, (РАС), см., например, Кет (1997) Β^οΐесйη^^иек 23:120-124; космиды, рекомбинантные вирусы, фаги или плазмиды.

Выражения нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты могут включать олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из перечисленного, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, РНК-ί) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, нуклеиновую кислоту пептида (РНА) или любое ДНК-подобное или РНК-подобное вещество, природного или синтетического происхождения, например РНК-ί (двухцепочечную интерферирующую РНК), рибонуклеопротеиды (например, 1ВЫР). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими каркасами, см., например, Ма1а (1997) Τοχκο1. Арр1. РИата^Е 144:189-197; δΙππικκ-δοιιΕιιρ (1997) ΒίοΟκιηίκΙιν 36:8692-8698; 8атк1ад (1996) Апйкепке Νυс1ею Ас1б Эгид Эей 6:153-156.

Применяемый в настоящем описании термин промотор включает все последовательности, способные управлять транскрипцией кодирующей последовательности в клетке, например в растительной клетке. Таким образом, промоторы, используемые в конструктах, предлагаемых в настоящем описании, включают цис-действующие элементы, контролирующие транскрипцию, и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модуляцию синхронизации и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-действующий элемент, контролирующий транскрипцию, включающий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, ориджин репликации, последовательность хромосомной интеграции, 5'- и 3'-нетранслируемые области или последовательность интронов, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-действующие последовательности обычно взаимодействуют с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (включения/выключения, регуляции, модуляции и т.д.) транскрипции. Конститутивные промоторы представляют собой промоторы, которые управляют экспрессией постоянно при большинстве условий окружающей среды и стадий развития или клеточной дифференцировки. Индуцибельные или регулируемые промоторы управляют экспрессией нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, под влиянием условий окружающей среды или условий развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию под действием индуцибельных промоторов, включают анаэробные

- 25 020145 условия, повышенную температуру, засушливость или присутствие света.

Тканеспецифические промоторы представляют собой элементы, контролирующие транскрипцию, которые активны только в определенных клетках или тканях либо органах, например, у растений или животных. Тканеспецифическая регуляция может быть достигнута с помощью определенных внутренних факторов, которые гарантируют экспрессию генов, кодирующих белки, специфичные для данной ткани. Такие факторы, как известно, существуют у млекопитающих и растений, что позволяет развиваться специфическим тканям.

Термин растение включает целые растения, части растений (например, листья, стебли, цветы, корни и т.д.), растительные протопласты, семена и растительные клетки и их потомство. Класс растений, который может быть использован в методе, предлагаемом в настоящем описании, обычно широк настолько, что включает класс высших растений, поддающийся методам трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), а также голосеменные. Он включает растения различных уровней плоидности, включая полиплоидные, диплоидные, гаплоидные и гемизиготные состояния. Применяемый в настоящем описании термин трансгенное растение включает растения или растительные клетки, в которые вставлена последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, например нуклеиновых кислот и различных рекомбинантных конструктов (например, экспрессионных кассет), предлагаемых в настоящем описании.

В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, предлагаемый в настоящем описании, соединена в подходящей фазе с лидирующей последовательностью, способной управлять секрецией транслированного полипептида или его фрагмента.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются слитые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты. Полипептид, предлагаемый в настоящем описании, может быть соединен с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Ν-концевые идентифицирующие пептиды, которые придают желаемые характеристики, такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также синтезированы и экспрессированы в виде слитых белков с одним или более соединенными с ними дополнительными доменами, например, для продукции более иммуногенного пептида, для более легкого выделения пептида, синтезированного рекомбинантным способом, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антител В-клеток и тому подобное. Облегчающие определение и очистку домены включают, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые тракты и гистидин-триптофановые модули, которые дают возможность проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены протеина А, которые дают возможность проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, использующий систему расширения ЕЬАС8/аффинную очистку (1ттипех Согр, 8еай1е \УА). Включение последовательности расщепляющего линкера, такого как фактор Ха, или последовательностей расщепления энтерокиназой (1пу|1годеп, 8ап О|едо СА) между доменом очистки и включающим мотив пептидом или полипептидом может облегчить очистку. Например, экспрессионный вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей эпитоп, связанную с шестью гистидиновыми остатками с последующим тиоредоксином и сайтом расщепления энтерокиназой (см., например, ХУПНапъ (1995) ВюсйетЩгу 34:1787-1797; ЭоЬей (1998) Рго1ет Ехрг. Риг1£. 12:404-414). Гистидиновые остатки облегчают определение и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает способ очистки эпитопа из оставшегося слитого белка. Способ, применяемый к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Кго11 (1993) 1)УА Се11. Вю1., 12:441-53.

Последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию.

В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК, ί-РНК), функционально связанные с последовательностью(тями), контролирующей(ими) экспрессию, например, промоторами или энхансерами, для управления или модуляции синтеза/экспрессии РНК. Последовательность, контролирующая экспрессию, может находиться в экспрессионном векторе. Примеры бактериальных промоторов включают 1ас1, 1асЯ, Т3, Т7, др1, лямбда РК, РЬ и 1гр. Примеры эукариотных промоторов включают немедленно-ранний СМУ, тимидинкиназу Н8У, ранний и поздний 8У40, ЬТК из ретровируса и металлотионеин мыши.

Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или 1гр Е. сой, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1, промотор лямбда РК, промотор лямбда РЬ, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3фосфоглицераткиназа (РСК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотные промоторы включают немедленно-ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК из ретровирусов и промотор металлотионеина-Ι мыши. Могут быть также использованы другие промоторы, известные как контролирующие экспрессию генов в прокариотных или эукариотных клетках или соответствующих вирусах.

Тканеспецифические промоторы растений.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются экспрессионные кассеты, которые могут экспрессироваться тканеспецифически, например которые могут экспрессировать гидро

- 26 020145 лазу, предлагаемую в настоящем описании, тканеспецифически. В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются растения или семена, которые экспрессируют гидролазу, предлагаемую в настоящем описании, тканеспецифически. Тканеспецифичность может представлять собой специфичность для семян, специфичность для стебля, специфичность для листьев, специфичность для корней, специфичность для плодов и тому подобное.

В одном аспекте конститутивный промотор, такой как СаМУ 358, может быть использован для экспрессии в конкретных частях растения или семян либо во всем растении. Например, для гиперэкспрессии гидролазы, предлагаемой в настоящем описании, может применяться фрагмент растительного промотора, который будет управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в некоторых или во всех тканях растения, например регенерированного растения. Такие конститутивные промоторы активны при большинстве условий окружающей среды и стадий развития или клеточной дифференцировки. Примеры конститутивных промоторов включают область инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358, 1'- или 2'-промотор, происходящий от Т-ДНК АдгоЬас1епит 1итеГас1епк, и другие области инициации транскрипции из различных растительных генов, известные специалистам в данной области техники. Такие гены включают, например, АСТ11 из АгаЬ1борк1к (Ниапд (1996) Р1ап1 Мо1 Вю1. 33:125139); Са13 из АгаЬ1борк1к (СепВапк №. И43147, 21юпд (1996) Мо1. Сеп. Сепе1. 251:196-203); ген, кодирующий стеароил-ацил-переносящий белок десатуразу из Втаккюа парик (СепЬапк №. Х74782, 8о1осотЬе (1994) Р1ап1 РЬу8ю1. 104: 1167-1176); СРс1 из маиса (СепВапк №. Х15596; МаНтех (1989) 1. Мо1. Вю1 208:551-565); Срс2 из маиса (СепВапк Ыо. И45855, МащипаШ (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 33:97-112); растительные промоторы, описанные в патентах США №№ 4962028; 5633440.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются тканеспецифические или конститутивные промоторы, происходящие от вирусов, которые могут включать, например, субгеномный промотор тобамовируса (Китади (1995) Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А 92:1679-1683); палочковидный тунгро-вирус риса (КТВУ), который реплицируется только в клетках флоэмы у инфицированных растений риса, с его промотором, который управляет усиленной специфичной для флоэмы экспрессией репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок маниоки (СУМУ) с наибольшей активностью в элементах сосудов, в мезофильных клетках листьев и в верхушках корня (Уетбадиет (1996) Р1ап1 Мо1. Вю1. 31: 11291139).

Альтернативно, растительный промотор может управлять экспрессией нуклеиновой кислоты, экспрессирующей гидролазу, в конкретной ткани, органе или типе клеток (т.е. тканеспецифические промоторы) или может находиться другим образом под более точным контролем окружающей среды или стадий развития либо под контролем индуцибельного промотора. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, присутствие света или опыление химикатами/гормонами. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются индуцируемые засухой промоторы маиса (Викк (1997) выше); индуцируемый холодом, засухой и высокой концентрацией соли промотор из картофеля (К1тсй (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 33:8 97 909).

Тканеспецифические промоторы могут стимулировать транскрипцию только в пределах определенной временной рамки или стадии развития в этой ткани; см., например, ВЫ/сщех (1998) Р1ап1 Се11 10:791-800, охарактеризовавшего промотор гена БЕАЕУ АтаЫборык; см. также Сагбоп (1997) Р1ап1 1 12:367-77, описавшего транскрипционный фактор 8РЬ3, который узнает консервативный мотив последовательности в области промотора гена АР1 идентичности меристемы цветка А. ТНаНапа; и Мапбе1 (1995) Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 29, р. 995-1004, описавшего промотор е1Г4 меристемы. Могут быть использованы тканеспецифические промоторы, которые активны в течение жизненного цикла конкретной ткани. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, функционально связаны с промотором, активным главным образом только в клетках волокон хлопка. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, функционально связаны с промотором, активным главным образом в течение стадий удлинения клеток волокон хлопка, например, как описано КтпейаЛ (1996) выше. Нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором гена ГЬ12А для предпочтительной экспрессии в клетках волокон хлопка (там же); см. также 1ойп (1997) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 89:5769-5773; 1оНп, е1 а1., патенты США №№ 5608148 и 5602321, описывающих промоторы, специфические для волокон хлопка, и методы создания трансгенных растений хлопка. Для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, могут также использоваться промоторы, специфические для корней. Примеры промоторов, специфические для корней, включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (ЭеЫк1е (1990) 1п1. Кеу. Су1о1. 123:39-60). Другие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, включают, например, специфические для семяпочки, эмбриоспецифические, специфические для эндосперма, специфические для покрова семяпочки, специфические для семенной оболочки или некоторые их сочетания; специфический для листьев промотор (см., например, Викк (1997) Р1ап11. 11:1285 1295, описывающего специфический для листьев промотор маиса; промотор 0ΚΡΊ3 из АдгоЬас1епит гЫходепек (который проявляет высокую активность в корнях, см., например, Напкеп (1997) выше); специфический промотор пыльцы маиса (см., например, Сиеггего (1990) Мо1. Сеп. СепеЕ 224:161 168); может быть ис

- 27 020145 пользован промотор томата, активный в течение созревания плодов, старения и опадания листьев и в меньшей степени цветов (см., например, В1ите (1997) Р1ап1 1. 12:731 746); специфический для пестика промотор гена 8К2 картофеля (см., например, Искег (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 35:425 431); ген В1ес4 из гороха, который активен в эпидермальной ткани точек роста вегетативных и цветочных побегов трансгенной люцерны, делая ее удобным инструментом для направленной экспрессии чужеродных генов в эпидермальном слое активно растущих побегов или волокон; специфический для семяпочки ген ВЕЬ1 (см., например, Ке1зег (1995) Се11 83:735-742, СеиВаик Ыо. И39944) и/или промотор в патенте США № 5589583 от К1ее, описывающем область растительного промотора, способную придавать высокие уровни транскрипции в ткани меристемы и/или быстро делящихся клетках.

Альтернативно, для экспрессии нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, используются растительные промоторы, которые индуцируются при экспозиции с гормонами растений, такими как ауксины. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются промоторы, включающие ауксинчувствительные элементы Е1 фрагмента промотора (АихКЕ) в сое (С1усте тах Ь.) (Ьш (1997) Р1ап1 РЬузю1. 115:397-407); ауксинчувствительный промотор С8Т6 АгаЬ1борз1з (отвечающий также на салициловую кислоту и перекись водорода) (С1еи (1996) Р1ап( 1. 10: 955-966); индуцируемый ауксином промотор рагС из табака (8ака1 (1996) 37:906-913); растительный биотинчувствительный элемент (81гей (1997) Мо1. Р1ап( МюгоЬе !п(егас1. 10:933-937) и промотор, отвечающий на гормон стресса абсцизовую кислоту (8йееи (1996) 8с1еисе 274:1900-1902).

Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также функционально связаны с растительными промоторами, которые индуцируются при экспозиции с химическими реагентами, которые могут быть применимы для растения, такими как гербициды или антибиотики. Например, может быть использован промотор 1и2-2 маиса, активируемый бензолсульфонамидными гербицидными антидотами (Эе Уеу1бег (1997) Р1ап( Се11 РНуз1о1. 38:568-577); применение различных гербицидных антидотов индуцирует отчетливую экспрессию паттернов генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности могут находиться под контролем, например, промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ауепа зайуа Ь. (овса) (Маздгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465473); или чувствительного к салициловой кислоте элемента (81аиде (1997) Р1ап( 1. 11: 1315-1324). При использовании промоторов, индуцируемых химически (например, гормоном или пестицидом), т.е. промоторов, чувствительных к химическим агентам, которые могут быть применены к трансгенным растениям в полевых условиях, экспрессия полипептида, предлагаемого в настоящем описании, может быть индуцирована на конкретной стадии развития растения. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются трансгенные растения, содержащие индуцибельный ген, кодирующий полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, диапазон хозяев которого ограничивается такими видами растений-мишеней, как кукуруза, рис, ячмень, пшеница, картофель или другие сельскохозяйственные культуры, который индуцируется на любой стадии развития сельскохозяйственной культуры.

Тканеспецифические растительные промоторы могут управлять экспрессией функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, тканеспецифический промотор представляет собой промотор, который управляет экспрессией преимущественно в тканимишени или клеточном типе, но может также вести к некоторой экспрессии в других тканях.

Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть также функционально связаны с растительными промоторами, которые индуцируются при экспозиции с химическими реагентами. Эти реагенты включают, например, гербициды, синтетические ауксины или антибиотики, которые могут быть применены, например, при распылении на трансгенные растения. Индуцибельная экспрессия предлагаемых в настоящем описании нуклеиновых кислот, продуцирующих гидролазу, должна позволять садоводу отбирать растения с оптимальным соотношением крахмал:сахар. Таким образом, может контролироваться развитие частей растения.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются средства для облегчения сбора растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используется промотор 1п2-2 маиса, активируемый бензолсульфонамидными гербицидными антидотами (Эе Уеу1бег (1997) Р1ап1 Се11 РНуз1о1. 38:568-577); применение различных гербицидных антидотов индуцирует отчетливую экспрессию паттернов генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности, предлагаемые в настоящем описании, также находятся под контролем промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ауепа зайуа Ь. (овса) (Маздгаи (1997) Р1ап1 1. 11:465473); или чувствительного к салициловой кислоте элемента (81аиде (1997) Р1ап1 1. 11: 1315-1324).

Если желательна подходящая экспрессия полипептида, должна быть включена область полиаденилирования на 3'-конце кодирующей области. Область полиаденилирования может происходить от природного гена, от различных других растительных генов или от генов агробактериальной Т-ДНК.

Экспрессионные векторы и носители для клонирования.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются экспрессионные векторы, экспрессионные кассеты и носители для клонирования, включающие нуклеиновые кислоты, например

- 28 020145 последовательности, кодирующие гидролазы и антитела. Экспрессионные векторы и носители для клонирования, предлагаемые в настоящем описании, могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагемиды, космиды, фосмиды, искусственные хромосомы бактерий, ДНК вирусов (например, вируса коровьей оспы, аденовируса, поксвируса птиц, вируса ложного бешенства и производные 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфические для конкретных интересующих хозяев (таких как бацилла, АкрегдШик и дрожжи). Предлагаемые в настоящем описании векторы могут включать последовательности хромосомной, нехромосомной и синтетической ДНК. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области техники, и они имеются в продаже. Примеры векторов включают векторы рОЕ (О1адеи), плазмиды рВЬИЕЗСШРТ™, векторы ρΝΗ, (векторы лямбда-ΖΑΡ (81га1адепе); р!гс99а, рКК223-3, рЭВ540. рШТ2Т (РЬагшааа); Еикагуойс: рХТ1, р865 (81га1адепе). р8УК3, рВРУ, рМ86, р8УЬ8У40 (Рйагтааа). Однако могут быть использованы какая-либо другая плазмида или другой вектор до тех пор, пока они способны к репликации и выживанию в хозяине. Могут применяться векторы с низким количеством копий или с высоким количеством копий.

В одном варианте осуществления экспрессионная кассета, предлагаемая в настоящем описании, включает нуклеотидную последовательность, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. кодирующую белок последовательность, такую как гидролаза, предлагаемая в настоящем описании) в хозяине, совместимом с такими последовательностями.

Экспрессионные кассеты включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей полипептид; и, необязательно, с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или полезные для влияния на экспрессию, например энхансеры. Применяемый в настоящем описании термин функционально связанный относится к связи промотора выше от последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, экспрессионные кассеты включают также плазмиды, экспрессионные векторы, рекомбинантные вирусы, любую форму вектора рекомбинантной голой ДНК и тому подобное. Вектор включает нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфецировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Должно быть ясно, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор, необязательно, включает вирусную или бактериальную нуклеиновые кислоты и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются этим, репликоны (например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым могут присоединяться фрагменты ДНК с появлением возможности реплицироваться. Векторы, таким образом, включают, но не ограничиваются этим, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и тому подобное, см., например, патент США № 5217879) и включают как экспрессионные, так и неэкспрессионные плазмиды. Когда рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описывается как экспрессионный вектор хозяина, это включает как внехромосомную кольцевую или линейную ДНК, так и ДНК, которая включена в хромосому(ы) хозяина. Когда вектор поддерживается клеткойхозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза как автономная структура, либо включаться в геном хозяина.

Экспрессионный вектор может включать промотор, сайт связывания рибосом для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать подходящие последовательности для амплификации экспрессии. Экспрессионные векторы млекопитающих могут включать ориджин репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, сайты доноров и акцепторов сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-примыкающие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для обеспечения требуемыми нетранскрибируемыми генетическими элементами могут быть использованы последовательности ДНК, происходящие из сайтов сплайсинга и полиаденилирования 8У40.

В одном аспекте экспрессионные векторы содержат один или более генов маркеров селекции для возможности отбора клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие маркеры секции включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотных клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину, для Е. сой, и ген ТКР1 δ. сегеу151ае. Области промотора могут быть отобраны от любого желаемого гена с использованием векторов хлорамфениколтрансферазы (САТ) или других векторов с маркерами селекции.

Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотных клетках могут также содержать энхансеры для повышения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно от приблизительно 10 до приблизительно 300 п.о. в длину, которые влияют на промотор, увеличивая его транскрипционную активность. Примеры включают энхансер δν40 в поздней области ориджина репликации от 100 до 270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы в поздней области ориджина репликации и энхансеры аденовируса.

Последовательность ДНК может быть вставлена в вектор с помощью разнообразных способов. В целом последовательность ДНК лигируют с желаемым положением в векторе с последующим гидроли- 29 020145 зом вставки и вектора подходящими рестрикционными эндонуклеазами. Альтернативно, можно лигировать тупые концы как во вставке, так и в векторе. Различные методы клонирования известны в данной области техники, например, как описано у и 8атЬгоок. Такие и другие методы находятся в сфере понимания специалистов в данной области техники.

Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомную, нехромосомную и синтетическую последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, ДНК фагов, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, происходящие из сочетаний ДНК плазмид и фагов, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса коровьей оспы, аденовируса, поксвируса птиц и вируса ложного бешенства. Разнообразные клонирующие и экспрессионные векторы для использования у прокариотных и эукариотных хозяев описаны, например, 8атЬгоок.

Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают имеющиеся в продаже плазмиды, включающие генетические элементы хорошо известных носителей для клонирования рВК322 ^ТСС 37017), рКК223-3 (Ркагтас1а Ппс Сйетюа1к, иррка1а, 8\\'ейеп). 6ЕМ1™ (Рготеда Вю1се. Майкоп, Μ υδΑ) рОЕ70, рОЕ60. рОЕ-9 (фадсп), рО10, рк1Х174 РЫиекспр! ΙΙ К8™, рЯ^Л р\Н16а. рИНИ^ рNΗ46Α (81га1адепе), р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΒ540, рК1Т5 (Рйагтайа), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотные векторы включают р8У2СΑΤ, р0644, рХТ1, р86 (81га1адепе) р8УК3, рВРУ, рМ86 и р8УЪ (Рйагтас1а). Однако может быть использован любой другой вектор до тех пор, пока он реплицируется и выживает в клетке-хозяине.

Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть экспрессированы в экспрессионных кассетах, векторах или вирусах и временно или стабильно экспрессироваться в растительных клетках и семенах. Один пример временной экспрессионной системы использует эписомальные экспрессионные системы, например вирусную РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), продуцируемую в ядре путем транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей сверхскрученную ДНК, см., например, Соуеу (1990) Ргос. №И. Αсаά. 8ск υδΑ 87:1633-1637. Альтернативно, кодирующие последовательности, т.е. все они или подфрагменты последовательностей, предлагаемые в настоящем описании, могут быть вставлены в геном растительной клетки-хозяина, становясь интегральной частью хромосомной ДНК хозяина.

Смысловые и антисмысловые транскрипты могут экспрессироваться таким способом. Вектор, включающий последовательности (например, промоторы или кодирующие области) от нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, может включать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип растительной клетке или семенам. Например, маркер может кодировать устойчивость к биоциду, особенно устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к канамицину, 0418, блеомицину, гигромицину или устойчивость к гербицидам, такую как устойчивость к хлорсульфурону или Вак1а.

Экспрессионные векторы, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области техники и могут включать, например, векторы из Αд^оЬасΐе^^ит крр., вируса X картофеля (см., например, Αηде11 (1997) ЕМВ0 ί. 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см., например, Сакрег (1996) 6епе 173:69-73), вируса кустистой карликовости томата (см., например, НШтап (1989) У1го1оду 169:42-50), вируса гравировки табака (см., например, ЭоЦа (1997) У1го1оду 234:243-252), вируса золотой мозаики бобов (см., например, Моппада (1993) МюгоЬю1 Iттипо1. 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см., например, СессЫш (1997) Мо1. Р1ап1 МюгоЬе [п(егас1. 10:1094-1101), мобильный генетический элемент Α^Ωκ маиса (см., например, КнЫп (1997) Мо1. Се11. Вю1. 17:6294-6302; Кипхе (1996) Сигг. Тор. МюгоЬюк Iттипо1. 204:161-194), мобильный генетический элемент, супрессормутатор (8рт) маиса (см., например, 8сй1арр1 (1996) Р1ап1 Мо1. Вю1. 32:717-725) и их производные.

В одном аспекте экспрессионный вектор может иметь две репликационные системы для возможности его поддержания в двух организмах, например для экспрессии в клетках млекопитающих, дрожжей, грибов или насекомых, и в клетках прокариотных хозяев для клонирования и амплификации. Более того, в случае интегрирующихся экспрессионных векторов экспрессионный вектор может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичные последовательности, которые примыкают к экспрессионному конструкту. Интегрирующийся вектор может быть направлен на специфический локус в клетке-хозяине путем выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкты для интегрирующихся векторов хорошо известны в данной области техники.

Экспрессионные векторы, предлагаемые в настоящем описании, могут также включать ген маркера селекции для возможности отбора бактериальных штаммов, которые трансформированы, например гены, которые придают бактериям устойчивость к лекарствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Маркеры селекции могут также включать гены биосинтеза, такие как гены, используемые в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Клетки-хозяева и трансформированные клетки.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются трансформированные клетки, включающие последовательность нуклеиновой кислоты, например последовательность, кодирующую

- 30 020145 гидролазу или антитело, или вектор, предлагаемый в настоящем описании. Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяина, знакомую специалистам в данной области техники, включая прокариотные клетки, эукариотные клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или растительные клетки.

Ферменты, предлагаемые в настоящем описании, могут быть экспрессированы в любой клеткехозяине, например любой бактериальной клетке, любой дрожжевой клетке любых Засскаготусек или Зс1пхокасс11аготусек крр., любых йсЫа крр., например йсЫа ракЮпк, ЗассЬаготусек сегеу181ае или Зс1пхокасскаготусек ротЬе. Примеры бактериальных клеток включают любые З1герЮтусек или ВасШик крр., например Е. со11, БасЮсоссик 1асбк, ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик, За1тоие11а ТурШтшлит или любые штаммы в пределах родов ВасШик, З1гсрЮтусек и З1арку1ососсик. Примеры клеток насекомых включают ОгокорЫ1а З2 и Зробор1ега ЗГ9. Примеры клеток животных включают СНО, СОЗ или клетки меланомы Вотек либо любые клеточные линии мыши или человека. Выбор подходящего хозяина находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Методы трансформации большого разнообразия видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе; см., например, Аектд (1988) Апп. Кеу. Сепе1. 22:421-477, патент США № 5750870.

Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием различных методов, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, инфицирование вирусом, генные пушки или Т1-опосредованный перенос генов. Конкретные методы включают трансфекцию фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ДЭАЭ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Паук, Ь., ОШиег, М., ВаРеу, I., Вакю МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (1986)).

Когда это необходимо, сконструированные клетки-хозяева могут культивироваться в общепринятых питательных средах, модифицированных подходящим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, предлагаемых в настоящем описании. После трансформации подходящего штамма хозяина и роста штамма хозяина до подходящей плотности клеток отобранный промотор может быть индуцирован с помощью подходящих способов (например, изменения температуры или химической индукции) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода для возможности продукции ими желаемого полипептида или его фрагмента.

В одном аспекте нуклеиновые кислоты или векторы, предлагаемые в настоящем описании, вводятся в клетки для скрининга, таким образом, нуклеиновые кислоты вводятся в клетки способом, подходящим для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Метод введения в значительной степени зависит от типа клетки-мишени. Примеры методов включают осаждение Са₂РО₄, липосомное слияние, липофекцию (например, ЫРОЕЕСТГЫ™), электропорации, инфицирование вирусом и т.д. Кандидатные нуклеиновые кислоты могут стабильно интегрироваться в геном клетки-хозяина (например, при ретровирусной интродукции) или могут временно или стабильно существовать в цитоплазме (т.е. при применении традиционных плазмид, использующих стандартные регуляторные последовательности, маркеры селекции и т.д.). Альтернативные варианты осуществления включают ретровирусные векторы, способные трансфецировать такие мишени (например, клетки млекопитающих, человека), потому что, например, многие фармакологически важные варианты скрининга требуют клеток-мишеней человека или модельных клетокмишеней млекопитающих.

Клетки могут быть собраны путем центрифугирования, разрушения физическими или химическими методами, и полученный общий экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Микробные клетки, применяемые для экспрессии белков, могут быть разрушены с помощью любого общепринятого метода, включая циклы замораживания-оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование агентов, лизирующих клетки. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области техники. Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть получен и очищен из рекомбинантных клеточных культур с помощью методов, включающих осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и лектиновую хроматографию. Если это необходимо, могут быть использованы стадии повторной укладки белка для завершения конфигурации полипептида. Если это желательно, для конечных стадий очистки может применяться высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Различные системы клеточных культур млекопитающих также могут применяться для экспрессии рекомбинантного белка. Примеры экспрессионных систем млекопитающих включают линии СОЗ-7 фибробластов почки обезьяны и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки из совестимого вектора, такие как клеточные линии С127, зтз, СНО, НеЬа и ВНК.

Конструкты в клетках-хозяевах могут быть использованы общепринятым образом для получения продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от используемого хозяина в методе рекомбинантной продукции полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, могут включать или могут не включать инициирующий остаток аминокислоты метионина.

- з1 020145

Для получения полипептида, предлагаемого в настоящем описании, могут также использоваться бесклеточные системы трансляции. Бесклеточные системы трансляции могут использовать мРНК, транскрибируемые с конструкта ДНК, включающего промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкт ДНК может быть линеаризован перед проведением реакции транскрипции ш νίΙΐΌ. Транскрибированную мРНК затем инкубируют с подходящим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, для получения желаемого полипептида или его фрагмента.

Экспрессионные векторы могут содержать один или более генов маркеров селекции для обеспечения фенотипическим признаком для отбора трансформированных клеток-хозяев, таких как ген дигидрофолатредуктазы или ген, придающий устойчивость к неомицину, для культуры эукариотных клеток, или таких как гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой.

Амплификация нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или модифицированные нуклеиновые кислоты, которые могут репродуцироваться, например, с помощью амплификации. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются пары праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих гидролазу, например липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу, где пары праймеров способны амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании. Специалист в данной области техники может создать последовательности пар праймеров для амплификации для любой части или полной длины этих последовательностей.

Реакции амплификации могут также использоваться для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (таком как количество матричной РНК в клеточном образце), для мечения нуклеиновой кислоты (например, для применения ее в микроматрице или блотинге), для определения нуклеиновой кислоты или для определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте амплифицируется матричная РНК, выделенная из клетки, или библиотека кДНК. Специалист в данной области техники может выбрать и создать подходящие праймеры для амплификации олигонуклеотидов. Методы амплификации, также хорошо известные в данной области техники, включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см., например, РСК РКОТОСОББ, Α бИГОЕ ТО ΜΕΤΗΘΌ8 ΑΝΌ ΑΡРЬ1САТЮЦ8, еб. 1пп18, Αсабет^с Рге§8, Ν. Υ. (1990) и РСК δΤΚΑΤΕ6ΙΕδ (1995), еб. 1пт8, Αсабет^с Ргс55. 1пс., Ν. Υ., лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см., например, \¥и (1989) Сепош1с8 4:560; Ьапбедгеп (1988) 8с1епсе 241:1077; Ватпдег (1990) Сепе 89: 117); амплификацию транскрипции (см., например, К^ой (1989) Ргос. №111. Αсаб. δα. υδΑ 86:1173) и самоподдерживаемую репликацию последовательности (см., например, Сиа1еШ (1990) Ргос. №111. Αсаб. δα. υδΑ 87:1874); амплификацию с помощью О-бетарепликазы (см., например, 8тйй (1997) 1. С1т. МюгоЬюк 35:1477-1491), автоматический тест амплификации с помощью О-бета-репликазы (см., например, Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬек 10:257-271) и другие методы с использованием РНК-полимеразы (например, ΝΑδΒΑ, Сапдепе, МЦЦ^аида, Оп1апо); см. также Вегдег (1987) Ме1йоб§ Еп7уто1. 152:307-316; δатЬ^оок; Αυ8ϋ^1; патенты США №№ 4 683195 и 4683202; δоокпапап (1995) Вю1есйпо1оду 13:563-564.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются пары праймеров для амплификации, включающие последовательности, предлагаемые в настоящем описании, например, где пары праймеров включают первый член, обладающий последовательностью, как представлено в приблизительно первых (с 5'-конца) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 или более остатках нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, и второй член, обладающий последовательностью, как представлено в приблизительно первых (с 5'конца) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 или более остатках комплементарной цепи первого члена.

Определение степени идентичности последовательностей.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, обладающие идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, полной (100%) с нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании, например, иллюстративная нуклеиновая кислота, предлагаемая в настоящем описании, (например, обладающая последовательностью, представленной δΕΟ ΙΌ ^:1, δΕΟ ΙΌ ^:3, δΕΟ ΙΌ ^:5, δΕΟ ΙΌ ^:7, δΕΟ ΙΌ ^:9, δΕΟ ΙΌ ^:11, δΕΟ ΙΌ ^:13, δΕΟ ΙΌ ^:15, δΕΟ ΙΌ ^:17, δΕΟ ΙΌ ^:19, δΕΟ ΙΌ ^:22 или δΕΟ ΙΌ ^:23, или δΕΟ ΙΌ NО:1, модифицированной для кодирования одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более (нескольких) или всех вариантов оснований, описанных в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквивалентов) и полипептиды, обладающие по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности с полипептидом, предлагаемым в настоящем описании, например иллюстративным полипептидом, обладающим последовательностью, представленной δΕΟ ΙΌ NО:2, δΕΟ ΙΌ NО:4, δΕΟ ΙΌ NО:6, δΕΟ ΙΌ NО:8, δΕΟ ΙΌ ^:10, δΕΟ ΙΌ ^:12, δΕΟ ΙΌ ^:14, δΕΟ ΙΌ ^:16, δΕΟ ΙΌ ^:18 или δΕΟ ΙΌ ^:20 или δΕΟ ΙΌ NО:2, обладающей одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью или более (не

- 32 020145 сколькими) или всеми вариантами аминокислот, описанных в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквивалентами. В альтернативных аспектах идентичность последовательностей может покрывать область по меньшей мере из приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательных остатков или всю длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Степень идентичности (гомологии) последовательностей может быть определена с использованием компьютерной программы и связанных с ней параметров, включая параметры, описанные в настоящем документе, такие как ВЬАБТ 2.2.2. или ЕАБТА, версия 3.0ΐ78, с параметрами по умолчанию. Применяемые в настоящем описании термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в их самых широких контекстах и включают все такие устройства, как подробно описано ниже.

В таблице, представленной ниже, описываются отобранные характеристики иллюстративных нуклеиновых кислот и полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, включая сравнение идентичности последовательностей для иллюстративных последовательностей с опубликованными базами данных для идентификации активности ферментов, предлагаемых в настоящем описании, по анализу гомологии (идентичности последовательностей). Все последовательности, описанные в таблице (все иллюстративные последовательности, предлагаемые в настоящем описании), являлись объектом поиска ВЬАБТ (как подробно описано ниже) против двух совокупностей баз данных. Первая совокупность базы данных доступна от ΝΟΒΙ (Ναΐίοηαΐ СсгИсг Гог В|о1сс11по1оду 1иГогтайои). Все результаты поисков против этих баз данных находятся в колонках, озаглавленных Описание ΝΚ, Код доступа ΝΚ, Ожидаемое число ΝΚ или Организм ΝΚ. ΝΚ обозначает нерезервированную базу данных нуклеотидов, поддерживаемую NСΒI. Эта база данных является составной частью СеиВаик, она обновляется СеиВаик и обновляется ЕМВЬ. Входы в колонку Описание ΝΚ относятся к линии определения в любой данной записи NСΒI, которая включает описание последовательности, такое как источник организма, название гена/название белка или некоторое описание функции последовательности, таким образом идентифицируя активность перечисленных иллюстративных ферментов, предлагаемых в настоящем описании, с помощью анализа гомологии (идентичности последовательностей). Входы в колонку Код доступа ΝΚ относятся к индивидуальному идентификатору, данному записываемой последовательности. Входы в колонку Ожидаемое число ΝΚ относятся к ожидаемому числу (Е-уа1ие), которое представляет вероятность того, что количество очков выравнивания столь же хорошо, что и количество очков, найденное между запрашиваемой последовательностью (последовательностями, предлагаемыми в настоящем описании) и последовательностью базы данных, которое должно было бы быть найдено в таком же количестве сравнений между случайными последовательностями, как и в выполненном в данном поиске ВЬАБТ. Входы в колонку Организм ΝΚ относятся к организму-источнику идентифицируемой последовательности, как наиболее близкому попаданию ВЬАБТ (гомологии последовательности). Вторая совокупность баз данных в собирательном значении известна как база данных СЕНЕ8ЕО™, которая доступна от Тйоткои ЭепуегИ (РЫ1абе1рЫа, РА). Все результаты поисков против этой базы данных находятся в колонках, озаглавленных Описание белков СЕНЕ8ЕО™, Код доступа к белкам СЕИЕБЕр™, Ожидаемое число для белка СЕНЕБЕО™, Описание ДНК СЕИЕБЕр™, Код доступа к ДНК СЕЯЕБЕО™ или Ожидаемое число для ДНК СЕЯЕБЕЭ™. Информация, найденная в этих колонках, сравнивается с информацией, найденной в колонках ΝΚ, описанных выше, за исключением того, что она добывается из поисков ВЬАБТ против базы данных СЕЫЕБЕО™ вместо баз данных ЫСВ1. Колонки Запрашиваемая длина ДНК и Запрашиваемая длина белка относятся к количеству нуклеотидов или аминокислот соответственно в последовательности, предлагаемой в настоящем описании, для которого проводится поиск или запрос против баз данных ЫСВ1 или СЕЯЕБЕО™. Колонки Длина ДНК СЕЯЕБЕО™ или ΝΚ и Длина белка СЕИЕЗЕО™ или ΝΚ относятся к количеству нуклеотидов или аминокислот соответственно в последовательности при максимальном образовании пар из поиска ВЬАБТ. Результаты, представленные в этих колонках, получены из поиска, который возвращал к более низкому числу Е-уа1ие, либо из баз данных ΝΕΈΙ, либо из базы данных Сеиекец. Колонки Белок СЕНЕ8ЕО™/НК%1Э и ДНК СЕНЕ8ЕЭ™/'НР%1Э относятся к проценту идентичности между последовательностью, предлагаемой в настоящем описании, и последовательностью из максимального образования пар ВЬАБТ. Результаты, представленные в этих колонках, получены из поиска, который возвращал к более низкому числу Е-уа1ие либо из баз данных ЫСВ1, либо из базы данных Сеиекед.

- 33 020145

8Е<2 ГО N0:	Описание ΝΚ	Код доступа ΝΚ	Ожидаемое число ΝΚ	Организм ΝΚ	Описание белков Оепевец	Код доступа к Сепевец	Ожидаемое СЗеиевец	Описание ДНК Оепевец	Код доступа к ДНК Оепевец	Ожидаемое ДНК Оепевеч	ДНК Оепезеч/ΝΚ %ГО
1,2	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рЫп§орух1з а1а5кеп518 КВ2256] _Βί\|98975854\|_εΗ\|ΑΒΓ 52005.Ц консервативный гипотетический белок [8рЫпцору.Х1з а1азкепз18 КВ2256]	103485777	7.00Е-40	ЗрЫпрорухн а1а ке 1 К Р,2256	пептид 8Ер ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	Α0Ζ64879	1.00Е-127	пептид 8Ер ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑςΖ64878
3,4	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рЫп8орух15 а1азкепз15 КВ2256] §1\|98975854\|§Ь\|АВР 52005.11 консервативный гипотетический белок [8рЫп§орух1з а1ая1<епя1я КВ2256]	103485777	2.00Е-40	8рЫп£ОруХ18 а1азкепз1з КВ2256	пептид 8 Е<2 ГО N0:2, гидролазную активность	ΑΟΖ64879	3.00Е-39	белок, кодируемый прокариот «0232.	АСА26233	1.8
5,6	гипотетический белок 8а1а_0282 ]8рЬт§орухО а1азкепз1з КВ2256] _ё1\|98975854\|_ёЬ\|АВЕ 52005.11 консервативный гипотетический белок [ЗрЫп^орухю а1азкепз1з КВ2256]	103485777	8.00Е-42	8рЫпворух1з аЬякепчч КВ2256	пептид 5ЕО ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑΟΖ64879	3.ΟΟΕ-39	пептид 8Е0 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	Α0Ζ64878	0.53
7,8	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рйш§орух1з а1азкепы5 КВ2256] §1\|98975854\|рЬ\|АВР 52005.11 консервативный гипотетический белок [ЗрЫпрорухВ а1азкепз15 КВ2256]	103485777	1.00Е-46	ΧρΙιίηρορνχΐΒ а1авкепв1з КВ2256	пептид 8ЕЦ ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑΟΖ64879	7.00Е-44	пептид 8Е0 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑΟΖ64878	1.00Е-04
9, 10	гипотетический белок 8а1а_0282 [ЗрЬтрорухН а1азкеп81я КВ2256] _ё1\|98975854\|_ёЬ\|АВР 52005.11 консервативный гипотетический белок [8рЫп§орух1в а1авкепв1в КВ2256]	103485777	3.00Е-51	8рЫп§орух1з а1азкепз1з КВ2256	пептид 8Εζ) П) N0:2, проявляющий гидролазную активность	Α0Ζ64879	2.00Е-42	пептид 8Е0 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑΟΖ64878	1 .ООЕ-07
п, 12	I гипотетический белок 8КА58—17128 [8рЫп§отопав зр. 8КА58] ^94422701\|_ёЬ\|ЕАТ 07736.11 гипотетический белок 8КА58_17128 [8рйт§отопав зр. 8КА58]	94497812	4.00Е-46	зр. 8КА58	пептид 8ЕО ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	ΑΟΖ64879	3.00Е-42	ческий и терапевтический белок человека 8Г0 ГО N0:2739.	ΑΟΝ41328	1.6
13,	гипотетический ΡΡ8ΙΚ124779 [Р1е5юеу5Й8 расШса 8ΙΒ-1] _ек]149817999]₈Ь\|ЕП М77458.Ц РР81К.1_24779 [Неыосузйз рас) Пса 81К.-1]	149921112	3.00Е-32	Незюсувйв расШса 8ΙΚ- 1	пептид 8Е(2 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	АО653993	1.00Е-155	пептид 8 Ер ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	АОО53992	0
15, 16	липаза [81гер(отусев ауегтШИв МА- 4680] §ί \|29607114\|<Иу\|ВАС 71173.11 предполагаемая липаза [ЗПерГотусев ауетпГШз МА- 4680]	29830004	1.00Е- 100	81гер1отусез ауегтШИв МА-4680	пептид 8Е<2 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	Α0Ζ64645	5.00Е-21	белковая тельность М. ХапИшз, веч И 9726.	АСЬ64205	0.003
17, 18	гипотетический белок Ыг2879 [ВгаОугЫгоЫит б арошсит Ο8ϋΑ 110] §1\|27351136\|аЬЛВАС 48144.11 Ыг2879 [ВгабугЫхоЫит ^арошсит ϋ8ϋΑ ПО]	27377990	1.00Е- 115	ВгаОугЫгоЫит арошсит ΟδϋΑ ПО	белок-антиген I микобактерий МусоЬасГегшт 1иЬегси1ов18 8Е0 ГО N0:5.	АВМ15916	8.00Е-48	пептид 8Е0 ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	АО/.64878	1.00Е-05
19, 20	гипотетический белок Ыг2879 [ВгайугЫгоЫит ]аротсит υδϋΑ 110] §1\|27351136\|с1Ь)\|ВАС 48144.11 Ъ1г2879 [ВгайугЫгоЫит баротсит Е8ОА НО]	27377990	1.00Е- 118	ВгаОугЫгоЫит арошсит □ЗОЛ НО	белок-антиген I микобактерий МусоЬас1егшт ГиЬегси1о515 8Ε0ΙΟΝΟ.5.	АВМ15916	1.00Е-44	пептид 8ЕО ГО N0:2, проявляющий гидролазную активность	Α0Ζ64878	2.00Е-04

8Εζ) ГО ΝΟ:	Описание ΝΚ.	Запрашиваемая длина ДНК	Запрашиваемая длина белка	Длина ДНК (Эепеяец/Ж	Длина белка Οεηβδβς/ΝΚ	<3ΕΝΕ8Ερ/ΝΚ%ΙΟ	ДНК <3ΕΝΕ8Ερ/ΝΚ%ΙΓ)
1,2	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рЫп§орух18 а1азкепя13 КВ2256] §1\|98975854)§Ъ\|АВР52005.1\| консервативный гипотетический белок [δρίιίπβορνχί.ι а1азкеп818 КВ2256]	684	227	684	227
3,4	гипотетический белок 8а1а_0282 [8р1нп£орухг5 а1а8кеп818 КВ2256] §1\|98975854\|§Ь\|АВР52005.1\| консервативный гипотетический белок [8рЫп§орух18 аЬзкеплз КВ2256]	633	210	0	249	47
5,6	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рЫп§орух18 а1азкеп818 КВ2256] βί[98975854\|еЬ \| АВР52005.11 консервативный гипотетический белок [8рЫп§орухи а1а5кепз18 ΒΒ2256]	711	236	0	249	42
7,8	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рйт§орух18 а1а5кепз18 КВ2256] §1\|98975854\|§Ъ\|АВР52005.1\| консервативный гипотетический белок [8рЫп£орух18 а1а8кепз18 КВ2256]	669	222	0	249	46
9, 10	гипотетический белок 8а1а_0282 [8рЫп§орух18 а1а5кеп818 КВ2256] §1\|98975854\|§Ь\|АВР52005.1\| консервативный гипотетический белок [8рЫп§орух1з а1а8кеп815 КВ2256]	669	222	0	249	48
11, 12 13, 14	гипотетический белок 8КА58_17128 [8рЬш§отопа8 8р. 8КА58] §1\|94422701\|§Ь\|ЕАТ07736.1\| гипотетический белок 8КА58_17128 [ЗрЫп^отопаз яр. 8КА58] гипотетический белок РР81К.1_24779 [Р1е8юсу8Й8 рас1йса 8ΙΚ.-1] §1\|149817999\|§Ь\|ЕОМ77458.1\| гипотетический белок ΡΡ8ΙΚΙ24779 [ΡΙβδίοογδίίδ расгбса 8ΙΚ.-1]	570 807	189 268	0 807	298 268	46
15, 16	липаза [81гер1отусе8 ах'егтШНз МА4680] §ί\|29607114\|бЬЛВАС71173.11 предполагаемая липаза [81гер1отусе8 ауегткШз МА-4680]	804	267	0	286	69
17, 18	гипотетический белок Ыг2879 [ВгабугЫгоЬшт ]арошсит υδϋΑ 110] _е1\|27351136\|бЬЛВАС48144.1\| Ыг2879 [ВгабугЫгоЫит ]арошсит ШОА 110]	798	265	0	266	79
19, 20	гипотетический белок Ыг2879 [ВгабугЫгоЫит ]арошсит ШОА 110] _В1\|27351136\|бЬЛВАС48144.1\| Ыг2879 [ВгабугЫгоЬшт ]аротсит υδϋΑ 110]	798	265	0	266	79

Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых уридины заменены тимидинами в последовательностях нуклеиновой кислоты. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любого из методов, описанных в настоящем документе, или могут быть получены в результате коррекции ошибки последовательностей. Должно быть понятно, что последовательности нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании, могут быть представлены в традиционном формате однобуквенного кода (см., например, 8!гуег, ЕиЬег!. В1осйет1з!гу, 3гб Еб., Ш. Н Егеешап & Со., Жлу Уогк) или в любом другом формате, который описывает идентичность нуклеотидов в последовательности.

Различные программы сравнения последовательностей, представленные в настоящем описании и известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы для сравнения последовательностей. Идентичность (гомология) белковых последовательностей и/или последовательностей нуклеиновых кислот может быть оценена при использовании любых из различных алгоритмов и программ сравнения последовательностей, известных в данной области техники. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются этим, ΤΒΕΑ8ΤΝ, ВЕА8ТР, ЕАЗТА, ТЕАЗТА и СРГ8ТДРШ (Реагзоп апб Пртап, Ргос. Ν!1. Асаб. 8сь ИЗА 85 (8) :2444-2448, 1988; А1!зсйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215 (3) :403-410, 1990; Тйотрзоп е! а1., Шс1е1с Ас1бз Кез. 22(2):4673-4680, 1994; Ηί§§ίπδ е! а1., Ме!йобз Еп/ушо1. 266:383402, 1996; А1!зсйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215(3):403-410, 1990; А1!зсйи1 е! а1., ^!иге Сепейсз 3:266-272, 1993).

Гомология или идентичность может быть измерена с использованием компьютерной программы анализа последовательностей (например, Зециепсе Апа1уз1з ЗоПмаге Раскаде о£ !йе Сепейсз Сотри!ег Сгоир, Итуегзйу о£ Ш1зсопзт Вю!есйпо1оду Сеп!ег, 1710 Итуегзйу Ауепие, Маб1зоп, 53705). Такая компьютерная программа подбирает сходные последовательности с помощью назначения степеней гомологии по отношению к различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или обозначенной области, измеренных с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или с помощью выравнивания вручную и визуального об

- 35 020145 следования. При сравнении последовательностей одна последовательность может действовать как реперная последовательность (например, иллюстративная нуклеиновая кислота или полипептидная последовательность, предлагаемые в настоящем описании), с которой сравниваются тестируемые последовательности. Когда используется алгоритм сравнения последовательностей, тестируемая и реперная последовательности вводятся в компьютер, назначаются координаты последовательностей, если это необходимо, и назначаются параметры алгоритма программы сравнения последовательностей. Могут использоваться параметры программы по умолчанию или могут назначаться альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно реперной последовательности на основе параметров программы.

Применяемый в настоящем описании термин окно сравнения включает ссылку на сегмент из какого-либо количества смежных остатков. Например, в альтернативных аспектах, как предлагается в настоящем описании, смежные остатки в диапазоне в пределах от 20 до полной длины иллюстративного полипептида или последовательности нуклеиновой кислоты сравниваются с реперной последовательностью из того же количества смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если реперная последовательность имеет требуемую идентичность последовательности с иллюстративным полипептидом или последовательностью нуклеиновой кислоты, например, в альтернативных аспектах, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо (100%) идентичность последовательности по отношению к иллюстративному полипептиду или последовательности нуклеиновой кислоты, предлагаемых в настоящем описании, эта последовательность входит в предлагаемый в настоящем описании объем. В альтернативных вариантах осуществления последовательности в диапазоне от приблизительно 20 до 600, от приблизительно 50 до 200 и от приблизительно 100 до 150 сравниваются с реперной последовательностью из того же количества смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии 8шйй & \Уа!егтап, Айу. Арр1. Ма!й. 2:482, 1981, с помощью алгоритма гомологичного выравнивания №ей1етап & ХУшъсй, 1. Мо1. Вю1. 48:443, 1970, путем поиска на сходство методом Регкоп & Ыршаи, Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 85:2444, 1988, с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТНТ, БА8ТА и ТБА8ТА в ХУ^сопмп СепеРск 8оП\таге Раскаде, СепеРск Сотри!ег Сгоир, 575 8аепсе Иг., Майкоп, XVI) или с помощью выравнивания вручную и визуального контроля. Другие алгоритмы для определения гомологии или идентичности включают, например, в дополнение к программе ВЬА8Т (программе поиска базисного локального выравнивания в национальном центре биологической информации), АЕ1СХ АМА8 (анализ последовательностей множественным выравниванием), АМР8 (множественное выравнивание белковых последовательностей), А88ЕТ (программу статистической оценки выровненных сегментов), ВАN^8, ВЕ8Т8С0К, ВIО8САN (узел сравнительного анализа биологических последовательностей), В1.1МР8 (ВЬоскк ШРгоуей 8еагсйег), БА8ТА, 1п1егуа1к & РопИк, ВМВ, С1.Р8ТАР V, С1.Р8ТАР V, С0№Е^И8, РС0\8Н\8Р8, ΧνίΌΝΑΡΝ+ΡΧ алгоритм 8тйй-’№а1егшап, 1)А1^'1\, алгоритм Ьак Уедак, БNАТ (программу принудительного выравнивания нуклеотидов), Бгашеайди, Бгатекеагсй, ΌΥNАМIС, НЬТЕК, Б8АР (пакет анализа последовательностей Рг1к1епкку), САР (программу глобального выравнивания), СЕNА^, С1ВВ8, СепОиек!, 188С (сравнения чувствительных последовательностей), ЬАΕ№Ν (локальное выравнивание последовательностей), ЬСР (программу локального содержания), МАί.Ά\ν (рабочее место для составления и анализа множественного выравнивания), МАР (программу множественного выравнивания), МВЬКР, МВЙКН Р1МА (индуцированное паттерном множественное выравнивание последовательностей), 8АСА (выравнивание последовательностей с помощью генетического алгоритма) и VНАТ-IБ. Такие программы выравнивания могут также использоваться в скрининге баз данных генома для идентификации полинуклеотидных последовательностей, обладающих, по существу, идентичными последовательностями. Базы данных генома доступны, например существенная часть генома человека доступна в виде части проекта Секвенирование генома человека (С1ЬЬк, 1995). Секвенировано несколько геномов, например М. деийаЕиш (Бгакег е! а1., 1995), М. )аппаксйй (Вий е! а1., 1996), Н. шПнепхае (Б1е1ксйтапп е! а1., 1995), Е. сой (В1айпег е! а1., 1997), дрожжей (8. сегеуыае) (Метек е! а1., 1997) и И. те1аподак!ег (Айатк е! а1., 2000). Существенный прогресс произошел в секвенировании геномов модельных организмов, таких как мышь, С. Е1едапк и АгаЬайорык кр. Базы данных, содержащие геномную информацию, аннотированную некоторой информацией о функциях, поддерживаются различными организациями и доступны через Интернет.

Используются также алгоритмы ВЙА8Т, ВЙА8Т 2.0 и ВЙА8Т 2.2.2. Они описаны, например, в А1!ксйи1 (1977) Шс. Ас1йк Кек. 25:3389-3402; Айксйи1 (1990) 1. Мо1. Вю1. 215:403-410. Компьютерные программы для осуществления анализов ВЙА8Т есть в открытом доступе в национальном центре биотехнологической информации. Этот алгоритм включает первоначальную идентификацию пар последовательностей с высокими очками (Н8Р) путем идентификации коротких слов длины V в запрашиваемой последовательности, которые либо имеют пару, либо удовлетворяют некоторому порогу очков Т с положи

- 36 020145 тельной величиной при выравнивании со словом той же длины в последовательности базы данных. Т обозначает близлежащий порог очков для слова (АЙксШ (1990) выше). Эти совпадения с первоначальным близлежащим словом действуют как отправные точки для инициации поисков с целью нахождения более длинных содержащих их ΗδΓ. Совпадения слов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока могут увеличиваться совокупные очки выравнивания. Совокупные очки рассчитываются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (поощрительные очки за пару совпадающих остатков; всегда >0). В случае аминокислотных последовательностей для подсчета совокупных очков используется матрица подсчета очков. Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда совокупные очки выравнивания уменьшаются на количество X от их максимально достигнутой величины; совокупные очки приходят к нулю или ниже из-за аккумуляции одного или более выравниваний остатков с отрицательными очками или при достижении конца любой последовательности. Параметры V, Т и X алгоритма В^ΑδТ определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа В^ΑδТN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (V) 11, ожидаемое число (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа Β^ΑδТР использует по умолчанию длину слова 3, и ожидаемые числа (Е) 10, и матрицу подсчета очков ΒΕ0δυΜ62 (см. Неп1коГГ & НешкоГГ (1989) Ргос. №111. Асай δα. ША 89:10915) выравниваний (В) 50, ожидаемые числа (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих цепей. Алгоритм Β^ΑδТ осуществляет также статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Кагйп & АИксШ (1993) Ргос. №11. Асай. δα. ^А 90:5873). Одно измерение сходства, обеспечиваемое алгоритмом Β^ΑδТ. представляет собой наименьшую суммарную возможность (Р(К)), которая дает указание на возможность, при которой образование пар между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет возникать случайно. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с реперной последовательностью, если наименьшая суммарная возможность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с реперной нуклеиновой кислотой менее приблизительно 0,2 или, альтернативно, менее приблизительно 0,01, или, альтернативно, менее приблизительно 0,001.

В одном аспекте гомологии последовательностей белков и нуклеиновых кислот оцениваются с использованием программы поиска базисного локального выравнивания (Β^ΑδТ). Например, пять конкретных программ Β^ΑδТ могут быть использованы для выполнения следующих задач: (1) Β^ΑδТР и Β^ΑδТ3 сравнивают запрашиваемую аминокислотную последовательность с базой данных белковых последовательностей; (2) Β^ΑδТN сравнивают запрашиваемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей; (3) Β^ΑδТX сравнивает рамку из шести гипотетических продуктов трансляции запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих цепей) с базой данных белковых последовательностей; (4) ТΒ^ΑδТN сравнивает запрашиваемую белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых во всех шести рамках считывания (обеих цепей); и (5) ТΒ^ΑδТX сравнивает трансляцию запрашиваемой нуклеотидной последовательности в шести рамках считывания с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслированной в шести рамках считывания.

В одном аспекте программы Β^ΑδТ идентифицируют гомологичные последовательности путем идентификации сходных сегментов, которые обозначаются в настоящем описании как пары сегментов с высокими очками, между запрашиваемой аминокислотной или нуклеотидной последовательностью и тестируемой последовательностью, которую, альтернативно, получают из базы данных белковых или нуклеотидных последовательностей. Пары сегментов с высокими очками могут быть идентифицированы (т.е. выровнены), альтернативно, с помощью матрицы очков, многие из которых известны в данной области техники. В одном аспекте используемая матрица очков представляет собой матрицу ΒΕ0δυΜ62 (Сопле! е1 а1., δ^ι^ 256:1443-1445, 1992; Неп1коГГ апй НешкоГГ, РгсИетк 17:49-61, 1993). В одном аспекте могут быть также использованы матрицы РАМ или РАМ250 (см., например, δ№\\ΉΠζ апй ОауНоГГ, ейк., 1978, ΜιΙγ^κ Гог Ие1есйпд 0№апсе ИекйюпкЫрк: АЙак ой Рго1ет δе^иеηсе апй δΙαΒαι^Ό, /акЫпдШп: ^йоп! Вюте±са1 Кекеагсй Еоипйайоп).

В одном аспекте для определения имеет ли нуклеиновая кислота требуемую идентичность последовательности, чтобы входить в объем изобретения, как предлагается в настоящем описании, используют программы NСΒI Β^ΑδТ 2.2.2 с опциями по умолчанию по Ь1ак1р. В программе Β^ΑδТ 2.2.2 существует около 38 установочных опций. В этом иллюстративном аспекте, предлагаемом в настоящем описании, используются все величины по умолчанию, кроме установки фильтрации по умолчанию (т.е. все параметры устанавливаются по умолчанию, за исключением фильтрации, которая устанавливается на выключено); на этом месте используется установка -Е Е, которая блокирует фильтрацию. Использование фильтрации по умолчанию часто ведет к нарушениям Каг1ш-АЙ8сйи1, обусловленным короткой длиной последовательности.

Величины по умолчанию, используемые в этом иллюстративном аспекте, предлагаемом в настоящем описании, включают фильтр для низкой сложности: включено, размер слова: 3,

- 37 020145 матрица: В1озит62, цена пробела: наличие: 11 удлинение: 1.

Другие установки по умолчанию представляют собой фильтр для низкой сложности выключено, размер слов 3 для белка, матрицу В1озит62, штраф за наличие пробела -11 и штраф за удлинение пробела -1. В одном аспекте опция -Ψ по умолчанию 0. Это означает, что, если не установлено, размер слова по умолчанию составляет 3 для белков и 11 для нуклеотидов.

Компьютерные системы и компьютерные программные продукты.

Для определения и идентификации идентичности последовательностей, структурных гомологий, мотивов и тому подобного 1и зШсо последовательность, предлагаемая в настоящем описании, может сохраняться, записываться и с ней могут проводиться манипуляции на любом носителе, который может считываться компьютером и для которого в компьютере есть доступ. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются компьютеры, компьютерные системы, компьютерные носители программ, компьютерные программные продукты и тому подобное, содержащие в себе (включающие) последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, записанные или сохраненные на них. Применяемые в настоящем описании слова записанный и сохраненный относятся к процессу хранения информации на компьютерном носителе. Специалист в данной области техники может легко усвоить любые известные методы записи информации на компьютерном носителе программ для получения продуктов, включающих одну или более последовательностей нуклеиновых кислот и/или полипептидов, предлагаемых в настоящем описании.

В другом аспекте в настоящем описании предлагается компьютерный носитель программ, обладающий записанной на нем по меньшей мере одной последовательностью нуклеиновой кислоты и/или полипептида, предлагаемых в настоящем описании. Компьютерные носители программ включают магнитные компьютерные носители программ, оптические компьютерные носители программ, электронные компьютерные носители программ и магнитные/электронные носители. Например, компьютерные носители программ могут представлять собой жесткий диск, дискету, магнитную ленту, СО-КОМ, цифровой видеодиск (ΌνΌ), оперативное запоминающее устройство (КАМ) или постоянное запоминающее устройство (КОМ), а также другие типы других носителей, известные специалистам в данной области техники.

Аспекты, предлагаемые в настоящем описании, включают системы (например, системы на основе Интернета), в частности компьютерные системы, которые сохраняют и осуществляют манипуляции с описанными в настоящем описании последовательностями и с информацией о последовательностях.

Один пример компьютерной системы 100 иллюстрируется в блок-схеме на фиг. 1. Применяемый в настоящем описании термин компьютерная система относится к аппаратным компонентам, компонентам программного обеспечения и компонентам хранения данных, используемых для анализа нуклеотидной или полипептидной последовательности, предлагаемой в настоящем описании.

Компьютерная система 100 может включать процессор для обработки, доступа и проведения манипуляций с данными последовательностей. Процессор 105 может представлять собой любой хорошо известный тип центрального процессора, такой как, например, Реийит III от 1и1е1 Сотротайоп, или сходный процессор от 8ип, Мо!ого1а, Сотрац, АМО или 1п1егпа1юпа1 Визтезз МасИпез. Компьютерная система 100 представляет собой систему для общих целей, которая включает процессор 105 и один или более компонентов 110 внутреннего хранения данных для хранения данных и одно или более извлекающих данные устройств для извлечения данных, хранящихся на компонентах хранения данных. Специалист в данной области техники может легко оценить, что какие-либо компьютерные системы, доступные в настоящее время, являются подходящими.

