MX2011002297A

MX2011002297A - Hidrolasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacerlas y usarlas.

Info

Publication number: MX2011002297A
Application number: MX2011002297A
Authority: MX
Inventors: Tim Hitchman; Jonathan Lyon; Nelson R Barton; Analia Bueno; Mark L Miller; Mark A Wall; Joslin Cuenca; Christopher L G Dayton
Original assignee: Verenium Corp
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-05-25
Also published as: CA3060541A1; EA020145B1; KR20110050703A; US20160108383A1; US20180057803A1; CN102197043A; US9238804B2; AR073942A1; ES2714673T3; EA020145B9; US20120227120A1; US8198062B2; EP2328907A4; CA3060541C; BRPI0918265A2; US20100055085A1; EP2328907A2; CA2735230C; CA2735230A1; WO2010025395A3

Abstract

Provistas son hidrolasas incluyendo lipasas saturasas, palmitasas y/o estereatasas y puleoneoclotidos que las codifican y métodos para hacer y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. Ademas provistos son polipeptidos , v. gr., lipasas, saturasas palmitasas y/o estearatasas métodos para preparar aceites saturados bajos o de grasa trans baja, tales como aceites animales o vegetales saturados bajos o de grasa trans baja, v. gr., aceites de soya o canola.

Description

HIDROLASAS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN, Y MÉTODOS PARA HACERLAS Y USARLAS Campo Técnico Provistos en la presente son polipéptidos con actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, polinucleótidos que los codifican, y métodos para hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. También provistos en la presente son péptidos y polipéptidos, v.gr., enzimas, teniendo actividad de lipasa, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , y métodos para tratamientos de grasas y aceites con tales péptidos y polipéptidos para preparar productos de aceite hidrolizados tales como aceites animales o vegetales saturados, v.gr., aceites de soya o cañóla, los productos de aceite así tratados, y productos comprendiendo tales aceites tratados.

Antecedentes Las aplicaciones industriales principales para hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, incluyen la industria de alimentos y bebidas, como agentes anti-endurecimiento para productos de panadería, y en la producción de margarina y otras composiciones para untar con sabores naturales a mantequilla; en sistemas de desechos; y en la industria farmacéutica donde son usados como auxiliares digestí-vos .

Aceites y grasas procesados son un componente principal de alimentos, aditivos alimenticios y auxiliares de procesamiento de alimentos, y también son materias primas renovables importantes para la industria química. Están disponibles en grandes cantidades a partir del procesamiento de semillas de aceite de plantas como salvado de arroz, maíz, colza, cañóla, girasol, olivo, palma o soya. Otras fuentes de aceites y grasas valiosos incluyen pescado, desechos de restaurante, y grasas animales producidas. Estas grasas y aceites son una mezcla de triglicéri-dos o lípidos, es decir, ácidos grasos (FA) esterificados sobre un andamiaje de glicerol. Cada aceite o grasa contiene una amplia variedad de diferentes estructuras de lípidos, definidas por el contenido de FA y su distribución regio-química en el esqueleto de glicerol. Estas propiedades de los lípidos individuales determinan las propiedades físicas del triacilglicérido puro. Por ende, el contenido de triacilglicéridos de una grasa o aceite en un grado mayor determina las propiedades físicas, químicas y biológicas del aceite. El valor de los lípidos se incrementa mayormente como una función de su pureza. Alta pureza puede lograrse por cromatografía o destilación fraccional, separando al triacilglicérido deseado del fondo mixto de la fuente de grasa o aceite. Sin embargo, esto es costoso y los rendimientos frecuentemente son limitados por los bajos niveles a los cuales el triacilglicérido ocurre naturalmente. Además, la facilidad de purificar al producto frecuentemente se compromete por la presencia de muchos triacilglicéridos similares estructuralmente y físicamente o químicamente en el aceite.

Una alternativa a purificar triacilglicéridos u otros lípidos a partir de una fuente natural es sintetizar los lípidos.

Los productos de tales procesos son llamados lípidos estructurales debido a que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre el esqueleto de glicerol . El valor de los lípidos también se incrementa mayormen-te mediante controlar el contenido de ácidos grasos y la distribución dentro del lípido. La eliminación de los triglicéri-dos, grasas o aceites de FA no deseables, o reemplazo de FA con propiedades no deseables por ácidos grasos con propiedades químicas, físicas o biológicas mejores o mas deseables, incremen-ta el valor de los lípidos. En particular, una necesidad existe por lipasas que pueden hidrolizar, v.gr., hidrolizar selectivamente, un ácido graso saturado (una "saturasa") , o aquellos que en particular, pueden hidrolizar, v.gr., hidrolizar selectivamente, un ácido palmítico (una "palmitasa") o un ácido esteárico (una "estearatasa" ) a partir de un esqueleto de glicerol.

Lipasas, tales como saturasas, v.gr., palmitasas y/o estearatasas pueden usarse para efectuar tal control donde el FA siendo removido, añadido o reemplazado es ácidos grasos saturados, v.gr., ácido palmítico o ácido esteárico.

Compendio Provistos en la presente son polipéptidos teniendo actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de lipasa. En un aspecto, provistas en la presente son clases novedosas de lipasas denominadas "saturasas", "palmitasas" y "estearatasas" . También provistos son polinucleótidos codificando polipéptidos teniendo actividad de saturasas, v.gr., palmitasa y/o estearatasa, y métodos para hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos . En un aspecto, provistos en la presente son polipéptidos, v.gr., enzimas, teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr. , actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa teniendo actividad de enzima (catalítica) termo-estable o termo-tolerante. Las actividades enzimáticas de los polipéptidos y péptidos según son provistos en la presente incluyen (comprenden o consisten en) una actividad de saturasa o una actividad de lipasa, incluyendo hidrólisis de lípidos, reacciones de acidólisis (v.gr., para reemplazar un ácido graso esterificado con un ácido graso libre) , reacciones de trans-esterificación (v.gr., intercambio de ácidos grasos entre triacilglicéridos) , síntesis de ésteres, reacciones de intercambio de ésteres y actividad de acil hidrolasa de lípido (LAII) . En otro aspecto, los polipéptidos según son provistos en la presente se usan para sintetizar productos quirales entantio-méricamente puros .

Los polipéptidos según son provistos en la presente pueden usarse en una variedad de contextos farmacéuticos, agrícolas e industriales, incluyendo la manufactura de cosméticos y nutracéuticos . Adicionalmente, los polipéptidos como son provistos en la presente pueden usarse en procesamiento de alimentos, fabricación de cerveza, aditivos para baño, producción de alcohol, síntesis de péptidos, enantioselectividad, preparación de cuero en la industria de la piel, gestión de desechos y degradación de desechos animales, recuperación de plata en la industria fotográfica, tratamiento médico, eliminación de gomas de la seda, degradación de bio-películas, conversión de biomasa a etanol, bio-defensa, agentes anti-microbianos y desinfectantes, productos de cuidado personal y cosméticos, reactivos de biotecnología, en aumentar el rendimiento de almidón a partir de molienda húmeda de maíz, y como farmacéuticos tales como auxiliares digestivos y agentes anti- inflamatorios (antiflogísticos) .

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) y métodos para producir aceites saturados bajos, v.gr., aceites con un contenido de ácidos grasos saturados menor, incluyendo aceites bajos en ácidos grasos palmitato, estearato, miristato, laurato o butirato y/o ácido caprílico (ácido octanoico) . Cualquier aceite vegetal, v.gr., aceite de cañóla, aceite de soya, o aceite o grasa animal, v.gr., sebo, pueden tratarse con una composición, o por un método, como se proveen en la presente. Cualquier alimento, bien comestible, productos para freír o cocinar (v.gr., salsas, marinadas, condimentos, aceites para rociar, margarinas, aceites para hornear, mayonesa, aceites para cocinar, aceites para ensaladas, aderezos cuchareables y derramables, y similares, y productos hechos con los mismos) puede comprender un aceite vegetal o grasa animal que se ha tratado con una composición o por un método como es provisto en la presente. Aceites vegetales modificados para ser aceites saturados menores pueden usarse en cualquier alimento, articulo comestible o productos para hornear o cocinar, v.gr., salsas, marinadas, condimentos, aceites de rocío, margarinas, aceites para hornear, mayonesa, aceites para cocinar, aceites para ensaladas, aderezos cuchareables y derramables y similares. En una forma de realización, provistos en la presente son aceites, tales como aceites vegetales, v.gr., aceite de cañóla o aceite de soya, y alimentos o productos para hornear o cocinar, incluyendo salsas, marinadas, condimentos, aceites de rocío, margarinas, aceites para hornear, mayonesa, aceites para cocinar, aceites para freír, aceites para ensaladas, aderezos cuchareables y derramables y similares, donde el aceite o alimento, producto para hornear o cocinar ha sido modificado usando una enzima como es provisto en la presente. En un aspecto, estos aceites vegetales, v.gr., aceite de cañóla, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de coriandro, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de avellana, aceite de cáñamo, aceite de linaza, aceite de hierba de la pradera, aceite de olivo, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de maní, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cártamo, aceite de sasanqua, aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de pino, aceite de camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o "crianza" tradicional tales como alto oleico, bajo linolénico, o aceites saturados bajos (aceite de cañóla alto oleico, aceite de soya bajo linolénico o aceites de girasol altos esteáricos) , grasas animales (sebo, lardo, grasa de mantequilla, y grasa de pollo) , aceites de pescado (aceite de eperlano, aceite de hígado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque, y aceite de sábalo) , o mezclas físicas de cualquiera de los anteriores, y alimentos o productos para hornear, freír o cocinar, comprenden aceites con un contenido menor de ácidos grasos saturados, incluyendo aceites bajos en ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octanoico) , etc., procesados mediante usar una composición o método según son provistos en la presente.

En un aspecto, provistos en la presente son polipépti-dos, por ejemplo, enzimas y anticuerpos catalíticos, teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo actividades enzimáticas termo-estables y termo-tolerantes , y actividad específicas de ácidos grasos y selectivas de ácidos grasos, y actividades enzimáticas tolerantes a bajo o alto pH, y polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos , incluyendo vectores, células hospederas, plantas transgénicas y animales no humanos, y métodos para hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos.

En otro aspecto, provistos en la presente son ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes , que comprenden: (a) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido, donde el ácido nucleico comprende una secuencia teniendo por lo menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 8 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas, o completa (100%) de identidad de secuencia con: (i) SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,., SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o (ii) el ácido nucleico de la SEQ ID NO:l teniendo uno o mas cambios de nucleótidos (o los equivalentes de los mismos) codificando uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de aminoácidos (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico de (i) o (ii) codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, o codifica un polipéptido o péptido capaz de generar un anticuerpo específico de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) (un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno) , (b) el ácido nucleico (polinucleótido) de (a) , donde las identidades de secuencia se determinan: (A) por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, o (B) sobre una región de por lo menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,050, 1,100, 1,150, 1,200, 1,250, 1,300, 1,350, 1,400, 1,450, 1,500, 1,550 o mas residuos o la longitud completa de un ADNc, transcripción (ARNm) o gen, (c) el ácido nucleico (polipéptido) de (a) o (b) , en donde, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 en donde una configuración de filtrado se fija en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se fijan en predeterminadas, (d) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido o péptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida bajo condiciones severas al complemento del ácido nucleico de (a) , (b) o (c) , donde las condiciones severas comprenden un paso de lavado que comprende un lavado en 0.2X SSC a una temperatura de alrededor de 65°C por alrededor de 15 minutos, (e) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, donde el polipéptido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de aminoácidos (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, (f) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO.-10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20 o fragmentos enzimáticamente activos de los mismos, (g) (A) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (f) y codificando un polipéptido teniendo por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos y reteniendo su actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palraitasa y/o estearatasa, o (B) el ácido nucleico de (g) (A) , en donde la por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos comprende sustituir un aminoácido con otro aminoácido de características similares; o, una sustitución conservadora comprende: reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alif tico; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo portando un grupo amida con otro residuo portando un grupo amida; intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, (h) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (g) codificando un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, pero careciendo de una secuencia de señal, (i) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (h) codificando un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprendiendo además una secuencia heteróloga, (j) el ácido nucleico (polinucleótido) de (i), donde la secuencia heteróloga comprende, o consiste de una secuencia que codifica: (A) una secuencia de señal heteróloga, (B) la secuencia de (A) , donde la secuencia de señal heteróloga se deriva de una enzima heteróloga, o (C) , un marcador, un epítopo, un péptido que apunta, una secuencia disociable, una fracción detectable o una enzima, o (k) una secuencia de ácidos nucleicos (polinucleótido) enteramente (completamente) complementaria a la secuencia de cualquiera de (a) a (j) .

En un aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante codifica un polipéptido o péptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, el cual es termo-estable. Los polipéptidos y péptidos codificados por ácidos nucleicos como son provistos en la presente, o cualquier polipéptido o péptido como es provisto en la presente, puede retener actividad enzimática o de ligadura (v.gr., ligadura a sustrato) bajo condiciones que comprenden un rango de temperaturas entre alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20°C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25 °C a alrededor de 37°C, alrededor de 37°C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55°C, alrededor de 55°C a alrededor de 70°C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75°C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90°C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110 °C, alrededor de 110 °C a alrededor de 120 °C, o 95°C( 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 11?,°C, 114 °C, 115 °C o mas. Provistos en la presente son polipéptidos termo-estables que retienen una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa, a una temperatura en los rangos descritos anteriormente, a alrededor de pH 3.0, alrededor de pH 3.5, alrededor de pH 4.0, alrededor de pH 4.5, alrededor de pH 5.0, alrededor de pH 5.5, alrededor de pH 6.0, alrededor de pH 6.5, alrededor de pH 7.0, alrededor de pH 7.5, alrededor de pH 8.0, alrededor de pH 8.5, alrededor de pH 9.0, alrededor de pH 9.5, alrededor de pH 10.0, alrededor de pH 10.5, alrededor de pH 11.0, alrededor de pH 11.5, alrededor de pH 12.0 o mas .

En un aspecto, polipéptidos según son provistos en la presente pueden ser termo- tolerantes y pueden retener una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, después de exposición a una temperatura en el rango de alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20°C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25°C a alrededor de 37 °C, alrededor de 37 °C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55°C, alrededor de 55°C a alrededor de 70 °C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75°C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90 °C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110°C, alrededor de 110°C a alrededor de 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o mas .

En algunas formas de realización, los polipéptidos termo-tolerantes retienen una actividad de hidrolasa v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, después de exposición a una temperatura en los rangos descritos anteriormente, a alrededor de pH 3.0, alrededor de pH 3.5, alrededor de pH 4.0, alrededor de pH 4.5, alrededor de pH 5.0, alrededor de pH 5.5, alrededor de pH 6.0, alrededor de pH 6.5, alrededor de pH 7.0, alrededor de pH 7.5, alrededor de pH 8.0, alrededor de pH 8.5, alrededor de pH 9.0, alrededor de pH 9.5, alrededor de pH 10.0, alrededor de pH 10.5, alrededor de pH 11.0, alrededor de pH 11.5, alrededor de pH 12.0 o mas.

En una forma de realización, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes comprenden una secuencia que híbrida bajo condiciones severas a un ácido nucleico según es provisto en la presente, v.gr., un ácido nucleico ejemplar como es provisto en la presente comprendiendo una secuencia como se señala en las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o una secuencia como se señala en la SEQ ID NO:l teniendo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos (modificaciones de secuencia a la SEQ ID N0:1) como se señalan en la Tabla3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o fragmentos o sub-secuencias de las mismas, y la secuencias (completamente) complementarias a las mismas. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. El ácido nucleico puede ser de por lo menos alrededor de 10, 15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas residuos de longitud o la longitud completa de un gen o transcripción comprendiendo la SEQ ID NO:l, y teniendo una secuencia como se señala en la SEQ ID N0:1 teniendo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos (modificaciones de secuencia de aminoácidos) a la SEQ ID N0:1 señalados en la Tabla3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y las secuencias (completamente) complementarias a las mismas. En un aspecto, las condiciones severas incluyen un paso de lavado comprendiendo un lavado en 0.2X SSC a una temperatura de alrededor de 65°C por alrededor de 15 minutos.

En una forma de realización, una sonda de ácido nucleico, v.gr., una sonda para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende una sonda que comprende o consiste de por lo menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000 o más, bases consecutivas de una secuencia según es provista en la presente, o fragmentos o sub- secuencias de las mismas, donde la sonda identifica al ácido nucleico por ligadura o hibridación. La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende por lo menos alrededor de 10 a 50, alrededor de 20 a 60, alrededor de 30 a 70, alrededor de 40 a 80, o alrededor de 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia según es provista en la presente, o fragmentos o sub-secuencias de las mismas. La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende por lo menos alrededor de 10 a 50, alrededor de 20 a 60, alrededor de 30 a 70, alrededor de 40 a 80, o alrededor de 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de ácidos nucleicos según, es provista en la presente, o una sub-secuencia de la misma.

En una forma de realización, un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica a un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende un par de cebadores que comprende o consiste de un par de cebadores capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia según es provista en la presente, o fragmentos o sub-secuencias de las mismas. Una o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación puede comprender un oligonucleótido comprendiendo por lo menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia.

En una forma de realización, métodos para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprenden amplificación de un ácido nucleico de plantilla con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente, o fragmentos o sub-secuencias de la misma .

En una forma de realización, cartuchos de expresión comprenden un ácido nucleico según es provisto en la presente o una sub-secuencia del mismo. En un aspecto, el cartucho de expresión puede comprender al ácido nucleico que está enlazado operativamente a un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, mamífero o de plantas. En un aspecto, el promotor de plantas puede ser un promotor de papa, arroz, maíz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tej ido o un promotor regulado ambientalmente o regulado en base a desarrollo. Por ende, el promotor puede ser, v.gr., un promotor específico de semilla, específico de hoja, específico de raíz, específico de tallo o inducido por abscisión. En un aspecto, el cartucho de expresión puede además comprender un vector de expresión de plantas o de virus de plantas .

En una forma de realización, vehículos de clonación comprenden un cartucho de expresión (v.gr., un vector) como es provisto en la presente o un ácido nucleico como es provisto en la presente. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adeno-asociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un plásmido, un vector derivado de bacteriófago Pl (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) .

En una forma de realización, células transformadas comprenden un ácido nucleico según es provisto en la presente o un cartucho de expresión (v.gr., un vector) según es provisto en la presente, o un vehículo de clonación según es provisto en la presente. En un aspecto, la célula transformada puede ser ,una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de planta. En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, trigo, arroz, maíz, tabaco o cebada. La célula transformada puede ser cualquiera de las células hospederas familiares a los técnicos en la materia, incluyendo células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insectos, o células de plantas. Células bacterianas ejemplares incluyen cualquier especie dentro de los géneros Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas y Staphylococcus, incluyendo, v.gr., Escherichia coli , Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens . Células fúngicas ejemplares incluyen cualquier especie de Aspergillus. Células de levadura ejemplares incluyen cualquier especie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe . Células de insectos ejemplares incluyen cualquier especie de Spodoptera o Drosophila, incluyendo Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Células animales ejemplares incluyen líneas celulares CHO, COS o de melanoma de Bowes o cualquiera de ratón o humano.

En una forma de realización, plantas transgénicas comprenden un ácido nucleico como es provisto en la presente o un cartucho de expresión (v.gr., un vector) como es provisto en la presente. La planta transgénica puede ser una planta de maíz, una planta de papa, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de semilla oleaginosa, una planta de colza, una planta de soya, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco .

En una forma de realización, semillas transgénicas comprenden un ácido nucleico según es provisto en la presente o un cartucho de expresión (v.gr., un vector) según es provisto en la presente. La semilla transgénica puede ser arroz, una semilla de maíz, una semilla de trigo, una semilla oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soya, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de ajonjolí, un maní o una semilla de planta de tabaco.

En una forma de realización, polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes tienen una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o esteara-tasa, o polipéptidos capaces de generar una respuesta inmunológi-ca específica para una hidrolasa, v.gr., una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa (v.gr., un epítopo) ; y en aspectos alternativos péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente comprenden una secuencia: (a) teniendo por lo menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 821> , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas , o completa (100%) de identidad de secuencia con: (i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, y teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de residuos de aminoácidos (o equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla3 , Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en donde el polipéptido o péptido de (i) o (ii) tiene una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, o el polipéptido o péptido es capaz de generar un anticuerpo específico de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) (un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno) , (b) el polipéptido o péptido de (a) , en donde las identidades de secuencia se determinan: (A) por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por una inspección visual, o (B) sobre una región de por lo menos alrededor de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 o mas residuos de aminoácidos, o sobre la longitud completa del polipéptido o péptido o enzima, y/o sub-secuencias enzimáticamen-te activas (fragmentos) de las mismas, (c) el polipéptido o péptido de (b) , donde el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde una configuración de filtrado se fija en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se fijan a predeterminadas ; (d) una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico provisto en la presente, en donde el polipéptido tiene (i) una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, o, (ii) tiene actividad inmunogena en que es capaz de generar un anticuerpo que se liga específicamente a un polipéptido teniendo una secuencia de (a) , y/o sub-secuencias enzimáticamente activas (fragmentos) de la misma; (e) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (d) , y comprendiendo por lo menos una sustitución conservadora de residuos de aminoácidos, y el polipéptido o péptido retiene una actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa; (f) la secuencia de aminoácidos de (e) , en donde la sustitución conservadora comprende reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo portando un grupo amida con otro residuo portando un grupo amida; intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, o una combinación de los mismos , (g) la secuencia de aminoácidos de (f ) , en donde el residuo alifático comprende alanina, valina, leucina, isoleucina o un equivalente sintético de los mismos; el residuo ácido comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo comprendiendo un grupo amida comprendiendo asparagina, glutamina o un equivalente sintético de los mismos; el residuo básico comprende lisina, arginina, histidina o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo aromático comprende fenilalanina, tirosina, triptofano o un equivalente sintético de los mismos; (h) el polipéptido de cualquiera de (a) a (f) teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, pero careciendo de una secuencia de señal , (i) el polipéptido de cualquiera de (a) a (h) teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprendiendo además una secuencia heteróloga; (j) el polipéptido de (i), en donde la secuencia heteróloga comprende, o consiste de: (A) una secuencia de señal heteróloga, (B) la secuencia de (A) , en donde la secuencia de señal heteróloga se deriva de una enzima heteróloga, y/o (C) un marcador, un epítopo, un péptido que apunta, una secuencia disociable, una fracción detectable o una enzima; o (m) comprendiendo una secuencia de aminoácidos codificada por cualquier secuencia de ácidos nucleicos según es provisto en la presente.

Secuencias de polipéptido o péptido ejemplares según son provistas en la presente incluyen la SEQ ID NO: 2, y sub-secuencias de las mismas y variantes de las mismas, v.gr., por lo menos alrededor de 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o mas residuos en longitud, o sobre la longitud completa de una enzima, todas teniendo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos de aminoácidos (modificaciones de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2) señalados en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23. Secuencias de polipéptido o péptido ejemplares según son provistas en la presente incluyen secuencias codificadas por un ácido nucleico según es provisto en la presente. Secuencias de polipéptido o péptido ejemplares según son provistas en la presente incluyen polipéptidos o péptidos específicamente ligados por un anticuerpo según es provisto en la presente. En un aspecto, un polipéptido según es provisto en la presente tiene por lo menos una actividad de hidrolasa, v.gr. , actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la actividad es una actividad regio-selectiva y/o quimio-selectiva .

En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender al polipéptido según es provisto en la presente que carece de una secuencia (péptido) de señal, v.gr. , carece su secuencia de señal homóloga, y en un aspecto, comprende una secuencia (péptido) de señal heteróloga. En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender al polipéptido según es provisto en la presente comprendiendo una secuencia de señal heteróloga, tal como una secuencia de seña de hidrolasa o no de hidrolasa heteróloga (v.gr., no lipasa, no saturasa o no palmitasa) . En un aspecto, proteínas quiméricas comprenden un primer dominio comprendiendo una secuencia de señal según es provista en la presente y por lo menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente, u otra hidrolasa .

En un aspecto, la actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una actividad específica en alrededor de 37°C en el rango de alrededor de 100 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una actividad específica de alrededor de 500 a alrededor de ,750 unidades por miligramo de proteína. Alternativamente, la actividad de hidrolasa comprende una actividad específica a 37°C en el rango de alrededor de 500 a alrededor de 1,200 unidades por miligramo de proteína. En un aspecto, la actividad de hidrolasa comprende una actividad específica a 37°C en el rango de alrededor de 750 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la termo-tolerancia comprende retención de por lo menos la mitad de la actividad específica de la hidrolasa a 37°C después de calentarse a una temperatura elevada. Alternativamente, la termo-tolerancia puede comprender retención de actividad específica a 37°C en el rango de alrededor de 500 a alrededor de 1,200 unidades por miligramo de proteína después de calentarse a una temperatura elevada.

En una forma de realización, los polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes según son provistos en la presente comprenden por lo menos un sitio de glicosilación . En un aspecto, la glicosilación puede ser una glicosilación N-enlazada. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosilado después de expresarse en P. pastoris o S. pombe o en plantas, tales como plantas productoras de aceite, v.gr., soya, cañóla, arroz, girasol, o variantes modificadas genéticamente (OMG) de estas plantas .

En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) bajo condiciones que comprenden alrededor de pH 6.5, H 6 , pH 5.5, pH 5, pH 4.5 o pH 4 o menor. En otro aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) bajo condiciones que comprenden alrededor de pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12.0 o mas.

En una forma de realización, preparaciones de proteína comprenden un polipéptido como es provisto en la presente, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido o un gel .

En un aspecto, heterodímeros según son provistos en la presente comprenden un polipéptido y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o un marcador. En un aspecto, homodímeros según son provistos en la presente comprenden un polipéptido según es provisto en la presente.

En una forma de realización, polipéptidos inmovilizados según son provistos en la presente tienen una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en donde el polipéptido comprende un polipéptido según es provisto en la presente, un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente, o un polipéptido comprendiendo un polipéptido según es provisto en la presente y un segundo dominio. En un aspecto, un polipéptido según es provisto en la presente puede ser inmovilizado sobre una célula, una vesícula, un liposoma, una película, una membrana, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un micro-electrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, un cristal, una tableta, una pildora, una cápsula, un polvo, un aglomerado, una superficie, una estructura porosa, un arreglo o un tubo capilar, o materiales tales como granos, hollejos, corteza, piel, cabello, esmalte, hueso, cáscara y materiales derivados de los mismos. Polinucleótidos , polipéptidos y enzimas según son provistos en la presente pueden formularse en una forma sólida tal como un polvo, una preparación liofilizada, gránulos, una tableta, una barra, un cristal, una cápsula, una pildora, una pelotilla, o en una forma líquida tal como una solución acuosa, un aerosol, un gel, una pasta, una lechada, una emulsión acuosa/aceite, una crema, una cápsula, o una suspensión vesicular o micelar.

En una forma de realización, suplementos alimenticios para un animal comprenden un polipéptido según es provisto en la presente, v.gr, un polipéptido codificado por el ácido nucleico según es provisto en la presente. En un aspecto, el polipéptido en el suplemento alimenticio puede ser glicosilado. En una forma de realización, matrices de entrega de enzimas comestibles comprenden un polipéptido según es provisto en la presente, v.gr., un polipéptido codificado por el ácido nucleico según es provisto en la presente. En un aspecto, la matriz de entrega comprende una pelotilla. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosilado. En un aspecto, la actividad de hidrolasa es termo-tolerante. En otro aspecto, la actividad de hidrolasa es termo-estable.

En una forma de realización, métodos para aislar o identificar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) comprenden los pasos de: (a) proporcionar un anticuerpo según es provisto en la presente; (b) proporcionar una muestra que comprende polipép-tidos; y (c) poner en contacto la muestra del paso (b) con el anticuerpo del paso (a) bajo condiciones en donde el anticuerpo puede ligarse específicamente al polipéptido, con lo cual aislando o identificando un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa).

En una forma de realización, métodos para hacer un anticuerpo anti-hidrolasa comprenden administrar a un animal no humano un ácido nucleico según es provisto en la presente o un polipéptido según es provisto en la presente o sub-secuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunológica humoral, con lo cual haciendo un anticuerpo anti-hidrolasa. Provistos en la presente son métodos para hacer un anticuerpo anti-hidrolasa comprendiendo administrar a un animal no humano un ácido nucleico según es provisto en la presente o un polipéptido según es provisto en la presente o sub-secuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunológica.

En una forma de realización, métodos para producir un polipéptido recombinante comprenden los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico según es provisto en la presente enlazado operativamente a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permiten expresión del polipéptido, con lo cual produciendo un polipéptido recombinante. En un aspecto, el método puede además comprender transformar una célula hospedera con el ácido nucleico del paso (a) seguido por expresar al ácido nucleico del paso (a) , con ello produciendo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

En una forma de realización, métodos para identificar un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido según es provisto en la presente; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) proporcionar un sustrato de hidrolasa; y (c) poner en contacto al polipéptido o un fragmento o variante del mismo del paso (a) con el sustrato del paso (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detectan un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .

En una forma de realización, métodos para identificar un sustrato de hidrolasa comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido según es provisto en la presente; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con el sustrato de prueba del paso (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción identifican al sustrato de prueba como un sustrato de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .

En una forma de realización, métodos para determinar si un compuesto de prueba se liga específicamente a un polipéptido comprenden los siguientes pasos: (a) expresar un ácido nucleico o un vector comprendiendo al ácido nucleico bajo condiciones permisivas para traducción del ácido nucleico a un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende un ácido nucleico según es provisto en la presente, o, proporcionar un polipéptido según es provisto en la presente; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto al polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se liga específicamente al polipéptido.

En una forma de realización, métodos para identificar un modulador de una actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprenden los siguientes pasos : (a) proporcionar un polipéptido según es provisto en la presente o un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con el compuesto de prueba del paso (b) y medir una actividad de la hidrolasa, en donde un cambio en la actividad de hidrolasa medida en presencia del compuesto de prueba comparada con la actividad en ausencia del compuesto de prueba proporciona una determinación de que el compuesto de prueba modula la actividad de hidrolasa. En un aspecto, la actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) puede medirse mediante proporcionar un sustrato de hidrolasa y detectar una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, o, un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad de un producto de reacción. Una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba según se compara con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica al compuesto de prueba como un activador de actividad de hidrolasa. Un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba según se compara con la cantidad del sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica al compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de hidrolasa.

En una forma de realización, sistemas de computador comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenado en el mismo una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según son provistas en la presente (v.gr., un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente) . En un aspecto, el sistema de computador puede además comprender un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos teniendo por lo menos una secuencia de referencia almacenada en el mismo. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computador que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema de computador puede además comprender un identificador que identifica uno o mas aspectos en dicha secuencia. En una forma de realización, medio legible por computador tiene almacenado en el mismo una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según son provistas en la presente.

En una forma de realización, métodos para identificar un aspecto en una secuencia comprenden los pasos de: (a) leer la secuencia usando un programa de computador que identifica uno o mas aspectos en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según son provistas en la presente; y (b) identificar uno o mas aspectos en la secuencia con el programa de computador.

En otra forma de realización, provistos en la presente son métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia comprendiendo los pasos de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa de computador el cual compara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según son provistas en la presente; y (b) determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computador. El paso de determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede además comprender un identificador que identifica uno o mas aspectos en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender leer la primera secuencia usando un programa de computador e identificar uno o mas aspectos en la secuencia.

En una forma de realización, métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo actividad de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) a partir de una muestra comprendiendo los pasos de: (a) proporcionar un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, en donde el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra o tratar la muestra tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación con el par de cebadores de amplificación; y (c) combinar al ácido nucleico del paso (b) con el par de cebadores de amplificación del paso (a) y amplificar ácido nucleico a partir de la muestra, con ello aislando o recuperando un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa a partir de una muestra. En una forma de realización, la muestra es una muestra ambiental, v.gr., una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de tierra, una muestra de aire o una muestra biológica, v.gr., una célula bacteriana, una célula protozoaria, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fúngica o una célula de mamífero. Una o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación puede comprender un oligonucleótido comprendiendo por lo menos alrededor de 10 a 50 o mas bases consecutivas de una secuencia según es provista en la presente.

En una forma de realización, métodos para incrementar la termo-tolerancia o termo-estabilidad de un polipéptido de hidrolasa comprenden glicosilar un polipéptido de hidrolasa, en donde el polipéptido comprende por lo menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido según es provisto en la presente; o un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente, con lo cual incrementando la termo-tolerancia o termo-estabilidad del polipéptido de hidrolasa. En un aspecto, la actividad específica de hidrolasa puede ser termo-estable o termo-tolerante a una temperatura en el rango de mas de alrededor de 37°C a alrededor de 95 °C.

En una forma de realización, métodos para sobre-expresar un polipéptido de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) recombinante en una célula comprenden expresar un vector comprendiendo un ácido nucleico según es provisto en la presente o una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente, en donde las identidades de secuencia se determinan por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, en donde la sobre-expresión es efectuada por el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o por amplificación de genes del vector.

En una forma de realización, composiciones detergentes comprendiendo un polipéptido según es provisto en la presente o un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente comprenden una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la hidrolasa puede ser una hidrolasa no de superficie activa. En otro aspecto, la hidrolasa puede ser una hidrolasa de superficie activa.

En una forma de realización, métodos para lavar un objeto comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido según es provisto en la presente o un polipéptido codificado por un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) y al objeto del paso (b) bajo condiciones en donde la composición puede lavar al objeto.

En una forma de realización, métodos para hacer una planta transgénica comprenden los siguientes pasos: (a) introducir una secuencia heterologa de ácidos nucleicos en una célula de planta, en donde la secuencia heterologa de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente, con lo cual produciendo una célula de planta transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, el paso (a) puede además comprender introducir la secuencia heterologa de ácidos nucleicos por electroporación o micro-inyección de protoplastos de célula de planta. En otro aspecto, el paso (a) puede además comprender introducir la secuencia heterologa de ácidos nucleicos directamente al tejido de planta por bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, el paso (a) puede además comprender introducir la secuencia heterologa de ácidos nucleicos en el ADN de célula de planta usando un hospedero de Agrobacterium tumefaciens . En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, maíz, arroz, trigo, tabaco, o cebada.

En una forma de realización, métodos para expresar una secuencia heterologa de ácidos nucleicos en una célula de planta comprende los siguientes pasos: (a) transformar la célula de planta con una secuencia heterologa de ácidos nucleicos enlazada operativamente a un promotor, en donde la secuencia heterologa de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico según es provisto en la presente; (b) cultivar la planta bajo condiciones en donde la secuencia heteróloga de ácidos nucleicos se expresa en la célula de planta.

En una forma de realización, un primer método para síntesis bio-catalítica de un lípido estructurado comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo acilo en la posición Sn2 del triacilglicérido (TAG), con lo cual produciendo un 1,3-diacilglicérido (DAG) ; (d) proporcionar un éster Rl; (e) proporcionar una hidrolasa específica de Rl, y (f) poner en contacto al 1,3 -DAG del paso (c) con el éster Rl del paso (d) y la hidrolasa específica de Rl del paso (e) bajo condiciones en donde la hidrolasa específica de Rl cataliza esterificación de la posición Sn2, con lo cual produciendo un lípido estructurado. La hidrolasa según es provista en la presente puede ser una lipasa específica de Sn2. El lípido estructurado puede comprender un alternativo de mantequilla de cacao (CBA) , una mantequilla de cacao sintética, una mantequilla de cacao natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP) , 1, 3-diestearoil-2-oleoilgli-cerol (SOS) , l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o 1-oleoil-2 , 3 -dimiristoilglicerol (OMM) .

En una forma de realización, un segundo método para síntesis bio-catalítica de un lípido estructurado comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG) , con lo cual produciendo un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover migración de acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG del paso (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, con lo cual produciendo una composición que comprende 1,3-DAG.