В одном аспекте компьютерная система 100 включает процессор 105, соединенный с магистральной шиной, которая соединена с основным запоминающим устройством 115 (альтернативно реализуемым как КАМ) и одним или более компонентов 110 внутреннего хранения данных, таких как жесткий диск и/или другие носители информации, обладающие записанными на них данными. Компьютерная система 100 может дополнительно включать одно или более извлекающих данные устройств 118 для считывания данных, хранящихся на устройствах 110 внутреннего хранения данных. Извлекающее данные устройство 118 может быть представлено, например, дисководом для дискет, магнитной лентой или модемом, способным осуществлять связь с данными, поступающими из удаленных пунктов системы хранения (например, через Интернет) и т.д. В некоторых вариантах осуществления устройство 110 внутреннего хранения данных представляет собой сменный компьютерный носитель, такой как дискета, компакт-диск, магнитная лента и т.д., содержащий логические схемы управления и/или записанные на нем данные. Компьютерная система 100 может преимущественно включать или программироваться подходящей компьютерной программой для чтения логических схем управления и/или данных из компонента хранения данных, уже введенных в устройство для извлечения данных. Компьютерная система 100 включает дисплей 120, который используется для вывода данных на дисплей для компьютерного пользователя. Следует также отметить, что компьютерная система 100 может быть соединена с другими компьютерными системами 125а-с в сетевом окружении или более широкой области сети для обеспечения централизованного доступа к компьютерной системе 100. Компьютерная программа для доступа и обработки

- 38 020145 нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, предлагаемых в настоящем описании, может постоянно храниться в основном запоминающем устройстве 115 в процессе исполнения. В некоторых аспектах компьютерная система 100 может дополнительно включать алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. Алгоритм и последовательность(и) могут храниться на компьютерном носителе программ. Алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или более программам, которые выполняются (местно или удаленно) на компьютерной системе 100 для сравнения нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, хранящимися на устройствах хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем описании, хранящиеся на компьютерном носителе программ с реперными последовательностями, хранящимися на компьютерном носителе программ, для идентификации гомологии или структурных мотивов.

Параметры, используемые в указанных выше алгоритмах, могут быть адаптированы в зависимости от длины последовательности и исследуемой степени гомологии. В некоторых аспектах параметры могут представлять собой параметры по умолчанию, используемые алгоритмами в отсутствие команд пользователя. На фиг. 2 представлена блок-схема, иллюстрирующая один аспект процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей, для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. База данных последовательностей может представлять собой персональную базу данных, сохраняемую в компьютерной системе 100, или общедоступную базу данных, такую как бЕИВАЫК, которая доступна через Интернет. Процесс 200 начинается с исходной стадии 201 и затем движется к стадии 202, на которой новая последовательность, подвергаемая сравнению, сохраняется в памяти компьютерной системы 100. Как обсуждалось выше, память может представлять собой любой тип памяти, включая КАМ или устройство внутреннего хранения данных. Процесс 200 затем движется к стадии 204, на которой базу данных последовательностей открывают для анализа и сравнения. Процесс 200 затем движется к стадии 206, на которой первая последовательность, сохраненная в базе данных, считывается из памяти компьютера. Затем на стадии 210 осуществляется сравнение для определения, является ли первая последовательность той же самой, что и вторая последовательность. Важно отметить, что эта стадия не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью в базе данных. Специалистам в данной области техники известны хорошо знакомые методы сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, в одну последовательность могут быть введены пробелы для того, чтобы поднять уровень гомологии между двумя тестируемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют либо пробелы, либо другие характеристики, вводимые в последовательность в процессе сравнения, обычно вводятся пользователем компьютерной системы. После осуществления сравнения двух последовательностей на стадии 210 производится принятие решения на стадии 210, являются ли две последовательности одинаковыми. Конечно, термин одинаковые не ограничивается последовательностями, которые абсолютно идентичны. Последовательности, которые находятся в пределах параметров гомологии, введенных пользователем, должны быть отмечены как одинаковые в процессе 200. Если принято решение, что две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 движется к стадии 214, на которой название последовательности из базы данных демонстрируется на дисплее пользователю. Эта стадия уведомляет пользователя о том, что последовательность с изображенным на дисплее названием удовлетворяет введенным требованиям, накладывающим ограничения на гомологию. После того как название запомненной последовательности изображается на дисплее для пользователя, процесс 200 движется к стадии принятия решения 218, на которой определяется, существуют ли еще такие последовательности в базе данных. Если больше таких последовательностей в базе данных не существует, то процесс 200 оканчивается на конечной стадии 220. Однако если действительно в базе данных существуют еще последовательности, то процесс 200 движется к стадии 224, на которой курсор движется к следующей последовательности в базе данных, так что она может быть сравнена с новой последовательностью. Таким способом новая последовательность выравнивается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных. Следует отметить, что если на стадии принятия решения 212 определено, что последовательности не являются гомологичными, то процесс 200 должен немедленно двигаться к стадии принятия решения 218 для того, чтобы определить, доступны ли какие-либо другие последовательности в базе данных для сравнения. Соответственно в одном аспекте в настоящем описании предлагается компьютерная система, включающая процессор, устройство для хранения данных, обладающее сохраненной на нем последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, и последовательность сравнения для проведения сравнения. Последовательность сравнения может указывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с этими последовательностями нуклеиновых кислот и полипептидными последовательностями. На фиг. з представлена блок-схема, иллюстрирующая один вариант осуществления процесса 250 в компьютере, для определения, являются ли две последовательности гомологичными. Процесс 250 начинается с исходной ста

- з9 020145 дии 252 и затем движется к стадии 254, на которой первая последовательность, подвергаемая сравнению, сохраняется в памяти. Затем на стадии 256 сохраняется в памяти вторая последовательность, подвергаемая сравнению. Процесс 250 затем движется к стадии 260, на которой считывается первая буква первой последовательности, и затем к стадии 262, на которой считывается первая буква второй последовательности. Должно быть понятно, что, если последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, то буква должна обычно представлять собой либо А, Т, С, С, либо и. Если последовательность представляет собой белковую последовательность, то это может быть однобуквенный код аминокислот, так что первые буквы последовательностей могут легко сравниваться. Затем на стадии принятия решения 264 определяется, являются ли две буквы одинаковыми. Если они одинаковы, затем процесс 250 движется к стадии 268, на которой считываются следующие буквы в первой и второй последовательностях. Затем определяется, являются ли следующие буквы одинаковыми. Если они одинаковы, затем процесс 250 продолжает этот цикл до тех пор, пока две буквы станут не одинаковыми. Если определяется, что следующие две буквы не являются одинаковыми, процесс 250 движется к стадии принятия решения 274 для определения, существует ли еще сколько-то букв в каждой последовательности для считывания. Если больше нет букв для считывания, затем процесс 250 движется к стадии 276, на которой уровень гомологии между первой и второй последовательностями отображается на дисплее для пользователя. Уровень гомологии определяется с помощью расчета пропорции букв, которые являются одинаковыми у последовательностей, относительно общего количества букв в первой последовательности. Таким образом, если каждая буква в первой последовательности из 100 нуклеотидов выровнена с каждой буквой во второй последовательности, то уровень гомологии должен составлять 100%.

Альтернативно, компьютерная программа может сравнивать реперную последовательность с последовательностью, предлагаемой в настоящем описании, для определения, отличаются ли последовательности по одному или более положениям. Программа может записывать длину и идентичность вставленных, удаленных или замененных нуклеотидов или аминокислотных остатков в отношении последовательности либо реперной, либо последовательности, предлагаемой в настоящем описании.

Компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли реперная последовательность однонуклеотидный полиморфизм (8№) по отношению к последовательности, предлагаемой в настоящем описании, или включает ли последовательность, предлагаемая в настоящем описании, 8№ известной последовательности. Таким образом, в некоторых аспектах компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует 8№. Метод может осуществляться компьютерной системой, описанной выше, и с помощью метода, проиллюстрированного на фиг. 3. Метод может осуществляться с помощью считывания последовательности, предлагаемой в настоящем описании, и реперных последовательностей с использованием компьютерной программы и идентификации различий с помощью компьютерной программы.

В других аспектах система на основе компьютера включает идентификатор для идентификации признаков нуклеиновой кислоты или полипептида, предлагаемых в настоящем описании.

Идентификатор относится к одной или более программам, которые идентифицируют определенные признаки в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания (ΟΒΡ) в нуклеотидной последовательности. На фиг. 4 представлена блок-схема, иллюстрирующая один аспект процесса идентификации 300, для определения присутствия признаков в последовательности. Процесс 300 начинается с исходной стадии 302 и затем движется к стадии 304, на которой первая последовательность, которая подвергается проверке на признаки, сохраняется в памяти 115 в компьютерной системе 100. Процесс 300 затем движется к стадии 306, на которой открывается база данных признаков последовательностей. Такая база данных должна включать перечень показателей каждого признака наряду с названием признака. Например, название признака может представлять собой инициирующий кодон и показателем должно быть ΛΤΟ. Другим примером должно быть название признака ТААТАА бокс и показателем признака должно быть ТААТАА. Пример такой базы данных создан генетической компьютерной группой университета Висконсина. Альтернативно, признаки могут представлять собой структурные мотивы полипептидов, такие как альфа-спирали, бета-складки, или функциональные полипептидные мотивы, такие как ферментативно активные сайты, мотивы спираль-поворот-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области техники. После открытия базы данных признаков на стадии 306 процесс 300 движется к стадии 308, на которой первый признак считывается с базы данных. Затем на стадии 310 осуществляется сравнение показателя первого признака с первой последовательностью. Затем на стадии принятия решения 316 проводится определение, найден ли показатель признака в первой последовательности. Если показатель найден, то процесс 300 движется к стадии 318, на которой название найденного признака выводится на дисплей для пользователя. Процесс 300 затем движется к стадии 320, на которой проводится определение, существуют ли еще признаки в базе данных. Если больше признаков не существует, то процесс 300 заканчивается на конечной стадии 324. Однако, если в базе данных действительно существуют еще признаки, то процесс 300 считывает признак следующей последовательности на стадии 326 и циклы возвращаются на стадию 310, на которой показатель следующего признака сравнивается с первой последовательностью. Если показатель признака не найден в первой последовательности на ста

- 40 020145 дии принятия решения 316, то процесс 300 движется прямо к стадии принятия решения 320 для того, чтобы определить, существуют ли еще признаки в базе данных. Таким образом, в одном аспекте предлагается компьютерная программа, которая идентифицирует открытые рамки считывания (0КГ).

Полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем описании, могут сохраняться или с ними могут проводиться манипуляции в разнообразных программах процессора данных в разных форматах. Например, последовательность может сохраняться в виде текста в файле в текстовом процессоре, таком как М1СК080ЕТ^0К0™ или ^0К0РЕКЕЕСТ™, или в виде файла А8С11 в разнообразных программах баз данных, знакомых специалистам в данной области техники, таких как ОВ2, 8УВА8Е или 0КЛСЬЕ™. Кроме того, многие компьютерные программы могут быть использованы в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов или источников реперных нуклеотидных последовательностей или полипептидных последовательностей, используемых для сравнения с последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. Программы и базы данных могут включать МАСРАТТЕКИ™ (ЕМВЬ), ^I8СОУЕ1ΥБА8Е™ (группа молекулярных прикладных программ), СЕНЕМШЕ™ (группа молекулярных прикладных программ), Ь00К™ (группа молекулярных прикладных программ), МАСЬ00К™ (группа молекулярных прикладных программ), ВЬА8Т и ВЬА8Т2 (КСВ1), В^А8ТN и ВЬА8ТХ (А11ксНн1 е! а1, 1. Мо1. Вю1. 215: 403, 1990), ЕА8ТА (Реагкоп апб Ыртап, Ргос. КаД. Асаб. 8с1. И8А, 85: 2444, 1988), ЕА8ТОВ™ (Вгибав е! а1. Сотр. Арр. ВюксЕ 6:237-245, 1990), САТАЬУ8Т™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), САТАЬУ8Т™)/8НАРЕ™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), СЕ1Ш)82.1)ВАССЕ88™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ΗΥРОСЕN™(Мо1еси1а^ 8нт.11а1юпк 1пс.), 1пк1цН1 II, (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), 018С0УЕ1™ (Мо1еси1аг 8ппи1а1юпк 1пс.), СНАКМт™ (Мо1еси1аг 8нпи1а1юпк 1пс.), ЕЕЬ1Х™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ОЕЬРН1™к (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), риАЯТЕММ™, (Мо1еси1аг 8нпи1а1юпк 1пс.), ΗОМО^ОСΥ™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), М0ЭЕЕЕ1™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), 1818™ (Мо1еси1аг 81ти1аИопк 1пс.), Циап1а/Рго1ет Оекщп (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), ^ЕВЕАВ™ (Мо1еси1аг 8нпи1а1юпк 1пс.), программу анализа разнообразия ХУЕВЕ-АВ™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), СЕМЕ ЕХРЬ0КЕК™ (Мо1еси1аг 81тц1айопк 1пс.), 8ЕОЕ0ЕЭ™ (Мо1еси1аг 81ти1айопк 1пс.), базу данных доступных химических директорий МОЕ, базу данных, представляющую данные о лекарствах МОЕ, полную базу данных медицинской химии, базу данных ОепхепГк всемирного индекса лекарств, базу данных ВюВу1еМак1егЕ11е, базу данных СепЬапк и базу данных Сепкецп. Многие другие программы и базы данных должны быть известны специалисту в области техники, представленной в настоящем раскрытии.

Мотивы, которые могут быть определены с использованием представленных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновые застежки, мотивы спираль-поворот-спираль, сайты гликозилирования, сайты убиквитинилирования, альфа-спирали и бета-складки, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые управляют секрецией кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислые фрагменты, ферментативно активные сайты, сайты связывания субстрата и сайты ферментативного расщепления.

Г ибридизация нуклеиновых кислот.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях с предлагаемой в настоящем описании нуклеиновой кислотой, например иллюстративной последовательностью, предлагаемой в настоящем описании, например последовательностью, представленной 8ЕЦ ΙΌ N0:1, 8ЕО ΙΌ N0:3, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:9, 8ЕО ΙΌ N0:11, 8ЕО ΙΌ N0:13, 8ЕО ΙΌ N0:15, 8ЕС) ΙΌ N0:17, 8ЕО ΙΌ N0:19, 8ЕО ΙΌ N0:22 или 8ЕО ΙΌ N0:23 либо 8ЕО ΙΌ N0:1, модифицированной для кодирования 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более (нескольких) либо всех вариантов оснований, описанных в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквивалентами, или подпоследовательностями и последовательностями, комплементарными им, или нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, предлагаемый в настоящем описании. Жесткие условия могут представлять собой условия высокой жесткости, условия средней жесткости, условия низкой жесткости, включая описанные в настоящем документе условия высокой и пониженной жесткости.

Гибридизация обозначает процесс, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью за счет спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными так, что конкретную интересующую последовательность можно идентифицировать даже в образцах, в которых она присутствует в низких концентрациях. Жесткие условия могут быть определены, например, по концентрациям соли или формамида в растворах для предварительной гибридизации и гибридизации или по температуре гибридизации, что хорошо известно в данной области техники. Например, жесткость может быть повышена путем снижения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации, изменения времени гибридизации, как подробно описано ниже. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяют по их способности гибридизоваться при различных условиях жесткости (например, высокой, средней и низкой), как представлено в настоящем описании.

В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем

- 41 020145 описании, как определяется по их способности гибридизоваться в жестких условиях, могут составлять от приблизительно пяти остатков до полной длины нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, например могут состоять по меньшей мере из 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков в длину. Включаются также нуклеиновые кислоты, более короткие, чем полноразмерные. Эти нуклеиновые кислоты могут использоваться как, например, зонды для гибридизации, меченые зонды, олигонуклеотидные зонды для ПЦР, ί-РНК, антисмысловые последовательности или последовательности, кодирующие пептиды, связывающиеся с антителами (эпитопы), мотивы, активные сайты и тому подобное.

В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяются по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия приблизительно 50% формамида при приблизительно от 37 до 42°С. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих условия приблизительно от 35 до 25% формамида при приблизительно от 30 до 35°С.

Альтернативно, нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия при 42°С в 50% формамиде, 5Х ББРЕ, 0,3% §Ό§, и при добавлении нуклеиновой кислоты, блокирующей повторяющиеся последовательности, такой как со!-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 мкг/мл деградированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося). В одном аспекте нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяют по их способности гибридизоваться в условиях низкой жесткости, включающих 35% формамид и пониженную температуру 35°С.

После гибридизации фильтр может быть промыт 6Х ББС, 0,5% при 50°С. Эти условия рассматриваются как являющиеся умеренными условиями - формамид выше 25% и условиями низкой жесткости - формамид ниже 25%. Конкретный пример условий гибридизации умеренной жесткости представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 30% формамиде. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 10% формамиде.

Диапазон температуры, соответствующий конкретному уровню жесткости, может быть дополнительно сужен с помощью расчета отношения пуринов к пиримидинам в интересующей нуклеиновой кислоте и соответствующей подгонки температуры. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем описании, определяют также по их способности гибридизоваться в условиях высокой, средней и низкой жесткости, как изложено у АикиЬе1 аиб БатЬгоок. Вариации указанных выше диапазонов и условий хорошо известны в данной области техники. Условия гибридизации дополнительно обсуждаются ниже.

Указанная выше процедура может быть модифицирована для идентификации нуклеиновых кислот, обладающих пониженными уровнями гомологии по отношению к последовательности зонда. Например, для получения нуклеиновых кислот с пониженной гомологией по отношению к определяемому зонду могут быть использованы менее жесткие условия. Например, температура гибридизации может быть снижена с шагом 5°С с 68 до 42°С в буфере для гибридизации, имеющем концентрацию №1' приблизительно 1 М. После гибридизации фильтр может быть промыт 2Х ББС, 0,5% БОБ при температуре гибридизации. Эти условия рассматриваются как условия умеренной жесткости - выше 50°С и как условия низкой жесткости - ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится при 55°С. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится при 45°С.

Альтернативно, гибридизация может быть осуществлена в буферах, таких как 6Х 88С, содержащих формамид при температуре 42°С. В этом случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена с шагом 5% от 50 до 0% для идентификации клонов, имеющих пониженные уровни гомологии с зондом. После гибридизации фильтр может быть промыт 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматриваются как условия умеренной жесткости - формамид выше 25% и как условия низкой жесткости - формамид ниже 25%. Конкретный пример условий гибридизации умеренной жесткости представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 30% формамиде. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 10% формамиде.

Однако выбор формата гибридизации не является критическим - именно жесткость условий промывки является условием, которое определяет, входит ли нуклеиновая кислота в предлагаемый в настоящем описании объем изобретения. Условия промывки, используемые для идентификации входят ли нуклеиновые кислоты в предлагаемый в настоящем описании объем изобретения, включают, например, концентрацию соли приблизительно 0,02 мол. при рН 7 и температуру по меньшей мере приблизительно 50 или от приблизительно 55 до приблизительно 60°С; или концентрацию соли приблизительно 0,15 М Хао при 72°С в течение приблизительно 15 мин; или концентрацию соли приблизительно 0,2Х 88С при температуре по меньшей мере приблизительно 50 или приблизительно от 55 до приблизительно 60°С в течение от приблизительно 15 до приблизительно 20 мин; или гибридизационный комплекс промывают

- 42 020145 дважды раствором с концентрацией соли приблизительно 2Х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8, при комнатной температуре в течение 15 мин, и затем промывают дважды 0,1Х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8 при 68°С в течение 15 мин; или эквивалентные условия. Смотри, 8атЬгоок, Туккеп апб Απκπ^1 для описания буфера 88С и эквивалентных условий.

Эти методы могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании.

Олигонуклеотидные зонды и методы их использования.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются зонды нуклеиновых кислот для идентификации нуклеиновых кислот, колирующих полипептид с гидролазной активностью, например с липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью. В одном аспекте зонд включает по меньшей мере 10 последовательных оснований нуклеиновой кислоты, как предлагается в настоящем описании. Альтернативно, зонд, предлагаемый в настоящем описании, может составлять по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более или приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70 последовательных оснований последовательности, как представлено в нуклеиновой кислоте, предлагаемой в настоящем описании. Зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту в результате связывания и/или гибридизации. Зонды могут быть использованы в матрицах, предлагаемых в настоящем описании, см. обсуждение ниже, включая, например, капиллярные матрицы. Зонды, предлагаемые в настоящем описании, могут также использоваться для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.

Зонды, предлагаемые в настоящем описании, могут использоваться для определения, содержит ли биологический образец, например образец почвы, организм, обладающий последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании (например, нуклеиновой кислоты, кодирующей гидролазу), или организм, из которого получена нуклеиновая кислота. В таких методах получают биологический образец, потенциально скрывающий организм, из которого выделяется нуклеиновая кислота, и из образца получают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты вводят в контакт с зондом в условиях, которые позволяют зонду специфически гибридизоваться с любыми комплементарными последовательностями, присутствующими в образце. Когда это необходимо, условия, которые позволяют зонду специфически гибридизоваться с комплементарными последовательностями, могут быть определены путем помещения зонда в контакт с комплементарными последовательностями из образцов, известных как содержащие комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарную последовательность. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида буфера для гибридизации или температура гибридизации, могут варьироваться для идентификации условий, которые позволяют зонду специфически гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами (см. обсуждение конкретных условий гибридизации).

Если образец содержит организм, из которого выделяется нуклеиновая кислота, затем определяется специфическая гибридизация зонда. Гибридизация может быть определена в результате промечивания зонда определяемым агентом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование определяемого продукта. Специалистам в данной области техники известно много методов использования меченых зондов для определения присутствия комплементарных нуклеиновых кислот в образце. Они включают иммуноблотинги, нозерн-блотинги, методы гибридизации колоний и дот-блотинги. Протоколы для каждого из этих методов предлагаются у ΑиκиЬе1 и 8атЬгоок.

Альтернативно, более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфически гибридизоваться с любой из комплементарных последовательностей, которые присутствуют в образце нуклеиновых кислот), могут быть использованы в реакции амплификации для определения, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании (например, организм, из которого выделяется нуклеиновая кислота). В одном аспекте зонды включают олигонуклеотиды. В одном аспекте реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны у ΑиκиЬе1 и 8атЬгоок (см. обсуждение реакций амплификации). В таких методах нуклеиновые кислоты в образце вводят в контакт с зондами, осуществляют реакцию амплификации и определяют любой конечный продукт амплификации. Продукт амплификации может быть определен с помощью выполнения гель-электрофореза продуктов реакции и окрашивания геля интеркалирующим красителем, таким как бромид этидия. Альтернативно, один или более зондов могут быть помечены радиоактивным изотопом и присутствие радиоактивного продукта амплификации может быть определено с помощью авторадиографии после гель-электрофореза.

Зонды, происходящие из последовательностей вблизи 3'- или 5'-концов последовательности нуклеиновой кислоты, как предлагается в настоящем описании, также могут быть использованы в методах прогулок по хромосоме для идентификации клонов, содержащих дополнительные, например геномные, последовательности. Такие методы позволяют выделять гены, которые кодируют дополнительные интересующие белки из организма хозяина.

- 43 020145

В одном аспекте последовательности нуклеиновых кислот, предлагаемые в настоящем описании, используются в качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах идентифицированные таким образом родственные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из организмов, отличных от организма, из которого была впервые выделена нуклеиновая кислота, предлагаемая в настоящем описании. В таких методах образец нуклеиновой кислоты вводят в контакт с зондом в условиях, которые позволяют зонду специфически гибридизоваться с родственными последовательностями. Г ибридизацию зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма затем определяют с использованием любого из методов, описанных выше.

В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня жесткости, должны варьироваться в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации. Например, при выборе условий гибридизации могут рассматриваться длина, степень комплементарности, состав последовательностей нуклеиновой кислоты (например, содержание СС по отношению к ΑΤ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК против ДНК) гибридизуемых областей нуклеиновых кислот. Дополнительно рассматривается, иммобилизована ли одна из нуклеиновых кислот, например, на фильтре. Гибридизация может быть осуществлена в условиях низкой жесткости, умеренной жесткости или высокой жесткости. В качестве примера гибридизации нуклеиновых кислот полимерную мембрану, содержащую иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты, первоначально предварительно гибридизуют в течение 30 мин при 45°С в растворе, содержащем 0,9 М №С1, 50 мМ NаΗ₂ΡО₄, рН 7,0, 5,0 мМ ΝτΕΩΤΑ, 0,5% δΩδ, 10Х раствора Денхардта и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем к раствору добавляют приблизительно 2х10⁷ имп/мин олигонуклеотидного зонда, меченного концевым ³²Р (со специфической активностью 4-9х10⁸ имп/мин/мкг). После инкубации в течение 12-16 ч мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре (ΚΤ) в 1Х δΕΤ (150 мМ №С1, 20 мМ триса-гидрохлорида, рН 7,8, 1 мМ ΝγΕΩΤΑ), содержащем 0,5% δΩδ, с последующим промыванием в течение 30 мин в свежем 1Х δΕΤ при Τт 10°С. Мембрану затем экспонируют с авторадиографической пленкой для определения сигналов гибридизации.

С помощью вариаций жесткости условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с определяемым зондом, могут быть идентифицированы и выделены нуклеиновые кислоты, обладающие различными уровнями гомологии с зондом. Жесткость может варьироваться путем проведения гибридизации при варьировании температур ниже точек плавления зондов. Температура плавления, Τт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с полностью комплементарным зондом. Очень жесткие условия выбирают как равные или приблизительно на 5°С ниже Τт конкретного зонда. Точка плавления зонда может быть рассчитана с использованием следующих иллюстративных формул. Для зондов из от 14 до 70 нуклеотидов в длину температура плавления Τт рассчитывается с использованием формулы: Τт=81,5+16,6(1од[Nа+])+0,41(фракции С+С)(600/Ν), где Ν представляет собой длину зонда. Если гибридизация осуществляется в растворе, содержащем формамид, точка плавления может быть рассчитана с использованием равенства: Τт=81,5+16,6(1од[Nа+])+0,41(фракции С+С)-(0,63% формамида)-(600/Ц), где N представляет собой длину зонда. Предварительная гибридизация может быть осуществлена в 6Х 88С, 5Х реагента Денхардта, 0,5% δΩδ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или 6Х 88С, 5Х реагента Денхардта, 0,5% δΩδ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы δδС и реагента Денхардта, а также других растворов перечислены, например, у δатЬгоок.

В одном аспекте гибридизацию проводят путем добавления определяемого зонда к растворам для предварительной гибридизации, перечисленным выше. Когда зонд включает двухцепочечную ДНК, его денатурируют перед добавлением к раствору для гибридизации. Фильтр контактирует с раствором для гибридизации в течение периода времени, достаточного для позволения зонду гибридизоваться с последовательностями, содержащими кДНК или геномные ДНК, комплементарными зонду или гомологичными ему. Для зондов из более 200 нуклеотидов в длину гибридизация может быть осуществлена при температуре на 15-25°С ниже Τт. Для более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизация может быть проведена при температуре на 5-10°С ниже Τт. В одном аспекте гибридизации в 6Х δδС проводят при приблизительно 68°С. В одном аспекте гибридизации в растворах, содержащих 50% формамид, проводят при приблизительно 42°С. Все вышеизложенные гибридизации должны рассматриваться как проводимые в условиях высокой жесткости.

В одном аспекте после гибридизации фильтр промывают для удаления любого неспецифически связавшегося определяемого зонда. Жесткость, используемая для промывания фильтров, также может варьироваться в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации, длины нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации, степени комплементарности, состава нуклеотидной последовательности (например, содержания СС относительно ΑΤ) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК против ДНК). Примеры прогрессивно повышающихся условий жесткости промывки являются следующими: 2Х 88С, 0,1% δΩδ при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая жесткость); 0,1Х

- 44 020145

88С, 0,5% 8Ό8 при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение от 15 до 30 мин при температуре гибридизации 68°С (высокая жесткость) и 0,15 М ЫаС1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая жесткость). Финальная промывка при низкой жесткости может быть проведена в 0,1Х 88С при комнатной температуре. Представленные выше примеры являются просто иллюстрацией одного набора условий, которые могут быть использованы для промывки фильтров. Специалист в данной области техники должен знать, что существует множество прописей для промывок с разной жесткостью.

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с зондом, могут быть идентифицированы с помощью авторадиографии или других общепринятых методов. Указанный выше метод может быть модифицирован для идентификации нуклеиновых кислот, обладающих пониженными уровнями гомологии с последовательностью зонда. Например, для получения нуклеиновых кислот с пониженной гомологией к определяемому зонду могут быть использованы менее жесткие условия. Например, температура гибридизации может быть понижена с шагом 5°С с 68 до 42°С в буфере для гибридизации, обладающем концентрацией №1' приблизительно 1 М. После гибридизации фильтр может быть промыт 2Х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Эти условия рассматриваются как являющиеся условиями умеренной жесткости - температура выше 50°С и условиями низкой жесткости - температура ниже 50°С. Примером умеренных условий гибридизации является такой, когда указанная выше гибридизация проводится при 55°С. Примером условий гибридизации низкой жесткости является такой, когда указанная выше гибридизация проводится при 45°С.

Альтернативно, гибридизация может быть осуществлена в буферах, таких как 6Х 88С, содержащих формамид, при температуре 42°С. В этом случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена с шагом 5% с 50 до 0% для идентификации клонов, обладающих пониженными уровнями гомологии с зондом. После гибридизации фильтр может быть промыт 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматриваются как являющиеся умеренными условиями - формамид выше 25% и условиями низкой жесткости - формамид ниже 25%. Конкретным примером умеренных условий гибридизации является такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 30% формамиде. Конкретным примером условий гибридизации низкой жесткости является такой, когда указанная выше гибридизация проводится в 10% формамиде.

Эти зонды и методы, предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для выделения или идентификации (например, с использованием матрицы) нуклеиновых кислот, обладающих последовательностью по меньшей мере приблизительно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании, включающей по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более ее последовательных оснований, и последовательностями, комплементарными ей. Гомология может быть измерена с использованием алгоритма выравнивания, как обсуждалось в настоящем описании. Например, гомологичные полинуклеотиды могут иметь кодирующую последовательность, которая является существующим в природе аллельным вариантом одной из кодирующих последовательностей, описанных в настоящем описании. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или добавление одного или более нуклеотидов по сравнению с нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем описании.

Кроме того, зонды и методы, предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для выделения или идентификации (например, с использованием матрицы) нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, обладающие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью (гомологией) последовательности с полипептидом, предлагаемым в настоящем описании, включающим по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 либо более его последовательных аминокислот, как определяется с помощью алгоритма выравнивания последовательностей, например, такого как алгоритм ЕА8ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию или программа ВБА8Т 2.2.2 с примерами установок, как представлено в настоящем описании.

Ингибирование экспрессии гидролаз.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, комплементарные (например, их антисмысловые последовательности) предлагаемым в настоящем описании последовательностям нуклеиновых кислот, например последовательностям, кодирующим гидролазу.

Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию генов, кодирующих гидролазу. Ингибирование может быть осуществлено с использованием ДНК, например ингибиторного рибозима, или РНК, например двухцепочечной ί-РНК, включающей последовательность, предлагаемую в настоящем описании. Транскрипция или функция нуклеиновой кислотымишени может быть ингибирована, например, путем гибридизации и/или расщепления. В настоящем

- 45 020145 описании предлагаются наборы ингибиторов, включающие олигонуклеотиды, способные связывать ген и/или мРНК гидролазы, в любом случае предотвращая или ингибируя продукцию или функцию гидролазы. Связывание может осуществляться с помощью специфической для последовательности гибридизации. Другой пригодный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление мРНК гидролазы. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, как в случае рибозимов. Олигонуклеотид может быть химически модифицированным или конъюгированным с ферментом или композицией, способной расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Можно проводить скрининг пула многих различных таких олигонуклеотидов для выявления олигонуклеотидов с желаемой активностью.

Антисмысловые олигонуклеотиды.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются антисмысловые олигонуклеотиды, способные связывать мРНК гидролазы, которые могут ингибировать активность гидролазы в результате направленного действия на мРНК или геномную ДНК. Стратегии получения антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области техники может получить такие олигонуклеотиды против гидролазы с использованием новых реагентов, предлагаемых в настоящем описании. Например, протоколы поиска генов с помощью прогулок по хромосоме/картирования РНК для скрининга эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области техники, см., например, Но (2000) МеШобк Епхуто1. з14:168-18з, описывающего метод картирования РНК, который основывается на стандартных молекулярных методах, для предоставления легкого и надежного метода отбора эффективных антисмысловых последовательностей; см. также Зтб11 (2000) Еиг. 1. РЬагт. Зск 11: 191-198.

В одном аспекте в качестве антисмысловых олигонуклеотидов используются полученные рекомбинантно или выделенные из природных источников нуклеиновые кислоты. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть любой длины; например, в альтернативных аспектах антисмысловые олигонуклеотиды содержат от приблизительно 5 до 100, от приблизительно 10 до 80, от приблизительно 15 до 60, от приблизительно 18 до 40 оснований. Антисмысловые олигонуклеотиды могут представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную РНК или ДНК. Оптимальная длина может быть определена с помощью обычного скрининга. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена с помощью обычного скрининга. Известно большое разнообразие синтетических, не существующих в природе аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут разрешить эту потенциальную проблему. Например, могут использоваться пептидные нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ), содержащие неионные каркасы, такие как Ы-(2-аминоэтил)глициновые единицы. Могут также использоваться антисмысловые олигонуклеотиды, обладающие фосфоротиоатными связями, как описано в патентах АО 97/0з211; АО 96/з9154; Ма1а (1997) Тох1со1 Арр1 Р1агтасо1 144:189-197; Апбкепке Ткегареибск, еб. Адгате1 (Нитаиа Ргекк, То1о\\'а, N1, 1996). В настоящем описании предлагаются антисмысловые олигонуклеотиды, обладающие каркасами синтетических аналогов ДНК, которые также включают фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, алкиловые фосфотриэфирные, сульфаматные, з'-тиоацетальные, метилен(метилимино), з'-№карбаматные и морфолинокарбонатные нуклеиновые кислоты, как описано выше.

Методы комбинаторной химии могут быть использованы для создания большого количества олигонуклеотидов, скрининг которых можно быстро проводить для поиска конкретных олигонуклеотидов, которые обладают подходящим связывающим сродством и специфичностью в отношении какой-либо мишени, такой как смысловые и антисмысловые последовательности гидролаз, предлагаемые в настоящем описании (см., например, Со1б (1995) 1. оГ Вю1. Скет. 70:1з581-1з584).

Ингибиторные рибозимы.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются рибозимы, способные связываться с мРНК гидролазы, что может ингибировать активность гидролазы в результате направленного действия на мРНК. Стратегии получения рибозимов и отбора специфической для гидролазы антисмысловой последовательности для направленного действия хорошо описаны в научной и патентной литературе и специалист в данной области техники может создать такие рибозимы с использованием новых реагентов, предлагаемых в настоящем описании. Рибозимы действуют в результате связывания с РНК-мишенью через связывающую часть рибозима для РНК-мишени, которая находится в непосредственной близости от ферментативной части РНК, которая расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим узнает и связывает РНК-мишень с помощью комплементарных пар оснований и после связывания с надлежащим сайтом действует ферментативно, расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени таким способом должно разрушить ее способность к прямому синтезу кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связался и расщепил свою РНК-мишень, он обычно освобождается от этой РНК и, таким образом, может связывать и расщеплять новые мишени многократно.

В некоторых условиях ферментативная природа рибозима может иметь преимущества над другими методами, такими как метод антисмысловых последовательностей (когда молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию, трансляцию или свя

- 46 020145 зывание с другой молекулой), так как эффективная концентрация рибозима, необходимая для действия при терапевтическом лечении, может быть более низкой, чем антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, единственная молекула рибозима способна расщепить много молекул РНК-мишени. Кроме того, рибозим обычно представляет собой высоко специфический ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от механизма связывания при спаривании оснований, но также и от механизма, с помощью которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. Это значит, что ингибирование вызывается расщеплением РНК-мишени и поэтому специфичность определяется как отношение скорости расщепления РНК-мишени к скорости расщепления РНК-немишеней. Этот механизм расщепления зависит от факторов, дополняющих факторы, которые вовлечены в образование пар оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть более высокой, чем при связывании антисмыслового олигонуклеотида с тем же сайтом РНК.

Молекула РНК ферментативного рибозима может быть образована в виде мотива головка молотка, но может быть также образована в виде мотива шпильки, вируса гепатита дельта, интрона группы Ι или РНКазы Р-подобной РНК (в ассоциации с направляющей последовательностью РНК). Описаны примеры таких мотивов головки молотка у Кокк1 (1992) Л^бκ Кекеагск апб Нитап Ке1гоу1гикек 8:183; мотивов шпильки у Натре1 (1989) Вюс11ет1к1гу 28:4929 и Натре1 (1990) Шс. Αс^бκ Кек. 18:299; мотива вируса гепатита дельта у Реггойа (1992) Вюс11ет1к1гу 31:16; мотива РНКазы Р у Сиетег-Такаба (1983) Се11 35:849 и интрона группы Ι у Сеск (патент США № 4987071). Перечисление этих конкретных мотивов не предназначено для ограничения; специалисты в данной области техники должны знать, что молекула ферментативной РНК, предлагаемая в настоящем описании, может иметь специфический сайт связывания субстрата, комплементарный одной или более областям РНК гена-мишени, и имеет нуклеотидную последовательность в пределах или вокруг сайта связывания субстрата, которая придает молекуле активность, расщепляющую РНК.

РНК-интерференция (РНК-1).

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются ингибиторные молекулы РНК, так называемые молекулы РНК-ί, включающие последовательность гидролазы, предлагаемую в настоящем описании. Молекула РНК-ί может включать двухцепочечную РНК (бк-РНК), например к1-РНК и/или т1-РНК. РНК-ί может ингибировать экспрессию гена или транскрипта гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). В одном аспекте молекула РНК-ί, например к1-РНК и/или т1-РНК, составляет приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 либо более дуплексов нуклеотидов в длину. Поскольку изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, РНК-ί может вводиться в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (кк-РНК) сходных или идентичных последовательностей, включая эндогенные мРНК. Когда клетка экспонируется с двухцепочечной РНК (бк-РНК), мРНК гомологичного гена избирательно разрушается в результате процесса, называемого РНК-интерференцией (РНК-ί). Основным возможным механизмом действия РНК-ί является разрезание двухцепочечной РНК (бк-РНК), образующей пары с конкретной последовательностью гена, на короткие участки, называемые короткой интерферирующей РНК, которые запускают деградацию мРНК, образующей пары с этой послсВовднолыассггжте РНК-ί, предлагаемые в настоящем описании, используются для терапии с помощью сайленсинга генов, см., например, 81шеу (2002) Эгид 01ксоу. Тобау 7: 1040-1046. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы избирательного разрушения РНК с использованием РНК-ί. Метод может быть осуществлен на практике ш νίΙΐΌ, ех у1уо и ш у1уо. В одном аспекте молекулы РНК-ί, предлагаемые в настоящем описании, могут быть использованы для создания мутации с потерей функции в клетке, в органе или у животного. Методы получения и использования молекул РНК-ί для избирательной деградации РНК хорошо известны в данной области техники, см., например, патенты США № 6506559; 6511824; 6515109; 6489127.

Модификация нуклеиновых кислот.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы получения вариантов нуклеиновых кислот, например нуклеиновых кислот, кодирующих гидролазу или антитело, как предлагается в настоящем описании. Эти методы могут повторяться или использоваться в различных сочетаниях для получения гидролаз или антител, обладающих измененной или отличной активностью, или измененной или отличной стабильностью по отношению к гидролазе или антителу, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой. Эти методы могут также повторяться или использоваться в различных сочетаниях, например, для создания вариантов экспрессии генов/мРНК, трансляции мРНК или стабильности мРНК. В другом аспекте генетический состав клетки изменяют с помощью, например, модификации гомологичного гена ех у1уо с последующим его повторным введением в клетку.

Термин вариант может включать полинуклеотиды или полипептиды, предлагаемые в настоящем описании, модифицированные по одному или более пар оснований, кодонов, интронов, экзонов или аминокислотных остатков соответственно до тех пор, пока сохраняется биологическая активность гидролазы, как предлагается в настоящем описании. Варианты могут быть получены с помощью любого количества методов, включая такие методы, как, например, подверженная ошибкам ПЦР, перетасовка, олиго

- 47 020145 нуклеотид-специфический мутагенез, сборочная ПЦР, мутагенез со скрещиванием с помощью ПЦР, мутагенез 1п νίνο, кассетный мутагенез, мутагенез с рекурсивной сборкой, мутагенез с экспоненциальной сборкой, сайт-специфический мутагенез, СепеВеаккетЫу, С88М^ЗМ и любое их сочетание. В настоящее описание включаются способы получения вариантов гидролаз, обладающих активностью при рН или температуре, например, которые отличаются от гидролазы дикого типа.

Нуклеиновая кислота, предлагаемая в настоящем описании, может быть изменена с помощью различных методов, например произвольных или стохастических методов, или нестохастических, или методов направленной эволюции, см., например, патент США № 6361974. Методы случайного мутагенеза генов хорошо известны в данной области техники, см., например, патент США № 5830696. Например, для случайной мутации гена могут быть использованы мутагены. Мутагены включают, например, ультрафиолетовый свет или гамма-излучение, или химический мутаген, например митомицин, азотистую кислоту, светочувствительные псоралены, поодиночке или в сочетании, для индукции разрывов ДНК, подлежащих репарации с помощью рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги предшественников нуклеотидов, например нитрозогуанидин, 5бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Эти агенты могут быть добавлены к реакции ПЦР вместо предшественника нуклеотидов, тем самым вызывая мутацию последовательности. Могут быть использованы также интеркалирующие агенты, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и тому подобное.

Может быть использован любой метод молекулярной биологии, например опосредованный ПЦР случайный мутагенез, см., например, В1се (1992) Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А 89:5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, см., например, Статей (1995) Β^οίесйη^^иек 18:194-196.

Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например гены, могут быть повторно собраны после случайной или стохастической фрагментации, см., например, патенты США №№ 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. В альтернативных аспектах модификации добавки или делеции вводятся с помощью подверженной ошибкам ПЦР, перетасовки, олигонуклеотидспецифического мутагенеза, сборочной ПЦР, мутагенеза со скрещиванием с помощью ПЦР, мутагенеза 1п νίνο, кассетного мутагенеза, мутагенеза с рекурсивной сборкой, мутагенеза с экспоненциальной сборкой, сайт-специфического мутагенеза, Сепе 8Не δ^υΓηΙιοπ Ми1адепек1к^8М (С88М^ЗМ), повторной сборки с синтетическим лигированием (8ЬВ или СепеВеаккетЫу), рекомбинации, рекурсивной рекомбинации последовательности, мутагенеза модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенеза содержащей урацил матрицы, мутагенеза дуплекса с пропуском, мутагенеза с репарацией точечного несоответствия, мутагенеза штамма хозяина с недостаточностью репарации, химического мутагенеза, радиогенетического мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза с ограничением-селекцией, мутагенеза с ограничениемочисткой, синтеза искусственного гена, сборочного мутагенеза, создания мультимера гибридной нуклеиновой кислоты и/или их сочетания и других методов.

Следующие публикации описывают разнообразные методы рекурсивной рекомбинации и/или методы, которые могут быть включены в методы, предлагаемые в настоящем описании: 81еттег (1999) 'Μο^υ^ Ьгеебтд οί уйикек ίοτ 1агде11пд апб ο11Β2Γ сйшса1 ргорегйек ΤιιιηοΓ Τа^деί^ηд 4:1-4; №кк (1999) №11иге Βίο>Ηιι·ιο1ο§ν 17:893-896; СИапд (1999) Ενο1иί^οη οί а суШкте иктд БНА Гатйу к1шЛ1тд №11иге Β^οίесйηο1οду 17:793-797; Мтк1ш11 (1999) Рго1ет еνο1иί^οη Ьу тο1еси1а^ Ьгеебтд Сиггеп! Ορίπίοπ т С11еппса1 Β^ο1οду 3:284-290; СНг1к11апк (1999) Э|гес1еб еνο1иί^οη οί Л1уппбте Шпаке ίοτ ΛΖΤ р1юкр1югу1аίίοπ иктд БНА Гатбу кйийИпд №11иге Β^οίесйηο1οду 17:259-264; Статей (1998) БНА к1шЛ1тд οί а £ат11у οί депек Ггот бгуегке креЫек ассе1ега1ек биейеб еνο1иί^οη №11иге 391:288-291; Статей (1997) Мο1еси1аг еνο1иί^οη οί ап агкепа1е беίοx^П^саί^οη раШиау Ьу БНА кНиПйпд; №11иге Βίο>Οιπο1ο§ν 15:436-438; 21апд (1997) Э|гес1еб еνο1иί^οη οί ап еЛссйуе Ш^^баке £гот а дайсГОйбаке Ьу БНА кйий1тд апб ксгеептд Ргос. Наб. Асаб. 8сг И8А 94:4504-4509; Рабеп е1 а1. (1997) Арр^а^го οί БНА 81шЙ1тд ίο РНагтасеийса1к апб Уасстек СиггеЫ Ορ^η^οη т Β^οίесйηο1οду 8:724-733; Статей е1 а1. (1996) Οοι·!^.^^ апб еνο1иί^οη οί ай^бу-рИаде НЬгайек Ьу БНА к1шЛ1тд №11иге Мебкте 2:100-103; Са1ек е1 а1. (1996) АППш11у ке1есНге οί Ндапбк Пгош рер11бе НЬгайек ШгоидН б1кр1ау οη а 1ас гертек^ Неабрлесе б1тег

Шип-ий οί Мο1еси1а^ Βίο1ο§ν 255:373-386; 81еттег (1996) 8ехиа1 РСВ апб АккетЬ1у РСВ 1п: Τ1κ ЕпсусШребха οί Мο1еси1а^ Βίο1ο§ν. УСН РиЬНкйегк, Неи ΥογΚ, рр.447-457; Статей апб 81еттег (1995) ί,’οιηόίпаЮпа1 ти1Цр1е саккейе тйадепейк сгеа1ек а11 1Не ρе^тиίаί^οηк οί ти1ап1 апб \\'Пб1уре саккейек Β^οΤесНпк|иек 18:194-195; 81еттег е1 а1. (1995) §1пд1е-к1ер аккетЬ1у οί а депе апб епИге р1акт1б ίοηη 1агде питЬегк οί ο1^дοбеοxуйЬοηис1еοί^бек Сепе, 164:49-53; 81еттег (1995) Лю Ενο1иί^οη οί Мο1еси1а^ Сοтρиίаίίοπ 8с1епсе 270: 1510; 81еттег (1995) 8еагсйпд 8ециепсе 8расе Βίο^Ηιι·ιο1ο§ν 13:549-553; 81еттег (1994) Вар1б еνο1иί^οη οί а рго1ет т νίίτο Ьу БНА кйий1тд №11иге 370:389-391 и 81еттег (1994) БНА йиЛЛтд Ьу ^аηбοт ί^адтеηίаί^οη апб геаккетЬ1у: 1п νίίτο ^есοтЬ^ηаί^οη ίοτ пю1еси1аг еνο1иί^οη. Ргос. Наб. Асаб. 8с1. И8А 91:10747-10751.

Мутационные методы создания разнообразия включают, например, сайт-специфический мутагенез (Ыпд е{ а1. (1997) Арргоасйек ίο БНА тйадепейк: ап ονе^ν^еи Апа1 ΒίοΟκιη. 254(2): 157-178; Ба1е е{ а1. (1996) Ο1^дοηис1еοί^бе-б^^есίеб ^аηбοт тйадепейк иктд 1Не ρйοкρйοгоίЫοаίе теЛюб МеЛюбк Мο1. Βίο1. 57:369-374; 8тйй (1985) 1п νίίτο тйадепейк Апп. Βеν. СепеГ 19:423-462; Βοίδί^ώ & 81югЛе (1985)

- 48 020145 'Ъйа1ед1ек апй аррЬсайопк ой ш уйго ши!адепек1к δ^ι^ 229:1193-1201; Сайег (1986) 'Ъйе-ййес1ей тЫадепек1к ВюсНет. ί. 237: 1-7; и Кипке1 (1987) ТНе ейййепсу ой о11допис1еоййе ййес!ей тп1адепек1к в N1.1с1ек Ас1йк & Μο1еси1а^ Вю1оду (Ескк!е1п, Р. апй ЬШеу, Ό. Μ. ί. ейк., δρ^^πде^ Уег1ад, Вег1ш)); мутагенез с использованием содержащих урацил матриц (Кипке1 (1985) Кар1й апй ей1Ыеп! кйе-кресйю шп1адепек1к ю!Нои! рНепойрю ке1ес!1оп Ргос. №Й. Асай. δ^. ^А 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987) Кар1й апй еГПаегИ кйе-крес1йс тп1адепек1к \\Ыюи1 рНепойрю ке1ес!1оп Μе!Нοйκ ш Εпζуто1. 154, 367-382 и Вакк е! а1. (1988) Μυοώ Тгр гергеккогк \νί11ι пе\у ^NΑ-Ыпйтд кресйюЫек δ^ι^ 242:240-245); олигонуклеотидспецифический мутагенез, (Μοΐΐαάδ ш Εпζуто1. 100: 468-500 (1983); Μе!Нοйк ш Εпζуто1. 154: 329-350 (1987); Ζо11е^ & διηίΐΐι (1982) 011допис1ео!1йе-й1гес!ей тп1адепек1к иктд Μ13^π\^ уесЮгк: ап еГПс1еп1 апй депега1 ргосейиге йог (Не ргойисйоп ой ро1п1 тШайопк ш апу ^NΑ йгадтеп! ШсЮс Ас1йк Кек. 10:64876500; Ζо11е^ & διηίΐΐι (1983) 011допис1ео!1йе-й1гес!ей тп1адепек1к ой ^NΑ йгадтеп!к с1опей ш!о Μ13 уес1огк Μе!Нοйк 1п Е1муто1. 100:468-500; и Ζо11е^ & διηίΐΐι (1987) 011допис1ео!1йе-й1гес!ей тп1адепек1к: а к1тр1е те(Ной иктд 1\\ό о11допис1еоййе рйтегк апй а кшд1е-к!гапйей ^NΑ !етр1а!е Μе!Нοйк ш Εпζуто1. 154:329-350); мутагенез модифицированной фосфоротиоатом ДНК (Тау1ог е! а1. (1985) ТНе ике ой рНокрНого!Ыоа!е-шой1йей ^NΑ ш гек!пс!юп еηζуте геасйопз (о ргераге шскей ^NΑ N^1. Ас1йк Кек. 13: 87498764; Тау1ог е! а1. (1985) ТНе гар1й депегайоп ой о11допис1еоййе-й1гес!ей ти!а!1опк а! ЫдН йгециепсу иктд рНокрНого!Ыоа!е-той1йей ^NΑ N^1. Ас1йк Кек. 13: 8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) ййпЫйоп ой гек!йс!юп епйопис1еаке №ί I с1еауаде Ьу рНокрНого!Ыоа!е дгоирк апй йк аррйсайоп !о о11допис1еоййе-й1гес!ей тЫадепешк N^1. Ас1йк Кек. 14: 9679-9698; δауе^к е! а1. (1988) Υ-Т Ехопис1еакек ш рНокрНого!Ыоа!еЬакей о11допис1еоййе-й1гес!ей ти!адепек1к N^1. Ас1йк Кек. 16:791-802 и δη^Ό^ е! а1. (1988) Ъйапй креаПс с1еауаде ой рНокрНого!Ыоа!е-соп1аштд ^NΑ Ьу геасйоп \νίΐ1ι гекйсйоп епйопис1еакек ш Не ргекепсе ой е!Н1йшт Ьготйе N^1. Ас1йк Кек. 16: 803-814); мутагенез, использующий дуплекс ДНК с пропуском (Кгатег е! а1. (1984) ТНе даррей йир1ех ^NΑ арргоасН !о ойдопис1еоййе-й1гес!ей ти1айоп сопкйисйоп №01. Ас1йк Кек. 12: 9441-9456; Кгатег & ΡπΙζ (1987) Μеΐйοйк ш Εηζуто1. 0йдопис1ео!1йе-й1гес!ей сопкйисйоп ой ти!а!1опк У1а даррей йир1ех ^NΑ 154:350-367; Кгатег е! а1. (1988) 1тргоуей епζутайс ш уйго геасИопк 1п !Не даррей йир1ех ^NΑ арргоасН !о ойдопис1еоййе-й1гес!ей сопкйисйоп ой ти!а!юпк №с1. Ас1йк Кек. 16: 7207; и ΡπΙζ е! а1. (1988) 0йдопис1ео!1йе-й1гес!ей сопкйисйоп ой тШайопк: а даррей йир1ех ^NΑ ргосейиге νίίΠοηΙ епζутайс геасйопз ш уйго №с1. Ас1йк Кек. 16: 6987-6999).

Дополнительные протоколы, используемые в методах, предлагаемых в настоящем описании, включают репарацию точечного несоответствия (Кгатег (1984) Рот! Μ^кта!сН Керай Се11 38:879-887), мутагенез штаммов хозяина с недостаточностью репарации (Сайег е! а1. (1985) 1тргоуей ойдопис1еоййе кйе-й1гес!ей ти!адепек1к иктд Μ13 уес!огк №с1. Ас1йк Кек. 13: 4431-4443; и Сайег (1987) 1тргоуей ο1ίдопис1ео!1йе-й1гес!ей ти!адепек1к иктд Μ1 3 уес!огк Μе!Нοйк ш Εηζутο1. 154: 382-403), делеционный мутагенез (ЕдН!ейагаайеН (1986) ике ой о11допис1еоййек !о депега!е 1агде йе1ейопк №с1. Ас1йк Кек. 14: 5115), ограничение-селекцию и ограничение-селекцию и ограничение-очистку, ^е11к е! а1. (1986) 1тройапсе ой Нуйгодеп-Ьопй йогтайоп ш к1аЫЫтд !Не йапкНюп к!а!е ой киЬййкш РН11. Тгапк. К. δοα Ьопй. А 317: 415-423), мутагенез путем синтеза целого гена ЩашЫаг е! а1. (1984) То!а1 куп!Нек1к апй с1ошпд ой а депе сойшд йог !Не йЬопис1еаке δ рго!еш δ^ι^ 223: 1299-1301; δаката^ апй КНогапа (1988) То!а1 куп!Нек1к апй ехргеккюп ой а депе йог !Не а-киЬиш! ой Ьоуше гой ои!ег кедтеп! диапте пис1еоййе-Ыпйшд рго!еш (йапвйист) N^1. Ас1йк Кек. 14: 6361-6372; Vе11к е! а1. (1985) Саккейе ти!адепек1к: ап еййаеп! те!Ной йог депегайоп ой ти1йр1е тШайопк а! йейпей кйек Сепе 34:315-323; и Сгипйк!гот е! а1. (1985) 011допис1ео!1йе-й1гес!ей ти!адепек1к Ьу т1сгокса1е кНо!-дип депе куп!Нек1к N^1. Ас1йк Кек. 13: 3305-3316), репарацию разрывов двойной цепи ^аМеск (1986); Ато1й (1993) Рго!еш епдшеегтд йог ипикиа1 епу1гоптеп!к Сиггеп! 0р1шоп ш Вю!есйпо1оду 4:450-455. 011допис1еоййе-й1гес!ей йоиЫе-кйапй Ьгеак герай ш р1акт1йк ой ЕксНейсЫа сой: а теЫой йог кйе-кресйю тЫадепеык Ргос. №!1. Асай. δΗ. ^А, 83:7177-7181). Дополнительные подробности многих из указанных выше методов могут быть найдены в книге Μе!Нοйк ш Епζутο1οду, Уо1ите 154, в которой также описываются пригодные контроли для выявления проблем дефектов различных методов мутагенеза.

Дополнительные протоколы, используемые в методах, предлагаемых в настоящем описании, включают протоколы, обсуждаемые в патенте США №№ 5605793, принадлежащем δ!етте^ (25 февраля 1997 г.), Μеΐйοйк йог 1п Уйго КесотЫпайоп; патенте США № 5811238, принадлежащем δ!етте^ е! а1. (22 сентября 1998 г.) Μе!Нοйк йог Сепегайпд Ро1упис1ео!1йек Наутд Эекней СНагас1епкйск Ьу Иегайге δе1ес!юп апй КесотЫпайоп; патенте США № 5830721, принадлежащем δ!етте^ е! а1. (3 ноября 1998 г.), ^NΑ Μи!адепек^к Ьу Капйот Ргадтеп!а!юп апй КеаккетЬ1у; патенте США № 5834252, принадлежащем δ!етте^, е! а1. (10 ноября 1998 г.) Епй-С.’отр1етеп1агу Ро1утегаке Кеасйоп; патенте США № 5837458, принадлежащем Μ^^Π, е! а1. (17 ноября 1998 г.), Μеΐйοйк апй Сотрокйюпк йог Се11и1аг апй Μе!аЬο1^с Епдшеегтд; патенте ν0 95/22625, δ!етте^ апй Статей, Μи!адепек^к Ьу Капйот Ргадтеп!айоп апй КеаккетЬ1у; патенте ν0 96/33207 от δ!етте^ апй ЫрксНиЫ Епй Сотр1етеп1агу Ро1утегаке СНаш Кеасйоп; патенте ν0 97/20078 от δ!етте^ апй Статей Μе!Нοйк йог Сепегайпд Ро1упис1еоййек Наушд Эекйей СНагас!ейк!1ск Ьу Иегайуе δе1ес!^οп апй КесотЫпайоп; патенте ν0 97/35966 от Μώ^^ апй δ!етте^, Μе!Нοйк апй Сотрокйюпк йог Се11и1аг апй ΜеΐаЬο1^с Епдшеегтд; патенте ν0 99/41402 от Риппопеп е! а1. Тагде!шд ой Сепейс Уассше Уес!огк; патенте ν0 99/41383 от Риииοпеп е! а1. Апйдеп ЫЬгагу Iттии^ζа

- 49 020145

Бои; патенте \¥О 99/41369 от Риииоиеи е! а1. Сеиейс Уассте Уес!ог Еидтеепид; патенте \¥О 99/41368 от Риииоиеи е! а1. ОрШт/аРои оГ 1ттииотоби1а!огу Ргорегйек оГ Сеиейс Уасстек; патенте ЕР 752008 от Б!еттег аиб Сгатеп, ΩΝΛ Ми!адеиек1к Ьу Каибот Егадтеи!айои аиб КеаккетЬ1у; патенте ЕР 0932670 от Б!еттег ЕуоМид Се11и1аг ПЫА Ир!аке Ьу КесигкКе Бедиеисе КесотЬтайои; патенте \¥О 99/23107 от Б!еттег е! а1., МобШсайои оГ У1гик Тгор1кт аиб Нок! Каиде Ьу У1га1 Сеиоте Б1шГПтд; патенте \¥О 99/21979 от Ар! е! а1., Нитаи РарШотау1гик Уес!огк; патенте \¥О 98/31837 от бе1 Сагбауге е! а1. Еуо1ийои оГ \У1ю1е Се11к аиб Огдашктк Ьу Кесигыуе Бедиеисе КесотЬтайои; патенте \¥О 98/27230 от Ра!!еи аиб Б!еттег, Мебюбк аиб Сотрокйюик Гог Ро1урерйбе Еидтеепид; патенте \¥О 98/27230 от Б!еттег е! а1., Мебюбк Гог ОрШт/айои оГ Сеие Тйегару Ьу Кесигыуе Бедиеисе БйиЕШид аиб Бе1есйои; патенте \¥О 00/00632, Мебюбк Гог Сеиегайид Н1дЫу Э|уегке ЫЬгапек; патенте \¥О 00/09679, Мебюбк Гог ОЬ!аштд 1и Уйго КесотЬтеб Ро1уиис1еойбе Бедиеисе Ваикк аиб Кеки1йид Бедиеисек; патенте \¥О 98/42832 от Агио1б е! а1., КесотЬтайои оГ Ро1уиис1еойбе Бедиеисек иктд Каибот ог Пейиеб Рптегк; патенте \¥О 99/29902 от Агио1б е! а1., Ме!йоб Гог Сгеайид Ро1уиис1еойбе аиб Ро1урерйбе Бедиеисек; патенте \¥О 98/41653 от У1иб, Аи ш Уйго Ме!1об Гог Соикйисйои оГ а ПЫА ЫЬгагу; патенте \¥О 98/41622 от Вогсйей е! а1., Ме!йоб Гог Соикйисйид а ЫЬгагу иктд ПЫА БйиГйтд и патенте \¥О 98/42727 от Рай и 2агйид, Бедиеисе А1!егайоик иктд Ното1одоик КесотЬтайои.

Протоколы, которые могут быть использованы (предоставляющие подробности относительно различного многообразия созданных методов), описаны, например, в патентной заявке США с порядковым № (ЕББУ) 09/407800, БНиЕЕЫЫС ОЕ СОНОУ АЬТЕКЕП СЕЫЕ8 от Ра!!еи е! а1., зарегистрированной 28 сентября 1999 г.; ЕУОШПОК ОЕ \У1 ЮРЕ СЕЬЬБ АУН ОКСАШБМБ ВУ КЕСИКБ1УЕ БЕОЕРУСЕ КЕСОМВЕИАТЮМ от бе1 Сагбауге е! а1., патенте Соединенных Штатов № 6379964; ОЫСОМиСЬЕОТШЕ МЕЭМТЕЭ УЕСРЕ1С АСЮ КЕСОМВЕКАТЮН от Сгатеп е! а1., патентах Соединенных Штатов №№ 6319714; 6368861; 6376246; 6423542; 6426224 и РСТ/иБ00/01203; ИБЕ ОЕ СО^ОN-УΛΚIЕ^ ОЫС1О\иСЕЕОТП)Е БУЖНЕБЫ ЕОК БУ\ТНЕТ1С БНЕЕЕР1УС от \Уе1сР е! а1., патенте Соединенных Штатов № 6436675; МЕТНОЭБ ЕОК МАКШО СНАКАСТЕК БТКШСБ, РОРУУЕСЕЕОУЮЕБ & РОЬУРЕРТШЕБ НАУШС ОЕБШЕЭ СНАКАСТЕК1БТ1СБ от БейГоиоу е! а1., зарегистрированном 18 января 2000 г., (РСТ/ИБ00/01202) и, например, МЕТ1 Ю1)Б ЕОК МАКШО СНАКАСТЕК БТКШСБ, РОРУУЕСБЕОТШЕБ & РОРУРЕРУШЕБ НАУШС НЕБ1РЕН СНАКАСТЕК1БТ1СБ от БейГоиоу е! а1., зарегистрированном 18 июля 2000 г. (США, серия № 09/618579); МЕТНОЭБ ОЕ РОРЕЕ/АТЫС. ПАТА БТКИСТИКЕБ ЕОК ИБЕ ΙΝ ЕУО^υТIОNΛΚΥ БЕМ^АТЮ^ от БейГоиоу аиб Б!еттег, зарегистрированном 18 января 2000 г. (РСТ/ИБ00/01138); и БINС^Е-БТΚАN^Е^ УЕСРЕ1С АСШ ТЕМРЬАТЕ-МЕП1АТЕП ΚЕСОМΒINАТIОN АУН УЕСРЕ1С АСШ ЕКАСМЕЭТ IБО^АТIОN от МГйо1!ег, зарегистрированном 6 сентября 2000 г. (США, серия № 09/656549) и патенты Соединенных Штатов №№ 6177263; 6153410.

Нестохастические методы или методы направленной эволюции, включающие, например, насыщающий мутагенез генных сайтов (СББМ^бм), повторную сборку с синтетическим лигированием (БЬК или СеиеКеаккетЬ1у) или их сочетание, используются для модификации нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем описании, для получения гидролаз с новыми или измененными свойствами (например, активностью в условиях высокой кислотности или щелочности, высоких температур и тому подобное). Может быть проведен скрининг полипептидов, кодируемых модифицированными нуклеиновыми кислотами, на их активность перед тестированием на протеолитическую или другую активность. Может быть использован любой метод или протокол тестирования, например, с использованием платформы капиллярной матрицы; см., например, патенты США №№ 6361974; 6280926; 5939250.

Насыщающий мутагенез или метод СББМ^бм

В одном аспекте в настоящем описании предлагается нестохастическая модификация генов, процесс направленной эволюции используется для получения гидролаз и антител с новыми или измененными свойствами. Варианты этого метода обозначаются как насыщающий мутагенез генных сайтов, сайт-насыщающий мутагенез, насыщающий мутагенез или просто СББМ^бм. Он может быть использован в сочетании с другими процессами мутагенеза. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются методы получения ферментов и антител с использованием метода СББМ^бм, например, как описано в настоящем документе, а также в патентах США №№ 6171820; 6579258; 6238884.

В одном аспекте метод СББМ^бм включает предоставление матричного полинуклеотида и множества олигонуклеотидов, где каждый олигонуклеотид включает последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, тем самым осуществляется выбор мишени специфической последовательности матричного полинуклеотида для последовательности, которая является вариантом гомологичного гена; создание потомков полинуклеотидов, включающих нестохастические варианты последовательностей путем репликации матричного полинуклеотида с олигонуклеотидами, тем самым создавая полинуклеотиды, включающие варианты последовательности гомологичного гена.

В одном аспекте используют праймеры кодонов, содержащих вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для введения точечных мутаций в полинуклеотид, создавая тем самым набор потомков полинуклеотидов, в которых представлен полный диапазон замен одиночных аминокислот в каждом положении аминокислоты, например целью модификации является аминокислотный остаток в ферментативно активном сайте или в лигандсвязывающем сайте. Эти олигонуклеотиды могут включать прилегающую

- 50 020145 первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т и, необязательно, вторую гомологичную последовательность.

Последующие продукты трансляции потомков использования таких олигонуклеотидов включают все возможные аминокислотные замены в каждом положении аминокислоты вдоль полипептида, потому что вырожденность последовательности Ν,Ν,Ο/Т включает кодоны для всех 20 аминокислот. В одном аспекте один такой вырожденный олигонуклеотид (состоящий из, например, одной вырожденной кассеты Ν,Ν,β/Т) используют для подвергания каждого исходного кодона в родительском матричном полинуклеотиде полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты - либо в том же самом олигонуклеотиде, либо нет, для подвергания по меньшей мере двух исходных кодонов в родительском матричном полинуклеотиде полному диапазону замен кодонов. Например, более одной последовательности Ν,Ν,β/Т может содержаться в одном олигонуклеотиде для введения аминокислотных мутаций более чем в один сайт. Эта множественность последовательностей Ν,Ν,β/Т может быть смежной или разделенной одной или более дополнительной(ыми) нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями). В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавок и делеций, могут быть использованы либо поодиночке, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,β/Т, для введения любого сочетания или перестановки добавок, делеций и/или замен аминокислот.

В одном аспекте одновременный мутагенез двух или более последовательных положений аминокислот делают с использованием олигонуклеотида, который содержит последовательные триплеты Ν,Ν,β/Т, т.е. вырожденную последовательность ЩХ,С/Т)п. В другом аспекте используют вырожденные кассеты, обладающие меньшей вырожденностью, чем последовательность Ν,Ν,β/Т. Например, в некоторых случаях может быть желательным использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, включающей только одно Ν, где указанное N может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, могут быть использованы в оставшихся двух положениях триплета. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательным использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν.

В одном аспекте использование вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,β/Т) позволяет систематически и легко создать полный диапазон возможных природных аминокислот (для всех 20 аминокислот) в каждом и любом положении аминокислоты в полипептиде (в альтернативных аспектах методы также включают создание в положении меньшего количества, чем все возможные замены на аминокислотный остаток или кодон). Например, для полипептида из 100 аминокислот может быть создано 2000 различных представителей (т.е. по 20 аминокислот на положение X в 100 положениях аминокислот). Путем использования олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,β/Т, 32 индивидуальных последовательности могут кодировать все 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором родительскую полинуклеотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, создаются 32 различных полинуклеотида-потомка, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайт-специфическом мутагенезе ведет только к одному полипептидному продукту-потомку на реакционный сосуд. Невырожденные олигонуклеотиды могут, необязательно, использоваться в сочетании с раскрытыми вырожденными праймерами; например, невырожденные олигонуклеотиды могут использоваться для создания конкретных точечных мутаций в работающем полинуклеотиде. Это предоставляет один инструмент для создания точечных молчащих мутаций, точечных мутаций, ведущих к соответствующим заменам аминокислот, и точечных мутаций, которые вызывают создание стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептидов.

В одном аспекте каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 полипептидных молекул-потомков (например, гидролазу, например липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу), так что все 20 природных аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующих положению кодона, подвергаемого мутации в родительском полинуклеотиде (в других аспектах используют меньше чем все 20 природных сочетаний). В 32 раза больше вырожденных полипептидов-потомков, созданных из каждого реакционного сосуда для насыщающего мутагенеза, может быть подвергнуто клональной амплификации (например, клонировано в подходящего хозяина, например в хозяина Е. со11, с использованием экспрессионного вектора) и подвергнуто скринингу на экспрессию. Когда индивидуальный полипептид-потомок идентифицирован с помощью скрининга как проявляющий благоприятное изменение свойства (такого как повышенная селективность гидролиза пальмитатных сложных эфиров по отношению к гидролизу олеатных сложных эфиров при сравнении с родительским полипептидом), он может быть секвенирован для идентификации соответствующей содержащейся в нем благоприятной замены аминокислоты.

В одном аспекте при мутагенезе в каждом и любом положении аминокислоты в родительском полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, раскрытого в настоящем описании, благоприятные аминокислотные замены могут быть идентифицированы в более чем одном положении аминокисло

- 51 020145 ты. Может быть создана одна или более новых молекул-потомков, которые содержат сочетание всех или части этих благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицировано 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, то перестановки включают 3 возможности в каждом положении (отсутствие изменения исходной аминокислоты и каждое из двух благоприятных изменений) и в 3 положениях. Таким образом, существует 3х3х3 или 27 суммарных возможностей, включая 7, которые проверялись ранее - 6 одиночных точечных мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и отсутствие изменения в любом положении.

В другом аспекте насыщающий сайты мутагенез может быть использован совместно с другими стохастическими или нестохастическими методами для изменения последовательности, например методами повторной сборки с синтетическим лигированием (см. ниже), перетасовки, гибридизации, рекомбинации и других методов мутагенеза и агентов, вызывающих мутации. В настоящем описании предлагаются метод(ы) мутагенеза, включающие насыщающий мутагенез, используемые повторяющимся образом.

Повторная сборка с синтетическим лигированием (δΕΚ).

В одном аспекте в настоящем описании предлагаются системы нестохастической модификации генов, называемые повторной сборкой с синтетическим лигированием или просто δΕΚ, также известные как метод СепеКеаккетЫу, процесс направленной эволюции, для получения полипептидов, например ферментов (таких как гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) или антител, как предлагается в настоящем описании, с новыми или измененными свойствами. δΕΚ представляет собой метод лигирования фрагментов нуклеотидов друг с другом нестохастическим образом. Этот метод отличается от стохастической перетасовки олигонуклеотидов тем, что блоки, составляющие нуклеиновую кислоту, не перетасовываются, образуют цепочку или гибридизуются случайным образом, а собираются нестохастически; см., например, патенты США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776.

В одном аспекте δΕΚ включает следующие стадии: (а) обеспечение матричного полинуклеотида, где матричный полинуклеотид включает последовательность, кодирующую гомологичный ген; (Ь) обеспечение множества строительных блоков полинуклеотидов, где строительные блоки полинуклеотидов создаются для повторной сборки путем кроссинговера с матричным полинуклеотидом в предварительно определенной последовательности и полинуклеотид строительного блока включает последовательность, которая является вариантом гомологичного гена, и последовательность, гомологичную варианту последовательности, примыкающему к матричному полинуклеотиду; (с) объединение полинуклеотида строительного блока с матричным полинуклеотидом таким образом, что полинуклеотид строительного блока повторно собирается путем кроссинговера с матричным полинуклеотидом с созданием полинуклеотидов, включающих варианты гомологичных последовательностей гена.

δΕΚ не зависит от наличия высоких уровней гомологии между полинуклеотидами, подвергаемыми перестановке. Таким образом, этот метод может быть использован для нестохастического создания библиотек (или наборов) молекул-потомков, включающих более 10¹⁰⁰ различных гибридов. δΕΚ может быть использована для создания библиотек, включающих более 10¹⁰⁰⁰ различных гибридов-потомков. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются нестохастические методы получения набора окончательных гибридных молекул нуклеиновых кислот, обладающих итоговым порядком сборки, который выбран конструктором. Этот метод включает стадии создания конструкций множества строительных блоков конкретных нуклеиновых кислот, обладающих пригодными взаимно совместимыми концами для лигирования, и сборку этих блоков нуклеиновых кислот так, что достигается задуманный итоговый порядок сборки.

Взаимно совместимые концы для лигирования строительных блоков нуклеиновых кислот, подвергаемых сборке, рассматриваются как являющиеся пригодными для этого типа порядка сборки, если они способны соединять строительные блоки в предварительно определенном порядке. Таким образом, итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены строительные блоки нуклеиновых кислот, устанавливается конструкцией концов для лигирования. Если предполагается использовать более одной стадии сборки, то итоговый порядок сборки, в котором могут быть соединены строительные блоки нуклеиновых кислот, устанавливается также последовательным порядком стадии(ий) сборки. В одном аспекте строительные блоки после отжига обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНКлигаза Т4), для достижения ковалентного связывания строительных блоков.

В одном аспекте конструкцию строительных блоков олигонуклеотидов получают с помощью анализа набора родительских матричных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые служат в качестве основы для получения набора потомков итоговых гибридных полинуклеотидов. Эти родительские матричные олигонуклеотиды служат, таким образом, в качестве источника информации о последовательностях, которая помогает в конструкции строительных блоков нуклеиновой кислоты, которые планируется подвергать мутации, например созданию гибридов или перетасовок. В одном аспекте этого метода последовательности множества родительских матричных нуклеиновых кислот выравнивают для того, чтобы выбрать одну или более точек демаркации. Точки демаркации могут быть локализованы в области гомологии и включают один или более нуклеотидов. Эти точки демаркации альтернативно используются совместно по меньшей мере двумя родительскими матрицами. Точки демаркации могут в

- 52 020145 результате этого быть использованы для описания границ строительных блоков олигонуклеотидов, создаваемых для перестановки родительских полинуклеотидов. Точки демаркации, идентифицированные и отобранные в родительских молекулах, служат в качестве потенциальных точек создания гибридов при сборке итоговых гибридных молекул-потомков. Точка демаркации может представлять собой область гомологии (состоящую по меньшей мере из одного гомологичного нуклеотидного основания), используемую совместно по меньшей мере двумя родительскими полинуклеотидными последовательностями. Альтернативно, точка демаркации может представлять собой область гомологии, которая используется совместно, по меньшей мере, половиной родительских полинуклеотидных последовательностей, или она может представлять собой область гомологии, которая используется совместно по меньшей мере двумя третями родительских полинуклеотидных последовательностей. В альтернативных вариантах осуществления пригодная точка демаркации представляет собой область гомологии, которая используется совместно по меньшей мере тремя четвертями родительских полинуклеотидных последовательностей, или она может использоваться совместно почти всеми родительскими полинуклеотидными последовательностями. В одном аспекте точка демаркации представляет собой область гомологии, которая используется совместно всеми родительскими полинуклеотидными последовательностями.

В одном аспекте процесс повторной сборки с лигированием осуществляют полностью для того, чтобы создать исчерпывающую библиотеку гибридных полинуклеотидов-потомков. Другими словами, все возможные порядковые сочетания строительных блоков нуклеиновых кислот представлены в наборе итоговых молекул гибридных нуклеиновых кислот. В то же самое время в другом аспекте порядок сборки (т.е. порядок сборки каждого строительного блока от 5'- к 3'-концу последовательности каждой итоговой гибридной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании определяется конструктором (или является нестохастическим), как описано выше. В настоящем описании предлагаются нестохастические методы, которые снижают возможность нежелательных побочных продуктов.

В другом аспекте метод повторной сборки с лигированием осуществляют систематически. Например, метод осуществляют для того, чтобы создать систематически компартментализированную библиотеку молекул-потомков с компартментами, скрининг которых можно проводить систематически, например один за другим. В настоящем описании предлагаются методы, включающие избирательное и разумное использование конкретных строительных блоков нуклеиновых кислот, связанное с избирательным и разумным использованием последовательных стадий реакций сборки, конструкция может быть достигнута, когда конкретные наборы продуктов-потомков создаются в каждом из нескольких реакционных сосудов. Это позволяет систематически проверять и проводить скрининг выполняемой процедуры. Таким образом, эти методы позволяют систематически проверять потенциально очень большое количество молекул-потомков в более мелких группах. Из-за своей способности осуществлять образование гибридов способом, который является крайне гибким, к тому же исчерпывающим, а также систематическим, особенно когда присутствует низкий уровень гомологии среди молекул-предшественников, эти методы обеспечивают создание библиотеки (или набора), включающих большое количество молекул-потомков. Из-за нестохастической природы методов моментальной повторной сборки с лигированием созданные молекулы-потомки могут включать библиотеку итоговых гибридных молекул нуклеиновых кислот, обладающих суммарным порядком сборки, который выбирается конструктором. Насыщающий мутагенез и оптимизированные методы направленной эволюции также могут быть использованы для создания различных видов молекул-потомков.

В одном аспекте методы настоящего описания дают свободу выбора и контроля в отношении отбора точек демаркации, размера и количества строительных блоков нуклеиновых кислот и количества и конструирования присоединений. Требование к межмолекулярной гомологии может быть крайне облегченным. Фактически точки демаркации могут даже выбираться в областях низкой межмолекулярной гомологии или в областях ее отсутствия. Например, из-за неоднозначного соответствия кодонов, т.е. вырожденности кодонов, в строительные блоки нуклеиновых кислот могут быть введены замены нуклеотидов без изменения аминокислоты, исходно кодируемой соответствующей родительской матрицей. Альтернативно, кодон может быть изменен так, что кодирование исходной аминокислоты изменяется. В одном аспекте замены могут быть введены в строительный блок нуклеиновой кислоты для того, чтобы увеличить долю межмолекулярных гомологичных точек демаркации и таким образом дать возможность увеличить количество соединений, которые достигаются между строительными блоками, которые, в свою очередь, позволяют создать более высокое число гибридных молекул-потомков.

В другом аспекте синтетическая природа стадии, на которой создаются строительные блоки, позволяет сконструировать и ввести нуклеотиды (например, один или более нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые могут позже, необязательно, удалены в методе 1и У11го (например, с помощью мутагенеза) или в методе 1и У1уо (например, с помощью использования способности к сплайсингу генов в организме-хозяине). Принимается во внимание, что во многих случаях введение этих нуклеотидов может также быть желательным по многим другим причинам в дополнение к потенциальному преимуществу создания пригодной точки демаркации.

В одном аспекте строительный блок нуклеиновой кислоты используется для введения интрона. Та

- 53 020145 ким образом, функциональные интроны вводятся в сделанный человеком ген, полученный в соответствии с методами, описанными в настоящем документе. Искусственно введенный(ые) интрон(ы) может функционировать в клетках-хозяевах в сплайсинге гена главным образом тем же путем, что и существующие в природе интроны функционально служат в сплайсинге гена.

Оптимизированная система направленной эволюции.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нестохастические системы модификации генов, называемые оптимизированной системой направленной эволюции, для получения гидролаз и антител с новыми или измененными свойствами. Оптимизированная направленная эволюция направлена на использование повторяющихся циклов редуктивной повторной сортировки, рекомбинации и селекции, которые позволяют направлять молекулярную эволюцию нуклеиновых кислот путем рекомбинации. Оптимизированная направленная эволюция позволяет создать большую совокупность эволюционировавших гибридных последовательностей, где созданная совокупность существенно обогащена последовательностями, которые имеют предварительно определенное количество событий кроссинговера.

Событие кроссинговера представляет собой точку в гибридной последовательности, в которой в последовательности происходит сдвиг от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. Такая точка обычно находится в месте соединения, в котором олигонуклеотиды от двух родителей лигируются вместе с образованием единой последовательности. Этот метод позволяет рассчитать точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей так, что итоговая совокупность гибридных последовательностей обогащается выбранным количеством событий кроссинговера. Это обеспечивает большей степенью контроля над выбором гибридных вариантов, обладающих предварительно определенным количеством событий кроссинговера.

Кроме того, этот метод обеспечивает подходящие средства для выяснения огромного количества пространства возможных белковых вариантов по сравнению с другими системами. Ранее, если в процессе реакции создавалось, например, 10¹³ гибридных молекул, было крайне трудно протестировать такое большое количество гибридных вариантов на конкретную активность. Более того, существенная часть совокупности потомков должна была иметь очень большое количество событий кроссинговера, что ведет к белкам, которые маловероятно имели бы повышенные уровни конкретной активности. С помощью использования этих методов совокупность гибридных молекул может быть обогащена теми вариантами, которые имеют конкретное количество событий кроссинговера. Таким образом, хотя все еще можно создать в процессе реакции 10¹³ гибридных молекул, каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, наиболее вероятно имеет, например, только три события кроссинговера. Так как полученная совокупность потомков может быть несимметричной в отношении предварительно определенного количества событий кроссинговера, границы функциональной вариабельности между гибридными молекулами снижаются. Это обеспечивает более управляемым количеством вариабельных при расчете, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретный признак.

Один метод получения последовательности гибридного полинуклеотида-потомка заключается в создании олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или частям каждой родительской последовательности. В альтернативных вариантах осуществления каждый олигонуклеотид включает уникальную область перекрытия, так что смешивание олигонуклеотидов вместе дает новый вариант, который обладает фрагментами каждого олигонуклеотида, собранными в правильном порядке. Альтернативные протоколы для использования на практике этих методов, как предлагается в настоящем описании, могут быть найдены в патентах США №№ 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776; 6361974.

Количество олигонуклеотидов, созданное для каждого родительского варианта, имеет отношение к суммарному числу итоговых кроссинговеров в гибридной молекуле, полученной в конечном итоге. Например, может быть предложено три варианта родительских нуклеотидных последовательностей для проведения реакции лигирования для того, чтобы найти гибридный вариант, обладающий, например, более высокой активностью при высокой температуре. В качестве одного примера набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей может быть создан в соответствии с каждым положением в каждом родительском варианте. Соответственно в течение процесса повторной сборкой с лигированием в этом случае может быть до 50 событий кроссинговера в каждой из гибридных последовательностей. Возможность того, что каждый из созданных гибридных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого родительского варианта в измененном порядке, очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент присутствует при реакции лигирования в той же самой молярной величине, то есть вероятность того, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из того же самого родительского полинуклеотида будут лигироваться вслед друг за другом и это, следовательно, не приведет к событию кроссинговера. Если в этом примере концентрация каждого олигонуклеотида от каждого родителя поддерживается на постоянном уровне в течение любой стадии лигирования, то существует шанс с вероятностью 1/3 (допуская наличие 3 родителей), что олигонуклеотид из того же самого родительского варианта будет лигироваться с гибридной последовательностью и не давать кроссинговера.

Соответственно может быть определена функция возможной плотности (РЭЕ) для предсказания со

- 54 020145 вокупности событий кроссинговера, возникновение которых вероятно в процессе каждой стадии реакции лигирования данного установленного количества родительских вариантов, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентраций каждого варианта в процессе каждой стадии реакции лигирования. Статистика и математика, лежащие в основе определения РЭЕ, описывается ниже. С помощью использования этих методов можно рассчитать такую возможную функцию плотности и таким образом обогатить совокупность гибридных потомков предварительно определенным количеством событий кроссинговера, проходящих в результате конкретной реакции лигирования. Более того, может быть предварительно определено пристрелочное количество событий кроссинговера и затем система запрограммирована для расчета исходных количеств каждого родительского олигонуклеотида в течение каждой стадии реакции лигирования, что ведет к функции возможной плотности, которая центрируется на предварительно определенном количестве событий кроссинговера. Эти методы направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной повторной сортировки, рекомбинации и селекции, которые позволяют направлять молекулярную эволюцию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, путем рекомбинации. Эта система позволяет создать большую совокупность эволюционировавших гибридных последовательностей, где созданная совокупность существенно обогащена последовательностями, которые имеют предварительно определенное количество событий кроссинговера. Событие кроссинговера представляет собой точку в гибридной последовательности, в которой в последовательности происходит сдвиг от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. Такая точка обычно находится в месте соединения, в котором олигонуклеотиды от двух родителей лигируются вместе с образованием единой последовательности. Этот метод позволяет рассчитать точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей так, что итоговая совокупность гибридных последовательностей обогащается выбранным количеством событий кроссинговера. Это обеспечивает большей степенью контроля над выбором гибридных вариантов, обладающих предварительно определенным количеством событий кроссинговера.

Определение событий кроссинговера.

Предлагаемые в настоящем описании аспекты включают систему и программное обеспечение, с помощью которых получают в качестве входных данных желаемую функцию плотности возможных событий кроссинговера (РЭЕ), количество родительских генов, подвергаемых повторной сборке, и количество фрагментов при повторной сборке. Выходным результатом этой программы является фрагмент ΡΌΓ, который может быть использован для определения схемы продукции генов при повторной сборке и ожидаемой ΡΌΕ событий кроссинговера этих генов. Описанная в настоящем документе обработка альтернативно осуществляется на языке программирования МЛТЬЛВ™ (Т1е Мабщогкк, №Шск, МаккаскикеНк) и в среде разработки для технических расчетов.

Повторяющиеся процессы.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются процессы, которые могут многократно повторяться. Например, идентифицируется нуклеиновая кислота (или нуклеиновая кислота), ответственная за измененный фенотип гидролазы или антитела, повторно выделяется, опять модифицируется, заново тестируется на активность. Этот процесс может многократно повторяться до тех пор, пока не создается желаемый фенотип. Например, в клетке может быть создан полный биохимический анаболический или катаболический путь, включая протеолитическую активность.

Сходно, если определено, что конкретный олигонуклеотид совсем не обладает влиянием на желаемый признак (например, на новый фенотип гидролазы), он может быть удален как переменная в результате синтеза более длинных родительских олигонуклеотидов, которые включают последовательность, подвергаемую удалению. Так как включение последовательности в более длинную последовательность предотвращает какие-либо события кроссинговера, больше не будет какого-либо изменения этой последовательности в полинуклеотидах-потомках. Эта практика повторения определения того, какие олигонуклеотиды наиболее подходят к желаемому признаку и какие не подходят, позволяет более эффективно исследовать все возможные варианты белков, которые могут обеспечить конкретный признак или активность.

Перетасовка ίη νίνο.

Перетасовка молекул ίη νίνο, которая обеспечивает вариантами полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, например антителами, гидролазами и тому подобным, используется в методах, предлагаемых в настоящем описании. Перетасовка ίη νίνο может быть осуществлена с использованием природного свойства клеток к рекомбинации мультимеров. Тогда как при рекомбинации ίη νίνο обеспечивается главный природный путь молекулярного разнообразия, генетическая рекомбинация остается относительно сложным процессом, который включает 1) узнавание гомологов; 2) расщепление цепи, инвазию цепи и метаболические стадии, ведущие к получению рекомбинантной хиазмы; и наконец, 3) расщепление хиазмы в дискретные рекомбинантные молекулы. Образование хиазмы требует узнавания гомологичных последовательностей.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы получения гибридного полинуклеотида, по меньшей мере, из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы, используемые для полу

- 55 020145 чения гибридного полинуклеотида с помощью введения в подходящую клетку-хозяина, по меньшей мере, первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, которые имеют совместную по меньшей мере одну область частичной гомологии последовательностей. Области частичной гомологии последовательностей стимулируют процессы, которые приводят к реорганизации последовательностей с получением гибридного полинуклеотида. В одном аспекте термин гибридный полинуклеотид охватывает любую нуклеотидную последовательность, которая получена методом, предлагаемым в настоящем описании, и в одном варианте осуществления содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут происходить в результате событий межмолекулярной рекомбинации, которые стимулируют интеграцию последовательностей между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут происходить в результате процессов межмолекулярной редуктивной повторной сортировки, которые используют повторяющиеся последовательности для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.

Получение вариантов последовательности.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы получения вариантов последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей гидролазы и антитела, предлагаемых в настоящем описании, или выделения гидролаз с помощью нуклеиновых кислот и полипептидов, предлагаемых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются варианты предлагаемого в настоящем описании гена гидролазы, который может быть изменен с помощью любых средств, включая, например, случайные или стохастические методы или нестохастические методы либо методы направленной эволюции, как описано выше.

Предлагаемые в настоящем описании методы создания варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий гидролазной активностью, например активностью липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, включают стадии (а) обеспечения матричной нуклеиновой кислоты, включающей предлагаемую в настоящем описании нуклеиновую кислоту; и (Ь) модификацию, удаление или добавление одного или более нуклеотидов в последовательности матрицы или их сочетание с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном аспекте метод может дополнительно включать экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для создания вариантной гидролазы, например полипептида липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы. Модификации, добавки или делеции могут быть введены с помощью метода, включающего подверженную ошибкам ПЦР, перетасовку, олигонуклеотидспецифический мутагенез, сборочную ПЦР, мутагенез со скрещиванием с помощью ПЦР, мутагенез ίη угуо, кассетный мутагенез, мутагенез с рекурсивной сборкой, мутагенез с экспоненциальной сборкой, сайт-специфический мутагенез, Сепе ЗИе ЗаШгабоп Ми1адеиек1^ЗМ (СЗЗМ^зм), повторную сборку с синтетическим лигированием (ЗЬК или СепеКеаккетЬ1у) или их сочетание. В другом аспекте модификации, добавки или делеции вводят с помощью метода, включающего рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез содержащей урацил матрицы, мутагенез дуплекса с пропуском, мутагенез с репарацией точечного несоответствия, мутагенез в штамме хозяина с недостаточностью репарации, химический мутагенез, радиогенетический мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез ограничением-селекцией, мутагенез ограничениемочисткой, синтез искусственного гена, сборочный мутагенез, создание мультимера гибридной нуклеиновой кислоты и их сочетание.

В одном аспекте метод может быть многократно воспроизведен до получения гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, обладающей измененной или иной активностью или измененной или иной стабильностью, отличающейся от таковой полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В одном аспекте вариант полипептида гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, устойчив к нагреванию и сохраняет некоторую активность после экспозиции при повышенной температуре. В другом аспекте вариант полипептида гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, имеет повышенное гликозилирование по сравнению с гидролазой, например липазой, сатуразой, пальмитазой и/или стеаратазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно, вариант полипептида гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, обладает гидролазной, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной, активностью при высокой температуре, притом, что гидролаза, например липаза, сатураза, пальмитаза и/или стеаратаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, неактивна при высокой температуре. В одном аспекте метод может быть многократно воспроизведен до получения кодирующей последовательности гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, содержащей кодон, измененный относительно матричной нуклеиновой кислоты. В другом аспекте метод может быть многократно воспроизведен до получения гена гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, обладающего повышенным или пониженным уровнем экспрессии или стабильности посредника по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой. В другом аспекте составление конечного продукта гидролазы, например продукта липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, обеспечивает повышение или модуляцию эффективности гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, в продукте.

Выделенные варианты могут быть природными. Варианты также могут быть созданы ш уйго. Вари

- 56 020145 анты могут быть созданы с помощью методов генной инженерии, таких как сайт-специфический мутагенез, случайный химический мутагенез, методы делеции с помощью экзонуклеазы ΙΙΙ и стандартные методы клонирования. Альтернативно, такие варианты, фрагменты, аналоги или производные могут быть созданы с помощью методов химического синтеза или модификации. Специалистам в данной области техники известны и другие методы получения вариантов. Они включают методы, при которых последовательности нуклеиновых кислот, полученных из природных изолятов, модифицируют с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, обладающие свойствами, которые повышают их ценность при промышленном или лабораторном применении. В таких процедурах получают и характеризуют большое количество вариантных последовательностей, содержащих одно или более нуклеотидных отличий от природного изолята. Эти нуклеотидные различия могут приводить к аминокислотным заменам в полипептидах, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.

Например, варианты могут быть созданы с помощью подверженной ошибкам ПЦР. При подверженной ошибкам ПЦР реакцию проводят в условиях, при которых точность копирования ДНКполимеразой низка, в результате чего получают высокий уровень точечных мутаций на протяжении всей длины продукта ПЦР. Подверженная ошибкам ПЦР описана, например, в Ьеипд, ЭЛУ., е1 а1., Тес11пк.|ие. 1:11-15, 1989) и Са1б^е11, КС. & Кусе 6.Е., РСК МеЛобк Аррйс, 2:28-33, 1992. Вкратце, при таких процедурах подлежащие мутагенезу нуклеиновые кислоты смешивают с праймерами для ПЦР, буфером для реакции, МдС1₂, МпС1₂, Тац-полимеразой и бНТРк в подходящей концентрации для достижения высокого уровня точечных мутаций на протяжении всей длины продукта ПЦР. Например, реакцию можно производить с использованием 20 фмоль подлежащей мутагенезу нуклеиновой кислоты, 30 пмоль каждого из праймеров для ПЦР, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатин, 7 мМ МдС1₂, 0,5 мМ МпС1₂, 5 единиц Тац-полимеразы, 0,2 мМ бСТР, 0,2 мМ бАТР, 1 мМ бСТР и 1 мМ бТТР. ПЦР можно проводить на протяжении 30 циклов, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут варьировать в зависимости от обстоятельств. Мутированные нуклеиновые кислоты клонируют в подходящий вектор и оценивают активность полипептидов, кодируемых мутированными нуклеиновыми кислотами.

Варианты могут быть также созданы с помощью олигонуклеотид-специфического мутагенеза для получения сайт-специфичных мутаций в любой клонированной интересующей ДНК. Олигонуклеотидный мутагенез описан, например, в Ке1бЬааг-018Оп (1988) 8с1епсе 241:53-57. Вкратце, при таких процедурах синтезируют множество двухцепочечных олигонуклеотидов, несущих одну или более мутаций, подлежащих введению в клонированную ДНК, и вставляют в подлежащую мутагенезу клонированную ДНК. Клоны, содержащие мутантную ДНК, собирают и оценивают активность полипептидов, которые ими кодируются.

Другим методом создания вариантов служит сборочная ПЦР. Сборочная ПЦР включает сборку продукта ПЦР из смеси малых фрагментов ДНК. В одном и том же сосуде параллельно протекает большое количество различных реакций ПЦР, причем продукты одной реакции служат затравкой для продуктов другой реакции. Сборочная ПЦР описана, например, в патенте США № 5965408.

Еще одним методом создания вариантов является мутагенез с помощью ПЦР гибридов. При мутагенезе с помощью ПЦР гибридов происходит усиленная гомологичная рекомбинация ίη νίίΓΟ между молекулами ДНК с разными, но очень близкими последовательностями, в результате случайной фрагментации молекулы ДНК на основе гомологии последовательности с последующей фиксацией кроссовера с помощью удлинения праймера в реакции ПЦР. Мутагенез с помощью ПЦР гибридов описан, например, в 81еттег (1994) Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 91:10747-10751. Вкратце, при таких процедурах множество подлежащих рекомбинации нуклеиновых кислот гидролизуют ДНКазой с получением фрагментов со средним размером 50-200 нуклеотидов. Фрагменты с желаемым средним размером очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновой кислоты. Например, ПЦР можно проводить путем ресуспендирования очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/л в растворе 0,2 мМ каждого из άNТР, 2,2 мМ МдС1₂, 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1, рН 9,0 и 0,1% тритона Х-100. Добавляют 2,5 единицы Тац-полимеразы на 100:1 реакционной смеси и проводят ПЦР с использованием следующего режима: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут варьировать в зависимости от обстоятельств. В некоторых аспектах в реакции ПЦР могут быть включены олигонуклеотиды. В других аспектах в первом ряду реакций ПЦР может быть использован фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, а в последующем ряду реакций ПЦР может быть использована Тац-полимераза. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые ими кодируются.

Варианты также могут быть созданы с помощью мутагенеза ίη νίνο. В некоторых аспектах случайные мутации в интересующей последовательности создают размножением интересующей последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. со11, который несет мутации в одном или более путях репарации ДНК. Такие мутирующие штаммы обладают более высокой скоростью случайных мутаций по сравнению с исходным диким типом. Размножение ДНК в одном из таких штаммов обычно приводит в конечном итоге к созданию случайных мутаций в ДНК. Мутирующие штаммы, пригодные

- 57 020145 для использования в мутагенезе ш νί\Ό, описаны, например, в публикации РСТ № \¥О 91/16427.

Варианты также могут быть созданы с помощью кассетного мутагенеза. При кассетном мутагенезе небольшую область двухцепочечной молекулы ДНК заменяют синтетической олигонуклеотидной кассетой, отличной от природной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично рандомизированную природную последовательность.

Для создания вариантов также может быть использован мутагенез с рекурсивной сборкой. Мутагенез с рекурсивной сборкой представляет собой алгоритм для конструирования белка (белковый мутагенез), разработанный для получения разнообразных популяций фенотипически родственных мутантов, члены которых различаются по аминокислотной последовательности. В этом методе используется механизм обратной связи для контроля последующих раундов комбинаторного кассетного мутагенеза. Мутагенез с рекурсивной сборкой описан, например, в ΑγΙωπ (1992) Ргос. Νη11. Αсаб. δ^. υδΑ 89:7811-7815.

В некоторых аспектах варианты создают с использованием мутагенеза с экспоненциальной сборкой. Мутагенез с экспоненциальной сборкой представляет собой процесс для создания комбинаторных библиотек с высоким процентом уникальных и функциональных мутантов, где небольшие группы остатков рандомизируют параллельно с идентификацией в каждом измененном положении аминокислот, дающих функциональные белки. Мутагенез с экспоненциальной сборкой описан, например, в Ое1едга\'е (1993) Вю1есйпо1оду Ве5. 11:1548-1552. Случайный и сайт-специфический мутагенез описаны, например, в Αγ^Π (1993) Сштеп! Ор1шоп ш В1о1есйпо1оду 4:450-455.

В некоторых аспектах варианты создают с помощью процедур перетасовки, где части множества нуклеиновых кислот, которые кодируют разные полипептиды, соединяют вместе с образованием гибридных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют гибридные полипептиды, как описано, например, в патентах США №№ 5965408; 5939250.

В настоящем описании предлагаются варианты полипептидов, содержащих последовательности, в которых один или более аминокислотных остатков (например, в случае иллюстративного полипептида, например, δΕΟ ΙΌ ^:2, δΕΟ ΙΌ ^:4, δΕΟ ΙΌ ^:6, δΕΟ ΙΌ ^:8, δΕΟ ΙΌ ^:10, δΕΟ ΙΌ ^:12, δΕΟ ΙΌ ^:14, δΕΟ ΙΌ ^:16, δΕΟ ΙΌ ^:18 или δΕΟ ΙΌ №:20 либо δΕΟ ΙΌ ^:2, содержащая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более (несколько) или все аминокислотные варианты, описанные в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквиваленты) заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (например, консервативным аминокислотным остатком), и такой заменяющий аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться генетическим кодом. Консервативными заменами являются такие замены, при которых происходит замена данной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами. Так, полипептиды настоящего описания включают полипептиды с консервативными заменами в последовательностях, например предлагаемые в настоящем описании иллюстративные последовательности (например, δΕΟ ГО NО:2, δΕΟ ГО NО:4, δΕΟ ГО NО:6, δΕΟ ГО NО:8, δΕΟ ГО ^:10, δΕΟ ГО ^:12, δΕΟ ГО ^:14, δΕΟ ГО ^:16, δΕΟ ГО ^:18 или δΕΟ ГО ^:20 либо δΕΟ ГО NО:2, содержащая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более (несколько) или все аминокислотные варианты, описанные в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквиваленты), включающие, но не ограниченные этим, следующие замены: замены алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислого остатка, такого как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, другим кислым остатком; замену остатка, содержащего амидогруппу, такого как аспарагин и глутамин, другим остатком, содержащим амидогруппу; замену основного остатка, такого как лизин и аргинин, другим основным остатком и замену ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин или триптофан, другим ароматическим остатком. Другими вариантами являются варианты, в которых один или более аминокислотных остатков полипептидов, предлагаемых в настоящем описании, включают замещающую группу.

Другими вариантами в пределах предлагаемого в настоящем описании объема являются варианты, в которых полипептид связан с другим соединением, таким как соединение, повышающее полужизнь полипептида, например полиэтиленгликоль.

Дополнительными вариантами в пределах предлагаемого в настоящем описании объема являются варианты, в которых полипептиду присоединены дополнительные аминокислоты, такие как лидерная последовательность, секреторная последовательность, последовательность пробелка или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида. В некоторых аспектах варианты, фрагменты, производные и аналоги предлагаемых в настоящем описании полипептидов сохраняют биологическую функцию или активность иллюстративных полипептидов, например протеолитическую активность, как описано в настоящем описании. В других аспектах вариант, фрагмент, производное или аналог включает пробелок, так что вариант, фрагмент, производное или аналог может быть активирован отщеплением части пробелка с получением активного полипептида.

Оптимизация кодонов для достижения высокого уровня экспрессии белка в клетках-хозяевах.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы модификации нуклеиновых кислот, кодирующих гидролазу, для модификации использования кодонов. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются методы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей гидролазу, для повышения или снижения ее экспрессии в клетке-хозяине, напри

- 58 020145 мер клетке бактерии, насекомого, млекопитающего, дрожжей или растения. Дополнительно в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие гидролазу, модифицированную для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, модифицированная таким образом гидролаза и методы получения модифицированных гидролаз. Метод включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в кодирующей гидролазу нуклеиновой кислоте и замену одного или более из этих непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим ту же самую аминокислоту, что и заменяемый кодон, и по меньшей мере один непредпочтительный или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте был заменен предпочтительным кодоном, кодирующим ту же самую аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпредставленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина.

Предлагаемые в настоящем описании клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессионных кассет и векторов включают клетки бактерий, дрожжей, грибов, растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы оптимизации использования кодонов во всех этих клетках, нуклеиновые кислоты с измененными кодонами и полипептиды, полученные с помощью нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Иллюстративные клетки-хозяева включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕксЬепсШа сок и Ркеиботопак Диогексепк; грамположительные бактерии, такие как ДасЮкасШик даккеп, ДасЮсоссик 1асДк, ЬасЮсоссик сгетоДк, ВасШик киЬДИк. Иллюстративные клетки-хозяева включают также эукариотные организмы, например различные дрожжи, такие как 8асскаготусек кр., включая 8асскаготусек сегеуПае, 8с1п/окасс11аготусек ротЬе, РюШа ракЮпк и К1иууеготусек 1асДк, Напкепи1а ро1утогрДа, Лκре^д^11иκ тдег, и клетки и клеточные линии млекопитающих и клетки и клеточные линии насекомых. Другие иллюстративные клетки-хозяева включают бактериальные клетки, такие как Е. сок, 81гер1отусек. ВасШик киЬДИк, ВасШик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтигшт и различные виды родов Ркеиботопак, 81гер1отусек и 81ар1у1ососсик, клетки грибов, таких как Α^^Π^, дрожжей, таких как любые виды РюШа, 8асскаготусек, 8с1пхокасс11аготусек. 8сктаппютусек, включая РюЫа ракЮпк. 8асскаготусек сегеу1к1ае, или 8с1пхокасскаготусек ротЬе, клетки насекомых, такие как ОгокорШа 82 и 8робор1ега 8Г9, клетки животных, такие как СНО, С08 или меланома Боувеса, и аденовирусы. Выбор подходящего хозяина находится в компетенции специалистов в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты и полипептиды, оптимизированные для экспрессии в этих организмах и видах.

Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей гидролазу, выделенную из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, чтобы нуклеиновая кислота оптимально экспрессировалась в бактериальной клетке, отличной от бактерии, из которой происходит гидролаза, в клетке дрожжей, гриба, растения и клетке насекомого или клетке млекопитающего. Методы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области техники, см., например, патент США № 5795737; Васа (2000) Д11. 1. Рагакйок 30:113-118; На1е (1998) Рго1еш Ехрг. РипГ. 12:185-188; №1гит (2001) ШесЕ Iттиη. 69:7250-7253; см. также №гит (2001) ШГссЪ Iттип. 69:7250-7253, где описаны оптимизированные кодоны для систем мыши; 0и1с1коигоу (2 002) Рго1еД1 Ехрг. РипГ. 24: 18-24, где описаны оптимизированные кодоны для дрожжей; Репд (2000) В^оскет^κΐ^у 39:15399-15409, где описаны оптимизированные кодоны для Е. сок; НитрШеук (2000) Рго1ет Ехрг. РипГ. 20:252-264, где описано использование оптимизированных кодонов, влияющее на секрецию в Е. со11.

Трансгенные животные, отличные от человека.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются трансгенные животные, отличные от человека, включающие нуклеиновую кислоту, полипептид (например, предлагаемую в настоящем описании гидролазу или антитело), экспрессионную кассету, вектор, трансфецированную или трансформированную клетку, предлагаемую в настоящем описании. Трансгенные животные, отличные от человека, могут представлять собой, например, коз, кроликов, овец, свиней, коров, крыс и мышей, включающих предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты. Эти животные могут быть использованы, например, в качестве моделей ш у1уо для изучения гидролазной активности или в качестве моделей для скрининга агентов, которые изменяют гидролазную активность ш у1уо. Кодирующие последовательности для полипептидов, подлежащих экспрессии у трансгенных животных, отличных от человека, могут быть сконструированы как конститутивные или находящиеся под контролем тканеспецифичных, зависимых от развития или индуцибельных транскрипционных регуляторных факторов. Трансгенные животные, отличные от человека, могут быть сконструированы и созданы с помощью любого метода, известного в данной области техники; см., например, патенты США №№ 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6^6; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, описывающие получение и использование трансформированных клеток и яиц и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров; см. также, например, Ро11оск (1999) ί. Iттиηо1. МеШобк 231: 147-157, где описано получение рекомбинантных белков в молоке трансгенных молочных животных; Вади1к1 (1999) Вю1ес11по1. 17:456-461, где показано получение трансгенных коз. В патенте США №

- 59 020145

6211428 описано получение и использование трансгенных отличных от человека млекопитающих, в мозгу которых экспрессируется конструкт нуклеиновой кислоты, включающий последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мыши, имплантация инъецированных яйцеклеток самкам с ложной беременностью и выращивание до родов трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют белки, связанные с патологией болезни Альцгеймера. В патенте США № 6187992 описано получение и использование трансгенных мышей, геном которых содержит повреждение гена, кодирующего белок-предшественник амилоида (АРР).

Для осуществления предлагаемых в настоящем описании методов также могут быть использованы нокаутные животные. Например, в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании трансгенные или модифицированные животные включают нокаутное животное, например нокаутную мышь, сконструированное так, что оно не экспрессирует эндогенный ген, который заменяют геном, экспрессирующим гидролазу или слитый белок, включающий предлагаемую в настоящем описании гидролазу. Как отмечалось выше, функциональные нокауты могут быть также вызваны с помощью предлагаемых в настоящем описании антисмысловых последовательностей, например двухцепочечных молекул РНК-1.

Трансгенные растения и семена.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются трансгенные растения и семена, содержащие нуклеиновую кислоту, полипептид (например, предлагаемые в настоящем описании гидролазу или антитело), экспрессионную кассету или вектор либо предлагаемую в настоящем описании трансфецированную или трансформированную клетку. Трансгенное растение может быть двудольным (йюо!) или однодольным (топосо!). В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются методы получения и использования этих трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или растительная клетка, экспрессирующие предлагаемый в настоящем описании полипептид, могут быть сконструированы в соответствии с любым методом, известным в данной области техники; см., например, патент США № 6309872.

Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты и экспрессионные конструкты можно вводить в растительную клетку с помощью любых средств. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессионные конструкты можно вводить в геном желаемого растения-хозяина или нуклеиновые кислоты или экспрессионные конструкты могут быть эписомами. Введение в геном желаемого растения может быть таким, что продукция гидролазы хозяином регулируется эндогенными транскрипционными или трансляционными контрольными элементами. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются нокаутные растения, где вставка последовательности гена, например, путем гомологичной рекомбинации ликвидировала экспрессию эндогенного гена. Средства для создания нокаутных растений хорошо известны в данной области техники, см., например, 8!герр (1998) Ргос Ν;·ι!1. Асай. 8ст И8А 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! 1. 7:359-3 65. Смотри также обсуждение по поводу трансгенных растений ниже.

Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты могут быть использованы для придания желаемых свойств, по существу, любому растению, например растениям, продуцирующим масличные семена, включая рисовые отруби, рапс (канола), подсолнечник, оливу, пальму или сою и тому подобное, или растениям, продуцирующим глюкозу или крахмал, таким как кукуруза, картофель, пшеница, рис, ячмень и тому подобное. Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты могут быть использованы для манипулирования метаболическими путями растения для оптимизации или изменения экспрессии хозяином гидролазы или субстрата либо продукта гидролазы, например масла, липида, такого как моно-, ди- или триацилглицерид, и тому подобное. Они могут изменять соотношение липидов, превращение и оборот липидов в растении. Это может облегчать промышленную переработку растения. Альтернативно, предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для получения трансгенного растения для продукции соединения, не продуцируемого этим растением в естественных условиях. Это может снижать стоимость производства или создать новый продукт.

В одном аспекте первая стадия получения трансгенного растения включает получение экспрессионного конструкта для экспрессии в растительной клетке. Эти методы хорошо известны в данной области техники. Они могут включать отбор и клонирование промотора, кодирующей последовательности для облегчения эффективного связывания рибосом с мРНК и отбор подходящих последовательностей терминатора гена. Одним иллюстративным конститутивным промотором служит СаМУ358 из мозаичного вируса цветной капусты, который обычно обеспечивает высокий уровень экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и отвечают на сигналы внутренней и внешней среды растения. Иллюстративным индуцируемым светом промотором служит промотор из гена саЬ, кодирующего главный белок, связывающий хлорофилл а/Ь.

В одном аспекте нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения большей экспрессии в растительной клетке. Например, предлагаемая в настоящем описании последовательность, видимо, содержит более высокий процент А-Т нуклеотидных пар по сравнению с наблюдаемым в растениях, некоторые из которых предпочитают С-С нуклеотидные пары. Поэтому А-Т нуклеотиды в кодирующей последовательности могут быть заменены С-С нуклеотидами без существенного изменения аминокислотной последовательности для повышения образования продукта гена в растительных клетках.

- 60 020145

К генному конструкту может быть добавлен ген маркера селекции для идентификации растительных клеток или тканей, содержащих успешно интегрированный трансген. Это может быть необходимым, поскольку достижение включения и экспрессии генов в растительных клетках является редким событием, имеющим место лишь в нескольких процентах тканей или клеток-мишеней. Гены маркеров селекции кодируют белки, которые обеспечивают устойчивость к агентам, которые в норме являются токсичными для растений, таких как антибиотики или гербициды. Лишь те клетки растения, которые содержат интегрированный ген маркера селекции, должны выживать при выращивании на среде, содержащей соответствующий антибиотик или гербицид. Как и для других вставляемых генов, для правильного функционирования генов маркеров требуются последовательности промотора и терминации.

В одном аспекте получение трансгенных растений или семян включает введение предлагаемых в настоящем описании последовательностей и, необязательно, генов маркеров в целевой экспрессионный конструкт (например, плазмиду, фаг) наряду с позиционированием последовательностей промотора и терминатора. Это может включать перенос модифицированного гена в растение с помощью подходящего метода. Например, конструкт может быть введен непосредственно в геномную ДНК растительной клетки с помощью таких методов, как электропорация и микроинъекция протопластов растительной клетки, или конструкты могут быть введены прямо в ткань растения с помощью баллистических методов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см. СЬпзЮи (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 35:197-203; Ра\\1о\\'зк| (1996) Мо1. Вю!есЬпо1. 6:17-30; К1еш (1987) №1иге 327:70-73; Такит1 (1997) Сепез Сепе!. Зуз!. 72:63-69, где обсуждается использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшеницу; и Абат (1997) выше по поводу использования бомбардировки частицами для введения УАС в растительные клетки. Например, КшеЬаг! (1997) выше использовал бомбардировку частицами для создания трансгенных растений хлопчатника. Аппарат для ускорения частиц описан в патенте США № 5015580 и существует имеющийся в продаже аппарат для ускорения частиц ВюКаб (ВюНзДсз) РЭ8-2000; см. также 1оЬп, патент США № 5608148 и ЕШз, патент США № 5681730, где описана опосредованная частицами трансформация голосемянных.

В одном аспекте протопласты могут быть иммобилизованы и инъецированы нуклеиновыми кислотами, например экспрессионным конструктом. Хотя регенерация растения из протопластов не является простой для зерновых, регенерация растения возможна у бобовых с помощью соматического эмбриогенеза из каллуса, полученного из протопласта. Организованные ткани могут быть трансформированы голой ДНК с помощью метода генного ружья, при котором ДНК наносят на вольфрамовые микроснаряды, пробивают 1/100 размера клеток и доставляют ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем индуцируют регенерацию трансформированной ткани, обычно с помощью соматического эмбриогенеза. Этот метод был успешно применен в нескольких видах зерновых, включая маис и рис.

Нуклеиновые кислоты, например экспрессионные конструкты, могут быть также введены в растительные клетки с помощью рекомбинантных вирусов. Растительные клетки могут быть трансформированы с помощью вирусных векторов, таких как, например, векторы из вируса табачной мозаики (Кои\успба1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 33:989-999), см. РоПа (1996) Изе о£ νίη1 герНсопз £ог !Ье ехргеззюп о£ депез 1п р1ап!з; Мо1. Вю1ес11по1. 5:209-221.

Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например экспрессионный конструкт, могут быть соединены с подходящими Т-ДНК фланкирующими областями и введены в традиционный вектор хозяина АдгоЬас!егшт 1итеГас1епз. Вирулентные функции хозяина АдгоЬас!егшт !ите1ас1епз должны направлять вставку конструкта и примыкающий маркер в ДНК растительной клетки при инфицировании клетки бактерией. Методы опосредуемой АдгоЬас!егшт 1итеГас1епз трансформации, включая обезоруживание и использование бинарных векторов, хорошо описаны в научной литературе; см., например, НогзсЬ (1984) 8с1епсе 233:496-498; Рга1еу (1983) Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А 80:4803 (1983); Сепе ТгапзГег !о Р1ап!з, Ро!гукиз, еб. (8ргтдег-Уег1ад, ВегИп 1995). ДНК в А. 1итеГас1епз находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как Т1 (индуцирующая опухоль) плазмида. Т1 плазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длиной ~20 т.п.н.), который переносится в растительную клетку в процессе инфекции и содержит ряд генов νπ (вирулентности), которые управляют процессом инфекции. А. !ите1ас1епз может инфицировать растение только через раны: когда корень или стебель растения поранены, они выделяют определенные химические сигналы, в ответ на которые гены νίΓ А. !ите1ас1епз активируются и вызывают ряд событий, необходимых для переноса Т-ДНК из Т1 плазмиды на хромосому растения. После этого Т-ДНК входит в растительную клетку через рану. Согласно одному из предположений Т-ДНК ожидает репликации или транскрипции растительной ДНК, после чего сама себя вставляет в экспонированную растительную ДНК. Для использования А. 1итеГас1епз в качестве вектора трансгена индуцирующая опухоль часть Т-ДНК должна быть удалена при сохранении пограничных областей ТДНК и генов νίΓ. После этого трансген вставляют между пограничными областями Т-ДНК, где он переносится в растительную клетку и становится интегрированным в хромосомы растения.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы трансформации однодольных растений, включая важные зерновые, с помощью предлагаемых в настоящем описании нуклеиновых кислот, см. Н1е1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1. 35:205-218; см. также, например, НогзсЬ, 8с1епсе (1984) 233:496; Ега1еу (1983) Ргос. Ν!1. Асаб. δα И8А 80:4803; ТЬук)аег (1997) выше; Рагк (1996) Р1ап!

- 61 020145

Мо1. Βίο1. 32: 1135-1148, где обсуждается интеграция Т-ДНК в геномную ДНК. Смотри также Ο'ΗαΙΙυίη, патент США № 5712135, где описывается способ стабильной интеграции ДНК, включающей ген, который является функциональным в клетке зернового или другого однодольного растения.

В одном аспекте третья стадия может включать отбор и регенерацию цельных растений, способных передавать включенный целевой ген следующему поколению. Такие методы регенерации основываются на манипулировании некоторыми фитогормонами в среде выращивания тканевой культуры, обычно на основе маркера биоцида и/или гербицида, введенного вместе с желаемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растения из культивируемых протопластов описана в Εναηκ е( а1., Рго1ор1аь18 Ιδθ1αΙίοη апб СиНиге, НапбЬоок оГ Р1ап1 Се11 СиНиге, р. 124-176, МасМПШаи РиЬНкЫпд Сотрапу, №\ν Уогк, 1983; и Втбтд, Кедепегабоп оГ Р1ап1к, Р1ап1 Рго1ор1аз(8. р. 21-73, СКС Ргекк, Воса Ка1оп, 1985. Регенерация может быть также получена из каллуса, эксплантатов, органов растения или их частей. Такие методы регенерации описаны в целом в К1ее (1987) Αηη. Кеу. оГ Р1ап1 РНук. 38:467-486. Для получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, их можно выращивать при контролируемых условиях окружающей среды в ряде сред, содержащих питательные вещества и гормоны, способом, известным как тканевая культура. После создания целых растений и получения семян начинают оценку потомства.

После того как экспрессионная кассета была стабильно интегрирована в трансгенных растениях, она может быть введена в другие растения с помощью полового скрещивания. В зависимости от видов, подлежащих скрещиванию, может быть использован любой из ряда стандартных методов скрещивания. Поскольку трансгенная экспрессия предлагаемых в настоящем описании нуклеиновых кислот ведет к фенотипическим изменениям, растения, содержащие предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты, могут быть подвергнуты половому скрещиванию со вторым растением с получением конечного продукта. Так, предлагаемое в настоящем описании семя может быть получено в результате скрещивания между двумя предлагаемыми в настоящем описании трансгенными растениями или между предлагаемым в настоящем описании растением и другим растением. Желаемые эффекты (например, экспрессия предлагаемых в настоящем описании полипептидов для получения растения с измененным, повышенным и/или пониженным содержанием липидов или масла) могут быть увеличены, когда оба родительских растения экспрессируют предлагаемые в настоящем описании полипептиды. Желаемые эффекты могут быть переданы будущим поколениям растения с помощью стандартных средств размножения.

Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты и полипептиды экспрессируются или вставлены в любом растении или семени. Предлагаемые в настоящем описании трансгенные растения могут быть двудольными или однодольными. Примерами предлагаемых в настоящем описании однодольных трансгенных растений служат травы, такие как луговая трава (голубая трава, Роа), кормовая трава, такая как овсяница, плевел, газонные травы, такие как ЛдгоЧЬ, и злаковые, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами предлагаемых в настоящем описании двудольных трансгенных растений служат табак, бобовые, такие как люпин, картофель, сахарная свекла, горох, бобы и соя, и крестоцветные растения (семейство Вгаккюасеае), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм Α^аЬ^бοрк^к (Накапа. Таким образом, предлагаемые в настоящем описании трансгенные растения и семена включают широкий спектр растений, включая, но не ограничиваясь этим, виды из родов Αηаса^б^ит, Л^аск^к. Αкра^адик, Αΐ^οра, Ανеηа, Вгаккюа, СНгик, СНгиПик, СаркР сит, СайНатик, Сосок, СоГГеа, СиситИ, СисигЬйа, Раисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усте, Соккуршт, НеНапШик, Не1егосаШк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасШса, Ьтит, Ьо1шт, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МашНок Ма.)огапа, Мебюадо, МсоРапа, 01еа, 0гуха, Ратеит, РапткеШт, Регкеа, РНакео1ик, Р|к1ас1по, Р1кит, Ругик, Ргипик, КарНапик, Шстик, 8еса1е, 8епесю, 81пар1к, 8о1апит, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТпРсит, У1аа, У1бк, У1дпа и 2еа.

В альтернативных вариантах осуществления предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты экспрессируют в растениях, которые содержат волоконные клетки, включая, например, хлопчатник, хлопковое дерево (капок, Се1Ьа рейапбга), пустынная ива, креозотовый кустарник, терескен шерстистый, бальза, рами, канаф, конопля, розель, джут, агава абака и лен. В альтернативных вариантах осуществления предлагаемые в настоящем описании трансгенные растения могут быть членами рода Соккуршт, включая любые виды Соккуршт, такие как С. агЬогеит, С. НегЬасеит, С. ЬагЬабепке и С. Н1гкиРип.

В некоторых вариантах осуществления трансгенные растения настоящего описания могут быть использованы для получения больших количеств предлагаемых в настоящем описании полипептидов (например, антител, гидролаз). Например, см. Ра1тдгеп (1997) Тгепбк Сепе(. 13:348; СНопд (1997) Тгапкдетс Кек. 6:289-296 (получение белка молока человека бета-казеина в трансгенных растениях картофеля с использованием индуцируемого ауксином промотора двунаправленной маннопинсинтазы (так1',2') с помощью методов опосредуемой Αд^οЬасΐе^^ит 1итеГас1епк трансформации листового диска).

Используя известные методы, специалист в данной области техники может скринировать предлагаемые в настоящем описании растения путем выявления повышения или снижения мРНК или белка трансгена в трансгенных растениях. Средства выявления и количественного определения мРНК или белков хорошо известны в данной области техники.

- 62 020145

В настоящем описании предлагаются жирные кислоты или производные жирных кислот из предлагаемых в настоящем описании трансгенных растений, например маслянистых растений. В одном аспекте получают маслянистые растения, содержащие по меньшей мере одну предлагаемую в настоящем описании гидролазу. В одном аспекте трансгенное растение содержит ген гидролазы, функционально связанный с промотором, обеспечивающим экспрессию гена либо в клеточном, либо во внеклеточном, либо тканевом компартментах, отличных от компартментов, в которых аккумулируются растительные липиды, или обеспечивающим экзогенную индукцию гидролазы. В одном аспекте собирают семена и/или фрукты, содержащие липиды растений, семена и/или фрукты измельчают (при необходимости после обработки для индукции гена гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы)) с тем, чтобы ввести в контакт липиды и предлагаемую в настоящем описании гидролазу, содержащиеся в семенах и/или фруктах. Смеси можно дать инкубироваться для обеспечения ферментативного гидролиза липидов основного вещества за счет каталитического действия предлагаемой в настоящем описании липазы, содержащейся в измельченном веществе. В одном аспекте образовавшиеся в результате гидролиза жирные кислоты экстрагируют и/или превращают для получения желаемых производных жирных кислот.