Este segundo método puede además comprender proporcionar un éster Rl y una lipasa específica de Rl, y poner en contacto al 1,3-DAG del paso (d) con el éster Rl y la lipasa específica de Rl bajo condiciones en donde la lipasa específica de Rl cataliza esterificación de la posición Sn2 , con lo cual produciendo un lípido estructurado. La hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, según es provista en la presente puede ser una enzima específica de Snl o Sn3. El lípido estructurado puede comprender cualquier aceite vegetal, v.gr. , un aceite de soya, un aceite de cañóla, alternativo a mantequilla de cacao (CBA) , una mantequilla de cacao sintética, una mantequilla de cacao natural, 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS) , l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2 , 3 -dimiristoilglicerol (OMM) .

El éster Rl puede comprender una fracción de menor saturación que el residuo acilo hidrolizado, en cuyo caso el lípido estructurado así producido es una grasa o aceite menos saturado que el TAG original. El éster Rl puede comprender uno o mas de un ácido graso omega-3, un ácido graso omega-6, un ácido graso mono-insaturado, un ácido graso poli-insaturado, un grupo fosfo, un éster de fitoesterol, y orizanol. Mas específicamente, el éster Rl puede comprender una fracción seleccionada a partir del grupo que consiste en ácido alfa-linolénico, ácido eicosapen-taenoico, ácido docosahexaenoico, ácido gamma- linolénico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol , cumestrol, dietiles-tilbestrol, y orizanol.

En un aspecto de este segundo método, el paso (d) además comprende usar resinas de intercambio de iones. Las condiciones cinéticamente controladas pueden comprender condiciones no de equilibrio resultantes en producción de un producto final teniendo mas de una relación 2:1 de 1,3-DAG a 2,3-DAG. La composición del paso (b) puede comprender un ácido graso fluorogénico (FA) . La composición del paso (b) puede comprender un éster de umbeliferil FA. El producto final puede ser enantio-méricamente puro.

En una forma de realización, un método para hacer una grasa o aceite menos saturado comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido (una hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente; (b) proporcionar un aceite o grasa, y (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con el aceite o grasa del paso (b) bajo condiciones en donde la hidrolasa puede modificar al aceite o grasa, v.gr., remover por lo menos un ácido graso saturado, v.gr., ácido palmítico, esteárico, láurico, caprílico (ácido octanoico) y similares. La modificación puede comprender una hidrólisis catalizada por hidrolasa de la grasa o aceite. La hidrólisis puede ser una hidrólisis completa o parcial de la grasa o aceite. El aceite hidrolizado puede comprender un éster de glicerol de un ácido graso poli-insaturado que puede reemplazar al ácido graso saturado removido, o un aceite de pescado, animal, o vegetal. El aceite vegetal puede comprender un aceite de olivo, cañóla, girasol, palma, soya o láurico o aceite de salvado de arroz o una combinación de los mismos.

En una forma de realización, un método para hacer una grasa o aceite menos saturado, que puede incluir ácidos grasos esenciales, comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o esteara-sa) según se proporciona en la presente; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG) ( con ello produciendo un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover migración de acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG del paso (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, con lo cual produciendo un 1,3-DAG.

El método puede además comprender proporcionar un éster Rl y una lipasa específica de Rl, y poner en contacto al 1,3-DAG del paso (d) con el éster Rl y la lipasa específica de Rl bajo condiciones en donde la lipasa específica de Rl cataliza esterificación d ela posición Sn2, con lo cual produciendo un lípido estructurado. El éster Rl puede comprender una fracción de menor saturación que el residuo acilo hidrolizado, en cuyo caso el lípido estructurado así producido es una grasa o aceite menos saturado que el TAG original. El éster Rl puede comprender un ácido graso omega-3 (alfa-linolénico; icosapentaenoico (EPA) , docosahexaenoico (DHA) ) , un ácido graso omega-6 (gamma-linoléni-co, dihomo-gamma-linolénico (DGLA) , o araquidónico) , un ácido graso mono-insaturado (oleico, palmoleico, y similares) , grupos fosfo (colina y serina) , ésteres de fitoesterol (beta-sitosterol, cumestrol, y dietilestilbestrol) , y orizanol. La hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, según es provista en la presente puede ser una enzima específica de Snl o Sn3. La grasa o aceite menos saturado puede hacerse por la hidrólisis anteriormente descrita de cualquier aceite de algas, aceite vegetal, o una grasa o aceite animal, v.gr., aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornmutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de especies Nannochloris, aceite de especies Spirulina, aceite de Chlorophycease (algas verdes) , y aceite de Bacilliarophy, aceite de cañóla, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de coriandro, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de avellana, aceite de cáñamo, aceite de linaza, aceite de hierba de la pradera, aceite de olivo, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de maní, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cártamo, aceite de sasanqua, aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de pino, aceite de tsubaki, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones alteradas de ácidos grasos mediante Organismos Modificados Genéticamente (OGM) o "crianza" tradicional tales como alto oleico, bajo linolénico, o aceites saturados bajos (aceite de cañóla alto oleico, aceite de soya bajo linolénico o aceites de girasol altos esteáricos) ; grasas animales (sebo, lardo, grasa de mantequilla, grasa de pollo) , aceites de pescado (aceite de eperlano, aceite de hígado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque, y aceite de sábalo) , o mezclas físicas de cualquiera de los anteriores. La grasa o aceite menos saturado puede usarse en alimentos o en productos de horneado, freído o cocina comprendiendo aceites o grasas con un menor contenido de ácidos grasos, incluyendo aceites bajos en ácido palmítico, ácido oleico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octanoico) , etc., procesados usando una composición o método según son provistos en la presente.

En una forma de realización, un método para refinar un lubricante comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende una ' hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente; (b) proporcionar un lubricante; y (c) tratar al lubricante con la hidrolasa bajo condiciones en donde la hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente puede hidrolizar selectivamente aceites en el lubricante, con lo cual retinándolo . El lubricante puede ser un aceite hidráulico.

En una forma de realización, un método para tratar una tela comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente, en donde la hidrolasa puede selectivamente hidrolizar ésteres carboxílieos ; (b) proporcionar una tela; y (c) tratar la tela con la hidrolasa bajo condiciones en donde la hidrolasa puede selectivamente hidrolizar ésteres carboxílicos con lo cual tratando a la tela. El tratamiento de la tela puede comprender mejora de la mano y colgadura de la tela final, teñido; obtener retardo de flamas, obtener repelencia a agua, obtener brillo óptico, u obtener terminado de resina. La tela puede comprender algodón, viscosa, rayón, lyocell, linaza, lino, ramio, todas las mezclas físicas de las mismas, o "mezclas físicas de las mismas con poliésteres, lana, poliamidas, acrílieos o poliacrílicos . En una forma de realización, una tela, estambre o fibra comprendiendo una hidrolasa según es provista en la presente pude ser adsorbida, absorbida o inmovilizada sobre la superficie de la tela, estambre o fibra.

En una forma de realización, un método para remover o disminuir la cantidad de una mancha de alimento o aceite comprende poner en contacto una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente con la mancha de alimento o aceite bajo condiciones en donde la hidrolasa puede hidrolizar aceite o grasa en la mancha. La hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente puede tener una estabilidad acrecentada a desnaturalización por tensioactivos y para calentar la desactivación. La hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente puede tener un detergente o una solución de lavandería.

En una forma de realización, una composición dietaria comprende una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente. La composición dietaria puede además comprender una base nutricional que comprende una grasa. La hidrolasa puede ser activada por una sal biliar. La composición dietaria puede además comprender una fórmula para infantes a base de leche de vaca. La hidrolasa puede hidrolizar ácidos grasos de cadena larga.

En una forma de realización, un método para reducir contenido de grasa en composiciones dietarias a base de leche o vegetales comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente; (b) proporcionar una composición que comprende una leche o un aceite vegetal, y (c) tratar a la composición del paso (b) con la hidrolasa bajo condiciones en donde la hidrolasa puede hidrolizar al aceite o grasa en la composición. En una forma de realización, una composición dietaria para un humano o para animales no rumiantes, comprende una base nutricional, en donde la base comprende una grasa y nada o poca hidrolasa, y una cantidad efectiva de una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente para incrementar absorción de grasa y crecimiento de humano o animal no rumiante.

En una forma de realización, un método para catalizar una reacción de inter-esterificación para producir nuevos triacilglicéridos comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente, en donde el polipéptido puede catalizar una reacción de inter-esterificación; (b) proporcionar una mezcla de triacil-glicéridos y ácidos grasos libres; (c) tratar la mezcla del paso (b) con el polipéptido bajo condiciones en donde el polipéptido puede catalizar intercambio de ácidos grasos libres con los grupos acilo de triacilglicéridos, con lo cual produciendo nuevos triacilglicéridos enriquecidos con ácidos grasos añadidos. El polipéptido puede ser una lipasa específica de Snl,3.

En una forma de realización, un método de inter-esterificación para preparar un aceite teniendo un contenido de ácidos trans bajo y ácidos grasos de cadena intermedia bajo, comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una mezcla de reacción de inter-esterificación que comprende un material fuente de ácido esteárico seleccionado a partir del grupo que consiste en ácido esteárico, mono-ésteres de ácido esteárico de bajo peso molecular, alcoholes mono-hídricos y mezclas de los mismos, (b) proporcionar un aceite vegetal líquido; (c) proporcionar un polipéptido (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente, en donde el polipéptido comprende una actividad de lipasa específica 1,3; (d) inter-esterificar el material fuente de ácido esteárico y el triacil-glicérido de aceite vegetal; (e) separar componentes de ácidos grasos libres inter-esterificados a partir de componentes de glicérido de la mezcla de inter-esterificación para proporcionar un producto de aceite de margarina inter-esterificado y una mezcla de ácidos grasos comprendiendo ácidos grasos, mono-ásteres de ácidos grasos o mezclas de los mismos liberados a partir del aceite vegetal, y (f) hidrogenar la mezcla de ácidos grasos. En una forma de realización del método de inter-esterificación, la reacción de inter-esterificación continúa hasta que hay equilibrio sustancial de los grupos éster en las posiciones 1, 3, del componente de glicérido con los componentes de ácido graso no de glicérido de la mezcla de reacción.

En una forma de realización, un método para hacer una composición comprende l-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) y 1 , 3 -diestearoil-2-monoleína (StOSt) comprendiendo proporcionar un polipéptido (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente, en donde el polipéptido es capaz de inter-esterificación catalizada por lipasa específica 1,3 de 1 , 3 -dipalmitoil-2-monoleína (POP) con ácido esteárico o tristearina, y poner en contacto a dicho polipéptido con una composición que comprende dicho POP en presencia de una fuente de estearina tal como ácido esteárico o tristearina para hacer un producto enriquecido en l-palmitoil-3-estearoil-2 -monoleína (POSt) o 1 , 3 -diestearoil-2 -monoleína (StOSt) .

En una forma de realización, un método para mejorar o prevenir toxicidad mediada por lipo-polisacárido (LPS) comprende administrar a un paciente una composición farmacéutica que comprende una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente. En una forma de realización, un método para destoxificar una endotoxina comprende poner en contacto a la endotoxina con una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente. En una forma de realización, un método para desacilar una cadena de ácidos grasos 2' o 3' a partir de un lípido A comprende poner en contacto al lípido A con un polipép-tido según es provisto en la presente.

En una forma de realización, métodos para alterar la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de una enzima lipasa progenitora (hidrolasa de ácido graso) teniendo una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 comprende el paso de generar (insertar) por lo menos l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla3 , Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, con lo cual generando una nueva enzima hidrolasa teniendo una secuencia de aminoácidos modificada y una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alterada según se compara con la enzima lipasa progenitora (hidrolasa de ácido graso) en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácidos grasos) comprende hidrólisis preferente o incrementada de ácido palmítico a partir de un aceite, o la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácido graso) comprende hidrólisis preferente o incrementada de ácido esteárico a partir de un aceite .

En un aspecto, la secuencia de aminoácidos modificada (según se compara con la SEQ ID NO: 2 "progenitora" ) comprende por lo menos una modificación de aminoácidos A58C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas, y/o por lo menos una modificación de codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 45 (GGA) ; (GCG) 92 (GCT) ; (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CGT) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG) ; (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (ATG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) , o el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas, y la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácidos grasos) comprende hidrólisis preferente o incrementada de ácido palmítico a partir de un aceite. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos modificada (según se compara con la SEQ ID NO: 2 "progenitora" ) comprende I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, O una combinación de las mismas, y la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácidos grasos) comprende hidrólisis preferente o incrementada de ácido esteárico a partir de un aceite.

En una forma de realización, métodos para hacer una enzima teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprenden hidrólisis preferente o incrementada de ácido palmítico a partir de un aceite, comprendiendo los pasos de: (a) proporcionar una enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato que comprende hidrólisis preferencial de ácido palmítico a partir de un aceite, en donde la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora tiene una secuencia según es provista en la presente; y (b) hacer por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas modificaciones de residuos de aminoácidos a la enzima hidrolasa (v.gr. , lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora, en donde las modificaciones de residuos de aminoácidos corresponden a las mutaciones de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2 como se muestran en la Tabla3 , Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, con lo cual generando una enzima teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial o incrementada de ácido palmítico a partir de un aceite.

En una forma de realización, métodos para hacer una enzima teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprenden hidrólisis preferencial o incrementada de ácido esteárico a partir de un aceite, comprendiendo los pasos de: (a) proporcionar una enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial de ácido esteárico a partir de un aceite, en donde la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora tiene una secuencia según es provista en la presente; y (b) hacer por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas modificaciones de residuos de aminoácidos a la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) progenitora, en donde las modificaciones de residuos de aminoácidos corresponden a las mutaciones de secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, con lo cual generando una enzima teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial o incrementada de ácido esteárico a partir de un aceite .

En una forma de realización, métodos para hacer una enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprenden hidrólisis preferencial de un ácido graso particular, comprendiendo los pasos de (a) proporcionar una secuencia de enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos según es provista en la presente; (b) generar (insertar) por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de residuos base en el ácido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a aquellos cambios de secuencia como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) probar la actividad de la enzima recién generada para una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial de un ácido graso particular, con lo cual haciendo la nueva enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial de un ácido graso particular. En un aspecto, la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos comprende una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico.

En una forma de realización, métodos para hacer una enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprende hidrólisis preferencial de un ácido graso particular, y comprenden los pasos de (a) proporcionar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica enzima hidrolasa (v.gr. , lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos según es provista en la presente; (b) generar (insertar) por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas mutaciones de residuos base en el ácido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a aquellos cambios de secuencia como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) expresar al ácido nucleico generado para hacer la nueva enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos, con ello haciendo una enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato comprendiendo hidrólisis preferencial de un ácido graso particular.

En un aspecto, la secuencia de codificación de enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una secuencia como se señala en la SEQ ID NO:l. En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico. En un aspecto, la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos es ácido palmítico a comparación con una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de ácido esteárico para la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos progenito-ra, o la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos es ácido esteárico según se compara con una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de ácido palmítico para la enzima hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de ácidos grasos progenito-ra.

En una forma de realización, lipasas comprenden una secuencia de aminoácidos como se señala en la SEQ ID NO: 2, pero también comprendiendo por lo menos una modificación de residuos de aminoácidos A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas, y/o por lo menos una modificación de codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 45 (GGA) ; (GCG) 92 (GCT) , (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CGT) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG) ; (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (GTG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) , o el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas. En una forma de realización, lipasas comprenden una secuencia de aminoácidos según se señala en la SEQ ID NO: 2, pero también comprendiendo por lo menos una modificación de residuos de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, O una combinación de las mismas.

En un aspecto, la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva lipasa comprende hidrólisis preferen- cial o incrementada de un ácido graso a partir de un aceite a comparación con la SEQ ID NO: 2 "progenitora" . En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico.

Los detalles de una o mas formas de realización según son provistas en la presente en los dibujos acompañantes y la descripción siguiente . Otras características, objetos, y ventajas según son provistas en la presente serán aparentes a partir de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, secuencias GenBank y depósitos ATCC, citados en la presente se incorporan de manera expresa en la presente por referencia para todos los propósitos.

Descripción de Dibujos Los siguientes dibujos son ilustrativos de formas de realización según son provistas en la presente y no tienen la intención de limitar el alcance de las reivindicaciones.

El archivo de patente o solicitud contiene por lo menos un dibujo ejecutado en color. Copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color serán provistos por la oficina ente solicitud y pago de la cuota necesaria.

La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de computador .

La figura 2 es un diagrama de flujo ilustrando un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o proteínas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos.

La figura 3 es un diagrama de flujo ilustrando un aspecto de un proceso en un computador para determinar si dos secuencias son homologas .

La figura 4 es un diagrama de flujo ilustrando un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia.

La figura 5 ilustra un método ejemplar según es provisto en la presente comprendiendo el uso de lipasas según es provisto en la presente para procesar un lípido, v.gr., un lípido a partir de un aceite de soya, para hidrolizar selectivamente un ácido palmítico para producir un "aceite de soya palmítico reducido" .

La figura 6a ilustra los efectos de mutaciones de GSSM de palmitasa ejemplares sobre hidrólisis de palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora, como se discute en detalle en el ejemplo 4, siguiente. La figura 6b ilustra los efectos de mutaciones de GSSM de estearatasa ejemplares sobre hidrólisis de palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora según se discute en detalle en el ejemplo 4, siguiente .

La figura 7 muestra la SEQ ID NO: 2, con las posiciones de mutación de palmitato y estearato particulares listadas en negritas de una letra mas grande. Mutaciones subrayadas (v.gr., 61A, E) son posiciones de residuos de aminoácidos alternativas (secuencias alternativas para formas de realización alternativas) para mejorar hidrólisis de palmitato. Mutaciones en cursivas (v.gr., 20L) son posiciones de residuos de aminoácidos alternativas (secuencias alternativas para formas de realización alternativas) para mejorar hidrólisis de estearato. La posición 116 es una posición de mutación de residuos de aminoácidos alternativas (una secuencia alternativa para una forma de realización alternativa) para mejorar hidrólisis de tanto palmitato y estearato .

La figura 8 muestra datos de ensayo de aceite de soya confirmatorios para clones seleccionados a partir de la biblioteca de palmitasa.

Símbolos de referencia similares en los varios dibujos indican elementos similares.

Descripción Detallada Formas de realización alternativas comprenden polipép-tidos, incluyendo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearata-sas, polinucleótidos que los codifican, y métodos para hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos . Formas de realización alternativas comprenden polipéptidos, v.gr., enzimas, teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo actividad de hidrolasa termo-estable y termo-tolerante , y polinucleótidos que codifican estas enzimas, y hacer y usar estos polinucleótidos y polipépti-dos . Las actividades de hidrolasa de los polipéptidos y péptidos según son provistas en la presente incluyen actividad de lipasa (hidrólisis de lípidos) , reacciones de inter-esterificación, síntesis de ásteres, reacciones de intercambio de ésteres, actividad de acil hidrolasa de lípidos (LAH) , y actividad enzimática relacionada. Para los propósitos de esta solicitud de patente, reacciones de inter-esterificación pueden incluir reacciones de acidólisis (involucrando la reacción de un ácido graso y un triacilglicérido) , alcohólisis (involucrando la reacción de un alcohol y un triacilglicérido) , glicerólisis (involucrando la reacción de un glicerol y un triacilglicérido) y reacciones de trans-esterificación (involucrando la reacción de un éster y un triacilglicérido) . Los polipéptidos según son provistos en la presente pueden usarse en una variedad de contextos farmacéutico, agrícola e industrial, incluyendo la manufactura de cosméticos y nutracéuticos . En otro aspecto, los polipéptidos según son provistos en la presente se usan para sintetizar productos quirales enantioméricamente puros.

En ciertas formas de realización, enzimas según son provistas en la presente pueden ser catalizadores altamente selectivos. Pueden tener la habilidad de catalizare reacciones con estéreo-, regio-, y quimio-selectividades no posibles en química de síntesis convencional. En una forma de realización, enzimas según son provistas en la presente pueden ser versátiles.

En varios aspectos, pueden funcionar en solventes orgánicos, operar a pHs extremos (por ejemplo, pHs altos y pHs bajos), temperaturas extrema (por ejemplo, altas temperaturas y bajas temperaturas) , niveles de salinidad extremos (por ejemplo, alta salinidad y baja salinidad) , y catalizar reacciones con compuestos que están estructuralmente no relacionados con sus sustratos fisiológicos, naturales.

En un aspecto, los polipéptidos según son provistos en la presente comprenden hidrolasas teniendo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa y pueden usarse, v.gr., en la síntesis bio-catalítica de lípidos estructurados (lípidos que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre el esqueleto de glicerol) , incluyendo cualquier aceite vegetal, v.gr., cañóla, soya, alternativos a aceite de soya, alternativos a mantequilla de cacao, 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéri-dos (TAGs) , tales como 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1, 3-diestearoil-2-oleoilglicerol (StOSt) , l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POSt) o l-oleoil-2 , 3 -dimiristoilglicerol (OMM) , ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga tales como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) .

En ciertas formas de realización, las enzimas y métodos según son provistos en la presente pueden usarse para remover, añadir o intercambiar cualquier ácido graso a partir de una composición, v.gr., hacer un aceite con un contenido de ácidos grasos saturados menor (v.gr., un aceite "saturado bajo") o un contenido de ácidos grasos diferente (v.gr., convirtiendo un aceite comprendiendo ácidos grasos "saturados" a un aceite comprendiendo ácidos grasos "insaturados" alternativo) .

Ejemplos de ácidos grasos saturados que pueden removerse, añadirse o "re-arreglarse" en un lípido, v.gr., un aceite, usando una enzima o mediante practicar un método según es provisto en la presente incluyen: Acético: CH3COOH Butírico: CH3 (CH2)2C00H Caproico : CH3 (CH2) 4COOH Caprílico: CH3 (CH2) 6COOH Cáprico : CH3 (CH2) 8COOH Undecanoico : CH3 (CH2) 9COOH Láurico: (ácido dodecanoico) : CH3 (CH2) 10COOH Mirístico : (ácido tetradecanoico) : CH3 (CH2) 12COOH Pentadecanoico : CH3 (CH2) 13COOH Palmítico : CH3 (CH2) 14COOH Margárico: CH3 (CH2) 15CO0H Esteárico : CH3 (CH2) 16COOH Araquídico : CH3 (CH2) 18COOH Behénico : CH3 (CH2) 20COOH Ejemplos de ácidos grasos insaturados omega-3 que pueden ser removidos, añadidos o "re-arreglados" en un lípido, v.gr., un aceite, usando una enzima o mediante practicar un método según es provisto en la presente incluyen: g-linolénico (ALA) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) vCOOH estearaiadónico (octadecatetraenoico) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 4COOH docosahexanoico (DHA) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 2COOH Ejemplos de ácidos grasos insaturados omega-6 que pueden ser removidos, añadidos o "re-arreglados" en un lípido, v.gr., un aceite, usando una enzima o mediante practicar un método según es provisto en la presente incluyen: Linoleico (ácido 9 , 12-octadecadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) 7COOH Gamma- linolénico (ácido 6 , 9 , 12-octadecatrienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 4C00H Eicosadienoico (ácido 11 , 14 -eicosadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) 9COOH Dihomo-gamma-linolénico (ácido 8 , 11 , 14 -eicosatrienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 6COOH Araquidónico (ácido 5 , 8 , 11 , 14 -eicosatetraenoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 6COOH Docosadienoico (ácido 13 , 16 -docosadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) i:LCOOH Adrénico (ácido 7 , 10 , 13 , 16-docosatetraenoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 5C00H Docosapentaenoico (ácido 4 , 7 , 10 , 13 , 16-docosapentaenoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 2COOH Ejemplos de ácidos grasos omega-9 que también pueden ser removidos, añadidos o "re-arreglados" sobre un lípido, v.gr., un aceite, usando una enzima o mediante practicar un método según es provisto en la presente, incluyen: Oleico (ácido 9-octadecenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 7COOH Eicosenoico (ácido 11-eicosenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 9COOH Mead (ácido 5 , 8 , 11-eicosatrienoico) : CH3 (CH2) 7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 3COOH Eúrico (ácido 13 -docosenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) xlCOOH Nervónico (ácido 15-tetracosenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 13COOH Palmitoleico : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 5COOH En un aspecto, provistas en la presente son clases novedosas de lipasas denominadas "saturasas", v.gr., "palmitasas" y "estearatasas" . El término "saturasa" como se usó previamente en la literatura describe una enzima que lleva a cabo la saturación de enlaces específicos en una trayectoria metabólica, v.gr., hidrogenación de un doble enlace (Moise, et al., J. Biol. Chem. 2005, 280 (30) : 27815-27825) . Sin embargo, provistas en la presente son "saturasas" novedosas y previamente no descritas, en donde las saturasas descritas en la presente hidrolizan ésteres de ácidos grasos saturados, en donde los ésteres hidrolizados pueden ser ésteres de ácidos grasos saturados y glicerol, umbeliferol u otros alcoholes.

También provistas en la presente son "palmitasas" y "estearatasas" previamente no descritas, en donde las palmitasas y estearatasas hidrolizan ácido palmítico y ácido esteárico, respectivamente, por ejemplo, a partir del esqueleto de glicerol. Las "saturasas" descritas en la presente también pueden denominarse "hidrolasas de saturado" . Similarmente , las "palmitasas" descritas en la presente pueden denominarse "hidrolasas de palmitato" y las "estearatasas" descritas en la presente pueden denominarse también "hidrolasas de estearato" .

En otro aspecto, las saturasas descritas en la presente hidrolizan selectivamente por lo menos 60%, 61%, 62% , 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% , 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos saturados. En otro aspecto, las palmitasas descritas en la presente selectivamente hidrolizan ácidos grasos tal que por lo menosi 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido palmítico. En otro aspecto, las estearatasas descritas en la presente selectivamente hidrolizan ácidos grasos tal que por lo menos 60%, , 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido esteárico .

En un aspecto, como se ilustra en la figura 5, métodos para usar una enzima según son provistos en la presente pueden procesar un lípido, v.gr. , un lípido a partir de un aceite de soya u otro vegetal, para selectivamente hidrolizar un ácido graso saturado, v.gr., un ácido palmítico o esteárico (v.gr., a partir de un aceite conteniendo estos ácidos grasos saturados) para producir un "aceite saturado bajo (o menor)", v.gr., un "aceite palmítico reducido" , tal como un "aceite vegetal palmítico reducido", v.gr., un "aceite de soya palmítico reducido" . Enzimas según son provistas en la presente también pueden usarse para hidrolizar selectivamente cualquier ácido graso, particularmente ácidos grasos saturados, a partir de un esqueleto de glicerol para producir un "aceite saturado bajo (o menor) " , incluyendo hidrolizar selectivamente un ácido graso saturado, v.gr., un ácido palmítico o un ácido esteárico, a partir de una posición Snl o Sn2 de un esqueleto de glicerol, además de hidrólisis a partir de una posición Sn3 (v.gr., hidrólisis de ácido palmítico a partir de la posición Sn3 ilustrada en la figura 5) .

En un aspecto, una síntesis ejemplar de triglicéridos saturados bajos, aceites o grasas es provista. Esta síntesis ejemplar puede usar ya sea ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos, dependiendo de la enzima usada. En un aspecto, las hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearata-sas, según son provistas en la presente se usan para remover o hidrolizar ácidos grasos saturados, tales como ácido acético, ácido butírico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido undecanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido aquídico, o ácido behénico a partir de un triglicérido, aceite o grasa. En un aspecto, los ácidos grasos removidos o hidrolizados son reemplazados con ácidos grasos con beneficios a la salud mejorados (tales como correlación reducida con enfermedad cardiovascular) , o propiedades químicas mejoradas (tales como estabilidad o reactividad oxidativas) o propiedades físicas mejoradas (tales como punto de fusión, o sensación en boca) . En un aspecto, los ácidos grasos añadidos son ácidos grasos insaturados omega-3, tales como ácido -linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico (EPA) , o ácido docosahe-xaenoico (DHA) , o PUFAs o ácidos grasos de aceite de pescado. En un aspecto, los ácidos grasos añadidos son ácidos grasos insaturados omega-6, tales como ácido linoleico, ácido gamma-linoleico, ácido eicosadienoico, ácido dihomo-gamma- linoleico, ácido araquidónico, ácido docosadienoico, ácido adrénico, o ácido docosapentaenoico. En un aspecto, los ácidos grasos añadidos son ácidos grasos insaturados omega-9, tales como ácido oleico, ácido eicosaenoico, ácido mead, ácido erúcico, ácido nervónico, o ácido palmitoleico. En un aspecto, los ácidos grasos añadidos (v.gr., omega-3, omega-6, u omega-9) se añaden por reacción de ácidos grasos con los triglicéridos , aceite o grasa después de la remoción o hidrólisis de ácidos grasos por las hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , según son provistas en la presente. En un aspecto los ácidos grasos añadidos (v.gr., omega-3, omega-6, u omega-9) se añaden por reacción de ésteres de ácidos grasos, incluyendo ésteres de glicerol, o etil o metil ésteres, con los triglicéridos, aceite o grasa después de la remoción o hidrólisis de ácidos grasos saturados por las hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, según es provisto en la presente. En un aspecto, la reacción para añadir ácidos grasos (v.gr., omega-3, omega-6, u omega-9) es catalizada por una hidrolasa o lipasa, tal como una lipasa no específica (incluyendo no regio-específica y no específica de ácidos grasos) , o una lipasa específica de Snl, 3, o una lipasa específica de Snl, o una lipasa específica de Sn3 , o una lipasa específica de Sn2, o una lipasa específica de ácidos grasos.

Los métodos y composiciones (hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente en la producción de nutracéuticos (v.gr., ácidos grasos y aceites poli-insaturados) , varios alimentos y aditivos alimenticios (v.gr., emulsionantes, reemplazos de grasa, margarinas y composiciones para untar) , cosméticos (v.gr., emulsionantes, cremas), farmacéuticos y agentes de entrega de fármacos (v.gr., liposomas, tabletas, formulaciones), y aditivos de alimentación de animales (v.gr., ácidos grasos poli-insaturados , tales como ácidos linoleicos) .

En un aspecto, lipasas según son provistas en la presente pueden actuar sobre ásteres de ácidos grasos (FA) fluorogénicos , v.gr., ásteres de umbeliferil FA. En un aspecto, perfiles de especificidades de FA de lipasas hechos o modificados por los métodos según son provistos en la presente pueden obtenerse mediante medir sus actividades relativas en una serie de ásteres de umbeliferil FA, tales como ásteres de palmitato, estearato, oleato, laurato, PUFA, o butirato.

En un aspecto, un polipéptido (v.gr. , anticuerpo o enzima, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provisto en la presente para estas reacciones se inmoviliza, v.gr., como se describe mas adelante. En aspectos alternativos, los métodos según son provistos en la presente no requieren un solvente orgánico, pueden proceder con tasas de reacción relativamente rápidas. Ver, v.gr., las patentes US 5,552,317; 5,834,259.

En ciertas formas de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente pueden usarse para hidrolizar (incluyendo selectivamente hidrolizar) aceites, tales como aceites de pescado, animales y vegetales, y lípidos, tales como ácidos grasos poli-insaturados. En un aspecto, los polipéptidos según son provistos en la presente se usan para hacer aceites saturados bajos, v.gr., mediante remover (hidrolizar) por lo menos un ácido graso a partir de un aceite; y la hidrólisis puede ser una hidrólisis selectiva, v.gr., mediante remover un ácido graso particular, tal como ácido graso palmítico, esteárico, u otro saturado, o solamente removiendo un ácido graso de una posición, v.gr., Snl, Sn2 o Sn3. En un aspecto, los polipéptidos según son provistos en la presente se usan para procesar ácidos grasos (tales como ácidos grasos poli-insaturados) , v.gr., ácidos grasos de aceite de pescado, v.gr., para uso en o como un alimento o aditivo de alimentación, o un aceite para cocinar, freír, hornear o comestible. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse para hidrolizar selectivamente ésteres saturados sobre ásteres insaturados hacia ácidos o alcoholes. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse para tratar látex para una variedad de propósitos, v.gr., para tratar látex usados en composiciones fijadoras de cabello para remover aromas no placenteros. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse en el tratamiento de una deficiencia de lipasa en un animal, v.gr., un mamífero, tal como un humano. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse para preparar lubricantes, tales como aceites hidráulicos. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse para hacer y usar detergentes. En otra forma de realización, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse en procesos para el acabado químico de telas, fibras o estambres. En un aspecto, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente pueden usarse para obtener retardo de flama en una tela usando, v.gr., un ácido carboxílico sustituido con halógeno o un éster del mismo, es decir, un ácido carboxílico fluorado, clorado o bromado o un éster de los mismos. En un aspecto, los métodos para generar lipasas a partir de bibliotecas ambientales son provistos.

En una forma de realización, las "hidrolasas" según son provistas en la presente abarcan polipéptidos (v.gr., anticuerpos, enzimas) y péptidos (v.gr., "sitios activos") teniendo cualquier actividad de hidrolasa, es decir, los polipéptidos según son provistos en la presente pueden tener cualquier actividad de hidrolasa, incluyendo, v.gr., una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En otra forma de realización, las "hidrolasas" según son provistas en la presente incluyen todos los polipéptidos teniendo cualquier actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo síntesis de lípidos o actividad de hidrólisis de lípidos, es decir, los polipéptidos según son provistos en la presente pueden tener cualquier actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En otra forma de realización, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas según son provistas en la presente incluyen enzimas activas en la bio-conversión de lípidos a través de catálisis de reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificación y aminólisis. En un aspecto, hidrolasas (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente pueden hidrolizar emulsiones de lípidos. En un aspecto, enzimas según son provistas en la presente pueden actuar preferencialmente sobre enlaces Snl, Sn2 y/o Sn3 de triacilglicéridos para liberar uno o mas ácidos grasos a partir del esqueleto de glicerol. Por ejemplo, actividad de hidrolasa, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipéptidos según es provista en la presente incluyen síntesis de mantequilla de cacao, ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs) . En otra forma de realización, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipéptidos según es provista en la presente también comprende producción de aceites saturados bajos, v.gr., aceite de soya o cañóla, mediante remover un ácido graso, v.gr., un ácido palmítico, oleico, láurico o esteárico. En aspectos alternativos, enzimas según son provistas en la presente también pueden hidrolizar y/o isomerizar enlaces a altas temperaturas, bajas temperaturas, pHs alcalinos y pHs ácidos. En un aspecto la hidrolasa, v.gr., lipasa, según es provista en la presente es una saturasa que cataliza reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificación y aminólisis donde el ácido carboxílico o graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido graso saturado tal como ácido acético, ácido butírico, ácido láurico, ácido miristico, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido araquídico. En un aspecto, la hidrolasa, v.gr., lipasa o saturasa, según es provista en la presente es una palmitasa que cataliza reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificación y aminólisis donde el ácido carboxílico o graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido palmítico. En un aspecto, la hidrolasa, v.gr., lipasa o saturasa, según es provista en la presente es una estearatasa que cataliza reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificación y aminólisis donde el ácido carboxílico o graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido esteárico.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son enzimas comprendiendo variantes de hidrolasa (v.gr. , "variante de lipasa", "variante de saturasa", "variante de palmitasa" o "variante de estearatasa") de las enzimas según son provistas en la presente; estas enzimas tienen una secuencia de aminoácidos la cual se deriva a partir de la secuencia de aminoácidos de un "precursor" . El precursor puede incluir hidrolasa tal como aparece en la naturaleza y/o hidrolasa recombinante . La secuencia de aminoácidos del variante de hidrolasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de hidrolasa precursora por la sustitución, supresión o inserción de uno o mas aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la "secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la lipasa precursora en lugar de manipulación de la enzima hidrolasa precursora per se. Métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen métodos divulgados en la presente, así como métodos conocidos por los técnicos en la materia.