В этом предлагаемом в настоящем описании процессе ферментативного гидролиза используются мягкие рабочие условия, он может осуществляться в малом масштабе и с использованием недорогого оборудования. В этом аспекте предлагаемое в настоящем описании растение индуцируют для продукции гидролазы для трансформации липидов растения. При использовании этой стратегии предотвращается вхождение в контакт фермента с запасенными липидами растения, что позволяет избежать любого риска преждевременного гидролиза (саморазрушение растения) до сбора урожая. Блоки для измельчения и инкубации могут быть легкими и маломасштабными; многие из них известны в аграрной промышленности и могут быть доставлены в места сбора растений.

В одном аспекте в настоящем описании предлагаемые трансгенные растения получают путем трансформации природных маслянистых растений. Предлагаемые в настоящем описании генетически трансформированные растения затем воспроизводят половым путем с тем, чтобы получить предлагаемые в настоящем описании трансгенные семена. Эти семена могут быть использованы для получения потомства трансгенного растения.

В одном аспекте ген гидролазы функционально связан с индуцибельным промотором для предотвращения преждевременного контакта гидролазы и липидов растения. Этот промотор может направлять экспрессию гена в компартменты, отличные от компартментов, в которых аккумулируются липиды, или промотор может инициировать экспрессию гидролазы в желаемое время путем экзогенной индукции.

Полипептиды и пептиды.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, имеющие сходство (например, по меньшей мере 50% идентичность последовательности) с 8ЕО ΙΌ ЫО:2, 8ЕО ΙΌ ЫО:4, 8ЕО ΙΌ ЫО:6, 8ЕО ΙΌ ЫО:8, 8ЕО ΙΌ ЫО:10, 8ЕО ΙΌ ЫО:12, 8ЕО ΙΌ ЫО:14, 8ЕО ΙΌ ЫО:16, 8ЕО ΙΌ ЫО:18 или 8ЕО ΙΌ ЫО:20 либо 8ЕО ΙΌ ЫО:2, содержащей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более (несколько) либо все аминокислотные варианты, описанные в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквиваленты. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, имеющие последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ЫО:2, 8ЕО ΙΌ ЫО:4, 8ЕО ΙΌ ЫО:6, 8ЕО ΙΌ ЫО:8, 8ЕО ΙΌ ЫО:10, 8ЕО ΙΌ ЫО:12, 8ЕО ΙΌ ЫО:14, 8ЕО ΙΌ ЫО:16, 8ЕО ΙΌ ЫО:18 или 8ЕО ΙΌ ЫО:20 или 8ЕО ΙΌ ЫО:2, содержащей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более (несколько) или все аминокислотные варианты, описанные в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23, или их эквиваленты.

Идентичность последовательности может распространяться на всю длину полипептида или идентичность может охватывать область по меньшей мере из приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков. Предлагаемые в настоящем описании полипептиды могут быть также короче полноразмерных иллюстративных полипептидов. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются полипептиды, включающие лишь подпоследовательность предлагаемой в настоящем описании последовательности и иллюстративные подпоследовательности могут состоять из приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков. В альтернативных аспектах полипептиды (пептиды, фрагменты) могут варьировать по размеру между приблизительно 5 и полноразмерным полипептидом, например предлагаемым в настоящем описании ферментом; при этом иллюстративные размеры составляют приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков, например следующие друг за другом остатки предлагаемой в настоящем описании иллюстративной гидролазы. Предлагаемые в настоящем описании полипептиды могут быть пригодны, например, в качестве метящих зондов, антигенов, толерагенов, мотивов, активных центров гидролазы.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды также включают антитела, способные связываться с гидролазой, предлагаемой в настоящем описании.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды также включают аминокислотные последова

- 63 020145 тельности, которые являются в значительной мере идентичными предлагаемым в настоящем описании последовательностям, включая последовательности, которые отличаются от реперной последовательности одной или более консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами, делециями или вставками, особенно тогда, когда такая замена имеет место в сайте, отличном от активного центра молекулы, и предлагаемые таким образом, что полипептид, по существу, сохраняет свои функциональные свойства. При консервативной аминокислотной замене, например, производится замена одной аминокислоты другой аминокислотой того же класса (например, замена одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой, или замена одной полярной аминокислоты другой, такая как замена аргинина лизином, глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой или глутамина аспарагином). Одна или более аминокислот могут быть удалены, например, из гидролазы с возникновением модификации структуры полипептида без существенного изменения биологической активности. Например, могут быть удалены концевые аминокислоты амино- и карбоксильного концов, которые не требуются для гидролазной активности.

Аминокислота или аминокислотная последовательность могут включать олигопептид, пептид, полипептид или белковую последовательность или фрагмент, часть или субъединицу любого из них и природные или синтетические молекулы.

Термины полипептид и белок могут включать аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидные изостеры, и могут содержать модифицированные аминокислоты, отличные от кодируемых генами 20 аминокислот. Термин полипептид также включает пептиды и полипептидные фрагменты, мотивы и тому подобное. Термин также включает гликозилированные полипептиды. Предлагаемые в настоящем описании пептиды и полипептиды также включают все миметирующие и пептидомиметирующие формы, как описано подробнее ниже.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды включают гидролазы в активной или неактивной форме. Например, предлагаемые в настоящем описании полипептиды включают пробелки до созревания или процессинга препропоследовательностей, например, под действием фермента процессинга пробелка, такого как конвертаза пробелка, с получением активного зрелого белка. Предлагаемые в настоящем описании полипептиды включают гидролазы, неактивные по другим причинам, например, до активации в результате посттрансляционного события процессинга, например действия эндо- или экзопептидазы или протеиназы, события фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфирования, события димеризации и тому подобное. Методы идентификации последовательностей препро домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области техники, см., например, Vаи бе Vеи (1993) Сгй. Кеу. Оисод. 4(2): 115-136. Например, для идентификации препропоследовательности белок очищают из внеклеточного пространства и Ν-концевую последовательность белка определяют и сравнивают с формой, не подвергнутой процессингу.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды включают все активные формы, включая активные подпоследовательности, например каталитические домены или активные центры предлагаемого в настоящем описании фермента. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются каталитические домены или активные центры, как изложено ниже. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются пептиды или полипептиды, включающие или состоящие из домена активного центра, предсказанного на основании базы данных, такой как РГат (которая представляет собой большой набор из множества выровненных последовательностей и скрытых моделей Маркова, охватывающих многие обычные семейства белков, Тйе РГат рго!ет ГатШез ба!аЬазе, А. Ва1етап, Е. В1теу, Ь. Сепий, К. ОигЬт, Ь. ЕЩШег, 8.К. Еббу, 8. СпйййзДоиез, К.Ь. Но\\е, М. Магзйай, аиб Е.Ь.Ь. 8опийаттег, Ыис1ею Ас1бз Кезеагсй, 30 (1) :276-280, 2002) или эквивалента.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются полипептиды, содержащие или не содержащие сигнальную последовательность и/или препропоследовательность. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются полипептиды с гетерологичными сигнальными последовательностями и/или препропоследовательностями. Препропоследовательность (включая предлагаемую в настоящем описании последовательность, которая используется в качестве гетерологичного препродомена) может быть локализована на аминоконце или карбоксильном конце белка. В другом варианте осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные сигнальные последовательности, препропоследовательности и каталитические домены (например, активные центры), включающие или состоящие из предлагаемых в настоящем описании последовательностей. Предлагаемые в настоящем описании сигнальные последовательности, препродомены и/или каталитический домен могут быть частью слитого белка, например, в виде гетерологичного домена в слитом белке. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие эти каталитические домены (СО), препродомены и сигнальные последовательности (8Р, например, пептид, содержащий последовательность, включающую/состоящую из остатков аминоконца предлагаемого в настоящем описании полипептида). В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются сигнальные последовательности, включающие пептид, включающий/состоящий из последовательности, как указано в остатках с 1 по 12, с 1 по 13, с 1 по 14, с 1 по

- 64 020145

15, с 1 по 16, с 1 по 17, с 1 по 18, с 1 по 19, с 1 по 20, с 1 по 21, с 1 по 22, с 1 по 23, с 1 по 24, с 1 по 25, с 1 по 26, с 1 по 27, с 1 по 28, с 1 по 28, с 1 по 30, с 1 по 31, с 1 по 32, с 1 по 33, с 1 по 34, с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44, с 1 по 45, с 1 по 46, с 1 по 47, с 1 по 48, с 1 по 49 или с 1 по 50 предлагаемого в настоящем описании полипептида.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды и пептиды могут быть выделенными из природных источников, синтетическими или созданными рекомбинантным способом полипептидами. Пептиды и белки могут быть рекомбинантно экспрессированы ΐπ νίΙΐΌ или ш у1уо. Предлагаемые в настоящем описании пептиды и полипептиды могут быть получены и выделены с помощью любого метода, известного в данной области техники. Предлагаемые в настоящем описании полипептид и пептиды могут быть также синтезированы, целиком или частично, с помощью химических методов, хорошо известных в данной области техники; см., например, СатиЛетк (1980) ШсШс Ас1бк Кек. 8утр. 8ег. 215-223; Нот (1980) N^1^ Ас1бк Кек. 8утр. 8ег. 225-232; Вапда, А.К., Тйегареийс Рерйбек апб РгсИетк, Еогти1аРоп, Ргосекктд апб Пейуегу 8ук!етк (1995) ТесНпотю РиЬйкЫпд Со., Ьапсак1ег, РА. Например, пептидный синтез может быть проведен с помощью различных методов твердофазного синтеза (см., например, КоЬетде (1995) 8с1епсе 269:202; МетГ1е1б (1997) МеФобк Епхуто1. 289:3-13), а автоматизированный синтез может быть осуществлен, например, с помощью пептидного синтезатора АБI 431А (Регк1п Е1тег) в соответствии с инструкциями, предлагаемыми производителем.

Предлагаемые в настоящем описании пептиды и полипептиды могут быть также гликозилированы. Гликозилирование может быть произведено посттрансляционно либо химически, либо с помощью клеточных биосинтетических механизмов, которые включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть природными для последовательности или добавленными в виде пептида либо добавленными в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть с О-присоединением или ^присоединением.

Термин рекомбинантные полипептиды или белки относится к полипептидам или белкам, получаемым с помощью методов рекомбинантной ДНК; т.е. получаемым из клеток, трансформированных конструктом экзогенной ДНК, кодирующей желаемый полипептид или белок. Синтетические нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды), полипептиды или белки, предлагаемые в настоящем описании, включают те нуклеиновые кислоты, полипептиды или белки, которые получают с помощью любого химического синтеза, например, как описано ниже.

В настоящем описании фрагменты представляют собой часть природного белка, который может находиться по меньшей мере в двух разных конформациях. Фрагменты могут содержать ту же самую или в значительной мере ту же самую аминокислотную последовательность, что и природный белок. В настоящем описании ферментативно активные фрагменты представляют собой часть аминокислотной последовательности (кодирующей белок), которая сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность белка, с которым она связана. Термин в значительной мере такой же означает, что аминокислотная последовательность в значительной мере, но не полностью, является такой же, но сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность последовательности, с которой она близка. В целом, две аминокислотные последовательности являются в значительной мере одинаковыми или в значительной мере гомологичными, если они идентичны по меньшей мере на 85%. Включаются также фрагменты, которые имеют трехмерные структуры, отличные от природного белка. Примером этого служит молекула проформы, такая как пробелок с низкой активностью, которая может быть модифицирована расщеплением с образованием зрелого фермента со значительно более высокой активностью.

Предлагаемые в настоящем описании пептиды и полипептиды, как определено выше, включают все миметирующие и пептидомиметирующие формы. Термины миметирующие и пептидомиметирующие относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает в значительной мере теми же структурными и/или функциональными свойствами, что и предлагаемые в настоящем описании полипептиды. Миметик может либо состоять из полностью синтетических, неприродных аналогов аминокислот либо представлять собой гибридную молекулу частично из природных пептидных аминокислот и частично из неприродных аналогов аминокислот. Миметик может также включать любое количество консервативных замен природных аминокислот до тех пор, пока такие замены не оказывают существенного влияния на структуру и/или активность миметика. Как и в случае предлагаемых в настоящем описании полипептидов, которые представляют собой консервативные варианты, обычные эксперименты должны определить, входит ли миметик в предлагаемый объем настоящего описания, т.е. не изменена ли в значительной мере его структура и/или функция. Так, в одном аспекте композиция миметика входит в предлагаемый объем настоящего описания, если она обладает гидролазной активностью.

Предлагаемые в настоящем описании композиции миметика полипептида могут содержать любое сочетание неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции миметика включают одну или все из следующих структурных групп: а) соединяющие остатки группы, отличные от соединения природной амидной связью (пептидной связью); Ь) неприродные остатки вместо природных аминокислотных остатков или с) остатки, которые индуцируют мимикрию вторичной структуры, т.е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например бета-поворот, гамма-поворот, бета-складку, конформацию альфа-спирали и тому подобное. На

- 65 020145 пример, предлагаемый в настоящем описании полипептид может быть охарактеризован как миметик, когда все или некоторые из его остатков соединены с помощью химических средств, отличных от природных пептидных связей. Индивидуальные пептидомиметические остатки могут быть соединены пептидными связями, другими химическими связями или средствами соединения, такими как, например, глутаральдегид, сложные эфиры №гидроксисукцинимида, бифункциональные малеимиды, дициклогексилкарбодиимид (ОСС) или ^№-диизопропилкарбодиимид (ΌΙΟ). Соединяющие группы, которые могут быть альтернативой соединениям посредством традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(=0)-СН₂- вместо -С(=0)-NН-), аминометилен (№^N4), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН₂-0), тиоэфир (СН₂-8), тетразол (СЩ-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, 8раЮ1а (1983) ίη СЬет181гу авб Вюскет181ту οί Лтто Ас1бк, Рерйбек аиб РгсИетк, νοί. 7, р. 267-357, Рерббе ВаскЬοηе Моб^ка^^; Магсе11 Эеккег, NΥ).

Предлагаемый в настоящем описании полипептид может быть также охарактеризован как миметик, когда все или некоторые из остатков заменяют природные остатки. Неприродные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; несколько иллюстративных неприродных композиций, пригодных в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и указания описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот могут быть созданы заменой, например, Ό- или Ь-нафтилаланином; Ό- или Ьфенилглицином; Ό- или Ь-2-тинеилаланином; Ό- или Ь-1, -2, 3- или 4-пиренеилаланином; Ό- или Ь-3тинеилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; О-(трифторметил)фенилглицином; Ό(трифторметил)фенилаланином; Ό-р-фторфенилаланином; Ό- или Ь-р-бифенилфенилаланином; Ό- или Ь-р-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами и Ό- или Ь-алкиламинами, где алкил может быть замещенным или незамещенным метилом, этилом, пропилом, гексилом, бутилом, пентилом, изопропилом, изобутилом, вторизотилом, изопентилом или некислыми аминокислотами. Ароматические кольца неприродной аминокислоты включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиопентила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.

Миметики кислых аминокислот могут быть созданы заменой, например, некарбоновыми аминокислотами, сохраняющими отрицательный заряд; (фосфоно)аланином; сульфированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) могут быть также избирательно модифицированы путем взаимодействия с карбодиимидами (К.'-ЫС-ЫК.'), такими как, например, 1циклогексил-3 -(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1 -этил-3 -(4-азония-4,4-диметолпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил могут быть также превращены в остатки аспарагинила и глутаминила путем взаимодействия с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть также созданы путем замены, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислотами орнитином, цитруллином или (гуанидино)уксусной кислотой или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил представляет собой указанное выше. Нитрильное производное (например, содержащее СХ-часть вместо СООН) может заменять аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила могут быть дезаминированы с получением соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики остатка аргинина могут быть созданы путем взаимодействия аргинила, например, с одним или более традиционными реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, альтернативно, в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина могут быть созданы путем взаимодействия тирозила, например, с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. N ацетилимидазол и тетранитрометан могут быть использованы для образования О-ацетильных форм тирозила и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина могут быть созданы путем взаимодействия остатков цистеинила, например, с альфа-галоацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами; с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики остатка цистеина могут быть также созданы путем взаимодействия остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, №алкилмалеимидами, 3-нитро-2пиридилдисульфидом; метил-2-пиридилдисульфидом; п-хлорртутьбензоатом; 2-хлорртуть-4нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть созданы (а аминоконцевые остатки могут быть изменены) путем взаимодействия лизинила, например, с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты. Миметики лизина и другого содержащего альфа-амин остатка могут быть также созданы путем взаимодействия со сложными имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксафосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфокислота, Ометилсульфомочевина, 2,4-пентандион и катализируемых трансамидазой реакций с глиоксилатом. Миметики метионина могут быть созданы путем взаимодействия, например, с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколовую кислоту, тазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики остатка гистидина могут быть созданы путем взаимодействия гистидила, например, с диэтилпирокарбонатом или пара-бромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, те, которые получены гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп остатков серила или треонила;

- 66 020145 метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием Ν-концевого амина; метилированием амидных остатков основной цепи или заменой Ν-метиламинокислотами или амидированием С-концевых карбоксильных групп.

Остаток, например аминокислота, предлагаемого в настоящем описании полипептида может быть также заменен аминокислотой (или пептидомиметическим остатком) с противоположной хиральностью. Так, любая аминокислота, находящаяся в природе в Ь-конфигурации (которая может также обозначаться К- или З-, в зависимости от структуры химического объекта), может быть заменена аминокислотой с тем же типом химической структуры или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, обозначаемой как Ό-аминокислота, но может быть обозначенной как К- или З-форма.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы модификации предлагаемых в настоящем описании полипептидов либо с помощью естественных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо с помощью методов химической модификации и полученные модифицированные полипептиды. Модификации могут иметь место в любой части полипептида, включая пептидный скелет, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксильный концы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может иметь место на одинаковом или разных уровнях в нескольких сайтах данного полипептида. Кроме того, данный полипептид может содержать многие типы модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемовой части, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию поперечной сшивкой, образование дисульфидной связи, дементилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование якоря СР1, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пэгилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфирование и опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование; см., например, Сге1дЫоп, Т.Е., Ргокшк -З1гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегйек 2пб Еб., А.Н. Егеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (199з); Рокйгапк1абопа1 Соуа1еп1 Моб1йсабоп оГ РгсИетк, В.С. .ТоЬпкоп, Еб., Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, р. 1-12 (198з).

Для синтеза предлагаемых в настоящем описании полипептидов или их фрагментов могут быть также использованы методы твердофазного химического синтеза пептидов. Такой метод известен в данной области техники с начала 1960-х годов (МетГк1б, К.В., 1. Ат. Скет. Зос. 85:2149-2154, 196з) (см. также З1е\\'агЕ 1М. апб Уоипд, Ι.Ό., Зокб Ркаке Рерббе ЗупШекк, 2пб Еб., Ркгсе Скетка1 Со., КоскГогб, 111, р. 11-12)) и недавно был использован в имеющихся в продаже наборах для лабораторного конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбде Кекеагск Вюскетка1к). Такие имеющиеся в продаже лабораторные наборы содержат обычно используемые указания Н.М. Сеукеп е1 а1., Ргос. №И. Асаб. Зс1, ИЗА, 81:з998 (1984) и обеспечивают синтез пептидов на концах множества палочек или иголок, все из которых соединены с одной платой. При использовании такой системы плата из палочек и иголок выворачивается и помещается во вторую плату соответствующих лунок или резервуаров, в которых находятся растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты к концам иголок или палочек. Путем повторения этой стадии процесса, т.е. выворачивания и помещения концов палочек и иголок в соответствующие растворы, аминокислоты выстраиваются в желаемые пептиды. Кроме того, доступен ряд систем синтеза пептидов ЕМОС. Например, сборка полипептида или фрагмента может быть произведена на твердой подложке с использованием автоматизированного синтезатора пептидов Арркеб Вюкукктк, 1пс. Мобе1 4з1 А™. Такое оборудование обеспечивает легкий доступ к предлагаемым в настоящем описании пептидам либо путем прямого синтеза, либо путем синтеза ряда фрагментов, которые могут быть соединены с помощью других известных методов.

Ферменты.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, например белки, имеющие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 5з, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 6з, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7з, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 8з, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 9з, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную (100%) идентичность последовательности с предлагаемым в настоящем описании иллюстративным полипептидом (например, ЗЕО ГО ^:2, ЗЕО ГО ^:4, ЗЕО ГО ^:6, ЗЕО ГО ^:8, ЗЕО ГО ^:10, ЗЕО ГО ^:12, ЗЕО ГО ^:14, ЗЕО ГО ^:16, ЗЕО ГО ^:18 или ЗЕО ГО ^:20 либо ЗЕО ГО ^:2, содержащей

I, 2, з, 4, 5, 6, 7, 8 или более (несколько) или все аминокислотные варианты, описанные в табл. з, 4, 9, 10,

II, 16 или 2з, или их эквиваленты, связывающие их антитела и методы их получения и использования. Предлагаемые в настоящем описании полипептиды могут обладать любой гидролазной активностью, например активностью липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы. В альтернативных аспектах активность предлагаемого в настоящем описании фермента включает гидролиз или синтез липидов или масел. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут модифицировать масла путем гидролиза, ацидолиза, алкоголиза, глицеролиза, этерификации, трансэтерификации и/или переэтерификации, вклю

- 67 020145 чая реакции усиленной миграции.

В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут обладать модифицированными или новыми формами активности по сравнению с иллюстративными гидролазами или формами активности, описанными в настоящем описании. В настоящем описании предлагаются гидролазы, содержащие или не содержащие сигнальные последовательности, и сами сигнальные последовательности. В настоящем описании предлагаются иммобилизованные гидролазы, антитела против гидролаз и их фрагменты. В настоящем описании предлагаются белки для ингибирования гидролазной активности, например антитела, которые связываются с активным центром гидролазы. В настоящем описании предлагаются гомодимеры и гетерокомплексы, например слитые белки, гетеродимеры и т.д., включающие гидролазы, предлагаемые в настоящем описании. В настоящем описании предлагаются гидролазы, обладающие активностью в широком диапазоне высоких и низких температур и рН (например, в условиях кислой и основной водной среды).

В одном аспекте одну или более предлагаемых в настоящем описании гидролаз (например, липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз) используют для биокаталитического синтеза структурированных липидов, т.е. липидов, которые содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на глицериновом скелете, включая альтернативы масла какао, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), 1,3-диацилглицериды (ΌΛΟ), 2-моноацилглицериды (МАС) и триацилглицериды (ТАС).

В настоящем описании предлагаются методы создания ферментов, обладающих измененным (более высоким или более низким) К_са1/К_т. В одном аспекте для создания дополнительных гидролазных ферментов с альтернативной субстратной специфичностью используют сайт-специфический мутагенез. Это может быть осуществлено путем реконструкции области связывания субстрата или активного центра фермента. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы более стабильны при высоких температурах, таких как от 80 до 85, до 90, до 95°С, по сравнению с гидролазами из традиционных или умеренных организмов.

Предлагаемые в настоящем описании различные белки обладают гидролазной активностью, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активностью, при разных условиях. В настоящем описании предлагаются методы получения гидролаз с разной каталитической эффективностью и стабильностью в отношении температуры, окислительных агентов и условий рН. В этих методах могут использоваться, например, методы сайт-специфического мутагенеза и/или случайного мутагенеза. В одном аспекте для получения гидролаз с альтернативной специфичностью и стабильностью может быть использована направленная эволюция.

Предлагаемые в настоящем описании белки используют в методах, способных идентифицировать модуляторы гидролазы, например активаторы или ингибиторы. Вкратце, тестируемые образцы (например, соединения, такие как члены пептидных или комбинаторных библиотек, бульоны, экстракты и тому подобное) добавляют к образцам гидролазы для определения их способности модулировать, например ингибировать или активировать, расщепление субстрата. Эти ингибиторы могут быть использованы в промышленности и исследованиях для подавления или предотвращения нежелательной изомеризации. Модуляторы, выявленные с помощью предлагаемых в настоящем описании методов, могут быть использованы для изменения (например, снижения или повышения) спектра активности гидролазы.

В одном аспекте в настоящем описании предлагаются методы обнаружения гидролаз с помощью предлагаемых в настоящем описании нуклеиновых кислот, полипептидов и антител. В одном аспекте библиотеки фага лямбда подвергают скринингу для выявления гидролаз на основе экспрессии. В настоящем описании предлагаются библиотеки фага лямбда для использования в скрининге для обеспечения выявления токсичных клонов; улучшенного доступа к субстрату; пониженной потребности в конструировании хозяина в обход возможности любого отклонения в результате крупного удаления из библиотеки и более быстрого роста при низкой плотности клонов. Скрининг библиотек фага лямбда может производиться в жидкой фазе или в твердой фазе. В настоящем описании предлагаются методы скрининга в жидкой фазе. Это может обеспечивать большую гибкость в условиях анализа; дополнительную гибкость субстратов; большую чувствительность для слабых клонов и простоту автоматизации по сравнению с твердофазным скринингом.

В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы скрининга с использованием предлагаемых в настоящем описании белков и нуклеиновых кислот при роботизированной автоматизации. Это обеспечивает проведение многих тысяч биокаталитических реакций и анализов скрининга за короткий промежуток времени, например за день, а также обеспечивает высокий уровень точности и воспроизводимости (см. обсуждение матриц ниже). В результате библиотека производных соединений может быть получена в течение нескольких недель.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гидролазные ферменты, которые представляют собой неприродные гидролазы, обладающие гидролазной активностью, стабильностью, субстратной специфичностью, профилем рН и/или рабочей характеристикой, отличными от неприродной гидролазы. Эти гидролазы содержат аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе. Они могут быть получены путем замены множества аминокислотных остатков гидро

- 68 020145 лазы-предшественника другими аминокислотами. Г идролаза-предшественник может представлять собой природную гидролазу или рекомбинантную гидролазу. В одном аспекте варианты гидролазы охватывают замену любых природных Ь-аминокислот в указанных положениях аминокислотных остатков.

Сигнальные последовательности, препро и каталитические домены гидролазы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются сигнальные последовательности (например, сигнальные пептиды (8Р)), препродомены и каталитические домены (СО). Предлагаемые в настоящем описании 8Р, препродомены и/или СО могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомбинантные пептиды или часть слитого белка, например гетерологичный домен в слитом белке. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие каталитические домены (СО), препродомены и сигнальные последовательности (8Р, например, пептид, содержащий последовательность, включающую/состоящую из остатков аминоконца предлагаемого в настоящем описании полипептида). В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются сигнальные последовательности, включающие пептид, включающий/состоящий из последовательности, как указано в остатках с 1 по 12, с 1 по 13, с 1 по 14, с 1 по 15, с 1 по 16, с 1 по 17, с 1 по 18, с 1 по 19, с 1 по 20, с 1 по 21, с 1 по 22, с 1 по 23, с 1 по 24, с 1 по 25, с 1 по 26, с 1 по 27, с 1 по 28, с 1 по 28, с 1 по 30, с 1 по 31, с 1 по 32, с 1 по 33, с 1 по 34, с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44 (или более длинного пептида) предлагаемого в настоящем описании полипептида. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные сигнальные последовательности, включающие/состоящие из предлагаемой в настоящем описании сигнальной последовательности, берущей начало от другого предлагаемого в настоящем описании фермента или фермента или полипептида другого типа.

Предлагаемые в настоящем описании сигнальные последовательности (8Р), СО и/или препропоследовательности могут представлять собой выделенные пептиды или последовательности, присоединенные к другому гидролазному или негидролазному полипептиду, например, в виде слитого (слитого) белка. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются полипептиды, включающие предлагаемые в настоящем описании сигнальные последовательности гидролазы. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании сигнальные последовательности 8Р, СО и/или препро включают последовательности, гетерологичные предлагаемым в настоящем описании гидролазам (например, слитый белок, включающий предлагаемые в настоящем описании 8Р, СО и/или препро и последовательности другой гидролазы или негидролазного белка). В настоящем описании предлагаются гидролазы с гетерологичными 8Р, СО и/или препро последовательностями, например последовательности с сигнальной последовательностью из дрожжей. Предлагаемая в настоящем описании гидролаза может содержать гетерологичную 8Р и/или препро в векторе, например векторе серии рР1С (1пу|1годеп, СагкЬаб, СА).

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании последовательности 8Р, СО и/или препро идентифицируют после идентификации новых гидролазных полипептидов. Пути, с помощью которых белки подвергаются сортировке и транспортировке к местам их правильной локализации в клетке, часто обозначают как пути адресации белков. Одним из наиболее важных элементов во всех этих системах адресации является короткая аминокислотная последовательность на аминоконце новосинтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующее место локализации в клетке и удаляется во время транспортировки или после достижения белком своего конечного места назначения. Большинство лизосомальных, мембранных или секретируемых белков содержит аминоконцевую сигнальную последовательность, которая помечает их для транслокации из просвета эндоплазматического ретикулума. Длина сигнальных последовательностей может варьировать от 13 до 45 или более аминокислотных остатков. Специалистам в данной области техники известны различные методы выявления сигнальных последовательностей. Например, в одном аспекте сигнальные пептиды новой гидролазы идентифицируют с помощью метода, обозначаемого как 81дпа1Р. В 81дпа1Р используется объединенная нейронная сеть, которая узнает и сигнальные пептиды, и сайты их отщепления (№е1кеп, е1 а1., 1бепрПса1юп о1 ргокагуойс апб еикагуойс ыдпа1 рерйбек апб ргебюйоп о11Не1г с1еаνаде 8Йе§. Рго1ет Епдтееппд, νο1. 10, по. 1, р. 1-6 (1997).

Следует понимать, что в некоторых аспектах предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут не содержать последовательности 8Р и/или препро и/или каталитические домены (СО). В одном аспекте в настоящем описании предлагаются полипептиды (например, гидролазы), лишенные всего или части 8Р, СО и/или препродомена. В другом аспекте в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие сигнальную последовательность (8Р), СО и/или препро от одной гидролазы, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты другой гидролазы, или, необязательно, могут быть желательны сигнальная последовательность (8Р) и/или препродомен из белка, отличного от гидролазы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие предлагаемые в настоящем описании сигнальные последовательности (8Р), препродомен и/или каталитические домены (СО) и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, не связанные в

- 69 020145 естественных условиях (например, с гидролазой) с 8Р, препродоменом и/или СИ. Последовательность, с которой 8Р, препродомен и/или СИ не связаны в естественных условиях, может находиться на аминоконце 8Р, препродомена и/или СИ, карбоксильном конце и/или на обоих концах 8Р и/или СИ. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие (или состоящие из) полипептид, включающий предлагаемые в настоящем описании сигнальную последовательность (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СИ), при условии, что он не связан с любой последовательностью, с которой он связан в естественных условиях (например, последовательностью гидролазы). В настоящем описании предлагаются выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие эти полипептиды. Так, в одном аспекте предлагаемая в настоящем описании синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота включает кодирующую последовательность для предлагаемых в настоящем описании сигнальной последовательности (8Р), препродомена и/или каталитического домена (СИ) и гетерологичную последовательность (т.е. последовательность, в естественных условиях не связанную с предлагаемыми в настоящем описании сигнальной последовательностью (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СИ)). Гетерологичная последовательность может находиться на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах последовательности, кодирующей 8Р, препродомен и/или СИ.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гибриды Ν-концевой или С-концевой подпоследовательностей предлагаемых в настоящем описании ферментов (например, сигнальных последовательностей, препропоследовательностей) с другими полипептидами, активными белками или фрагментами белков. Получение предлагаемого в настоящем описании фермента (например, гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) может быть также осуществлено путем экспрессии фермента в виде неактивного слитого белка, который впоследствии активируется в результате события протеолитического расщепления (с помощью либо эндогенной, либо экзогенной протеазной активности, например, трипсина), что ведет к разделению партнера слитого белка и зрелого фермента, например, предлагаемой в настоящем описании гидролазы. В одном аспекте предлагаемый в настоящем описании слитый белок экспрессируется с гибридного нуклеотидного конструкта, который кодирует в единой рамке считывания следующие элементы: нуклеотидную последовательность для слитого белка, линкерную последовательность (определяемую как нуклеотидная последовательность, которая кодирует гибкую аминокислотную последовательность, которая соединяет два менее гибких домена белка), сайт, узнаваемый расщепляющей протеазой, и последовательность зрелого фермента (например, любого предлагаемого в настоящем описании фермента, например гидролазы). В альтернативных аспектах слитый белок может содержать последовательность пектатлиазы, последовательность ксиланазы, последовательность фосфатазы фосфатидной кислоты или другую последовательность, например последовательность, которая, как было показано ранее, усиленно экспрессируется в интересующей системе хозяина. Может быть использована любая система хозяина (см. обсуждение выше), например Е. сой или РюЫа рак!опк. Расположение нуклеотидных последовательностей в гибридном нуклеотидном конструкте может быть определено на основании уровней экспрессии белка, обеспечиваемых каждым гибридным конструктом. Если идти от 5'-конца нуклеотидного конструкта к 3'-концу конструкта, в одном аспекте нуклеотидные последовательности собирают в следующем порядке: сигнальная последовательность/слитый белок/линкерная последовательность/сайт, узнаваемый расщепляющей протеазой/зрелый фермент (например, любой предлагаемый в настоящем описании фермент, например гидролаза) или сигнальная поеледовательность/пропоследовательность/зрелый фермент/линкерная последовательность/слитый белок. Экспрессия фермента (например, любого предлагаемого в настоящем описании фермента, например гидролазы) в виде неактивного слитого белка может улучшать суммарную экспрессию последовательности фермента, может снижать потенциальную токсичность, связанную с избыточной продукцией активного фермента, и/или может повышать срок хранения фермента до использования, поскольку фермент должен быть неактивен до тех пор, пока слитый белок, например пектатлиаза, не будет отделен от фермента, например, предлагаемой в настоящем описании гидролазы.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются специфические составы для активации предлагаемой в настоящем описании гидролазы, экспрессируемой в виде слитого белка. В одном аспекте активация гидролазной активности, исходно экспрессированной в виде неактивного слитого белка, производится с использованием протеолитической активности или потенциальной протеолитической активности в сочетании с аминоконцевой или карбоксиконцевой пептидазой (пептидаза может представлять собой предлагаемый в настоящем описании фермент или другой фермент). Это событие активации может быть осуществлено множеством путей и на многих этапах процесса получения/хранения до применения для рафинирования масла.

Предлагаемые в настоящем описании иллюстративные процессы включают расщепление за счет эндогенной активности, экспрессируемой хозяином-продуцентом после секреции гибридного конструкта в среду ферментации; расщепление за счет активности эндогенной протеазы, которая активируется или входит в контакт с внутриклеточно экспрессируемым гибридным конструктом после разрушения клетокхозяев; пропускание сырого или очищенного гибридного конструкта через колонку с иммобилизованной протеазной активностью для осуществления расщепления и активации фермента (например, предлагае

- 70 020145 мой в настоящем описании гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) перед составлением фермента; обработку сырого или очищенного гибридного конструкта растворимым источником протеолитической активности; активацию гидролазы (например, предлагаемой в настоящем описании гидролазы) на заводе по рафинации масла с использованием либо растворимого, либо нерастворимого источника протеолитической активности непосредственно перед использованием в процессе; и/или активацию активности гидролазы (например, предлагаемой в настоящем описании липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) путем непрерывной циркуляции состава гибридного конструкта через колонку с иммобилизованной протеазной активностью при пониженной температуре (например, при любой температуре между приблизительно 4 и 20°С). Это событие активации может быть осуществлено перед доставкой к месту использования или может иметь место на заводе по рафинации масла.

Гликозилирование.

Предлагаемые в настоящем описании пептиды и полипептиды (например, гидролазы, антитела) могут быть также гликозилированными, например, в одном аспекте, содержащими по меньшей мере один сайт гликозилирования, например гликозилирование с Ν-присоединением или О-присоединением. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в Р. раЧогЕ или δ. ротЬе. Гликозилирование может быть произведено посттрансляционно либо химически, либо с помощью клеточных биосинтетических механизмов, которые включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или могут быть добавлены в виде пептида либо добавлены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты.

Гибридные гидролазы и пептидные библиотеки.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гибридные гидролазы (например, синтетические белки) и слитые белки, включающие пептидные библиотеки, которые включают предлагаемые в настоящем описании последовательности. Предлагаемые в настоящем описании пептидные библиотеки могут быть использованы для выделения пептидных модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) мишеней. Предлагаемые в настоящем описании пептидные библиотеки могут быть использованы для идентификации формальных партнеров мишеней по связыванию, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и тому подобное.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании слитые белки (например, пептидная часть) являются конформационно стабилизированными (относительно линейных пептидов) для обеспечения более высокого сродства связывания мишеней. В другом аспекте в настоящем описании предлагаются гибриды предлагаемых в настоящем описании гидролаз и других пептидов, включая известные и случайные пептиды. Они могут быть соединены таким образом, что структура фермента или антитела (например, гидролазы) не меняется существенно, а пептид метаболически или структурно конформационно стабилизирован. Это обеспечивает создание пептидной библиотеки, которую легко отслеживать и на ее присутствие в клетке, и на ее количество.

Предлагаемые в настоящем описании варианты аминокислотной последовательности могут быть охарактеризованы заранее определенной природой вариации, особенностью, которая ставит их отдельно от имеющейся в природе формы, например аллельной или межвидовой вариации последовательности гидролазы. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании варианты проявляют качественно такую же биологическую активность, что и природный аналог. Альтернативно, могут быть отобраны варианты с модифицированными свойствами. В одном аспекте при том, что сайт или область введения вариации аминокислотной последовательности заранее определен, сама по себе мутация не обязательно заранее определена. Например, для оптимизации осуществления мутации в данном сайте может быть произведен случайный мутагенез в кодоне- или области-мишени, и экспрессируемые варианты гидролазы подвергают скринингу на предмет оптимального сочетания желаемой активности. Методы получения мутаций с заменами в заранее определенных сайтах ДНК, содержащих известную последовательность, хорошо известны, как обсуждается в настоящем описании, например мутагенез с праймером М13 и мутагенез с помощью ПЦР. Скрининг мутантов может быть произведен с помощью тестов на протеолитическую активность. В альтернативных аспектах аминокислотные замены могут затрагивать одиночные остатки; вставки могут включать порядка от 1 до 20 аминокислот, хотя могут быть произведены значительно более крупные вставки. Делеции могут варьировать от приблизительно 1 до приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или более. Для получения конечного производного с оптимальными свойствами могут быть использованы замены, делеции, вставки или любое их сочетание. Обычно эти изменения производят на немногих аминокислотах для сведения к минимуму перестройки молекулы. Однако при некоторых обстоятельствах могут быть допустимы более значительные изменения.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гидролазы, у которых были модифицированы полипептидный остов, вторичная или третичная структура, например альфаспиральная или бета-складчатая структура. В одном аспекте было произведено изменение гидрофобности. В одном аспекте было модифицировано множество боковых цепей. Существенные изменения в функции или иммунологической идентичности производятся путем отбора замен, которые являются менее консервативными. Например, могут быть произведены замены, которые более существенно влияют на структуру полипептидного остова в области изменения, например альфа-спиральную или бета

- 71 020145 складчатую структуру; заряд или гидрофобный сайт молекулы, который может находиться в активном центре; или боковую цепь. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются белки, включающие предлагаемые в настоящем описании замены последовательности, например, где (а) гидрофильные остатки, например серил или треонил, заменены (или на) гидрофобным остатком, например лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (Ь) цистеин или пролин заменены (или на) любым другим остатком; (с) остаток, содержащий электроположительную боковую цепь, например лизил, аргинил или гистидил, заменен (или на) электроотрицательный остаток, например глутамил или аспартил; или (б) остаток с объемной боковой цепью, например фенилаланин, заменен (или на) остатком, не содержащим боковой цепи, например глицином. Варианты могут проявлять качественно ту же самую биологическую активность (т.е. гидролазную активность), хотя при необходимости могут быть отобраны варианты для модификации свойств гидролаз.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы включают эпитопы или метки для очистки, сигнальные последовательности или другие присоединенные последовательности и т.д. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть соединены со случайным пептидом с образованием гибридного полипептида. Присоединенный или функционально связанный в настоящем описании означает, что случайный пептид и гидролаза соединены друг с другом таким образом, чтобы свести к минимуму нарушение стабильности структуры гидролазы, например она сохраняла гидролазную активность. Гибридный полипептид (или гибридный полинуклеотид, кодирующий гибридный полипептид) может включать также дополнительные компоненты, включая множество пептидов во множестве петель.

В одном аспекте пептиды (например, подпоследовательности гидролазы) и кодирующие их нуклеиновые кислоты являются рандомизированными, либо полностью рандомизированными, либо со смещенной рандомизацией, например, по частоте нуклеотид/остаток в целом или в определенном положении. Рандомизированный означает, что каждая нуклеиновая кислота и пептид состоит, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. В одном аспекте нуклеиновые кислоты, которые дают начало пептидам, могут быть химически синтезированы и, таким образом, могут включать любой нуклеотид в любом положении. Таким образом, когда нуклеиновые кислоты экспрессируются с образованием пептидов, любой аминокислотный остаток может быть включен в любое положение. Может быть разработан процесс синтеза для создания рандомизированных нуклеиновых кислот для обеспечения образования всех или большинства возможных комбинаций по длине нуклеиновой кислоты с образованием тем самым библиотеки рандомизированных нуклеиновых кислот. Библиотека может обеспечить в значительной мере структурно разнообразную популяцию рандомизированных продуктов экспрессии для оказания влияния на вероятностно существенный диапазон клеточных ответов с получением одной или более клеток, проявляющих желаемый ответ. В настоящем описании предлагаются библиотеки взаимодействий, достаточно большие для того, чтобы хотя бы один из ее членов имел структуру, придающую ему сродство к некоей молекуле, белку или другому фактору.

Методологии скрининга и устройства для отслеживания в оперативном режиме.

При осуществлении предлагаемых в настоящем описании методов может быть использовано множество аппаратов и методологий в связке с предлагаемыми в настоящем описании полипептидами и нуклеиновыми кислотами, например, для скрининга полипептидов на предмет гидролазной активности, для скрининга соединений в качестве потенциальных активаторов или ингибиторов гидролазной активности (например, скрининга потенциальных лекарств), для скрининга антител, которые связываются с предлагаемым в настоящем описании полипептидом, для скрининга нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с предлагаемыми в настоящем описании нуклеиновыми кислотами, для скрининга клеток, экспрессирующих предлагаемый в настоящем описании полипептид; и тому подобное; см., например, патент США № 6337187.

Капиллярные матрицы.

В предлагаемых в настоящем описании методах могут быть использованы капиллярные матрицы, такие как СЮАМАТШХ™, Э|уег5а Согрогайоп, 8ап П1едо, СА. Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты или полипептиды могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу, включая капиллярные матрицы. Матрицы могут быть использованы для скрининга или отслеживания библиотек композиций (например, небольших молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) на предмет их способности связывать или модулировать активность предлагаемых в настоящем описании нуклеиновой кислоты или полипептида. Капиллярные матрицы обеспечивают другую систему хранения и скрининга образцов. Например, аппарат для скрининга образцов может включать множество капилляров, выстроенных в матрицу из соседних капилляров, где каждый капилляр включает по меньшей мере одну стенку, формирующую полость для удержания образца. Аппарат может дополнительно включать промежуточное вещество, расположенное между соседними капиллярами в матрице, и один или более индикаторов, созданных внутри промежуточного вещества. Капилляр для скрининга образца, который приспособлен для связывания в матрице из капилляров, может включать первую стенку, формирующую полость для удержания образца, и вторую стенку, образованную из фильтрующего вещества, для фильтрования энергии возбуждения, подаваемой в полость для возбуждения образца.

- 72 020145

Полипептид или нуклеиновая кислота, например лиганд или субстрат, может быть введен в первый компонент, по меньшей мере в часть капилляра или капиллярной матрицы. Каждый капилляр капиллярной матрицы может включать по меньшей мере одну стенку, формирующую полость для удержания первого компонента. Позади первого компонента в капилляр может быть введен пузырек воздуха. В капилляр может быть введен второй компонент, где второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Интересующий образец может быть введен в качестве первой жидкости, меченной выявляемой частицей, в капилляр или капиллярную матрицу, где каждый капилляр или капиллярная матрица включает по меньшей мере одну стенку, формирующую полость для удержания первой жидкости и выявляемой частицы, и где по меньшей мере одна стенка покрыта связывающим веществом для связывания выявляемой частицы по меньшей мере с одной стенкой. Метод может дополнительно включать удаление первой жидкости из капиллярной трубки, когда связанная выявляемая частица остается внутри капилляра, и введение в капиллярную трубку второй жидкости.

Капиллярная матрица может включать множество отдельных капилляров, включающих по меньшей мере одну внешнюю стенку, формирующую полость. Внешняя стенка капилляра может представлять собой одну или более стенок, соединенных друг с другом. Сходным образом, стенка может формировать полость, которая иметь цилиндрическую, квадратную, гексагональную или любую другую геометрическую форму до тех пор, пока стенки формируют полость для удержания жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут быть собраны вместе в тесной близости с образованием плоской структуры. Капилляры могут быть соединены друг с другом спайкой (например, когда капилляры изготовлены из стекла), склеены, соединены или прижаты стенка к стенке. Капиллярная матрица может быть собрана из любого количества отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Капиллярная матрица может образовывать планшет для микротитрования, содержащий приблизительно 100000 или более соединенных вместе отдельных капилляров.

Матрицы или биочипы.

Предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты или полипептиды могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Матрицы могут быть использованы для скрининга или отслеживания библиотек композиций (например, небольших молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) на предмет их способности связывать или модулировать активность предлагаемых в настоящем описании нуклеиновой кислоты или полипептида. Например, в одном предлагаемом в настоящем описании аспекте отслеживаемым параметром служит экспрессия транскрипта гена гидролазы. Один или более или все транскрипты клетки могут быть измерены путем гибридизации образца, включающего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, отображающие или комплементарные транскриптам клетки, с иммобилизованными на матрице или биочипе нуклеиновыми кислотами. Путем использования матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки могут быть измерены одновременно. Альтернативно, матрицы, включающие геномную нуклеиновую кислоту, могут быть также использованы для определения генотипа заново созданного штамма, полученного с помощью предлагаемых в настоящем описании методов. Полипептидные матрицы также могут быть использованы для одновременного количественного определения множества белков. В настоящем изобретении может быть использована любая известная матрица, обозначаемая также как микроматрица, или матрица нуклеиновых кислот, или матрица полипептидов, или матрица антител, или биочип либо их вариант. В целом, матрицы представляют собой множество точек или элементов-мишеней, причем каждый элемент-мишень включает определенное количество одной или более биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной области поверхности субстрата, для специфического связывания с молекулой образца, например, транскриптами мРНК.

Предлагаемые в настоящем описании матрицы, или микроматрицы, или биочипы, или чипы могут включать множество элементов-мишеней, причем каждый элемент-мишень включает определенное количество одного или более полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной области поверхности субстрата.

В одном аспекте гидролазы используются в иммобилизованной форме. Может быть использован любой метод иммобилизации, например иммобилизация на инертной подложке, такой как диэтиламиноэтилцеллюлоза, пористое стекло хитин или клетки. Клетки, экспрессирующие предлагаемые в настоящем описании гидролазы, могут быть иммобилизованы поперечной сшивкой, например, с помощью глутаральдегида, с поверхностью субстрата.

При осуществлении предлагаемых в настоящем описании методов может быть включена любая известная матрица и/или метод получения и использования матриц, целиком или частично, или их вариации, как описано, например, в патентах США №№ 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; см. также, например, №О 99/51773; №О 99/09217; №О 97/46313; №О 96/17958; см. также, например, .к+пзюп (1998) Сигг. Вю1. 8:К171-К174; 8сйиттег (1997) Вю1есйпк|иез 23:1087-1092; Кет (1997) В|о1есйпк|иез 23:120-124; 8ойпаз-То1бо (1997) Сеиез, Сйготозотез & Саисег 20:399-407; Во\\1е11 (1999) ЫаШге Сеиейсз 8ир. 21:25-32; см. также опубликованные патентные заявки США №№ 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449;

- 73 020145

20010014448; 20010012537;20010008765.

Антитела и методы скрининга на основе антител.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфически связываются с предлагаемой в настоящем описании гидролазой. Эти антитела могут быть использованы для выделения, идентификации или количественного определения предлагаемой в настоящем описании гидролазы или родственных полипептидов. Эти антитела могут быть использованы для выделения других предлагаемых в настоящем описании полипептидов или других родственных гидролаз.

Предлагаемые в настоящем описании антитела могут включать пептид(ы) или полипептид(ы), берущие начало от, сконструированных после или в значительной мере кодируемых геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов или их фрагментами, способные специфически связывать антиген или эпитоп, см., например, Рипйатеп!а1 Ιιηιηι.ιηο1ο§ν. ТЫгй Еййюп, ^.Е. Раи1, ей., Рагеп Ргезз, КУ. (1993); ХУйзоп (1994) 1. Тттипок Ме11юйз 175:267-273; УагтизБ (1992) 1. ВюсНет. ВюрБуз. Ме11юйз 25:85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е. антигенсвязывающие сайты (например, фрагменты, последовательности, области, определяющие комплементарность (СОР.)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (ί) РаЬ фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два РаЬ фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) Рй фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Ρν фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одной ветви антитела; (ν) йАЬ фрагмент (^агй е1 а1., (1989) №11иге 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) выделенную область, определяющую комплементарность (СОЯ). Термин антитело при ссылке на него также включает одноцепочечные антитела. В настоящем описании предлагаются антитела, включая антигенсвязывающие сайты и одноцепочечные антитела, которые специфически связываются с предлагаемой в настоящем описании гидролазой. При осуществлении предлагаемых в настоящем описании методов могут быть также использованы полипептиды, обладающие гидролазной активностью.

Антитела могут быть использованы для иммунопреципитации, окрашивания, иммуноаффинных колонок и тому подобного. При необходимости последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих специфические антигены, могут быть созданы путем иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на предлагаемой в настоящем описании матрице. Альтернативно, предлагаемые в настоящем описании методы могут быть использованы для модификации структуры антитела, продуцируемого подлежащей модификации клеткой, например сродство антитела может быть увеличено или снижено. Более того, с помощью предлагаемых в настоящем описании методов может быть сконструирован фенотип клетки, способной производить или модифицировать антитела.

Методы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области техники и описаны в научной и патентной литературе, см., например, Сойдап, СЫШЕХТ РЯ0Т0С0Б8 Ш ΕΜΜΗ^^ΟΥ, №йеу/6геепе, НУ (1991); 8Йез (ейз.) ВА8ΙΟ АЫЭ СБЮТСАБ ΙΜΜυΧ0Ε0ΟΥ (7(Н ей.) Бапде Мейюа1 РиЬйсайопз, Боз АНоз, СА (8Шез); Сойтд, М0Х0СБ0ХЛБ АNТIВ0^IЕ8: РРБХаРБЕЗ АХО РНАС'ПСЕ (2й ей.) Асайетю Ргезз, Хеи Уогк, КУ (1986); КоЫег (1975) Ыа^ 256:495; Наг1ои (1988) АNТIВ0^IЕ8, А БАВа^ТО^У МА^АЕ, Со1й Зрппд НагЬог РиЬйсайопз, Хе\ν Уогк. Антитела могут быть также созданы ш уйго, например, с использованием связывающего сайта рекомбинантного антитела, экспрессируемого библиотеками фагового дисплея, в дополнение традиционным методам ш νί\Ό с использованием животных; см., например, НоодепЬоот (1997) Тгепйз Вю1есЬпо1. 15:62-70; Как (1997) Аппи. Реу. Вюрйуз. Вюто1. 81гис(. 26:27-45.

Полипептиды или пептиды могут быть использованы для создания антител, которые специфически связываются с предлагаемыми в настоящем описании полипептидами. Полученные антитела могут быть использованы для процедур иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения того, находится ли полипептид в биологическом образце. При таких процедурах белковый препарат, такой как экстракт, или биологический образец вводят в контакт с антителом, способным специфически связываться с одним из предлагаемых в настоящем описании полипептидов.

При иммуноаффинных процедурах антитело прикрепляют к твердой подложке, такой как шарик, или другой матрикс колонке. Белковый препарат вводят в контакт с антителом в условиях, при которых антитело специфически связывается с одним из предлагаемых в настоящем описании полипептидов. После промывки для удаления неспецифически связанных белков специфически связанные полипептиды элюируют.

Способность белков биологического образца связываться с антителом может быть определена с помощью любой из множества процедур, знакомых специалистам в данной области техники. Например, связывание может быть определено путем промечивания антитела выявляемой меткой, такой как флуоресцентный агент, ферментная метка или радиоизотоп. Альтернативно, связывание антитела с образцом может быть выявлено с помощью вторичного антитела, имеющего на себе такую выявляемую метку. Конкретные типы анализа включают анализ ЕЫЗА, анализ сэндвичного типа, радиоиммунологический анализ и иммуноблоттинг.

- 74 020145

Индуцированные поликлональные антитела против предлагаемых в настоящем описании полипептидов могут быть получены путем прямой инъекции полипептидов животному или введения полипептидов отличному от человека животному. Полученное таким образом антитело обычно затем связывает сам полипептид. Таким путем для индукции антител, которые могут связываться с цельным нативным полипептидом, может быть использована даже последовательность, кодирующая лишь фрагмент полипептида. Такие антитела могут быть затем использованы для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих этот полипептид.

Для получения моноклональных антител может быть использован любой метод, который дает антитела, продуцированные культурами непрерывных клеточных линий. Примеры включают метод гибридомы, метод триомы, метод гибридомы В-клеток человека и метод ЕВУ-гибридомы (см., например, Со1е (1985) в Мопос1опа1 АпйЬоб1ек апб Сапсег ТНегару, А1ап К. Ыкк, Шс., р. 77-96).

Для продукции одноцепочечных антител против предлагаемых в настоящем описании полипептидов могут быть адаптированы методы, описанные для продукции одноцепочечных антител (см., например, патент США № 4946778). Альтернативно, для экспрессии гуманизированных антител против этих полипептидов или их фрагментов могут быть использованы трансгенные мыши.

Антитела, индуцированные против предлагаемых в настоящем описании полипептидов (включая антиидиотипические антитела), могут быть использованы для скрининга сходных полипептидов из других организмов и образцов. При таких методах полипептиды из организма вводят в контакт с антителом, и определяют полипептиды, которые специфически связывают антитело. Для выявления связывания антитела может быть использована любая из процедур, описанных выше.

Иммобилизованные гидролазы.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, используют в виде иммобилизованных форм, например, для переработки липидов, для структурированного синтеза липидов, для гидролиза белков и тому подобного. Предлагаемые в настоящем описании иммобилизованные липазы могут быть использованы, например, для гидролиза триацилглицеридов, диацилглицеридов или сложных эфиров или для этерификации или трансэтерификации жирных кислот, диацилглицеридов или триацилглицеридов или переэтерификации жиров. В одном аспекте липаза является специфичной в отношении этерификации жирных кислот спиртом, 1,3специфичной или специфичной в отношении гидролиза частичных глицеридов, сложных эфиров или триацилглицеридов. Предлагаемые в настоящем описании иммобилизованные липазы могут быть использованы в упакованном слое для непрерывной трансэтерификации жиров без растворителя; см., например, патент США № 4818695; 5569594.

Могут быть использованы любой метод иммобилизации или форма подложки, например матрицы, шарики, капиллярные подложки и тому подобное, как описано выше. В одном аспекте иммобилизация гидролазы может производиться на инертную подложку, такую как диэтиламиноэтилцеллюлоза, пористое стекло хитин или клетки. Клетки, экспрессирующие предлагаемые в настоящем описании гидролазы, могут быть иммобилизованы поперечной сшивкой, например, с помощью глутаральдегида с поверхностью субстрата. Предлагаемые в настоящем описании иммобилизованные гидролазы могут быть получены в форме, содержащей гидролазы, связанные с сухой, пористой гидрофобной подложкой из частиц, поверхностно-активным веществом, таким как сложный эфир полиоксиэтиленсорбита с жирной кислотой или сложный эфир полиглицерина с жирной кислотой. Подложка может представлять собой алифатический олефиновый полимер, такой как полиэтилен или полипропилен, гомо- или сополимер стирола или его смеси или предварительно обработанную неорганическую подложку. Эти подложки могут быть выбраны из алифатических олефиновых полимеров, окисленных полимеров, смесей этих полимеров или предварительно обработанных неорганических подложек для придания этим подложкам гидрофобности. Эта предварительная обработка может включать силанизацию с помощью органического соединения кремния. Неорганическое вещество может представлять собой диоксид кремния, оксид алюминия, стекло или керамику. Подложки могут быть изготовлены из полистирола, сополимеров стирола, полиэтилена, полипропилена или из сополимеров, берущих начало от (мет)акрилатов; см., например, патент США № 5773266.

Гидролазные ферменты, их фрагменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты и фрагменты, могут быть прикреплены к твердой подложке. Это часто является экономичным и эффективным при использовании гидролаз в производственных процессах. Например, сочетание или смесь гидролазных ферментов (или их активных фрагментов), которые используются в специфической химической реакции, могут быть присоединены к твердой подложке и погружены в рабочий котел. Может происходить ферментативная реакция. Затем твердая подложка может быть извлечена из котла вместе с прикрепленными к ней ферментами для повторного использования. В одном предлагаемом в настоящем описании варианте осуществления к твердой подложке прикрепляют предлагаемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты. В другом предлагаемом в настоящем описании варианте осуществления твердую подложку выбирают из группы, состоящей из геля, смолы, полимера, керамики, стекла, микроэлектрода и любого их сочетания.

Например, предлагаемые в настоящем описании твердые подложки включают гели. Некоторые

- 75 020145 примеры гелей включают ЗЕРНАЮЗЕ™ (СЕ НеаИНсаге, Р1кса1а\\'ау, N1), желатин, глутаральдегид, обработанный хитозаном глутаральдегид, альбумин-глутаральдегид, хитозан-ксантан, гель ίοуορеа^1 (полимерный гель), альгинат, альгинат-полилизин, каррагинан, агарозу, глиоксальагарозу, магнитную агарозу, декстранагарозу, гидрогель поли(карбамоилсульфонат), гидрогель БСА-ПЭГ, фосфорилированный поливиниловый спирт (ПВА), моноаминоэтил-Н-аминоэтил (МАНА), амино или любое их сочетание.

Другие предлагаемые в настоящем описании твердые подложки включают смолы или полимеры. Некоторые примеры смол или полимеров включают целлюлозу, акриламид, нейлон, вискозу, полиэфир, анионообменную смолу, ХАБ-7, ΛМΒΕΒ^IΤΕ™ ХАБ-8, ΛМΒΕΒ^IΤΕ™ 1ВА-94, АМΒΕΒ^IΤΕ™ 1ВС-50 ^οΐω апб Наак, РЫ1абе1рЫа, РА), поливинил, полиакриловую, полиметакрилат или любое их сочетание.

Другой тип предлагаемой в настоящем описании твердой подложки включает керамику. Некоторые примеры включают непористую керамику, пористую керамику, 8ίΟ₂, А1Ю3. Другим типом твердой подложки, пригодным в настоящем изобретении, является стекло. Некоторые примеры включают непористое стекло, пористое стекло, аминопропиловое стекло или любое их сочетание. Другим типом твердой подложки, который пригоден для использования, является микроэлектрод. Примером служит покрытый полиэтиленимином магнетит. В качестве твердой подложки могут быть использованы частицы графита.

Другой тип предлагаемой в настоящем описании твердой подложки включает продукты диатомовой земли и силикаты. Некоторые примеры включают СЕР^Е®, КЕНШЕ®, ЭМСЛУ®, РВ1М181Ь®, Б1АИЬ® диатомиты и МIСΒΟ-СΕ^®, (41+1.(+4 δ^δΟ^™ и СЕЕКА+Е® (\ογ16 Мшега1к 1пс., 8апίа Βа^Ьа^а, СА) синтетические силикаты кальция и магния.

Другим примером твердой подложки является клетка или включает ее, такая как эритроцит крови. Наборы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются наборы, включающие композиции, например нуклеиновые кислоты, экспрессионные кассеты, векторы, клетки, трансгенные семена растений или части растений, полипептиды (например, гидролазы) и/или предлагаемые в настоящем описании антитела. Наборы могут также содержать обучающий материал с методологическими указаниями и промышленным применением, как предлагается в настоящем описании, как описано в настоящем описании.

Промышленное и медицинское применение.

Предлагаемые в настоящем описании гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) имеют много применений в промышленности и медицине и ниже описаны немногочисленные иллюстративные применения и композиции. Предлагаемые в настоящем описании процессы включают превращение неспособного к гидратации фосфолипида в гидратируемую форму, рафинирование масла, производство пищевых продуктов, переработку масел (например, получение масла с низким насыщением) из растений, рыбы, водорослей и тому подобного, обозначающих лишь немногие области применения.

Производство пищевых продуктов и кормов.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются процессы приготовления сыра с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз (например, липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз). В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются сыры, включающие гидролазы. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы или их сочетание) используются для обработки сыров для усиления вкуса, для повышения выхода и/или для стабилизации сыров, например, путем снижения склонности к вымасливанию, или в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты используют для получения сыра из сырного молока. Эти предлагаемые в настоящем описании процессы могут включать любой метод или протокол, например, как описано, например, в патентах США №№ 6551635 и 6399121, \Ο 03/070013, \Ο 00/054601. Например, в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) используют для стабилизации жировой эмульсии в молоке или включающих молоко композициях, например сливках, и используют для стабилизации молочных композиций, например, для производства сливок или сливочных напитков. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются процессы усиления вкуса сыра с использованием по меньшей мере одного предлагаемого в настоящем описании фермента, причем процесс включает инкубацию белка, жира и протеазы и липазы (например, предлагаемой в настоящем описании) в водной среде в условиях, которые создают усиленный вкус сыра (например, пониженную горечь), например, как описано в \Ο 99/66805. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании липазы используют для усиления вкуса сыра (например, творога) путем смешивания с водой, протеазой и фосфолипазой при повышенной температуре, например между приблизительно 75 и 95°С, как описано, например, в патенте США № 4752483. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании липазы используют для ускорения созревания сыра путем добавления предлагаемого в настоящем описании фермента к сыру (например, сырному молоку) перед добавлением к молоку коагулятора или путем добавления предлагаемого в настоящем описании фермента (например, липазы) к творо

- 76 020145 гу с солью перед прессованием, например, как описано, например, в патенте США № 4707364. В одном аспекте предлагаемую в настоящем описании липазу используют для разрушения триацилглицерида в молочном жире для высвобождения свободных жирных кислот, приводящего к усилению вкуса. Предлагаемый в настоящем описании фермент может быть также использован в любом из этих предлагаемых в настоящем описании процессов, см., например, Вгшб1к1 (2001) 1. оГ Рооб 8с1. 66: 1100-1107.

Структурированный синтез и переработка масел.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы структурированного синтеза масел, липидов и тому подобного с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз (например, липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз). Предлагаемые в настоящем описании методы включают биокаталитический синтез структурированных липидов, т.е. липидов, которые содержат определенный набор жирных кислот, распределенных определенным образом на остове, например на остове глицерина. Продукты, получаемые с использованием гидролаз и методов реализации, предлагаемых в настоящем описании, включают масла с низким насыщением, например масла из овощей (например, сои, канолы), животных, растений, рыбы, водорослей, причем эти масла были переработаны или обработаны предлагаемым в настоящем описании полипептидом; и пищевые продукты, корма, добавки, фармацевтические препараты и тому подобное, содержащие масла с низким насыщением, полученные с применением методов и/или композиций (например, ферментов), предлагаемых в настоящем описании. Продукты, полученные с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз и методов реализации, также включают альтернативы масла какао, липиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), липиды, содержащие незаменимые жирные кислоты, липиды, содержащие мононенасыщенные жирные кислоты, липиды, содержащие фосфохолин и фосфосерин, липиды, содержащие фитостерины, 1,3-диацилглицериды (ΌΑ0), 2-моноацилглицериды ^ΑΟ) и триацилглицериды (^6).

Предлагаемые в настоящем описании методы обеспечивают синтез липидов или жирных кислот с определенной избирательностью в отношении положения и пространственной ориентации. В настоящем описании предлагаются масла, липиды и тому подобное и масла, которые могут быть использованы в пищевых продуктах и кормах и материалах для приготовления пищи (например, маслах для жарки, маслах для обжарки, маслах для выпечки, соусах, маринадах, приправах, аэрозольных маслах, маргаринах, майонезе, густых и жидких подливах, альтернативах масла какао и тому подобном), которые были переработаны или обработаны предлагаемыми в настоящем описании полипептидами или пептидами, например гидролазами, такими как липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются фармацевтические агенты, нутрицевтики и косметические средства, включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, гидролазы, такие как липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы; или пептиды либо антитела).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы переработки (модификации) масел, липидов и тому подобного с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз. Методы могут быть использованы для переработки масел из растений, животных, микроорганизмов.

Предлагаемые в настоящем описании методы могут быть использованы в структурированном синтезе масел, сходных с маслами, обнаруживаемыми в растениях, животных и микроорганизмах. Липиды и масла могут быть переработаны с получением желаемых свойств. Липиды и масла, которые могут быть переработаны с помощью предлагаемых в настоящем описании методов (с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз), включают альтернативы масла какао, липиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), липиды, содержащие незаменимые жирные кислоты, липиды, содержащие мононенасыщенные жирные кислоты, липиды, содержащие фосфохолин и фосфосерин, липиды, содержащие фитостерины, 1,3-диацилглицериды (ΌΑΟ), 2-моноацилглицериды ^ΑΟ) и триацилглицериды (ΠΑΟ). В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании переработанные и синтетические масла и жиры (например, альтернативы масла какао и масла овощей) могут быть использованы во множестве применений, например в получении пищевых продуктов (например, кондитерских изделий, выпечки) и в составлении фармацевтических средств, нутрицевтиков и косметических средств. В настоящем описании предлагаются методы переработки жиров и масел, например масличных семян, растений, включая, например, канолу, кастор, кокосовую пальму, кориандр, кукурузу, семена хлопчатника, лещину рогатую, семена конопли, льняное семя, пенник луговой, оливу, пальмовое масло, косточковую пальму, арахис, рапс, рисовые отруби, сафлор, камелию горную, сою, подсолнечник, 1а11, 1киЬак1, множество природных масел с измененными составами жирных кислот благодаря генетически модифицированным организмам (ГМО) или традиционному скрещиванию, таким как масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты или масла с низким насыщением (канола с высоким содержанием олеиновой кислоты, соя с низким содержанием линоленовой кислоты или подсолнечник с высоким содержанием стеариновой кислоты) или смеси указанного выше, с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы переработки масел из животных, например рыбы (талеихтиса, рыбьего жира, хоплостета, сардины, сельди, американ

- 77 020145 ской сельди и тому подобного), млекопитающих (свинины, говядины) и птицы (кур и тому подобного) с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы. В одном аспекте эти синтетические или переработанные масла используют в качестве кормовых добавок, пищевых продуктов, ингредиентов фармацевтических составов, нутрицевтиков или в косметических средствах. Например, в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы используют для гидролиза жирных кислот из рыбных масел с тем, чтобы жирные кислоты можно было собрать и использовать в качестве кормовой добавки. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для обработки масла из отходов ресторанов и топленых жиров животных.

В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы переработки жиров и масел, например из масел водорослей, включая, например, масло №осЬ1опз о1еоаЬипбап8, масло Зсепебезтиз бтогрЬиз, масло Еид1епа дгасШз, масло РЬаеобас!у1ит !псоти!ит, масло Р1еигосЬгуз1з саПегае, масло Ргутпезшт рагуит, масло Те!газе1т1з сЬш, масло Те1газе1т1з зиеаса, масло 1зосЬгуз1з да1Ьапа, масло №ппосЬ1огорз1з займа, масло Во!гуососсиз Ьгаипи, масло ЭипайеНа !егИо1ес!а, масло №ппосЬ1опз зреОез, масло 8р1ги11па зреаез, масло СЬ1огорЬусеазе (зеленая водоросль), масло ВааШагорЬу и смесей любых из указанных жиров и масел.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы являются универсальными биокатализаторами в органическом синтезе, например в структурированном синтезе масел, липидов и тому подобного. Предлагаемые в настоящем описании ферменты (включая гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) могут акцептировать широкий спектр субстратов, включая вторичные и третичные спирты, например, из природного продукта, такого как альфа-терпинеол, линалоол, и тому подобное. В некоторых аспектах предлагаемые в настоящем описании гидролазы обладают от хорошей до превосходной энантиоспецифичностью (например, стереоспецифичностью).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагается процесс превращения масла (например, растительных масел, масла какао и тому подобного), включающий по меньшей мере один предлагаемый в настоящем описании фермент (например, липазу, сатуразу, пальмитазу и/или стеаратазу). В одном аспекте процесс превращения масла представляет собой контролируемый гидролиз и ацилирование, например ацилирование глицерина, которое может обеспечивать высокую чистоту широкого спектра продуктов. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) используют для получения диацилглицеридных масел и структурированных пищевых масел. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются процессы этерификации пропиленгликоля с использованием предлагаемого в настоящем описании фермента, например регио- и/или хемоселективной липазы для монозамещенной этерификации в положении 8п-1. В настоящем описании предлагаются процессы для структурированного синтеза масел с намеченными профилями насыщенных или ненасыщенных жирных кислот с использованием предлагаемого в настоящем описании фермента, например регио- и/или хемоселективной липазы, для удаления насыщенной жирной кислоты и для направленного добавления жирной кислоты к глицериновому остову.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы дополнительно включают процессы для избирательного удаления жирных кислот (например, нежелательных жирных кислот) из масел, например отделением насыщенных и/или ненасыщенных жирных кислот из масел, с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы). Предлагаемый в настоящем описании процесс может отделять насыщенные и/или ненасыщенные жирные кислоты из любого масла, например соевого масла. Фермент может быть хемоселективным и/или энантиоселективным. В одном аспекте эти процессы создают высокостабильные жиры и масла, например здоровые масла для обжарки. Этот предлагаемый в настоящем описании иллюстративный процесс может быть использован для создания масел с меньшим содержанием серы, например, с помощью процесса, включающего удаление серы из сырого масла. Предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть также использованы для процессов переэтерификации для этих и других целей.

В одном аспекте предлагаемый в настоящем описании фермент используют для получения жирного масла не-транс. В одном аспекте масло не-транс получают из частично гидрогенизированного масла с получением только цис-масла. Фермент может быть хемоселективным и/или энантиоселективным.

В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются процессы модификации масел какао с использованием предлагаемого в настоящем описании фермента. Приблизительно 80% масел какао содержат триацилглицериды РОР, 808 и РОЗ (Р представляет собой пальмитиновую жирную кислоту, О представляет собой олеиновую жирную кислоту, 8 представляет собой стеариновую жирную кислоту). Структура насыщенная-ненасыщенная-насыщенная жирная кислота масел какао придает им характерные профили плавления, например, в шоколаде. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании процессы структурированного и направленного синтеза используют для снижения неоднородности масла какао или для получения синтетических масел какао (альтернатив масла какао). В одном аспекте предлагаемую в настоящем описании хемоселективную и/или энантиоселективную (например, региоселективную) гидролазу (например, липазу или эстеразу) используют для получения альтернативы масла какао, например заместителя масла какао, заменителя масла какао и/или эквивалента

- 78 020145 масла какао. В настоящем описании предлагаются альтернативы масла какао, включая заместители масла какао, заменители масла какао, эквиваленты масла какао и промежуточные соединения их производства, включая предлагаемый в настоящем описании фермент. Предлагаемый в настоящем описании процесс (с использованием предлагаемого в настоящем описании фермента) для получения альтернатив масла какао может включать смешивание растительного масла, например пальмового масла, с масляным деревом или эквивалентом, иллипе или эквивалентом и стеринами салового дерева или эквивалентом и обработку смеси масел предлагаемыми в настоящем описании полипептидами. В одном аспекте предлагаемый в настоящем описании процесс включает использование переэтерификации. Предлагаемый в настоящем описании процесс может создавать композиционные или кристаллические формы, которые имитируют природное масло какао.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются процессы (с помощью предлагаемого в настоящем описании фермента) получения диацилглицерина (ИАС), например 1,3диацилглицерина, с использованием растительного масла, например дешевого масла. Фермент может быть хемоселективным и/или энантиоселективным. Предлагаемый в настоящем описании процесс может давать содержащую ЭЛС композицию с хорошей стабильностью, длительным периодом хранения и высокотемпературной рабочей характеристикой.

Предлагаемые в настоящем описании ферменты (гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) и предлагаемые в настоящем описании методы могут быть также использованы в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6025171. В этом иллюстративном методе предлагаемые в настоящем описании ферменты иммобилизуют путем получения эмульсии, содержащей непрерывную гидрофобную фазу, такую как триацилглицеридное масло, и диспергированную водную фазу, содержащую амфифильный фермент, такой как предлагаемая в настоящем описании липаза, и вещество-носитель, которое частично растворено и частично не растворено в водной фазе, и удаления воды из водной фазы до превращения фазы в твердые частицы носителя, покрытые ферментом. Нерастворимой частью вещества-носителя может служить вещество, которое нерастворимо в воде и масле, или водорастворимое вещество в нерастворенной форме из-за того, что водная фаза уже насыщена водорастворимым веществом. Водная фаза может быть образована с использованием сырой жидкости ферментации липазой, содержащей остатки ферментации и биомассу, которые могут служить в качестве веществ-носителей. Иммобилизованная липаза пригодна для перестройки сложного эфира и для деацилирования масел. После взаимодействия иммобилизованный фермент может быть регенерирован для последующего взаимодействия путем добавления воды с обеспечением частичного растворения носителя и выпаривания воды из полученной водной фазы, содержащей фермент и носитель, диспергированной в гидрофобной фазе, с повторным образованием частиц носителя, покрытых ферментом.

Предлагаемые в настоящем описании ферменты (например, липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) и предлагаемые в настоящем описании методы могут быть также использованы для получения переэтерифицированных масел, как описано, например, в патенте США № 5288619. В настоящем описании предлагаются методы ферментативной трансэтерификации для получения маргаринового масла с низким содержанием и транс-кислоты, и промежуточной цепи жирной кислоты. Метод включает стадии создания реакционной смеси трансэтерификации, содержащей вещество-источник стеариновой кислоты и пищевое жидкое растительное масло, вещество-источник переэтерифицируемой стеариновой кислоты и растительное масло, с использованием специфичной в отношении 1-, 3-положений и последующей заключительной гидрогенизацией смеси жирных кислот с получением повторно используемого вещества-источника стеариновой кислоты для повторного взаимодействия с растительным маслом. В настоящем описании предлагается противоточный метод получения трансэтерифицированного масла. Метод включает стадии образования реакционной зоны трансэтерификации, содержащей специфичную в отношении положений 1, 3 липазу, внесения растительного масла в зону трансэтерификации, введения вещества-источника стеариновой кислоты, введения противоточной жидкости для сверхкритического газа или субкритического сжиженного газа, проведения реакции трансэтерификации потока триацилглицерида с потоком стеариновой кислоты или моноэфира стеариновой кислоты в реакционной зоне, удаления потока переэтерифицированного триацилглицеридного маргаринового масла, удаления противоточной жидкой фазы, гидрогенизации переэтерифицированной стеариновой кислоты или моноэфира стеариновой кислоты с получением гидрогенизированного повторно используемого вещества-источника стеариновой кислоты и введения гидрогенизированного повторно используемого вещества-источника стеариновой кислоты в реакционную зону.

В одном аспекте для обеспечения действия предлагаемого в настоящем описании фермента обе фазы, фазу масла и водную фазу, содержащую фермент, следует тщательно смешивать. Простое перемешивание может быть недостаточным. Получению хорошей дисперсии фермента в масле помогает растворение фермента в небольшом количестве воды, например 0,5-5 мас.% (по отношению к маслу) и эмульгирование в масле в этой форме с образованием капелек с диаметром менее 10 мкм (средневзвешенного). Капельки могут быть менее 1 мкм. Турбулентное перемешивание может быть осуществлено при радиальных скоростях более 100 см/с. Масло также может циркулировать в реакторе с помощью внешнего

- 79 020145 роторного насоса. Водная фаза, содержащая фермент, может быть также мелко диспергирована в результате действия ультразвука. Может быть использован аппарат для диспергирования.

В одном аспекте предлагаемая в настоящем описании ферментативная реакция происходит на поверхности раздела между масляной фазой и водной фазой. Целью всех этих мер по смешиванию является создание наибольшей возможной поверхности для водной фазы, которая содержит фермент. Добавление поверхностно-активных веществ увеличивает микродиспергирование водной фазы. Поэтому в некоторых случаях к раствору фермента добавляют поверхностно-активные вещества с величинами НЬВ выше 9, такие как додецилсульфат №, как описано, например, в ЕР-А 0513709. Метод улучшения эмульгирования со сходной эффективностью заключается в добавлении лизолецитина.

Добавленное количество может находиться в диапазоне от 0,001 до 1% по отношению к маслу. Температура во время обработки ферментом не является решающей. Могут быть использованы температуры между 20 и 80°С, но последняя может быть применена лишь в течение короткого промежутка времени. В этом аспекте используют предлагаемую в настоящем описании липазу, обладающую хорошей устойчивостью к температуре и/или низкому рН. Оптимальным является использование температур между 30 и 50°С. Период обработки зависит от температуры и может укорачиваться с ростом температуры. Обычно достаточно от 0 до 10 ч или от 1 до 5 ч. Взаимодействие происходит в реакторе и его можно разделить на стадии. Например, инкубацию можно производить в течение 3 ч при 40°С, затем в течение 1 ч при 60°С. Если взаимодействие производят постадийно, это может также открывать возможность доведения величин рН до различных значений на отдельных стадиях. Например, на первой стадии рН раствора может быть доведен, например, до 7, а на второй стадии до 2,5 добавлением лимонной кислоты или других подходящих кислот. Однако по меньшей мере на одной стадии рН раствора фермента должен быть ниже 4 или ниже 3. Если рН впоследствии снижается ниже этого уровня, может быть обнаружено ухудшение действия. Поэтому к раствору фермента может быть добавлена лимонная кислота до смешивания фермента с маслом.

Предлагаемые в настоящем описании ферменты (гидролазы, например липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы) и предлагаемые в настоящем описании методы могут быть также использованы для получения масел, как описано, например, в патентной заявке США № 11/567318, включенной в полном объеме в качестве ссылки. В настоящем описании предлагаются непрерывные процессы ферментативной обработки липидов. Метод относится к процессу и аппарату для непрерывной ферментативной переэтерификации содержащих липид композиций с использованием множества реакторов с фиксированной основой, где поток содержащей липид композиции через аппарат может оставаться, по существу, постоянным, даже если ферментативная активность фиксированной основы снижается с течением времени и даже когда фиксированную основу изымают из аппарата, например, для ремонта, замены или освежения.

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагается метод гидролиза масла или жира путем взаимодействия масла или жира с ферментом пальмитазой. В одном варианте осуществления гидролиз проводят в присутствии эмульгатора, имеющего НЬВ выше 12. В одном варианте осуществления фермент пальмитаза кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 99,5 или 100% идентичность последовательности δΕΟ ΙΌ NО:1 и содержащей ί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 95 (или его эквивалент), как показано в табл. 9, ίί) изменения нуклеотидов (или их эквивалент), кодирующих аминокислотные остатки в положениях 85 и 172 (или их эквиваленте), как показано в табл. 15, ίίί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 83 (или его эквивалент), как показано в табл. 16, и ίν) следующие молчащие мутации 35ССТ, 1026ΤΤ, 108Α6Τ, 117СТТ, 126Α66, 133ТСТ и 188ΑСС. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность δΕΟ ΙΌ NО:1, содержащую ί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 95 (или его эквивалент), как показано в табл. 9, ίί) изменения нуклеотидов (или их эквивалент), кодирующих аминокислотные остатки в положениях 85 и 172 (или их эквиваленте), как показано в табл. 15, ίίί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 83 (или его эквивалент), как показано в табл. 16, и ίν) следующие молчащие мутации 35ССТ, 1026ΤΤ, 108Α6Τ, 117СТТ, 126Α66, 133ТСТ и 188ΑСС. В одном варианте осуществления фермент пальмитаза представляет собой устойчивую к нагреванию находку 29, как описано в табл. 9, и содержащую ί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 95 (или его эквивалент), как показано в табл. 9, ίί) изменения нуклеотидов (или их эквивалент), кодирующих аминокислотные остатки в положениях 85 и 172 (или их эквиваленте), как показано в табл. 15, ίίί) изменение нуклеотидов (или его эквивалент), кодирующих аминокислотный остаток в положении 83 (или его эквивалент), как показано в табл. 16, и ίν) следующие молчащие мутации 35ССТ, 1026ΤΤ, 108Α6Τ, 117СТТ, 126Α66, 133ТСТ и 188ΑСС. В одном варианте осуществления фермент пальмитаза, используемый в предлагаемых в настоящем описании методах, представляет собой фермент 29 δΜ со следующими молчащими мутациями 35ССТ, 1026ΤΤ, 108Α6Τ, 117СТТ, 126Α66, 133ТСТ и 188ΑСС, как описано в примере 12.

В некоторых вариантах осуществления эмульгатор обладает НЬВ выше 12, 14, 16 или 18. В некото

- 80 020145 рых вариантах осуществления эмульгатор выбран из олеата натрия, олеата калия, линолеата натрия, линолеата калия, линолената натрия, линолената калия, лауреата натрия, лауреата калия, стеарата натрия, стеарата калия, пальмитата натрия, пальмитата калия, пальмолеата натрия, пальмолеата калия или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления реакционная смесь включает приблизительно от 1 до 20% воды по отношению к общей массе реагентов. В одном варианте осуществления реакционная смесь включает приблизительно 1, 3, 5, 7, 10, 15, 17 или 20% воды по отношению к общей массе реагентов.

В некоторых вариантах осуществления масло или жир смешивают с эмульгатором перед добавлением фермента пальмитазы. В некоторых вариантах осуществления смесь масло/жир и эмульгатора гомогенизируют до или после добавления фермента пальмитазы для создания однородной эмульсии.

В некоторых вариантах осуществления реакцию проводят при температуре приблизительно от 20 до 70°С. В некоторых вариантах осуществления реакцию проводят при температуре приблизительно от 20, 30, 40, 50, 60 или 70°С. В некоторых вариантах осуществления предлагаемый в настоящем описании фермент пальмитаза снижает содержание пальмитата в масле/жире до приблизительно 5% или ниже. В некоторых вариантах осуществления предлагаемый в настоящем описании фермент пальмитаза снижает содержание пальмитата в масле/жире до приблизительно 5, 4, 3, 2, 1% или ниже. В некоторых вариантах осуществления желаемое снижение содержания пальмитата происходит приблизительно через 48, 24, 20, 16, 12, 10, 5 или 3 ч или менее. В некоторых вариантах осуществления метод дополнительно включает предварительную обработку масла/жира для удаления камеди и водной фазы для снижения свободных жирных кислот. Могут быть использованы любые методы предварительной обработки, которые представляются пригодными для специалиста в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления метод дополнительно включает добавление основания (добавление каустика) для образования мыла.

В некоторых вариантах осуществления используемое в реакции масло представляет собой рафинированное масло или сырое масло. В одном варианте осуществления реакция дополнительно включает добавление фосфолипида. В реакциях может быть использован любой фосфолипид, который представляется пригодным для специалиста в данной области техники. В одном варианте осуществления фосфолипид представляет собой лецитин. В одном варианте осуществления масло, используемое в предлагаемых в настоящем описании реакциях, является рафинированным маслом, и реакция включает добавление фосфолипида.

Нутрицевтики.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции и методы могут быть использованы для получения нутрицевтиков путем переработки или синтеза липидов и масел с использованием предлагаемых в настоящем описании ферментов, например гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз. В одном аспекте переработанные или синтезированные липиды или масла включают полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), диацилглицериды, например 1,3-диацилглицериды (ΌΑΟ), моноацилглицериды, например 2-моноацилглицериды (МАС) и триацилглицериды (ТАС). В одном аспекте нутрицевтики получают путем процессинга диацилглицеридов, например 1,3диацилглицеридов (ОАС), моноацилглицеридов, например 2-моноацилглицеридов (МАС) и/или триацилглицеридов (ТАС) из растительных (например, масличных семян) источников или из животных (например, рыбьего жира) источников. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются нутрицевтики (например, диетические композиции), включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, ферменты, пептиды, антитела).

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции и методы могут быть использованы для подкрепления диетических композиций, особенно продуктов на основе коровьего молока, например формул для грудных детей на основе коровьего молока, с использованием активированных солями желчных кислот гидролаз. Композиции, полученные предлагаемыми в настоящем описании методами, и предлагаемые в настоящем описании композиции могут быть использованы для кормления новорожденных и недоношенных детей, включая введение активированной солями желчных кислот предлагаемой в настоящем описании гидролазы для усиления переваривания жира и тем самым увеличения скорости роста. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются композиции и методы для лечения индивидуумов с неадекватной продукцией фермента поджелудочной железы путем введения активированной солью желчной кислоты гидролазы вместе с потреблением жиров; см., например, обсуждение ниже.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются диетические композиции, включающие гидролазу, например предлагаемую в настоящем описании гидролазу, активированную солью желчной кислоты. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются диетические композиции, включающие питательную основу, включающую жир, и эффективное количество предлагаемой в настоящем описании гидролазы, активированной солью желчной кислоты. В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются формулы для грудных детей на основе коровьего молока, включающие гидролазу, например предлагаемую в настоящем описании гидролазу, активированную солью желчной кислоты. В одном аспекте предлагаемая в настоящем описании гидролаза активна в гидролизе длинноцепочечных жирных кислот, например от С₁₂ до С₂₂, которые со

- 81 020145 ставляют очень высокий процент большинства видов молока, например 99% молока молочной железы человека; см., например, патент США № 5000975.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются диетические композиции, включающие жир растительного масла и предлагаемую в настоящем описании гидролазу. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы переработки продуктов на основе молока и/или включающих растительное масло композиций для получения диетических композиций. В одном аспекте переработанные композиции включают масло лауриновой кислоты, масло олеиновой кислоты, масло пальмитиновой кислоты и/или масло линолевой кислоты. В одном аспекте жиры и масла, например масличные семена из растений, включая, например, канолу, кастор, кокосовую пальму, кориандр, кукурузу, семена хлопчатника, лещину рогатую, семена конопли, льняное семя, пенник луговой, оливу, пальмовое масло, косточковую пальму, арахис, рапс, рисовые отруби, сафлор, камелию горную, сою, подсолнечник, 1а11, (киЬа.кй множество природных масел с измененными составами жирных кислот благодаря генетически модифицированным организмам (ГМО) или традиционному скрещиванию, такие как масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты или масла с низким насыщением (канола с высоким содержанием олеиновой кислоты, соя с низким содержанием линоленовой кислоты или подсолнечник с высоким содержанием стеариновой кислоты), смеси любых из указанных выше, для использования в нутрицевтиках и диетических композициях перерабатывают или получают с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы; см., например, патент США № 4944944.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты предлагаются в форме, которая стабильна при хранении в составе и/или в желудке, но активна, когда состав достигает части желудочнокишечного тракта, где состав обычно должен быть переварен. Составы (например, микрокапсулы) для высвобождения в кишечнике хорошо известны в данной области техники, например биодеградируемые полимеры, такие как полилактид и полигликолид, как описано, например, в патентах США №№ 4767628; 4897268; 4925673; 5902617.

Кондитерские изделия, масло какао и пищевые продукты.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции и методы могут быть использованы для получения и переработки твердых масел, таких как масло какао. В другом аспекте в настоящем описании предлагаются кондитерские изделия, масло какао и пищевые продукты, включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, ферменты, пептиды, антитела).

Предлагаемые в настоящем описании композиции и методы могут быть использованы для получения альтернатив масла какао с помощью методов структурированного синтеза с использованием предлагаемых в настоящем описании ферментов, например гидролаз, например липаз, сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз. Например, в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы обеспечивают переработку или синтез триацилглицеридов, диацилглицеридов и/или моноацилглицеридов для использования в качестве, например, альтернатив масла какао. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы обеспечивают создание твердого масла с определенной областью пластичности для поддержания достаточной твердости при температуре ниже комнатной. В одном аспекте переработанный или синтезированный липид сконструирован так, что он имеет очень узкую область пластичности, например в одном аспекте он быстро тает при температуре, приблизительно равной температуре тела. Природное масло какао начинает размягчаться при температуре приблизительно от 30 до 32°С и полностью тает при приблизительно 36°С. Природное масло какао может содержать 70 мас.% или более трех 1,3двунасыщенных-2-олеоилглицеринов, которые представляют собой 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерин (Р0Р), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерин (Р081) и 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерин (8ΐ08ΐ). Эти три глицерина проявляют сходный друг с другом паттерн плавления и ответственны за свойства плавления масла какао, проявляющего очень узкую область пластичности. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются синтетические виды масла какао или переработанные виды масла какао (синтезированные или переработанные с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы, все возможные композиции обозначаются как альтернативы масла какао) с различным процентным содержанием 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (Р0Р), 1-пальмитоил-2-олеоил-3стеароилглицерина (Р081) и 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (8ΐ08ΐ) в зависимости от желаемых свойств синтетического масла какао и синтетические виды масла какао с большим или меньшим 70 мас.% содержанием трех 1,3-двунасыщенных-2-олеоилглицеринов. Предлагаемые в настоящем описании синтетические виды масла какао могут частично или полностью вытеснить природные или непереработанные виды масла какао и могут сохранять или улучшать необходимые свойства твердого масла.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются синтетические виды масла какао или переработанные виды масла какао (синтезированные или переработанные с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы) с желаемыми свойствами для использования в кондитерских изделиях, выпечке и фармацевтических продуктах. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются кондитерские изделия, выпечка и фармацевтические продукты и тому подобное, включающие предлагаемую в настоящем описании гидролазу. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются методы получения или переработки липида (жира) из сладостей (например,

- 82 020145 шоколада) или для использования в кондитерских изделиях. В одном аспекте липид получают или перерабатывают так, чтобы шоколад проявлял меньшее прилипание к пальцам по сравнению с шоколадом из природного масла какао при сохранении выраженных свойств плавления во рту. В одном аспекте липид получают или перерабатывают так, чтобы кондитерское изделие (например, шоколад) можно было изготавливать при сравнительно высокой температуре окружающей среды или изготавливать с использованием охлаждающей воды при сравнительно высокой температуре. В одном аспекте липид получают или перерабатывают так, чтобы кондитерское изделие (например, шоколад) можно было хранить при относительно более теплых условиях, например условиях тропиков или субтропиков или в зданиях с центральным отоплением. В одном аспекте липид получают или перерабатывают так, чтобы кондитерское изделие (например, шоколад) имело липидное (жирное) содержимое с твердой композицией и качеством. Предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть использованы для обеспечения заменяющей композиции масла какао, которая может значительно улучшать его термостабильность и замещать его в широком диапазоне применений.

Получение маргарина и жира для теста.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются синтетические или переработанные жиры, например маргарин и жир для теста, синтезированные или переработанные с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы. В других вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются синтетические или переработанные жиры, например маргарин и жир для теста, включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, ферменты, пептиды, антитела).

В одном варианте осуществления в настоящем описании предлагаются переработанные жиры, включающие растительное масло, такое как канола, кастор, кокосовая пальма, кориандр, кукуруза, семена хлопчатника, лещина рогатая, семена конопли, льняное семя, пенник луговой, олива, пальмовое масло, косточковая пальма, арахис, рапс, рисовые отруби, сафлор, камелия горная, кунжут, соя, подсолнечник, 1а11, ЬнЬакг множество природных масел с измененными составами жирных кислот благодаря генетически модифицированным организмам (ГМО) или традиционному скрещиванию, такие как масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты или масла с низким насыщением (канола с высоким содержанием олеиновой кислоты, соя с низким содержанием линоленовой кислоты или подсолнечник с высоким содержанием стеариновой кислоты), синтезированные или переработанные с использованием предлагаемой в настоящем описании гидролазы. Синтетические или переработанные жиры, например маргарин и жир для теста, конструируют так, чтобы они обладали желаемой пластичностью. Многие из пластичных жирных продуктов, такие как маргарин и жир для теста, получают из твердого сырья и жидких масел в качестве сырых материалов. Например, жидкие масла, такие как канола, кастор, кокосовая пальма, кориандр, кукуруза, семена хлопчатника, лещина рогатая, семена конопли, льняное семя, пенник луговой, олива, пальмовое масло, косточковая пальма, арахис, рапс, рисовые отруби, сафлор, камелия горная, кунжут, соя, подсолнечник, 1а11, ЬнЬакг множество природных масел с измененными составами жирных кислот благодаря генетически модифицированным организмам (ГМО) или традиционному скрещиванию, такие как масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты или масла с низким насыщением (канола с высоким содержанием олеиновой кислоты, соя с низким содержанием линоленовой кислоты или подсолнечник с высоким содержанием стеариновой кислоты), смешивают с их отвержденными маслами (твердым сырьем) и смесь доводят до соответствующей консистенции (пластичности). Пластичные жирные продукты, такие как маргарин и жир для теста, полученные таким образом, склонны к образованию относительно крупных кристаллов из-за того, что жиры и масла, используемые в качестве сырья, состоят из жирных кислот, имеющих почти одинаковую длину углеродной цепи. Другими словами, они содержат высокоунифицированную композицию жирных кислот. По этой причине пластичность этих продуктов может поддерживаться на соответствующем уровне только в пределах узкого диапазона температур, так что содержащиеся в них жидкие масла склонны к выпотеванию. В настоящем описании предлагаются методы получения или переработки жиров, созданных таким образом, что они содержат переменный (и определенный) состав жирных кислот. Полученное масло, например маргарин или жир для теста, может иметь более широкий диапазон пластичности.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы и композиции используют для получения или переработки растительных масел, таких как канола, кастор, кокосовая пальма, кориандр, кукуруза, семена хлопчатника, лещина рогатая, семена конопли, льняное семя, пенник луговой, олива, пальмовое масло, косточковая пальма, арахис, рапс, рисовые отруби, сафлор, камелия горная, кунжут, соя, подсолнечник, 1а11, 18иЬак1, множество природных масел с измененными составами жирных кислот благодаря генетически модифицированным организмам (ГМО) или традиционному скрещиванию, такие как масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, низким содержанием линоленовой кислоты или масла с низким насыщением (канола с высоким содержанием олеиновой кислоты, соя с низким содержанием линоленовой кислоты или подсолнечник с высоким содержанием стеариновой кислоты), с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз, включая переэтерификацию и ферментативную трансэтерификацию, см., например, патент США № 5288619 патентную заявку США с порядковым №

- 83 020145

11/567з18. Предлагаемые в настоящем описании методы и композиции могут быть использованы вместо случайной переэтерификации, как описано, например, в патенте США № з949105. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы и композиции могут быть использованы при ферментативной трансэтерификации для получения масла, например маргаринового масла, с низким содержанием и транс-кислоты, и жирной кислоты с промежуточной цепью.

В одном аспекте симметричную структуру масла, например масел типа пальмового или лауринового, модифицируют, например, в случайную структуру. Таким образом, предлагаемые в настоящем описании методы могут быть использованы для модификации свойств пластичности жирных продуктов. В одном аспекте модификация масел предлагаемыми в настоящем описании методами может быть разработана для предотвращения или замедления постепенного затвердения масла со временем, в особенности при хранении продуктов.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы и композиции используются в реакционной смеси трансэтерификации, включающей вещество-источник стеариновой кислоты и пищевое жидкое растительное масло, с трансэтерификацией вещества-источника стеариновой кислоты и растительного масла с использованием предлагаемой в настоящем описании липазы, специфичной в отношении 1-, з-положений, с последующей гидрогенизацией смеси жирных кислот с получением повторно используемого вещества-источника стеариновой кислоты для повторного взаимодействия с растительным маслом; см., например, патент США № 5288619.

В одном аспекте реакцию переэтерификации проводят с предлагаемой в настоящем описании липазой. В одном аспекте предлагаемая в настоящем описании липаза обладает избирательностью в отношении 1- и з-положений триацилглицерида для замедления или ингибирования повышения количества тринасыщенных триацилглицеридов в масле. В этой предлагаемой в настоящем описании реакции недостатки традиционной переэтерификации и затруднения переэтерификации при использовании неспецифической липазы могут быть преодолены, поскольку переэтерификацию проводят с помощью предлагаемого в настоящем описании фермента, обладающего избирательностью в отношении 1- и зположений триацилглицеридов. В одном аспекте выпотевание жидких масел, содержащихся в продуктах, замедляется или предотвращается при повышении температуры реакции для ингибирования роста точки плавления, вызываемого повышением количества тринасыщенных триацилглицеридов. Это относится к проблеме затвердения продуктов во время длительного хранения.

Фармацевтические композиции и лечение недостаточности гидролазы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы и композиции (предлагаемые в настоящем описании ферменты, например предлагаемые в настоящем описании эстеразы, ацилазы, липазы, фосфолипазы или протеазы), которые могут быть использованы в лечении недостаточности гидролазы у животного, например млекопитающего, такого как человек. Например, в одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы и композиции используют для лечения больных, страдающих недостаточностью панкреатической липазы. В одном аспекте липазу вводят перорально. Предлагаемый в настоящем описании фермент может доставляться вместо препарата или вместе с препаратом фермента поджелудочной железы свиньи.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются фармацевтические композиции, включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, ферменты, пептиды, антитела). Эти фармацевтические композиции могут находиться в форме таблеток, пилюль, гелей, капсул, гидрогелей, спреев, порошков, аэрозолей, имплантов, липосом, кремов, мазей, жидкостей, микросфер, частиц на основе множества частиц, эмульсии, суспензии, наноструктур и тому подобного. Фармацевтические композиции, включающие предлагаемые в настоящем описании полипептиды (например, ферменты, пептиды, антитела), можно вводить в любой форме, например перорально, внутрикожно, внутрибрюшинно, в/в, местно и тому подобное. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании фармацевтические композиции составлены для местной, подъязычной, пероральной, внутривенной, подкожной, внутримышечной, чрескожной, внутриартериальной, внутрисуставной или внутрикожной доставки.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции, используемые для такого лечения, активны в кислых условиях. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции вводят перорально в составах (например, таблетках, пилюлях, гелях, капсулах, гидрогелях, спреях, порошках, аэрозолях), которые проходят через кислые области желудка и высвобождают фермент только в относительно щелочной среде тощей кишки. В одном аспекте предлагаемая в настоящем описании гидролаза составлена с носителем, таким как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, производные целлюлозы или желатин или любым другим таким наполнителем. Может быть также добавлен смазывающий агент, такой как стеарат магния, стеарат кальция или полиэтиленгликолевый воск. В качестве покрытия может быть добавлен концентрированный раствор сахара, который может содержать добавки, такие как тальк, диоксид титана, желатин или аравийская камедь. Для инкапсулирования гидролазы в виде жидкого или твердого препарата могут быть использованы мягкие или твердые капсулы; см., например, патент США № 5691181; 5858755.

Детергенты.

- 84 020145

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы и композиции (ферменты, например, предлагаемые в настоящем описании липазы, сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы), которые могут быть использованы при получении и использовании детергентов. Предлагаемая в настоящем описании гидролаза может быть добавлена, например, путем смешивания к любой известной композиции детергента, твердой или жидкой, с изменением или без изменения состава композиции детергента. Например, предлагаемая в настоящем описании гидролаза может быть добавлена к любому мылу, например алифатическим сульфатам, таким как алкильным или алкенильным сульфатам с прямой или разветвленной цепью, амидным сульфатам, простым эфирам алкильных или алкенильных сульфатов с прямой или разветвленной цепью, к алкильной или алкенильной группе которых добавлено одно или более из этиленоксида, пропиленоксида и бутиленоксида, алифатическим сульфонатам, таким как алкилсульфонаты, амидные сульфонаты, диалкильные сульфосукцинаты, сульфонаты альфа-олефинов, олефинов винилиденового типа и внутренних олефинов, ароматическим сульфонатам, таким как алкилбензолсульфонаты с прямой или разветвленной цепью, простым эфирам алкильных или алкенильных карбонатов или амидов с прямой или разветвленной цепью, к алкильной или алкенильной группе которых добавлено одно или более из этиленоксида, пропиленоксида и бутиленоксида, или амидов, солей или сложных эфиров альфа-сульфо-жирных кислот, поверхностно-активных веществ аминокислотного типа, поверхностно-активных веществ фосфатного типа, таких как алкильные или алкенильные кислые фосфаты и алкильные или алкенильные фосфаты, амфотерных поверхностно-активных веществ типа сульфокислоты, амфотерных поверхностно-активных веществ типа бетаина, алкильных или алкенильных простых эфиров или спиртов с прямой или разветвленной цепью, к алкильной или алкенильной группе которых добавлено одно или более из этиленоксида, пропиленоксида и бутиленоксида, простых эфиров полиоксиэтиленалкилфенила с прямой или разветвленной цепью, к алкильной группе которых добавлено одно или более из этиленоксида, пропиленоксида и бутиленоксида, алканоламидов высших жирных кислот или их алкиленоксидных аддуктов, сложных эфиров жирных кислот и сахарозы, сложных моноэфиров жирных кислот и глицерина, алкил- или алкениламиноксидов, катионных поверхностно-активных веществ типа соли тетраалкиламмония или их сочетания; см., например, патент США № 5827718.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются композиции детергентов, включающие один или более предлагаемых в настоящем описании полипептидов (гидролаз). Могут быть использованы поверхностно-активные и поверхностно-неактивные формы. В одном аспекте общее количество гидролазы, поверхностно-активной и поверхностно-неактивной, может составлять от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1,0% или от приблизительно 0,0002 до приблизительно 0,5% по массе от композиции детергента. В одном аспекте в композиции детергента поверхностно-активная гидролаза составляет от приблизительно 5 до приблизительно 67%, а поверхностно-неактивная гидролаза составляет от приблизительно 33 до приблизительно 95% от суммарной гидролазной активности в ферментативной смеси. В одном аспекте оптимум рН суммарной ферментативной смеси находится между приблизительно 5 и приблизительно 10,5.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании композиции детергентов включают предлагаемые в настоящем описании щелочные гидролазы, которые действуют при щелочных значениях рН, поскольку рН промывающего раствора может находиться в щелочной области рН при обычных условиях промывки; см., например, патент США № 5454971.

Предлагаемые в настоящем описании полипептиды (предлагаемые в настоящем описании ферменты) могут быть использованы в любой композиции детергентов, которые хорошо известны в данной области техники, см., например, патент США № 5069810; 6322595; 6313081. Например, в одном аспекте предлагается композиция детергента для стирки. Она может включать от 0,8 до 80 м.д. предлагаемой в настоящем описании липазы.

Может быть использован любой метод получения и использования композиций детергента с предлагаемыми в настоящем описании ферментами, см., например, патент США № 6413928; 6399561; 6365561; 6380147. Композиции детергента могут быть водной композицией из одной и двух частей, неводной жидкой композицией, твердым образцом, гранулированной формой, спрессованной таблеткой, формой геля, порошком, гидрогелем, липосомой, аэрозолем, пастой и/или формой гидросмеси. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть также использованы в качестве аддукта детергента в твердой или жидкой форме. Такие аддукты предназначены для дополнения или поддержания рабочих характеристик традиционных композиций детергента и могут быть добавлены на любой стадии процесса стирки.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы, обеспечивающие удаление больших загрязнений пищей, пленок из остатков пищи и других минорных пищевых композиций с использованием этих композиций детергента. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут облегчать удаление пятен путем каталитического гидролиза липидов, жиров или масел. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы в детергентах для мытья посуды и в детергентах для стирки текстиля.

Действительное содержание активного фермента зависит от метода производства композиции детергента и не является решающим при допущении, что композиция детергента обладает желаемой фер

- 85 020145 ментативной активностью. В одном аспекте количество гидролаз, находящееся в конечной композиции, варьирует от приблизительно 0,001 до 0,5 мг на 1 г композиции детергента. Конкретный фермент, выбранный для использования в процессе, и предлагаемые в настоящем описании продукты зависят от условий оказания конечной услуги, включая физическую форму продукта, используемый рН, используемую температуру и типы загрязнений, подлежащих разрушению или изменению. Фермент может быть выбран для обеспечения оптимальной активности и стабильности для любого заданного набора условий оказания услуги. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы активны в диапазоне рН от приблизительно 4 до приблизительно 12 и в температурном диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 95°С. Предлагаемые в настоящем описании детергенты могут включать катионные, полуполярные неионные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества либо их смеси.

В одном варианте осуществления предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть составлены в порошковые и жидкие детергенты с рН между 4,0 и 12,0 на уровне от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мас.% (альтернативно от 0,1 до 0,5 мас.%). Эти композиции детергента могут также включать другие ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, эндо-бета-1,4глюканазы, бета-глюканазы, эндо-бета-1,3(4)-глюканазы, кутиназы, пероксидазы, лакказы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллюланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилоглюканазы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, пектинметилэстеразы, целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы. Эти композиции детергента могут также включать связующие агенты и стабилизаторы.

Добавление предлагаемых в настоящем описании гидролаз к традиционным моющим композициям не создает какого-либо специального ограничения на использование. Другими словами, любые температура и рН, пригодные для детергента, также пригодны и для предлагаемых в настоящем описании композиций до тех пор, пока фермент активен или устойчив при предназначенных для использования рН и/или температуре. Кроме того, предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы в моющей композиции без детергентов, вновь либо отдельно, либо в сочетании со связующими агентами и стабилизаторами.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются моющие композиции, включая композиции детергента, для очистки твердых поверхностей, композиции детергента для стирки тканей, композиции для мытья посуды, композиции для очистки рта, композиции для чистки зубов и растворы для очистки контактных линз.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы мытья предмета, включающие контактирование предмета с предлагаемым в настоящем описании полипептидом в условиях, достаточных для мытья. Предлагаемая в настоящем описании гидролаза может быть включена в качестве моющей присадки. Предлагаемая в настоящем описании композиция детергента может быть составлена, например, в виде композиции детергента для ручной или машинной стирки, включающей предлагаемый в настоящем описании полипептид. Присадка для стирки, пригодная для предварительной обработки загрязненных тканей, может включать предлагаемый в настоящем описании полипептид. Композиция умягчителя ткани может включать предлагаемую в настоящем описании гидролазу. Альтернативно, предлагаемая в настоящем описании гидролаза может быть составлена в виде композиции детергента для использования в обычных операциях по очистке твердой поверхности в доме. В альтернативных аспектах предлагаемые в настоящем описании моющие присадки и композиции детергента могут включать один или более других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, другая протеаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например лактаза, и/или пероксидаза (см. также выше). Свойства предлагаемого в настоящем описании фермента (ферментов) выбраны таким образом, чтобы обеспечить совместимость с выбранным детергентом (т.е. оптимум рН, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т.д.) и чтобы фермент (ферменты) находился в эффективном количестве. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты используют для удаления зловонных веществ из тканей. Различные композиции детергентов и методы их получения, которые могут быть использованы, описаны, например, в патентах США №№ 6333301; 6329333; 6326341; 6297038; 6309871; 6204232; 6197070; 5856164.

При составлении в виде композиций, пригодных для использования в методах стирки в стиральной машине, предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут включать и поверхностно-активное вещество, и связующее соединение. Они могут дополнительно включать один или более моющих компонентов, например органические полимерные соединения, отбеливающие агенты, дополнительные ферменты, гасители пены, диспергирующие агенты, агенты, диспергирующие кальциевое мыло, агенты, суспендирующие грязь и подавляющие повторное отложение, и ингибиторы коррозии. Предлагаемые в настоящем описании композиции для стирки могут также содержать смягчающие агенты в качестве дополнительных моющих компонентов. Композиции, содержащие предлагаемые в настоящем описании гидролазы, могут обеспечивать очистку ткани, удаление пятен, поддержание белизны, смягчение, сохранение цвета, подавление перенесения краски и санитарную обработку при составлении в виде моющих композиций для стирки.

- 86 020145

Плотность предлагаемых в настоящем описании моющих композиций для стирки может варьировать приблизительно от 200 до 1500 г/л, или приблизительно от 400 до 1200 г/л, или приблизительно от 500 до 950 г/л, или приблизительно от 600 до 800 г/л композиции; она может быть измерена при температуре, равной приблизительно 20°С.

Компактная форма предлагаемых в настоящем описании моющих композиций для стирки лучше всего отражена в плотности и в терминах композиции в количестве неорганической соли-наполнителе. Неорганические соли-наполнители представляют собой традиционные ингредиенты моющих композиций в форме порошка. В традиционных моющих композициях соли-наполнители находятся в существенных количествах, обычно от 17 до 35 мас.% от всей композиции. В одном аспекте компактных композиций соль-наполнитель находится в количестве, не превышающем 15% от всей композиции, или не превышающем 10%, или не превышающем 5% от массы композиции. Неорганические соли-наполнители могут быть выбраны из сульфатных и хлоридных солей щелочных и щелочно-земельных металлов, например сульфата натрия.

Предлагаемые в настоящем описании жидкие моющие композиции могут также находиться в концентрированной форме. В одном аспекте жидкие моющие композиции могут содержать меньшее количество воды по сравнению с традиционными жидкими моющими средствами. В альтернативных аспектах содержание воды в концентрированном жидком моющем средстве составляет менее 40, менее 30 или менее 20% от массы композиции моющего средства. Предлагаемые в настоящем описании соединения моющих средств могут включать составы, описанные в \УО 97/01629.

Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть пригодны при составлении различных моющих композиций. Ряд известных соединений является подходящими поверхностно-активными веществами, включая неионные, анионные, катионные или цвиттерионные детергенты, например, как раскрыто в патентах США №№ 4404128; 4261868; 5204015. Кроме того, предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть использованы, например, в применении к кусковому или жидкому мылу, составам по уходу за посудой, растворам для промывки контактных линз или продуктам, гидролизу пептидов, обработке отходов, текстильном применении, ферментам соединения-расщепления при получении белка и тому подобному. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут обеспечивать улучшенные рабочие характеристики моющей композиции по сравнению с другой протеазой моющего средства, в результате чего группа ферментов может повышать очистку некоторых чувствительных к ферменту пятен, таких как трава или кровь, как определяется с помощью обычной оценки после стандартного цикла стирки. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть составлены в известные порошковые и жидкие моющие средства, имеющие рН между 6,5 и 12,0, на уровне от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мас.% (например, приблизительно от 0,1 до 0,5 мас.%). Эти детергентные моющие композиции могут также включать другие ферменты, такие как другие известные эстеразы, фосфолипазы, протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также связующие агенты и стабилизаторы.

Обработка и переработка пищевых продуктов.

Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для разделения компонентов материала из растительных клеток. Например, предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для разделения обогащенного белком материала (например, растительных клеток) на компоненты, например сахарозы из сахарной свеклы или крахмала или сахаров из картофеля, фракций мякоти или кожуры. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для разделения обогащенных белком или обогащенных маслом зерновых на ценный белок и масло и фракции кожуры. Процесс разделения может быть осуществлен с использованием методов, известных в данной области техники.

Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы при получении фруктовых или овощных соков, сиропов, экстрактов и тому подобного для повышения выхода. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы при ферментативной обработке (например, гидролизе белков) различных материалов из стенок растительных клеток или отходов, например, производства вина или сока, или сельскохозяйственных остатков, таких как кожура овощей, кожура бобов, стружка сахарной свеклы, мякоть оливы, мякоть картофеля и тому подобное. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для изменения консистенции вида перерабатываемых фруктов или овощей. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для обработки растительного материала для облегчения переработки растительного материала, включая пищевые продукты, облегчения очистки или экстракции растительных компонентов. Предлагаемые в настоящем описании гидролазы могут быть использованы для улучшения ценности кормов, снижения способности связывать воду, улучшения разрушаемости в растениях сточных вод и/или улучшения превращения растительного материала в силос и тому подобного.

Корма для животных и пищевые или кормовые добавки.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются методы обработки кормов для животных и пищевых продуктов и пищевые или кормовые добавки с использованием предлагаемых в настоящем описании гидролаз, причем животные включают млекопитающих (например, человека), птиц, рыб и тому подобное. В других вариантах осуществления в настоящем описании предла

- 87 020145 гаются корма для животных, пищевые продукты, кормовые и пищевые присадки и добавки, включающие предлагаемые в настоящем описании гидролазы.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гидролазы для использования в модификации кормов для животных или пищевых продуктов, например для переработки пищи или корма 1п νίΙΐΌ (путем модификации компонентов корма или пищи) или 1п у1уо. В другом аспекте предлагаемая в настоящем описании гидролаза может быть предоставлена путем экспрессии ферментов непосредственно в трансгенных кормовых культурах зерновых (например, в трансгенных растениях, семенах и тому подобном), таких как кукуруза, соя, рапс, люпин и тому подобное. В одном аспекте в настоящем описании предлагаются трансгенные растения, части растений или клетки растений, включающие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую предлагаемый в настоящем описании полипептид. В одном аспекте нуклеиновая кислота экспрессируется таким образом, что предлагаемая в настоящем описании гидролаза продуцируется в извлекаемом количестве. Гидролаза может быть извлечена из любого растения или части растения. Альтернативно, растение или часть растения, содержащее рекомбинантный полипептид, может быть использовано как таковое для улучшения качества пищи или корма, например, путем улучшения питательной ценности, вкуса и реологических свойств или для разрушения противопищевого фактора.

Переэтерификация.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании методы и композиции могут быть использованы для модификации свойств смесей триацилглицеридов и в одном аспекте их консистенции. В одном аспекте предлагаемый в настоящем описании фермент может быть использован в присутствии катализатора, такого как металлический натрий или метоксид натрия, для стимуляции перемещения ацила между молекулами глицерида, в результате чего продукты состоят из смесей глицеридов, в которых остатки жирной кислоты случайным образом распределены между молекулами глицеридов.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть использованы для получения продуктов переэтерификации в условиях взаимодействия, при которых гидролиз жира сведен к минимуму, так что катализируемая липазой переэтерефикация становится преобладающей реакцией. Эти условия могут включать, например, ограничение количества воды в системе.

В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании ферменты могут быть использованы для катализа реакций переэтерификации с использованием смесей триацилглицеридов и свободных жирных кислот, как описано, например, в ЕР 0093602 В2. В этих случаях свободная жирная кислота может обмениваться с ацильными группами триацилглицеридов с получением новых триацилглицеридов, обогащенных добавленной жирной кислотой. В одном аспекте предлагаемые в настоящем описании 1,3специфичные липазы могут быть использованы для ограничения реакции положениями 1 и 3 глицеридов, что позволяет получать смесь триацилглицеридов, которые не могут быть получены путем химической переэтерификации или реакции с неспецифической липазой. В одном аспекте неспецифические липазы используют для достижения результатов, сходных с химической переэтерификацией.

Способность получать новые смеси триацилглицеридов с помощью специфичных в отношении положения предлагаемых в настоящем описании липаз полезна для производства масел и жиров, поскольку некоторые из этих смесей обладают ценными свойствами. Одним примером является катализируемая 1,3-специфической липазой переэтерификация 1,3-дипальмитоил-2-моноолеина (Р0Р), который является основным триацилглицеридом средней фракции пальмового масла, либо со стеариновой кислотой, либо с тристеарином, с получением продуктов, обогащенных ценным 1-пальмитоил-3-стеароил-2моноолеином (Р08!) и 1,3-дистеароил-2-моноолеином (8ΐ08ΐ). Р08! и 8ΐ08ΐ являются важными компонентами масла какао. Таким образом, в одном предлагаемом в настоящем описании аспекте предлагается реакция переэтерификации для получения эквивалентов масла какао из дешевых исходных материалов.

В одном аспекте в настоящем описании предлагаются методы получения заменителя твердого жира с использованием предлагаемых в настоящем описании 1,3-специфических липаз. В одном аспекте заменитель твердого жира включает смесь средней фракции пальмы и 8ΐ08ΐ, Р08! или 8ΐ08ΐ/₽08ΐ с чистотой по меньшей мере 85%.

Изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие примеры; следует, однако, понимать, что изобретение не ограничено такими примерами.

Примеры

Пример 1. Иллюстративные тесты липазы-сатуразы.

В следующем примере описаны иллюстративные тесты для скрининга гидролазной, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной активности. В одном аспекте эти иллюстративные тесты могут быть использованы в качестве рутинных фильтров для определения того, входит ли полипептид в предлагаемый в настоящем описании объем. Такие тесты включают использование соединенийиндикаторов рН для выявления отщепления жирных кислот от триацилглицеридов, спектрофотометрических методов, ВЭЖХ, ГХ, МС, ТСХ и других. 1аедег (1994) ЕЕМ8 М1сгоЬю1. Кеу. 15:29-63; Абег (1997) МеФобк Епхуток 286:351-386; Уогбегтеи1Ьеске (1992) Епхуте М1сгоЬ. Тес1по1. 14:631-639; Кепагб (1987) Ыр1бк 22: 539-541.

Скрининг на липазную/эстеразную активность.

- 88 020145

Колонии собирают стерильными зубочистками и используют для одиночной инокуляции каждой из лунок 96-луночных планшет для микротитрования. Лунки содержали 50 мкл среды ЬВ с 100 мкг/мл ампициллина, 80 мкг/мл метициллина и 10% об./об. глицерина (ЬВ Λтр/Меΐк, глицерин). Клетки выращивали в течение ночи при 37°С без встряхивания. Таким образом, каждая лунка содержала запасную культуру клеток Е. сок, каждая из которых содержала рВЬЬЕЗСШРТ™ с уникальной вставкой ДНК.

Для размножения инокулята одного планшета (конденсированного планшета) использовали 96луночные планшеты, содержащие в каждой лунке 200 мкл ЬВ Αтр/Меΐк, глицерин. Эту стадию проводили с использованием Н1д1 Оепкйу Керксакпд Тоо1 (НОЕТ) ВЮМЕК™ (Весктап Соикет, Шс., Еи11ег1оп, СЛ) с 1% отбеливателем, водой, изопропанолом, циклом воздушно-сухой стерилизации при каждой инокуляции. Каждая лунка конденсированного планшета, таким образом, содержала от 10 до 12 разных клонов рВЬиЕ8СК1РТ™ из каждого из исходных планшет библиотеки. Конденсированный планшет выращивали в течение 16 ч при 37°С и затем использовали для инокуляции двух белых 96-луночных дочерних планшетов для микротитрования (Ро1уП11гоп1ск, Шс., Коск1апб МЛ), содержащих в каждой лунке 250 мкл ЬВ Лтр/Меΐк (без глицерина). Исходный конденсированный планшет помещали на хранение при 80°С. Два конденсированных дочерних планшета инкубировали при 37°С в течение 18 ч.

Исходный раствор 600 мкМ субстрата для эстеразы коротких цепей получали следующим образом: 25 мг каждого из следующих соединений растворяли в соответствующем объеме ДМСО с получением 25,2 мМ раствора. Использованными соединениями были 4-метилумбеллиферила проприоноат, 4метилумбеллиферила бутират и 4-метилумбеллиферила гептаноат. 250 мкл каждого раствора в ДМСО добавляли к приблизительно 9 мл 50 мМ, рН 7,5 буфера НЕРЕ8, содержащего 0,6% тритона Х-100 и 0,6 мл на 1 мл додецилмальтозида (Απаΐ^асе, Маитее, ОН). Объем доводили до 10,5 мл указанным выше буфером НЕРЕ8 с получением слегка мутной суспензии.

Исходный раствор 600 мкМ субстрата с длинными цепями получали следующим образом: 25 мг каждого из следующих соединений растворяли в ДМСО до 25,2 мМ, как указано выше. Использованными соединениями были 4-метилумбеллиферила элаидат, 4-метилумбеллиферила пальмитат, 4метилумбеллиферила олеат и 4-метилумбеллиферила стеарат. Для всех требовалось краткое нагревание на бане 70°С для достижения растворения. 250 мкл каждого раствора в ДМСО добавляли к буферу НЕРЕ8 и разбавляли до 10,5 мл, как указано выше. Все семь производных умбеллиферила были получены от 81дта Скет^са1 Со. (8ΐ. Ьошк, М0).

мкл исходного раствора 600 мкМ субстрата для эстеразы длинных цепей или эстеразы коротких цепей добавляли в каждую лунку белого конденсированного планшета с помощью ВЮМЕК™ с получением конечной концентрации субстрата приблизительно 100 мкМ. Величины флуоресценции записывали (возбуждение=326 нм, испускание=450 нм) на флуорометре для считывания планшет сразу после добавления субстрата. Планшет инкубировали при 70°С в течение 60 мин в случае субстратов с длинной цепью и 30 мин при комнатной температуре в случае субстратов с короткой цепью. Вновь записывали величины флуоресценции. Сравнивали исходную и конечную величины флуоресценции для определения присутствия активного клона.

Для выделения индивидуального клона, который несет активность, планшеты 8оигсе СепВапк размораживали и индивидуальные лунки использовали для одиночной инокуляции нового планшета, содержащего ЬВ Лтр/Меΐк. Как указано выше, планшеты инкубировали при 37°С для выращивания клеток, добавляли 50 мкл 600 мкМ исходный раствор субстрата с помощью ВЮМЕК™ и определяли флуоресценцию. После идентификации активной лунки из планшета-источника клетки из этой активной лунки наносили штрихами на агар с ЬВ Лтр/Меΐк и выращивали в течение ночи при 37°С с получением одиночных колоний. Восемь одиночных колоний были собраны с помощью стерильной зубочистки и использованы для одиночной инокуляции лунок 96-луночного планшета для микротитрования. Лунки содержали 250 мкл ЬВ Лтр/Меΐк. Клетки выращивали в течение ночи при 37°С без встряхивания. Из каждой лунки отбирали аликвоту 200 мкл и тестировали с помощью соответствующих субстратов с длинной или короткой цепью, как указано выше. Был идентифицирован наиболее активный клон, и оставшиеся 50 мкл культуры использовали для нанесения штрихами на чашку агара с ЬВ Лтр/Меΐк. Были собраны, выращены и протестированы, как описано выше, восемь одиночных колоний. Наиболее активный клон был использован для инокуляции 3 мл культур ЬВ Лтр/Меΐк, которые выращивали в течение ночи. Из культур выделяли плазмидную ДНК и использовали для секвенирования.