Generar y Manipular Ácidos Nucleicos En un aspecto, ácidos nucleicos, incluyendo cartuchos de expresión tales como vectores de expresión, codifican a los polipéptidos (v.gr., hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas , y anticuerpos) según son provistos en la presente. En otro aspecto, ácidos nucleicos teniendo una secuencia según se señala en la SEQ ID. N0:1 y teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos base descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o los equivalentes de las mismas) son provistos en la presente. En una forma de realización, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos teniendo una secuencia según se señala en la SEQ ID NO: 2 y teniendo por teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todos los cambios de residuos base descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o los equivalentes de las mismas) son provistos en la presente .

SEQ ID NO:l ATGCTGAAACCGCCTCCCTACGGACGCCTGCTGCGCGAACTGGCCGATATCCCGG CCATCGTGACGGCACCGTTCCGGGGCGCTGCGAAAATGGGCAAACTGGCGGATG GCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCCGACGACAACGCCACCTCGGT GCTGCGCAAGACCTTCGATGTCGCGGGCTTTGCCTGTTCGGGCTGGGAACGCGGC TTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCGTGGACCGGCTGGTCGACCGGCTGCGGG CGGTGTCGGAGGCGGCCGGTGGTCAGAAGGTGATCGTGGTCGGCTGGAGCCTCG GCGGCCTCTATGCGCGCGAGCTGGGCCACAAGGCGCCCGAACTGATCCGGATGG TCGTCACGCTCGGCAGTCCGTTCGCGGGCGACCTCCACGCCAACCATGCGTGGAA GATCTACGAGGCGATCAACAGCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGGTCGA TTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCGCACCATCGCGGTGTGGTCGCCGCTCGACGGG GTGGTGGCGCCGGAGACCTCGGAAGGCTCGCCCGAGCAGTCGGACGAGCGGCTA GAGCTGGCGGTGACCCACATGGGCTTTGCCGCATCGAAGACCGGGGCCGAGGCT GTGGTCCGGCTGGTCGCGGCGCGGCTCTAG SEQ ID NO: 2 (codificada por la SEQ ID NO: 1) : código de 1 letra: MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATSVLR KTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRAVSEAAGGQKVIWGWSLGGL YARELGHKAPELIRMWTLGSPFAGDLHANHAWKIYEAINSHTVDNLPIPVDFQIKPP VRTIAV SPLDGWAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAEAWRLVAAR L- Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu Ala Asp lie Pro Ala lie Val Thr Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val Ala Gly Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly lie Arg Gly Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser Glu Ala Ala Gly Gly Gln Lys Val lie Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu lie Arg Met Val Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn His Ala Trp Lys lie Tyr Glu Ala lie Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro lie Pro Val Asp Phe Gln lie Lys Pro Pro Val Arg Thr lie Ala Val Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ser Pro Glu GIn Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala Ala Arg Leu SEQ ID NO: 3: ATGGCCGGCCACCAGGGCGCGCGGGGCCCCAAAGACGGTCCGCCGGCGATGGTG ATCCCGGGCTTCCTCGCCCACGACAGGCACACGACACGATTGCGCCGGGAACTC GCCGAGGCGGGGTTCAGGGTTCACCCGTGGCGGCAGGGCTGGAACATGGGAGCG CGTGCCGACACGCTCGAGAAATTGAAGCGGGCAGTGGACCAGTGCGGTCATGAC GAGCCGATCCTGCTGGTCGGCTGGAGTCTGGGCGGGCTCTACGCGAGGGAGGTC GCGCGCGCCGAGCCGGATCAGGTGCGGGCGGTGGTCACTCTTGGTTCCCCGGTGT CGGGCGACCGGCGCCGCTACACCAACGTGTGGAAGCTGTACGAATGGGTGGCGG GTCACCCGGTGGACGACCCGCCGATCCCCGACAAGGAGGAAAAGCCGCCGGTGC CGACCCTGGCTTTGTGGTCGGCGGATGACGGGATCGTCGGCGCCCCGTCGGCGCG CGGGACTCAGTTATCTCACGACAAGGCGGTCGAGATGCGAACGAGCCACATGGG CTTTGCCATGTCGGCGAAGAGCGCACGCTTTGTTGTCGCCGAGATCGTGAAGTTC CTGAAGAAAACCGAAGGTTCCGAGTCGCACGATTGA SEQ ID N0:4 (codificada por la SEQ ID N0:3): MAGHQGARGPKDGPPAMVIPGFLAHDRHTTRLRRELAEAGFRVHPWRQGWNMGA RADTLEKLKRAVDQCGHDEPILLVGWSLGGLYAREVARAEPDQVRAWTLGSPVSG DRRRYTNVWKLYEWVAGHPVDDPPIPDKEEKPPVPTLALWSADDGIVGAPSARGTQ LSHDKAVEMRTSHMGFAMSAKSARFWAEIVKFLKKTEGSESHD SEQ ID NO: 5: GTGAGCGAGAAAGGCGCACCCAAGGGAAGGCAGCGGCTGAAGGAGATCGGCGC GCTTCTGTTCCACGCGCCTCGCAGCTTGGGCCATCTGGGCGCGCGCGGCCCCAAG GACGGTCCTCCGGTGATGGTCATCCCGGGATTCCTCGCGCACGACTTGCATACGA CGCAGTTGCGCCGGGCGCTCGCGAAGGCAGGCTTCCGAGTGCATCCGTGGCGGC AGGGGATGAACCTTGGAGCGCGCGCCGATACGCTCGAAATTCTGAAGCGCGCGG TGGATTCCTGCGGCTCGAGCGAGCCGATGCTGCTCGTCGGCTGGAGCCTGGGCGG TCTCTATGCCCGGGAGATCGCGCGTGCGGAGCCGGACCGGGTGCGGGCGGTGGT GACGATGGGATCGCCGGTGTGGGGCGACCGCAGGCGCTACACCAACGTGTGGAA GCTGTACGAACGGATTGCCGGCCATCCGGTCGACAAGCCGCCGATCCCGGACAA GAGCCAGAAGCCGCCGGTGCCGACTCTGGCTTTGTGGTCGCAGCATGATGGCATC GTCGGCGCGCCCTCGGCGAGAGGGACGAAGAAGACCCGCGACAAGGCGGTCGC CATCGACACGACTCACATGGGGTTTGCCATGTCGCCCAAGACGACGCGCGCGGC AGTGCGTGAGATCGTGGGCTTTTTGAATGAAGTCGAAGGCGGTTCGTCACCCCGG GCGTGA SEQ ID NO:6 (codificada por la SEQ ID NO:5): MSEKGAPKGRQRLKEIGALLFHAPRSLGHLGARGPKDGPPVMVIPGFLAHDLHTTQL RRALAKAGFRVHPWRQGMNLGARADTLEILKRAVDSCGSSEPMLLVGWSLGGLYA REIARAEPDRVRAWTMGSPVWGDRRRYT VWKLYERIAGHPVDKPPIPDKSQKPP VPTLAL SQHDGIVGAPSARGTKKTRDKAVAIDTTHMGFAMSPKTTRAAVREIVGF LNEVEGGSSPRA SEQ ID N0 : 7 : ATGAGGCTGCGCGAGGGGGGCGCGCTCGTATCGCGGGCCTATCGCGCCTTCGGG CGCCTCGGCGAGCGCGGCCCGGCGGACGGGCCGCCGCTGATGGTGATCCCGGGC TTCCTCGCCACCGATCGCACCACTTTGGGGCTGCAGCGGGCGCTGGCCAAGGGCG GCTACAAGGTGACCGGATGGGGCATGGGCCTCAACAGCGGCGTCACCGAAGACA TAGTCGACCGCATCGCCGCTCGGGTCGAAAGGTTTGGAGCCGGCCGCAAAGTGA TCCTCGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGACTCTACGCGCGCGTGGTCGCGCAGGAGC GGCCGGATCTCGTCGACAAGGTGGTCACGCTCGGCTCGCCCTTTTCGGGCGACAG GCGCCGCAACAACAATGTCTGGCGGCTCTACGAGTTCGTC GCCGGCCATCCGGTCAACAGCCCGCCGATCGACAAGGACCCCGAGGTGAAGCCG CCGGTGCCGACGCTCGCTATCTGGTCGCGGCGCGACGGCATCGTCTCTCCGGCGG GCGCGCGCGGGCGGGAGGGAGAGCGCGACGCCGAGCTCGAGCTCGACTGCAGC CACATGGGCTTTGCGGTCAGCGCCAGGGCTTATCCCAAGATCGTGGAGGCGGTG CGGGCGTTTCCGGAAAACATCCGTTCGCGCTGA SEQ ID N0 : 8 ( codif icada por la SEQ ID NO : 7 ) : MRLREGGALVSRAYRAFGRLGERGPADGPPLMVIPGFLATDRTTLGLQRALAKGGY KVTG GMGLNSGVTEDIVDRIAARVERFGAGRKVILVG SLGGLYARWAQERPD LVDKWTLGS P FS GDRRRNNNVWRL YE F VAGH P VNS P P I DKD P E VKP PVPTLAI WS R RDGIVSPAGARGREGERDAELELDCSHMGFAVSARAYPKIVEAVRAFPENIRSR SEQ ID NO : 9 : ATGAAGCCGCCGCCCGGATGGATGAAGATCCGGGAGGCGGGCTCGCTCCTCGCG CGCTTCTACCGCGCGTTCGGCAAGCTCGAGCCGCGCGGGCCGGCGGACGGGCCG AAGCTGATGGTGATCCCGGGTTTCCTCGCGGGCGACAGGACGACGCTCGGGCTG CAGCGAGCGCTGGCCGGCGGCGGCTACCGGGTCGCCGGCTGGGGGCTGGGGGTG AACCGCGGCGTTTCGGAGGACGTGGTCGACCGGATCGGCCAGCAAGTCGCGCGG TTCGGGGCGGGCGAGAAGGTGATCCTGGTCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCGCGCGTGGTGGCGCAGGAGCGGCCCGACCTCGTCGAGAAGGTGGTGACCTTG GGCTCGCCGTTTTCGGGCGACCGGCGGCGCAACAACAATGTGTGGCGGCTCTATG AGTGGGTGGCTGGGCATCCGGTGAACGATCCGCCGATCGACAAGGACCCGGCGA AGAAGCCCCCGGTGCCGACGCTCGCGATCTGGTCGCGGCGTGATGGGATCGTGG CGGTCGAAGGCGCGCGGGGGCGGCCGGAGGAGCGGGATGCCGAGCTGGAGATC GATTGCAGCCACATGGGGTTTGGGGTCAGCGGCAAGGCGTTTCCCCGAATCGTA GAGGCGGTGAAGGGGTTCTAA SEQ ID NO : 10 ( codi f icada por la SEQ ID NO : 9 ) MKPPPGWMKIREAGSLLARFYRAFGKLEPRGPADGPKLMVIPGFLAGDRTTLGLQR ALAGGGYRVAGWGLGV RGVSEDWDRIGQQVARFGAGEKVILVGWSLGGLYAR WAQERPDLVEKWTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEWVAGHPV DPPIDKDPAKKPP VPTLAIWSRRDGIVAVEGARGRPEERDAELEIDCSHMGFGVSGKAFPRIVEAVKGF SEQ ID N0:11: GTGTTGGTGCTGCCGGCGTTCCTCGCCAACGACCTTCCCACTTCGCTTCTCCGCAG GACGCTGAAGGCGAACGGGTTTCGCCCGTTCGGCTGGGCGAACGGTTTCAACTTA GGTGCACGGCCGGACACGCTCCAGCGCCTGAGCGCACGGCTCGATGCGGTGGTT CAGGAAGCGGGCAGGCCGGTTGCATTGATCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCCCGAGAGCTGGCGAAACGCAGGTCGGCTGAGGTGTCGGCAGTGATCACGCTC GGCACGCCCTTCTCGGTTGACCTCAGACGCAACAACGCCTGGAAGCTGTACGAG CTCATCAACGATCATCCTGTCGATGCCCCTCCCTTGGATGTTCAGGTCGACGCGA AGCCACCCGTCCGAACCTTCGCTTTGTGGTCGCGTCGCGACGGGATCGTAGCGCC CGCGAGCGCGCACGGCATGGAGGGCGAGTTCGACCAGGCGATCGAGCTGCAGTG CACGCACAACGAGATGGTCAGTGATCCGGAGGCCCTCTCCACGATCGTTACCTTG CTGCGGGAAAATGTTGGCTCCTGA SEQ ID NO: 12 (codificada por la SEQ ID NO: 11) : MLVLPAFLANDLPTSLLRRTLKANGFRPFGWANGFNLGARPDTLQRLSARLDAWQ EAGRPVALIGWSLGGLYARELAKRRSAEVSAVITLGTPFSVDLRRNNAWKLYELIND HPVDAPPLDVQVDAKPPVRTFALWSRRDGIVAPASAHGMEGEFDQAIELQCTHNEM VSDPEALSTIVTLLRENVGS SEQ ID NO: 13: GTGAATACAGCCGACCTATTGAAGCCACCACCCGCAAGCATGACAGTTCTCGAG GCGAGAGCGCTGCTGGACATATGCAAGATGAGCGCCCCATTGGCGCGCTTGCTA TTCAAAAAGAACTCGCCCTGGCGCAAACAACGGGTTCTCGTAATACCTGGCTTTG GCGCTGATGATCGCTACACCTGGCCGTTGCGCAATTTCGTCCAGGCACAGGGCTA TGCCACGACTGGCTGGGGCCTGGGCACCAACAAGGCAGGTCTCAATATGCCGCA TCAACTATCCGACGTCCACCCCAGATGGAAGCTAAAACCCAAGACGCCGTACCG TGGTGAGGCGGGCGTACCTTACGTGATTGACCGCTTGATCGAACGGTTTGACGAA TTGGCATCGACGGATCCGCAACCCATCGCACTTATAGGTTGGAGTCTGGGTGGTT TCATGGCCCGTGAAGTTGCCCGAGAGCGCCCAAACCAGGTGAGTCAGGTTATTA CCCTCGGTTCTCCTGTCATCGGAGGCCCAAAATACACCCTCGCTGCATCGGCTTT CATCCGGCGCAAATACGATTTGGACTGGGTGGAGCAAGTGATCGCGGAGCGGGA AGATCGCCCCATTACTGTTCCTATTACAGCAATAGTCAGCCAGTCTGATGGCATC GTCGGATATTCAGCGGCAATCGATCACCACAGTCCCGCTGTGCAGCATTTACATA TGGATGTTGCCCATTTGGGCTTTCCTTACAACACGAGGGTTTGGTCAGAAATCGC CAATGCGCTCAACTCTTTAGAGGTGGAGAAGGAGCGTGTTTAG SEQ ID NO: 14 (codificada por la SEQ ID NO: 13) MNTADLLKPPPASMTVLEARALLDICKMSAPLARLLFKK SP RKQRVLVIPGFGA DDRYTWPLRNFVQAQGYATTGWGLGTNKAGLNMPHQLSDVHPRWKLKPKTPYRG EAGVPYVIDRLIERFDELASTDPQPIALIG SLGGFMAREVARERPNQVSQVITLGSPV IGGPKYTLAASAFIRRKYDLDWVEQVIAEREDRPITVPITAIVSQSDGIVGYSAAIDHH 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CTGGCGCAGCCCGAGGGGGAATTTAAGCATTTTGACCGGTCGGGTCCCTTTGCCA TTGCCTATGGCCCCCCTGAAAATGCACAATCCTGA SEQ ID NO: 18 (codificada por la SEQ ID NO: 17) : RAAADSGTAEGQRLRPPSLFLMLAEARGLLELNSSLLLSPLLLRAPKGDGHPVLALP GFLASDLSMAPMRRYLKELGYDAHAWNMGRNLGGVASKREALRDLLRRIYSQTGR KVSLVGWSLGGVYARDLALQAPDMVRSVITLGSPFASDIRATNATRLYEALSGERV DDNPELTAAIAGDLPVPATSIYSRTDGIVNWHTSLLRPSATAENIEVYFASHIGLGVNP AAL AVADRLAQPEGEFKHFDRSGPFAIAYGPPENAQS SEQ ID NO: 19: ATGCCGGAGCGAAACGAAGCGCAGGCCCCGCCGCGTCTTCGTCCGCCGGGGCTC GGGCTGTTCCTCGCCGAAGCGCGGGGCATTTTCGAGCTCAACGCGAGCCTGTTGC TGTCGCCGCTTCTGTTGCGCGCGCCGCGCGGCGACGGCCATCCGGTGCTGGCGTT GCCGGGCTTTCTTGCCAGTGATCTATCGATGGCGCCGTTGCGCCGCTACCTCACC GAGCTCGGCTACGACACCCACGCCTGGCGCATGGGCCGCAATGTCGGCGGCATC GCGAAGATGCGGATCGCGCTGCTCGAGCGGCTCACGCAGATCCATGCCGAGTGC GGCCGCAAGGTCTCGATTGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGCGACC TCGCGTTGCAGGCGCCCGAGATGGTGCGCTACGTCGTCACCCTCGGCAGCCCCTT CGCCAGCGACGTCCGCGCCACCAATGCGACGCGGCTCTATGAGGCGATGTCGGG CGAAACGGTCGGCGACAATGTCGACCTCGTGCAGGCGATTGCCGGCGACCTGCC GGTTCCCGTGACCTCGATCTATTCGAAGAGCGACGGCATCGTGAACTGGCGGACC TGCCTGCTGCGCCCGTCCGCGACCGCCGAGAATATCGAGGTCTATTTCGCGAGCC ATGTCGGCATCGGCGTCAATCCGGCCGCGCTGTGGGCGATCGCGGACCGGCTGG CCCAGCGGGAAGGCGAATTCCGCCCCTTCGACCGGTCCGGTCCTTTTGCCATTGC CTACGCGCCCCCGGAACAGGCACAATCGATCTGA SEQ ID NO: 20 (codificada por la SEQ ID NO: 19) : MPERNEAQAPPRLRPPGLGLFLAEARGIFELNASLLLSPLLLRAPRGDGHPVLALPGF LASDLS APLRRYLTELGYDTHAWRMGRNVGGIAKMRIALLERLTQIHAECGRKVS IVGWSLGGVYARDLALQAPEMVRYWTLGSPFASDVRATNATRLYEAMSGETVGD NVDLVQAIAGDLPVPVTSIYSKSDGIVNWRTCLLRPSATAENIEVYFASHVGIGVNPA ALWAIADRLAQREGEFRPFDRSGPFAIAYAPPEQAQSI Provistos en la presente son métodos para descubrir nuevas secuencias de hidrolasa usando los ácidos nucleicos según son provistos en la presente. También provistos son métodos para modificar los ácidos nucleicos según son provistos en la presente mediante tecnologías, v.gr., GSSM y GeneReassembly . Los ácidos nucleicos según son provistos en la presente pueden hacerse, aislarse y/o manipularse mediante, v.gr., clonación y expresión de bibliotecas de ADNc, amplificación de ADN de mensaje o genómico por PCR, y similares.

La fuente inicial de polipéptidos y ácidos nucleicos ejemplares seleccionados es: Al llevar a la práctica los métodos según son provistos en la presente, genes homólogos pueden ser modificados mediante manipular un ácido nucleico de plantilla, según se describe en la presente. La materia sujeto reivindicada puede ser practicada en conjunto con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en la materia, los cuales son bien descritos en la literatura científica y de patentes.

Técnicas Generales En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos incluyendo AR , ARNi, ácido nucleico anti-sentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus, o híbridos de los mismos, ácidos nucleicos aislados a partir de una variedad de fuentes, diseñados genéticamente, amplificados, y/o expresados/generados de una manera recombinante . Polipéptidos recombinantes generados a partir de estos ácidos nucleicos se pueden aislar o clonar individualmente y se pueden probar para una actividad deseada. Se puede utilizar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión de células de bacterias, de mamífero, de levadura, fúngicas, de insecto, o de planta.

Alternativamente, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describen en, v.gr., Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radie. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; patente US 4,458,066.

Técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, v.gr., sub-clonación, sondas marcadoras (v.gr., marcado con cebador aleatorio utilizando polimerasa Klenow, traducción de apriete, amplificación) , secuenciación, híbrida-ción, y similares, se describen bien en la literatura científica y de patentes, ver, v.gr., Sambrook, ed. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2DA. ED . ) , Vols . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. , John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) .

Otros medios útiles para obtener y manipular ácidos nucleicos utilizados para practicar los métodos según son provistos en la presente es clonar a partir de muestras genómi-cas, y si se desea, clasificar y volver a clonar los insertos aislados o amplificados a partir de, v.gr., clones genómicos o clones de ADNc. Las fuentes de ácido nucleico utilizadas en los métodos de la invención incluyen bibliotecas genómicas o de ADNc contenidas en, v.gr., cromosomas artificiales de mamífero (MACs) , ver, v.gr., patentes US 5,721,118 y 6,025,155; cromosomas artificiales humanos, ver, v.gr., Rosenfeld (1997) iVafc. Genet. 15:333-335; cromosomas artificiales de levadura (YAC) ; cromosomas artificiales bacterianos (BAC) ; cromosomas artificiales de Pl, ver, v.gr., Woon (1998) Genomics 50:306-316; vectores derivados de Pl (PACs) , ver, v.gr., Kern (1997) Biotechnigues 23:120-124; cósmidos, virus recombinantes, fagos, o plásmidos.

Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos" pueden incluir un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o un fragmento de cualquiera de estos, ADN o ARN (v.gr., ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético, que pueden ser de una sola cadena o de doble cadena, y pueden representar una cadena en sentido o anti-sentido, ácido nucleico peptídico (ANP) , o cualquier material tipo ADN o tipo ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi (ARN de "interferencia" de doble cadena), ribonucleoproteínas (v.gr., iRNPs) . El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonu-cleótidos, que contengan análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca las estructuras tipo ácido nucleico con esqueletos sintéticos; ver, v.gr., Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36 : 8692-8698 ; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156.

Como se utiliza en la presente, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia de codificación en una célula, v.gr. , una célula de planta. Por consiguiente, promotores utilizados en las construcciones según son provistas en la presente incluyen elementos de control de transcripción de acción cis y secuencias regulatorias que están involucradas en la regulación o modulación del tiempo y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de transcripción de acción cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de transcripción, un origen de réplica, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intrónica, que estén involucrados en regulación de transcripción. Estas secuencias de acción cis típicamente interactúan con proteínas u otras bio-moléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Promotores "constitutivos" son aquellos que impulsan la expresión continuamente bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresión del ácido nucleico según es provisto en la presente bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones del desarrollo. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz.

Promotores "específicos de tejido" son elementos de control de transcripción que solamente están activos en células o tejidos u órganos particulares, v.gr., en plantas o animales. Regulación específica del tejido se puede lograr mediante ciertos factores intrínsecos que aseguran que se expresen genes que codifican proteínas específicas para un tejido dado. Se sabe que tales factores existen en mamíferos y plantas tal que permitan que tejidos específicos se desarrollen.

El término "planta" incluye plantas enteras, partes de plantas (v.gr., hojas, tallos, flores, raíces, etc.), protoplas-tos de plantas, semillas, y células de plantas, y progenie de las mismas . La clase de plantas que se puede utilizar en el método según es provisto en la presente es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas . Incluye las plantas de una variedad de niveles ploideos, incluyendo los estados poliploideo, diploideo, aploideo, y hemicigótico . Como se utiliza en la presente, el término "planta transgénica" incluye las plantas o células de plantas en las cuales se ha insertado una secuencia de ácido nucleico heteróloga, v.gr., los ácidos nucleicos y varias construcciones recombinantes (v.gr., cartuchos de expresión) según son provistas en la presente.

En un aspecto, un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención se ensambla en la fase apropiada con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o el fragmento del mismo.

La invención proporciona proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la invención se puede fusionar con un péptido o polipéptido heterologo, tal como los péptidos de identificación N-terminal que imparten características deseadas, tal como una mayor estabilidad o una purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se puede sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales enlazados a los mismos, por ejemplo, para producir un péptido más inmunógeno, para aislar más fácilmente un péptido recombinantemente sintetizado, para identificar y aislar anti-cuerpos y células B que expresen anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales, tales como los tramos de polihistidina y los módulos de histidina-triptofano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (Immunex Corp. Seattle WA) . La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprenda el motivo, facilitan la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique al epítopo enlazada a seis residuos de histidina, seguida por una tio-redoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa (ver, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Los residuos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología perteneciente a los vectores que codifican proteínas de fusión, y la aplicación de las proteínas de fusión, se describen bien en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell.

Biol., 12:441-53.

Secuencias de control de transcripción y traducción En otra forma de realización, secuencias de ácidos nucleicos (v.gr., ADN, ARNi) operativamente enlazadas con secuencias de control de expresión (v.gr., de transcripción o de traducción), v.gr., promotores o potenciadores , para dirigir o modular la síntesis/expresión del ARN son provistas en la presente. La secuencia de control de expresión puede estar en un vector de expresión. Promotores bacterianos ejemplares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL, y trp. Los promotores eucariotas ejemplares incluyen el CMV inmediato temprano, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína de ratón.

Promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacl, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7 , el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, promotores a partir de operones que codifican enzimas glicolíti-cas, tales como 3 - fosfoglicerato quinasa (PGK) , y el promotor de fosfatasa ácida. Promotores eucariotas incluyen al promotor CMV inmediato temprano, al promotor de timidina quinasa de HSV, los promotores de choque por calor, el promotor SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína-I de ratón. También se pueden utilizar otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus.

Promotores de Planta Específicos de Tejido En una forma de realización, cartuchos de expresión son provistos en la presente que se pueden expresar de una manera específica del tejido, v.gr. , que pueden expresar una hidrolasa según es provista en la presente en una manera específica de tejido. En otra forma de realización, plantas o semillas son provistas en la presente que expresan una hidrolasa según es provista en la presente en una manera específica de tejido. La especificidad de tejido puede ser específica de semilla, específica de tallo, específica de hoja, específica de raíz, específica de fruta y similares.

En un aspecto, se puede utilizar un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, para expresión en partes específicas de la planta o la semilla, o a través de toda la planta. Por ejemplo, para la sobre-expresión de una hidrolasa según es provista en la presente, se puede emplear un fragmento de promotor de planta, el cual dirigirá la expresión de un ácido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, v.gr., una planta regenerada. Tales promotores "constitutivos" son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de transcripción 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), el promotor l1- o 2' derivado a partir del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de inicio de transcripción a partir de varios genes de plantas conocidos por los técnicos en la materia. Tales genes incluyen, v.gr., ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat de Arabidopsis (GenBank No . U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); el gen que codifica desaturasa de proteína portadora de estearoílo-acilo de Brassica napus (GenBank No. X74782, Solocombe (1994) Plant. Physiol. 104:1167-1176); GPcl de maíz (GenBank No. X15596; Martínez (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565); GPc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); los promotores de plantas descritos en las patentes US 4,962,028 y 5,633,440.

En una forma de realización, promotores específicos de tejido o constitutivos derivados de virus, los cuales pueden incluir, v.gr., el promotor sub-genómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1679-1683); el virus baciliforme de arroz tungro (RTBV) , el cual se replica solamente en células de floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor el cual impulsa una fuerte expresión del gen reportero específico del floema; el promotor del virus de mosaico de vena de cassava (CVMV) , con su actividad más alta en elementos vasculares, en las células de mesófilo de hojas, y en puntas de raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139) son provistos en la presente.

Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión de un ácido nucleico que expresa hidrolasa en un tipo específico de tejido, órgano, o célula (es decir, promotores específicos de tejido) o puede estar de otra manera bajo un control ambiental o de desarrollo más preciso o bajo el control de un promotor inducible. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, la presencia de luz, o rociado con productos químieos/hormonas . En una forma de realización, promotores inducible por sequía de maíz (Busk (1997) supra) ; el promotor inducible por frío, sequía, y alto contenido de sal de la papa (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909) son provistos en la presente .

Promotores específicos del tejido pueden promover transcripción solamente dentro de cierto lapso de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Ver, v.gr., Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Ver también Cardón (1997) Plant J. 12:367-77, que describe el factor de transcripción SPL3, el cual reconoce un motivo de secuencia conservado en la región promotora del gen de identidad de meristemo floral API de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol . 29, pp. 995-1004, que describe el promotor de meristemo elF4. Se pueden utilizar promotores específicos de tejido que sean activos a través de todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos según son provistos en la presente se enlazan operativamente con un promotor activo primordialmente sólo en células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos según son provistos en la presente se enlazan operativamente a un promotor activo primordialmente durante las etapas de elongación de células de fibra de algodón, v.gr., como es descrito por Rinehart (1996) supra. Los ácidos nucleicos se pueden enlazar operativamente al promotor del gen Fbl2A para expresarse con preferencia en células de fibra de algodón {Ibid) . Ver también John (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John et al., patentes US 5,608,148 y 5,602,321, que describen promotores específicos de fibra de algodón, y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas . También se pueden utilizar promotores específicos de raíz para expresar los ácidos nucleicos según son provistos en la presente. Ejemplos de promotores específicos de raíz incluyen al promotor del gen de deshidrogena-sa de alcohol (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Otros promotores que se pueden utilizar para expresar los ácidos nucleicos según son provistos en la presente incluyen, v.gr., promotores específicos del óvulo, específicos del embrión, específicos del endosperma, específicos del integumento, específicos del recubrimiento de la semilla, o alguna combinación de los mismos; un promotor específico de hoja (ver, v.gr., Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, que describe un promotor específico de hoja en maíz) ; el promotor ORF13 de Agrobacterium rizogenes (que exhibe una alta actividad en raíces, ver, v.gr., Hansen (1997) supra) ; un promotor específico de polen de maíz (ver, v.gr., Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161-168); un promotor de jitomate activo durante la maduración de la fruta, senectud, y abscisión de las hojas, y en un menor grado, de las flores (ver, v.gr., Blume (1997) Plant J. 12:731-746); un promotor específico de pistilo del gen SK2 de papa (ver, v.gr., Picker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431); el gen Blec4 de chícharo, el cual es activo en el tejido epidérmico de los ápices del vastago vegetativos y florales de alfalfa transgénica que lo hacen una herramienta útil para dirigir la expresión de genes extraños hacia la capa epidérmica de vástagos o fibras que crecen activamente; el gen BEL1 específico del óvulo (ver, v.gr., Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944); y/o el promotor en Klee, patente US 5,589,583, que describe una región promotora de planta que es capaz de conferir altos niveles de transcripción en tejido meristémico y/o células que se dividen rápidamente.

Alternativamente, se utilizan promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a hormonas de plantas, tales como auxinas, para expresar los ácidos nucleicos según son provistos en la presente. En una forma de realización, promotores que comprenden el fragmento del promotor El de elementos de respuesta a auxina (AuxRes) de la semilla de soya {Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407) ; el promotor GST6 de Arabidop-sis que responde a auxina (que también responde a ácido salicíli-co y peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10:955-966) ; el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913) ; un elemento de respuesta a biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y el promotor que responde al ácido abscísico de hormona de tensión (Sheen (1996) Science 274:1900-1902) son provistos en la presente.

Los ácidos nucleicos según son provistos en la presente también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a reactivos químicos que se puedan aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, el promotor ln2-2 de maíz, activado por el herbicida de bencensulfonamida se puede usar (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577) ; la aplicación de diferentes aseguradores de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en la raíz, hidátodos, y el meristemo apical del vástago. Secuencias de codificación pueden estar bajo el control de, v.gr., un promotor inducible por tetraciclina, v.gr., como se describe con plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J". 11:465-473); o un elemento que responde a ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324). Utilizando promotores químicamente inducidos (v.gr., por hormonas o plaguicidas) , es decir, promotor que responde a un producto químico el cual se pueda aplicar a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de arginina en una etapa particular del desarrollo de la planta. En ciertas formas de realización, son provistas en la presente plantas transgénicas que contienen un gen inducible que codifica para polipéptidos según son provistos en la presente, cuyo rango hospedero está limitado a especies de plantas objetivo, tales como cultivos de maíz, arroz, cebada, trigo, papa, u otros, inducibles en cualquier etapa de desarrollo del cultivo.

Promotores de plantas específicos de tejido pueden impulsar la expresión de secuencias operativamente enlazadas en tejidos diferentes al tejido objetivo. Por lo tanto, un promotor específico del tejido es uno que impulsa la expresión de preferencia en el tejido o tipo de célula objetivo, pero también puede conducir a alguna expresión en otros tejidos.

Los ácidos nucleicos de la invención también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, v.gr., herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos, que se pueden aplicar, v.gr., rociar, sobre las plantas transgénicas. Expresión inducible de ácidos nucleicos productores de hidrolasa según son provistos en la presente permitirá que el cultivador seleccione plantas con la proporción óptima de almidón/azúcar. De esta manera se puede controlar el desarrollo de las partes de las plantas .

En una forma de realización, provistos en la presente son medios para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en varias formas de realización, se utiliza el promotor In2-2 de maíz, activado por los aseguradores de herbicidas de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); aplicación de diferentes aseguradores de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo expresión en la raíz, hidátodos, y el meristemo apical del vástago. Secuencias de codificación según son provistas en la presente también están bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, v.gr. , como se describe con plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento que responda a ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11 : 1315-1324) .

Si se desea expresión apropiada del polipéptido, se debe incluir una región de poliadenilación en el extremo 31 de la región de codificación. La región de poliadenilación se puede derivar a partir del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de plantas, o a partir de genes en el ADN-T de Agrobacteri .

Vectores de Expresión y Vehículos de Clonación En una forma de realización, provistos en la presente son vectores de expresión, cartuchos de expresión y vehículos de clonación que comprenden ácidos nucleicos, v.gr., secuencias que codifican las hidrolasas y anticuerpos. Vectores de expresión y vehículos de clonación según son provistos en la presente pueden comprender partículas virales, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacteria-nos, ADN viral (v.gr., vacunas, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, pseudo-rabia, y derivados de SV40) , cromosomas artificiales basados en Pl, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para hospederos específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus, y levadura) . Vectores según son provistos en la presente pueden incluir secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas , y sintéticas. Grandes números de vectores adecuados son conocidos para los técnicos en la materia, y están comercial-mente disponibles. Vectores ejemplares incluyen: bacterianos: pQE (Qiagen) , plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene) ) ; ptrc99a, pKK223-3; pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3 , pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia) . Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector, siempre que se puedan replicar y sean viables en el hospedero. Se pueden emplear vectores de un bajo número de copias o de un alto número de copias .

En una forma de realización, un "cartucho de expresión" según es provisto en la presente comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de tener efecto sobre la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteína, tal como una hidrolasa según es provista en la presente) en un hospedero compatible con tales secuencias. Cartuchos de expresión incluyen cuando menos un promotor operativamente enlazado con la secuencia de codificación de polipéptido; y, opcionalmente, con otras secuencias, v.gr., señales de terminación de transcripción. También se pueden utilizar factores adicionales necesarios o útiles para tener efecto sobre la expresión, v.gr., potenciadores . "Operativamente enlazado", como se utiliza en la presente, se refiere a un enlace de un promotor corriente arriba de una secuencia de ADN, de tal manera que el promotor regule transcripción de la secuencia de ADN. Por consiguiente, cartuchos de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes , cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante, y similares. Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoriamente o permanentemente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico formando complejo con una proteína o lípido. El vector comprende opcionalmente ácidos nucleicos y/o proteínas virales o bacterianos, y/o membranas (v.gr.., una membrana celular, una envoltura de lípido viral, etc.) . Vectores incluyen, pero no se limitan a, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN, y se pueden llegar a replicar. Por consiguiente, vectores incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN o ARN circular o lineal de auto-réplica autónoma (v.gr., plásmidos, virus, y similares, ver, v.gr., la patente US 5,217,879), e incluyen tanto los plásmidos de expresión y no de expresión. Donde un microorganismo o cultivo celular recombinante se describe como hospedando un "vector de expresión" , éste incluye tanto ADN circular y lineal extra-cromosómieo como ADN que se ha incorporado en los cromosomas del hospedero. Donde un vector está siendo mantenido por una célula hospedera, el vector puede ser establemente replicado por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o bien se incorpora dentro del genoma del hospedero.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlace de ribosoma para inicio de traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Vectores de expresión de mamífero pueden comprender un origen de réplica, cualesquiera sitios de enlace de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios de donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo 5'. En algunos aspectos, se pueden utilizar secuencias de ADN derivadas a partir del empalme SV40 y de los sitios de poliadenilación, para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células hospederas que contengan al vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a neomicina para un cultivo celular eucariota, genes que confieren resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae . Regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado, utilizando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables .

Vectores para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en células eucariotas, también pueden contener potenciado-res para aumentar niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN de acción cis, usualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ejemplos incluyen al potenciador de SV40 sobre el lado tardío del origen de réplica de los pares de bases 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de réplica, y los potenciadores de adenovirus .

Se puede insertar una secuencia de ADN en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga a la posición deseada en el vector siguiendo a digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Alternativamente, se pueden ligar los extremos romos tanto del inserto y el vector. Una variedad de técnicas de clonación son conocidas en la materia, v.gr., como se describen en Ausubel y Sambrook. Tales procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los técnicos en la materia.

El vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas , y sintéticas, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vacunas, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, y pseudo-rabia . Una variedad de vectores de clonación y expresión para utilizarse con hospederos procariotas y eucariotas son descritos, v.gr., por Sambrook .

Vectores bacterianos particulares que se pueden utilizar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles comprendiendo elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) , pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) , GEMI (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pDIO, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene) , ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3 , pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector, siempre que sea replicable y viable en la célula hospedera.

Los ácidos nucleicos según son provistos en la presente se pueden expresar en cartuchos de expresión, vectores o virus, y se pueden expresar de una manera transitoria o estable en células y semillas de plantas. Un sistema de expresión transito-ria de ejemplo utiliza sistemas de expresión episomal, v.gr., el ARN viral del virus de mosaico de coliflor (CaMV) generado en el núcleo mediante la transcripción de un ADN super-enrollado que contiene mini-cromosoma episomal, ver, v.gr., Covey (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Alternativamente, se pueden insertar secuencias de codificación, es decir, todas o sub-fragmentos de secuencias según son provistas en la presente, en un genoma de célula hospedera de planta que llegue a ser una parte integral del ADN cromosómico del hospedero. Transcripciones en sentido o anti-sentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprenda las secuencias (v.gr., promotores o regiones codificantes) de los ácidos nucleicos según son provistos en la presente, puede comprender un gen marcador que confiera un fenotipo seleccionable en una célula de planta o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, en particular resistencia a antibióticos, tal como resistencia a kanamicina G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia a clorosulfurón o Basta.

Vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en la materia, y pueden incluir, v.gr., vectores a partir de Agrojbacte-rium spp. , virus X de papa (ver, v.gr., Angelí (1997) EMBO J. 16:3675-3684), virus de mosaico de tabaco (ver, v.gr., Casper (1996) Gene 173:69-73), virus de añublo de arbusto de jitomate (ver, v.gr., Hillman (1989) Virology 169 : 2-50) , virus de añublo de tabaco (ver, v.gr., Dolja (1997) Virology 234 : 243 -252) , virus de mosaico dorado de frijol (ver, v.gr., Morinaga (1993) Microbiol Immunol . 37:471-476), virus de mosaico de coliflor (ver, v.gr., Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transpondible Ac/Ds de maíz (ver, v.gr., Rubín (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), y el elemento transpondible del supresor-mutador de maíz (Spm) (ver, v.gr., Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725) ; y derivados de los mismos.

En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de réplica para permitirle mantenerse en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero, levadura, hongos o insecto para expresión y en un hospedero procariota para clonación y amplificación. Adicionalmente , para integrar los vectores de expresión, el vector de expresión puede contener cuando menos una secuencia homologa al genoma de la célula hospedera. Puede contener dos secuencias homologas que flanqueen la construcción de expresión. El vector de integración se puede dirigir hacia un locus específico en la célula hospedera, mediante seleccionar la secuencia homologa apropiada para inclusión en el vector. Construcciones para vectores de integración son bien conocidas en la materia.

Vectores de expresión según son provistos en la presente también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas , v.gr., genes que hagan a la bacteria resistente a fármacos, tales como ampicilina, cloranfenicol , eritromicina, kanamicina, neomicina, y tetraciclina . Marcadores seleccionables también pueden incluir genes bio-sintéticos, tales como aquellos en las trayectorias bio-sintéticas de histidina, triptofano, y leucina.

Células Hospederas y Células Transformadas En una forma de realización, provistas en la presente son células transformadas que comprenden una secuencia de ácido nucleico, v.gr., una secuencia que codifica una hidrolasa o un anticuerpo, o un vector según son provistos en la presente. La célula hospedera puede ser cualquiera de las células hospederas familiares a los técnicos en la materia, incluyendo células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células füngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células de planta.

Enzimas según son provistas en la presente se pueden expresar en cualquier célula hospedera, v.gr., cualquier célula bacteriana, cualquier célula de levadura, cualquier Saccharomyces o Schizosaccharomyces spp. , cualquier Pichia spp. , v.gr., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe. Células bacterianas ejemplares incluyen cualquier Streptomyces o Bacillus spp., v.gr., E. coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium o cualquier especie dentro de los géneros de Bacillus, Streptomyces, y Staphylococcus . Células de insecto ejemplares incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Células de animales ejemplares incluyen CHO, COS, o melanoma de Bowes, o cualquier línea celular de ratón o humana. La selección de un hospedero apropiado está dentro de la capacidad de los técnicos en la materia. Técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas, y se describen en la literatura técnica y científica. Ver, v.gr., Weising (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421-477, patente US 5,750,870.

El vector se puede introducir en las células hospederas empleando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transíección, transducción, infección viral, pistolas genéticas, o transferencia genética mediada por Ti. Métodos particulares incluyen transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electropo-ración (Davis, L. , Dibner, M. , Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) .

Cuando sea apropiado, las células hospederas diseñadas se pueden cultivar en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes según son provistos en la presente. En seguida de la transformación de una cepa hospedera adecuada y crecimiento de la cepa hospedera a una densidad celular apropiada, se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (v.gr., cambio de temperatura o inducción química) y las células se pueden cultivar por un período adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores según son provistos en la presente se introducen en las células para clasificación, y de esta manera, los ácidos nucleicos entran a las células de una forma adecuada para la expresión subsecuente del ácido nucleico. El método de introducción es en gran parte dictado por el tipo de célula objetivo. Métodos ejemplares incluyen precipitación con CaP04, fusión de liposoma, lipofección (v.gr., LIPOFECTIN) , electroporación, infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos se pueden integrar establemente en el genoma de la célula hospedera (por ejemplo, con introducción retroviral) , o pueden existir ya sea de una manera transitoria o estable en el citoplasma (es decir, a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras convencionales, marcadores de selección, etc.). Formas de realización alternativas comprenden vectores retrovirales capaces de transfectar tales objetivos (v.gr., células de mamífero, humanas) debido a que, v.gr., muchas clasificaciones farmacéuticamente importantes requieren objetivos celulares humanos o de mamíferos modelo.

Células pueden ser cosechadas mediante centrifugación, alteradas mediante elementos físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. Células microbianas empleadas para expresión de proteínas pueden alterarse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, tratamiento sónico, alteración mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Tales métodos son bien conocidos por los técnicos en la materia. El polipéptido expresado o el fragmento del mismo se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía con interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. Se pueden emplear pasos de repliegue de proteína, como sean necesarios, para llevar a cabo la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) para los pasos de purificación finales.

También se pueden emplear diferentes sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar la proteína recombinan-te. Ejemplos de los sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, y otras líneas celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Las construcciones de las células hospederas se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante . Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por células hospederas conteniendo al vector pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados . Polipéptidos según son provistos en la presente pueden o no incluir también un residuo de aminoácido de metionina inicial .

También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir un polipéptido según es provisto en la presente. Sistemas de traducción libres de células pueden utilizar ARNms transcritos a partir de una construcción de ADN que comprenda un promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifique al polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la construcción de ADN se puede linearizar antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. Luego se incuba el ARNm transcrito con un extracto de traducción libre de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o el fragmento del mismo .

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo genotípico para la selección de células hospederas transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo celular eucariota, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Amplificación de Ácidos Nucleicos En otra forma de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican a los polipéptidos, o ácidos nucleicos modificados, pueden ser reproducidos por, v.gr., amplificación. En una forma de realización, provistos en la presente son pares cebadores de amplificación para amplificar ácidos nucleicos que codifican una hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, donde los pares cebadores son capaces de amplificar secuencias de ácidos nucleicos según son provistas en la presente. Un técnico en la materia puede diseñar pares de secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte de o la longitud completa de estas secuencias.

También se pueden utilizar reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), marcar el ácido nucleico (v.gr. , para aplicarlo a un arreglo o un blot) , detectar el ácido nucleico, o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. En un aspecto según es provisto en la presente, se amplifica el mensaje aislado a partir de una célula o una biblioteca de ADNc . El técnico en la materia puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. Métodos de amplificación son bien conocidos en la materia, e incluyen, v.gr. , reacción en cadena de polimerasa, PCR (ver, v.gr., PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N. Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N. Y.), reacción en cadena de ligasa (LCR) (ver, v.gr., u (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de transcripción (ver, v.gr., Kwoh (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173); y réplica de secuencia auto-sostenida (ver, v.gr., Guatelli (1990) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación de replicasa Q Beta (ver, v.gr., Smith (1997) J". Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación de replicasa Q-beta automatizado (ver, v.gr., Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por polimerasa de ARN (v.gr., NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) ; ver también Berger (1987) Methods Enzymol . 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patentes US 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13 : 563-564.

En una forma de realización, provistos en la presente son pares cebadores de amplificación comprendiendo secuencias según son provistas en la presente, por ejemplo, en donde el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se señala por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 o más residuos de un ácido nucleico según es provisto en la presente, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se señala por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 o más residuos de la cadena complementaria¦¦ del primer miembro .

Determinar el grado de identidad de secuencia En una forma de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de ácidos nucleicos o completa (100%) con un ácido nucleico según es provisto en la presente, v.gr. , un ácido nucleico ejemplar según es provisto en la presente (v.gr., teniendo una secuencia como se señala en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO:l modificada para codificar una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de bases descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o los equivalentes de las mismas).; y polipéptidos teniendo una identidad de secuencia de cuando menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 8 %/ 88%/ 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97% , 98% , 99% o más, o completa (100%) , con un polipéptido según es provisto en la presente, v.gr., un polipéptido ejemplar que tiene una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO : 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o los equivalentes de las mismas. En aspectos alternativos, la identidad de secuencia puede estar sobre una región de cuando menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000 o más residuos consecutivos, o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar utilizando cualquier programa de computadora y parámetros asociados, incluyendo aquellos descritos en la presente, tales como BLAST 2.2.2 o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros predeterminados.

La tabla siguiente describe características seleccionadas de ácidos nucleicos y polipéptidos ejemplares según son provistos en la presente, incluyendo comparación de identidad de secuencias de las secuencias ejemplares con bases de datos públicas para identificar actividad de enzimas según son provistas en la presente por análisis de homología (identidad de secuencias) . Todas las secuencias descritas en la tabla (todas las secuencias ejemplares según son provistas en la presente) se han sometido a una búsqueda de BLAST (como se describe a detalle, más adelante), contra dos conjuntos de bases de datos. El primer conjunto de base de datos está disponible a través de NCBI (National Center for Biotechnology Information) . Todos los resultados de las búsquedas contra estas bases de datos se encuentran en las columnas tituladas "descripción NR" , "código de acceso NR" , "valorE NR" , u "organismo NR" . "NR" se refiere a la base de datos de nucleótidos No Redundante mantenida por NCBI . Esta base de datos es un compuesto de GenBank, actualizaciones de GenBank, y actualizaciones de EMBL. Las anotaciones en la columna de "descripción NR" se refieren a la línea de definición en cualquier registro NCBI, que incluye una descripción de la secuencia, tal como el organismo fuente, nombre del gen/nombre de proteína, o alguna descripción de la función de la secuencia -por consiguiente identificando una actividad de las enzimas ejemplares listadas según son provistas en la presente por análisis de homología (identidad de secuencias) . Las anotaciones en la columna de "Código de Acceso NR" se refieren al identifica-dor único dado a un registro de secuencia. Las anotaciones en la columna de "ValorE NR" se refieren al valor Esperado (valorE) , que representa la probabilidad de que un puntaje de alineación sea tan bueno como el que se encontraría entre la secuencia pedida (las secuencias según son provistas en la presente) y una secuencia de la base de datos en el mismo número de comparaciones entre secuencias aleatorias como se hizo en la presente búsqueda BLAST. Las anotaciones en la columna de "Organismo NR" se refieren al organismo fuente de la secuencia identificada como el acierto BLAST más cercano. El segundo conjunto de bases de datos se conoce colectivamente como la base de datos GENESEQ, la cual está disponible mediante Thomson Derwent (Philadelphia, Pennsylvania, Estados Unidos) . Todos los resultados de las búsquedas contra esta base de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripción de Proteína GENESEQ" , "Código de Acceso de Proteína GENESEQ", "ValorE de Proteína GENESEQ", "Descripción de ADN GENESEQ" , "Código de Acceso de ADN GENESEQ" , o "ValorE de ADN GENESEQ" . La información que se encuentra en estas columnas es comparable con la información que se encuentra en las columnas NR descritas anteriormente, con la excepción de que se derivó a partir de las búsquedas BLAST contra la base de datos GENESEQ, en lugar de las bases de datos NCBI. Las columnas de "Longitud de ADN Pedido" y "Longitud de Proteína Pedida" se refieren al número de nucleótidos o al número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia según es provista en la presente, que se buscó o que se pidió contra cualquiera de las bases de datos NCBI o GENESEQ. Las columnas "Longitud de ADN GENESEQ o NR" y "Longitud de Proteína GENESEQ o NR" , se refieren al número de nucleótidos o al número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de la mejor concordancia a partir de la búsqueda BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valorE más bajo, ya sea a partir de las bases de datos NCBI o la base de datos GENESEQ. Las columnas de "%ID Proteina GENESEQ o NR" y "%ID ADN GENESEQ/NR" , se refieren al porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia de la invención y la secuencia de la mejor concordancia de BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valorE más bajo, ya sea partir de las bases de datos NCBI la base de datos GENESEQ.

Secuencias homologas también incluyen secuencias de ARN en las cuales uridinas reemplazan a las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias homologas se pueden obtener utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos según se señalan en la presente se pueden representar en el formato de un solo carácter tradicional (ver, v.gr., Stryer, Lubert . Biochemistry, 3ra Ed. , W. H Freeman & Co. , Nueva York) , o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

Varios programas de comparación de secuencias identificados en la presente y conocidos por los técnicos en la materia pueden usarse para comparación de secuencias. Las identidades de secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos (homologías) se pueden evaluar utilizando cualquiera de la variedad de algoritmos de comparación de secuencias y programas conocidos en la materia. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 ( 8 ) : 2444 -2448 , 1988; Altschul et al., J. Mol. Blol. 215 (3) :403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (2 ): 4673 -4680 , 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3) :403-410, 1990; Altschul et al . , Nature Genetics 3 : 266-272 , 1993) .

Homología o identidad se puede medir utilizando el software de análisis de secuencias (v.gr., el Paquete de Software de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) . Tal software empareja secuencias similares asignando grados de homología a diferentes supresiones, sustituciones, y otras modificaciones. Los términos "homología" e "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que sean las mismas o que tengan un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que sean los mismos al compararse y alinearse para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual.

Para la comparación de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia (v.gr., una secuencia ejemplar de ácidos nucleicos o polipéptidos según es provista en la presente) con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, secuencias de prueba y de referencia se introducen en un computador, se designan las coordenadas de la sub-secuenciar si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa predeterminados, o se pueden designar parámetros alternativos.

Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación" , como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de los números de residuos contiguos. Por ejemplo, en aspectos alternativos según son provistos en la presente, residuos contiguos variando de cualquiera de 20 a la longitud completa de una secuencia ejemplar de polipéptidos o ácidos nucleicos, se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida con una secuencia ejemplar de polipéptidos o ácidos nucleicos, v.gr., en aspectos alternativos, una identidad de secuencia del 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55% , 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, , 99%, o mas, o completa (100%) con una secuencia ejemplar de polipéptidos o ácidos nucleicos según es provista en la presente, esa secuencia está dentro del alcance según es provisto en la presente. En formas de realización alternativas, sub-secuencias variando de aproximadamente 20 a 600, aproximada-mente 50 a 200, y aproximadamente 100 a 150, se comparan con- una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. Alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, v.gr., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482,1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitudes de Person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFAS A en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI) , o mediante alineación manual e inspección visual. Otros algoritmos para determinar homología o identidad incluyen, por ejemplo, además del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biological Information) , ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequen-ees) , AMPS (Protein Múltiple Sequence Alignment) , ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool) , BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node) , BLIMPS (BLocks IMProved Searcher) , FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool) , Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package) , GAP (Global Alignment Program) , GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison) , LALIGN (Local Sequence Alignraent) , LCP (Local Content Program) , MACAW (Múltiple Alignment Construction & Analysis Workbench) , MAP (Múltiple Alignraent Program) , MBLKP, MBLK , PIMA (Pattern-Induced Multi- sequence Alignment) , SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. Tales programas de alineación también se pueden utilizar para rastrear bases de datos de genomas, con el fin de identificar secuencias de polinucleótidos que tengan secuencias sustancialraente idénticas. Hay un número de bases de datos de genomas disponibles, por ejemplo, una porción sustancial del genoma humano está disponible como parte del Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano (Gibbs, 1995) . Se han secuenciado varios genomas, por ejemplo, M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000) . También se ha hecho un progreso significativo en la secuenciación de genomas de organismos modelo, tales como ratón, C. elegans y Arabidopsis sp. Bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional se mantienen por diferentes organizaciones, y están accesibles por medio de la Internet.

Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0, y BLAST 2.2.2., también se pueden utilizar. Éstos se describen, v.gr., en Altschul (1977) Nuc. Acíds Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410. Software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) mediante identificar palabras cortas de una longitud en la secuencia pedida, las cuales ya sea concuerdan o satisfacen algún puntaje T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referido como un umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul (1990) supra) . Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulativo. Puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos concordantes; siempre >0) . Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X de su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibili-dad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. ¿Vafcl. Acad. Sci. USA 89:10915) , alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, v.gr., Karlin & Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N) ) , la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría por azar una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, o alternativamente, menor que aproximadamente 0.01, o, alternativamente, menor que aproximadamente 0.001.

En un aspecto, homologías de secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos se evalúan utilizando la Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST") . Por ejemplo, se pueden utilizar cinco programas BLAST específicos para llevar a cabo la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos pedida contra una base de datos de secuencias de proteínas; (2) BLASTN compara una secuencia de nucleótidos pedida contra una base de datos de secuencias de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptuales de seis marcos de una secuencia de nucleótidos pedida (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteína pedida contra una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas) ; y (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleótidos pedida contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos .

En un aspecto, los programas BLAST identifican secuencias homologas mediante identificar segmentos similares, los cuales son referidos en la presente como "pares de segmentos de alto puntaje", entre una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico pedida y una secuencia de prueba, la cual alternativa-mente se obtiene a partir de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Pares de segmentos de alto puntaje pueden alternativamente identificarse (es decir, alinearse) por medio de una matriz de puntaje, muchas de las cuales son conocidas en la materia. En un aspecto, la matriz de puntaje utilizada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993) . En un aspecto, también se pueden utilizar las matrices PAM o PAM250 (ver, v.gr., Schwartz y Dayhoff, eds . , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation) .

En un aspecto, para determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para estar dentro del alcance según es provisto en la presente, se utilizan los programas NCBI BLAST 2.2.2, con las opciones predeterminadas de blastp. Hay aproximadamente 38 opciones de configuración en el programa BLAST 2.2.2. En este aspecto ejemplar según es provisto en la presente, se utilizan todos los valores predeterminados, excepto por la configuración de filtración predeterminada (es decir, todos los parámetros se fijan a predeterminados excepto la filtración la cual se fija en DESACTIVADA) ; en su lugar, se utiliza una configuración "-F F" , la cual inhabilita la filtración. El uso de la filtración predeterminada con frecuencia resulta en violaciones de Karlin-Altschul, debido a la corta longitud de la secuencia.

Los valores predeterminados utilizados en este aspecto ejemplar según es provisto en la presente, incluyen: "Filtro para baja complejidad: ACTIVADO Tamaño de Palabra: 3 Matriz : Blosum62 Costos de Huecos: Existencia: 11 Extensión: 1" .

Otras configuraciones predeterminadas son: filtro para baja complejidad DESACTIVADO, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, multa por existencia de huecos de -11, y una multa por extensión de huecos de -1. En un aspecto, la opción "- " se predetermina a 0. Esto significa que, si no se establece, el tamaño de palabra se predetermina en 3 para proteínas y 11 para nucleótidos.

Sistemas de Computación y Productos de Programas de Cómputo Para determinar e identificar identidades de secuencias, homologías estructurales, motivos y similares in silico, la secuencia según es provista en la presente se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que pueda ser leído y accesado por un computador. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son computadores, sistemas de computación, medios legibles por computador, productos de programas de cómputo, y similares, conteniendo en los mismos (comprendiendo) secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos según son provistas en la presente registradas o almacenados en los mismos. Como se utilizan en la presente, las palabras "registrado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio de computador. Un técnico puede adoptar fácilmente cualquier método conocido para registrar información en un medio legible por computador para generar manufacturas que comprendan una o.- más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o polipéptidos según son provistas en la presente.

Otro aspecto según es provisto en la presente es un medio legible por computador que tiene registrado en el mismo cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos y/o polipéptidos según es provista en la presente. Medios legibles por computador incluyen medios magnéticamente legibles, medios ópticamente legibles, medios electrónicamente legibles, y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, el medio legible por computador puede ser un disco duro, un disco flexible, una cinta magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD) , Memoria de Acceso Aleatorio (RAM) , o Memoria de Sólo Lectura (ROM) , así como otros tipos de otros medios conocidos por los técnicos en la materia.

Aspectos de la invención incluyen sistemas (v.gr., sistemas basados en Internet) , en particular sistemas de cómputo, que almacenan y manipulan las secuencias e información de secuencias descrita en la presente. Un ejemplo de un sistema de cómputo 100 se ilustra en forma de diagrama de bloques en la Figura 1. Como se utiliza en la presente, "un sistema de cómputo" se refiere a componentes de hardware, componentes de software, y componentes de almacenamiento de datos utilizados para analizar una secuencia de nucleótidos o polipéptidos según es provista en la presente. El sistema de cómputo 100 puede incluir un procesador para procesar, accesar, y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad de procesamiento central, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD, o International Bussines Machines. El sistema de cómputo 100 es sistema para propósitos generales que comprende al procesador 105 y uno o más componentes de almacenamiento de datos internos 110 para almacenar datos, y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos . Un técnico puede apreciar fácilmente que es adecuado cualquiera de los sistemas de cómputo actualmente disponibles.

En un aspecto, el sistema de cómputo 100 incluye un procesador 105 conectado a una barra colectora la cual se conecta a una memoria principal 115 (alternativamente implementada como RAM) y uno o más dispositivos de almacenamiento de datos internos 110, tales como un disco duro y/u otro medio legible por computador que tenga datos registrados en el mismo. El sistema de cómputo 100 puede incluir además uno o más dispositivos de recuperación de datos 118 para leer los datos almacenados en los dispositivos de almacenamiento de datos internos 110. El dispositivo de recuperación de datos 118 puede representar, por ejemplo, una unidad de disco flexible, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un modem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (v.gr. , mediante la Internet), etc. En algunas formas de realización, el dispositivo de almacenamiento de datos interno 110 es un medio legible por computador removible, tal como un disco flexible, un disco compacto, una cinta magnética, etc., conteniendo la lógica de control y/o datos registrados en el mismo. El sistema de cómputo 100 puede ventajosamente incluir o programarse mediante software apropiado para leer la lógica de control y/o los datos a partir del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos. El sistema de cómputo 100 incluye una pantalla 120 que se utiliza para exhibir la salida a un usuario del computador. También se debe observar que el sistema de cómputo 100 se puede enlazar a otros sistemas de cómputo 125a-c en una red o red de área amplia, para proporcionar un acceso centralizado al sistema de cómputo 100. Software para accesar y procesar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos según son provistas en la presente puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución. En algunos aspectos, el sistema de cómputo 100 puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente. El algoritmo y las secuencias se pueden almacenar en un medio legible por computador. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se implementan (localmente o remotamente) en el sistema de cómputo 100 para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o compuestos almacenados dentro de medios de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos según son provistas en la presente almacenadas en un medio legible por computador con secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por computador para identificar homologías o motivos estructurales .

Los parámetros utilizados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de secuencia y grado de homología estudiado. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser parámetros predeterminados utilizados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o proteínas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homología entre la secuencia nueva y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema de cómputo 100, o una base de datos pública tal como GENBANK que está disponible a través de la Internet. El proceso 200 empieza en un estado de inicio 201 y luego se mueve hasta un estado 202 en donde se almacena la nueva secuencia a ser comparada a una memoria en un sistema de cómputo 100. Como se discutió anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo una RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. El proceso 200 entonces se mueve a un estado 204 en donde se abre una base de datos de secuencias para análisis y comparación. Luego el proceso 200 se mueve hasta un estado 206 en donde la primera secuencia almacenada en la basé de datos se lee en una memoria en el computador. Luego se lleva a cabo una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante observar que este paso no está limitado a llevar a cabo una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia de la base de datos. Métodos bien conocidos son conocidos por los técnicos en la materia para comparar dos secuencias de nucleótidos o proteínas, inclusive cuando no sean idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en una secuencia con el objeto de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias probadas. Los parámetros que controlan si se introducen huecos u otras características en una secuencia durante la comparación normalmente son introducidos por el usuario del sistema de cómputo. Una vez que se ha llevado a cabo una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinación, en el estado de decisión 210, de si las dos secuencias son las mismas. Por supuesto, el término "las mismas" no se limita a secuencias que sean absolutamente idénticas. Secuencias que estén dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario se marcarán como "las mismas" en el proceso 200. Si se hace una determinación de que las dos secuencias son las mismas, el proceso 200 se mueve al estado 214 en donde se exhibe el nombre de la secuencia a partir de la base de datos al usuario. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre exhibido satisface las restricciones de homología que se introdujeron. Una vez que se exhibe el nombre de la secuencia almacenada al usuario, el proceso 200 se mueve a un estado de decisión 218 en donde se hace una determinación de si existen más secuencias en la base de datos . Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en el estado de fin 220. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 se mueve al estado 224, en donde se mueve un apuntador a la siguiente secuencia de la base de datos tal que se puede comparar con la nueva secuencia. En esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia en la base de datos. Se debe observar que, si se hubiera hecho una determinación en el estado de decisión 212 de que las secuencias no eran homologas, entonces el proceso.200 se movería inmediatamente al estado de decisión 218 para determinar si estuvieron disponibles cualesquiera otras secuencias en la base de datos para comparación. De manera acorde, un aspecto según es provisto en la presente es un sistema de cómputo que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenada en el mismo una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente y un comparador de secuencias para conducir la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas o identificar motivos estructurales, o puede identificar motivos estructurales en secuencias que se comparan con estos códigos de ácidos nucleicos y códigos de polipéptidos . La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una forma de realización de un proceso 250 en un computador para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 comienza en un estado de inicio 252 y luego se mueve a un estado 254 en donde se almacena en una memoria una primera secuencia a ser comparada. La segunda secuencia a ser comparada se almacena entonces en una memoria en un estado 256. Luego el proceso 250 se mueve al estado 260 en donde se lee el primer carácter de la primera secuencia, y luego a un estado 262 en donde se lee el primer carácter de la segunda secuencia. Se debe entender que si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, entonces el carácter normalmente sería cualquiera de A, T, C, G, o U. Si la secuencia es una secuencia de proteínas, entonces puede ser un código de aminoácidos de una sola letra tal que se pueden comparar fácilmente las primeras y siguientes secuencias. Luego se hace una determinación en un estado de decisión 264 de si los dos caracteres son los mismos. Si son los mismos, entonces el proceso 250 se mueve a un estado 268 en donde se leen los siguientes caracteres de las primera y segunda secuencias.

Entonces se hace una determinación de si los siguientes caracteres son los mismos. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este ciclo hasta que dos caracteres no sean los mismos. Si se hace una determinación de que los siguientes dos caracteres no son los mismos, el proceso 250 se mueve a un estado de decisión 274 para determinar si hay más caracteres qué leer de cualquier secuencia. Si no hay más caracteres para leer, entonces el proceso 250 se mueve a un estado 276 en donde se exhibe el nivel de homología entre las primera y segunda secuencias al usuario. El nivel de homología se determina mediante calcular la proporción de caracteres entre las secuencias que fueron las mismas del número total de secuencias en la primera secuencia. Por consiguiente, si cada carácter de la primera secuencia de 100 nucleótidos se alinea con cada carácter de una segunda secuencia, el nivel de homología sería del 100%.

Alternativamente, el programa de computador puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia según es provista en la presente para determinar si las secuencias difieren en una o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de los nucleótidos o residuos de aminoácidos insertados, suprimidos, o sustituidos con respecto a la secuencia ya sea de referencia o una secuencia según es provista en la presente . El programa de computador puede ser un programa que determine si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia según es provista en la presente, o, si una secuencia según es provista en la presente comprende un SNP de una secuencia conocida. Por consiguiente, en algunos aspectos, el programa de computador es un programa que identifica los SNPs . El método se puede llevar mediante los sistemas de cómputo descritos anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método se puede llevar a cabo leyendo una secuencia según es provista en la presente y las secuencias de referencia a través del uso del programa de computador e identificando las diferencias con el programa de computador .

En otros aspectos, el sistema basado en computador comprende un identificador para identificar características dentro de un ácido nucleico o polipéptido según son provistos en la presente. Un "identificador" se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características dentro de una secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifique un marco de lectura abierta (ORF) en una secuencia de ácidos nucleicos. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 empieza en un estado de inicio 302, y luego se mueve hasta un estado 304, en donde una primera secuencia que se vaya a verificar para determinar sus características se almacena en una memoria 115 en el sistema de cómputo 100. Entonces el proceso 300 se mueve a un estado 306 en donde se abre una base de datos de características de secuencias. Tal una base de datos incluiría una lista de atributos de cada característica junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser "Codón de Inicio", y el atributo sería "ATG" . Otro ejemplo sería el nombre de característica "Cuadro TAATAA" y el atributo de característica sería "TAATAA" . Un ejemplo de tal una base de datos es producido por el University of isconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, las características pueden ser motivos de polipéptidos estructurales, tales como hélices alfa, hojas beta, o motivos de polipéptido funcionales tales como sitios activos enzimáticos, motivos de hélice-vuelta-hélice, u otros motivos conocidos por los técnicos en la materia. Una vez que se abre la base de datos de características en el estado 306, el proceso 300 se mueve a un estado 308 en donde se lee la primera característica a partir de la base de datos. Entonces se hace una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia en un estado 310. Luego se hace una determinación en un estado de decisión 316 de si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 se mueve a un estado 318 en donde se exhibe el nombre de la característica encontrada para el usuario. Luego el proceso 300 se mueve a un estado de decisión 320 en donde se hace una determinación de si existen características para mover en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300. lee la siguiente característica de la secuencia en un estado 326, y cicla de regreso hasta el estado 310, en donde se compara el atributo de la siguiente característica contra la primera secuencia. Si el atributo de la característica no se encuentra en la primera secuencia en el estado de decisión 316, el proceso 300 se mueve directamente al estado de decisión 320 con el objeto de determinar si existen más características en la base de datos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un programa de computador que identifica marcos de lectura abierta (ORFs) .

Una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos según es provista en la presente se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como MICROSOFTWORD o WORDPERFECT o como un archivo ASCII en . una variedad de programas de bases de datos familiares para los técnicos en la materia, tales como DB2, SYBASE, u ORACLE. Además, se pueden utilizar muchos programas de computador y bases de datos como algoritmos de comparación de secuencias, identificado-res, o fuentes de secuencias de nucleótidos o secuencias de polipéptidos de referencia para compararse con una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente. Los programas y bases de datos pueden comprender: ACPATTERN (EMBL) , DISCOVERY-BASE (Molecular Applications Group) , GENEMINE (Molecular Applications Group) , LOOK (Molecular Applications Group) , MACLOOK (Molecular Applications Group) , BLAST y BLAST2 (NCBI) , BLASTN y BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci . 6:237-245, 1990), CATALYST (Molecular Simulations Inc.), CATALYST/SHAPE (Molecular Simulations Inc.) , CERIUS2.DBACCESS (Molecular Simulations Inc.) , HYPOGEN (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), DISCOVER (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.) , FELIX (Molecular Simulations Inc.) , DELPHI, (Molecular Simulations Inc.), QUANTEMM, (Molecular Simulations Inc.) , HOMOLOGY (Molecular Simulations Inc.) , MODELER (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), GENE EXPLORER (Molecular Simulations Inc.) , SEQFOLD (Molecular Simulations Inc.) , la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos Derwent 1 s World Drug Index, la base de datos BioByteMasterFile, la base de datos Genbank, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos serían aparentes para un técnico en la materia, dada la presente divulgación.

Motivos que se pueden detectar utilizando los programas anteriores incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-vuelta-hélice, sitios de glicosila-ción, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y hélices beta, secuencias de señales que codifiquen péptidos de señales que dirijan la secreción de proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de transcripción, tales como horneo-cuadros, estiramientos ácidos, sitios activos enzimáticos, sitios de ligadura de sustrato, y sitios de disociación enzimática. Hibridación de Ácidos Nucleicos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinan-tes que se hibridan bajo condiciones severas a un ácido nucleico provisto en la presente, v.gr., una secuencia ejemplar provista en la presente, v.gr., una secuencia como se señala en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o la SEQ ID NO:l modificada para codificar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones base descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o el equivalente de las mismas, y sub-secuencias y secuencias complementarias de las mismas, o un ácido nucleico que codifique un polipéptido según es provisto en la presente. Las condiciones severas pueden ser condiciones altamente severas, condiciones de media severidad, o condiciones de baja severidad, incluyendo las condiciones de severidad alta y reducida descritas en la presente .

"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas tal que se pueda identificar una secuencia particular de interés inclusive en las muestras en donde esté presente en bajas concentraciones. Condiciones severas se pueden definir mediante, por ejemplo, las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de pre-hibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la severidad se puede incrementar mediante reducir la concentración de sal, incrementar la concentración de formamida, o elevar la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe con detalle más adelante. En aspectos alternativos, ácidos nucleicos según son provistos en la presente se definen por su capacidad para hibridarse bajo diferentes condiciones de severidad (v.gr., alta, media, y baja), como se señala en la presente .

En formas de realización alternativas, ácidos nucleicos según son provistos en la presente según se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones severas pueden ser de entre aproximadamente 5 residuos y la longitud completa del ácido nucleico según es provisto en la presente; v.gr., pueden ser de cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000 o más residuos de longitud. También se incluyen ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa. Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles como, v.gr., sondas de hibridación, sondas de marcado, sondas de oligonucleótidos de PCR, ARNi, péptidos anti-sentido o secuencias que codifican péptidos de ligadura a anticuerpos (epítopos) , motivos, sitios activos, y similares.

En un aspecto, ácidos nucleicos según son provistos en la presente se definen por su capacidad para hibridarse bajo alta severidad, que comprende condiciones de aproximadamente 50% de formamida a aproximadamente 37°C a 42°C. En un aspecto, ácidos nucleicos según son provistos en la presente se definen por su capacidad para hibridarse bajo severidad reducida que comprende condiciones de aproximadamente 35% a 25% de formamida a aproximadamente 30°C a 35°C.

Alternativamente, ácidos nucleicos según son provistos en la presente se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta severidad que comprenden a 42°C en 50% de formamida, SSPE 5X, SDS al 0.3%, y un ácido nucleico de bloqueo de secuencia repetitivo, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (v.gr., 200 ug/ml de ADN de esperma de salmón desgarrado y desnaturalizado) . En un aspecto, ácidos nucleicos según son provistos en la presente se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de severidad reducida que comprenden 35% de formamida a una temperatura reducida de 35°C.

Enseguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6x, SDS al 0.5%, a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" por encima de 25% de formamida, y como condiciones "bajas" por debajo de 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderada" es cuando la hibridación anterior se conduce a 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se conduce a 10% de formamida .

El rango de temperaturas correspondiente a un nivel particular de severidad se puede estrechar adicionalmente mediante calcular la proporción de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustar la temperatura de manera acorde. Ácidos nucleicos según son provistos en la presente también se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de severidad alta, media, y baja como se señala en Ausubel y Sambrook. Variaciones sobre los rangos y condiciones anteriores son bien conocidas en la materia. Las condiciones de hibridación se discuten adicionalmente, más adelante.

El procedimiento anterior se puede modificar para identificar ácidos nucleicos teniendo niveles decrecientes de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología decreciente con la sonda detecta-ble, se pueden emplear condiciones menos severas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede reducir en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un regulador de hibridación teniendo una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 2X, SDS al 0.5% a la temperatura de la hibridación. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" por encima de 50 °C y como condiciones "bajas" por debajo de 50°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce a 55 °C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se conduce a 45 °C.

Alternativamente, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como SSC 6X, conteniendo formamida a una temperatura de 42 °C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos de 5% desde 50% a 0%, para identificar clones que tengan niveles decrecientes de homología con la sonda. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6X, SDS al 0.5% a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" por encima del 25% de formamida, y como condiciones "bajas" por debajo del 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce a 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se conduce a 10% de formamida.

Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es critica - es la severidad de las condiciones de lavado la que señala las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance según es provisto en la presente incluyen, v.gr. : una concentración de sal de aproximadamente 0.02 molar a un pH de 7 y a una temperatura de cuando menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55 °C a aproximadamente 60°C; o una concentración de sal de NaCl aproximadamente 0.15 M a 72 °C por aproximadamente 15 minutos; o, una concentración de sal de aproximadamente SSC 0.2X a una temperatura de cuando menos 50 °C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C por aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución a una concentración de sal de aproximadamente SSC 2X conteniendo SDS al 0.1% a temperatura ambiente por 15 minutos y luego se lava dos veces con SSC 0. IX conteniendo SDS al 0.1% a 68°C por 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Ver Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del regulador SSC y condiciones equivalentes.

Estos métodos se pueden emplear para aislar los ácidos nucleicos según son provistos en la presente.

Sondas de Oligonucleótidos y Métodos para Utilizarlas En ciertas formas de realización, provistas en la presente son sondas de ácidos nucleicos para identificar ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido con actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la sonda comprende cuando menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico según es provisto en la presente. Alternativamente, una sonda según es provista en la presente puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más, o de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70 bases consecutivas de una secuencia como se señala en un ácido nucleico según es provisto en la presente. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante ligadura y/o hibridación. Las sondas se pueden utilizar en arreglos según son provistos en la presente, ver la descripción más adelante, incluyendo, v.gr., arreglos capilares. Las sondas según son provistas en la presente también se pueden utilizar para aislar otros ácidos nucleicos o polipéptidos .

Las sondas según son provistas en la presente se pueden utilizar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de tierra, contiene un organismo que tenga una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente (v.gr., un ácido nucleico que codifica hidrolasa) , o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En tales procedimientos, una muestra biológica potencialmente alojando al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico se obtiene, y ácidos nucleicos se obtienen a partir de la muestra. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda bajo condiciones que permiten que la sonda hibride específicamente a cualesquiera secuencias complementarias presentes en la muestra. Cuando sea necesario, condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a secuencias complementarias puede determinarse mediante colocar la sonda en contacto con las secuencias complementarias a partir de muestras conocidas por contener la secuencia complementaria, así como secuencias de control que no contengan a la secuencia complementaria. Condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del regulador de hibridación, la concentración de formamida del regulador de hibridación, o la temperatura de hibridación, puede variarse para identificar condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a ácidos nucleicos complementarios (ver la descripción sobre condiciones específicas de hibridación) .

Si la muestra contiene al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta la hibridación específica de la sonda. Hibridación se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable tal como un isótopo radioactivo, un tinte fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Muchos métodos para utilizar las sondas marcadas para detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los técnicos en la materia. Éstos incluyen Southern Blots, Northern Blots, procedimientos de hibridación de colonias, y blots de puntos. Protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook.

Alternativamente, se puede utilizar más de una sonda (cuando menos una de las cuales es capaz de hibridarse específicamente a cualesquiera secuencias complementarias que estén presentes en la muestra de ácido nucleico) en una reacción de amplificación para determinar si la muestra contiene un organismo que contenga una secuencia de ácido nucleico según es provista en la presente (v.gr., un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico) . En un aspecto, las sondas comprenden oligonu-cleótidos. En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción PCR. protocolos de PCR se describen en Ausubel y Sambrook (ver discusión sobre reacciones de amplificación) . En tales procedimientos, los ácidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas, se lleva a cabo la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto, de amplificación resultante. El producto de amplificación se puede detectar llevando a cabo electroforesis en gel sobre los productos de reacción y tiñendo el gel con un intercalador tal como bromuro de etidio. Alternativamente, una o más de las sondas se pueden marcar con un isótopo radioactivo y se puede detectar la presencia de un producto de amplificación radioactivo mediante auto-radiografía después de electroforesis en gel.

También se pueden utilizar sondas derivadas a partir de secuencias cercanas a los extremos 3 ' o 5 ' de una secuencia de ácidos nucleicos según es provista en la presente en los procedimientos de avance de cromosomas para identificar clones que contengan secuencias adicionales, v.gr., genómicas . Tales raétodos permiten el aislamiento de genes que codifiquen proteínas adicionales de interés a partir del organismo hospedero.

En un aspecto, secuencias de ácidos nucleicos según son provistas en la presente se utilizan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados asi identificados pueden ser ADNcs o ADNs genómicos a partir de organismos diferentes de aquél a partir del cual se aisló primeramente el ácido nucleico de la invención. En tales procedimientos, se pone en contacto una muestra de ácido nucleico con la sonda bajo condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a secuencias relacionadas. Luego se detecta hibridación de la sonda a ácidos nucleicos del organismo relacionado empleando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

En reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones utilizadas para alcanzar un nivel particular de severidad pueden variar, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por ejemplo, la longitud, grado de complementariedad, composición de secuencia de nucleótidos (v.gr. , contenido de GC contra AT) , y tipo de ácido nucleico (v.gr., ARN contra ADN) de las regiones de hibridación de ácidos nucleicos pueden considerarse al seleccionar condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, sobre un filtro. La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones de severidad baja, severidad moderada, o severidad alta. Como un ejemplo de la hibridación de ácidos nucleicos, primero se pre-hibrida una membrana polimérica que contenga ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45°C en una solución consistente en NaCl 0.9 M, NaH2P04 50 mM, pH 7.0, Na2EDTA 5.0 mM, SDS al 0.5%, Denhardt 10X, y 0.5 mg/ml de ácido poli-riboadenílico . Entonces se agregan aproximadamente 2 x 107 cpm (actividad específica de 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonu-cleótido marcada en el extremo con 32P a la solución. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en SET IX (NaCl 150 mM, clorhidrato de Tris 20 mM, pH 7.8, Na2EDTA 1 mM) conteniendo SDS al 0.5%, seguido por un lavado de 30 minutos en SET IX fresco a una Tm 10°C para la sonda de oligonucleótido . Luego se expone la membrana a película auto-radiográfica para detección de señales de hibridación.

Mediante variar la severidad de las condiciones de hibridación empleadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNcs o ADNs genómicos, los cuales se hibriden a la sonda detectable, se pueden identificar y aislar ácidos nucleicos teniendo diferentes niveles de homología con la sonda. La severidad se puede variar mediante conducir la hibridación a diferentes temperaturas debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definidos) a la cual se híbrida 50% de la secuencia objetivo a una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy severas se seleccionan iguales a, o aproximadamente 5°C menores que, la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular utilizando las siguientes fórmulas ejemplares. Para sondas de entre 14 y 70 nucleótidos de longitud, la temperatura de fusión (Tm) se calcula utilizando la fórmula: Tm=81.5+16.6 (log [Na+] ) +0.41 (fracción G+C) - (600/N) , en donde N es la longitud de la sonda. Si la hibridación se lleva a cabo en una solución que contenga formamida, la temperatura de fusión se puede calcular utilizando la ecuación: Tm=81.5+16.6 (log [Na+] ) +0.41 ( fracción G+C) -(0.63% formamida) - (600/N) , en donde N es la longitud de la sonda. Pre-hibridación se puede llevar a cabo en SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5%, 100 \ig de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, o SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5%, 100 g de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, y formamida al 50%. Fórmulas para SSC y reactivo de Denhardt y otras soluciones se enlistan, v.gr., en Sambrook.

En un aspecto, hibridación se conduce mediante añadir la sonda detectable a las soluciones de pre-hibridación enlistadas anteriormente. Cuando la sonda comprenda ADN de doble cadena, se desnaturaliza antes de agregarse a la solución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la solución de hibridación durante un período de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride a ADNcs o ADNs genómicos que contengan secuen-cias complementarias para la misma u homologas a la misma. Para sondas de más de 200 nucleótidos de longitud, la hibridación se puede llevar a cabo de 15-25°C debajo de la Tm. Para sondas más cortas, tales como sondas de oligonucleotidos, la hibridación se puede conducir de 5-10°C debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridaciones en SSC 6X se conducen a aproximadamente 68 °C. En un aspecto, hibridaciones en soluciones que contengan formamida al 50% se conducen a aproximadamente 42 °C. Todas las hibridaciones anteriores se considerarían como bajo condiciones de alta severidad.

En un aspecto, en seguida de la hibridación, el filtro se lava para remover cualquier sonda detectable no específicamente enlazada. La severidad utilizada para lavar los filtros también se puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos siendo hibridados, la longitud de los ácidos nucleicos siendo hibridados, el grado de complementariedad, la composición de secuencia de nucleótidos (v.gr., contenido de GC contra AT) , y el tipo de ácido nucleico (v.gr., ARN contra ADN) . Ejemplos de los lavados en condiciones de severidad progresivamente más altas son como sigue: SSC 2X, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante 15 minutos (severidad baja); SSC 0.1X, SDS al 0.5% a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (severidad moderada); SSC 0.1X, SDS al 0.5% durante 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridación y 68°C (severidad alta) ; y NaCl 0.15M durante 15 minutos a 72°C (severidad muy alta). Se puede conducir un lavado de baja severidad final en SSC 0.1X a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden emplear para lavar los filtros. Un técnico en la materia sabría que existen numerosas recetas para lavados de diferente severidad.

Los ácidos nucleicos que se hayan hibridado a la sonda se pueden identificar mediante auto-radiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento anterior se puede modificar para identificar ácidos nucleicos que tengan niveles decrecientes de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología decreciente con la sonda detecta-ble, se pueden utilizar condiciones menos severas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede reducir en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un regulador de hibridación teniendo una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 2X, SDS al 0.5%, a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba de 50 °C, y como condiciones "bajas" debajo de 50°C. Un ejemplo de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce a 55°C. Un ejemplo de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se conduce a 45 °C.

Alternativamente, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como SSC 6X, que contengan formamida, a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos de 5% desde 50% hasta 0%, para identificar clones que tengan niveles decrecientes de homología con la sonda. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6X, SDS al 0.5% a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" por encima del 25% de formamida, y como condiciones "bajas" debajo del 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce con 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se conduce con 10% de formamida.

Estas sondas y métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para aislar, o identificar (v.gr., utilizando un arreglo) , ácidos nucleicos teniendo una secuencia con una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas , con una secuencia de ácido nucleico según es provista en la presente que comprenda cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, o más bases consecutivas de la misma, y las secuencias complementarias a la misma. La homología se puede medir utilizando un algoritmo de alineación, como se describe en la presente. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia de codificación que sea una variante alélica que se presente naturalmente de una de las secuencias de codificación descritas en la presente. Estas variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión, o adición de uno o más nucleótidos, al compararse con un ácido nucleico según es provisto en la presente.

Adicionalmente , las sondas y métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para aislar, o identificar (v.gr., utilizando un arreglo), ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan una identidad de secuencia (homología) de cuando menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97% , 98%, 99%, o mas , con un polipéptido según es provisto en la presente que comprenda cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 o más aminoácidos consecutivos de los mismos, como se determina utilizando un algoritmo de alineación de secuencias, v.gr., tal como el algoritmo FASTA versión 3.0t78, con los parámetros predeterminados, o un programa BLAST 2.2.2 con las configuraciones ejemplares según se señalan en la presente.

Inhibición de Expresión de Hidrolasas En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos complementarios para (v.gr., secuencias anti-sentido para) las secuencias de ácidos nucleicos según son provistas en la presente, v.gr., secuencias que codifican hidrolasa. Secuencias anti-sentido son capaces de inhibir el transporte, empalme, o transcripción de genes que codifican hidrolasa. La inhibición se puede efectuar a través de la dirección de ADN genómico o ARN mensajero. La inhibición se puede efectuar utilizando ADN, v.gr., una enzima inhibidora, o un ARN, v.gr., un ARNi de doble cadena, comprendiendo una secuencia según es provista en la presente. La transcripción o función del ácido nucleico dirigido se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o disociación. Provistos en la presente son conjuntos de inhibidores que comprenden oligonucleotidos capaces ligar al gen y/o mensaje de hidrolasa, en cualquier caso impidiendo o inhibiendo la producción o función de hidrolasa. La asociación puede ser a través de hibridación específica de secuencia. Otra clase útil de inhibidores incluye los oligonucleotidos que provocan la inactivación o disociación del mensaje de hidrolasa. El oligonucleótido puede tener actividad enzimática que provoque dicha disociación, tal como de ribozimas. El oligonucleótido se puede modificar químicamente, o se puede conjugar con una enzima o composición capaz de disociar el ácido nucleico complementario. Se puede clasificar un conjunto de muchos tales oligonucleotidos diferentes para buscar aquéllos con la actividad deseada.

Oligonucleótidos Anti -Sentido En ciertas formas de realización, provistos en la presente son oligonucleótidos anti-sentido capaces de ligar mensaje de hidrolasa el cual puede inhibir la actividad proteolí-tica mediante dirección al ARNm o del ADN genómico. Estrategias para diseñar oligonucleótidos anti-sentido están bien descritas en la literatura científica y de patentes, y el técnico en la materia puede diseñar tales oligonucleótidos de hidrolasa utilizando los reactivos novedosos según son provistos en la presente. Por ejemplo, los protocolos de avance de genes/mapeo de ARN para clasificar oligonucleótidos anti-sentido efectivos son bien conocidos en la materia; ver, v.gr., Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, describiendo un ensayo de mapeo de ARN, el cual se basa en las técnicas moleculares convencionales para proporcionar un método fácil y confiable para la selección de secuencias anti-sentido potentes. Ver también Smith (2000) E r. J. Pharm. Sci. 11:191-198.

En un aspecto, ácidos nucleicos que se presentan naturalmente recombinantemente generados, o, aislados, se utilizan como oligonucleótidos anti-sentido. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleótidos anti-sentido son de entre aproximadamente 5 y 100, aproximadamente 10 a 80, aproximadamente 15 a 60, y aproximadamente 18 a 40. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden ser ARN o ADN de una sola cadena o de doble cadena. La longitud óptima se puede determinar mediante clasificación de rutina. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar mediante clasificación de rutina. Una amplia variedad de nucleótidos y análogos de ácidos nucleicos que no se presentan naturalmente, sintéticos, se conocen los cuales pueden resolver este problema potencial. Por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) conteniendo estructuras base no iónicas, tales como las unidades de N- (2-aminoetil) -glicina se pueden utilizar. También se pueden utilizar oligonucleótidos anti-sentido teniendo enlaces de fosforotioato, como se describen en las publicaciones internacionales O 97/03211 y WO 96/39154; en Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics , ed. Agra al (Humana Press, Totowa, N. J., 1996) . Provistos en la presente son oligonucleótidos anti-sentido que tienen análogos de estructura base de ADN sintética, los cuales también pueden incluir ácidos nucleicos de fosforo-dioato, metil-fosfonato, fosforamidato, alquil-fosfotriéster, sulfamato, 31 - ioacetal , metilen (metil-imino) , 31 -N-carbamato, y morfolino-carbamato, como se describe anteriormente .

Se puede utilizar la metodología química de combinación para crear grandes números de oligonucleótidos que se puedan clasificar rápidamente para buscar oligonucleótidos específicos que tengan afinidades y especificidades de ligadura apropiadas hacia cualquier objetivo, tales como las secuencias de hidrolasa en sentido y anti-sentido según son provistas en la presente (ver, v.gr., Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584). Ribozimas Inhibidoras En ciertas formas de realización, provistas en la presente son ribozimas capaces de ligar mensaje de hidrolasa, el cual puede inhibir la actividad de hidrolasa dirigiéndose al ARNm. Estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia anti-sentido específica de hidrolasa para la dirección están bien descritas en la literatura científica y de patentes, y el técnico en la materia puede diseñar tales ribozimas utilizando los reactivos novedosos según son provistos en la presente. Las ribozimas actúan mediante ligadura a un ARN objetivo a través de la porción de ligadura del ARN objetivo de una ribozima que se mantiene en estrecha proximidad a una porción enzimática del ARN que disocia el ARN objetivo. Por consiguiente, la ribozima reconoce y se liga a un ARN objetivo a través de emparejamiento de bases complementarias, y una vez ligada al sitio correcto, actúa enzimáticamente para disociar e inactivar al ARN objetivo. La disociación de un ARN objetivo en tal manera destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada si se presenta la disociación en la secuencia de codificación. Después de que una ribozima se ha ligado y ha disociado su ARN objetivo, típicamente se libera de ese ARN y así puede ligarse y disociar nuevos objetivos repetidamente.

En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser ventajosa sobre otras tecnologías, tales como tecnología anti-sentido (en donde una molécula de ácido nucleico simplemente se liga con un objetivo de ácido nucleico para bloquear su transcripción, traducción, o asociación con otra molécula) , pues la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser más baja que aquélla de un oligonucleótido anti-sentido . Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente . Por ende, una sola molécula de ribozima es capaz de disociar muchas moléculas de ARN objetivo. Además, una ribozima típicamente es un inhibidor altamente específico, dependiendo la especificidad de inhibición no solamente del mecanismo de emparejamiento de bases de ligadura, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN al cual se liga. Es decir, la inhibición es causada por la disociación del objetivo de ARN y de esta manera la especificidad se define como la proporción del índice de disociación del ARN objetivo sobre el índice de disociación del ARN no objetivo. Este mecanismo de disociación depende de factores adicionales a los implicados en el emparejamiento de bases. Por consiguiente, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor que aquélla del oligonucleótido anti-sentido que se ligue al mismo sitio de ARN.

La molécula de ARN de ribozima enzimática. se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, pero también se puede formar en el motivo de horquilla, virus de hepatitis delta, intrón del grupo I, o ARN tipo ARNsaP (en asociación con una secuencia guía de ARN) . Ejemplos de tales motivos de cabeza de martillo son descritos por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos de horquilla por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, y Hampel (1990) iVuc. Acids Res. 18:299; motivo del virus de hepatitis delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; motivo de ARNsaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; e intrón del grupo I por Cech, patente US 4,987,071. La relación de estos motivos específicos no pretende ser limitante; los técnicos en la materia reconocerán que una molécula de ARN enzimática según es provista en la presente puede tener un sitio de ligadura de sustrato específico complementario con una o más de las regiones de ARN del gen objetivo, y tiene una secuencia de nucleótidos dentro o alrededor de ese sitio de ligadura de sustrato que imparte una actividad de disociación de ARN a la molécula .

Interferencia de ARN (ARNi) En ciertas formas de realización, provistas en la presente son moléculas inhibitorias de ARN, denominadas moléculas de "ARNi" , comprendiendo una secuencia de hidrolasa según es provista en la presente. La molécula de ARNi puede comprender una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) , v.gr., ARNsi y/o miARN. El ARNi puede inhibir la expresión de un gen o transcripción de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .

En un aspecto, la molécula de ARNi, v.gr., ARNsi y/o miARN, es de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, O 30 O más nucleótidOS dúplex de longitud. Aunque la invención no está limitada por algún mecanismo de acción particular, el ARNi puede entrar a una célula y provocar la degradación de un ARN de una sola cadena (ARNss) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNms endógenos. Cuando se expone una célula al ARN de doble cadena (ARNds) , se degrada selectivamente el ARNm a partir del gen homólogo mediante un proceso denominado como interferencia de ARN (ARNi) . Un posible mecanismo básico detrás del ARNi, es el rompimiento de un ARN de doble cadena (ARNds) concordando con una secuencia genética específica en pedazos cortos denominados ARN de interferencia corto, los cuales desencadenan la degradación del ARNm que concuerda con su secuencia.

En un aspecto, los ARNis según son provistos en la presente se utilizan en la terapia de silenciamiento de genes, ver, v.gr., Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para degradar selectivamente ARN utilizando los ARNis . El proceso se puede practicar in vitro, ex vivo, o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi de la invención se pueden utilizar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano, o un animal. Métodos para hacer y usar moléculas de ARNi para degradar selectivamente el ARN son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., las patentes US 6,506,559; 6,511,824; 6,515,109; 6,489,127.

Modificación de Ácidos Nucleicos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para generar variantes de los ácidos nucleicos, v.gr., aquellos que codifican una hidrolasa o un anticuerpo según son provistos en la presente. Estos métodos se pueden repetir o utilizar en diferentes combinaciones para generar hidrolasas o anticuerpos teniendo una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de aquélla de una hidrolasa o anticuerpo codificado por el ácido nucleico de plantilla. Estos métodos también se pueden repetir o utilizar en diferentes combinaciones, v.gr., para generar variaciones en expresión del gen/mensaje, traducción del mensaje, o estabilidad del mensaje. En otro aspecto, la composición genética de una célula se altera, v.gr., mediante la modificación de un gen homólogo ex vivo, seguida por su reinserción en la célula.

El término "variante" puede incluir polinucleótidos o polipéptidos según son provistos en la presente modificados en uno ó más pares de bases, codones, intrones, exones, o residuos de aminoácidos (respectivamente) y no obstante todavía retienen la actividad biológica de una hidrolasa según es provista en la presente. Variantes se pueden producir mediante cualquier número de medios, incluyendo métodos tales como, por ejemplo, PCR susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleó-tido, PCR de ensamble, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cartucho, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, GSSM, y cualquier combinación de las mismas. Técnicas para producir hidrolasas variantes que tengan actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que sea diferente de una hidrolasa de tipo silvestre, se incluyen en la presente.

Un ácido nucleico según es provisto en la presente se puede alterar por cualquier medio. Por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos , o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", ver, v.gr., la patente US 6,361,974. Los métodos para mutación aleatoria de genes son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., la patente US 5,830,696. Por ejemplo, se pueden utilizar mutágenos para mutar aleatoriamente un gen. Mutágenos incluyen, v.gr., irradiación de luz ultravioleta o gamma, o un mutágeno químico, v.gr., mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados , solos o en combinación, para inducir rompimientos del ADN susceptibles a reparación por recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina, o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores de nucleótidos, v.gr., nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Estos agentes se pueden agregar a una reacción PCR en lugar del precursor de nucleótido, mutando de esta manera la secuencia. También se pueden utilizar agentes intercaladores tales como proflavina, acriflavina, quinacrina, y similares.

Se puede emplear cualquier técnica en biología molecular, v.gr., mutagénesis de PCR aleatoria, ver, v.gr., Rice (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; o mutagénesis de múltiples cartuchos de combinación, ver, v.gr., Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196. Alternativamente, ácidos nucleicos, v.gr., genes, se pueden reensamblar después de fragmentación aleatoria o "estocástica" , ver, v.gr., las patentes US 6,291,242; 6,287,862; 6,287,861; 5,955,358; 5,830,721; 5,824,514; 5,811,238; 5,605,793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones, o supresiones mediante PCR susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cartucho, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR o GeneReassembly) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de estos y otros métodos.

Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursiva que se pueden incorporar en los métodos según son provistos en la presente: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" t ture Biotechnology 17 : 793-797 ; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinión in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94 : 4504 -4509 ; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceu-ticals and Vaccines" Current Opinión in Biotechnology 8 : 724-733 ; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarles through display on a lac repressor ' headpiece dimer'" Journal of Molecular Biology 255 : 373-386 ; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" En: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publisher, Nueva York, pp. 447-457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial múltiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270:1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/'Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.

Métodos de mutación para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254 (2) : 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds . , Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol . 154, 367-382; y Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specifici-ties" Science 242:240-245); mutagénesis dirigida al oligonucleó-tido (Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagénesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA fragments cloned into MI3 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zollery y Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagénesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucí. Acids Res. 13:8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucí. Acids Res. 13:8765-8787 (1985) ; Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 14:9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction ith restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucí. Acids Res. 16:803-814); mutagénesis utilizando ADN dúplex con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucí. Acids Res. 12:9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol . "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucí. Acids Res. 16:7207; y Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucí. Acids Res. 16:6987-6999).

Protocolos adicionales empleados en los métodos según son provistos en la presente incluyen reparación de mal emparejamiento puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagénesis utilizando cepas hospederas deficientes en reparación (Cárter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucí. Acids Res. 13:4431-4443; y Cárter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154:382-403), mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonu-cleotides to genérate large deletions" Nucí. Acids Res. 14:5115) , restricción-selección, y restricción-selección y restricción-piurificación (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317:415-423), mutagénesis mediante síntesis genética total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223:1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) " Nucí. Acids Res. 14:6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites" Gene. 34:315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ' shot-gun' gene synthesis" Nucí. Acids Res. 13:3305-3316), reparación de rompimiento de doble cadena (Mandecki (1986) ; Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinión in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181). Detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores se pueden encontrar en Methods in Enzymology, Volumen 154, que también describe controles útiles para la resolución de problemas con diferentes métodos de mutagénesis.

Protocolos adicionales utilizados en los métodos según son provistos en la presente incluyen los descritos en la patente US 5,605,793 a Stemmer (25 de febrero de 1997), "Methods for In Vitro Recombination" ; patente US 5,811,238 a Steemer et al. (22 de septiembre de 1998) , "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; patente US 5,830,721 a Stemmer et al. (3 de noviembre de 1998) , "DNA Mutagénesis by Random Fragmentation and Reassembly" ; patente US 5,834,252 a Stemmer et al. (10 de noviembre de 1998), "End-Complementary Polymerase Reaction"; patente US 5,837,458 a Minshull et al. (17 de noviembre de 1998) , "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Enginee-ring" ; WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagénesis by Random Fragmentation and Reassembly"; WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz, "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; WO 97/20078 por Stemmer y Crameri, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination" ; WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering" ; WO 99/41402 por Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors" ; WO 99/41383 por Punnonen et al. "Antigen Library Immunization" ; WO 99/41369 por Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"; WO 99/41368 por Punnonen et al., "Optimiza-tion of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines" ; patente EP 752008 por Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reasserably" ; patente EP 0932670 por Stemmer, "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombina-tion" ; WO 99/23107 por Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling" ; WO 99/21979 por Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors" ; WO 98/31837 por del Cardayre et al., "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination" ; WO 98/27230 por Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering" ; WO 98/27230 por Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection" ; WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries" ; WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"; WO 98/42832 por Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers" ; WO 99/29902 por Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences" ; WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library" ; 98/41622 por Borchert et al., "Method for Construc-ting a Library Using DNA Shuffling" ; y WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination" .

Protocolos que se pueden utilizar (que proporcionan detalles con respecto a varios métodos generadores de diversidad) se describen, v.gr., en la solicitud de patente US 09/407,800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES", por Patten et al . , presentada el 28 de septiembre de 1999; "EVOLUTION OF HOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" , por del Cardayre et al., patente US 6,379,964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", por Crameri et al., patentes US 6,319,714; 6,368,861; 6,376,246; 6,423,542; 6,426,224, y PCT/US00/01203 ; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch et al., patente US 6,436,675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov et al., presentada el 18 de enero de 2000, (PCT/US00/01202) , y, v.gr., "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov et al., presentada el 18 de julio de 2000 (solicitud de patente US 09/618,579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero de 2000 (PCT/US00/01138) ; y "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, presentada el 6 de septiembre de 2000 (solicitud de patente US 09/656,549); y patente US 6,177,263 y 6,153,410.

Métodos no estocásticos o de "evolución dirigida" incluyen, v.gr. , mutagénesis de saturación de sitio de genes (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR o GeneReas-sembly) , o una combinación de los mismos se utilizan para modificar los ácidos nucleicos de la invención para generar hidrolasas con propiedades nuevas o alteradas (v.gr., actividad bajo condiciones altamente ácidas o alcalinas, altas temperaturas, y similares) . Polipéptidos codificados por ácidos nucleicos modificados se pueden clasificar para una actividad antes de probar la actividad proteolítica u otra. Se puede utilizar cualquier modalidad o protocolo de prueba, v.gr., utilizando una plataforma de arreglo capilar. Ver, v.gr., las patentes US 6,361,974; 6,280,926; 5,939,250.

Mutagénesis de Saturación o tecnología GSSM En un aspecto según es provisto en la presente, se utiliza modificación genética no estocástica, un "proceso de evolución dirigida" , para generar hidrolasas y anticuerpos con propiedades nuevas o alteradas. Variaciones de este método se han denominado como "mutagénesis de saturación de sitio genético", "mutagénesis de saturación de sitio" , "mutagénesis de saturación" , o simplemente "GSSM" . Se puede emplear en combinación con otros procesos de mutación. En un aspecto, provistos en la presente son métodos para hacer enzimas y anticuerpos usando tecnología GSSM, v.gr., según se describe en la preente y también en las patentes US 6,171,820; 6,579,258; 6,238,884.

En un aspecto, la tecnología GSSM comprende proporcionar un polinucleótido de plantilla y una pluralidad de oligonu-cleótidos, en donde cada oligonucleótido comprenda una secuencia homologa al polinucleótido de plantilla, dirigiendo de esta manera una secuencia específica del polinucleótido de plantilla, y una secuencia que sea una variante del gen homólogo; generar polinucleótidos de progenie que comprendan variaciones de secuencia no estocásticas , mediante replicar al polinucleótido de plantilla con los oligonucleótidos , generando de esta manera polinucleótidos que comprendan variaciones de secuencias genéticas homologas.

En un aspecto, se utilizan cebadores de codones conteniendo una secuencia N,N-G/T degenerada para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, tal que se genere un conjunto de polipéptidos de progenie en los cuales esté representado un rango completo de sustituciones de aminoácidos individuales en cada posición de aminoácido, v.gr., un residuo de aminoácido en un sitio activo enzimático o en un sitio de ligadura de ligando dirigido para ser modificado. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia N,N,G/T degenerada, y opcionalmente, una segunda secuencia homologa. Los productos de traducción de progenie corriente abajo a partir del uso de tales oligonucleótidos incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácido a lo largo del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia N, N, G/T incluye codones para los 20 aminoácidos. En un aspecto, un tal oligonucleótido degenerado (comprendido, v.gr., de un cartucho N,N,G/T degenerado) se utiliza para someter a cada codón original de una plantilla de polinucleótido progenitora a un rango completo de sustituciones de codones . En otro aspecto, se utilizan cuando menos dos cartuchos degenerados - ya sea en el mismo oligonucleótido o no, para someter a cuando menos dos codones originales de una plantilla de polinucleótido progenitor a un rango completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, puede haber más de una secuencia N, N, G/T contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T pueden estar directamente contiguas, o separadas por una o más secuencias de nucleótidos adicionales. En otro aspecto, se pueden utilizar oligonucleótidos que sirvan para introducir adiciones y supresiones, ya sea solos o en combinación con los codones conteniendo una secuencia N, , G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones, y/o sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, se hace mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguas utilizando un oligonucleótido que contenga tripletes de N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia (N,N,G/T)n degenerada. En otro aspecto, se utilizan cartuchos degenerados teniendo menos degeneración que la secuencia N, , G/ . Por ejemplo, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (v.gr., en un oligonucleótido) una secuencia triplete degenerada comprendida de solamente un N, en donde dicho N puede estar en la primera, segunda, o tercera posición del triplete. Se pueden utilizar cualesquiera otras bases, incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas, en las dos posiciones restantes del triplete. De una manera alternativa, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (v.gr., en un oligonucleótido) una secuencia triplete ?,?,? degenerada.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (v.gr., tripletes N,N,G/T) permite hacer una generación sistemática y fácil de un rango completo de posibles aminoácidos naturales (para un total de 20 aminoácidos) en tocas y cada una de las posiciones de aminoácido de un polipéptido (en aspectos alternativos, los métodos también pueden incluir la generación de menos que todas las posibles sustituciones por posición de residuo de aminoácido, o codón) . Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2,000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoácidos por posición X 100 posiciones de aminoácidos) . A través del uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contengan un triplete N, N, G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar para todos los 20 posibles aminoácidos naturales. Por consiguiente, en un recipiente de reacción en donde una secuencia de polinucleótido progenitor se someta a mutagénesis de saturación utilizando cuando menos un tal oligonucleótido, se generan 32 polinucleótidos de progenie distintos que codifican 20 polipéptidos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en mutagénesis dirigida al sitio conduce solamente a un producto de polipéptido de progenie por recipiente de reacción. Opcionalmente se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados en combinación con cebadores degenerados divulgados; por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona medios para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones puntuales conduciendo a cambios de aminoácidos correspondientes, y mutaciones puntuales que ocasionen la generación de codones de paro y la expresión correspondiente de fragmentos de polipéptidos .

En un aspecto, cada recipiente de reacción de mutagéne-sis de saturación contiene polinucleótidos que codifican cuando menos 20 moléculas del polipéptido de progenie (v.gr., hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tal que estén representados todos los 20 aminoácidos naturales en la una posición de aminoácido específica correspondiente a la posición del codón mutado en el polinucleótido progenitor (otros aspectos utilizan menos que las 20 combinaciones naturales) . Los polipéptidos de progenie degenerados 32 veces generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación se pueden someter a amplificación clonal (v.gr, clonados en un hospedero adecuado, v.gr., hospedero de E. coli, utilizando, v.gr., un vector de expresión) , y se someten a clasificación de expresión. Cuando se identifica un polipéptido de progenie individual mediante clasificación por exhibir un cambio favorable en propiedades (al compararse con el polipéptido progenitor, tal como selectividad incrementada para hidrólisis de ésteres de palmitato contra hidrólisis de ésteres de oleato) , se puede secuenciar para identificar la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en el mismo.

En un aspecto, después de mutar todas y cada una de las posiciones de aminoácido en un polipéptido progenitor utilizando mutagénesis de saturación como se divulga en la presente, se pueden identificar cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se pueden generar una o más moléculas de progenie nuevas que contengan una combinación de todas o parte de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si se identifican dos cambios de aminoácidos favorables específicos en cada una de tres posiciones de aminoácidos de un polipéptido, las permutaciones incluyen tres posibilidades en cada posición (ningún cambio del aminoácido original, y cada uno de dos cambios favorables) y tres posiciones. Por consiguiente, hay 3 x 3 x 3, o 27 posibilidades en total, incluyendo 7 que se examinaron previamente - 6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de tres posiciones) , y ningún cambio en cualquier posición.

En otro aspecto, se puede utilizar mutagénesis de saturación del sitio junto con otros medios estocásticos o no estocásticos para variar la secuencia, v.gr., reensamble de ligamiento sintético (ver más adelante) , mezcla, quimerización, recombinación, y otros procesos de mutación y agentes de mutación. Provistos en la presente son procesos de mutación, incluyendo mutagénesis de saturación, utilizados de una manera iterativa.