Пример 2. Иллюстративные протоколы определения с помощью ЖХМС профиля высвобожденных жирных кислот в результате ферментативного гидролиза растительного масла.

В следующем примере описаны иллюстративные методы (протоколы) проведения ферментативного гидролиза растительного масла, такого как масло сои (используемого в этом примере), (включая получение фермента) с использованием, например, предлагаемых в настоящем описании ферментов. В этом примере также описаны иллюстративные методы (протоколы) выявления и количественного определения жирных кислот, высвобожденных из масла. Описывается метод с использованием липазы 8ЕО ΙΌ N0:2, но он применим к другим ферментам, включая предлагаемые в настоящем описании ферменты, например иллюстративные ферменты, имеющие последовательности, показанные в 8ЕО ΙΌ N0:2 и со

- 89 020145 держащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций или все модификации аминокислотных остатков, описанных в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23.

Экспрессия белка в глубоком 96-луночном планшете.

1. Вырастить липазные клоны Е. сой в течение ночи при 30°С в 1 мл среды ТВ, содержащей карбенициллин (100 мкг/мл) в глубоких 96-луночных планшетах с записью расположения и идентичности клонов.

2. Инокулировать свежие глубокие 96-луночные планшеты, содержащие среду ТВ (1 мл; 100 мкг/мл карбенициллин) жидкими культурами (10 мкл/лунку).

3. Инкубировать культуру в течение ночи при 30°С со встряхиванием при 200 об/мин.

4. Индуцировать экспрессию белка переносом 500 мкл каждой ночной культуры в свежий 96луночный планшет, содержащий среду ТВ (50 мкл/лунку; 100 мкг/мл карбенициллин) и безводный тетрациклин (200 нг/мл).

5. Инкубировать при 30°С в течение 2 ч со встряхиванием при 200 об/мин.

6. Собрать клетки центрифугированием каждого планшета в течение 10 мин при 3000хд. Удалить супернатант. Осадки клеток могут быть использованы немедленно для тестов с маслом или могут храниться при -20°С для последующего использования.

Реакция ферментативного гидролиза масла.

1. Добавить 100 мкл В-РЕВ™ (Иегсе Сйет1са1, Воск&тй, 1Ь) к каждому осадку клеток. Если осадки хранятся при -20°С, дать им разморозиться в течение 10 мин при комнатной температуре перед добавлением В-РЕВ™.

2. Добавить 400 мкл соевого масла в каждую лунку глубокого 96-луночного планшета.

3. Добавить несколько шариков (стекло 710-1180 мкм) на лунку. Запечатать планшеты САРМАТ8™ (^йа!тап, Б1огйат Рагк, N1).

4. Клетки лизируются и образуется эмульсия масло/фермент/буфер с помощью смесительной мельницы (Ве!ксй 1пс., №\\1о\уп, РА). Поместить пару запечатанных планшет в смесительную мельницу и встряхивать в течение 30 с при частоте 30 циклов/с.

5. Заменить слой СЛРМЛТ8™ газопроницаемым слоем.

6. Инкубировать планшеты в течение 2 ч при 37°С со встряхиванием при 200 об/мин.

Экстракция жирных кислот.

1. Добавить 1 мл растворителя для экстракции (СНС1₃:МеОН:4н. НС1 (2:1:0,075)) в каждую лунку глубокого 96-луночного планшета.

2. Пипетировать смесь вверх и вниз несколько раз до гомогенного вида.

3. Накрыть планшеты слоем алюминиевой фольги.

4. Центрифугировать в течение 5 мин при 3000хд. Разрезать фольгу с помощью бритвенного лезвия.

5. Пройти кончиком пипетки через верхнюю фазу и перенести 5 мкл нижней фазы в новый глубокий 96-луночный планшет, содержащий 995 мкл/лунку МеОН (т.е. разбавление нижней фазы 1/200). Следует быть осторожным, чтобы не загрязнить верхней фазой. Хранить отделенные экстракционные смеси при 4°С.

6. Перенести 150 мкл разбавления 1/200 всех образцов в полистироловый 96-луночный планшет.

7. Для предотвращения упаривания запаять планшеты. Убедитесь, что покрытие не контактирует с МеОН, поскольку это обычно мешает правильной адгезии.

8. Анализировать образцы с помощью ЖХ/МС.

Анализ ЖХ/МС.

1. Образцы, представленные в формате 96-луночного планшета, вводят с помощью автоматизированного пробоотборника НТСРАЬ™ (ЙЕАР Тесйпо1од1ек, СаггЬого, ΝΟ) в изократическую смесь Н₂О/МеСN (10/90, об./об.) и 0,1% муравьиной кислоты, подаваемую насосами ЕС-ЮАОУР™ (Ыптайхи, Куо!о, Япония) со скоростью 1,2 мл/мин.

2. Разделение обеспечивается колонкой 8ΥNЕВСI МАХ-ВР™ (Рйепотепех, 8ийет Сгеек СА) 150х2,00 мм с детекцией.

Количественное определение производится с помощью тройного квадрупольного массспектрометра (Аррйей Вюкук!етк, Бок!ег, СА) с использованием ионизации электрораспылением (Е81) и отслеживания множества ионов для масс 277, 279, 281, 255, 283 в режиме отрицательных ионов.

3. Инструментальный контроль и формирование данных осуществляется с помощью программы ЛNА^Υ8Т 1.3™ (Аррйей Вюкук!етк, Бок!ег, СА).

4. ЖХ/МС, калиброванная для каждой жирной кислоты в диапазоне от 0,5 до 50 мкг с помощью стандартных образцов (81дта). Этот диапазон наилучшим образом соответствует стандартной кривой квадратической регрессии, которая используется для расчета количества каждой кислоты, высвобожденной в образцах с ферментом.

Пример 3. Иллюстративные протоколы для НТР скрининга эволюционных библиотек липазы для повышенной избирательности гидролиза пальмитатных или стеаратных сложных эфиров по сравнению с олеатными сложными эфирами.

- 90 020145

В следующем примере описываются иллюстративные методы (протоколы) для высокопроизводительного (НТР) скрининга эволюционных библиотек липазы для повышенной избирательности гидролиза пальмитатных или стеаратных сложных эфиров по сравнению с олеатными сложными эфирами. Этот иллюстративный метод (протокол/НТР скрининга) описывает скрининг эволюционных библиотек липазы, полученных из δΕ^ ΙΌ N0:2, но он применим к другим ферментам, включая предлагаемые в настоящем описании ферменты, например иллюстративные ферменты, содержащие последовательности, показанные в δΕ^ ΙΌ N0:2, и содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 либо более модификаций или все модификации аминокислотных остатков, описанных в табл. 3, 4, 9, 10, 11, 16 или 23; и этот иллюстративный метод (протокол) применим для библиотек других типов.

Эти иллюстративные НТР скрининги производят с использованием флуорогенных субстратов: пальмитатных или стеаратных сложных эфиров метилумбеллиферила по сравнению с олеатным сложным эфиром метилумбеллиферила.

Ход НТР скрининга.

1. Клоны библиотеки распределяют в планшеты для микротитрования и анализируют в первичном НТР скрининге.

2. Клоны, идентифицированные как обладающие улучшенной избирательностью, обозначают как первичные попадания.

3. Первичные попадания перераспределяют в планшетах для микротитрования и анализируют во вторичном НТР скрининге.

4. Клоны с подтвержденной улучшенной избирательностью обозначают как вторичные попадания.

5. Вторичные попадания секвенируют для идентификации имеющихся мутаций последовательности и тестируют на масле (см. отдельный протокол).

Протокол НТР теста.

1. Пометить черной меткой 384-луночные планшеты для анализа; пометить меткой 384-луночные планшеты для выращивания и внести 30 мкл/лунку среды ЬВ (100 мкг/мл карбенициллина).

2. Перенести или отобрать клоны в планшеты для выращивания и выращивать в течение ночи при 30°С в инкубаторе с увлажнением.

3. Индуцировать экспрессию липазы добавлением 30 мкл/лунку среды ЬВ (100 мкг/мл карбенициллина), содержащей 4 мкг/мл безводного тетрациклина, и инкубировать 2 ч при 30°С.

4. Лизировать клетки добавлением 20 мкл/лунку В-РЕК™ (Р1егсе СНетса1, Коскйогй, ГЬ); оставить при комнатной температуре до помещения в робот.

5. Провести анализ липазной активности на роботе (см. ниже).

6. Клоны, идентифицированные как обладающие повышенной избирательностью в отношении пальмитатных или стеаратных сложных эфиров ΜеυΜΒ по сравнению с олеатным сложным эфиром ΜеυΜΒ, обозначают как первичные попадания.

7. Перенести клоны-попадания в глубокие 96-луночные планшеты, содержащие среду ЬВ (1 мл/лунку; 100 мкг/мл карбенициллин) и выращивать в течение ночи при 30°С.

8. Первичные попадания перераспределить в 384-луночные планшеты и повторить стадии 1-8 во вторичном скрининге; обозначить попадания как вторичные попадания.

9. Вторичные попадания после стадии 8 подвергнуть скринингу.

Иллюстративный протокол автоматизированного НТР скрининга.

1. Арпсо!: Перемешать и перенести аликвоту (10 мкл) лизированных клеток из планшета для выращивания (см. стадии 1-4 выше) в каждый из двух отдельных планшетов для анализа (1 и 2).

2. \1О.ТП)1ЮР''·' (ТНегто Е1ес!гоп Согрогайоп, ΜΠΗγΗ ΜΑ). Добавить 70 мкл субстрата 1 (υΜΒ16:0) в планшет для анализа 1; добавить 70 мкл субстрата 1 (υΜΒ-18:1) в планшет для анализа 2.

3. Инкубировать планшеты для анализа в течение 20 мин при 37°С.

4. Считать на флуориметре: возбуждение 360 нм, испускание 465 нм.

Клоны-вторичные попадания с выявленными уникальными последовательностями распределяют и выращивают в 96-луночных планшетах и тестируют на масле сои (см. ниже).

- 91 020145

Структуры флуорогенных субстратов, используемых в НТР скрининге

Пример 4. Иллюстративная эволюция для улучшенного гидролиза пальмитатных или стеаратных сложных эфиров с использованием технологии С88М^8М.

В следующем примере описаны и суммированы результаты иллюстративных протоколов ферментативной эволюции и скрининга, которые позволили идентифицировать предлагаемые в настоящем описании ферменты, например ферменты, содержащие последовательность, показанную в 8ЕР ГО N0:2, но содержащую также модификацию остатков, показанную в табл. 3 или 4; или ферменты, кодируемые нуклеиновой кислотой, показанной в 8ЕР ГО N0:1, но содержащей также модификацию остатков, показанную в табл. 3 или 4. В одном аспекте в иллюстративном скрининговом анализе для идентификации этих иллюстративных предлагаемых в настоящем описании ферментов использовалось масло сои в качестве субстрата и характеризовались жирные кислоты, высвобожденные (гидролизованные) из масла сои, например, как линоленовая кислота, линолевая кислота, олеиновая кислота, пальмитиновая кислота или стеариновая кислота.

Масло сои имеет следующий состав жирных кислот: линоленовая = 8%; линолевая = 53%; олеиновая = 23%; пальмитиновая = 12%; стеариновая = 4%. Таким образом, если процент пальмитиновой кислоты, высвобожденной (гидролизованной) из масла сои иллюстративным предлагаемым в настоящем описании ферментом превышает 12%, то этот фермент предпочтительно гидролизует (высвобождает) пальмитиновую кислоту.

Скрининг пальмитазы: получение пальмитазной библиотеки.

Пальмитазную библиотеку вариантов 8ЕР ГО N0:2 получали с помощью технологии С88М^8М (номер патента 6171820). Точечные мутации вводили с помощью вырожденных олигонуклеотидов, за один раз одно положение аминокислоты, так что каждый исходный кодон заменен каждой из 20 кодируемых природных аминокислот. Мутантными вариантами трансформировали хозяина ЕзсЬепсЫа сой ТОР10 (1пуйгодеп, и8А) для экспрессии и скрининга. Библиотеку конструировали в экспрессионном векторе рА8К-5, который представлял собой модифицированный вектор рА8К-1ВА (1ВА СтЬН, Германия). Для получения рА8К-5 исходный линкер для клонирования был заменен новыми сайтами для клонирования, конкретно, последовательность от ХЬа1 до НшбШ рА8К-1ВА была заменена следующей последовательностью

КВЗ Агд5егН18Н1аН15Нх8Н18Н1в

ТСТАОАТААССА6(ЗвСААААССАТСС(ЗАд<ЗАТССА(ЗАТСТСАТСАССАТСАССАТСАСТААОСТТ (5Е0 ΙΡ ΝΟ;21) ХЬа1 Ысо1 Вап>Н1 Вд1И ΗίηάΙΙΙ

Экспрессию вариантов С88М^8М индуцировали ангидротетрациклином после достижения оптимальной плотности клеток-хозяев.

Ферменты, имеющие аминокислотные последовательности, генерированные технологией С88М^8М, подвергали скринингу с помощью протокола высокопроизводительного (НТР) скрининга, например протокола, описанного в примере 3, что позволяло определить, какая жирная кислота предпочтительно гидролизуется из жира-масла сои в этом тесте. Цель проекта эволюции заключалась в улучшении пальмитазной избирательности исходной последовательности 8ЕР ГО N0:2 на масле. Тест включал контактирование нового/с модифицированной последовательностью фермента с маслом сои, которое содержит разные жирные кислоты, включая линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту (см. % состав, указанный выше), и измерение количества каждой жирной кислоты, гидролизованной каждым модифицированным ферментом. Была установлена библиотека последовательностей, обеспечивающих способность фермента предпочтительно гидролизовать пальмитиновую кислоту (или стеариновую кислоту, см. ниже) из масла сои (так называемая пальмитатная библиотека):

первичный и вторичный скрининг проводили с помощью НТР скрининга, например, методом, описанным в примере 3;

секвенирование вторичных попаданий выявило аминокислотные мутации, приведшие к улучшенной избирательности гидролиза пальмитата над олеатом при НТР скрининге по сравнению, например, с исходной последовательностью 8ЕР ГО N0:2.

для каждого кодонного варианта, кодирующего аминокислотную мутацию, отбирали один клон и распределяли в 96-луночные планшеты для тестирования на масле;

- 92 020145 на основании тестов на масле была получена избирательность мутантных ферментов в отношении пальмитата или стеарата или других жирных кислот (табл. 3);

наибольшее попадание обеспечивало содержание пальмитата 59% в высвобожденных жирных кислотах (ЖК) против 43% для 8Ер ΙΌ NΟ:2 в том же тесте; это соответствует повышению показателя избирательности с 3,6 до 4,9;

некоторые клоны проявили также повышение стеаратной избирательности.

В табл. 1 ниже суммированы С88М^8М мутации (см. выше), отобранные для включения в пальмитатную библиотеку для объединения с помощью технологии СепеВеаккетЬ1у^8М (см. пример 5). В одном иллюстративном тесте были идентифицированы четырнадцать (14) одиночных аминокислотных мутаций, дающих наибольшее повышение гидролиза пальмитата в тестах с маслом (см. также табл. 1, 3 и 4 ниже). Среди остатков, которые обеспечивают значительное повышение гидролиза пальмитата или стеарата в тестах с маслом, размечают остатки в соответствии с порядком, в котором они располагаются в исходной 8Ер ΙΌ NΟ:2 (см. фиг. 7). Представлены исходные а.к. в 8Ер ΙΌ NΟ:2 и удачные мутации (новые аминокислоты), т.е. предлагаемые в настоящем описании иллюстративные последовательности. В одном аспекте одиночные мутации заменой аргинином (В) в положениях остатков 163 и 164 могут быть включены альтернативно, так что эта иллюстративная библиотека должна включать клоны с последовательностями 163У-164Э (8Ер ΙΌ NΟ:2), 163В-164Э и 163У-164В, но не последовательностью 163В164В.

Таблица 1

Остаток	Исходная аминокислота	Новые аминокислоты
61	ϋ	А,Е
72	К	Е,К
116	Е	А,О,К,Т,У
133	3	А
151	I	С, А
163	V	В
164	ϋ	К

Фиг. 6а иллюстрирует эффекты иллюстративных С88М^8М мутаций пальмитазы на гидролиз пальмитата и стеарата по сравнению с исходной 8Ер ΙΌ NΟ:2. Для каждой из четырнадцати (14) одиночных аминокислотных мутаций, отобранных для включения в пальмитазную библиотеку ΟеηеΒеаккетЬ1у^8М, процент изменения высвобождаемых пальмитата и стеарата по сравнению с исходной 8Ер ΙΌ NΟ:2 представлен в виде графика. Многие из этих мутаций давали значительное повышение гидролиза пальмитата, сопровождающееся от небольшого до значительного повышением гидролиза стеарата. Однако несколько мутаций вызывает слабое снижение гидролиза стеарата. Звездочки обозначают мутации, идентифицированные как ведущие к повышенной избирательности сатуразного типа.

Стеаратный скрининг: получение стеаратной (стеаратазной) библиотеки.

Стеаратазную библиотеку вариантов 8Ер ΙΌ NΟ:2 получали с помощью технологии С88М^8М (номер патента 6171820). Точечные мутации вводили с помощью вырожденных олигонуклеотидов, за один раз одно положение аминокислоты, так что каждый исходный кодон мог быть заменен каждой из 20 кодируемых природных аминокислот. Мутантными вариантами трансформировали хозяина ЕксНепсЫа гой ТОР10 ^пуйгодеп, и8А) для экспрессии и скрининга. Библиотеку конструировали в экспрессионном векторе рА8К-5 (как описано выше). Экспрессию вариантов С88М^8М индуцировали ангидротетрациклином после достижения оптимальной плотности клеток-хозяев.

Ферменты, имеющие аминокислотные последовательности, генерированные технологией С88М^8М, подвергали скринингу с помощью протокола высокопроизводительного (НТР) скрининга, например протокола, описанного в примере 3, что позволяло определить, какая жирная кислота предпочтительно гидролизуется из жира-масла сои в этом тесте. Тест включал контактирование нового/с модифицированной последовательностью фермента с маслом сои, которое содержит разные жирные кислоты, включая линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту (см. % состав, указанный выше), и измерение количества каждой жирной кислоты, гидролизованной каждым модифицированным ферментом. Была установлена библиотека последовательностей, обеспечивающих способность фермента предпочтительно гидролизовать стеариновую кислоту (или пальмитиновую кислоту, см. выше) из масла сои (так называемая стеаратная библиотека):

секвенирование вторичных попаданий выявило аминокислотные мутации, приведшие к улучшенной избирательности гидролиза стеарата над олеатом при НТР скрининге по сравнению, например, с исходной последовательностью 8Ер ΙΌ NΟ:2;

- 93 020145 на основании тестов на масле секвенированных вторичных попаданий была получена избирательность мутантных ферментов в отношении пальмитата или стеарата или других жирных кислот (табл. з);

наибольшее попадание обеспечивало содержание стеарата 22% в высвобожденных жирных кислотах (ЖК) против 9% для ЗЕр ГО NО:2 в том же тесте; это соответствует повышению показателя избирательности с 2,з до 5,5;

некоторые клоны проявили также повышение пальмитазной избирательности.

В табл. 2 ниже суммированы СЗЗМ^зм мутации (см. выше), отобранные для включения в стеаратазную библиотеку для объединения с помощью технологии СепеКеаккетЬ1у^ЗМ. В одном иллюстративном тесте были идентифицированы двадцать две (22) одиночных аминокислотных мутаций, дающих наибольшее повышение гидролиза стеарата в тестах с маслом (см. также табл. 2, з и 4 ниже). Среди остатков, которые обеспечивают значительное повышение гидролиза пальмитата или стеарата в тестах с маслом, размечают остатки в соответствии с порядком, в котором они располагаются в исходной ЗЕр ГО NО:2. Представлены исходная аминокислота в ЗЕр ГО NО:2 и удачные мутации (новые аминокислоты), т.е. предлагаемые в настоящем описании иллюстративные последовательности. В одном аспекте одиночная мутация заменой аланином (А) в положении остатка 22з включена в качестве фиксированной мутации, так что каждый клон в этой иллюстративной библиотеке содержит эту мутацию.

Таблица 2

Фиг. 6Ь (см. также выше) иллюстрирует эффекты двенадцати (12) из двадцати двух (22) образцовых СЗЗМ^зм мутаций стеаратазы на гидролиз пальмитата и стеарата по сравнению с исходной ЗЕр ГО NО:2. Для каждой из двенадцати (12) одиночных аминокислотных мутаций, представленных на фиг. 6Ь и отобранных для включения в стеаратазную библиотеку СепеКеаккетЬ1у^ЗМ, процент изменения высвобождаемых пальмитата и стеарата по сравнению с исходной ЗЕр ГО NО:2 представлен в виде графика. Большинство из этих мутаций давали значительное повышение гидролиза стеарата, но от небольшого до значительного снижение гидролиза пальмитата. Звездочки обозначают мутации, идентифицированные как ведущие к повышенной избирательности сатуразного типа, т.е. повышению избирательности гидролиза пальмитата и стеарата против гидролиза ненасыщенных жирных кислот в масле, например олеата, линолеата и линолената.

Итоги.

Скрининг библиотеки СЗЗМ^зм (см. выше, где подробно описана технология СЗЗМ^зм), созданной на основе исходной ЗЕр ГО NО:2, дал клоны с одиночными мутациями аминокислот со значительным улучшением пальмитатной и стеаратной избирательности и сатуратной избирательности (например, избирательного гидролиза пальмитата и/или стеарата из масла сои).

Были обнаружены клоны со значительно улучшенной стеаратной избирательностью (избирательным гидролизом стеариновой кислоты по отношению к другим жирным кислотам).

Были обнаружены мутанты СЗЗМ^зм с повышенной пальмитатной избирательностью (избирательным гидролизом пальмитиновой кислоты по отношению к другим жирным кислотам) по сравнению с ферментом ЗЕр ГО NО:2.

В табл. з и 4 ниже описаны (дополнительно суммированы) последовательности предлагаемых в настоящем описании иллюстративных гидролазных ферментов, например иллюстративных ферментов, имеющих последовательность, представленную в ЗЕр ГО NО:2 и содержащую по меньшей мере одну (одну, несколько или все) из замен аминокислотных остатков, описанных в таблицах. В табл. з и 4 также суммированы данные по активности отобранных иллюстративных ферментов; данные включают соотнесение отдельных иллюстративных ферментов с их позитивной гидролазной активностью, включающей

- 94 020145 катализ гидролиза (высвобождения) пальмитатной или стеаратной жирной кислоты из масла сои, выявленного с помощью высокопроизводительного (НТР) протокола скрининга, описанного выше.

В табл. 3 и 4 термин исходная аминокислота обозначает аминокислотный остаток-мишень (обозначаемую как аминокислотный остаток) в исходном ферменте 8Ер ГО N0:2 (мишени для изменения); а термин новые аминокислоты означает заново сконструированный аминокислотный остаток (который заменяет остаток-мишень в старой последовательности) в предлагаемом в настоящем описании иллюстративном (новом) ферменте. Запись остатка новая аминокислота в колонку стеарат против пальмитат указывает на то, какой из двух высокопроизводительных скринингов жирных кислот (т.е. высвобождение пальмитиновой кислоты при одном скрининге и высвобождение стеариновой кислоты при другом скрининге, см. пример 3) был использован для выявления (идентификации) конкретного фермента с указанным изменением остатка (последовательность нового фермента, остаток новая аминокислота).

Например, в первой строке табл. 3 в положении 7 аминокислотного остатка тирозин (или Υ) исходного фермента 8Ер ГО N0:2 заменен аргининовым (или К) аминокислотным остатком и этот новый фермент (Υ7Κ) обладает активностью, которая отличается от активности исходного фермента (см. табл. 3); например, в данных с маслом суммирована субстратная (в отношении жирных кислот) предпочтительность нового фермента (например, фермента Υ7Κ) путем перечисления высвобожденных (гидролизованных) жирных кислот, появившихся при экспозиции фермента (контактировании) с маслом сои (тесты описаны выше) при том, что субстрат масла сои содержит несколько потенциально гидролизуемых жирно-кислотных составляющих групп, включая линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту.

Например, в первой строке для фермента Υ7Κ 8,3% от высвобожденных жирных кислот (из подвергнутого взаимодействию масла сои) составляла линоленовая кислота, 22,1% от высвобожденных жирных кислот составляла линолевая кислота; 19,7% от высвобожденных жирных кислот составляла олеиновая кислота; 41,5% от высвобожденных жирных кислот составляла пальмитиновая кислота; 8,4% от высвобожденных жирных кислот составляла стеариновая кислота (эти четыре члена составляют 100%).

В колонке Р+8 суммированы данные для Р и для 8 для подытоживания того, какая часть от всех высвобожденных жирных кислот приходилась на пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту (41,5% плюс 8,4%=49,9% от гидролизованных жирных кислот приходилось на пальмитиновую кислоту и стеариновую кислоту, или Р+8).

Таблица 3

- 95 020145

		V	брак
36	0		А	51,0%
			3	50,9%
40	V		Р	32,2%
42	V		I	47,2%
			ь	47,8%
43	Ъ	V		51,5%
45	С	А		44,4%
		ъ		52,7%
48	А		3	45,4%
			V	70,1%
			V	55,7%
		т		33,60%
54	3	н	55,6%
61	0	А		60,5%
		Е		55,0%
		3		49, 8%
62	V	Е	Е	53,0%
		А		56,6%
		3		56, 5%
		И		51,9%
		N		49, 7%
		0		52,4%
		3		55,5%
		Т		50,7%
			ϋ	52,5%
			Ъ
			И	50,2%
66	А		N	54,2%
			К	52,1%
72	К	Е		58,3%
		К		61,0%
		Р		27,2%
		3		55,3%
		т		55,9%
		Υ		50,1%
74	Г	I		53,8%
		ь		54,8%
		Р		52,3%
		к		50,5%
77	3	Р	38,1%
78	I		ϋ	47,1%
			Е	37,1%
			Р	40, 9%

80	3	Р	51,9%
82	Ъ		Р	37,3%
83	V	с		47,7%
		м		59,3%
84	ϋ	V	40,2%
87	V		А	49,2%
			С	46,1%
			ϋ	43, 9%
			Е	46, 6%
			3
			Р	53,3%
			3	45,2%
			Т	42,8%
			Н	52,9%
			N	50,3%
88	ϋ		Е	44,6%
			Е	50,3%
			Н	45,9%
			Ь	49,1%
			Р	59,6%
			Р	48,9%
			Ω	47,1%

- 96 020145

89	В	5	54,5%
92	А		ϋ	47,3%
			Е	59,3%
			К	42, 6%
			3	48,7%
			т	52,1%
			V	57,5%
93	V		м	48,2%
96	А	С	с	51, 4%
		I	I	брак
		3	3	46, 8%
98	С	А		45, 0%
		ъ		брак
101	К		А	49, 8%
103	I		ь	36,8%
107	И		Р	46,20%
			А	39, 5%
			С	39, 4%
			С	47,5%
			Н	42,0%
			В	68,0%
			3	36, 8%

		Ь Р, Е217<2 V V, Ε217Ώ	64,8% 46,2% 37,8% 44,80%
108	3		СТОП	19, 0%
			А	43, 0%
			С	26, 0%
			С	47, 5%
			К	57,8%
			Ъ	44,0%
			Р	56, 9%
			0	58,6%
			В	54,7%
			V	53,4%
		Т, А218Т
			Е, Е2170	46, 50%
109	ь		М	49, 0%
110	с		ъ	54,4%
113	Υ		Е	35,8%
			С	39,8%
		Е		36, 5%
116	Е	А	66,6%

	Е С Н ъ ь Р 0 0 В, Н140В В 3 3 т V В, Н140В	54,7% 53,8% 57,9% 58,5% 55,1% 58,0% 59,6% 60,5% 60,6% 61,8% 58,6% 59,7% 67,6% 67,8%
117 Ъ	В, 1161Ь	54,1% В 51,6%
120 К	I ь Е м 3	46,7% Ь 60,8% 52,6% 49,9% 3 53,3%

- 97 020145

132	С		0,	3212А	56,2%
133	3			А	53,2%
				А	55,8%
				С	45, 6%
				Р	56, 0%
				К	51,7%
				Т	54,9%
			V,	Ь139,Н	53,2%
134	Ρ			С	7,2%
				К
135	Г			К	51,8%
139	ъ		Н,	3133ν	53,2%
140	н	К, Е116К		К	45,5%
141	А			К	40,2%
				т	43,3%
142	N			и	46, 1%
				к	53, 8%
				3	43,2%
				т	64,3%
144	А		Т,	Ν142Κ	33, 9%
146	К			3	50,2%
				6	49, 4%
				ь	51, 6%
		А			52,2%
147	I	Е			56,5%
		Е			50,5%
		Ъ			52,2%
150	А			ъ	59,7%
				ь	53,3%
151	I	А			48,6%
		С			53,0%
		Н			60, 0%
		Р			33,7%
		3			52,2%
		Т			49,2%
152	N			Е	28,0%
				С	53,0%
				Н	46,7%
				М	35, 7%
				К	21,1%
155	Т	С	51, 1%
157	ϋ	3			50,4%
		С			48,7%
		Т			54,7%
158	N	А	51, 2%
159	Ъ	М	51,5%
160	Р	Т	52,8%
161	I		ъ,	Ы17К	54,1%
				ь	51,6%
162	Р			к	брак
				к	брак
163	V			Е	55,7%
				К	63,9%
				Т	49,7%
164	ϋ			А	42,1%
				Е	брак
				Н	39, 8%
				К	49, 4%
				ъ	брак
				к	61,3%
				3	47,9%
				т	53,0%
				V	42,3%
				и	брак
166	Ω			с	49, 9%

- 98 020145

		N К	41,3% брак
167	I	К	К	53,3%
		3	3	47,3%
170	Р		0	45, 6%
			А	52,5%
			А, 3212Н	34,7%
171	V		К	34,1%
172	К	Р		51,7%
		<2		54, 9%
		3		40,2%
178	3		К	50,6%
180	Ь		Е	54,0%
			Н	44,6%
			<2	брак
			Е, С32Э	44, 6%
183	V		I	брак
193	Р		49, 4%
194	Е		А	брак
			М	47,9%
			<2	брак
			ϋ, Р1933	49, 4%

197 Ό	К	39, 4%
198 Е	стоп	56, 1%
200 Ъ		V 55,3%
204 V		Ъ 45,9% К 45,7%
210 А	V	50,2%
211 А	Т 3 I Т, Е217А	Е 35,3% Н 48,1% К 39,4% Ь 45,0% 50,3% Е 32,6% N 46,1% Р 49,2% К 55,2% И 47,8% Υ 48,9% 50,8% 52,7% 3 52,7% I 49,8% 46, 2%
212 3	С К А Е 6 Н Е Р 0 к т V и Υ	49,3% 50,3% А, 21320 53,2% 36, 8% 36, 6% 44,3% 46, 5% 53,2% 12,2% 41, 8% 50,2% 53, 7% 38,7% 48,4% 47,1% Η, Р170А 34,7%
213 К	I с т т стоп	47, 9% 57,7% 56,7% 55,5%
214 Т		С 51,6%

- 99 020145

	V V Р N К Υ Υ	С V	53,0% 52,2% 54,5% 51,9% 56, 9% 55, 1% 62,7% 62,7%
215	С	А	А	56,6%
			I	54,1%
			Ь	29, 9%
		Н		50,2%
		3		52,1%
		М		47,9%
		V		55,6%
		Р		47,3%
		С		60,4%
		И		52,8%
		стоп		53, 9%
			V, Т22М	52,1%
216	А	Т	Т	50,9%
		К		41, 9%
		Υ		34,8%
		V	V	56, 9%
		С		59,7%
		3	3	55, 0%
		Ь		55,6%
217	Е	Ω		36, 6%
		к		59, 4%
		3		53, 5%
		А		46,2%
		С		44,8%
		Р		46, 2%
218	А	м		42,5%
		н	Н	49,1%
		0	0	47,7%
		к		53,4%
		и		51, 9%
		3		51,1%
		т		50,0%
		к		52,4%
		К, С8Е
		К, 228К
223	V		А	48,8%
			М	31, 6%
			К	23,4%
			т	брак
224	А		Е	49, 5%
			С	58,2%
			Θ	48,4%
			I	41,7%
				46, 4%
			Υ	43,7%
225	А		(3	49,3%
			Ь	54,3%
			И	49,0%
			0	45,8%
			т	43,2%
226	К		н	48,3%
			т	41,2%
227	Ь		к	41, 4%

100 020145

- 101 020145

82	13, 0%	28,3%	21,4%	33,3%	4,0%	37,3%
83	7,5%	20,0%	24,7%	31,1%	16,6%	47,7%
	6, 8%	18,6%	15, 3%	51,5%	7,8%	59,3%
84	0, 0%	32, 4%	27,4%	21,0%	19,2%	40,2%
87	12,7%	11, 9%	26,2%	39, 7%	9, 5%	49,2%
	14,5%	11, 8%	27,6%	33, 1%	13,0%	46, 1%
	9, 3%	12,3%	34,5%	32,7%	11,2%	43,9%
	12,2%	10, 5%	30, 8%	33,6%	13, 0%	46, 6%
	10, 6%	9, 9%	26,2%	40, 6%	12,7%	53,3%
	14,4%	12,4%	27,9%	36, 0%	9, 2%	45,2%
	6, 7%	25, 8%	24,7%	39, 5%	3, 3%	42,8%
	4,4%	23,2%	19,4%	48,5%	4,5%	52,9%
	11,7%	11,3%	26,7%	31,5%	18,8%	50,3%
88	14,1%	13, 4%	27,9%	34,7%	9, 9%	44,6%
	13,4%	15,2%	21,0%	36, 7%	13,6%	50,3%
	13,3%	12,5%	28,3%	32,5%	13, 4%	45,9%
	13,0%	9,2%	28,7%	40, 3%	8,8%	49, 1%
	2,9%	22,5%	15,0%	59,0%	0,7%	59,6%
	4,2%	35,5%	11,4%	35,6%	13,3%	48,9%
	14,7%	9,7%	28,5%	34,9%	12,2%	47,1%
89	0, 0%	35, 4%	10,1%	39, 0%	15,5%	54,5%
92	13,1%	16, 1%	23,5%	36, 4%	10, 9%	47,3%
	12,0%	10, 4%	18,2%	48,0%	11,4%	59, 3%
	13,5%	11, 3%	32,6%	34,8%	7,7%	42, 6%
	8,3%	25,1%	17,9%	46,1%	2,6%	48,7%
	13,7%	9,8%	24,4%	39,6%	12,5%	52,1%
	4,9%	20, 0%	17,5%	51,7%	5, 8%	57,5%
93	11,7%	9, 3%	30, 8%	40, 8%	7,4%	48,2%
96	10,3%	12,4%	25,9%	37,8%	13,6%	51,4%
	17,5%	35, 4%	35,5%	брак	11,6%	брак
	12,5%	12,0%	28,7%	33, 3%	13,6%	46, 8%
98	13,4%	19, 9%	21,7%	39,7%	5,3%	45,0%
	18,5%	30, 8%	36,8%	брак	13,9%	брак
101	9, 8%	12,5%	27,9%	39, 7%	10,1%	49, 8%
103	9,1%	36,6%	17,5%	26,0%	10,8%	36,8%
107	11, 9%	10, 1%	31,8%	30,5%	15,7%	46,20%
	0, 0%	20, 4%	40,1%	12,1%	27,4%	39,5%
	0, 0%	29, 6%	30, 9%	6, 8%	32,6%	39, 4%
	0,0%	29, 6%	22,9%	9, 5%	38,0%	47,5%
	2,2%	12,0%	43,9%	22,0%	19, 9%	42,0%
	30, 4%	12,5%	46,2%	10, 9%	57,1%	68,0%
	12,0%	20,5%	30,7%	5,2%	31,6%	36, 8%
	5, 0%	16,0%	14,2%	62,2%	2,6%	64,8%
	11,9%	10, 1%	31,8%	30, 5%	15,7%	46,2%
	0, 0%	15, 6%	46, 5%	10,2%	27, 6%	37,8%
	13,2%	21, 6%	20, 4%	31,3%	13,5%	44,80%
108	9, 0%	49,0%	23,0%	12,3%	6, 7%	19,0%
	0,0%	51,0%	6, 1%	33, 1%	9, 9%	43,0%
	11,0%	18,4%	44,6%	4,1%	21,9%	26, 0%
	0, 0%	29, 6%	22,9%	9, 5%	38,0%	47,5%
	0, 0%	32,0%	10,2%	53, 5%	4,3%	57,8%
	0,0%	45, 6%	10,4%	38,2%	5,8%	44,0%
	0,0%	28,4%	14,7%	51,2%	5,7%	56, 9%
	5, 4%	18,9%	17,2%	52,8%	5, 8%	58,6%
	0, 0%	10, 6%	34,7%	5, 9%	48,8%	54,7%
	0, 0%	21, 9%	24,7%	32,7%	20, 8%	53, 4%
	12,1%	13, 9%	27,6%	33, 8%	12,7%	46,50%
109	10,9%	8,8%	31,3%	37,7%	11,3%	49, 0%
110	0,4%	21, 4%	23,9%	54,4%	0, 0%	54,4%
113	5,0%	44,1%	15,1%	21,0%	14,8%	35,8%
	13,6%	14,6%	32,0%	15,2%	24,6%	39,8%
	13,9%	25, 9%	23,7%	36, 5%	0, 0%	36, 5%
116	4,8%	17,4%	11,2%	55,5%	11,1%	66,6%
	7,8%	17,7%	19,8%	47,0%	7,7%	54,7%

102 020145

	3,3%	26,7%	16,1%	33,1%	20,7%	53,8%
	7,3%	18,3%	16,5%	47,8%	10,1%	57,9%
	4,3%	22,9%	14,2%	54,3%	4,2%	58,5%
	4,6%	26,8%	13,5%	41,6%	13,5%	55,1%
	0,0%	32,4%	9,6%	38,3%	19,8%	58,0%
	8,1%	16,1%	16,2%	50,4%	9,3%	59,6%
	7,3%	20,5%	11,7%	49,2%	11,2%	60,5%
	6,9%	19,6%	12,9%	52,1%	8,5%	60,6%
	5,4%	17,4%	15,4%	50,8%	11,0%	61,8%
	8,7%	18,7%	13,9%	49,1%	9,5%	58,6%
	6,7%	22,8%	10,8%	46,3%	13,4%	59,7%
	6,4%	17,2%	8,8%	50,3%	17,2%	67,6%
	5,6%	17,6%	9,0%	59,0%	8,8%	67,8%
117	6,2%	21,4%	18,3%	46,0%	8,0%	54,1%
	8,9%	21,8%	17,7%	40,6%	11,0%	51,6%
120	15,3%	17, 9%	20,1%	44,4%	2,3%	46, 7%
	7,5%	15, 4%	16, 3%	51,3%	9, 5%	60, 8%
	17,3%	4,4%	25,7%	44,0%	8, 6%	52, 6%
	4,1%	25,5%	20,5%	36,9%	13,0%	49,9%
	15,7%	10,1%	20,9%	36, 8%	16, 5%	53, 3%
132	0,0%	32, 8%	10, 9%	56,2%	0,0%	56,2%
133	6,6%	20,7%	19,5%	49,9%	3,3%	53,2%
	9,3%	18,3%	16,5%	45,1%	10,8%	55,8%
	3, 3%	30,4%	20,7%	45, 6%	0,0%	45, 6%
	0, 0%	34,3%	9, 6%	56,0%	0,0%	56, 0%
	13,2%	12,9%	22,2%	42,7%	9,0%	51,7%
	10,1%	11,6%	23,3%	46, 5%	8,4%	54,9%
	0,0%	35,9%	10,9%	46,9%	6,3%	53,2%
134	0, 0%	56,2%	36, 6%	7,2%	0,0%	7,2%
135	0, 0%	41,1%	7,2%	51, 8%	0,0%	51,8%
139	0, 0%	35,9%	10,9%	46, 9%	6,3%	53,2%
140	9,7%	23,4%	21,4%	32,7%	12,8%	45,5%
141	11,2%	12,1%	36,5%	28,2%	12,1%	40,2%
	14,7%	13,9%	28,1%	38,3%	5,0%	43,3%
142	16, 3%	18,8%	18,8%	10, 3%	35,7%	46, 1%
	0, 0%	34,5%	11,7%	43, 4%	10,5%	53,8%
	8,6%	15,8%	32,5%	22,8%	20,4%	43,2%
	2,4%	9, 6%	23,7%	47,7%	16,7%	64,3%
144	0, 0%	14,9%	51,2%	13,4%	20,4%	33, 9%
146	13,6%	10,3%	26,0%	31,4%	18,7%	50,2%
	12,6%	12,4%	25,5%	36, 5%	12,9%	49, 4%
	6,6%	22,4%	19,5%	48,2%	3,4%	51, 6%
	9,0%	19, 7%	19,0%	41,7%	10,5%	52,2%
147	8,0%	17,9%	17,6%	48,8%	7,7%	56,5%
	7,2%	24,5%	17,9%	33,0%	17,4%	50,5%
	9,5%	20,6%	17,7%	42,2%	9,9%	52,2%
150	7,7%	15,1%	17,5%	50,4%	9,2%	59,7%
	7,5%	20,6%	18,6%	41,3%	12,0%	53,3%
151	7,8%	26,1%	17,5%	46,4%	2,2%	48,6%
	5,0%	29,6%	12,4%	48,9%	4,1%	53,0%
	0,0%	25,5%	14,5%	55,5%	4,5%	60, 0%
	0,0%	14,2%	52,1%	20,0%	13,7%	33,7%
	0,0%	17,3%	30,5%	43,3%	8, 9%	52,2%
	8,0%	22,7%	20,2%	44,0%	5,1%	49,2%
152	0,0%	56, 3%	15,7%	23, 6%	4,4%	28,0%
	8,0%	12,7%	26,3%	22,5%	30,5%	53, 0%
	0,0%	27,1%	26,2%	26,2%	20,5%	46,7%
	0,0%	20,1%	44,2%	24,8%	10,8%	35,7%
	9,5%	31,2%	38,3%	2,2%	18,9%	21, 1%
155	18,4%	4, 9%	25,6%	41,5%	9, 6%	51,1%
157	7,9%	19, 5%	22,2%	41,2%	9,2%	50,4%
	9, 6%	21,7%	20, 1%	39,1%	9, 6%	48,7%
	7,2%	25,2%	13,0%	34,9%	19,8%	54,7%

103

158	14,0%	1,2%	33,5%	42,8%	8,5%	51, 2%
159	6,3%	28,4%	13,8%	36,7%	14,8%	51,5%
160	5, 6%	20,8%	20,8%	46, 6%	6, 2%	52,8%
161	6,2%	21,4%	18,3%	46, 0%	8,0%	54,1%
	8,9%	21,8%	17,7%	40,6%	11,0%	51,6%
162	10,2%	45, 6%	38,4%	брак	5,7%	брак
	22,1%	39,2%	32,7%	брак	6, 0%	брак
163	5,9%	22,9%	15,5%	47,4%	8,3%	55,7%
	8,6%	17,1%	10,4%	61,4%	2,5%	63,9%
	6,4%	23,5%	20,4%	45,7%	4,0%	49,7%
164	8,4%	26, 9%	22,6%	39, 2%	2, 9%	42,1%
	13,0%	38,4%	37,5%	брак	11,2%	брак
	9, 6%	29,5%	21,1%	35,1%	4,7%	39, 8%
	17,8%	12,3%	20, 5%	38,7%	10,7%	49, 4%
	23,3%	23,1%	39,1%	брак	14,5%	брак
	6,5%	15,2%	17,1%	58,0%	3,3%	61,3%
	9, 1%	23,1%	19, 8%	40, 1%	7, 8%	47,9%
	9,2%	20,1%	17,7%	41,2%	11,8%	53,0%
	15,6%	17,7%	24,4%	29, 9%	12,4%	42,3%
	15,9%	37,0%	35,5%	брак	11,7%	Брак
166	5, 5%	21,8%	22,8%	44,5%	5, 4%	49, 9%
	14,6%	22,3%	21,8%	33,2%	8, 1%	41,3%
	22,3%	33,3%	36,8%	брак	7, 6%	Брак
167	7,2%	19,4%	20,1%	44,8%	8,4%	53, 3%
	10,0%	21,9%	20,7%	36,3%	11,0%	47,3%
170	12,5%	12, 4%	29,4%	37,8%	7,8%	45, 6%
	8,5%	18,2%	20,8%	43, 0%	9,5%	52,5%
	3, 5%	22,0%	39, 8%	8, 9%	25,9%	34,7%
171	8,0%	22,4%	35,5%	33,4%	0,7%	34,1%
172	8,0%	18, 8%	21, 4%	43, 6%	8,1%	51,7%
	7,4%	19, 1%	18,6%	45,1%	9, 8%	54,9%
	22,5%	0, 0%	37,3%	40,2%	0,0%	40,2%
178	14,5%	12,9%	22,0%	32,3%	18,3%	50, 6%
180	8,6%	19,0%	18,5%	42,1%	11,8%	54,0%
	11,8%	14,2%	29, 3%	32,1%	12,5%	44, 6%
	11,5%	40, 0%	36,3%	брак	12,2%	Брак
	14,6%	12, 1%	28,7%	36, 6%	7,9%	44, 6%
183	10, 6%	35, 4%	40,7%	брак	13,3%	Брак
193	3, 0%	32,4%	15,2%	49,4%	0,0%	49, 4%
194	10, 9%	38,7%	42,0%	брак	8,4%	Брак
	9,6%	21,8%	20,7%	34,6%	13,2%	47,9%
	12,6%	31, 0%	37,8%	брак	18,6%	брак
	3, 0%	32,4%	15,2%	49,4%	0,0%	49, 4%
197	9,8%	0, 0%	50,9%	39,4%	0,0%	39, 4%
198	7,7%	19, 7%	16,6%	46, 8%	9,3%	56,1%
200	8,5%	16, 8%	19,3%	48,7%	6,7%	55,3%
204	13,7%	12,8%	27,6%	32,2%	13,7%	45,9%
	9, 9%	14,0%	30,5%	23,2%	22,5%	45, 7%
210	7,2%	22,0%	20,7%	39, 0%	11,2%	50,2%
211	9,0%	16,2%	39,4%	24,0%	11,2%	35,3%
	10,2%	17,0%	24,7%	35,7%	12,4%	48,1%
	13,8%	10,4%	36,5%	24,1%	15,3%	39,4%
	6,5%	12,2%	36,3%	30,5%	14,5%	45,0%
	6,9%	26,6%	16,1%	32,7%	17,7%	50,3%
	3, 4%	36, 2%	27,7%	32, 6%	0,0%	32, 6%
	6, 9%	26, 5%	20,5%	28, 9%	17,3%	46, 1%
	0,0%	35, 1%	15,6%	39, 6%	9,7%	49,2%
	0, 0%	25, 3%	19,5%	46, 8%	8, 4%	55,2%
	6, 6%	19, 7%	25,9%	37,2%	10, 6%	47,8%
	7,7%	22,8%	20,7%	36, 6%	12,3%	48,9%
	16,3%	4, 6%	28,2%	49, 1%	1,7%	50,8%
	8,0%	22,1%	17,2%	41, 2%	11,5%	52,7%
	8,0%	22,1%	17,2%	41,2%	11,5%	52,7%
	18,2%	3,2%	28,7%	42,4%	7,5%	49,8%
	11, 9%	10, 1%	31,8%	30, 5%	15,7%	46,2%
212	7,5%	25,6%	17,6%	36,5%	12,8%	49,3%

104

	19,1%	0,9%	29,7%	46,8%	3,5%	50,3%
	8,8%	28,4%	9, 6%	33,7%	19,5%	53, 2%
	19,4%	24,8%	18,9%	33,5%	3,3%	36,8%
	19,1%	26, 9%	17,5%	31, 6%	4, 9%	36, 6%
	5,5%	42,3%	7,9%	30,8%	13,5%	44,3%
	4, 6%	23, 9%	25,1%	35,5%	11,0%	46,5%
	8,8%	28,4%	9,6%	33,7%	19,5%	53,2%
	0, 0%	65,4%	22,4%	10, 5%	1, 7%	12,2%
	3,3%	14,2%	40,6%	30,7%	11,1%	41,8%
	11,2%	13, 6%	25, 0%	40, 3%	9,9%	50, 2%
	10,6%	16, 6%	19, 1%	42,7%	11,0%	53,7%
	21,1%	22,7%	17,4%	17,5%	21,2%	38,7%
	7,6%	24,0%	20,0%	38,9%	9, 5%	48,4%
	10,3%	20,4%	22,2%	33,7%	13,4%	47,1%
	3,5%	22,0%	39, 8%	8,9%	25,9%	34,7%
213	7, 6%	28,2%	16,3%	30, 4%	17,5%	47,9%
	5,3%	18,8%	18,1%	41,3%	16,4%	57,7%
	7,5%	21,0%	14,8%	48,5%	8,2%	56,7%
	8,3%	17,8%	18,5%	44,6%	10,9%	55,5%
214	9,1%	20,2%	19,1%	47,0%	4,5%	51,6%
	8,3%	19, 8%	18,9%	44, 6%	8,4%	53,0%
	7,7%	20,5%	19,6%	45,3%	7,0%	52,2%
	7,1%	21,5%	16,9%	42,4%	12,1%	54,5%
	7,0%	25,9%	15,1%	39,9%	12,0%	51,9%
	6, 9%	18,0%	18,3%	48,5%	8,4%	56, 9%
	7,4%	19,2%	18,2%	45, 6%	9, 5%	55, 1%
	5,3%	21,1%	10,9%	47,3%	15,4%	62,7%
	5,3%	21,1%	10,9%	47,3%	15,4%	62,7%
215	7,8%	19,8%	15,8%	46,4%	10,2%	56,6%
	7,9%	20,2%	17,7%	40,6%	13,6%	54,1%
	20, 0%	24,8%	25, 4%	25, 7%	4,1%	29, 9%
	4,4%	26, 2%	19,2%	45,1%	5,1%	50,2%
	8,1%	19, 6%	20, 1%	42,7%	9, 4%	52,1%
	2,3%	30,1%	19,7%	31,8%	16,1%	47,9%
	5,9%	23,7%	14,8%	39,3%	16,3%	55,6%
	9, 6%	26, 0%	17,0%	36,5%	10,9%	47,3%
	4,7%	20,8%	14,1%	42,2%	18,2%	60,4%
	4,2%	31,0%	12,0%	40,7%	12,1%	52,8%
	6,7%	21,3%	18,1%	41,7%	12,3%	53,9%
	8,0%	19, 5%	20,4%	47,1%	5, 0%	52,1%
216	8,3%	21,9%	18,9%	40,9%	10,0%	50,9%
	0, 0%	28,0%	30, 1%	22,8%	19,1%	41, 9%
	34,6%	0, 0%	30, 6%	33,7%	1,1%	34,8%
	7,3%	17,8%	17,9%	47,0%	10,0%	56,9%
	6,6%	16, 6%	17,2%	50,0%	9, 7%	59,7%
	7,7%	18,1%	19,2%	44,5%	10,5%	55,0%
	7,5%	20,3%	16,5%	45,0%	10,6%	55,6%
217	0,0%	42,3%	21,0%	24,3%	12,3%	36,6%
	6, 8%	16,7%	17,1%	50,1%	9,3%	59, 4%
	7,4%	20, 5%	18,7%	44,1%	9,4%	53,5%
	11, 9%	10, 1%	31,8%	30,5%	15,7%	46,2%
	13,2%	21,6%	20,4%	31,3%	13,5%	44,8%
	12,1%	13, 9%	27, 6%	33,8%	12,7%	46,2%
218	0,7%	39,0%	17,8%	30, 3%	12,1%	42,5%
	4,7%	26,8%	19,4%	30,5%	18,7%	49,1%
	7,1%	22,8%	22,4%	38,3%	9,4%	47,7%
	7,2%	19, 9%	19,6%	44,1%	9,2%	53,4%
	8,5%	19,7%	19, 9%	42,2%	9,7%	51, 9%
	7,2%	25,9%	15,8%	37,6%	13,5%	51,1%
	8,0%	21,1%	20, 9%	41, 9%	8,2%	50,0%
	8,7%	19, 9%	19,0%	42,9%	9,4%	52,4%
223	4,5%	29,5%	17,2%	15,8%	33,0%	48,8%
	0,0%	38,4%	30,1%	31, 6%	0,0%	31, 6%
	20,2%	22,8%	33,6%	17,3%	6, 0%	23, 4%
	19,0%	37,0%	34,9%	брак	9,1%	брак
224	8,0%	20, 5%	22,1%	41, 0%	8,4%	49, 5%
	6,6%	18,2%	17,1%	51,4%	6,8%	58,2%
	7,9%	22,1%	21,6%	37,0%	11,4%	48,4%
	14,4%	19, 0%	24,9%	33,1%	8,5%	41,7%
	3, 1%	26, 3%	24,2%	40,8%	5, 6%	46,4%
	10,3%	20, 1%	25, 8%	38,1%	5,7%	43, 7%
225	9, 7%	22,2%	18,8%	41, 8%	7,5%	49, 3%
	4,3%	23,5%	17,8%	47,9%	6, 4%	54,3%
	12,0%	21,9%	17,1%	39,1%	9, 9%	49,0%
	12,9%	23, 8%	17,5%	34,1%	11,7%	45,8%
	15,9%	22,6%	18,3%	38,0%	5,2%	43,2%
226	4,9%	24, 9%	21,9%	45, 8%	2,5%	48,3%
	6,5%	29,5%	22,8%	32, 4%	8,8%	41,2%
227	13, 6%	23,1%	21,9%	38,3%	3, 2%	41, 4%

Табл. 4 представляет собой итог или дополнительную компиляцию данных, представленных в табл. 3 (выше). Например, термин положение означает положение аминокислотного остатка в 8ЕР ГО ЫО:2; термин исходная аминокислота, как и в табл. 3, означает неизмененный исходный остаток, а термин

105 новая аминокислота, как и в табл. 3, означает измененный (новый) аминокислотный остаток в этом положении. Термины ШТ_Р и ШТ_8 обозначают субстратную (в отношении высвобождения жирной кислоты) предпочтительность исходного фермента, например 8Ер ΙΌ N0:2, в отношении конкретного субстрата (жирной кислоты) путем указания количества жирной кислоты, высвобожденной (гидролизованной) из масла сои (как и в табл. 3), где Р означает пальмитиновую кислоту, а 8 означает стеариновую кислоту.

В колонках пальмитат и стеарат показано количество пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты, высвобожденных (путем ферментативного гидролиза) из масла сои, которое содержит линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, как обсуждалось выше. Р+8 показывает суммарное количество гидролизованных жирных кислот, которыми были пальмитиновая кислота и стеариновая кислота, или Р+8. Термины дельта_Р и дельта_8 означают изменение предпочтительности предлагаемого в настоящем описании фермента (например, Э61А из первой строки) в отношении гидролиза пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты соответственно по сравнению с соответствующей активностью 8Ер ΙΌ N0:2. Термин дельта Р+8 означает общее или суммарное изменение в предпочтительности предлагаемого в настоящем описании иллюстративного фермента (например, Э61А из первой строки) в отношении гидролиза пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты по сравнению с соответствующей активностью 8Ер ΙΌ N0:2. В разделе пальмитатные мутации суммированы предлагаемые в настоящем описании иллюстративные ферменты, обладающие предпочтительной активностью (гидролиз жирной кислоты) в отношении высвобождения пальмитиновой кислоты относительно других жирных кислот. В разделе стеаратные мутации суммирован предлагаемый в настоящем описании иллюстративный фермент, обладающий предпочтительной активностью в отношении высвобождения стеариновой кислоты относительно других жирных кислот (из масла сои, тест описан выше).

Таблица 4

- 106 020145

Пример 5. Иллюстративная эволюция для улучшенного гидролиза пальмитата с использованием технологии СеηеΚеа88етЬ1у^δΜ.

Четырнадцать (14) одиночных аминокислотных мутаций, идентифицированных с помощью скрининга 6δδΜ^δΜ, которые охватывают семь (7) положений аминокислот, были объединены с помощью технологии СеηеΚеа88етЬ1у^δΜ (патент США номер 6605449). Полноразмерные последовательности нуклеиновых кислот, созданные в фазе СеηеΚеа88етЬ1у, клонировали в экспрессионный вектор ρΑδΚ-5 (см. описание выше) для экспрессии в хозяине Ε8^γ&Ηι со11 ΗΜδ 175 (Nоνадеη, США). Экспрессию вариантов СеηеΚеа88етЬ1у индуцировали ангидротетрациклином после достижения оптимальной плотности клеток-хозяев.

мутаций, которые давали наибольшее повышение гидролиза пальмитата, показанные в табл. 2, были отобраны для включения в пальмитазную СеηеΚеа88етЬ1у библиотеку, созданную с помощью методов, описанных выше. Исходные клоны были подвергнуты скринингу на предмет активности на умбеллиферила пальмитате с получением приблизительно 145 клонов с уникальной последовательностью, активность которых тестировали на масле сои, как описано выше.

На фиг. 8 показаны данные первичного и вторичного скрининга в тестах с маслом сои для отобранных клонов из пальмитазной библиотеки. Клоны, которые давали пальмитат на уровне выше 70% от гидролизованных ЖК в первичном тесте (при стандартных условиях начальной скорости метода тестирования), были отобраны для повторного тестирования на масле сои. Для каждого теста с маслом сои экстрагированные ЖК разбавляли 50-кратно и 100-кратно для анализа с помощью ЖХ-МС или ГХ. Отмечались также обнаруженные дополнительные ненаправленные мутации. Представлены выявленные отношения гидролиза ЖК и количества каждой выявленной ЖК. На чертеже высокая и низкая означают величины, выходящие за пределы диапазона калибровочной кривой. Ряды располагают в порядке процента высвобожденного пальмитата во вторичном тесте и затем по общему количеству высвобожденного пальмитата. Множество клонов проявило значительно повышенную избирательность в отношении пальмитата (до 100%) по сравнению с исходной δΕρ ΙΌ NΘ:2 (61,2%).

- 107 020145

Наилучшие 25 пальмитазных попаданий, отобранных на основании вторичного теста, описанного выше, субклонировали в системы Ркеиботопак (Т)о\у С1оЬа1 ТесНпо1о§1ек ^с., патентная публ. США АРР. № 20050130160 и Эом С1оЬа1 ТесЬпо1о§1ек ^с., патентная публ. США АРР. № 20050186666). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент или полипептид, вставляли либо в вектор рМУС (Эом С1оЬа1 ТесЬпо1о§1ек ^с., патентная публ. США АРР. № 20050130160), либо в вектор р1Х)\\1169 (Т)о\у С1оЬа1 ТесЬпо1о§1ек ^с., патентная публ. США АРР. № 20080058262) и затем вводили в хозяина Ркеиботопак йиогексепк с помощью электропорации. Трансформированные клетки отбирали либо выращиванием в минимальной среде для конструктов рЭ0\1169, либо выращиванием в обогащенной среде плюс тетрациклин для конструктов рМУС. Экспрессию фермента или полипептида индуцировали ГРТС после достижения оптимальной плотности клеток-хозяев.

В табл. 5 показаны данные тестирования на масле сои, проведенных в двух параллелях, для 25 наилучших попаданий, экспрессированных в системах Ркеиботопак. 4 попадания, сконструированных в векторе р1Х)\\1 169, приведены жирным шрифтом с подчеркиванием; все остальные попадания были сконструированы в векторе рМУС. Фермент добавляли к 5 г сырого масла, что обеспечивало конечное содержание воды 20%. Смесь затем гомогенизировали с помощью 7-мм зонда и инкубировали в течение 40 ч при 25°С при перемешивании палочкой. Аликвоты отбирали и анализировали на ЖК путем превращения ЖК в ΓЛМЕ и количественного определения ΓЛМЕ с помощью ГХ, как описано в примере 8. 25 ферментов загружали в 5 г масла сои на основе равного количества единиц активности на ИМВпальмитате. В этих реакциях пальмитат в масле значительно снижался с 11% в необработанном масле до 5% или ниже в маслах, обработанных ферментом, что указывает на повышенную предпочтительность в отношении гидролиза пальмитата по сравнению с исходным ферментом 8ЕР ГО N0:2.