Reensamble de Ligamiento Sintético (SLR) En un aspecto, provistos en la presente son sistemas de modificación genética no estocásticos denominados "reensamble de ligamiento sintético" , o simplemente "SLR" , también conocido como tecnología "GeneReassembly" , un "proceso de evolución dirigida" , para generar polipéptidos, v.gr., enzimas (tales como hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) anticuerpos según son provistos en la presente, con propiedades nuevas o alteradas. SLR es un método para ligar fragmentos de oligonucleó-tidos entre sí de una manera no estocástica. Este método difiere de la mezcla estocástica de oligonucleótidos en que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no están mezclados, concatenados, o quimerizados aleatoriamente, sino que más bien se ensamblan de una manera no estocástica. Ver, v.gr., las patentes US 6,773,900; 6,740,506 6,713, 282; 6,635,449; 6,605,449; 6, 537, 776.

En un aspecto, SLR comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polinucleótido de plantilla, en donde el polinucleótido de plantilla comprende la secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleóti-dos de bloques de construcción, en donde los polinucleótidos de bloques de construcción se diseñan para reensamblarse cruzadamente con el polinucleótido de plantilla en una secuencia predeter-minada, y un polinucleótido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo y una secuencia homologa al polinucleótido de plantilla que flanquea a la secuencia variante; (c) combinar un polinucleótido de bloque de construcción con un polinucleótido de plantilla tal que el polinucleótido de bloque de construcción se reensamble cruzadamente con el polinucleótido de plantilla para generar polinucleó-tidos comprendiendo variaciones de secuencias genéticas homologas.

SLR no depende de la presencia de altos niveles de homología entre polinucleótidos a ser re-arreglados. Por consiguiente, este método se puede emplear para generar de una manera no estocástica bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 quimeras diferentes. SLR se puede utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de -LQiooo qUimeras de progenie diferentes. En un aspecto, provistos en la presente son métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se elige por diseño. Este método incluye los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos teniendo extremos ligables mutuamente compatibles servibles, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, tal que se logre un orden de ensamble global diseñado.

Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos a ser ensamblados se consideran como "servibles" para este tipo de ensamble ordenado si permiten que los bloques de construcción se acoplen en órdenes predeterminados. Por lo tanto, el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por el diseño de los extremos ligables. Si se va a utilizar más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el que se puedan acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos también se especifica por el orden secuencial de los pasos de ensamble. En un aspecto, las piezas de construcción templadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (v.gr., ligasa de ADN T4) , para lograr el enlace covalente de las piezas de construcción.

En un aspecto, el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos se obtiene analizando un conjunto de plantillas de secuencias de ácidos nucleicos progenitoras que sirvan como una base para producir un conjunto de progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos progenitoras sirven de esta manera como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos a ser mutados, v.gr. , quimerizados o mezclados. En un aspecto de este método, se alinean las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras con el objeto de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología, y están comprendidos de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación de preferencia son compartidos alternativamente por cuando menos dos de las plantillas progenitoras. De esta manera, los puntos de demarcación se pueden utilizar para delinear los límites de los bloques de construcción de oligonucleótidos a ser generados para re-arreglar los polinucleótidos progenitores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamble de las moléculas de progenie quiméricas finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (comprendida de cuando menos una base de nucleótido homologa) compartida por cuando menos dos secuencias de polinucleótidos progenitores. Alternativamente, un punto de demarcación puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos dos terceras partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En formas de realización alternativas, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por cuando menos tres cuartas partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser compartida por casi todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras.

En un aspecto, el proceso de reensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera exhaustiva con el objeto de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleótidos quiméricos de progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizadas. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia 5' a 3' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación es por diseño (o no estocástico) como se describe anteriormente. Provistos en la presente son métodos no estocásticos que reducen la posibilidad de productos secundarios indeseados .

En otro aspecto, el método de reensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera sistemática. Por ejemplo, el método se lleva a cabo con el objeto de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de progenie, con compartimientos que se puedan clasificar de una manera sistemática, v.gr., uno por uno. Provistos en la presente son métodos que comprenden el uso selectivo y juicioso de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseño en donde se hagan conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de los diferentes recipien-tes de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimien-to sistemático de examen y clasificación. Por consiguiente, estos métodos permiten que se examinen sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie en grupos más pequeños. Debido a su capacidad para llevar a cabo quimerizacio-nes de una manera que es altamente flexible pero exhaustiva y sistemática también, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie . Debido a la naturaleza no estocástica de los métodos de reensamble de ligamiento presentes, las moléculas de progenie generadas pueden comprender una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se elige por diseño. También se pueden utilizar los métodos de mutagénesis de saturación y de evolución dirigida optimizada, para generar diferentes especies moleculares de progenie.

En un aspecto, los métodos presentes proporcionan libertad de elección y control con respecto a la selección de puntos de demarcación, el tamaño y número de los bloques de construcción de ácidos nucleicos, y el tamaño y diseño de los acoplamientos . El requerimiento de homología intermolecular puede ser altamente relajado. De hecho, se pueden incluso elegir puntos de demarcación en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la ondulación de los codones, es decir, la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleótidos en los bloques de construcción de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente. Alternativamente, se puede alterar un codón tal que se altere la codificación de un aminoácido original. En un aspecto, sustituciones se pueden introducir en el bloque de construcción de ácido nucleico con el objeto de aumentar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares, y por lo tanto, permitir que se logre un mayor número de acoplamientos entre los bloques de construcción, lo cual a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas de progenie .

En otro aspecto, la naturaleza sintética del paso en el que se generan los bloques de construcción permite el diseño y la introducción de nucleótidos (v.gr., uno o más nucleótidos, los cuales pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias regulatorias) que posteriormente pueden ser removidas opcional-mente en un proceso in vitro (v.gr., mediante mutagénesis) , o en un proceso in vivo (v.gr., mediante utilizar la capacidad de empalme de genes de un organismo hospedero) . Se aprecia que, en muchos casos, también puede ser deseable la introducción de estos nucleótidos por muchas otras razones además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación servible.

En un aspecto, se utiliza un bloque de construcción de ácido nucleico para introducir un intrón. Por consiguiente, se introducen intrones funcionales en un gen hecho por el hombre fabricado de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Los intrones artificialmente introducidos pueden ser funcionales en una célula hospedera para el empalme de genes, de una manera muy parecida a la forma en que los intrones que se presentan naturalmente sirven funcionalmente en el empalme de genes.

Sistema de Evolución Dirigida Optimizada En ciertas formas de realización, provistos en la presente son sistemas de modificación genética no estocásticos denominados "sistema de evolución dirigida optimizada" para generar hidrolasas y anticuerpos con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se dirige al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de los ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada está significativamente enriquecida para secuencias que tienen un número predeterminado de eventos cruzados.

Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia de una variante progenitora a otra variante progenitora. Tal un punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidos de dos progenitores para formar una sola secuencia. Este método permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos tal que se enriquezca la población quimérica final de secuencias para el número seleccionado de eventos cruzados. Esto proporciona más control sobre la selección de las variantes quiméricas que tengan un número predeterminado de eventos cruzados .

Además, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio variante de proteína en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generaban, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, sería extremadamente difícil probar este número tan alto de variantes quiméricas para una actividad particular. Más aún, una porción significativa de la población de progenie tendría un número muy alto de eventos cruzados lo cual resultaría en proteínas que serían menos probables a tener mayores niveles de una actividad particular. Mediante utilizar estos métodos, se puede enriquecer la población de moléculas quiméricas para aquellas variantes que tienen un número particular de eventos cruzados. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas elegidas para análisis adicional más probablemente tiene, por ejemplo, sólo tres eventos cruzados. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número predeterminado de eventos cruzados, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido a partir de los polinucleótidos progenitores originales podría ser responsable de afectar un rasgo particular.

Un método para crear una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. En formas de realización alternativas, cada oligonucleótido incluye una región única de traslape tal que mezclar los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Protocolos alternativos para practicar estos métodos según son provistos en la presente se pueden encontrar en las patentes US 6,773,900; 6,740,506; 6,713,282; 6,635,449; 6,605,449; 6,537,776; 6,361,974.

El número de oligonucleótidos generados para cada variante progenitora lleve una relación con el número total de cruces resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se podrían proporcionar tres variantes de secuencias de nucleótidos progenitoras para sufrir una reacción de ligamiento para encontrar una variante quimérica teniendo, por ejemplo, una mayor actividad a alta temperatura. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleótidos correspondientes a cada una de las porciones de cada variante progenitora. De manera acorde, durante el proceso de reensamble de ligamiento podría haber hasta 50 eventos cruzados dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contenga oligonucleótidos a partir de cada variante progenitora en orden alternado es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligamiento en la misma cantidad molar, es probable que en algunas posiciones los oligonucleótidos a partir del mismo polinucleótido progenitor se liguen juntos entre sí y por lo tanto no resulten en un evento cruzado. Si se mantiene constante la concentración de cada oligonucléotido a partir de cada progenitor durante cualquier paso de ligamiento en este ejemplo, hay 1/3 de oportunidad (asumiendo tres progenitores) de que un oligonucleótido a partir de la misma variante progenitora se ligue dentro de la secuencia quimérica y no produzca cruce .

De manera acorde, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de eventos cruzados que tienen probabilidades de presentarse durante cada paso en una reacción de ligamiento dado un número establecido de variantes progenitoras, un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada paso en la reacción de ligamiento. Más adelante se describen las estadísticas y matemáticas detrás de la determinación de la PDF. Mediante utilizar estos métodos, se puede calcular tal una función de densidad de probabilidad, y de esta manera enriquecer la población de progenie quimérica para un número predeterminado de eventos cruzados resultantes de una reacción de ligamiento particular. Más aún, se puede predeterminar un número objetivo de eventos cruzados, y luego se programa el sistema para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido progenitor durante cada paso en la reacción de ligamiento para resultar en una función de densidad de probabilidad que se centre en un número predeterminado de eventos cruzados. Estos métodos se refieren al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifica un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece significativamente para secuencias que tienen un número predeterminado de eventos cruzados . Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia a partir de una variante progenitora a otra variante progenitora. Tal un punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre si los oligonucleótidos a partir de dos progenitores para formar una sola secuencia. El método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos tal que se enriquezca la población quimérica final de secuencias en el número elegido de eventos cruzados . Esto proporciona más control sobre la elección de variantes quiméricas teniendo un número predeterminado de eventos cruzados .

Determinación de Eventos Cruzados Aspectos según son provistos en la presente incluyen un sistema y software que reciben una función de densidad de probabilidad (PDF) de cruce deseada, el número de genes progenitores a ser reensamblados, y el número de fragmentos en el reensamble como entradas. La salida de este programa es una "PDF de fragmento" que se puede utilizar para determinar una receta para producir genes reensamblados, y la PDF de cruce estimada de estos genes. El procesamiento descrito en la presente se lleva a cabo alternativamente en MATLAB (The Mathworks, Natick, Massachu-setts, Estados Unidos) , un lenguaje de programación y un ambiente de desarrollo para computación técnica.

Procesos Iterativos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son procesos se pueden repetir iterativamente. Por ejemplo, se identifica un ácido nucleico (o el ácido nucleico) responsable de un fenotipo de hidrolasa o anticuerpo alterado, se vuelve a aislar, se modifica nuevamente, y se vuelve a probar por actividad. Este proceso se puede repetir de una manera iterativa hasta que se diseñe un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede diseñar una trayectoria anabólica o catabólica bioquímica entera en una célula, incluyendo actividad proteolítica .

De una manera similar, si se determina que un oligonu-cleótido particular no tiene efecto alguno sobre el rasgo deseado (v.gr., un nuevo fenotipo de hidrolasa), se puede remover como una variable mediante sintetizar oligonucleótidos progenitores más grandes que incluyan la secuencia a ser removida. Debido a que incorporar la secuencia dentro de una secuencia más grande impide cualquier evento cruzado, ya no habrá variación alguna de esta secuencia en los polinucleótidos de progenie. Esta práctica iterativa de determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado, y cuáles no están relacionados, permite hacer una exploración más eficiente de todas las variantes de proteína posible que podrían proporcionar un rasgo o actividad particular.

Mezcla In Vivo La mezcla in vivo de moléculas se usa en métodos según son provistos en la presente que proporcionan variantes de polipéptidos según son provistos en la presente, v.gr., anticuerpos, hidrolasas, y similares. La mezcla in vivo se puede llevar a cabo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la principal ruta natural hacia la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra: 1) el reconocimiento de homologías; 2) disociación de cadena, invasión de cadena, y pasos metabólicos que conducen a la producción de quiasma recombinante ; y finalmente 3) la resolución del quiasma en moléculas recombina-das discretas. La formación del quiasma requiere del reconocimiento de secuencias homologas.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para producir un polinucleótido híbrido a partir de cuando menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. En otras formas de realización, provistos en la presente son métodos utilizados para producir un polinucleótido híbrido mediante introducir cuando menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que compartan cuando menos una región de homología de secuencia parcial en una célula hospedera adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial promueven procesos que resultan en una reorganización de la secuencia produciendo un polinucleótido híbrido. En un aspecto, el término "polinucleótido híbrido" abarca cualquier secuencia de nucleótidos que resulte de un método según es provisto en la presente, y en una forma de realización contiene la secuencia a partir de cuando menos dos secuencias de polinucleótidos originales. Tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación intermolecular que promueven integración de secuencia entre las moléculas de ADN. Además, tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación reductiva intermolecular que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN.

Producción de Variantes de Secuencia En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para hacer variantes de secuencia de las secuencias de ácidos nucleicos e hidrolasa y anticuerpo según son provistas en la presente o para aislar hidrolasas utilizando los ácidos nucleicos y polipéptidos según son provistos en la presente. En ciertas formas de realización, provistas en la presente son variantes de un gen de hidrolasa según es provisto en la presente, las cuales se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, v.gr., métodos aleatorios o estocásticos , o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", como se describen anteriormente .

Provistos en la presente son métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido teniendo actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprendiendo los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla comprendiendo un ácido nucleico según es provisto en la presente; y (b) modificar, suprimir o añadir uno o mas nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el método puede además comprender expresar el ácido nucleico variante para generar una hidrolasa variante, v.gr., un polipéptido de lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa. Las modificaciones, adiciones o supresiones pueden introducirse por un método que comprende PCR susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cartucho, mutagénesis de ensamble recursiva, mutagénesis de ensambla exponencial, mutagénesis específica de sitio, Mutagéne-sis de Saturación de Sitio Genético (GSSM) , re-ensamble de ligamiento sintético (SLR o GeneReassembly) o una combinación de los mismos. En otro aspecto, las modificaciones, adiciones o supresiones se introducen por un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla conteniendo uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el método se puede repetir iterativamente hasta que una hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, teniendo una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de aquella de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla se produzca. En un aspecto, el polipéptido de hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, variante es termo-tolerante, y retiene alguna actividad después de exponerse a una temperatura elevada. El otro aspecto, el polipéptido de hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, variante tiene glicosilación incrementada según se compara con la hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, codificada por un ácido nucleico de plantilla. Alternativamente, el polipéptido de hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, variante tiene actividad de hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, bajo una alta temperatura, en donde la hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, codificada por el ácido nucleico de plantilla no está activa bajo la alta temperatura. En un aspecto, el método puede repetirse iterativamente hasta que una secuencia de codificación de hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, teniendo un uso de codón alterado de aquel del ácido nucleico de plantilla se produce. En otro aspecto, el método puede repetirse iterativamente hasta que un gen de hidrolasa, v.gr., gen de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, teniendo mayores o menores niveles de expresión de mensaje o estabilidad de aquellos del ácido nucleico de plantilla se produce. En otro aspecto, la formulación del producto de hidrolasa final, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, permite un incremento o modulación del desempeño de la hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa en el producto.

Las variantes aisladas pueden presentarse naturalmente. Las variantes también se pueden crear in vitro. Las variantes se pueden crear empleando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de exonucleasa III, y técnicas de clonación estándar. Alternativamente, tales variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear empleando procedimientos de síntesis o modificación química. Otros métodos para hacer variantes también son familiares para los técnicos en la materia. Éstos incluyen procedimientos en los cuales se modifican las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas a partir de aislados naturales para generar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan características que mejoren su valor en las aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Éstas diferencias de nucleótidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de los aislados naturales .

Por ejemplo, se pueden crear variantes utilizando PCR susceptible a error. En PCR susceptible a error, PCR se lleva a cabo bajo condiciones en donde la fidelidad de copiado de la polimerasa de ADN sea baja, de tal manera que se obtenga un alto índice de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. PCR susceptible a error se describe, v.gr., en Leung, D. W. et al., Technigue, 1:11-15,1989, y Caldwell, R. C. y Joyce G. F. , PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992. Dicho de una manera breve, en tales procedimientos, ácidos nucleicos a ser mutados se mezclan con los cebadores de PCR, regulador de reacción, MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq y una concentración apropiada de dNTPs para alcanzar un alto Indice de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 ficomoles de ácido nucleico a ser mutado, 30 picomoles de cada cebador de PCR, un regulador de reacción que comprenda KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH de 8.3) , y gelatina al 0.01%, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. PCR se puede llevar a cabo por 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 45°C durante 1 minuto, y 72 °C durante 1 minuto. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutados se clonan en un vector apropiado y las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutados se evalúan.

También se pueden crear variantes utilizando mutagéne-sis dirigida al oligonucleótido, para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis del oligonucleótido se describe, v.gr., en Reidhaar-Olson (1988) Science 241 : 53-57. Brevemente, en tales procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos de doble cadena que lleven una o más mutaciones a ser introducidas en el ADN clonado se sintetizan y se insertan en el ADN clonado a ser mutado. Clones conteniendo el ADN mutado se recuperan y las actividades de los polipéptidos que codifican se evalúan.

Otro método para generar variantes es PCR de ensamble. PCR de ensamble involucra el ensamble de un producto de PCR a partir de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Se presentan un gran número de reacciones PCR diferentes en paralelo en el mismo frasco, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. PCR de ensamble se describe, v.gr., en la patente US 5,965,408.

Todavía otro método para generar variantes, es mutagénesis de PCR sexual. En mutagénesis de PCR sexual, se presenta recombinación homologa forzada entre las moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes pero altamente relacionadas in vitro, como resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN con base en la homología de secuencias, seguida por fijación del cruce mediante extensión del cebador en una reacción PCR. Mutagénesis de PCR sexual se describe, v.gr., en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Dicho de una manera breve, en tales procedimientos una pluralidad de ácidos nucleicos que se vayan a recombinar se digieren con ADNsa para generar fragmentos que tengan un tamaño promedio de 50-200 nucleótidos. Fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y se vuelven a suspender en una mezcla de PCR. PCR se conduce bajo condiciones que faciliten la recombinación entre los fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, PCR se puede llevar a cabo volviendo a suspender los fragmentos purificados en una concentración de 10 a 30 ng/ml en una solución de 0.2 m de cada dNTP, MgCl2 2.2 mM, KCl 50 mM, Tris Hcl 10 mM, pH 9.0, y Tritón X-100 al 0.1%. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de mezcla de reacción y se lleva a cabo PCR empleando el siguiente régimen: 94 °C durante 60 segundos, 94 °C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos (de 30 a 45 veces), y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleóti-dos en las reacciones PCR. En otros aspectos, se puede utilizar el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN en un primer conjunto de reacciones PCR y se puede utilizar polimerasa Taq en un conjunto subsecuente de reacciones PCR. Secuencias recombinan-tes se aislan y las actividades de los polipéptidos que codifiquen se evalúan.

También se pueden crear variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés mediante propagar la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, la cual lleve mutaciones en una o más de las trayectorias de reparación de ADN. Estas cepas "imitadoras" tienen un índice de mutación aleatoria más alto que aquél de una progenitora de tipo silvestre. Propagar el ADN en una de estas cepas eventualmente generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Cepas mutadoras adecuadas para utilizarse para mutagénesis in vivo se describen, v.gr., en la publicación internacional WO 91/16427.

También se pueden generar variantes utilizando mutagénesis de cartucho. En la mutagénesis de cartucho, una pequeña región de una molécula de ADN de doble cadena es reemplazada con un "cartucho" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido con frecuencia contiene a la secuencia nativa completamente y/o parcialmente aleatorizada.

También se puede emplear mutagénesis de ensamble recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamble recursivo es un algoritmo para ingeniería de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir poblaciones diversas de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis de cartucho de combinación. La mutagénesis de ensamble recursivo se describe, v.gr., en Arkin (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815.

En algunos aspectos, se crean variantes utilizando mutagénesis de ensamble exponencial. Mutagénesis de ensamble exponencial es un proceso para generar bibliotecas de combinación con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conduzcan a las proteínas funcionales. Mutagénesis de ensamble exponencial se describe, v.gr., en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552. Mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describen, v.gr., en ArnoId (1993) Current Opinión in Biotechnology 4 :450-455.

En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando procedimientos de mezcla en donde se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos distintos, para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifiquen polipéptidos quiméricos, como se describe, v.gr., en las patentes US 5,965,408; 5,939,250.

Provistas en la presente son variantes de polipéptidos de la invención que comprenden secuencias en donde uno o más de los residuos de aminoácidos (v.gr., de un polipéptido ejemplar, v.gr., SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas de las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o los equivalentes de las mismas) son sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (v.gr., un residuo de aminoácido conservado) , y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Sustituciones conservadoras son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Por consiguiente, polipéptidos presentes incluyen aquéllos con sustituciones conservadoras de secuencias, v.gr., las secuencias ejemplares según son provistas en la presente (v.gr., SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, O SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas de las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o los equivalentes de las mismas) incluyendo, pero no limitándose a los siguientes reemplazos: reemplazos de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina, e isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleve un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que lleve un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina, tirosina, con otro residuo aromático. Otras variantes son aquéllas en donde uno o más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la invención incluyen un grupo sustituyente .

Otras variantes dentro del alcance según es provisto en la presente son aquéllas en donde el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido, por ejemplo polietileno glicol. Variantes adicionales dentro del alcance según es provisto en la presente son aquéllas en donde se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido, tales como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de pro-proteína o una secuencia que facilite purificación, enriquecimiento, o estabilización del polipéptido. En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados, y análogos de los polipéptidos según son provistos en la presente retienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos ejemplares, v.gr., una actividad proteolítica, como se describe en la presente. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado, o análogo incluye una pro-proteína, tal que la variante, fragmento, derivado, o análogo puede ser activado por la disociación de la porción de pro-proteína para producir un polipéptido activo.

Optimización de Codones para Alcanzar Altos Niveles de Expresión de Proteína en Células Hospederas En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican hidrolasa para modificar el uso de codones. En una forma de realización, provistos en la presente son métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una hidrolasa para aumentar o reducir su expresión en una célula hospedera, v.gr., una célula bacteriana, de insecto, de mamífero, de levadura, o de planta. Además provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican una hidrolasa modificada para aumentar su expresión en una célula hospedera, hidrolasa así modificada, y métodos para hacer las hidrolasas modificadas. El método comprende identificar un codón "no preferido" o uno "menos preferido" en ácido nucleico que codifica hidrolasa y reemplazar uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifique al mismo aminoácido que el codón reemplazado y cuando menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifique al mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes de la célula hospedera, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias de codificación en genes de la célula hospedera.

Células hospederas para expresar los ácidos nucleicos, cartuchos de expresión, y vectores según son provistos en la presente incluyen bacterias, levadura, hongos, células de plantas, células de insectos, y células de mamíferos. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos y polipéptidos alterados por codones hechos mediante los ácidos nucleicos alterados por codones. Células hospederas ejemplares incluyen bacterias gram-negativas, tales como Escherichia coli y Pseudo onas fluorescens; bacterias gram-positivas, tales como Lactobacillus gasseri, Lactocossus lactis, Lactococcus crémoris, Bacillus subtilis . Células hospederas ejemplares también incluyen organismos eucariotas, v.gr., varias levaduras, tales como Saccharomyces sp. , incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, y células y líneas celulares de mamífero, y células y líneas celulares de insecto. Otras células hospederas ejemplares incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Strepto yces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, células fúngicas, tales como Aspergillus, levadura tal como cualquier especie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomycees pombe, células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células de animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La selección de un hospedero apropiado está dentro de las habilidades de los técnicos en la materia. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos y polipépti-dos optimizados para expresión en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifique una hidrolasa aislada a partir de una célula bacteriana se modifican tal que el ácido nucleico se exprese de manera óptima en una célula bacteriana diferente de la bacteria a partir de la cual se derivó la hidrolasa, una levadura, un hongo, una célula de planta, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Métodos para optimizar los codones son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., la patente US 5,795,373; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69 :7250-7253. Ver también Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que describe optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39 : 15399-15409 , que describe optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, que describe optimización del uso de codones que afecta secreción en E. coli.

Animales No Humanos Transgénicos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (v.gr., una hidrolasa o un anticuerpo según son provistos en la presente) , un cartucho de expresión, un vector, o una célula transfectada o transformada según son provistos en la presente. Los animales no humanos transgénicos pueden ser, v.gr., cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas, y ratones, comprendiendo los ácidos nucleicos según son provistos en la presente. Estos animales se pueden utilizar, v.gr. , como modelos in vivo para estudiar actividad de hidrolasa, o como modelos para clasificar para agentes que cambian la actividad de hidrolasa in vivo. Las secuencias de codificación para los polipéptidos a ser expresados en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar como constitutivas, o bajo el control de factores reguladores de transcripción específicos de tejido, específicos de desarrollo, o inducibles. Animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar empleando cualquier método conocido en la materia; ver, v.gr. , las patentes US 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571, que describen la fabricación y uso de células y huevos transformados, y ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos, y vacas transgénicas . Ver también, v.gr., Pollock (1999) J. Inmuno1. Methods 231:147-157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Nat . Biotech-nol . 17:456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas. La patente US 6,211,428 describe la fabricación y uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente US 5,387,742 describe la inyección de secuencias de ADN recombinantes o sintéticas clonadas en huevos de ratón fertilizados, implantación de huevos inyectados en hembras pseudo-preñadas , y crecimiento hasta término de ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente US 6,187,992 describe la fabricación y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica la proteína precursora amiloide (APP) .

También se pueden utilizar "animales con eliminación genética" para practicar los métodos según son provistos en la presente. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados según son provistos en la presente comprenden un "animal con eliminación genética", v.gr., un "ratón con eliminación genética" diseñado para no expresar un gen endógeno, el cual es reemplazado con un gen que exprese una hidrolasa, o una proteína de fusión que comprenda una hidrolasa según es provista en la presente. Como se observa anteriormente, también se pueden generar eliminaciones genéticas funcionales utilizando secuencias anti-sentido según son provistas en la presente, v.gr. , moléculas de ARNi de doble cadena.

Plantas y Semillas Transgénicas En ciertas formas de realización, provistas en la presente son plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (v.gr., una hidrolasa o un anticuerpo según son provistos en la presente) , un cartucho o vector de expresión, o una célula transíectada o transformada según son provistos en la presente. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) . En una forma de realización, provistos en la presente son métodos para hacer y usar estas plantas y semillas transgénicas . La planta o célula de planta transgénica que exprese un polipéptido según es provisto en la presente se puede construir de acuerdo con cualquier método conocido en la materia. Ver, por ejemplo, la patente US 6,309,872.

Se pueden introducir ácidos nucleicos y construcciones de expresión según son provistos en la presente en una célula de planta por cualquier medio. Por ejemplo, ácidos nucleicos o construcciones de expresión se pueden introducir en el genoma de una planta hospedera deseada, o los ácidos nucleicos o construcciones de expresión pueden ser episomas . La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que se regule la producción de hidrolasa del hospedero mediante elementos de control de transcripción o de traducción endógenos . En un aspecto, provistas en la presente son "plantas con eliminación genética", en donde inserción de una secuencia genética mediante, v.gr., recombinación homologa, ha alterado la expresión del gen endógeno. Medios para generar plantas "con eliminación genética" son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., Strepp (1998) Proc Nati. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J. 7:359-365. Ver la discusión sobre plantas transgénicas, más adelante.

Los ácidos nucleicos según son provistos en la presente se pueden utilizar para conferir rasgos deseados a esencialmente cualquier planta, v.gr., a plantas productoras de semillas oleaginosas, incluyendo salvado de arroz, colza (cañóla), girasol, olivo, palma o soya, y similares, o a plantas productoras de glucosa o almidón, tales como maíz, papa, trigo, arroz, cebada, y similares. Ácidos nucleicos según son provistos en la presente se pueden utilizar para manipular trayectorias metabóli-cas de una planta para optimizar o alterar la expresión en el hospedero de una hidrolasa o un sustrato o producto de una hidrolasa, v.gr., un aceite, un lípido, tal como un mono-, di-, o triacilglicérido, y similares. Pueden cambiar las proporciones de lípidos, conversión de lípidos, y cambios en una planta. Esto puede facilitar el procesamiento industrial de una planta. Alternativamente, hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto no naturalmente producido por esa planta. Esto puede reducir los costos de producción o crear un producto novedoso.

En un aspecto, el primer paso en la producción de una planta transgénica involucra hacer una construcción de expresión para expresión en una célula de planta. Estas técnicas son bien conocidas en la materia. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia de codificación para facilitar el enlace eficiente de los ribosomas a ARNm y seleccionar las secuencias terminadoras de genes apropiadas . Un promotor constitutivo ejemplar es CaMV35S, a partir del virus de mosaico de coliflor, que en general resulta en un alto grado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a claves en el ambiente interno o externo de la planta. Un promotor inducible por luz ejemplar es el promotor a partir del gen cab, que codifica la proteína de enlace de clorofila a/b mayor.

En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr una mayor expresión en una célula de planta. Por ejemplo, es probable que una secuencia según es provista en a presente tenga un porcentaje más alto de pares de nucleótidos A-T, comparado con lo que se ve en una planta, algunas de las cuales prefieren pares de nucleótidos G-C. Por consiguiente, nucleótidos A-T en la secuencia de codificación pueden ser sustituidos con nucleótidos G-C, sin cambiar de una manera significativa la secuencia de aminoácidos para mejorar la producción del producto genético en células de plantas.

Se puede agregar un gen marcador seleccionable a la construcción genética con el objeto de identificar células o tejidos de plantas que hayan integrado con éxito el transgén. Esto puede ser necesario debido a que lograr incorporación y expresión de genes en células de plantas es un evento raro, que se presenta en solamente un pequeño porcentaje de los tejidos o células apuntados. Genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son tóxicos a plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente sobrevivirán las células de plantas que hayan integrado el gen marcador seleccionable cuando se cultiven en un medio que contenga el antibiótico o herbicida apropiado. Como para otros genes insertados, los genes marcadores también requieren de secuencias promotoras y de terminación para su función apropiada.

En un aspecto, el hacer plantas o semillas transgénicas comprende incorporar secuencias según son provistas en la presente, y opcionalmente genes marcadores en una construcción de expresión objetivo (v.gr., un plásmido, un fago), junto con la colocación del promotor y secuencias terminadoras . Esto puede involucrar transferir al gen modificado a la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, se puede introducir una construcción directamente al ADN genómico de la célula de planta empleando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células de plantas, o se pueden introducir las construcciones directamente al tejido de planta empleando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, ver, v.gr., Christou (1997) Plant Mol . Biol. 35:197-203; Pa lowski (1996) Mol. Biotechnol . 6:17-30; Klein (1987) Nature 327 :70-73 ; Takumi (1997) Genes Genet. Syst . 72:63-69, que describen el uso del bombardeo de partículas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) supra, que utiliza el bombardeo de partículas para introducir YACs en células de plantas. Por ejemplo, Rinehart (1997) supra, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. El aparato para acelerar las partículas se describe en la patente US 5,015,580; y el instrumento de aceleración de partículas comercialmente disponible BioRad (Biolistics) PDS-2000; ver también John, patente US 5,608,148; y Ellis, patente US 5,681,730, que describen la transformación de gimnospermas mediada por partículas.

En un aspecto, protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con un ácido nucleico, v.gr., una construcción de expresión. Aunque no es fácil la regeneración de la planta a partir de protoplastos con cereales, es posible la regeneración de la planta en legumbres utilizando embriogénesis somática a partir de callo derivado del protoplasto. Tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo empleando la técnica de pistola genética, en donde se recubren micro-proyectiles de tungsteno con ADN, disparados a 1/100 del tamaño de las células, los cuales llevan al ADN profundamente hacia adentro de las células y los organelos . Luego se induce al tejido transformado para regenerarse, usualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha tenido éxito en varias especies de cereales, incluyendo maíz y arroz. Ácidos nucleicos, v.gr., construcciones de expresión, también se pueden introducir a células de plantas utilizando virus recombinantes . Las células de plantas se pueden transformar utilizando vectores virales, tales como, v.gr., vectores derivados de virus de mosaico de tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), ver Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants" , Mol. Biotechnol. 5:209- Alternativamente, ácidos nucleicos, v.gr., una construcción de expresión, se pueden combinar con las regiones de flanqueo de ADN-T adecuadas, y se pueden introducir en un vector hospedero de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedero de Agrobac erium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y marcador adyacente hacia el ADN de la célula de planta cuando la célula sea infectada por la bacteria. Técnicas de transformación mediadas por Agrrojbacterium tumefaciens, incluyendo desarmado y uso de vectores binarios, están bien descritas en la literatura científica. Ver, v.gr., Horsch (1984) Science 233 : 496-498 ; Fraley (1983) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlín 1995) . El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano, así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor de tumor) . El plásmido Ti contiene una extensión de ADN denominado ADN-T (-20 kb de largo) que se transfiere a la célula de planta en el proceso de infección, y una serie de genes vir (de virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens solamente puede infectar una planta a través de heridas; cuando se hiere una raíz o tallo de planta desprende ciertas señales químicas, en respuesta a las cuales llegan a activarse los genes vir de A. tumefaciens y dirigen una serie de eventos necesarios para la transferencia del ADN-T a partir del plásmido Ti hasta el cromosoma de la planta. Luego el ADN-T entra a la célula de la planta a través de la herida. Una especulación es que el ADN-T espera hasta que se esté replicando o transcribiendo el ADN de la planta, y luego se inserta en el ADN de la planta expuesto. Con el objeto de utilizar A. turnefaciens como un vector de transgén, se tiene que remover la sección inductora de tumor del ADN-T, mientras que se retienen las regiones del borde del ADN-T y los genes vir. Entonces se inserta el transgén entre las regiones de borde del ADN-T, en donde se transfiere a la célula de planta y llega a integrarse en los cromosomas de la planta .

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para la transformación de plantas monocoti-ledóneas utilizando los ácidos nucleicos según son provistos en la presente, incluyendo cereales importantes, ver Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Ver también, v.gr., Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Nati Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra,- Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que describen la integración del ADN-T en el ADN genómico. Ver también D'Halluin, patente US 5,712,135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, o de otra planta monocoti-ledónea.

En un aspecto, el tercer paso puede involucrar la selección y regeneración de plantas enteras capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generación. Tales técnicas de regeneración se apoyan en la manipulación de ciertas fito-hormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, que se apoya típicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se haya introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. Regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callo de plantas, explantes, órganos, o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen en general en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys . 38:467-486. Con el fin de obtener plantas enteras a partir de tejidos transgénicos tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar bajo condiciones ambientales controladas, en una serie de medios que contengan nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que se generan plantas enteras y producen semillas, empieza la evaluación de la progenie.

Después de que se incorpora establemente el cartucho de expresión en las plantas transgénicas , se puede introducir en otras plantas mediante cruza sexual . Se puede emplear cualquiera de un número de técnicas de reproducción estándar, dependiendo de la especie que se vaya a cruzar. Dado que la expresión transgéni-ca de los ácidos nucleicos según son provistos en la presente conduce a cambios fenotípicos, plantas comprendiendo los ácidos nucleicos recombinantes según son provistos en la presente se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por consiguiente, la semilla según es provista en la presente se puede derivar a partir de una cruza entre dos plantas transgénicas según son provistas en la presente, o una cruza entre una planta según es provista en la presente y otra planta. Los efectos deseados (v.gr., expresión de los polipépti-dos según son provistos en la presente para producir una planta con contenido de lípidos o aceite incrementado y/o disminuido) se pueden mejorar cuando ambas plantas progenitoras expresen los polipéptidos según son provistos en la presente. Los efectos deseados se pueden pasar a las generaciones futuras de las plantas por medios de propagación convencionales.

Los ácidos nucleicos y polipéptidos según son provistos en la presente se expresan en o se insertan en cualquier planta o semilla. Plantas transgénicas según son provistas en la presente pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas . Ejemplos de plantas transgénicas monocotiledóneas según son provistas en la presente son pastos, tales como pasto de prados (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como festuca, lolio, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, v.gr., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz. Ejemplos de plantas transgénicas dicotiledóneas según son provistas en la presente son tabaco, legumbres, tales como lupinas, papa, remolacha, chícharo, frijol y semilla de soya, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana . Por consiguiente, las plantas y semillas transgénicas según son provistas en la presente incluyen un amplio rango de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicu , Cartha us, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisu , Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En formas de realización alternativas, los ácidos nucleicos según son provistos en la presente se expresan en plantas que contengan células de fibra, incluyendo, v.gr., algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra) , cedro del desierto, arbusto de creosota, gaulteria, balsa, ramie, kenaf, cáñamo, rosella, yute, sisal abacá, y lino. En formas de realización alternativas, las plantas transgénicas según son provistas en la presente pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo miembros de cualquier especie de Gossypium, tales como G. arboreum ; . G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.

En ciertas formas de realización, las plantas transgé-nicas presentes pueden usarse para producir grandes cantidades de los polipéptidos (v.gr., anticuerpos, hidrolasas) según son provistos en la presente. Por ejemplo, ver Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que produce la proteína beta-caseína de leche humana en plantas de papa transgénicas utilizando un promotor de sintasa de manopina bidireccional inducible por auxina (masl',2') con métodos de transformación de disco de hoja mediada por Agrojacterium tumefaciens) .

Empleando procedimientos conocidos, un técnico puede clasificar para plantas según son provistas en la presente mediante detectar el aumento o reducción del ARNm o proteína.del transgén en plantas transgénicas . Medios para detectar y cuantificar ARNms o proteínas son bien conocidos en la materia.

Provistos en la presente son ácidos grasos o derivados de ácidos grasos a partir de plantas transgénicas según son provistas en la presente, v.gr., plantas oleaginosas transgénicas. En un aspecto, se producen plantas oleaginosas transgénicas que comprenden cuando menos una hidrolasa según es provista en la presente. En un aspecto, la planta transgénica comprende un gen de hidrolasa operativamente enlazado a un promotor, permitiendo la expresión del gen ya sea en compartimientos celulares, extra-celulares, o de tejido, diferentes de aquéllos en donde se acumulan los lípidos de planta, o permitiendo inducción exógena de la hidrolasa. En un aspecto, se recolectan semillas y/o frutas que contienen los lípidos de las plantas, se trituran las semillas y/o frutas (si es necesario, después del tratamiento de inducción genética de hidrolasa (v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) ) , para poner en contacto los lípidos e hidrolasa según es provista en la presente contenidos en las semillas y/o frutas. La mezcla se puede dejar incubar para permitir hidrólisis enzimática de los lípidos del material molido mediante acción catalítica de la lipasa según es provista en la presente contenida en el material triturado. En un aspecto, los ácidos grasos formados por la hidrólisis son extraídos y/o se convierten con el objeto de obtener los derivados de ácidos grasos deseados .

Este proceso de hidrólisis enzimática según es provisto en la presente utiliza condiciones operativas suaves, y pueden ser a escala pequeña y usar instalaciones económicas . En este aspecto, la planta según es provista en la presente se induce para producir la hidrolasa para transformación de lípidos de planta. Empleando esta estrategia, se impide que la enzima entre en contacto con lípidos almacenados de planta, con el fin de evitar cualquier riesgo de hidrólisis prematura ( "auto-degradación de la planta") antes de cosechar. Las unidades de trituración e incubación pueden ser ligeras y de escala pequeña; muchas son conocidas en la industria agrícola y se pueden llevar a cabo en los sitios en donde se cosechen las plantas.

En un aspecto, las plantas transgénicas según son provistas en la presente se producen mediante la transformación de plantas oleaginosas naturales . Las plantas genéticamente transformadas según son provistas en la presente se reproducen entonces sexualmente con el fin de producir semillas transgénicas según son provistas en la presente. Estas semillas se pueden utilizar para obtener la progenie de la planta transgénica.

En un aspecto, el gen de hidrolasa se enlaza operativamente a un promotor inducible con el fin de prevenir cualquier contacto prematuro de hidrolasa y lípido de planta. Este promotor puede dirigir la expresión del gen en compartimientos diferentes de aquéllos en donde se acumulen los lipidos, o el promotor puede iniciar la expresión de la hidrolasa en un momento deseado mediante una inducción exógena.

Polipéptidos y Péptidos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (v.gr., cuando menos 50% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20, o la SEQ ID NO : 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) do todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16, o Tabla 23, o el equivalente de las mismas. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican polipéptidos teniendo una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20, o la SEQ ID NO: 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) do todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16, o Tabla 23, o el equivalente de las mismas.

La identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del polipéptido, o la identidad puede estar sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 O más residuos. Polipéptidos según son provistos en la presente también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos ejemplares. En un aspecto, provistos en la presente son polipéptidos que comprende solamente una sub-secuencia de una secuencia según es provista en la presente, sub-secuencias ejemplares pueden ser de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos. En aspectos alternativos, polipéptidos (péptidos, fragmentos) pueden variar en tamaño entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipéptido, v.gr., una enzima según es provista en la presente; tamaños ejemplares siendo de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos, v.gr., residuos contiguos de una hidrolasa ejemplar según es provista en la presente. Péptidos según son provistos en la presente pueden ser útiles, v.gr., como sondas marcadoras, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de hidrolasa.

Polipéptidos según son provistos en la presente también incluyen anticuerpos capaces de enlazarse a una hidrolasa según es provista en la presente.

Polipéptidos según son provistos en la presente también incluyen secuencias de aminoácidos que son "sustancialmente idénticas" a secuencias según son provistas en la presente, incluyendo secuencias que difieren de una secuencia de referencia por una o mas sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, particularmente cuando tal una sustitución ocurre en un sitio que no es el sitio activo de la molécula, ' y provisto que el polipéptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitución de aminoácidos conservadora, por ejemplo, sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (v.gr., sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina) . Uno o mas aminoácidos pueden ser suprimidos, por ejemplo, a partir de una hidrolasa, resultando en modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar significativamente su actividad biológica. Por ejemplo, aminoácidos terminales amino o carboxilo que no se requieren para actividad de hidrolasa se pueden remover.

"Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" pueden incluir un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína, o un fragmento, porción, o sub-unidad de cualquiera de los mismos, y moléculas que se presenten naturalmente o sintéticas .

Los términos "polipéptido" y "proteína" pueden incluir aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El término "polipéptido" también incluye fragmentos de péptidos y polipéptidos , motivos, y similares. El término también incluye polipéptidos glicosilados . Los péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente también incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" , como se describen con mayor detalle más adelante.

Los polipéptidos según son provistos en la presente incluyen hidrolasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos según son provistos en la presente incluyen proproteínas antes de la "maduración" o procesamiento de secuencias prepro, v.gr., mediante una enzima de procesamiento de pro-proteína, tal como una convertasa de proproteína para generar una proteína madura "activa" . Los polipéptidos según son provistos en la presente incluyen hidrolasas inactivas por otras razones, v.gr., antes de la "activación" mediante un evento de procesamiento post-traducción, v.gr., una acción de endo- o exo-peptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amida-ción, una glicosilación o una sulfatación, un evento de dimeriza-ción, y similares. Métodos para identificar secuencias de dominio "prepro" y secuencias de señales son bien conocidos en la materia; ver, v.gr., Van de Ven (1993), Crit. Rev. Oncog. 4 (2) : 115-136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la proteína se purifica a partir del espacio extra-celular, y se determina la secuencia de proteína N-terminal y se compara con la forma no procesada.

Los polipéptidos según son provistos en la presente incluyen todas las formas activas, incluyendo las sub-secuencias activas, v.gr., dominios catalíticos o sitios activos, de una enzima según son provistos en la presente. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son dominios catalíticos o sitios activos como se señalan mas adelante. En otras formas de realización, provistos en la presente son péptidos o polipéptidos comprendiendo o consistiendo en un dominio de sitio activo según se predice a través del uso de una base de datos tal como Pfam (que es una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y modelos de Markov ocultos que cubren muchas familias de proteínas comunes, The Pfam Protein Families Datábase, A.

Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, y E.L.L. Sonnharamer, Nucleic Acids Research, 30 (1) : 276-280 , 2002), o su equivalente .

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son polipéptidos con o sin una secuencia de señal y/o una secuencia prepro. En una forma de realización, provistos en la presente son polipéptidos con secuencias de señales y/o secuencias prepro heterólogas . La secuencia prepro (incluyendo una secuencia según es provista en la presente utilizada como un dominio prepro heterólogo) se puede localizar sobre el extremo terminal amino o terminal carboxi de la proteína. En otra forma de realización, provistas en la presente son secuencias de señales aisladas o recombinantes , secuencias prepro, y dominios catalíticos (v.gr., "sitios activos" ) comprendiendo o consistiendo de secuencias según son provistas en la presente. La secuencia de señal, dominios prepro y/o dominio catalítico según son provistos en la presente pueden ser parte de una proteína de fusión, v.gr., como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (Cds) , dominios prepro y secuencias de señales (Sps, v.gr., un péptido teniendo una secuencia que comprende/consiste de residuos terminales amino de un polipéptido según es provisto en la presente) . En ciertas formas de realización, provistas en la presente son secuencias de señal que comprenden un péptido que comprende/consiste de una secuencia según se señala en los residuos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, l a 21, 1 a 22, 1 a 23, l a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30, 1 a 31, l a 32, 1 a 33, l a 34, 1 a 35, l a 36, l a 37, 1 a 38, l a 39, l a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44, l a 45, 1 a 46, 1 a 47, 1 a 48, 1 a 49 o 1 a 50, de un polipéptido según es provisto en la presente.

Polipéptidos y péptidos según son provistos en la presente se pueden aislar a partir de fuentes naturales, ser sintéticos o ser polipéptidos recombinantemente generados. Péptidos y proteínas se pueden expresar de una manera recombinan-te in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente se pueden hacer y aislar empleando cualquier método conocido en la materia. Los polipéptidos y péptidos de la invención también se pueden sintetizar, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en la materia. Ver, v.gr., Carut ers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K. , Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, síntesis de péptidos se puede llevar a cabo empleando diferentes técnicas en fase sólida (ver, v.gr., Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13), y la síntesis automatizada se puede lograr, v.gr., utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante .

Los péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente también se pueden glicosilar. La glicosilación se puede agregar post-traducción ya sea químicamente o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en donde los últimos incorporan el uso de motivos de glicosilación conocidos, los cuales pueden ser nativos a la secuencia, o se pueden agregar como un péptido, o se pueden agregar en la secuencia de codificación del ácido nucleico. La glicosilación puede estar O-enlazada o N-enlazada.

Polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refieren a polipéptidos o proteínas producidos por técnicas de ADN recombi-nante, es decir, producidos a partir de células transformadas por construcción exógena de ADN que codifica al polipéptido o proteína deseados . Ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos, polipéptidos o proteínas "sintéticos" según son provistos en la presente incluyen aquellos preparados or cualquier síntesis química, v.gr., como se describe, más adelante.

"Fragmentos" como se usa en la presente son una porción de una proteína como se presenta en la naturaleza la cual puede existir en por lo menos dos diferentes conformaciones. Fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la proteína según se presenta en la naturaleza. "Fragmentos enzimáticamente activos" como se usa en la presente son una porción de una secuencia de aminoácidos (que codifica una proteína) la cual retiene por lo menos una actividad funcional de la proteína a la cual se refiere. "Sustancialmente la misma" significa que una secuencia de aminoácidos es mayormente, pero no por completo, la misma, pero retiene por lo menos una actividad funcional de la secuencia a la cual se refiere. En general, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente la misma" o "sustancialmente homologa" si son cuando menos alrededor de 85% idénticas. Fragmentos que tienen estructuras tridimensionales diferentes como la proteína tal como se presenta en la naturaleza también se incluyen. Un ejemplo de esto es una molécula "proforma", tal como una pro-proteína de baja actividad que puede modificarse por disociación para producir una enzima madura con actividad significativamente mayor.

Los péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" . Los términos "miméticas" y "peptidomiméticas" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructura-les y/o funcionales de los polipéptidos según son provistos en la presente. El mimético puede estar enteramente compuesto de análogos de aminoácidos no naturales, sintéticos, o, es una molécula quimérica de parcialmente aminoácidos peptídicos naturales y parcialmente análogos de aminoácidos no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustitu-ciones conservadoras de aminoácidos naturales, siempre que tales sustituciones no alteren de una manera sustancial la estructura y/o actividad del mimético. Como con los polipéptidos según son provistos en la presente los cuales son variantes conservadoras, experimentación de rutina determinará si un mimético está dentro del alcance según es provisto en la presente, es decir, que no se altere sustancialmente su estructura y/o función. Por consiguiente, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance según es provisto en la presente si tiene una actividad de hidrolasa.

Composiciones miméticas de polipéptidos según son provistos en la presente pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En el aspecto alternativo, las composiciones miméticas según son provistas en la presente incluyen uno o todos de los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes de los enlaces de amida naturales ("enlace peptídico" ) ; b) residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, v.gr., una vuelta beta, vuelta gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido según es provisto en la presente se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos estén unidos por medios químicos diferentes de enlaces peptídicos naturales. Residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, v.gr., glutaraldehído, ásteres de N-hidroxi-succinimida, maleimidas bifuncionales, N, 1 -diciclohexil-carbodiimida (DCC) , o ?,?' -diisopropilcarbodiimida (DIC) . Grupos de enlace que pueden ser una alternativa para los enlaces de amida tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, v.gr., cetometileno (v.gr., -C(=0)-CH2- para -C (=0) -NH- ) , aminometileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH20) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, v.gr., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol . 7, pp. 267-357, "Peptide Backbone Modifications" , Marcell Dekker, NY) .

Un polipéptido según es provisto en la presente también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente. Residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patente; unas cuantas composiciones no naturales ejemplares útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y los lineamientos se describen más adelante. Se pueden generar miméticos de aminoácidos aromáticos mediante reemplazar, v.gr., por D- o L-naftil-alanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2 -tienilalanina; D- o L-1,2,3, o 4-pireneilalanina; D- o L-3-tienilalanina; D- o L- (2-piridinil) -alanina; D- o L- (3 -piridinil) -alanina; D- o L- (2-pirazinil) -alanina; D- o L- (4-isopropil) -fenilglicina; D- (trifluorometil) -fenilglicina; D- (trifluorometil) -fenilalanina; D-p-fluorofenila-lanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxibifenilfenilalanina; D- o L-2 -indol (alquil) alaninas; y D- o L-alquilalani-ñas, en donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, isobutilo secundario, isopentilo, o un aminoácido no ácido, sustituidos o insustitui-dos . Anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, v.gr., anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo.

Se pueden generar miméticos de aminoácidos mediante sustitución, v.gr., por aminoácidos que no sean de carboxilato mientras que se mantenga una carga negativa; ( fosfono) alanina; treonina sulfatada. Grupos secundarios carboxilo (v.gr., aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar de una manera selectiva mediante su reacción con carbodiimidas (R 1 -N-C-N-R 1 ) , tales como, v.gr., l-ciclohexil-3 - (2-morfolinil- (4-etil) -carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia- , -dimetilpentil) carbodi-imida. Aspartilo o glutamilo también se pueden convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante su reacción con iones de amonio. Se pueden generar miméticos de aminoácidos básicos mediante sustitución con, v.gr., (además de lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino) -acético, o ácido (guanidino) alquil-acético, en donde alquilo es como se define anteriormente. Se puede sustituir el derivado nitrilo (v.gr., conteniendo la fracción CN en lugar de COOH) por asparagina o glutamina. Residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los residuos de aspartilo o glutamilo correspondientes . Se pueden generar miméticos de residuos de arginina mediante la reacción de arginilo con, v.gr. , uno o más reactivos convencionales, incluyendo, v.gr., fenilglio-xal, 2 , 3-butanodiona, 1, 2-ciclo-hexanodiona, o ninhidrina, alternativamente bajo condiciones alcalinas. Se pueden generar miméticos de residuos de tirosina mediante la reacción de tirosilo con, v.gr., compuestos de diazonio aromáticos o con tetranitrometano . Se pueden utilizar N-acetilimidazol y tetrani-trometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados de 3 -nitro, respectivamente. Se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de los residuos de cisteinilo con, v.gr., alfa-haloacetatos , tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y aminas correspondientes; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . También se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de residuos de cisteinilo con, v.gr., bromo-trifluoro-acetona, ácido alfa-bromo-beta- (5-imidazolil) propiónico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas , disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil-2-piridilo; p-cloromercuribenzoato ; 2 -cloromercuri-4 -nitrofenol ; o cloro-7-nitrobenzo-oxa-l, 3-diazola. Se pueden generar miméticos de lisina (y se pueden alterar residuos terminales amino) mediante la reacción de lisinilo con, v.gr., anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de residuos de lisina u otros residuos que contengan alfa-amino mediante su reacción con imidoésteres , tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencenosulfónico, O-metilisourea, 2 , 4 -pentanodio-na, y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar miméticos de metionina mediante la reacción con, v.gr., sulfóxido de metionina. Miméticos de prolina incluyen, v.gr., ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, 3- o 4-hidroxi prolina, deshidroprolina, 3- o 4 -metilprolina, o 3,3-dimetilprolina. Se pueden generar miméticos de residuos de histidina mediante la reacción de histidilo con, v.gr., procarbo-nato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo . Otros miméticos incluyen, v.gr., aquéllos generados mediante la hidroxilación de prolina y lisina; la fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo; metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina, e histidina; acetilación de la amina terminal N; metilación de residuos de amida de cadena principal o sustitución con N-metil-aminoácidos ; o amidación de grupos carboxilo terminales C.

Un residuo, v.gr., un aminoácido, de un polipéptido según es provisto en la presente también puede ser reemplazado por un aminoácido (o un residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por consiguiente, cualquier aminoácido que se presente naturalmente en la configuración L (que también puede ser referida como L o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede ser reemplazado con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, referido como el D-aminoácido, pero también puede ser referido como la forma R o S.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para modificar los polipéptidos según son provistos en la presente ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento post-traducción (v.gr., fosforilación, acilación, etc.), o mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Modificaciones se pueden presentar en cualquier parte en el polipéptido, incluyendo en la estructura base del péptido, las cadenas secundarias de aminoácidos, y las terminales amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo o diferentes grados en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol , ciclación reticulante, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxila-ción gamma, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxila-ción, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegila-ción, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos a proteína mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación. Ver, v.gr., Creighton, T.E., Proteins-Structure and Molecular Properties 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, editor, Academic Press, Nueva York, pp. 1-12 (1983) .

También se pueden emplear los métodos de síntesis química de péptidos en fase sólida para sintetizar los polipépti-dos o fragmentos de los mismos, según es provisto en la presente. Tal método se ha conocido en la materia desde principios de la década de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154, 1963) (Ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. Ed. , Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pp. 11-12)), y recientemente se ha empleado en kits de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals) . Tales kits de laboratorio comercialmente disponibles han empleado en general las enseñanzas de H. M. Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , USA, 81:3998 (1984) , y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "picos" , todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se utiliza tal un sistema, una placa de varillas o picos se invierte y se inserta en una segunda placa de pozos o cavidades correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los picos o varillas. Mediante la repetición de este paso del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las varillas y picos en las soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos hasta obtener los péptidos deseados. Además, está disponible un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC. Por ejemplo, el ensamble de un polipéptido o fragmento se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado Applied Biosystems, Inc., modelo 431A. Tal equipo proporciona un acceso fácil a los péptidos según son provistos en la presente, ya sea mediante síntesis directa, o mediante síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar empleando otras técnicas conocidas .

Enzimas En ciertas formas de realización, provistas en la presente son hidrolasas, v.gr. , lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , v.gr., proteínas comprendiendo cuando menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% , 64%, 65%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76% , 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, o completa (100%) , con un polipéptido según es provisto en la presente, v.gr. , un polipéptido ejemplar que tiene una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, O SEQ ID NO: 20 O SEQ ID NO : 2 teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas (varias) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o los equivalentes de las mismas, anticuerpos que las ligan, y métodos para hacerlas y usarlas. Los polipéptidos según son provistos en la presente pueden tener cualquier actividad de hidrolasa, v.gr., una actividad de lipasa, saturasas, palmitasa y/o estearatasa. En aspectos alternativos, una actividad de una enzima según es provista en la presente comprende hidrólisis o síntesis de lipidos o aceites. Las hidrolasas según son provistas en la presente pueden modificar aceites mediante hidrólisis, acidólisis, alcohólisis, glicerólisis , esterificación, trans-esterificación, y/o inter-esterificación, incluyendo reacciones de "migración forzada" .

En aspectos alternativos, las hidrolasas según son provistas en la presente pueden tener actividades modificadas o nuevas según se comparan con las hidrolasas ejemplares o las actividades descritas en la presente. Provistas en la presente son hidrolasas con y sin secuencias de señales, y las secuencias de señales mismas. Provistas en la presente son hidrolasas inmovilizadas , anticuerpos anti-hidrolasa, y fragmentos de los mismos. Provistas en la presente son proteínas para inhibir la actividad de hidrolasa, v.gr., anticuerpos que se enlazan con el sitio activo de hidrolasa. Provistos en la presente son homo-dímeros y hetero-complejos , v.gr., proteínas de fusión, hetero-dímeros, etc., que comprenden las hidrolasas según son provistas en la presente. Provistas en la presente son hidrolasas que tienen actividad sobre un amplio intervalo de altas y bajas temperaturas y pHs (v.gr. , condiciones acuosas acidas y básicas) .

En un aspecto, se utilizan una o más hidrolasas, v.gr. , lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente, para la síntesis bio-catalítica de lípidos estructurados, es decir, lípidos que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre la estructura base de glicerol, incluyendo alternativos de manteca de cacao, ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , 1, 3-diacil-glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) , y triacilglicéridos (TAGs) .

Provistos en la presente son métodos para generar enzimas que tienen una ?^/?-, alterada (más alta o más baja) . En un aspecto, se utiliza mutagénesis dirigida al sitio para crear enzimas hidrolasas adicionales con especificidades de sustrato alternativas. Esto se puede hacer, por ejemplo, volviendo a diseñar la región de ligadura de sustrato o el sitio activo de la enzima. En un aspecto, hidrolasas según son provistas en la presente son más estables a altas temperaturas, tales como 80°C a 85°C a 90°C a 95°C, comparadas con hidrolasas de organismos convencionales o moderados .

Varias proteínas según son provistas en la presente tienen una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, bajo diferentes condiciones. Provistos en la presente son métodos para hacer hidrolasas con diferente eficiencia catalítica y estabilidad hacia condiciones de temperatura, agentes oxidantes, y pH. Estos métodos pueden emplear, v.gr., las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede utilizar la evolución dirigida para producir hidrolasas con especificidades y estabilidad alternativas.

Las proteínas según son provistas en la presentes se utilizan en métodos que pueden identificar moduladores de hidrolasa, v.gr., activadores o inhibidores. Dicho de manera breve, se agregan muestras de prueba (v.gr., compuestos tales como miembros de bibliotecas de péptidos o de combinación, caldos, extractos, y similares) a ensayos de hidrolasa para determinar su capacidad para modular, v.gr., inhibir" o activar, disociación del sustrato. Estos inhibidores se pueden utilizar en la industria y en investigación para reducir o prevenir isomeri-zación indeseada. Moduladores encontrados empleando los métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para alterar (v.gr., reducir o aumentar) el espectro de actividad de una hidrolasa.

En un aspecto, provistos en la presente son métodos para descubrir hidrolasas utilizando los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos según son provistos en la presente. En un aspecto, se clasifican bibliotecas de fagos lambda para descubrimiento de hidrolasas a base de expresión. Provistas en la presente son bibliotecas de fagos lambda para uso en clasificación para permitir la detección de clones tóxicos; acceso mejorado al sustrato; necesidad reducida de diseñar un hospedero, sobrepasando el potencial de cualquier inclinación resultante de excisión de masa de la biblioteca; y, crecimiento más rápido a bajas densidades de clones. La clasificación de bibliotecas de fagos lambda puede ser en fase líquida o en fase sólida. Provistos en la presente son métodos para clasificar en fase líquida. Esto da una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; flexibilidad adicional del sustrato; más alta sensibilidad para clones débiles; y facilidad de automatización sobre clasificación en fase sólida.

En otras formas de realización, provistos en la presente son métodos de clasificación utilizando las proteínas y ácidos nucleicos según son provistos en la presente involucrando automatización robótica. Esto hace posible la ejecución de muchas miles de reacciones biocatalíticas y ensayos de clasificación en un corto período de tiempo, v.gr., por día, así como se asegura un alto nivel de precisión y reproducibilidad (ver discusión de arreglos, más adelante) . Como resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en un lapso de semanas.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son enzimas hidrolasas que son hidrolasas que no se presentan naturalmente, que tienen diferente actividad de hidrolasa, estabilidad, especificidad del sustrato, perfil de pH, y/o características de desempeño comparadas con la hidrolasa que no se presenta naturalmente. Estas hidrolasas tienen una secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza. Se pueden derivar mediante sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una hidrolasa precursora con aminoácidos diferentes. La hidrolasa precursora puede ser una hidrolasa que se presente naturalmente o una hidrolasa recombinante . En un aspecto, las variantes de hidrolasa abarcan la sustitución de cualquiera de los L-aminoácidos que se presentan naturalmente en las posiciones de residuos de aminoácidos designadas.

Secuencias de Señales, Dominios Prepro y Catalíticos de Hidrolasa En ciertas formas de realización, provistas en la presente son secuencias de señales (v.gr., péptidos de señales (SPs) ) , dominios prepro, y dominios catalíticos (CDs) . Los péptidos de señales, dominios prepro, y/o CDs según son provistos en la presente pueden ser péptidos aislados, sintéticos o recombinantes o pueden ser parte de una proteína de fusión, v.gr., como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs) , dominios prepro, y secuencias de señales (SPs, v.gr., un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste en, residuos terminales amino de un polipéptido según es provisto en la presente) . En ciertas formas de realización, provistas en la presente son secuencias de señales que comprenden/consisten en una secuencia como se señala en los residuos 1 a 12, 1 a 13 , l a 14, 1 a 15, 1 a 16, l a 17, 1 a 18, 1 a 19, l a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, 1 a 28, l 29, 1 a 30 o 1 a 31, 1 a 32, l a 33, 1 a 34, 1 a 35, l a 36, 1 a 37, l a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 (o un péptido más largo), de un polipéptido según es provisto en la presente. En una forma de realización, provistas en la presente son secuencias de señales aisladas, sintéticas o recombinantes que comprenden/consisten de una secuencia de señales según es provista en la presente derivada de otra enzima según es provista en la presente, u otro tipo de enzima o polipéptido.

Las secuencias de señales (SPs) , CDs, y/o secuencias prepro de hidrolasa según son provistas en la presente pueden ser péptidos aislados, o secuencias unidas a otra hidrolasa o a un polipéptido no de hidrolasa, v.gr., como una proteína de fusión (quimérica) . En ciertas formas de realización, provistos en la presente son polipéptidos que comprenden secuencias de señales de hidrolasa según son provistas en la presente. En un aspecto, polipéptidos que comprenden secuencias de señales SPs, CDs, y/o prepro de hidrolasa según son provistas en la presente comprenden secuencias heterólogas a hidrolasas según son provistas en la presente (v.gr., una proteína de fusión que comprende una SP, CD, y/o prepro según son provistas en la presente y secuencias de otra hidrolasa o una proteína no hidrolasa) . Provistas en la presente son hidrolasas según son provistas en la presente con secuencias SPs, CDs, y/o prepro heterólogas, v.gr., secuencias con una secuencia de señal de levadura. Una hidrolasa según es provista en la presente puede comprender una SP y/o prepro heteróloga en un vector, v.gr., un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) .

En un aspecto, secuencias SPs, CDs, y/o prepro según son provistas en la presente se identifican siguiendo identificación de polipéptidos de hidrolasa novedosos. Las trayectorias mediante las cuales se seleccionan las proteínas y se transportan hasta su localización celular apropiada con frecuencia son referidas como trayectorias de dirección de proteína. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de dirección es una secuencia de aminoácidos corta en la terminal amino de un polipéptido recién sintetizado denominado la secuencia de señal. Esta secuencia de señal dirige una proteína hasta su localización apropiada en la célula y se remueve durante el transporte o cuando la proteína llega a su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas, tienen una secuencia de señal terminal amino que las marca para translocali-zarse en el lumen del retículo endoplásmico . Las secuencias de señales pueden variar en longitud de 13 a 45 o más residuos de aminoácidos. Diferentes métodos de reconocimiento de secuencias de señales son conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, en un aspecto, los péptidos de señales de hidrolasa novedosos se identifican mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neuronal combinada que reconoce tanto péptidos de señales y sus sitios de disociación. (Nielsen y et al., "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites" . Protein Engineering, vol . 10, no. 1, pp. 1-6 (1997)).

Se debe entender que en algunos aspectos hidrolasas según son provistas en la presente pueden no tener SPs y/o secuencias prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) . En un aspecto, provistos en la presente son polipéptidos (v.gr., hidrolasas) que carecen de todo o parte de un SP, CD, y/o dominio prepro. En otro aspecto, provistos en la presente son ácidos nucleicos que codifican una secuencia de señal (SP) , un CD y/o prepro a partir de una hidrolasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una hidrolasa diferente, u opcionalmente , se puede desear una secuencia de señal (SP) y/o dominio prepro a partir de una proteína no de hidrolasa.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden secuencias de señales (SPs) , dominios prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) según son provistos en la presente y secuencias heterólogas. Las secuencias heterólogas son secuencias que naturalmente asociadas (v.gr., a una hidrolasa) con un SP, dominio prepro, y/o CD. La secuencia con la cual el SP, dominio prepro, y/o CD no están naturalmente asociados puede estar sobre el extremo terminal amino del SP, dominio prepro, y/o CD, extremo terminal carboxi, y/o sobre ambos extremos del SP y/o CD. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden (o que consisten en) un polipéptido que comprende una secuencia de señal (SP) , dominio prepro, y/o dominio catalítico (CD) según son provistos en la presente con la condición de que no esté asociado con cualquier secuencia con la cual esté naturalmente asociado (v.gr., secuencia de hidrolasa). Provistos en la presente son ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. Por consiguiente, en un aspecto, los ácidos nucleicos aislados o recombinantes según son provistos en la presente comprenden una secuencia de codificación para una secuencia de señal (SP) , dominio prepro, y/o dominio catalítico (CD) según son provistos en la presente y una secuencia heterólo-ga (es decir, una secuencia que no está naturalmente asociada con una secuencia de señal (SP) , dominio prepro, y/o dominio catalítico (CD) según son provistos en la presente) . La secuencia heteróloga puede estar sobre el extremo terminal 3 ' , el extremo terminal 5 ' , y/o sobre ambos extremos de la secuencia de codificación del SP, dominio prepro, y/o CD.

En ciertas formas de realización, provista en la presente es la fusión de sub-secuencias terminales N o terminales C de enzimas según son provistas en la presente (v.gr., secuencias de señales, secuencias prepro) con otros polipéptidos , proteínas activas o fragmentos de proteína. La producción de una enzima según es provista en la presente (v.gr., una hidrolasa, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) también se puede lograr mediante expresar la enzima como una proteína de fusión inactiva que posteriormente se activa mediante un evento de disociación proteolítica (utilizando ya sea una actividad de proteasa endógena o exógena, v.gr., tripsina) que resulte en la separación del socio de proteína de fusión y la enzima madura, v.gr. , hidrolasa según es provista en la presente. En un aspecto, la proteína de fusión según es provista en la presente se expresa a partir de una construcción de nucleótidos híbrida que codifica un solo marco de lectura abierta que contiene los siguientes elementos: la secuencia de nucleótidos para la proteína de fusión, una secuencia enlazadora (definida como una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos flexible que une a dos dominios de proteína menos flexibles) , sitio de reconocimiento de disociación de proteasa, y la secuencia de la enzima madura (v.gr., cualquier enzima según es provista en la presente, v.gr., una hidrolasa). En aspectos alternativos, la proteína de fusión puede comprender una secuencia de pectato liasa, una secuencia de xilanasa, una secuencia de fosfatasa de ácido fosfatídico, u otra secuencia, v.gr., una secuencia que previamente ha sido mostrada que se sobre-expresa en un sistema hospedero de interés. Se puede utilizar cualquier sistema hospedero (ver la descripción anterior) , por ejemplo, E. coli o Pichia pastoris . La configuración de las secuencias de nucleóti-dos en la construcción de nucleótidos quimérica se puede determinar basándose en los niveles de expresión de proteína alcanzados con cada construcción de fusión. Procediendo desde el extremo 5' de la construcción de nucleótidos hasta el extremo 3' primordial de la construcción, en un aspecto, la secuencia de nucleótidos se ensambla como sigue: secuencia de señal/proteína de fusión/secuencia enlazadora/sitio de reconocimiento de disociación de proteasa/enzima madura (v.gr., cualquier enzima según es provista en la presente, v.gr., una hidrolasa) , o secuencia de señal/secuencia pro/enzima madura/secuencia enlazadora/proteína de fusión. La expresión de enzima (v.gr., cualquier enzima según es provista en la presente, v.gr., una hidrolasa) como una proteína de fusión inactiva puede mejorar la expresión global de la secuencia de enzima, puede reducir cualquier toxicidad potencial asociada con la sobre-producción de enzima activa, y/o puede aumentar la vida de anaqueles de la enzima antes de utilizarse debido a que la enzima estaría inactiva hasta que se separe la proteina de fusión, v.gr., pectato liasa, de la enzima, v.gr., hidrolasa según es provista en la presente .

En una forma de realización, provistas en la presente son formulaciones específicas para la activación de una hidrolasa según es provista en la presente expresada como una proteína de fusión. En un aspecto, la activación de la actividad de hidrolasa inicialmente expresada como una proteína de fusión inactiva se logra utilizando una actividad proteolítica o potencialmente una actividad proteolítica en combinación con una peptidasa terminal amino o terminal carboxi (la peptidasa puede ser una enzima según es provista en la presente, u otra enzima) . Este evento de activación se puede lograr en una variedad de formas y en una variedad de puntos en el proceso de manufactura/almacenamiento, antes de aplicarse al desengomado de aceite. Procesos ejemplares según son provistos en la presente incluyen: disociación mediante una actividad endógena expresada por el hospedero de manufactura ante secreción de la construcción de fusión hacia el medio de fermentación; disociación mediante una actividad de proteasa endógena que se activa o entra en contacto con la construcción de fusión intracelularmente expresada después de la ruptura de las células hospederas; el paso de la construcción de fusión cruda o purificada sobre una columna de actividad de proteasa inmovilizada para lograr disociación y activación de enzima (v.gr., hidrolasa según es provista en la presente, v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) previo a formulación de enzima; tratamiento de la construcción de fusión cruda o purificada con una fuente soluble de actividad proteolítica; activación de una hidrolasa (v.gr., una hidrolasa según es provista en la presente) en la refinería de aceite utilizando una fuente soluble o insoluble de actividad proteolítica inmediatamente previo a uso en el proceso; y/o activación de la actividad de hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa según es provista en la presente) mediante circular continuamente la formulación de construcción de fusión a través de una columna de actividad de proteasa inmovilizada a temperatura reducida (v.gr., cualquiera entre aproximadamente 4°C y 20°C) . Este evento de activación se puede lograr previo a suministro al sitio de uso o puede ocurrir en sitio, en la refinería de aceite. Glicosilación Los péptidos y polipéptidos según son provistos en la presente (v.gr., hidrolasas, anticuerpos) también se pueden glicosilar, por ejemplo, en un aspecto, comprendiendo cuando menos un sitio de glicosilación, v.gr., una glicosilación N-enlazada u O-enlazada. En un aspecto, el polipéptido se puede glicosilar después de haberse expresado en P. pastoris o S. pombe. La glicosilación se puede agregar post-traducción ya. sea químicamente o mediante mecanismos bio-sintéticos celulares, en donde éstos últimos incorporan el uso de motivos de glicosilación conocidos, los cuales pueden ser nativos a la secuencia o se pueden agregar como un péptido o agregar en la secuencia de codificación del ácido nucleico.