Таблица 5

Фермент	Пальмитат	Стеарат	Олеат	Линолеат	Линоленат	Положение аминокислоты и присутствующая аминокислота
53	61	72	116	126	133	151	160	163	164
1	6,0%	4,3%	24,9%	59,7%	5,1%		А	Е	А	А			к.
1	6,4%	4,3%	24,8%	59,3%	5,2%		А	Е	А	А			к.
2	6,6%	4,3%	24,8%	59,2%	5,1%		А	Е	V	А			к
2	6,9%	4,3%	24,7%	59,0%	5,1%		А	Е	V	А			к
3	9,0%	4,3%	24,1%	57,3%	5,2%		Е	Е	V	А				к
3	8,4%	4,3%	24,3%	57,8%	5,2%		Е	Е	V	А				к
4	3,9%	4,3%	25,1%	61,6%	5,1%	А	А	К	А				к
4	5,8%	4,4%	25,0%	59,7%	5,2%	А	А	К	А				к
5	5,6%	4,3%	25,0%	60,0%	5,1%			Е	V				я
5	5,8%	4,3%	25,0%	59,8%	5,1%			Е	V				к.
6	4,9%	4,3%	24,9%	60,8%	5,1%			Е	V
6	5,7%	4,3%	24,8%	60,1%	5,1%			Е	V
7	5,0%	4,3%	24,9%	60,7%	5,1%		Е	Е	V	А	А
7	4,9%	4,3%	24,9%	60,8%	5,1%		Е	Е	V	А	А
8	5,2%	4,0%	24,7%	61,3%	4,8%		Е		V	А			к.
8	5,2%	4,0%	24,7%	61,3%	4,8%		Е		V	А			к
9	5,3%	4,1%	24,8%	60,9%	4,9%				V	А			к
9	5,5%	4,2%	24,9%	60,6%	4,9%				V	А			к
10	5,7%	4,0%	23,3%	56,2%	10,8%		Е	Е	V	А			к
10	5,6%	4,3%	25,0%	60,1%	5,0%		Е	Е	V	А			к
11	8,3%	5,7%	23,3%	57,7%	5,0%	Т	Е	Е	А	А		Р		к
11	5,9%	3,8%	24,5%	60,6%	5,2%		Е	Е	А	А				к

12	7,8%	5,1%	24,8%	57,3%	5,0%	Е	Е	V				я
12	5,7%	4,4%	25,0%	59,7%	5,1%	Е	Е	V				я
13	4,8%	3,3%	24,7%	62,2%	4,9%	Е	К	V			Я
13	5,9%	4,0%	24,5%	60,8%	4,9%	Е	К	V			К
14	5,5%	3,8%	25,2%	60,6%	5,0%	Е	К	V
14	5,9%	4,5%	24,8%	59,9%	4,9%	Е	К	V
15	5,8%	3,6%	25,0%	60,7%	5,0%	Е	Е	Т			Я
15	5,6%	4,3%	24,9%	60,4%	4,9%	Е	Е	Т			я
16	6,1%	4,0%	24,1%	60,9%	4,9%	Е	Е	V		А
16	6,2%	4,0%	24,1%	60,9%	4,8%	Е	Е	V		А
17	5,7%	4,4%	24,9%	59,9%	5,1%	Е	К				я
17	5,0%	4,3%	25,0%	60,8%	4,9%	Е	К				я
18	8,3%	4,2%	23,5%	55,7%	8,2%	Е	Е	V			я
18	7,9%	4,2%	23,7%	56,0%	8,2%	Е	Е	V			я
19	6,8%	4,2%	24,0%	56,9%	8,1%		К	V		А	я
19	6,8%	4,2%	24,0%	56,9%	8,1%		К	V		А	я
20	6,1%	4,2%	24,0%	57,5%	8,2%	Е	К		А		я
20	5,4%	4,1%	23,9%	58,5%	8,0%	Е	Я		А		я
21	6,7%	4,0%	23,3%	58,0%	8,0%	А	Е	А		А
21	6,5%	3,9%	23,2%	58,5%	7,9%	А	Е	А		А
22	5,4%	4,0%	23,9%	58,6%	8,0%	Е	Е	А		А	я
22	5,3%	4,1%	24,0%	58,7%	8,0%	Е	Е	А		А	я
23	6,6%	3,9%	23,2%	58,4%	7,9%	Е		V		А
23	6,4%	3,9%	23,1%	58,8%	7,8%	Е		V		А
24	6,0%	4,3%	24,3%	57,3%	8,1%	А	Е	V

- 108 020145

N0 (не определяли).

В табл. 6 ниже показаны данные по термостабильности для 25 наилучших пальмитазных попаданий, отобранных во вторичном тесте, описанном выше. Эти данные были получены с использованием попаданий, экспрессированных в хозяине Е. сой НМ8174. Клоны были распределены в 96-луночных планшетах, инкубированы в течение 10 мин при комнатной температуре (КТ), 45, 50 или 55°С и затем тестированы при КТ на МеиМВ-пальмитате. Процент оставшейся активности определяют делением активности после инкубации при каждой температуре на активность после инкубации при КТ. Также показаны имеющиеся мутации в каждой пальмитазе и примеры пальмитатной избирательности и активности на масле сои. 8ЕР ΙΌ N0:2 сохраняла приблизительно 15% активности после инкубации в течение 10 мин при 50°С, но не содержала активности после инкубации при 55°С.

Таблица 6

Положение аминокислоты и присутствующая % стабильности аминокислота

Фермент	55С	50С	45С	61	72	116	133	151	163	164	Другое
27		23,0%	62,7%	Е	К	V
28		22,8%	62,1%	Е	К	V			К
29			55,9%	Е	К				К
30	24,1%	68,8%	75,6%	Е	Е	V	А
31	22,0%	68,1%	82,5%	Е	Е	V	А		К
32		27,1%	58,4%	Е	Е	V			Я
33		26,1%	56,6%	Е	Е	V		А	К
34		24,7%	54,0%	Е	Е	V	А			я
35	8,1%	64,1%	67,6%	Е	Е	т			К
36	10,3%	53,8%	75,7%	Е	Е	А	А		К
37	9,2%	54,8%	61,5%	Е	Е	А			к
38		45,4%	68,4%	Е	Е	А	А	А
39		22,9%	61,9%	Е	Е	А	А			я
40		35,3%	77,1%	Е		V	А		к
41		30,6%	70,2%	Е		V	А
42	20,3%	71,8%	79,3%	Е		А	А	О	к
43			64,2%	Е		А	А
44			63,2%	А	К	V
45			56,0%	А	К	V	А	А	к
46			80,7%	А	К	А			к
47	22,2%	71,8%	88,1%	А	Е	V	А		к
48		60,6%	83,2%	А	Е	V		А	к
49		50,7%	68,0%	А	Е	V
50		50,2%	77,2%	А	Е	V			к
51		21,1%	53,6%	А	Е	V		А		я
52			56,5%	А	Е	0	А	А	я
53		73,6%	118,3%	А	Е	А	А
54		69,2%	110,7%	А	Е	А	А		я
55			82,2%	А		V
56			51,4%	А		А	А
57			82,8%		К	V	А	О
58			60,1%		К	V			я
59			58,3%		К	V	А				Р1628
60			57,9%		К	V	А		я		Υ62Ρ
61			56,3%		К	V	А		я
62			51,9%		К	9	А		я
63			74,8%		К	А
64			58,8%		К	А	А
65		49,6%	72,0%		Е	V			я
66		46,3%	66,0%		Е	V
67			55,1%		Е	V	А		я
68			51,7%		Е	V	А	А
69		23,6%	54,6%		Е	А
70			76,2%		Е	А				я
71			59,2%			V	А
72			51,8%			V	А		я

- 109 020145

Пример 6. Лабораторный протокол для оценки кандидатных пальмитазных, стеаратазных или сатуразных ферментов.

Предлагаемые в настоящем описании иллюстративные ферменты и полипептиды экспрессировали в системе Рзеиботопаз (Пом П1оЬа1 ТесЬпо1о§1е§ 1пс., патентная публ. США АРР. № 20050130160). Нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент или полипептид, вставляют в вектор рМУС (Пом П1оЬа1 Тес1по1о§1е§ 1пс., патентная публ. США АРР. № 20050130160) и затем вводят ауксотрофному хозяину Рзеиботопаз Пиогексепк электропорацией. Трансформированные клетки отбирали выращиванием в минимальной среде. Экспрессию фермента или полипептида индуцировали 1РТП после достижения оптимальной плотности клеток-хозяев.

Для оценки способности предлагаемого в настоящем описании фермента или полипептида гидролизовать образец масла используется следующая процедура. Пальмитазный фермент добавляют к 1 кг сырого масла с получением конечного содержания воды 20%. Смесь затем гомогенизируют с помощью верхнего миксера и инкубируют при комнатной температуре при постоянном перемешивании лопастным смесителем. Аликвоты (0,5 мл) отбирали через 0, 21, 43, 65 и 72 ч и обрабатывали для превращения в РАМЕ и анализа ГХ, как описано в примере 8.

Указанная выше процедура была использована с 8Е^ ΙΌ N0:2, образец представлял собой сырое масло сои. Через 72 ч образцы и необработанного, и обработанного ферментом масла дали результаты, представленные в табл. 7.

Таблица 7

Состав жирных	Необработанное	Обработанное
кислот	масло (%)	ферментом масло (%)
С16: 0	11,1	3,7
С18:0	4,1	4,2
С18 :1	22,1	24,3
С18 :2	54,5	59,5
С18.3	8,2	8,3

Результаты показывают значительное снижение количества пальмитиновой кислоты (С16:0), причем такое снижение рассматривается как желательное.

Пример 7. Оценка липаз, сатураз или пальмитаз с гомологией последовательностей иллюстративному полипептиду 8Е^ П) N0:2.

Несколько гомологичных липазных последовательностей были субклонированы в вектор рМАРс2х (№м Епд1апб Вю1аЬ§, США) с помощью метода χΐ-клонирования (Оеп1ап11§, США). Конструктами, содержащими 8Е^ П) N0:2, 8Е^ П) N0:6, 8Е^ П) N0:14 или 8Е^ П) N0:16, трансформировали хозяина ЕзсРепсЫа со11 АгсИсЕхргезз КР (81га1адепе, и8А) для экспрессии. Экспрессия липаз находится под контролем промотора, который индуцируется ШТС после достижения оптимальной плотности клетокхозяев. Рекомбинантные ферменты тестировали на масле сои на предмет избирательности ЖК (табл. 8). Липазы, включающие 8Е^ П) N0:2, 8Е^ П) N0:6, 8Е^ П) N0:14 или 8Е^ П) N0:16, экспрессировали и отщепляли от гибридной метки МБР, используя стандартные условия. Одиночную колонию инокулировали в среду ЬВ, содержащую 20 мкг/мл гентамицина, и встряхивали при 200 об/мин в течение ночи при 30°С. Эту ночную культуру инокулировали в свежую среду ЬВ, содержащую 20 мкг/мл гентамицина, до достижения величины ОП600 0,05. Эту культуру встряхивали при 200 об/мин и 30°С до достижения величины ОП600 0,5. Культуры переносили для встряхивания при 12°С при 200 об/мин и давали им прийти в равновесие с пониженной температурой перед индукцией экспрессии липазы добавлением 0,5 мМ ШТП с последующим выращиванием в течение 24 ч. Клетки собирали центрифугированием, суспендировали в трис-буфере рН 8, содержащем ЫаС1, СаС1₂, ДНКазу Ι и лизозим, и затем лизировали ультразвуком. Клеточные лизаты осветляли центрифугированием. Ферменты отщепляли от МВР инкубацией гибрида липаза-МВР с фактором Ха в течение 6 ч при комнатной температуре и еще дополнительно 18 ч при 12°С. Все осветленные лизаты с интактными, активными рекомбинантными ферментами показали сильную и сходную предпочтительность в отношении гидролиза пальмитата по сравнению с другими ЖК при тестировании на масле сои (табл. 8).

Таблица 8

	Сходство с 8Еф ГО N0:2	Гидролизованные жирные кислоты (%)
Фермент	Идентичность	Сходство	Пальмитат	Стеарат	Олеат	Линолеат	Линоленат
Масло сои	ΝΑ	ΝΑ	11,0%	4,3%	24,9%	59,7%	5,1%
8Еф ГО N0:2	100%	100	50,9%	5,1%	16,9%	18,1%	9,0%
8Еф ГО N0:14	27%	42%	45,8%	2,0	14,2%	37,9%	0,0%
8Еф ГО N0:12	47%	62%	50,4%	4,1%	16,1%	23,4%	6,0%
8Еф ГО N0:6	41%	56%	37,0%	6,2%	28,5%	20,7%	7,6%

Пример 8. Метод превращения свободных жирных кислот или триглицеридов в метиловые сложные эфиры жирных кислот (РАМЕ) и количественного определения РАМЕ газовой хроматографией.

Жирные кислоты, высвобожденные из липидов, триглицеридов, жиров или масел под действием

- 110 020145 липаз, например сатураз, пальмитаз и/или стеаратаз, могут быть прямо количественно определены с помощью ЖХ-МС с использованием метода, описанного в примере 2. Альтернативно, эти гидролизованные жирные кислоты могут быть превращены в сложные эфиры жирных кислот (ЕАМЕ) с использованием каталитического метанолиза и затем количественно определены газовой хроматографией (ГХ). В этом примере масло после взаимодействия с липазами, например сатуразами, пальмитазами и/или стеаратазами, обрабатывают добавлением 1 мл растворителя для экстракции (СНС1_з:МеОН:4н. НС1 (2:1:0,075)) на 0,5 мл объема реакционной смеси;

аликвоту 45 мкл экстрагированного масла переносят в 4-мл сосуд с завинчивающейся крышкой. В каждый сосуд помещают небольшую мешалку-палочку и затем 2 мл гексана и 400 мкл 20% (об./об.) МеОН в НС1;

сосуды затем закрывают и нагревают при перемешивании в течение 15 мин. Затем сосуды удаляют из нагревателя и дают им остыть перед добавлением 800 мкл Н2О;

смесь затем встряхивают и образец (500 мкл) верхнего гексанового слоя, содержащего ЕАМЕЗ, переносят в сосуд автоматического пробоотборника для ГХ. К каждому образцу добавляют 500 мкл 0,5 мг/мл С15:0 ЕАМЕ в качестве внутреннего стандарта.

Синтезированный с использованием этого метода ЕАМЕ затем анализируют газовой хроматографией с использованием следующих рабочих параметров:

оборудование представляет собой Не\\'1е11 Раскагб 6890 Зепек СС с автоматическим пробоотборником;

используемая колонка представляет собой капиллярную колонку Зире1со ЗР-2з80 Еикеб ЗШса з0 мх0,25 мм и пленку толщиной 0,2 мкм;

инжектор и детектор устанавливают на 260°С;

поток газа-носителя гелия устанавливают на 0,6 мл/мин;

печь устанавливают на начальную температуру 150°С;

образцы (1 мл) вводят при щели для ввода 10:1.

Использованный метод ГХ включает наклон 1: 4С/мин в течение 10 мин = 190°С, наклон 2: 15С/мин в течение 4 мин = 250°С, удержание: 250°С в течение 2 мин.

ЖК триглицеридов также можно анализировать путем превращения в ЕАМЕ, даже в присутствии гидролизованных жирных кислот.

Используя сочетание указанного выше метода и метода, представленного ниже, можно определять избирательность в отношении жирной кислоты липазы, например сатуразы, пальмитазы и/или стеаратазы, и действие фермента на масло. В методе анализа ЖК, присоединенной к глицерину (или другим спиртам), используется катализируемый основанием метанолиз:

масло после взаимодействия с липазами, например сатуразами, пальмитазами и/или стеаратазами, обрабатывают добавлением 1 мл растворителя для экстракции (СНС1_з:МеОН:4н. НС1 (2:1:0,075)) на 0,5 мл объема реакционной смеси;

аликвоту 45 мкл экстрагированного масла переносят в микроцентрифужную пробирку. Добавляют 500 мкл гептана и затем 50 мкл 2н. КОН в метаноле;

смесь тщательно встряхивают в течение з0 с и затем центрифугируют;

аликвоту (50 мкл) верхнего гептанового слоя, содержащего ЕАМЕ, переносят в сосуд автоматического пробоотборника и объединяют с 450 мкл гексана, содержащего внутренний стандарт С15:0;

анализ ЕАМЕ с помощью ГХ проводят, как описано выше.

Пример 9. Иллюстративная эволюция для улучшенной устойчивости к нагреванию пальмитазы с использованием технологии СЗЗМ^зм

Иллюстративная пальмитаза изобретения, включающая мутации Э61Е, К72К и У16зК ЗЕО ΙΌ NО:2 (фермент 17, табл. 5 выше), была выбрана в качестве лидирующего по избирательности мутанта из предшествующих циклов эволюции (примеры 4 и 5 выше). Дополнительную эволюцию для улучшения устойчивости к нагреванию лидирующего по избирательности фермента (ЗЕО ΙΌ NО:2 с мутациями Э61Е, К72К и У16зК) проводили с использованием технологии СЗЗМ (см., например, патент США № 6171820).

Вкратце, эволюцию СЗЗМ проводили введением точечных мутаций с помощью вырожденных олигонуклеотидов, за один раз одно положение аминокислоты, так что каждый исходный кодон мог быть заменен каждой из 20 кодируемых природных аминокислот. Библиотеку конструировали в векторе рООА-Кап, анализировали в агарозном геле, обрабатывали ЭРМ и затем трансформировали ей компетентные клетки ХЬ1В1ие Е. со11. Колонии выращивали, собирали и секвенировали. Колонии объединяли и получали ДНК с использованием набора 01адеп т1ш-ргер (Са1а1од # 27106, О|адеп, Уа1епаа, СА). Затем этой ДНК трансформировали компетентные клетки Ркеиботопак Пиогексепк. Хозяин Ркеиботопак Г1иогексепк был получен от Эо\\· С1оЬа1 Тес1то1ощек 1пс. (патентная публ. США АРР. № 200501з0160, патентная публ. США АРР. № 20050186 и патентная публ. США АРР. № 20060110747). Вектор рЭОА-Кап

- 111 020145 был сконструирован добавлением маркера устойчивости к канамицину к р^ОV1169 (1)о\с С1оЬа1 Тесйпо1од1ек 1пс., патентная публ. США АРР. № 20080058262). Клетки выращивали в минимальной среде М9 (1)о\у С1оЬа1 Тесйпо1од1ек 1пс., патентная публ. США АРР. № 20050186666) с добавкой урацила и канамицина. Все последующие примеры, в которых описывается использование вектора р^ОV-Каη, Ркеийотопак йиогексепк и сред М9, относят к тем же самым вектору р^ОV-Кап, Ркеийотопак йиогексепк и средам М9, которые описаны выше.

Библиотеку С88М подвергали скринингу в 384-луночном формате. Первичный и вторичный скрининг проводили с использованием ИМВ-пальмитата (как описано выше в примере 3). Для идентификации мутаций, которые поддерживают активность фермента, при повышенной температуре проводили тестирование путем инкубации флуорогенного субстрата с цельным клеточным лизатом при 54°С в течение 30 мин с предшествующей 30-минутной инкубацией цельного клеточного лизата с буфером в течение 30 мин при 54°С для обеспечения достижения ферментом 54°С до внесения субстрата. Измеряли флуоресценцию каждого мутанта (см. колонку 2, табл. 9) и любой мутант с величиной флуоресценции, превышающей 2 стандартных отклонения над контролем, определяли как попадание, то есть мутант с существенно повышенной устойчивостью к нагреванию. В результате скрининга с ИМВ-пальмитатом было идентифицировано 117 попаданий с уникальными изменениями аминокислот (см. табл. 9 ниже). Аминокислотные изменения в 117 попаданиях с одиночными мутациями приходились на 50 остатков; 22% белка затрагивалось изменениями аминокислот. 117 попаданий дополнительно оценивали на производительность на сыром масле в стандартных тестах с 5 г (см. пример 5) при 25 и 45°С. Результаты показаны в табл. 10 ниже.

Таблица 9

Фермент	имвпальмитат	ИСХОДНЫЙ кодон	новый кодон	исходная аминокислота	новая аминокислота	положение аминокислотного остатка	дополнительные мутации
ТТ1	43670	ТАС	стт	Υ	ь	7
ТТ2	40432	ССС	сто	А	ь	15
ТТЗ	21247	ОСС	АТО	А	м	15
ТТ4	65535	ОАТ	ТОО	ϋ	XV	16
ТТ5	23779	АТО	АТТ	М	I	31
ТТ6	65535	ООС	ОАО	О	Е	32
ТТ7	65535	ООС	ССТ	о	Р	32
ТТ8	26222	СТО	АТО	ь	м	34
ТТ9	60900	СТО	АТТ	ь	I	43
ТТ10	28008	ттс	ТТТ	Г	Р	46
ТТ11	65535	ОСС	ТОТ	А	с	48
ТТ12	55409	ОСС	АТО	А	м	48
ТТ13	65535	ОСС	АСТ	А	т	48
ТТ14	65535	ОАС	ААТ	ϋ	N	49
ТТ15	57979	ОАС	СОТ	ϋ	В	49
ТТ16	65535	ОАС	ТСТ	ϋ	8	49
ТТ17	23108	ОСС	АТО	А	М	52
ТТ18	65535	ТСО	ТТТ	8	Р	68
ТТ19	65535	тсо	ТАТ	8	Υ	68
ТТ20	24003	соо	ОСТ	к	А	85
ТТ21	37005	соо	ОАТ	К	ϋ	85
ТТ22	65535	соо	САС	К	Ω	85
ТТ23	39478	соо	ТСТ	в	8	85
ТТ24	65535	соо	АСО	к	Т	85
ТТ25	65535	соо	ТАТ	к	Υ	85
ТТ26	52743	ОАО	ААО	Е	К	95	(ОСО)92(ОСТ)
ТТ27	30520	ОСО	ОТТ	А	V	92
ТТ28	18239	ОСО	ОАО	А	Е	92
ТТ29	25819	ОАО	ОАТ	Е	ϋ	95
ТТЗО	21805	ОАО	ОСТ	Е	А	95
ТТ31	42531	ОСО	ААО	А	К	96

- 112 020145

ТТ32	23046	ССС	АОО	А	к.	96
ТТЗЗ	19889	ОСС	тсо	А	8	97
ТТ34	17199	ААО	сот	К	К	101
ТТ35	33316	ОТО	тто	V	Б	104
ТТ36	45591	ΤΑΤ	стт	Υ	Б	113
ТТ37	31618	ОАО	ОСО	Е	А	116
ТТ38	65535	ОАО	тот	Е	С	116
ТТ39	65535	ОАО	ΟΑΤ	Е	ϋ	116
ТТ40	36485	ОАО	ттт	Е	Г	116
ТТ41	65535	ОАО	АТТ	Е	I	116	(ТТС)135(ТТТ)
ТТ42	48338	ОАО	АТТ	Е	I	116
ТТ43	38696	ОАО	СТТ	Е	Б	116
ТТ44	58069	ОАО	ААТ	Е	N	116
ТТ45	65535	ОАО	САО	Е	<2	116
ТТ46	42681	ОАО	АОТ	Е	8	116
ТТ47	65535	ОАО	АСТ	Е	Т	116
ТТ48	65535	ОАО	ОТТ	Е	V	116
ТТ49	60385	ОАО	ТОО	Е	χν	116
ТТ50	42924	ОАО	ТАТ	Е	Υ	116
ТТ51	18591	СТО	АТС	Б	и	117
ТТ52	65535	ААО	АОО	К	к	120
ТТ53	50984	АОТ	ОСТ	8	А	133
ТТ54	65535	ОСО	ТСО	А	8	136
ТТ55	32933	ООС	ТТТ	О	Р	137
ТТ56	65535	СТС	АТО	Б	м	139
ТТ57	54461	САС	АОО	Н	к.	140
ТТ58	20741	ААС	ТОО	N	XV	142
ТТ59	25491	ОСО	АТТ	А	I	144
ТТ60	19150	ОСО	ТТО	А	Е	144
ТТ61	54979	ОСО	АТО	А	м	144
ТТ62	33234	ОСО	ОТО	А	V	144
ТТ63	51208	ОАО	САТ	Е	н	149
ТТ64	21503	ОСО	АТТ	А	I	150
ТТ65	51405	ОСО	АТО	А	м	150
ТТ66	65535	ОСО	ТОО	А	XV	150
ТТ67	25795	АОС	ААТ	8	N	153
ТТ68	18156	АОС	СОТ	8	О	153
ТТ69	65535	ААС	САС	N	ϋ	158
ТТ70	65535	ССО	ООТ	Р	О	162
ТТ71	18622	ссо	ААО	Р	к	162
ТТ72	55639	ССО	ТСО	Р	8	162	К163Р
ТТ73	26167	ссо	ТСО	Р	8	162	1167Б
ТТ74	20774	ссо	ТСО	Р	8	162
ТТ75	65535	ото	АТТ	V	1	183
ТТ76	20029	САО	ССО	<2	А	166

113 020145

ΤΤ77	21399	САО	ОАО	Ω	Е	166
ТТ78	32863	САС	АСС	Ω	т	166
ТТ79	25576	АТТ	ТТТ	I	Е	167
ТТ80	16567	АТТ	ААС	I	К	167
ТТ81	26239	АТТ	сто	I	Е	167
ТТ82	19330	АТТ	сст	I	К.	167
ТТ83	31994	АТТ	ТАТ	I	Υ	167
ΤΤ84	65535	ССС	САТ	к	н	172
ТТ85	38603	ССС	ААС	к	к	172
ТТ86	24428	ССС	СТТ	к	Б	172
ТТ87	37581	ССС	ТАТ	к	Υ	172
ТТ88	30655	СТС	ААС	е	к	180
ТТ89	65535	СТС	АСС	т	к	180
ТТ90	64023	ССС	ТОТ	А	с	185
ТТ91	41225	ССС	ААТ	А	N	185
ТТ92	65535	САА	ССС	Е	А	190
ТТ93	65535	САА	ААС	Е	К	190
ТТ94	65535	САА	АТС	Е	м	190
ТТ95	65535	САА	САО	Е	Ω	190
ТТ96	65535	САА	АСС	Е	к	190
ТТ97	17914	СТА	АТТ	Е	I	200
ТТ98	18910	СТА	СТА	Б	V	200	Ε201Υ
ТТ99	35222	СТА	ОТТ	Б	V	200
ТТ100	38817	САС	ТАТ	Е	Υ	201
ТТ101	65535	ССС	САТ	А	н	203
ТТ102	65535	ССС	ССС	А	Р	203
ТТ103	65535	ССС	АСС	А	к	203
ΤΤ104	47048	АТС	СТТ	М	Б	207
ТТ105	65535	АСС	САТ	т	Н	214
ТТ106	65535	АСС	ААС	Т	К	214
ТТ107	48095	АСС	АСС	Т	к	214
ТТ108	35774	АСС	ТСС	т	8	214
ТТ109	65535	АСС	СТТ	т	V	214
ТТ110	53546	ООО	ССС	с	А	215
ттш	65535	СТС	АТТ	Б	I	222
ТТ112	24987	ССС	ТСТ	А	8	225
ТТ113	26618	ССО	ТАТ	К	Υ	163
ТТ114	22246	ССС	АТС	К	м	163
ΤΤ115	42199	ССС	АСС	К	т	163
ΤΤ116	42127	ССС	ТТ6	к	Е	163
тли	33933	ССС	ТОТ	к	С	163

Таблица 10

114 020145

Отрицательный контроль	отрицательный	10,7%	10,8%	10,8%	10,5%
Отрицательный
контроль	отрицательный	10,7%	10,8%	10,7%	10,6%
Отрицательный
контроль	отрицательный	10,8%	10,8%	10,8%	10,7%
ТТ35	У104Ь	6,0%	7,3%	5,6%	5,7%	7,9%	7,7%	9,1%	6,ЗО/о	6,3%	6,5%
ТТ36	У113Ь	7,1%	7,3%	6,5О/о	6,7%	8,9о/о	8,8о/о	9,3о/о	7,1%	6,9о/„	6,6о/„
ТТ37	Е116А	8,0%	8,2%	7,3%	7,6%	9,6%	9,5%	10,2%	8,5%	7,4%	8,6%
ТТ38	Е116С	7,1%	7,5%	5,7о/о	6,5%
ТТ39	Ε116Ω	6,4%	6,6%	5,8%	5,9%
ТТ48	Е116У	6,9%	7,5%	6,2о/„	6,6%
ТТ52	К120К	5,7%	6,0%	5,1%	6,5%
ТТ56	Ъ139М	7,6%	8,1%	б,?»/»	7,1%	9,9о/„	10,1%	9,9%	9,5%	9,5%	8,5%
ТТ65	А150М	6,2%	6,4%	5,60/0	5,9%
ТТ74	Р1628	7,0%	7,0%	5,8%	6,2%
ТТ116	К163Ь	6,3%	6,4о/о	5,8%	6,1%
ТТ80	Ι167Κ	6,5%	6,90/с	5,бо/о	6,4%
ТТ4	1)169/	6,3%	6,7о/о	5,7о/о	6,4%
ТТ92	Е190А	6,7%	6,7о/о	5,9%	5,9%
ТТ95	Е190Ц	6,7%	6,9О/о	5,9о/о	6,3%
ТТ100	Ε201Υ	6,5%	7,4о/о	5,8о/о	6,4%
ТТ101	А203Н	6,2%	6,5О/о	5,8о/„	6,3%
ТТ104	М207Ь	7,8%	7,8»/о	6,8о/о	7,4%	9,5о/о	9,3%	10,3о/о	8,7%	6,9о/о	7,9о/о
ТТ107	Т214К	6,6%	6,9о/о	5,5о/„	6,1%
ТТ109	Т214У	6,3%	7,8%	5,4%	5,7%
ТТ6	О32Е	6,6%	6,9%	5,7%	6,5%
ТТ8	Ь34М	6,8%	7,2о/„	6,2о/о	6,6%
ТТ12	А48М	10,2%	10,8о/„	10,1»/»	10,4%
ТТ14	Ω49Ν	6,7%	7,6%	5,3%	6,4%	8,5%	7,8«/„	8,9%	7,7%	5,4%	5,8%
ТТ1	У7Ь	6,5%	7,2о/о	5,0о/о	6,2%
ТТ120	Р1628, К163Р	6,6%	7,5%	6,3%	6,4%	8,7о/о	9,1%	ю,зо/„	6,9о/о	6,6о/„	7,5о/о
Отрицательный
контроль	отрицательный	10,6%	10,7%	10,6%	10,7%
8ЕЦ ГО N0:2 с
Ώ61Ε, К.72К, и
У163К	исходный	6,1%	6,1%	4,8%	6,2%
8ЕЦ ГО N0:2 с Ω61Ε, К.72К, и У163К	исходный	6,0%	6,2%	5,4%	6,0%
ТТ45	Е116Ц	5,9%	5,7%	5,6%	4,9%	8,2%	8,4%	8,4%	7,4%	7,1%	7,0%
ТТ47	Е116Т	5,7%	4,7о/о	5,4о/о	4,2%	8,₀о/о	8,₆о/о	8,6о/о	6,90/0	7,9о/„	6,2О/о
ТТ52	К120К.	6,0%	5,7%	5,6О/„	5,0%	8,4о/о	9,4о/о	8,8о/о	9,7о/о	8,бо/о	6,4О/о
ТТ57	Н140К	7,1%	6,80/0	6,8О/_О	6,0%	8,8о/о	δ,?»/.	9,5о/о	7,9о/о	8,2о/о	7,2о/о
ТТ58	N1429/	10,3%	3,5о/о	10,3%	10,2%
ТТ59	Α144Ι	10,5%	10,2%	10,3%	9,8%
ТТ60	А144Ь	9,1%	8,4%	8,₉о/о	8,1%
ТТ66	А1509/	7,1%	6,5%	6,5О/о		7,3%	7,7%	9,0%	6,9о/о	6,1»/о	6,7%
ТТ2	А15Ь	7,5%	6,7О/_О	7,Р/о	6,5%
ТТЗ	А15М	7,7%	7,3»/о	7,4%	7,3%
ТТ115	К.163Т	7,1%	6,5о/о	6,3«/о	5,9%
ТТ78	Ц166Т	5,8%	4,5о/о	5,5о/о	4,0%
ТТ79	Ι167Ρ	6,7%	5,4%	6,2%	4,7%	8,5%	8,7%	9,4%	8,0%	7,2%	6,2%
ТТ83	Ι167Υ	5,8%	5,7%	5,2о/о	4,9%	8,6о/„	9,0%	8,бо/о	8,0%	9,2%	6,3%
ТТ89	Ы80К.	6,1%	5,2о/_в	5,8о/о	4,6%
ТТ75	У1831	6,1%	5,6%	5,6%	5,0%
ТТ90	А185С	7,2%	6,20/с	6,9о/о		8,8о/_о	8,1о/„	9,2%	8,Зо/„	6,50/о	6,8%
ТТ89	Ы80К	6,2%	5,40/0	5,4%	4,4%
ТТ108	Т2148	6,6%	5,6%	5,0о/о		8,5о/_о	8,5о/о	8,5о/о	7,8%	9,1%	6,2%
ТТ110	0215А	6,2%	6,1»/0	5,4%	5,1%
ТТ9	Ь431	6,2%	5,9»/о	5,5о/о	4,9%	8,0о/₀	7,6%	9,2о/о	7,0о/о	5,9о/о	5,8%
ТТ15	Ω49Κ	7,9%	7,1%	8,0о/_о		9,0%	8,6о/о	9,7о/о	8,3о/о	7,50/с	8,6о/«
ТТ16	Ω498	6,8%	5,8%	6,5%	4,7%
ТТ18	868Р	6,2%	5,6о/о	6,10/0	4,9%
ТТ19	868Υ	6,5%	5,5%	7,0%	4,7%
ТТ22	К85ф	6,8%	6,2о/о	6,3о/_о	5,3%
ТТ23	К.858	6,6%	6,0%	6,30/0	5,3%
ТТ24	К85Т	6,9%	5,9-/0	6,70/0	5,2%
ТТ31	А96К	6,7%	5,5о/о	6,4%	4,8%
8ЕЦ ГО N0:2 с О61Е, К72К, и У163К	исходный	6,4%	5,7%	6,1%	4,7%
ТТ34	К101К	6,9%	5,6%	4,4%	6,3%
ТТ40	Е116Р	7,1%	6,4о/о	5,7о/о	6,8%
ТТ46	Е1168	7,1%	7,0%	5,9о/о	7,0%
ТТ49	Ε116Ψ	7,5%	7,4%	6,60/0	7,6%
ТТ50	Ε116Υ	6,9%	6,6%	5,4%	6,3%
ТТ53	8133А	7,2%	7,2%	6,₀о/о	7,1%

115 020145

ТТ54	А1368	7,1%	6,6%	5,8%	6,9%
ТТ55	О137Р	7,7%	6,6%	5,6%	7,2%
ТТ60	А144Ь	10,5%	10,0%	9,3%	9,8%
ТТ68	81530	6,9%	6,4%	5,5%	6,5%
ТТЗ	А15М	7,3%	6,9%	5,8%	6,9%
ТТ13	А48Т	7,2%	6,0%	5,1%	7,0%
ТТ115	К163Т	8,2%	8,1%	6,8%	7,8%
ТТ73	Р1628,1167Б	6,4%	6,3%	5,4%	6,4%
ТТ117	К.163С	6,7%	6,1%	5,2%	6,4%
ТТ114	К163М	8,2%	7,3%	7,2%	7,2%
ТТ115	К163Т	5,7%	5,1%	4,4%	5,0%
ТТ113	Κ.163Υ	6,9%	6,6%	5,8%	6,6%
ТТ77	Ц166Е	6,2%	5,8%	5,0%	6,0%
ТТ81	1167Ь	7,1%	6,9%	6,1%	6,6%
ТТ82	Ι167Κ	7,8%	7,2%	6,2%	7,2%
ТТ85	К.172К	6,4%	5,7%	5,0%	5,9%
ТТ87	Κ.172Υ	6,5%	6,4%	5,2%	6,0%
ТТ88	Ы80К	6,2%	6,1%	5,2%	6,7%
ТТ89	Б180К	7,2%	6,0%	5,1%	6,9%
ТТ93	Е190К	7,3%	6,7%	5,6%	7,1%
ТТ94	Е190М	6,9%	6,8%	5,5%	6,0%
ТТ96	Е190К	6,9%	6,3%	5,4%	6,5%
ТТ97	Ь2001	5,7%	5,7%	5,0%	5,9%
ТТ5	М311	6,8%	5,8%	5,0%	6,4%
ТТ102	А203Р	7,5%	6,6%	5,9%	6,8%
ТТ103	А203К.	6,6%	6,2%	5,4%	6,2%

ТТ5	М311	7,4%	7,1%	6,2%	7,1%
ТТ6	О32Е	7,2%	6,7%	6,3%	6,4%
ТТ13	А48Т	7,1%	6,8%	5,8%	6,9%
ТТ17	А52М	6,9%	5,7%	5,0%	6,4%
ТТ1		6,5%	6,5%	5,8%	6,6%
ТТ20	В.85А	7,1%	5,7%	5,1%	6,3%
ТТ28	А92Е	7,3%	5,8%	5,0%	6,7%
ТТ27	А92У	6,9%	5,5%	4,8%	6,3%
ТТЗО	Е95А	7,9%	5,7%	4,9%	7,2%
ТТ29	Ε95ϋ	7,6%	5,6%	5,0%	6,9%
ТТ32	А96К	6,7%	6,6%	5,8%	6,2%
ТТЗЗ	А978	7,4%	5,4%	4,8%	6,7%
ТТ114	К163М	7,2%	5,8%	5,8%	7,6%	7,5%	7,0%	8,9%	6,0%	7,2%	5,8%
ТТ116	К.163Ь	7,0%	5,9%	5,1%	7,2%	8,1%	7,4%	9,4%	7,8%	7,0%	5,9%

Изменение кодона данного остатка, которое не приводит к замене аминокислоты, обозначают как молчащая мутация. Молчащие мутации получены в качестве попаданий благодаря повышенной экспрессии относительно исходного фермента и наблюдались в 37 сайтах при скрининге С88М (табл. 11 ниже).

116 020145

Таблица 11

Пример 10. Иллюстративная эволюция для улучшенной устойчивости к нагреванию пальмитазы с использованием технологии ТМСА^бм.

Наиболее производительные мутации, идентифицированные во время СББМ эволюции (пример 9 выше), оценивали в первичном и вторичном тесте с маслом для включения в ТМСА эволюцию. Проводили тесты с 5 г сырого масла, как описано в примере 5, но при содержании воды 5%, с 117 уникальными попаданиями при 25 и 45°С. Профиль масла оценивали через 24 и 48 ч взаимодействия. Первичные попадания подвергали вторичным тестам с маслом при 25, 45 и 55°С. Аликвоты отбирали через 3, 24 и 48 ч для оценки профилей масла. Наиболее эффективные варианты перечислены в табл. 12 ниже с пальмитатом, остающимся в масле, представленным в виде процента от общего количества связанных жирных кислот. Для оценки влияния промежуточной очистки каустиком тесты при 45°С были очищены каустиком путем добавления 11% №ОН (установленного для 7% СЖК) и нагревали при непрерывном перемешивании при 60°С. Свежий фермент добавляли к очищенному маслу при содержании воды 20%, гомогенизировали и проводили взаимодействие с маслом перемешиванием еще в течение 24 ч при 45°С. Конечное содержание пальмитата в очищенных каустиком образцах показано в последней колонке СК 24 ч.

Из наиболее эффективных вариантов, показанных в табл. 12, 15 мутантов (отмеченных жирным курсивом в табл. 12) были отобраны для объединения с использованием технологии ТМСА. Библиотеку ТМСА конструировали, как описано в публикации РСТ номер ШО 2009/018449 и дополнительно описано ниже. Эта библиотека включала 9216 уникальных вариантов.

- 117 020145

Таблица 12

		Пальмитат	3 часа пальмитат	24 часа пальмитат	48 часов пальмитат
Фермент	Мутации	45С 24 час	25С 24 час	25С 48 час	45С 48 час	55С 3 час	45С 3 час	25С 3 час	55С 24 час	45С 24 час	25С 24 час	55С 48 час	45С 48 час	25С 48 час	СК. 24
ТТ11	А48С	8,0%	8,2%	7,5%	7,3%	8,7%	9,3%	10,1%	6,5%	6,7%	7,5%	6,7%	6,6%	6,8%	5,3%
ТТ41	Ε116Ι, (ТТС)135(ТТТ)	8,0%	9,9%	9,4%	7,2%	9,4%	9,3%	10,7%	9,3%	7,1%	9,5%	9,1%	6,5%	9,1%	5,6%
ТТ43	Е116Ь	7,3%>	7,6%	6,8%	6,5%	9,0%	9,1%	9,8%	6,3%	6,8%	8,1%	6,2%	6,0%	6,8%	4,8%
ТТ44	Ε116Ν	5,9%	6,5%	5,3%	4,9%	8,9%	9,9%	10,3%	7,1%	6,4%	8,1%	6,5%	5,6%	7,2%	4,4%
ТТ70	Р162С	8,5%	9,7%	7,9%	7,3%,	9,7%	10,2%	10,9%	7,6%	6,6%	9,4%	6,7%	5,6%	8,4%	4,7%
ТТ84	К172Н	6,3%	6,3%	5,5%	5,2%,	8,1%	8,0%	9,5%	6,3%	6,9%	7,5%	6,8%	6,4%	6,7%	6,1%
ТТ64	Α150Ι	6,9%	7,3%	6,8%	6,5%	7,4%	7,0%	8,8%	6,6%	5,9%	6,8%	6,8%	5,4%	6,0%	5,2%
ТТ63	Е149Н	9,0%	10,2%	9,5%	8,8%	10,2%	9,8%	10,7%	9,4%	8,7%	9,6%	9,4%	8,7%	9,6%	8,2%
ТТ26	Е95К, (ССв)92(6СТ)	7,5%	8,9%	6,9%	6,8%	8,1%	7,9%	9,8%	6,7%	5,7%	7,1%	6,9%	5,1%	6,4%	4,7%
ТТ71	Р162К	6,6%	8,7%	6,9%	6,3%	9,0%	9,1%	10,4%	8,2%	6,1%	7,9%	7,6%>	5,3%	6,7%	4,5%
ТТ86	К172Ь	6,1%	6,8%	6,1%	5,8%	8,7%	8,6%	9,6%	6,8%	6,3%	6,9%	6,7%>	6,4%	6,3%	5,1%
ТТ25	Κ85Υ	6,8%	8,7%	6,8%		7,8%	7,6%	9,9%	8,0%	6,0%	7,1%	8,2%>	6,7%	6,7%	6,3%
ТТ118	Ν158ϋ, Р162С	7,5%	8,2%	6,7%		9,7%	10,2%	10,4%	8,3%	6,7%	9,1%	9,2%	6,1%	7,6%
ТТ59	Α144Ι	9,7%	10,1%	9,7%>	9,2%	10,4%	10,3%		9,8%	9,5%	10,2%	9,9%	9,6%	10,3%	9,1%
ТТ112	А2258	8,6%	9,2%	8,6%	8,1%	9,9%	9,8%	10,3%	8,9%	7,9%	8,9%	9,5%	7,5%	8,6%	6,1%
ТТ15	Ώ49Ε	7,9%	7,1%	8,0%		9,0%	8,6%	9,7%	8,3%	7,5%	8,6%	8,9%	7,4%	8,8%	8,2%

ТТ14	Ώ49Ν	6,7%	7,6%	5,3%	6,4%	8,5%	7,8%	8,9%	7,7%	5,4%	5,8%	7,9%	5,5%	5,6%	4,8%
ТТ62	А144У	7,4%	7,5%	6,7%		9,2%	9,7%	9,9%	7,7%	8,6%	7,6%	7,6%	8,7%	7,4%	6,8%
ТТ105	Т214Н	6,4%	7,3%	6,1%	6,1%	8,3%	7,8%	9,5%	6,7%	7,3%	7,0%	6,3%	6,8%	5,7%	4,8%
ТТ61	А144М	9,0%	9,2%	8,4%	8,4%	10,6%	10,5%	10,3%	9,8%	10,1%	9,5%	9,0%	9,7%	8,6%
ТТ113	Κ163Υ	6,4%	7,3%	6,0%	5,6%	7,6%	7,0%	9,7%	6,4%	6,1%	6,2%	6,5%	5,9%	5,5%	5,3%
ТТ7	632Р	6,1%	8,7%	8,3%	5,8%	8,6%	8,5%	9,0%	8,1%	7,1%	7,0%	7,6%	6,8%	6,5%
ТТ120	Р1628, К.163Р	6,6%	7,5%	6,3%	6,4%	8,7%	9,1%	10,3%	6,9%	6,6%	7,5%
ТТ37	Е116А	8,0%	8,2%	7,3%	7,6%	9,6%	9,5%	10,2%	8,5%	7,4%	8,6%

Технология подогнанной многосайтной комбинаторной сборки (ТМСА), технология ТМСА (см. публикацию РСТ № Ш0 09/018449) включает метод получения множества вторичных полинуклеотидов, содержащих различные сочетания различных мутаций во множестве сайтов. Метод может быть осуществлен отчасти путем сочетания по меньшей мере одной или более следующих стадий.

Получение информации о последовательности (первого, или матричного) полинуклеотида. Например, первая, или матричная, последовательность может быть дикого типа (например, 8Ер ΙΌ N0:2 с мутациями Э61Е, К72К и У163К) или мутантной последовательностью. Информация о последовательности может касаться всего полинуклеотида (например, гена или открытой рамки считывания) или отдельных интересующих областей, таких как последовательность, кодирующая сайт связывания, специфичность связывания, катализ или субстратную специфичность.

Идентификация трех или более интересующих мутаций вдоль первой, или матричной, полинуклеотидной последовательности. Например, мутации могут находиться в 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 или более положениях в первой, или матричной, последовательности. Положения могут быть заранее определены абсолютным положением или контекстом окружающих остатков или гомологией. Например, для ТМСА пальмитазных полипептидов в качестве интересующих мутаций были включены наиболее термоустойчивые аминокислотные замены, которые приводили к улучшенной производительности фермента. Могут быть известны последовательности, прилегающие к положениям мутаций с любой стороны. Каждое положение мутации может содержать две или более мутаций, таких как для разных аминокислот. Такие мутации могут быть идентифицированы с помощью технологии Сепе 8Ие 8а1игаИоп Ми1адепек1к™ (С88М^8М), как описано в настоящем описании и, например, патентах США №№ 6171820; 6562594 и 6764835.

Предложение праймеров (например, синтетических олигонуклеотидов), включающих интересующие мутации. В одном варианте осуществления для каждой интересующей мутации предлагается праймер. Так, для первого, или матричного, полинуклеотида, содержащего 3 интересующих мутации, может быть использовано 3 праймера в этом положении. Праймер может быть также предложен в виде пула праймеров, содержащих вырожденное положение, так что интересующая мутация представляет собой спектр из любого нуклеотида или природной аминокислоты или подгруппу этого спектра. Например, может быть предложен пул праймеров, которые способствуют мутациям алифатических аминокислотных остатков.

Праймеры могут быть получены в виде прямых или обратных праймеров или праймеры могут быть получены в виде по меньшей мере одного прямого праймера и по меньшей мере одного обратного праймера. Когда мутации расположены близко друг от друга, может быть удобным использование праймеров, которые содержат мутации для более чем одного положения или разные сочетания мутаций во множестве положений.

Предложение полинуклеотида, содержащего матричную последовательность. Первый, или матричный, полинуклеотид может быть кольцевым или сверхспирализованным, также как и плазмида или век- 118 020145 тор для клонирования, секвенирования или экспрессии. Полинуклеотид может быть одноцепочечным (оцДНК) или может быть двухцепочечным (дцДНК). Например, в методе ТМСА сверхспирализованную (кс) матрицу дцДНК подвергают стадии нагревания при 95°С в течение 1 мин (см. Ьеуу, №.1с1е1с Ас1й Кек., 28(12):е57(1-уи) (2000)).

Добавление праймеров к матричному полинуклеотиду в реакционной смеси. Праймеры и матричный полинуклеотид соединяют в условиях, которые обеспечивают отжиг праймеров с матричным полинуклеотидом. В одном варианте осуществления протокола ТМСА праймеры добавляют к полинуклеотиду в единой реакционной смеси, но могут быть добавлены во множество реакционных смесей.

Проведение полимеразной реакции (реакций) удлинения. Продукты удлинения (например, в виде потомства или модифицированного удлиненного полинуклеотида) могут быть амплифицированы традиционными средствами. Продукты могут быть проанализированы на предмет длины, последовательности, желаемых свойств нуклеиновой кислоты или экспрессированы в виде полипептидов. Другие методы анализа включают гибридизацию т-кйи, скрининг последовательности или скрининг экспрессии. Анализ может включать один или более циклов скрининга и селекции в отношении желаемого свойства.

Продуктами можно также трансформировать клетку или другую экспрессионную систему, такую как бесклеточную систему. Бесклеточная система может содержать ферменты, связанные с репликацией ДНК, репарацией, рекомбинацией, транскрипцией или трансляцией. Иллюстративные хозяева включают клетки и клеточные линии бактерий, дрожжей, растений и животных и включают Е. со11, Ркеийотопак йиогексепк, РюЫа рак!ойк и АкрегдШик шдег. Например, в качестве хозяев могут быть использованы штаммы ХЬ1-В1ие или δΐ№2 Е. сой.

Для получения продуктов, содержащих разные сочетания или разное количество мутаций, может быть использован метод изобретения с одними и теми же или разными праймерами в разных условиях реакции.

Путем реализации описанного выше иллюстративного метода протоколом также предлагаются один или более полинуклеотидов, полученных с помощью этого метода ТМСА эволюции, которые могут быть затем подвергнуты скринингу или отобраны по желаемому свойству. Один или более полинуклеотидов-потомков могут быть экспрессированы в виде полипептидов и, необязательно, подвергнуты скринингу или селекции по желаемому свойству. Таким образом, в этом варианте осуществления протокола эволюции ТМСА предлагаются полинуклеотиды и кодируемые полипептиды, а также библиотеки таких полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды. В этом варианте осуществления протокола эволюции ТМСА дополнительно предлагаются для скрининга библиотеки, которые путем скрининга или селекции библиотеки обеспечивают получение одного или более полинуклеотидов, кодирующих один или более полипептидов, обладающих желаемой активностью.

Другой вариант осуществления протокола эволюции ТМСА, описанный в публикации РСТ № ν0 2009/018449, включает метод получения множества модифицированных полинуклеотидов. Такие методы обычно включают (а) добавление по меньшей мере трех праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в единой реакционной смеси, где по меньшей мере три праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из трех праймеров включает по меньшей мере одну мутацию, отличную от других праймеров, где по меньшей мере один праймер представляет собой прямой праймер, который может отжигаться с минусовой цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер представляет собой обратный праймер, который может отжигаться с плюсовой цепью матрицы, и (Ь) введение реакционной смеси в полимеразную реакцию удлинения с получением множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из трех праймеров.

Другой вариант осуществления протокола эволюции ТМСА, описанный в публикации РСТ № ν0 2009/018449, включает метод, в котором клетку трансформируют множеством удлиненных продуктов, которые не были обработаны лигазой. В другом варианте осуществления изобретения множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов извлекают из клетки. В другом варианте осуществления извлеченное множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов анализируют, например, путем экспрессии по меньшей мере одного из множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов и анализа экспрессированного в результате полипептида. В другом варианте осуществления отбирают множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов, включающих интересующие мутации.

В другом варианте осуществления протокола эволюции ТМСА получают информацию о последовательности матричного полинуклеотида и могут быть идентифицированы три или более интересующие мутации вдоль матричного полинуклеотида. В другом варианте осуществления продукты, полученные полимеразным удлинением, могут быть проанализированы перед трансформацией клетки множеством удлиненных модифицированных продуктов.

В одном варианте осуществления протокола эволюции ТМСА продукты, полученные полимеразным удлинением, обрабатывают ферментом, например ферментом рестрикции, таким как фермент рестрикции Эрпк тем самым разрушая матричную полинуклеотидную последовательность. Обработанными продуктами можно трансформировать клетку, например клетку Е. со11.

В одном варианте осуществления протокола эволюции ТМСА может быть использовано по меньшей мере два, или по меньшей мере три, или по меньшей мере четыре, или по меньшей мере пять, или по

- 119 020145 меньшей мере шесть, или по меньшей мере семь, или по меньшей мере восемь, или по меньшей мере девять, или по меньшей мере десять, или по меньшей мере одиннадцать, или по меньшей мере двенадцать либо более праймеров. В одном варианте осуществления каждый праймер включает одиночную точечную мутацию. В другом варианте осуществления два прямых или два обратных праймера включают разное изменение в одном и том же положении на матричном полинуклеотиде. В другом варианте осуществления по меньшей мере один праймер включает по меньшей мере два изменения в разных положениях матричного полинуклеотида. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере один праймер включает по меньшей мере два изменения в разных положениях и по меньшей мере два прямых или два обратных праймера включают разное изменение в одном и том же положении на матричном полинуклеотиде.

В одном варианте осуществления протокола эволюции ТМСА прямые праймеры группируют в прямую группу, а обратные праймеры группируют в обратную группу, и праймеры в прямой группе и праймеры в обратной группе, независимо друг от друга, нормализуют с получением равной концентрации в соответствующей группе независимо от положений на матричном полинуклеотиде, и где после нормализации в реакционную смесь добавляют равное количество прямых и обратных праймеров. В этом методе нормализации сочетание некоторых положений может быть смещено. Это смещение может быть обусловлено, например, относительно низкой концентрацией праймера в одном положении, содержащем один праймер, по сравнению с положением, содержащим множество праймеров. Позиционное смещение относится к получаемым полинуклеотидам, которые проявляют выраженную предпочтительность к включению праймеров в одном положении по сравнению с другими положениями в пределах их прямой или обратной группы праймеров. Это ведет к сочетанию модифицированных полинуклеотидов, которые могут содержать высокий процент мутаций внутри положения одного праймера, но низкий процент мутаций в другом положении в пределах их групп прямых или обратных праймеров. Это смещение является неблагоприятным, когда целью ТМСА служит получение полинуклеотидов-потомков, включающих все возможные сочетания изменений матрицы. Отклонение может быть скорректировано, например, путем нормализации праймеров в виде равного пула в каждом положении.

В одном варианте осуществления протокола эволюции ТМСА нормализацию праймеров производят путем организации праймеров во множество групп в зависимости от их локализации на матричном полинуклеотиде, где праймеры, покрывающие одну и ту же область на матрице, находятся в одной группе; нормализации сгруппированных праймеров внутри каждой группы до равной концентрации; объединения прямых праймеров внутри одной группы в прямую группу и нормализации концентрации между каждой группой прямых праймеров до равной величины; объединения обратных праймеров внутри одной группы в обратную группу и нормализации концентрации между каждой группой обратных праймеров до равной величины и добавления равного количества объединенных прямых и обратных праймеров в реакционную смесь. Не наблюдалось смещения в отношении сочетаний положений.

В одном варианте осуществления протокола эволюции ТМСА предлагается набор вырожденных праймеров, каждый из которых включает вырожденное положение, где интересующая мутация представляет собой спектр разных нуклеотидов в вырожденном положении. В другом варианте осуществления предлагается набор вырожденных праймеров, включающих по меньшей мере один вырожденный кодон, соответствующий по меньшей мере одному кодону на матричном полинуклеотиде и по меньшей мере одну прилегающую последовательность, которая гомологична последовательности, прилегающей к кодону матричной полинуклеотидной последовательности. В другом варианте осуществления вырожденный кодон представляет собой Ν,Ν,Ν и кодирует любую из 20 природных аминокислот. В другом варианте осуществления вырожденный кодон кодирует менее 20 природных аминокислот.

Другой вариант осуществления протокола эволюции ТМСА, описанный в публикации РСТ № \¥О 2009/018449, включает метод получения множества модифицированных полинуклеотидов, включающих интересующие мутации. Такие методы обычно включают (а) добавление по меньшей мере двух праймеров к двухцепочечному матричному полинуклеотиду в единой реакционной смеси, где по меньшей мере два праймера не перекрываются и где каждый по меньшей мере из двух праймеров включает по меньшей мере одну мутацию, отличную от другого(других) праймера(праймеров), где по меньшей мере один праймер представляет собой прямой праймер, который может отжигаться с минусовой цепью матрицы, и по меньшей мере один праймер представляет собой обратный праймер, который может отжигаться с плюсовой цепью матрицы, (Ь) введение реакционной смеси в полимеразную реакцию удлинения с получением множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере из двух праймеров, (с) обработку множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов ферментом, разрушающую тем самым матричный полинуклеотид, (б) трансформацию клетки обработанными удлиненными модифицированными полинуклеотидами, которые не обрабатывали лигазой, (е) выделение из клетки множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов и (ί) отбор множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов, содержащих интересующие мутации.

В этом примере в табл. 13 ниже показаны 15 мутаций, отобранных для включения в устойчивую к нагреванию ТМСА библиотеку. Использовали шесть матриц ДНК: δΕΟ ΙΌ NО:2 с мутациями Ό61Ε, Κ72Κ и Υ163Κ (исходная), исходную с мутацией Е95К, исходную с мутацией Р162О, исходную с мута

- 120 020145 цией Р162К, исходную с мутацией Е95К и Р162О и исходную с мутациями Е95К и Р162К. Плазмиды исходной матрицы с мутацией Е95К, исходной матрицы с мутацией Р162О, исходной матрицы с мутацией Р162К пропускали через компетентные клетки Е. со11 ХЕ1В1ие для метилирования ДНК. Было проведено шесть отдельных эволюций ТМСА, по одной для каждой из шести матриц, в сочетании с олигонуклеотидами, перечисленными в табл. 14 ниже.

Таблица 13

Таблица 14

Название олигонуклеотида	Последовательность олигонуклеотида - 5' - 3'
Α144Ι-Κ	ТССАССОТбТббСТОТТОАТСОССТСОТАОАТСТТССАААТАТСОТТОбСОТСбАСОТСОС (ЗЕО Ю N0:24)
Α144Ι-Α150Ι-Ρ	ТС6АСС0Т6Т60СТСТТ0АТААТСТС0ТАСАТСТТССАААТАТ00ТТ00С6Т06А00ТС0С (5ЕО Ю N0:25)
Α144Ι-Ε149Η-Α150Ι-Ρ	ТССАССОТОТОССТОТТОАТААТАТеОТАбАТСТТССАААТАТСОТТбОССТССАОбТСбС (5Е0 Ю N0:26)
Α144Ι-Ε149Η-Κ	ТССАССОТОТООСТСТТСАТСОСАТООТАСАТСТТССАААТАТСеТТООССТООАОСЗТССС (5Е0 Ю N0:27)
Α150Ι-Ρ	ТССАССОТОТбОСТОТТеАТААТСТССТАОАТСТТССАСОСАТСОТТООСбТеСАОбТСбС (ЗЕО Ю N0:28)
А2258-Р	ТТСОССТСОАОТСАОАОСССАОАСССбАССАОССОСАССАСАО (ЗЕО Ю N0:29)
А48С-О49Р-Е	ТООТОСТОСССеОСТТССТОТОТССТОАСААСОССАССТСООТССТ (ЗЕО Ю N0:30)
А48С-Е	ТССТССТ6СССОССТТССТОТСТСАС6АСААССССАССТССОТ6СТ (ЗЕО Ю N0:31)
О49Р-Р	ТО6ТОСТОСССООСТТССТССССССТСЗАСААС6ССАССТСООТОСТ (ЗЕО Ю N0:32)
Ε116Ι-Ε	ТС66СС6ССТСТАТ6СССССАТТСТСС0ССАСАА0СС0ССССА (ЗЕО Ю N0:33)
Е116Ы=	ТСбОСОбССТСТАТбСОСОССТТСТбООССАСААОССОСССОА (ЗЕО Ю N0:34)
Ε116Ν-Ρ	ТСС6С60ССТСТАТ6С6С0СААТСТС06ССАСАА06С0ССССА (ЗЕО Ю N0:35)
Ε149Η-Α150Ι-Ρ	ТСбАССОТОТООСТСТТОАТААТАТООТАОАТСТТССАСОСАТООТТСССОТеОАОбТССС (ЗЕО Ю N0:36)
Е149Н-Р	ТС6АСС0Т0Т06СТ0ТТ0АТСССАТ00ТАСАТСТТССАСеСАТСеТТ6СС6Те0АС6ТС6С (ЗЕО Ю N0:37)
Р172Н-К	С0ССАССАСАСС6С0АТ60ТАТ6САССС6С00СТТААТСТ00А (ЗЕО Ю N0:38)
Р172Б-Р	СбССАССАСАССОСбАТООТААОСАССбССбОСТТААТСТООА (ЗЕО Ю N0:39)
Ρ85Υ-Ε	ТТСОТООСОАССТСОТеОАСТАТСТСОТСОАСССОСТССбООС (ЗЕО Ю N0:40)

Члены библиотеки амплифицировали в векторе р1)0Ш-кап, анализировали с помощью агарозного геля и обрабатывали ОРШ. Образцами затем трансформировали компетентные клетки ХЕ1В1ие Е. со11. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Результаты секвенирования показали, что мутация Е116Е и мутации аминокислот в положениях 144, 14 9 и 150 представлены в меньшей степени по сравнению с теоретическим максимумом. Поэтому была создана другая библиотека ТМСА с использованием нормализованной смеси всех шести матриц. Реакции ТМСА были повторены с использованием всех олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 14, за исключением олигонуклеотидов для мутаций ΙΠΙ6Ι и Е116К Количество праймеров, использованных для мутации Е116Е и для области 4 (аминокислоты 144, 149 и 150), было удвоено. Образцы амплифицировали в векторе рЕ0Ш-кап, анализировали с помощью агарозного геля и обрабатывали ОРШ. Образцами ДНК трансформировали компетентные клетки ХЕ1В1ие Е. со11. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Включение мутаций в положения аминокислот 144, 149 и 150 было улучшено, но Е116Е все еще была представлена в меньшей степени по сравнению с теоретическим максимумом. ДНК из обеих библиотек трансформировали компетентные клетки ХЕ1В1ие Е. со11. Колонии объединяли и получали ДНК с помощью набора Р1адеп ттЕргер. ДНК затем использовали для трансформации компетентных клеток Рзеийотопаз Пиогезсепз. Клетки выращивали в среде ЕВ с добавкой урацила (750 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл). Было получено достаточное количество колоний для 10-кратной супердискретизации библиотеки. Библиотеку супердискретизировали в десять раз для учета недостаточной представленности Е116Е.

Полученную устойчивую к нагреванию библиотеку ТМСА выращивали в минимальной среде М9 с добавлением урацила (750 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл) и подвергали скринингу с использованием скрининга НТР, описанного в примере 3 выше. Библиотеку инкубировали при 60°С в течение 30 мин до и после добавления ИМВ-пальмитата. 384-луночные планшеты затем считывали при возбуждении 365 нм и испускании 460 нм. Каждый планшет быстро охлаждали центрифугированием, а спектрофотометр заранее нагревали для сведения к минимуму артефактов считывания. Регистрируются величины флуоресценции по каждому 384-луночному планшету. Попадания идентифицировали как значения, превы

- 121 020145 шающие на >2 стандартных отклонения положительный контроль (одиночную мутацию Е116Ь). При вторичном НТР скрининге первичные попадания НТР тестировали при двух температурах 60 и 63°С. Вторичные попадания определяли как значения, превышающие на >4 стандартных отклонения среднее положительного контроля в планшете 63°С и сохраняющие >50% активности между 60 и 63°С.

Было идентифицировано 318 уникальных последовательностей вторичных попаданий НТР. Эти попадания содержат от 2 до 9 мутаций. Были проведены стандартные тесты с 5 г сырого масла (как описано в примере 5) с осветленными лизатами 318 попаданий. Из 318 вторичных попаданий НТР варианты, которые снижали пальмитат более эффективно при повышенных температурах (45 или 60°С) по сравнению с 25°С в тесте с маслом, были выбраны как устойчивые к температуре масляные попадания. Было идентифицировано и охарактеризовано с помощью дополнительных тестов с маслом 57 устойчивых к температуре масляных попаданий (см. табл. 15 и 16 ниже). Были проведены дополнительные тесты с 5 г масла и было идентифицировано 9 масляных попаданий, которые обладали предпочтительными температурными профилями в дополнение к варьирующим уровням общей активности (см. табл. 17 ниже).

Таблица 15

Термоустойчивое попадание #

118		Κ85Υ					Р162С	К172Н		9,7%	8,7%	8,1%	8,9%	8,3%	7,9%
134	А48С						Р162С	Р172Н	А2255	10,3%	9,4%	9,2%	10,3%	9,0%	9,2%
135		Ρ85Υ					Р162К	К172Н		6,8%	7,0%	9,6%	6,0%	7,0%	9,4%
136	А48С						Р162К	Р172Н		9,2%	8,1%	8,0%	8,7%	8,1%	7,6%
155							Р162К	Р172Н	А2255	9,5%	8,6%	10,5%	8,5%	8,1%	10,5%
161		Ρ85Υ	Е95К	Ε116Ν	Α144Ι					9,8%	9,6%	9,8%	9,7%	11,6%	9,7%
184	А48С		Е95К	Ε116Ν	Α144Ι	Α150Ι				10,5%	10,4%	10,4%	10,5%	10,5%	10,4%
202				Ε116Ν			Ρ162Θ	К172Н		8,8%	7,4%	8,2%	8,1%	6,9%	8,0%
204		Κ85Υ		Ε116Ι			Р1626	К172Н		9,4%	8,3%	6,7%	8,8%	7,4%	7,1%
211	А48С	Η85Υ		Е116Б			Р1626	К172Н		9,6%	8,9%	8,7%	8,6%	8,3%	8,5%
215	А48С			Ε116Ι			Р 162(3	К172Б	А2255	10,4%	10,1%	10,3%	10,5%	10,0%	10,0%
216		Κ85Υ					Р162С	Р172Н	А2255	9,7%	9,6%	8,9%	9,0%	8,0%	8,8%
229	А48С	Κ85Υ					Р162С	К172Б	А2255	10,3%	9,8%	10,1%	10,0%	9,7%	10,1%
235	А48С			Ε116Ι			Р1626	Е?1721_		10,3%	10,0%	10,3%	10,0%	9,3%	10,4%
236	А48С						Р 162(3			10,1%	9,7%	9,7%	10,1%	9,3%	9,6%
238		Ρ85Υ		Ε116Ν			Р162С	К172Н	А2258	9,2%	7,6%	7,6%	8,3%	6,9%	7,6%
239	А48С						Р162СЗ			10,2%	8,8%	10,1%	9,8%	7,8%	10,3%
241				Е116Б			Ρ162Θ	Р172Б	А2258		7,4%	10,2%	6,5%	6,6%	10,3%
243				Ε116Ι			Р162С		А2258	9,2%	7,5%	10,3%	8,2%	6,8%	10,4%
244		Ρ85Υ					Р162С			10,1%	7,6%	7,8%	9,6%	6,9%	8,0%
246	А48С	Ρ85Υ	Е95К	Ε116Ι			Р 162(3	К172Н		10,2%	9,7%	10,6%	9,7%	9,7%	10,5%
247		Κ85Υ	Е95К	Ε116Ι			Ρ162Θ		А2258	10,1%	7,8%	10,0%	9,8%	7,0%	10,1%
248		Ρ85Υ	Е95К				Р162С	К172Н		9,6%	8,7%	9,8%	8,6%	7,9%	9,9%
257			Е95К				Р162СЗ	В172Н		8,7%	8,0%	9,5%	7,2%	7,4%	9,4%
263										10,3%	9,9%	9,8%	10,1%	10,0%	9,7%

269			Е95К	Ε116Ι				Р1626	Р172Б	А2258	9,5%	8,6%	10,5%	9,1%	8,0%	10,6%
274		Κ85Υ	Е95К					Р162(3	В172Б		10,1%	9,4%	10,5%	10,5%	9,0%	10,5%
278	А48С			Е116Б					К172Н	А2258	10,1%	9,2%	10,4%	10,2%	9,1%	10,4%
282	А48С	Κ85Υ		Ε116Ν	Α144Ι				Н172Н	А2258	10,6%	10,6%	10,5%	10,6%	10,5%	10,4%
284	А48С		Е95К	Ε116Ι	Α144Ι	Е149Н			К172Н	А2258	10,6%	10,6%	10,5%	10,6%	10,5%	10,5%
286				Ε116Ι	Α144Ι				К172Н		10,5%	10,5%	10,2%	10,4%	10,4%	10,0%
288		Ρ85Υ			Α144Ι		Α150Ι				10,4%	10,4%	9,9%	10,3%	10,1%	9,8%
292	А48С			Ε116Ν	Α144Ι		Α150Ι		Р172Н		10,5%	10,6%	10,0%	10,2%	10,9%	9,8%
296	А48С			Ε116Ν	Α144Ι	Е149Н	Α150Ι		Р172Н		10,6%	10,6%	10,6%	10,6%	10,6%	10,5%
297	А48С	Ρ85Υ		Ε116Ι							10,3%	9,8%	10,5%	10,2%	9,7%	10,5%
298		Κ85Υ		Ε116Ν					Н172Н		8,6%	7,8%	10,2%	7,9%	7,3%	10,2%

* Термоустойчивые попадания 29, 40, 41 и 74 содержат также дополнительные мутации (см. дополнительные мутации, перечисленные в табл. 16 ниже).

- 122 020145

Таблица 16

Дополнительные мутации, также содержащиеся в термоустойчивых попаданиях 29, 40, 41 и 74

Термоустойчивое	старый	новый	старая	новая	положение
попадание #	кодон	кодон	аминокислота	аминокислота	аминокислоты
29	СТС	АТС	V	М	83
40	ОСС	ОСТ	А	А	92
41	ссс	ССТ	А	А	92
74	ссс	ССТ	А	А	92

Таблица 17

Пример 11. Иллюстративная эволюция повышенной экспрессии пальмитазы с использованием технологии ТМСА^8М.

индивидуальных молчащих мутаций, идентифицированных при скрининге С88М (см. табл. 11, пример 9 выше), оценивали на предмет экспрессии (см. табл. 18 ниже). 50-мл культуры экспрессировали в среде М9 с добавлением урацила и канамицина в 250-мл сосудах. Попадания выращивали при 30°С в течение от 16 до 20 ч до и после индукции 0,3 мМ 1РТС. Клетки осаждали центрифугированием и лизировали с помощью В-РЕК™ (каталожный номер 78248, Р1егсе Рго!ет Кезеагск Ргобис^з, КоскГогб, 1Ь). Часть цельного лизата центрифугировали для осветления. И цельный клеточный лизат, и осветленный лизат анализировали на содержание суммарного белка с помощью Вю-Каб Рго!ет Аззау (Вю-Каб, Негси1ез, СА, каталожный # 500-0006), основанного на методе Брэдфорда, и на активность на флуорогенном субстрате иМВ-пальмитате, а также с помощью 8О8-ПАГЭ. Величины нормализовали, принимая исходную величину за 100%. Было идентифицировано 16 попаданий по проявлению повышенной активности по сравнению с исходной.

Таблица 18

	% от исходной активности	% растворимой фракции
сайт а.к.	цельный	осветленный	активность	белок
35	352	247	53	79
37	191	126	50	83
41	163	103	48	91
45	706	640	68	89
52	252	161	48	57
89	281	190	51	47
97	167	102	46	77
102	617	525	64	72
108	583	452	58	60
109	373	244	49	72
114	238	147	46	72
115	не опред.
117	653	555	64	70
124	442	336	57	62
126	509	368	55	70
128	416	327	59	70
129	354	260	55	73
133	511	455	67	47
137	339	240	53	54
138	266	186	53	75
139	135	101	56	105
142	221	175	60	63
172	243	210	65	59
183	433	356	62	65
188	455	325	54	97
192	253	179	53	60
193	117	59	38	57
202	196	121	47	63
203	339	247	55	68
205	63	31	37	68
206	125	78	47	63
208	232	162	53	99
212	320	238	56	87
222	126	75	45	86
223	149	88	45	99
226	213	110	39	81
227	183	174	71	71
Положительный	100	100	75	71
Отрицательный	0	1

- 123 020145 наилучших индивидуальных мутаций (табл. 19 ниже) были объединены с помощью технологии ТМСА, как описано в публикации РСТ номер ШО 2009/018449 и дополнительно описано ниже.

Таблица 19

Для эволюции ТМСА использовали четыре матрицы ДНК: (1) исходную А пальмитазу (8Ер ГО ЫО:2 с мутациями Э61Е, К72К и У163К), (2) исходную В пальмитазу (исходную А с дополнительными мутациями (ССС)45(ССА) и (СТС)117(СТТ)), (3) исходную С пальмитазу (исходную А с дополнительной мутацией (ССС)45(ССА)) и (4) исходную Ό (исходную А с дополнительной мутацией (СТС)117(СТТ)). Примечание: мутации представлены в виде исходного кодона с последующим номером положения модифицированной аминокислоты и затем нового кодона. Например, (ССС)45(ССА) указывает на то, что кодон для аминокислоты в положении 45 8ЕР ГО ЫО:2 был изменен с (ССС) на (ССА).

Первый цикл реакций ТМСА был произведен с каждой из четырех матриц ДНК и праймерами для областей 1 и 4 (см. табл. 20 ниже; область 1: аминокислота 35; область 4: аминокислоты 183 и 188) с формированием тем самым четырех подбиблиотек. Продукты подбиблиотек очищали с помощью набора Р1адеи РСК с1еаи-ир. Каждую подбиблиотеку, содержащую смесь очищенных продуктов и, следовательно, содержащих множество матриц, затем использовали в единственной второй реакции ТМСА на библиотеку с праймерами для областей 2 и 3 (см. табл. 21 ниже; область 2: аминокислоты 102 и 108; область 3: аминокислоты 124, 126, 128 и 133).

Таблица 20

Название олигонуклеотида	Последовательность олигонуклеотида -5-3’
35СЗСТ	СТ0С0ААААТ060САААСТ00СТ0АТС0С0А6ССС0ТАСТССТ (ЗЕО Ю N0:41)
1830ТТ	ТОСТСОСССОАОССТТСССАОСТСТССОССОССАСААССССОТСОАОСООСОАССАСА (ЗЕО Ю N0:42)
183ОТТ188АСО	Т0СТС0С0ССАСССТТСС0АС6ТСТСС0СС0ССАСААСССС0ТССА0С00С0АССАСА (ЗЕО Ю N0:43)
188АСС	Т6СТС6С0ССА6ССТТСС0АС0ТСТСС60С0ССАССАСССССТС0А6С00С0АССАСА (ЗЕО Ю N0:44)

Таблица 21

Название олигонуклеотида	Последовательность олигонуклеотида -5’-3’
102ОТТ-КС	АОбССеССбОТООТСАОААОбТТАТСОТСОТССОСТСОАбССТСООСОСССТСТАТОССС (ЗЕО Ю N0:45)
1026ТТ108А6Т-КС	АООСООССОбТОбТСАОААбСТТАТСбТОСТСбССТООАОТСТСООСОбССТСТАТбСбС (ЗЕО Ю N0:46)
108АСТ-ЯС	А6СС6ССС00Т00ТСА0АА0СТ0АТС0Т60ТС60СТ0СА0ТСТС00С06ССТСТАТСС0С (ЗЕО Ю N0:47)
124ТТ013ЗТСТ короткий-НС	ТССССС0С6ААСС0АСА6СС0А6С0Т6АС0АССАТСС06АТСААТТССС6С0ССТТ6Т00 (ЗЕО Ю N0:48)
124ТТС126АО6короткий-КС	ТСОСССбСОААССОАСТОССОАОСОТбАССАССАТССТОАТСААТТССОССОССТТСТОб (ЗЕО Ю N0:49)
124ТТС126ΑΘ0128СТСкороткий-КС	ТСССССССОААСеОАСТОССОАбСОТСАССАССАТССТОАТСААТТСССОСОССТТОТСС (ЗЕО Ю N0:50)
126АС013ЗТСТ короткий-НС	ТС0ССС6С0ААС00А0А6СС6А6С0Т6АС6АССАТССТ0АТСА6ТТС0С0С0ССТТСЭТ60 (ЗЕО Ю N0:51)
124ТТО126ΑΟΘ128ΘΤ013ЗТСТкороткий-КС	ТСОСССОСОААСООАОАОСССА6СОТ6АССАССАТССТОАТСААТТСОООСОССТТСТОО (ЗЕО Ю N0:52)

- 124 020145

133ТСТкороткий-КС	ТСССССбССААСОСАОАСССОАСССТбАСбАССАТСССеАТСАСТТСОеСССССТТеТбе (ЗЕО Ю N0:53)
128ΟΤΘ1 ЗЗТСТкороткий-ВС	ТССССССССААСОСАСАССССАССОТСАССАССАТССССАТСАСТТСОООСОССТТСТСО (ЗЕО Ю N0:54)
124ТТ0126А00133ТСТСкороткий-КС	ТСОСССОСОААСООАОАОССОАОСОТОАССАССАТССТОАТСААТТСОСОСОССТТОТОО (ЗЕО Ю N0:55)
126АССкороткий-КС	ТС6ССС6СеААС0САСТ0СС6А6С0Т6АС6АССАТССТ0АТСА0ТТС666С6ССТТ(ЗТ0С (ЗЕО Ю N0:56)
124ΤΤΘ128ОТ6короткий-ЕС	ТСССССССОААСООАСТОССОАОССТСАССАССАТССООАТСААТТСОССССССТТСТСС (ЗЕО Ю N0:57)
126А6С128СТС1 ЗЗТСТкороткий-КС	ТСССССОССААССОАОАСССОАбСОТСАССАССАТССТОАТСАСТТСОООССССТТОТСО (ЗЕО Ю N0:58)
124ТТ0128ΟΤΘ1ЗЗТСТкороткий-КС	ТСОСССССОААСООАСАОСССАОССТОАССАССАТССООАТСААТТСССОССССТТОТОО (ЗЕО Ю N0:59)
124ТТСкороткий-Е?С	ТСССССОСОААССОАСТОССОАОСОТОАСОАССАТССООАТСААТТСОООССССТТОТОО (ЗЕО Ю N0:60)
128ОТСкороткий-КС	ТСОССССССААСООАСТОССОАОСОТСАССАССАТССООАТСАОТТСООеСОССТТОТОО (ЗЕО Ю N0:61)

Образцы амплифицировали в векторе рООШ-каи, анализировали с помощью агарозного геля, обрабатывали ΟΙ^ΝΙ и затем ими трансформировали компетентные клетки ХЬ1В1ие Е. со11. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Колонии объединяли и получали ДНК для каждой подбиблиотеки с использованием набора р1адеи шЫ-ргер (Са!а1од # 27106, р1адеи, Уа1еис1а, СА). Затем этой ДНК трансформировали компетентные клетки Ркеиботоиак Пиогексеик. Клетки выращивали в среде кВ с добавлением урацила (750 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл). Было получено достаточное количество колоний для семикратной супердискретизации библиотеки (по меньшей мере 14000 колоний).

Библиотеку распределяли, выращивали в минимальной среде М9 с урацилом (750 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл) и тестировали с 400 мкМ 4-метилумбеллиферилпальмитатом в 80 мМ НЕРЕБ при рН 7,5. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 54°С до и после добавления субстрата. Флуоресценцию считывали при _Ех360 нм и _Ет465 нм. 46 образцов молчащих мутаций дали уникальные последовательности (см. табл. 22 ниже). Показатели флуоресценции для каждого из 46 образцов молчащих мутаций также представлены в табл. 22, первой колонке Активность ИМВ. Образцы молчащих мутаций 2, 7, 9, 10, 13, 16, 23, 25, 40 и 44 содержали изменения аминокислот (а.к.) в дополнение к молчащим мутациям (см. табл. 23 ниже).

Таблица 22

- 125 020145

39330	4
38876	5
31705	6	СТС	СТТ	183
35315	7
36662	8
35945	9
37161	10
35399	11
39316	12	АСТ	ТСТ	133
39682	13	АСС	АСС	188
46354	14
39952	15
37049	16	АСС	АСС	188
34741	17
34261	18
30495	19
31485	20
34474	21
36301	22	СТС	СТО	128
37711	23
37855	24
34094	25
41223	26
35751	27
34878	28

36361	29
35801	30
42393	31	АСТ	ТСТ	133	СТС	СТТ	183	АСС	АСС	188
29278	32
34274	33
36610	34	АСС	АСС	188
42445	35	АСС	АСС	188
41151	36
39376	37
35116	38
35224	39	АСС	АСС	188
39996	40
35206	41
34163	42
34789	43	АСС	АСС	188
33168	44
37120	45
38626	46

Таблица 2з

заты количественно анализировали с помощью Вю-Каб Рго1ет Аккау (Вю-Каб, Негси1ек, СА, каталожный # 500-0006), основанного на методе Брэдфорда и затем нормализовали по экспрессии суммарного белка. Экспрессию анализировали с помощью ЗЭЗ-ПАГЭ.

- 126 020145

Исходную последовательность (8Ер ΙΌ N0:2 с мутациями О61Е, В72К и У163В), отрицательный контроль и 4 попадания молчащих мутаций экспрессировали в масштабе 1 л. Каждый образец лизировали с помощью микрофлуидизатора или в присутствии детергента ВРЕВ. Концентрацию белка в сырых и осветленных лизатах количественно оценивали с помощью Вю-Вай Рго1еш Аккау (Вю-Вай, Негси1ек, СА, каталожный # 500-0006), основанного на методе Брэдфорда. Затем каждую дорожку геля δΌδ-ПАГЭ загружали равным количеством белка. Сходные уровни пальмитазы наблюдались при всех тестированных условиях растворения и лизиса. Попадания молчащих мутаций 26, 34, 35 и 37 (табл. 22 и 23 выше) проявляли больший процент экспрессии пальмитазы по сравнению с исходной последовательностью (8Ер ΙΌ N0:2 с мутациями О61Е, В72К и У163В). Попадание молчащих мутаций 35 (табл. 22 и 23 выше) имело наибольший процент экспрессии пальмитазы. Попадание молчащих мутаций 35 содержало следующие семь молчащих мутаций по сравнению с исходной последовательностью: (ССС)35(ССТ), (СТС)102(СТТ), (АСО^ОАСТ), (СТС)117(СТТ), (ССС)126(АСС), (АСТ)133(ТСТ) и (АСС)188(АСС).

Пример 12. Иллюстративная эволюция повышенной экспрессии термоустойчивых пальмитаз.

Для оценки экспрессии 9 наилучших кандидатов термоустойчивых пальмитаз (пример 10, табл. 15, 16 и 17) 7 лучших молчащих мутаций (пример 11) были включены в каждый наилучший термоустойчивый вариант, как описано ниже. В результате каждый наилучший термоустойчивый вариант (термоустойчивые попадания 29, 40, 41, 74, 81, 202, 204, 238 и 244) содержал следующие молчащие мутации (35ССТ, 102СТТ, 108АСТ, 117СТТ, 126АСС, 133ТСТ, 188АСС), включенные в каждый из них. Вместе со включенными молчащими мутациями каждый наилучший термоустойчивый вариант был переименован добавлением 8М к концу номера термоустойчивого попадания. Например, термоустойчивое попадание 29 со включенными молчащими мутациями было переименовано в 29 8М. Сходным образом, попадание 40 стало 40 8М, попадание 41 стало 41 8М, попадание 74 стало 74 8М, попадание 81 стало 81 8М, попадание 202 стало 202 8М, попадание 204 стало 204 8М, попадание 238 стало 238 8М и попадание 244 стало 244 8М.

Для включения 7 лучших молчащих мутаций в 9 наилучших термоустойчивых вариантов использовали технологию ТМСА, как описано в публикации РСТ номер АО 2009/018449 и дополнительно описано ниже.

Для первого цикла эволюции ТМСА 9 наилучших термоустойчивых вариантов и лучшее экспрессионное попадание (попадание молчащих мутаций # 35) пропускали через компетентные клетки Е. со11 ХЕ1В1ие для метилирования ДНК. Попадание молчащих мутаций # 35 использовали в качестве матрицы ДНК. Для включения сочетаний мутаций в матрицу ДНК использовали олигонуклеотиды, представленные в табл. 24 ниже.

Таблица 24

Название олигонуклеотида	Последовательность олигонуклеотида -5-3’
1-ЕогйС	ТбОТОСТОСССбОСТТССТОТОТбАСОАСААСОССАССТСООТ (ЗЕО Ю N0:62)
2-ЕогйС	ТТСОТООСОАССТСбТОСАСТАТСТбОТСОАССООСТОСОО (ЗЕО Ю N0:63)
2-АК-РогйС	ТС66САТТС6Т66ССАССТСАТ60АСТАТСТ66ТС0АСС0ССТ(ЗС00 (ЗЕО Ю N0:64)
3-ЕогйС	СТ06ТС0АСС00СТ6С000СТ0Т0ТС0АА06С00ССС0Т00ТСА0АА6 (ЗЕО Ю N0:65)
4-ΚβνΰΟ	ТСОООСОССТТОТбОССААСААТССбСбСАТАбАООСССССОА (ЗЕО Ю N0:66)
4-ΑΙί-ΚβνΰΟ	ТС0С6С0ССТТ6Т06ССАА0АТТСС0С6САТА6А06СС0СС0А (ЗЕО Ю N0:67)
4-ΑΙί2-ΚενΰΟ	ТС660С6ССТТ6Т06ССАА(ЗАА66С0С0САТА0А0ССС0СС0А (ЗЕО Ю N0:68)
5-ΚβνΰΟ	сООСТТААТСТООАААТСССОАССОАТСООСАООТТОТССАССО (ЗЕО Ю N0:69)
6-ΚβνΰΟ	С0С0АССАСАСССС6АТС0ТАТ0САСС60СС0СТТААТСТ6СА (ЗЕО Ю N0:70)
7-ΚενϋΟ	ТТ000СТС0А0ТСА0А0СС0А6АС0С0АССА0СС66АССАСА6 (ЗЕО Ю N0:71)

Образцы амплифицировали в векторе ρΌΟΑ-кап, анализировали с помощью агарозного геля и обрабатывали Ι)ΓΝΙ. Образцами трансформировали компетентные клетки Е. со11 ХЕ1В1ие. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Секвенирование выявило несколько сочетаний мутаций. Однако некоторые сочетания были недостаточно представлены. Поэтому некоторые из новых конструктов первого цикла эволюции ТМСА были отобраны для использования в качестве матриц для следующего цикла эволюции ТМСА. Использованные матрицы представлены в табл. 25 ниже.

- 127 020145

Таблица 25

Название матрицы	Аминокислоты с желаемыми мутациями
Е8	48, 92, 95, 162, 172
НЮ	48, 116Ь, 162, 172
А8	85, 92, 95
СИ	116Ν, 172

Сочетания матриц и олигонуклеотидов, использованные во втором цикле эволюции ТМСА, представлены в табл. 26 ниже. Для каждого ряда в табл. 26 проводили отдельную реакцию ТМСА с созданием отдельной библиотеки для каждого ряда. Например, один цикл состоял из матрицы Е8 и праймеров 2Εογ и 7 Всу. Второй цикл состоял из матрицы Е8 и праймеров 2Εογ и 6 Всу. Отметим, что использовали несколько тех же праймеров, что и в первом цикле. Два дополнительных праймера были заказаны для второго цикла ПЦР. Эти олигонуклеотиды были названы 116ЕЕ и 162Е. Олигонуклеотид 116ЬЕ содержит обратную и комплементарную последовательность олигонуклеотида 4-АЙ2-Всу1С. Олигонуклеотид 162Е содержит обратную и комплементарную последовательность 5-ВсуЗС.

Таблица 26

Матрица для второго цикла ТМСА	Аминокислоты для добавления во втором цикле ТМСА	Праймеры для второго цикла ТМСА
Г8	85,225	2Еог и 7 Кеч
Е8	85	2Еог и бКеч
Н10	85,225	2Еог и 7 Кеч
Попадание молчащих мутаций #35	83, 85, 172	2АИ и бКЕУ
А8	116Ъ, 172, 225	ИбЬ Е и бКеч и 7Кеч
СИ	85, 162, 225	2Гог и 5Кеч и 7Кеч
Попадание молчащих мутаций #35	85,116,162,172	2Еог, 4Кеч, 5Кеч, бКеч
Попадание молчащих мутаций #35	85,162	2Еог и 5Кеч
СИ	162	162Е и 5Кеч

Образцы амплифицировали в векторе ρ^ΟV-каη, анализировали с помощью агарозного геля и обрабатывали БРНЕ Образцами трансформировали компетентные клетки Е. εο1ΐ ХЕШ1ис. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Секвенирование выявило достаточно высокую представленность 7 из 9 желаемых конструктов. Однако, поскольку два других конструкта были представлены недостаточно, потребовался дополнительный цикл эволюции ТМСА для получения остальных наиболее термоустойчивых вариантов в сочетании с семью молчащими мутациями. Для третьего цикла эволюции ТМСА использовали два новых конструкта. Эти матрицы представлены в табл. 27 ниже. Сочетания матриц и олигонуклеотидов, использованные в третьем цикле, представлены в табл. 28 ниже. Для каждого ряда в табл. 28 проводили отдельную реакцию ТМСА с созданием отдельной библиотеки для каждого ряда. Например, один цикл состоял из матрицы Е3 и праймеров 162Е и 7 Всу. Второй цикл состоял из матрицы В5 и праймеров 162Е и 6 Всу.

Таблица 27

Название матрицы	Аминокислоты с желаемыми мутациями
ЕЗ	85, 116Ν, 172
В5	85, 1161, 162

Матрица для третьего цикла ТМСА

Аминокислоты для добавления в третьем цикле ТМСА

Праймеры для использования в третьем цикле ТМСА 162Е и 7 Кеч

Таблица 28

ЕЗ

162, 225

В5

172

162 Г и бКеч

Образцы амплифицировали в векторе ρ^ΟV-каη, анализировали с помощью агарозного геля и обрабатывали ОРМ. Образцами трансформировали компетентные клетки Е. εο1ΐ ХЬШЫс. Колонии собирали, выращивали и секвенировали. Была получена достаточная представленность оставшихся двух конструктов. Полученной ДНК для всех желаемых конструктов Е. οο1ϊ ХЫИие трансформировали компетентные клетки Ρксиάοтοηак ί^οί^ε^^ Клетки выращивали в среде ΕΒ с добавлением урацила (750 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл). Образцы были подтверждены секвенированием.

Для скрининга библиотеку выращивали в минимальной среде М9 с добавлением урацила (750 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл). Проводили стандартные тесты с маслом путем загрузки осветленных

- 128 020145 лизатов при содержании воды 10% с использованием фосфатного буфера в тесты с сырым маслом при уровнях активности на иМВ-пальмитате, представленных в левой колонке табл. 29. Тесты с маслом загружали, гомогенизировали и затем непрерывно перемешивали, как в стандартных реакциях, при 25, 45 и 60°С. 50 мкл аликвоты 11% №0Н добавляли через 3 и 20 ч в каждую масляную реакционную смесь и затем гомогенизировали. Отбирали аликвоты через 20, 44 и 68 ч и подвергали стандартной экстракции хлороформом-метанолом и суммарному метанолизу с последующим анализом РАМЕ с помощью ГХ (как описано в примере 8 выше). Пальмитат, оставшийся в масле, указан для каждой аликвоты в табл. 29. Термоустойчивое попадание молчащих мутаций 29 8М резко снижало пальмитат с течением времени при 25°С.

Активность имв

Таблица 29

	Пальмитат 20 час (50 мкл каустика через 3 час)	Пальмитат 44 час (каустик через 3 и 20 час)	Пальмитат 68 час (каустик через 3 и 20 час)
Фермент	25°С	45°С	60°С	25°С	45°С	60°С	25С	45С	60С
Отрицательный	10,6%	10,6%	10,7%	10,7%	10,6%	10,6%	10,6%	10,6%	10,6%
Исходный	6,6%	7,0%	9,1%	5,5%	7,0%	8,9%	5,4%	7,0%	9,0%
29 ЗМ	4,5%	5,1%	6,3%	3,3%	4,8%	6,3%	2,8%	5,0%	6,3%
40 ЗМ	10,3%	9,9%	8,8%	10,1%	7,9%	8,7%	9,3%	7,1%	8,7%
41 ЗМ	10,3%	10,1%	8,1%	10,2%	8,4%	7,9%	9,6%	7,5%	7,9%
74 ЗМ	8,2%	5,3%	7,2%	5,0%	4,4%	7,4%	3,0%	4,4%	7,6%
81 ЗМ	10,2%	9,2%	7,2%	9,2%	6,7%	6,7%	6,6%	5,7%	6,6%
202 ЗМ	9,7%	6,6%	7,6%	7,8%	5,3%	7,6%	5,3%	5,1%
204 ЗМ	10,2%	8,6%	7,3%	8,9%	6,3%	7,4%	9,6%	5,9%	7,4%
238 ЗМ	9,9%	8,1%	6,7%	7,6%	6,0%	6,5%	5,0%	5,9%	6,5%
244 8М	9,7%	8,3%	8,1%	7,3%	6,1%	8,1%	5,3%	6,2%	8,1%

Пример 13. Калиевая соль олеиновой кислоты в качестве эмульгатора дает возможность ферменту образовывать 1% пальмитатное масло.

Образцы масла инкубировали с 10% олеатом калия для оценки влияния этого эмульгатора на взаимодействие масла с пальмитазой. Осветленные лизаты попадания 298М или отрицательного контроля загружали при содержании воды 5% в анализируемые образцы предварительно обработанного масла (А и В) и сырого масла (С). Предварительную обработку проводили с помощью обработки ферментом, нагревания, центрифугирования и последующей фильтрации масла для удаления камеди и водной фазы и снижения свободных жирных кислот, как описано в примере 14, с получением свободного от камеди масла с <5% пальмитата. Масло гомогенизировали до и после добавления фермента для обеспечения однородных эмульсий. 0,5 г имеющейся в продаже калиевой соли олеиновой кислоты отвешивали в 5 г масла, смешивали при 60°С для растворения и затем гомогенизировали. К реакционным смесям, отнесенным к каустическим, добавляли каустик для нейтрализации 1% СЖК. К анализируемым образцам масла добавляли фермент, повторно гомогенизировали и затем непрерывно перемешивали, как при стандартных реакциях. Отбирали аликвоты через 3, 24, 48, 72 и 120 ч. Аликвоты подвергали экстракции хлороформом-метанолом и суммарному метанолизу с последующим анализом РАМЕ с помощью ГХ (как описано в примере 8 выше). Пальмитат, оставшийся в масле, указан для каждой аликвоты в табл. 30 ниже. Предварительно обработанные масла были успешно доведены до уровня пальмитата 1%.

Таблица 30

		Пальмитат
А	Масло с 3,7% пальмитата	3 час	24	48
			час	час
	Фермент	3,4%	3,2%	3,1%
	Олеат+фермент	2,3%	1,2%	1,2%
	Олеат+каустик+фермент	2,3%	1,1%	1,2%
	Олеат+каустик (образец отрицательного	3,4%	3,3%	3,3%
	контроля)
В	Масло с 4,5% пальмитата	3 час	24
			час
	Олеат+фермент	4,2%	1,1%	1,0%
	Олеат (образец отрицательного контроля)	7,0%	6,7%	6,9%
С	Сырое масло	3 час	24	48	72 120
			час	час	час час
	Фермент	7,9%	4,9%	4,7%	4,6% 5,4%
	Олеат+фермент	10,0%	7,9%	6,6%	5,5% 3,9%
	Олеат+каустик+фермент	10,7%	10,4%	10,6%	10,5% 10,4%
	Олеат+каустик (образец отрицательного	10,7%	10,6%	10,6%	10,5% 10,5%
	контроля)

- 129 020145

Пример 14. 2 кг масла с промежуточным центрифугированием и эмульгированием олеатом обеспечивают получение масла с 1% пальмитата.

Совместное действие полипептида, промежуточной стадии фильтрации и добавления олеата калия для получения масла с 1% пальмитата оценивали в настольном формате. 2 кг сырого масла вводили во взаимодействие с 29 8М при содержании воды 5%. Реакционную смесь масла гомогенизировали в течение 1 мин с помощью 1КА при скорости 6 с доведением температуры до 25°С. Верхний смеситель был снабжен лопаткой от смесителя для краски и перемешивал реакционную смесь масла при 390 об/мин. После 1 ч взаимодействия скорость перемешивания повышали до 530 об/мин. Отслеживаемая температура взаимодействия колебалась от 21 до 29°С с прерывистым нагреванием с помощью нагревательного блока. Отбирали образцы для отслеживания изменений в профиле масла. После 28 ч реакционную смесь масла нагревали до 66°С и центрифугировали в гиротестере. Фракцию масла охлаждали до комнатной температуры в течение ночи при перемешивании лопаткой и затем охлаждали с помощью ледяной бани до температуры ниже 10°С. Добавляли диатомовую землю и отделяли ТАС8 и ВАС8 от свободных жирных кислот с помощью фильтрации через охлажденную бюхнеровскую воронку с ватмановской бумагой.

кг этого масла со сниженным пальмитатом использовали для инициации реакций с олеатом калия в качестве эмульгатора. К маслу добавляли 100 г олеата калия. Реакционные смеси нагревали до 60°С при перемешивании для обеспечения растворения. Масло охлаждали до 23°С и затем добавляли 50 мл фермента с получением содержания воды 5%. Это масло гомогенизировали до и после добавления фермента 29 8М для обеспечения однородных эмульсий. Аликвоты отбирали через 6, 21, 24, 28 ч, после фильтрации, после добавления олеата, при инициации нового теста и через 3, 20 и 22 ч при втором тесте. Аликвоты подвергали стандартной экстракции хлороформом-метанолом и суммарному метанолизу с последующим анализом ЕАМЕ с помощью ГХ (как описано в примере 8 выше). Жирные кислоты, оставшиеся связанными в масле, указаны для каждой аликвоты в табл. 31 ниже. Попадание 29 8М было способно довести уровень пальмитата в масле до 1%.

Таблица 31

Стеарат

Линоленат

Пальмитат

Олеат

Линолеат масло час час час час отфильтрованное масло масло+олеат

Пример 15. Двойное центрифугирование и фильтрация дают масло с низким пальмитатом.

Возможность отделения олеата калия после реакций масла продемонстрирована ниже. 2 кг сырого масла вводили во взаимодействие с 29 8М при содержании воды 5%. Реакционную смесь масла гомогенизировали в течение 1 мин с помощью 1КА при скорости 6 с доведением температуры до 25°С. Верхний смеситель был снабжен лопаткой от смесителя для краски и перемешивал реакционную смесь масла при 390 об/мин. После 1 ч взаимодействия скорость перемешивания повышали до 530 об/мин. Отслеживаемая температура взаимодействия колебалась от 21 до 29°С с прерывистым нагреванием с помощью нагревательного блока. Отбирали образцы для отслеживания изменений в профиле масла. После 28 ч реакционную смесь масла нагревали до 80°С и центрифугировали в гиротестере. Фракцию масла охлаждали до комнатной температуры в течение ночи при перемешивании лопаткой и затем охлаждали с помощью ледяной бани до температуры ниже 10°С. Добавляли диатомовую землю и отделяли ТАС8 и ВАС8 от свободных жирных кислот с помощью фильтрации через охлажденную бюхнеровскую воронку с ватмановской бумагой.

кг этого обработанного масла использовали для инициации реакций с олеатом калия в качестве эмульгатора. Добавляли 50 г олеата калия с получением 5%. Содержимое перемешивали и гомогенизировали. Вносили 50 мл фермента с получением содержания воды 5% и гомогенизировали в течение 1 мин при 6 на 1КА с доведением температуры до 26,6°С. Эту реакционную смесь масла перемешивали снабженным лопаткой от смесителя для краски верхним смесителем при 400 об/мин. Использовали прерывистое нагревание нагревательным блоком. Аликвоты отбирали через 3, 20, 24 и через 8, 28 и 48 ч после инициации второго теста. Аликвоты подвергали стандартной экстракции хлороформом-метанолом и суммарному метанолизу с последующим анализом ЕАМЕ с помощью ГХ (как описано в примере 8 выше). Жирные кислоты, оставшиеся связанными в масле, указаны для каждой аликвоты в табл. 32 ниже. 2 9 8М доводила уровень пальмитата до 1,5%. Это масло нагревали до 85°С и центрифугировали с удалением белковых остатков. Фракцию масла охлаждали до 6°С при перемешивании лопаткой, добавляли

- 130 020145 диатомовую землю и вещество разделяли на бюхнеровской воронке. Фильтрацию проводили при 25°С. Таблица 32

	Пальмитат	Стеарат	Олеат	Линолеат	Линоленат
масло	10,7%	4,8%	23,2%	52,9%	8,4%
3 час	8,3%	4,7%	23,5%	54,8%	8,7%
20 час	4,9%	4,7%	24,3%	57,4%	8,7%
24 час	4,7%	4,6%	24,1%	57,9%	8,7%
+8 час	3,2%	4,6%	24,4%	59,3%	8,5%
+28 час	1,9%	4,5%	24,4%	60,9%	8,3%
+48 час	1,5%	4,4%	24,5%	61,5%	8,1%

Пример 16. Оптимизация кодонов.

Версии с оптимизированными кодонами для экспрессии в Ркеиботопак Ниогексепк наилучшего термоустойчивого попадания с молчащими мутациями 29 8М (пример 12) были сконструированы с помощью двух разных методов. В первой версии с оптимизированными кодонами все кодоны в попадании 29 8М были заменены кодонами, предпочитаемыми Ркеиботопак Ниогексепк, включая вставленные 7 наилучших молчащих мутаций (пример 12). Эта версия была названа 298М-РГ (8Ер ΙΌ N0:22).

Предпочтительное использование кодонов Ркеиботопак Г1иогексепк было определено путем рассмотрения базы данных использования кодонов, доступной в сети на сайте Ка/ика ^NΑ Кекеагсй ^кШЩе (2-6-7 Ка/ика-каша1ап, К1кага/и, СЫЬа 292-0818 ^ΑРΑN, найденном в 2009 г. в Интернете <иКЕ:ййр://№№№.ка7ика.ог.]р/собоп/тбех.Ыш1>). В частности, при конструировании последовательности с оптимизированными кодонами 8Ер ΙΌ N0:22 были использованы паттерны использования кодонов для Ркеиботопак Г1иогексепк РГО-Ι (найденные в 2009 г. в Интернете <иКЬ: Нйр://¹№¹№¹№.ка7ика.ог.]р/собоп/сд1-Ьт/кйо¹№собоп.сд1?крес1ек=205922>) Ркеиботопак Г1иогексепк РГ-5 (найденные в 2009 г. в Интернете <иКЕ:ййр://№№№.ка7ика.ог.]р/собоп/сд1Ып/к11омсоск)п.сд1?крес1ек=220664>).

Во второй версии с оптимизированными кодонами все кодоны в попадании 298М также были заменены кодонами, предпочитаемыми Ркеиботопак Г1иогексепк, за исключением 7 наилучших молчащих мутаций (пример 11). Эта версия была названа 298М-РГ+8М (8Ер ΙΌ N0:23). 298М-РГ+8М (8Ер ΙΌ N0:23) является лучшим кандидатом по сравнению с 298М-РГ (8Ер ΙΌ N0:22).

8Ер Ι1) N0:22

АТ<ЗСТСААаСССССАССТТАСааССаТСТССТССаССААСТаССТСАТАТССС13(ЗССА тсатсАстастссаттссасассссАассААААтаассАААстассАСАтессаАасссатАс тастсстассссасттсстоасссАссАСААсасаАссАссатсстссасААаАссттсаАса тсасс<313СтттссатасА<зсасстаа<ЗААААСсасттсААСстса<зсАттсстаассАССТСА тссАстАсстестссАссссстссссассатсАссаАсссссссасаасасАаААСстААтса таатсаастсатссстсаасассстстАсасссссаАсттссассАСААаасссссаААстаА тссатАтсатсатсАсастсаастсссссттсасс&зсаАсстссАссссААССАТссст&ЗА АСАТСТАСаАССССАТСААСТСССАСАСабТССАСААССТССССАТСССаССССАТТТССАСА

ТТААССССССССТССАТАССАТСССССТСТССАССССССТССАСбСССТССТССССССССАСА ссАссаААсасАссссссАССАаАесаАССАасасттааАаставссатаАсссАСАТсааст ттсссастАасААСАСсссассааАассАстсстссссстастсассссссссстстоА

8Ер ΙΌ N0:23

АТаСТСААССССССАССТТАССаСССТСТССТССаССААСТаССТСАТАТСССаСССА тсст(ЗАСТССТСССТТСССССССССАСССААААТССССАААСТСССтаАТССССА(ЗССС01ТАС тсстсстссссассттсстаасссАсаАСААсссаАССАасатастасасААаАссттссАса тсассеестттасатасАассастаавААААбб12сттсААСстсаасАттсстсассАсстсА тссАСТАСстсатссАССссстасасасс(зтаАассАсассссассассасАаААс<зттАтсс тсетсаастссАатстссссаасстстАсасссаасАссттсассАСААаасссссаААСтсА тсАссАтсатсатсАсастсаастстсссттссссзасаАсстссАсассААссАтасстааА АСАТСТАССАССССАТСААСТСССАСАСССТССАСААССТССССАТССССгССгС&АТТТССАСА ттААассассастосАТАССАТсассататсаАасссастсаАсаааатаатсссссссоАСА свАсс(ЗААаасАасссссА(зсАаАсссАссАасасттааАастасссстаАсссАСАТс<заст ттасасстАасААСАСссссасбСАсасАСТсатссасстсстсоссасссссстстсА

Последовательности обеих версий гена с оптимизированными кодонами были посланы в ^NΑ 2.0 ^согрогаЩб (Меп1о Рагк, ΟΑ) для синтеза ДНК. Гены были синтезированы в векторе рЭ201 с сайтами рестрикции 8реI и ХЫ по обе стороны гена. После доставки синтезированных генов плазмиды были разрезаны ферментами рестрикции. Вектор рЭ0\-Кап также был разрезан теми же ферментами рестрикции и затем обработан щелочной фосфатазой из кишечника телят (№ν Епд1апб Вю1аЬк Ргобис! #М0290Ь). Все образцы очищали в геле и экстрагировали с помощью набора рМ.дшск де1 ехйасРоп (ρΐадеп, Ргобис! #28706). Вектор и вставки затем лигировали с использованием набора КосНе КарИ Ыдайоп (КосНе, Ргобис! # 11635379001). Продуктами лигирования затем трансформировали компетентные клетки Е.сой ХЬ1В1ие. Колонии собирали, выращивали и получали ДНК с помощью набора Р1адеп тЫ-ргер. Последовательность ДНК в образцах была подтверждена и ДНК затем использовали для трансформации

- 131 020145

Ркеиботопак Пиогексепк.

29ЗМ-РГ (ЗЕО ΙΌ NО:22), 29ЗМ-РГ+ЗМ (ЗЕО ΙΌ NО:23), 29ЗМ, исходную последовательность (ЗЕО ΙΌ NО:2 с мутациями Э61Е, К72К и У16зК) и контрольный вектор/хозяин затем выращивали и индуцировали в 250-мл встряхиваемых сосудах. Концентрацию белка в осветленных лизатах количественно определяли с помощью Вю-Каб Рго1ет Аккау (Вю-Каб, Негси1ек, СА, са1а1од# 500-0006), основанного на методе Брэдфорда, и затем нормализовали по экспрессии суммарного белка. Экспрессию анализировали с помощью ЗЭЗ-ПАГЭ с нанесением на каждую дорожку геля ЗЭЗ-ПАГЭ равного количества суммарного белка. 29ЗМ-РГ и 29ЗМ-РГ+ЗМ содержали более высокий процент экспрессированного белка пальмитазы по сравнению с 29ЗМ и исходной последовательностью. 29ЗМ-РГ+ЗМ имел слегка более высокий процент экспрессированной пальмитазы по сравнению с 29ЗМ-РГ. Следовательно, улучшение экспрессии было слегка более выраженным при наличии молчащих мутаций.

Был описан ряд вариантов осуществления, предлагаемых в настоящем описании. Тем не менее, следует понимать, что могут быть произведены различные модификации без выхода за пределы духа и объема, предлагаемых в настоящем описании.

Соответственно другие варианты осуществления входят в объем следующей формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая:

(a) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, где нуклеиновая кислота включает последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 7з, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 8з, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 9з, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой ЗЕО ΙΌ ^:1, имеющая по меньшей мере одну замену нуклеотида (или эквивалент), кодирующую аминокислотную замену У16зК (или ее эквивалент), где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, или кодирует полипептид или пептид, способные генерировать образование антитела, специфичного к гидролазе (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, з0, з5, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, з00, з50, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1з00, 1з50, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков или полной длины кДНК, транскрипта (мРНК) или гена;

(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а) или (Ь), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм ВЬАЗТ версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как Ь1ак1а11 -р Ь1ак1р -б пг ра1аа -ЕЕ и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(б) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид или пептид, обладающие гидролазной активностью, где нуклеиновая кислота включает последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементом нуклеиновой кислоты из (а), (Ь) или (с), где жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2Х ЗЗС при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;

(е) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной, активностью, где полипептид включает последовательность ЗЕО ΙΌ NО:2 или ее ферментативно активные фрагменты, имеющие, по меньшей мере, аминокислотную замену У16зК (или ее эквивалент);

(Г) (А) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(е), кодирующую полипептид, содержащий по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты и сохраняющий свою гидролазную активность, или (В) нуклеиновую кислоту по (Г) (А), где по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты включает замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками или консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком;

(д) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(Г), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности;

(1) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(д), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, дополнительно включающий гетерологичную последовательность;

(ί) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (1), где гетерологичная последовательность включает

- 1з2 020145 последовательность, кодирующую (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, определяемую часть или фермент, или состоит из нее; или (ί) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), полностью (целиком) комплементарную последовательности по любому из (а)-(|).
2. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность, где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов, где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,

84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.
3. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает:

(a) гидролиз триацилглицерина до диацилглицерина и свободной жирной кислоты, или гидролиз триацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз диацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз моноацилглицерина до свободной жирной кислоты и глицерина, или гидролиз триацилглицерина (ТАС), диацилглицерина (ЭАС) или моноацилглицерина (МАС);

(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;

(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (Р0Р), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (808), 1пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (Р08) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (ОНА) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);

(б) гидролазную активность, которая специфична в отношении положения триацилглицерина (ТАС), диацилглицерина (ЭАС) или моноацилглицерина (МАС), где, необязательно, гидролазная активность является 8η2-специфичной, 8η1- или 8η3-специфичной;

(е) гидролазную активность, которая специфична в отношении жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;

(ί) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;

(д) гидролазную активность, которая является региоспецифичной или химиоселективной, где, необязательно, гидролазная активность включает синтез энантиомерно чистых хиральных продуктов; или (1) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).
4. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет липазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
5. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от при

- 133 020145 близительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
6. Экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования, включающие нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, где, необязательно, носитель для клонирования включает вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, где, необязательно, вирусный вектор включает аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор, и, необязательно, носитель для клонирования включает бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, происходящий из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (ΥΑС) или искусственную хромосому млекопитающих (ΜΑ0).
7. Трансформированная клетка, включающая нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, или экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования по п.6, где, необязательно, клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения.
8. Трансгенное животное, отличное от человека, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, животное представляет собой мышь.
9. Трансгенное растение, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву или растение табака.
10. Трансгенное семя, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, семя представляет собой рис, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса, семя сои, зерно пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, рис, ячмень, арахис или семя растения табака.
11. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, включающий:

(a) последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полной) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью δΕΟ ΙΌ NО:2 или ее ферментативно активными фрагментами и содержащую, по меньшей мере, аминокислотную замену ν163Κ (или ее эквивалент), или где полипептид или пептид обладают гидролазной активностью или полипептид или пептид способны генерировать образование антитела, специфичного в отношении гидролазы (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) последовательность полипептида или пептида по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков либо на протяжении полной длины полипептида или пептида либо фермента и/или их ферментативно активных подпоследовательностей (фрагментов);

(c) последовательность полипептида или пептида по (Ь), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм ВЙ-ΑδΤ версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как Ь1аь1а11 -р Ь1аь1р -б пг ра!аа -ЕЕ и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(б) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид обладает (ί) гидролазной активностью или (ίί) иммуногенной активностью в том плане, что он способен генерировать образование антитела, которое специфически связывается с полипептидом, обладающим последовательностью по (а) и/или его ферментативно активными подпоследовательностями (фрагментами);

(е) аминокислотную последовательность по любому из (а)-(б), включающую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка и где полипептид или пептид сохраняют гидролазную активность;

(ί) аминокислотную последовательность по (е), где консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком или их сочетание;

(д) аминокислотную последовательность по (ί), где алифатический остаток включает аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислый остаток включает аспарагиновую кислоту,

- 134 020145 глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, включающий амидную группу, включает аспарагин, глутамин или их синтетический эквивалент; основной остаток включает лизин, аргинин, гистидин или их синтетический эквивалент или ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин, триптофан или их синтетический эквивалент;

(Н) последовательность полипептида по любому из (а)-(й), обладающего гидролазной активностью, но лишенного сигнальной последовательности;

(ΐ) последовательность полипептида по любому из (а)-(Н), обладающего гидролазной активностью и дополнительно включающего гетерологичную последовательность;

(ί) последовательность полипептида по (ί), где гетерологичная последовательность включает (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, и/или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, обнаруживаемую часть или фермент, или состоит из нее; или (т) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1.
12. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность, где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов, где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.
13. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает:

(a) гидролиз триацилглицерина до диацилглицерина и свободной жирной кислоты, или гидролиз триацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз диацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз моноацилглицерина до свободной жирной кислоты и глицерина, или гидролиз триацилглицерина (ТАС), диацилглицерина (ЭАС) или моноацилглицерина (ΜΑС);

(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;

(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (Р0Р), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (δ0δ), 1пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (Τ0δ) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (ОНА) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);

(й) гидролазную активность, которая специфична для положений триацилглицерина (ТАС), диацилглицерина (ЭАС) или моноацилглицерина (ΜΑС), где, необязательно, гидролазная активность является δп-специфичной, δΐ'11- или δп3-специфичной;

(е) гидролазную активность, которая специфична для жирных кислот, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;

(й) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;

(д) гидролазную активность, которая является региоспецифичной или химиоселективной, где, необязательно, гидролазная активность включает синтез энантиомерно чистых хиральных продуктов; или (Н) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).
14. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизи

- 135 020145 тельно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
15. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.
16. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает специфичную активность приблизительно при 37°С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 750 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка или от приблизительно 750 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка.
17. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, где, необязательно, гликозилирование может представлять собой Н-связанное гликозилирование, и, необязательно, полипептид гликозилирован после экспрессии в Р. ракШпк или 8. ροтЬе.
18. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или выше.
19. Препарат белка, включающий полипептид по п.11, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель.
20. Гетеродимер, включающий полипептид по п.11, и второй домен, где, необязательно, второй домен представляет собой полипептид и гетеродимер представляет собой слитый белок или второй домен представляет собой эпитоп или метку.
21. Г омодимер, включающий полипептид по п.11.
22. Иммобилизованный полипептид, где полипептид включает последовательность по п. 11 или ее подпоследовательность, где, необязательно, полипептид иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке.
23. Матрица, включающая (ί) иммобилизованный полипептид по п.11.
24. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11, где, необязательно, антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.
25. Гибридома, включающая антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11.
26. Пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция, включающие полипептид по п.11 или его подпоследовательность, где, необязательно, полипептид гликозилирован.
27. Матрица для доставки пригодного в пищу фермента, включающая полипептид по п.11, где, необязательно, матрица для доставки включает гранулу и, необязательно, полипептид гликозилирован или полипептид обладает термоустойчивой или термостабильной гидролазной активностью.
28. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий стадии (а) обеспечения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где нуклеиновая кислота включает последовательность по п.1; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, с получением тем самым рекомбинантного полипептида, где, необязательно, способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), с получением тем самым рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
29. Способ идентификации полипептида, обладающего гидролазной активностью, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение полипептида по п.11, (b) обеспечение субстрата гидролазы,

- 136 020145 (с) приведение полипептида в контакт с субстратом со стадии (Ь) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции указывает на полипептид, обладающий гидролазной активностью, где, необязательно, субстрат представляет собой жирную кислоту, триацилглицерин (ТАС), диацилглицерин (ОАО) или моноацилглицерин (МАС).
30. Способ повышения термоустойчивости или термостабильности гидролазного полипептида, причем способ включает гликозилирование гидролазного полипептида, где полипептид включает по меньшей мере тридцать последовательных аминокислот полипептида по п.11, чем повышается термоустойчивость или термостабильность гидролазного полипептида, где, необязательно, специфическая гидролазная активность является термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне выше чем от приблизительно -100 до приблизительно 115°С.
31. Композиция детергента, включающая полипептид по п.11, где полипептид включает гидролазную активность, где, необязательно, гидролаза представляет собой не поверхностно-активную гидролазу или поверхностно-активную гидролазу или, необязательно, гидролазу составляют в виде неводной жидкой композиции, литой твердой формы, гранулированной формы, в форме частиц, в форме прессованной таблетки, в форме геля, порошка, геля, гидрогеля, липосомы, аэрозоля, пасты или в форме суспензии.
32. Способ мытья объекта, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение композиции, включающей полипептид, обладающий гидролазной активностью, где полипептид включает полипептид по п. 11;

(b) обеспечение объекта;

(c) приведение полипептида со стадии (а) и объекта со стадии (Ь) в контакт в условиях, при которых композиция может мыть объект.
33. Способ стереоселективного гидролиза рацемических смесей сложных эфиров 2-замещенных кислот, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение гидролазы по п.11, где гидролаза является стереоселективной;

(b) обеспечение композиции, включающей рацемическую смесь сложных эфиров 2-замещенных кислот; и (c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид со стадии (Ь) может селективно гидролизовать сложные эфиры, где, необязательно, гидролаза иммобилизована и, необязательно, 2-замещенная кислота включает 2-арилоксизамещенную кислоту, К-2-(4-гидроксифенокси)пропионовую кислоту или 2-арилпропионовую кислоту, где, необязательно, 2-замещенная кислота включает кетопрофен.
34. Композиция, включающая гидролазу по п.11, вариант гидролазы по п.35 или фермент, полученный способом по п.37, где, необязательно, композиция представляет собой пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, диетическую добавку или диетическую композицию и где, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают питательную основу, включающую жир или жир и немного гидролазы или ее отсутствие, или, необязательно, гидролаза активируется солью желчной кислоты, или, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают состав для детей на основе коровьего молока, или, необязательно, гидролаза может гидролизовать длинноцепочечные жирные кислоты.
35. Способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с гидролазной активностью, включающий стадии:

(a) обеспечения матричной нуклеиновой кислоты по п.1 и (b) модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов или их сочетания в матричную последовательность для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты, где, необязательно, способ дополнительно включает экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для получения варианта гидролазного полипептида, и, необязательно, модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего подверженную ошибкам ПЦР, перетасовку, олигонуклеотид-специфический мутагенез, сборочную ПЦР, мутагенез со скрещиванием ПЦР, мутагенез ш νί\Ό, кассетный мутагенез, мутагенез с рекурсивной сборкой, мутагенез с экспоненциальной сборкой, сайт-специфический мутагенез, Сепе 811е 8а1ига1юп Ми1адепез18^8М (С88М^8М), повторную сборку с синтетическим лигированием (8ЬК или СепеКеаззетЫу) и их сочетание, или модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез содержащей урацил матрицы, мутагенез дуплекса с пропуском, мутагенез с репарацией точечного несоответствия, мутагенез штамма хозяина с недостаточностью репарации, химический мутагенез, радиогенетический мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с ограничением-селекцией, мутагенез с ограничением-очисткой, синтез искусственного гена, мутагенез со сборкой, создание мультимера гибридной нуклеиновой кислоты и их сочетание.
36. Способ по п.35, где способ итеративно повторяется до тех пор:

(а) (ί) пока не получают гидролазу, обладающую измененной или отличной активностью или изме

- 137 020145 ненной или отличной стабильностью, отличных от полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, вариант гидролазного полипептида является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после экспозиции при повышенной температуре, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает повышенным гликозилированием по сравнению с гидролазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает гидролазной активностью при высокой температуре, где гидролаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна при высокой температуре;

(ίί) пока не получают кодирующую последовательность гидролазы, характеризуемую использованием кодона, измененного по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, способ итеративно повторяется до тех пор, пока не получают ген гидролазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии или стабильности мРНК по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой; или (ш) пока не получают гидролазу, обладающую измененной субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, где, необязательно, субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой и стеариновой кислоты из масла; или (Ь) пока не получают гидролазу по (а), где вариант имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более либо все замены аминокислотных остатков (или их эквивалентов), как представлено в табл. 3 или 4.
37. Способ получения фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающий:

(a) обеспечение родительской гидролазы по п.11 и (b) получение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы, где, необязательно, модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2, как представлено в табл. 3 или 4 (или их эквивалентам), с получением тем самым фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты, где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты, где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.
38. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:2, но также включающая:

(a) по меньшей мере, модификацию аминокислотного остатка А48С; Ό49Κ; Э61А; Э61Е; К72Е; К72К; У83М; Κ85Υ; Е95К; Е116А Е1161; Е116Ь; Е1^; Е1160; Е116К; Е116Т; Е116У; 8133А; А1441; Е149Н; А1501; 1151С; 1151А; Р162С; Р162К; У163К; Ό164Κ; К172Н К172Ь; А2258 или его эквивалента либо их сочетания;

(b) по меньшей мере, модификацию одного кодона (ССС)35(ССТ); (ССС)45(ССА); (ССС)92(ССТ); (СТС)102(СТТ); (АСС)108(АСТ); (СТС)117(СТТ); (СТС)124(ТТС); (ССС)126(АСС); (СТС)128(СТС); (АСТ)133(ТСТ); (ТТС)135(ТТТ); (СТС)183(СТТ); (АСС)188(АСС) или его эквивалента либо их сочетания или (c) липазу по (а), дополнительно включающую, по меньшей мере, модификацию одного кодона (ССС)35(ССТ); (ССС)45(ССА); (ССС)92(ССТ); (СТС)102(СТТ); (АСС)108(АСТ); (СТС)117(СТТ); (СТС)124(ТТС); (ССС)126(АСС); (СТС)128(СТС); (АСТ)133(ТСТ); (ТТС)135(ТТТ); (СТС)183(СТТ); (АСС)188(АСС) или его эквивалента либо их сочетания.
39. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:2, но также включающая, по меньшей мере, модификацию одного аминокислотного остатка 120Ь; У628; С77Р; У83С; О88Н; Υ113Ο; Е116Т; Е116С; Н140К; К1468; Ι1678; Ь180Е; Е194М; А2110; 8212Υ; С215С; С215У; С215Ш; А218Н; А2188; У223А; А225М; А2250 или его эквивалента либо их сочетания.
40. Липаза по п.38 или 39, где субстратная специфичность или субстратная предпочтительность новой липазы включают предпочтительный или усиленный гидролиз жирной кислоты по сравнению с родительской 8Е0 ΙΌ N0:2, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.
41. Косметическое средство или крем, включающие липазу по п.38 или 39 либо полипептид по п.11.

- 138 020145
42. Фармацевтический агент, липосома, таблетка, капсула, состав или агент для доставки лекарства, включающие липазу по п.38 или 39 либо фермент по п.11.