Hidrolasas Híbridas y Bibliotecas de Péptidos En ciertas formas de realización, provistas en la presente son hidrolasas híbridas (v.gr., proteínas sintéticas) y proteínas de fusión, incluyendo bibliotecas de péptidos, que comprenden secuencias según son provistas en la presente. Las bibliotecas de péptidos según son provistas en la presente se pueden utilizar para aislar moduladores peptídicos (v.gr., activadores o inhibidores) de objetivos. Las bibliotecas de péptidos según son provistas en la presente se pueden utilizar para identificar socios de ligadura formales de los objetivos, tales como ligandos, v.gr., citoquinas, hormonas, y similares.

En un aspecto, las proteínas de fusión según son provistas en la presente (v.gr., la fracción peptídica) se estabilizan conformacionalmente (en relación a péptidos lineales) para permitir una mayor afinidad de ligadura para objetivos. En otro aspecto, provistas en la presente son fusiones de hidrolasas según son provistas en la presente y otros péptidos, incluyendo péptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de una manera tal que no se perturbe significativamente la estructura de la enzima o anticuerpo (v.gr., hidrolasa) , y el péptido se estabiliza conformacionalmente de una manera metabólica o estructural. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que se monitoriza fácilmente, tanto para determinar su presencia adentro de las células, como su cantidad.

Variantes de secuencias de aminoácidos según son provistas en la preséntese pueden caracterizar por una naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las separa de una forma que se presenta naturalmente, v.gr., una variación alélica o inter-especies de una secuencia de hidrolasa. En un aspecto, las variantes según son provistas en la presente exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el análogo que se presenta naturalmente. Alternativamente, se pueden seleccionar las variantes por tener características modificadas. En un aspecto, aunque el sitio o región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminada, la mutación por sí misma no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, con el objeto de optimizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se puede conducir mutagénesis aleatoria en el codón o en la región objetiva, y se clasifican las variantes de hidrolasa expresadas para la combinación óptima de actividad deseada. Técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN teniendo una secuencia conocida son bien conocidas, como describen en la presente, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis de PCR. Clasificación de mutantes puede hacerse utilizando ensayos de actividades proteolíticas . En aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser de residuos individuales; se pueden hacer inserciones del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden hacer inserciones considerablemente más grandes. Supresiones pueden variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o m s. Para obtener un derivado final con las propiedades óptimas, se pueden utilizar sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas. En general, estos cambios se hacen sobre unos cuantos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, se pueden tolerar cambios más grandes en ciertas circunstancias.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son hidrolasas en donde se ha modificado la estructura base del polipéptido, la estructura secundaria o terciaria, v.gr., una estructura de hélice alfa o de hoja beta. En un aspecto, se ha modificado la carga o la hidrofobia. En un aspecto, se ha modificado el volumen de una cadena secundaria. Se hacen cambios sustanciales en la función o la identidad inmunoló-gica mediante seleccionar sustituciones que sean menos conserva-doras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afecten de una forma más significativa: la estructura base del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo una estructura de hélice alfa o de hoja beta; una carga o un sitio hidrófobo de la molécula, que puede estar en un sitio activo; o una cadena secundaria. En otras formas de realización, provistas en la presente son proteínas que comprenden sustituciones de secuencias según son provistas en la presente, v.gr., en donde (a) un residuo hidrófilo, v.gr., serilo o treonilo, es sustituido por un residuo hidrófobo, v.gr., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tenga una cadena secundaria electropositiva, v.gr., lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por un residuo electronegativo, v.gr., glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tenga una cadena secundaria voluminosa, v.gr., fenilalanina, es sustituido por uno que no tenga cadena secundaria, v.gr., glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biológica cualitativa (es decir, actividad de hidrolasa) , aunque se pueden seleccionar las variantes para modificar las características de las hidrolasas como sea necesario.

En un aspecto, hidrolasas según son provistas en la presente comprenden epítopos o marcadores de purificación, secuencias de señales u otras secuencias de fusión, etc. En un aspecto, las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden fusionar a un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. "Fusionado" u "operativamente enlazado" significa en la presente que el péptido aleatorio y la hidrolasa se enlazan entre sí, de tal manera que se minimiza la alteración a la estabilidad de la estructura de hidrolasa, v.gr., retiene su actividad de hidrolasa. El polipéptido de fusión (o polinucleóti-do de fusión que codifica al polipéptido de fusión) puede comprender componentes adicionales también, incluyendo múltiples péptidos en múltiples espirales.

En un aspecto, los péptidos (v.gr., sub-secuencias de hidrolasa) y ácidos nucleicos que los codifican se seleccionan de manera aleatoria, ya sea de una manera completamente aleatoria, o son sesgados en su selección aleatoria, v.gr., en la frecuencia de nucleótidos/residuos generalmente o por posición. "Selección aleatoria" significa que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos que dan lugar a los péptidos se pueden sintetizar químicamente, y por lo tanto pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Por lo tanto, cuando se expresan los ácidos nucleicos para formar péptidos, se puede incorporar cualquier residuo de aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar ácidos nucleicos seleccionados de manera aleatoria, con el fin de permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones sobre la longitud del ácido nucleico, formando de esta manera una biblioteca de ácidos nucleicos aleatoriamente seleccionados. La biblioteca puede proporcionar una población suficientemente diversa estructuralmente de productos de expresión seleccionados aleatoriamente, para afectar un intervalo probabilísticamente suficiente de respuestas celulares, para proporcionar una o más células que exhiban una respuesta deseada. Provistas en la presente son bibliotecas de interacción suficientemente grandes tal que cuando menos uno de sus miembros tenga una estructura que le dé afinidad para alguna molécula, proteína, u otro factor.

Metodologías de Clasificación y Dispositivos de Monitorización "En Línea" En la práctica de los métodos según son provistos en la presente, se pueden utilizar una variedad de aparatos y metodologías en conjunto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención, v.gr., para clasificar polipéptidos para actividad de hidrolasa, para clasificar compuestos como activadores o inhibidores potenciales de una actividad de hidrolasa (v.gr., para clasificación de fármacos potenciales) , para anticuerpos que se liguen a un polipéptido según es provisto en la presente, para ácidos nucleicos que se hibriden a un ácido nucleico según es provisto en la presente, para clasificar células que expresen un polipéptido según es provisto en la presente, y similares. Ver, v.gr., la patente US 6,337,187.

Arreglos Capilares Arreglos capilares, tales como el GIGAMATRIX, Diversa Corporation, San Diego, California, Estados Unidos, se pueden utilizar en los métodos según son provistos en la presente. Ácidos nucleicos o polipéptidos según son provistos en la presente se pueden inmovilizar en o se pueden aplicar a un arreglo, incluyendo arreglos capilares. Arreglos se pueden utilizar para clasificar o monitorizar bibliotecas de composiciones (v.gr., moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.), por su capacidad para ligarse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido según son provistos en la presente. Arreglos capilares proporcionan otro sistema para contener y clasificar muestras. Por ejemplo, un aparato de clasificación de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en un arreglo de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprenda cuando menos una pared que defina un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir además un material intersticial dispuesto entre los capilares adyacentes del arreglo, y una o más indicaciones de referencia formadas dentro del material intersticial. Un capilar para clasificar una muestra, en donde el capilar se adapte para enlazarse en un arreglo de capilares, puede incluir una primera pared que defina un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material filtrador, para filtrar la energía de excitación proporcionada al lumen para excitar la muestra.

Se puede introducir un polipéptido o ácido nucleico, v.gr., un ligando o un sustrato, en un primer componente, en cuando menos una porción de un capilar de un arreglo capilar. Cada capilar del arreglo capilar puede comprender cuando menos una pared que defina un lumen para retener al primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente por la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interés como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de un arreglo capilar, en donde capilar del arreglo capilar comprenda cuando menos una pared que defina un lumen para retener al primer líquido y la partícula detectable, y en donde la cuando menos una pared se recubre con un material de ligadura para ligar la partícula detectable a la cuando menos una pared. El método puede incluir además remover el primer líquido del tubo capilar, en donde se mantenga la partícula detectable enlazada adentro del capilar, e introducir un segundo líquido en el tubo capilar.

El arreglo capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprendan cuando menos una pared externa que defina un lumen. La pared externa del capilar puede ser de una o más paredes fusionadas entre sí. De una manera similar, la pared puede definir un lumen que sea cilindrico, cuadrado, hexagonal, o de cualquier otra forma geométrica, siempre que las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o muestra. Los capilares del arreglo capilar se pueden mantener juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares se pueden ligar entre sí, al fusionarse (v.gr., en donde los capilares se hacen de vidrio), adherirse, ligarse, o sujetarse lado a lado. El arreglo capilar se puede formar de cualquier número de capilares individuales, por ejemplo, un intervalo de 100 a 4,000,000 capilares. Un arreglo capilar puede formar una placa de micro-titulación que tenga aproximadamente 100,000 o más capilares individuales ligados entre sí.

Arreglos o "Biochips" Ácidos nucleicos o polipéptidos según son provistos en la presente se pueden inmovilizar en, o aplicar a, un arreglo. Arreglos se pueden utilizar para clasificar o monitorizar bibliotecas de composiciones (v.gr., moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.), para su capacidad para ligarse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido según son provistos en la presente. Por ejemplo, en un aspecto según es provisto en la presente, un parámetro monitorizado es expresión de transcripción de un gen de hidrola-sa. Una o más, o todas las transcripciones de una célula se pueden medir mediante la hibridación de una muestra que comprenda transcripciones de la célula, o los ácidos nucleicos representativos de o complementarios para las transcripciones de una célula, mediante hibridación a los ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo, o "biochip" . Mediante la utilización de un "arreglo" de ácidos nucleicos sobre un microchip, se pueden cuantificar simultáneamente algunas o todas las transcripciones de una célula. Alternativamente, también se pueden utilizar arreglos que comprendan ácido nucleico genómico para determinar el genotipo de una cepa recién diseñada hecha mediante los métodos según son provistos en la presente. También se pueden utilizar "arreglos de polipéptidos" para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente invención se puede practicar con cualquier "arreglo" conocido, también referido como un "micro-arreglo" o "arreglo de ácido nucleico" o "arreglo de polipéptido" o "arreglo de anticuerpo" o "biochip" , o una variación de los mismos. Los arreglos son genéricamente una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivos", comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, v.gr., oligonucleótidos , inmovilizadas sobre un área definida de una superficie de sustrato para su enlace específico con una molécula de muestra, v.gr., transcripciones de AR m.

Los "arreglos" o "micro-arreglos" o "biochips" o "chips" según son provistos en la presente pueden comprender una pluralidad de elementos objetivo, cada elemento objetivo comprendiendo una cantidad definida de uno o mas polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de sustrato.

En un aspecto, las hidrolasas se utilizan como formas inmovilizadas. Se puede emplear cualquier método de inmovilización, v.gr., inmovilización sobre un soporte inerte tal como dietilaminoetilcelulosa, vidrio poroso, quitina, o células. Células que expresan hidrolasas según son provistas en la presente se pueden inmovilizar mediante reticulación, v.gr., con glutaraldehído a una superficie de sustrato.

En la práctica de los métodos según son provistos en la presente, se puede incorporar cualquier arreglo conocido y/o método para hacer y utilizar arreglos, del todo o en parte, o variaciones de los mismos, como se describen, por ejemplo, en las patentes US 6,277,628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,606; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,452; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5,700,637; 5,556,752; 5,434,049; ver también, v.gr., las publicaciones internacionales WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; ver también, v.gr., Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23 : 1087-1092 ; Kern (1997) Biotechniques 23 : 120-124 ; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cáncer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. Ver también las solicitudes de patente US 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Anticuerpos y Métodos de Clasificación Basados en Anticuerpos En ciertas formas de realización, provistos en la presente son anticuerpos aislados, sintéticos o recombinantes que se ligan específicamente a una hidrolasa según es provista en la presente. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar, identificar, o cuantificar la hidrolasa según es provista en la presente o polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar otros polipéptidos según son provistos en la presente u otras hidrolasas relacionadas.

"Anticuerpos" según son provistos en la presente pueden comprender péptidos o polipéptidos derivados de, modelados en o sustancialmente codificados por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de ligarse específicamente a un antígeno o epítopo, v.gr. , Fundamental Immunology, 3ra. edición, W. E. Paul, ed.( Raven Press, N. Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol . Methods 175:267-273;. Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys . Methods 25:85-97. El término anticuerpo incluye porciones de ligadura a antígeno, es decir, "sitios de ligadura a antígeno", (v.gr., fragmentos, sub-secuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ) que retienen capacidad para ligarse a antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb ( ard et al. (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Anticuerpos de una sola cadena también se incluyen por referencia en el término "anticuerpo". Provistos en la presente son anticuerpos, incluyendo sitios de ligadura a antígeno y anticuerpos de una sola cadena que se ligan específicamente a una hidrolasa según es provista en la presente. Al practicar los métodos según son provistos en la presente, polipéptidos teniendo una actividad de hidrolasa también se pueden usar.

Los anticuerpos se pueden utilizar en inmunoprecipita-ción, teñido, columnas de inmunoafinidad, y similares. Si se desea, se pueden generar secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen los antígenos específicos mediante inmunización, seguido por el aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización del polipéptido sobre un arreglo según es provisto en la presente. Alternativamente, los métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una célula a ser modificada, v.gr., se puede aumentar o reducir la afinidad de un anticuerpo. Mas aun, la capacidad para hacer o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo diseñado en una célula mediante los métodos según son provistos en la presente.

Métodos de inmunización, produciendo y aislando anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los técnicos en la materia, y se describen en la literatura científica y de patente, ver, v.gr., Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, iley/Greene , NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a Edición) , Lange Medical Publications , Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (2a Ed. ) , Academic Press, Nueva York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Anticuerpos también se pueden generar in vitro, v.gr., utilizando bibliotecas de exhibición de fagos que expresen sitios de ligadura de anticuerpos recombinantes , además de los métodos tradicionales in vivo utilizando animales. Ver, v.gr., Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.

Polipéptidos o péptidos se pueden utilizar para generar anticuerpos que se liguen específicamente a los polipéptidos según son provistos en la presente. Los anticuerpos resultantes se pueden utilizar en procedimientos de cromatografía por inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, una preparación de proteína, tal como un extracto, o una muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo capaz de ligarse específicamente con uno de los polipéptidos según son provistos en la presente.

En procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparación de proteína se pone en contacto con el anticuerpo bajo condiciones en las cuales el anticuerpo se liga de una manera específica con uno de los polipéptidos según son provistos en la presente. Después de un lavado para remover proteínas no específicamente enlazadas, se eluyen los polipéptidos específicamente enlazados.

Se puede determinar la capacidad de las proteínas de una muestra biológica para ligarse con el anticuerpo utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los técnicos en la materia. Por ejemplo, se puede determinar ligadura mediante el marcado del anticuerpo con una marca detectable, tal como un agente fluorescente, una marca enzimática, o un radioisótopo. Alternativa, se puede detectar ligadura del anticuerpo con la muestra utilizando un anticuerpo secundario que tenga esta marca detectable en el mismo. Ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos de emparedado, radioinmunoensayos , y Western Blots .

Se pueden obtener anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos según son provistos en la presente mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal, o mediante la administración de los polipéptidos a un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se ligará entonces con el polipéptido mismo. De esta manera, inclusive se puede utilizar una secuencia que codifique solamente un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que puedan ligarse al polipéptido nativo entero. Tales anticuerpos se pueden utilizar luego para aislar el polipéptido de las células que expresen ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales , se puede emplear cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Ejemplos incluyen la técnica de hibridoma, la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma-EBV (ver, v.gr., Colé (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (ver, v.gr., la patente US 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena para los polipéptidos según son provistos en la presente. Alternativamente, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de los mismos .

Anticuerpos generados contra los polipéptidos según son provistos en la presente (incluyendo anticuerpos anti-idiotipo) se pueden utilizar en clasificación de polipéptidos similares a partir de otros organismos y muestras. En tales técnicas, polipéptidos a partir del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan los polipéptidos que se enlacen de una manera específica con el anticuerpo. Se puede emplear cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para detectar ligadura del anticuerpo.

Hidrolasas Inmovilizadas En un aspecto, las hidrolasas según son provistas en la presente, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y /o estearata-sas, se utilizan como formas inmovilizadas, v.gr., para procesar lipidos, en la síntesis estructurada de lípidos, para digerir proteínas y similares. Las lipasas inmovilizadas según son provistas en la presente se pueden utilizar, v.gr., para hidrólisis de triacilglicéridos , diacilglicéridos o ásteres o para la esterificación o trans-esterificación de ácidos grasos, diacilglicéridos , o triacilglicéridos, o en la inter-esterifica-ción de grasas. En un aspecto, la lipasa es específica para la esterificación de ácidos grasos con alcohol, 1 , 3 -específica o para la hidrólisis de glicéridos parciales, ésteres, o triacil-glicéridos. Lipasas inmovilizadas según son provistas en la presente se puede utilizar en un lecho empacado para trans-esterificación continua de grasas sin solvente. Ver, v.gr., las patentes US 4,818,695 y 5,569,594.

Se puede emplear cualquier método o inmovilización o forma de soporte, v.gr., arreglos, perlas, soportes capilares, y similares, como se describe en lo anterior. En un aspecto, la inmovilización de hidrolasa puede ocurrir sobre un soporte inerte, tal como dietilaminoetilcelulosa, vidrio poroso, quitina, o células. Células que expresan hidrolasas según son provistas en la presente se pueden inmovilizar mediante reticulación, v.gr., con glutaraldehído, a una superficie de sustrato. Hidrolasas inmovilizadas según son provistas en la presente se pueden preparar conteniendo hidrolasa ligada a un soporte hidrófobo en partículas poroso y seco, con un tensioactivo, tal como un éster de ácido graso de sorbitán de polioxietileno o un éster de ácido graso de poliglicerol . El soporte puede ser un polímero olefínico alifático, tal como un polietileno o un polipropileno, un homo-o co-polímero de estireno, o una mezcla física de los mismos, o un soporte inorgánico pre-tratado. Estos soportes se pueden seleccionar a partir de polímeros olefínicos alifáticos, polímeros de oxidación, mezclas físicas de estos polímeros, o soportes inorgánicos pre-tratados con el objeto de hacer a estos soportes hidrófobos. Este pre-tratamiento puede comprender silanización con un compuesto de silicio orgánico. El material inorgánico puede ser una sílice, una alúmina, un vidrio, o una cerámica. Soportes se pueden hacer de poliestireno, co-polímeros de estireno, polietileno, polipropileno, o a partir de co-polímeros derivados de (met) acrilatos . Ver, v.gr., la patente US 5, 773, 266.

Las enzimas hidrolasas, fragmentos de las mismas y ácidos nucleicos que codifican las enzimas y fragmentos se pueden fijar sobre un soporte sólido. Esto es frecuentemente económico y eficiente en el uso de las hidrolasas en procesos industriales. Por ejemplo, un consorcio o coctel de enzimas hidrolasas (o fragmentos activos de las mismas) , que se usan en una reacción química específica, pueden unirse a un soporte sólido y sumergirse en una cuba de proceso. La reacción enzimática puede ocurrir. Entonces, el soporte sólido puede tomarse fuera de la cuba, junto con las enzimas fijas al mismo, para uso repetido. En una forma de realización según es provista en la presente, un ácido nucleico aislado según es provisto en la presente se fija a un soporte sólido. En otra forma de realización según es provista en la presente, el soporte sólido se selecciona a partir del grupo de un gel, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un micro-electrodo y cualquier combinación de los mismos.

Por ejemplo, soportes sólidos provistos en la presente incluyen geles. Algunos ejemplos de geles incluyen SEPHAROSE (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos) , gelatina, glutaral-dehído, glutaraldehído tratado con quitosán, albúmina-glutaral-dehído, quitosán-xantana, gel de toyoperla (gel de polímero) , alginato, alginato-polilisina, carragenina, agaroasa, glioxilo agaroasa, agarosa magnética, dextrano-agarosa, hidrogel de poli (sulfonato de carbamoilo) , hidrogel de BSA-PEG, poli (alcohol vinílico) (PVA) fosforilado, monoaminoetil-N-aminoetilo (MANA) , amino, o cualquier combinación de los mismos.

Otros soportes sólidos provistos en la presente comprenden resinas o polímeros. Algunos ejemplos de resinas o polímeros incluyen celulosa, acrilamida, nilón, rayón, poliéster, resina de intercambio de aniones, AMBERLITE XAD-7, AMBERLITE XAD-8, AMBERLITE IRA- 94, AMBERLITE IRC-50 (Rohm and Haas, Filadelfia, PA, Estados Unidos) , polivinilo, poliacrílico, polimetacrilato, o cualquier combinación de los mismos .

Otro tipo de soporte sólido provisto en la presente comprende cerámica. Algunos ejemplos incluyen cerámica no porosa, cerámica porosa, Si02, Al203. Otro tipo de soporte sólido útil en la presente invención es vidrio. Algunos ejemplos incluyen vidrio no poroso, vidrio poroso, vidrio de aminopropilo o cualquier combinación de los mismos. Otro tipo de soporte sólido que puede usarse es un micro-electrodo. Un ejemplo es una magnetita revestida de polietilenoimina . Partículas de grafito puede usarse como un soporte sólido.

Otro tipo de soporte sólido provisto en la presente comprende productos de tierra diatomácea y silicatos. Algunos ejemplos incluyen diatomitas CELITE, KENITE, DIACTIV, PRIMISIL, DIAFIL y silicatos de calcio y magnesio sintéticos MICRO-CEL, CALFLO, SILASORB, y CELKATE (World Minerals Inc., Santa Barbara, CA, Estados Unidos) .

Otro ejemplo de un soporte sólido es o comprende una célula, tal como un glóbulo rojo.

Kits En ciertas formas de realización, provistos en la presente son kits que comprenden las composiciones, v.gr., ácidos nucleicos, cartuchos de expresión, vectores, células, semillas transgénicas o plantas o partes de plantas, polipéptidos (v.gr., hidrolasas) y/o anticuerpos según son provistos en la presente. Los kits también pueden contener material de instrucciones enseñando las metodologías y usos industriales según son provistos en la presente, como se describen en la presente. Aplicaciones Industriales y Médicas Las hidrolasas (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) provistas en la presente tienen muchos usos industriales y aplicaciones médicas, y unos cuantos usos ejemplares y composiciones se describen mas adelante. Los procesos según son provistos en la presente comprenden convertir un fosfolípido no hidratable a una forma hidratable, desengomado de aceite, procesamiento de alimentos, procesamiento de aceites (v.gr., hacer un aceite saturado bajo) a partir de plantas, pescado, algas y similares, por nombrar sino algunas aplicaciones .

Procesamiento de alimentos y alimentaciones En ciertas formas de realización, provistos en la presente son procesos para hacer queso usando hidrolasas (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente. En otras formas de realización, provistos en la presente son quesos que comprenden hidrolasas . En un aspecto, las enzimas según son provistas en la presente (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas o una combinación de las mismas) se usan para procesar quesos para mejora de sabor, para incrementar el rendimiento y/o para "estabilizar" quesos, v.gr., mediante reducir la tendencia a "sacar aceite", o, en un aspecto, las enzimas según son provistas en la presente se usan para producir queso a partir de leche para queso. Estos procesos según son provistos en la presente pueden incorporar cualquier método o protocolo, v.gr. , como se describe, v.gr., 6,551,635 y 6,399,121, O 03/070013, O 00/054601. Por ejemplo, en un aspecto, las hidrolasas (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente se utilizan para estabilizar la emulsión de grasa en leche o composiciones que comprenden leche, v.gr., crema, y se utilizan para estabilizar las composiciones de leche, v.gr., para la fabricación de cremas o licores de crema. En una forma de realización, provistos en la presente son procesos para mejorar el sabor de un queso utilizando cuando menos una enzima según es provista en la presente, comprendiendo el proceso incubar una proteína, una grasa, y una proteasa y una lipasa (v.gr., según es provista en la presente) en un medio acuoso bajo condiciones que produzcan un sabor mejorado del queso (v.gr. , amargura reducida) , v.gr., según se describe en WO 99/66805. En un aspecto, lipasas según son provistas en la presente se utilizan para mejorar el sabor en un queso (v.gr. , una cuajada) mediante mezclar con agua, una proteasa, y una fosfolipasa a una temperatura elevada, v.gr. , entre aproximadamente 75°C y 95°C, como se describe, v.gr., en la patente US 4,752,483. En un aspecto, lipasas según son provistas en la presente se utilizan para acelerar el añej amiento del queso mediante añadir una enzima según es provista en la presente a un queso (v.gr., una leche de queso) antes de añadir un coagulante a la leche, o mediante añadir una enzima (v.gr., una lipasa) según es provista en la presente a una cuajada con sal antes de prensar, v.gr., como se describe, v.gr., en la patente US 4,707,364. En un aspecto, se utiliza una lipasa según es provista en la presente para degradar un triacilglicérido en grasa de leche, con el fin de liberar los ácidos grasos libres, resultando en una mejora de sabor. Una enzima según es provista en la presente también se puede utilizar en cualquiera de estos procesos según son provistos en la presente, ver, v.gr. , Brindisi (2001) J. Of Food Sci. 66:1100-1107.

Síntesis estructurada y procesamiento de aceites En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para la síntesis estructurada de aceites, lípidos y similares usando hidrolasas (v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente. Los métodos según son provistos en la presente comprenden una síntesis bio-catalítica de lípidos estructurados, es decir, lípidos que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre una estructura base, v.gr., una estructura base de glicerol . Productos generados usando las hidrolasas y practicando los métodos según son provistos en la presente incluyen aceites saturados bajos, v.gr. , aceites a partir de vegetales (v.gr., soya, cañóla), animales, plantas, pescados, algas, los cuales aceites han sido procesados o tratados con un polipéptido según es provisto en la presente; y alimentos, alimentaciones, suplementos, farmacéuticos y similares comprendiendo aceites saturados bajos hechos mediante practicar los métodos y/o composiciones (v.gr., enzimas) según son provistos en la presente. Productos generados usando las hidrolasas y practicando los métodos según son provistos en la presente también incluyen alternativos a mantequilla de cacao, lípidos conteniendo ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , lípidos conteniendo ácidos grasos esenciales, lípidos conteniendo ácidos grasos mono-insaturados , lípidos conteniendo fosfo-colina y fosfo-serina, lipidos conteniendo fitoesteroles , 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéri-dos (TAGs) .

Los métodos según son provistos en la presente permiten la síntesis de lipidos o ácidos grasos con regio-selectividades y estéreo-selectividades definidas. Provistos en la presente son aceites, lipidos y similares, y aceites que pueden usarse en alimentos y alimentaciones y materiales para cocinar (v.gr., aceites para cocinar, aceites para freír, aceites para hornear, salsas, marinadas, condimentos, aceites para rociar, margarinas, mayonesa, aderezos cuchareables y derramables, alternativos de mantequilla de cacao, y similares) que han sido procesados o tratados con polipéptidos o péptidos (v.gr., hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistos en la presente. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son farmacéuticos, nutracéuticos y cosméticos comprendiendo polipéptidos (v.gr., hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas; o péptidos o anticuerpos) según son provistos en la presente.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para procesar (modificar) aceites, lipidos y similares usando hidrolasas según son provistas en la presente. Los métodos pueden usarse para procesar aceites a partir de plantas, animales, micro-organismos. Los métodos según son provistos en la presente pueden usarse en la síntesis estructura-da de aceites similares a aquellos encontrados en plantas, animales, y micro-organismos. Lípidos y aceites pueden procesarse para tener una característica deseada. Lípidos y aceites que se pueden procesar por los métodos según son provistos en la presente (usando las hidrolasas según son provistas en la presente) incluyen alternativos de mantequilla de cacao, lípidos conteniendo ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , lípidos conteniendo ácidos grasos esenciales, lípidos conteniendo ácidos grasos mono-insaturados , lípidos conteniendo fosfo-colina y fosfo-serina, lípidos conteniendo fitoesteroles, 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2 -monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéri-dos (TAGs) . En un aspecto, los aceites y grasas procesados y sintéticos según son provistos en la presente (v.gr., alternativos de mantequilla de cacao y aceites vegetales) pueden usarse en una variedad de aplicaciones, v.gr., en la producción de alimentos (v.gr., confitería, pastas) y en la formulación de f rmacéuticos, nutracéuticos y cosméticos. Provistos en la presente son métodos para procesar grasas y aceites, v.gr., semillas oleaginosas, de plantas, incluyendo, v.gr., cañóla, ricino, coco, coriandro, maíz, semilla de algodón, avellana, cáñamo, linaza, espuma de la pradera, olivo, aceite de palma, semilla de palma, maní, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, pino, camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o crianza tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linolénico, o saturados bajos (cañóla alto oleico, soya bajo linolénico o girasol alto esteárico) , o mezclas físicas de cualquiera de los anteriores usando una hidrolasa según es provista en la presente.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para procesar aceites a partir de animales, v.gr., pescado (eperlano, hígado de bacalao, reloj anaranjado, sardina, arenque, sábalo, y similares) , mamíferos (cerdo, res, y similares) y aves de corral (pollo, y similares) , usando las hidrolasas según son provistas en la presente. En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para la síntesis estructurada de aceites similares a aquellos encontrados en animales, v.gr., pescado, aves de corral, y mamíferos y microorganismos, usando las hidrolasas según son provistas en la presente. En un aspecto, estos aceites sintéticos o procesados se usan como aditivos de alimentación, alimentos, como ingredientes en formulaciones farmacéuticas, nutracéuticos o en cosméticos. Por ejemplo, en un aspecto las hidrolasas según son provistas en la presente se usan para hidrolizar ácidos grasos fuera de aceites de pescado tal que los ácidos grasos se puedan recuperar y usar como un aditivo de alimentación. En un aspecto, las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden usar para procesar aceite a partir de desechos de restaurante y grasas animales producidas.

En otras formas de realización, provistos en la presente son métodos para procesar grasas y aceites, v.gr., a partir de aceites de algas, incluyendo, v.gr., aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de especies Nannochloris, aceite de especies Spirulina, aceite de Chlorophycease (algas verdes) , y aceite de Bacilliarophy o mezclas físicas de cualesquiera de dichas grasas y aceites.

En un aspecto, las hidrolasas según son provistas en la presente son bio-catalizadores versátiles en síntesis orgánica, v.gr., en la síntesis estructurada de aceites, lípidos y similares. Enzimas según son provistas en la presente (incluyendo hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearata-sas) pueden aceptar un rango amplio de sustratos, incluyendo alcoholes secundarios y terciarios, v.gr., a partir de un producto natural tal como alfa-terpineol, linalool y similares. En algunos aspectos, las hidrolasas según son provistas en la presente tienen buena a excelente enantio-especificidad (v.gr., estéreo-especificidad) .

En ciertas formas de realización, provisto en la presente es un proceso de conversión de aceite (v.gr., aceites vegetales, mantequillas de cacao, y similares) comprendiendo por lo menos una enzima (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente. En un aspecto, un proceso de conversión de aceite comprende una hidrólisis controlada y acilación, v.gr., una acilación de glicerol, lo cual puede resultar en una alta pureza para un rango amplio de productos. En un aspecto, hidrolasas (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según son provistas en la presente se usan para producir aceites de diacilglicerol y aceites nutrimentales estructurados . En ciertas formas de realización, provistos en la presente son procesos para la esterificación de propileno glicol usando una enzima según es provista en la presente, v.gr., una lipasa regio- y/o quimio selectiva para esterificación mono-sustituida en la posición Sn-1. Provistos en la presente son procesos para la síntesis estructurada de aceites con perfiles de ácidos grasos saturados e insaturados dirigidos usando una enzima según es provista en la presente, v.gr., una lipasa regio- y/o quimio-selectiva para la remoción de un ácido graso saturado, o, para la adición dirigida de un ácido graso a una estructura base de glicerol .

En un aspecto, los métodos según son provistos en la presente además comprenden procesos para la remoción selectiva de ácidos grasos (v.gr., ácidos grasos no deseables) a partir de aceites, v.gr., separar ácidos grasos saturados y/o insaturados a partir de aceites, usando una hidrolasa (v.gr., una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según es provista en la presente. El proceso según es provisto en la presente puede separar ácidos grasos saturados y/o insaturados a partir de cualquier aceite, v.gr., un aceite de soya. La enzima puede ser quimio-selectiva y/o enantio-selectiva. En un aspecto, estos procesos generan grasas y aceites de alta estabilidad, v.gr., aceites para freír "saludables" . Este proceso ejemplar según es provisto en la presente se puede usar para generar aceites con menos azufre, v.gr., usando un proceso que comprende remoción de azufre a partir de aceite crudo. Las enzimas según son provistas en la presente también se pueden usar en procesos de inter-esterificación para estos y otros propósitos.

En un aspecto, una enzima según es provista en la presente se usa para generar un aceite con grasa "no trans" . En un aspecto, un aceite "no trans" se genera a partir de un aceite parcialmente hidrogenado para producir un aceite solamente cis. La enzima puede ser quimio-selectiva y/o enantio-selectiva.

En otras formas de realización, provistos en la presente son procesos para modificar mantequillas de cacao usando una enzima según es provista en la presente. Alrededor de 80% de las mantequillas de cacao comprenden triacilglicéridos POP, SOS y POS (P es ácido graso palmítico, O es ácido graso oleico, S es ácido graso esteárico) . La estructura de ácido graso saturado-insaturado- saturado de las mantequillas de cacao imparte sus perfiles de fusión característicos, v.gr., en chocolates. En un aspecto, los procesos sintéticos estructurados y directos según son provistos en la presente se usan sobre mantequillas de cacao para reducir variaciones de mantequilla de cacao o para producir mantequillas de cacao sintéticas ("alternativos a mantequilla de cacao") . En un aspecto, una hidrolasa (v.gr., lipasa o esterasa) quimio-selectiva y/o enantio-selectiva (v.gr., regio-selectiva) según es provista en la presente se usa para hacer un alternativo a mantequilla de cacao, v.gr., un sustituto de mantequilla de cacao, un reemplazador de mantequilla de cacao y/o un equivalente a mantequilla de cacao. Provistos en la presente son alternativos a mantequilla de cacao, incluyendo sustitutos de mantequilla de cacao, reemplazadores de mantequilla de cacao y equivalentes a mantequilla de cacao y sus intermediarios de fabricación comprendiendo una enzima según es provista en la presente. Un proceso según es provisto en la presente (usando una enzima según es provista en la presente) para hacer alternativos a mantequilla de cacao puede comprender mezclar físicamente un aceite vegetal, v.gr., un aceite de palma, con karité o equivalente, ilipe o equivalente y esterinas Sal o equivalentes, y tratar los aceites mezclados físicamente con polipéptidos según son provistos en la presente. En un aspecto, el proceso según es provisto en la presente comprende el uso de inter-esterificación. El proceso según es provisto en la presente puede generar formas de composición o cristalinas que simulan mantequilla de cacao "natural" .

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son procesos (usando una enzima según es provista en la presente) para producir un diacilglicerol (DAG) , v.gr., 1,3-diacilglicerol , usando un aceite vegetal, v.gr., un aceite de bajo costo. La enzima puede ser quimio-selectiva y/o enantio-selectiva. El proceso según es provisto en la presente puede resultar en una composición comprendiendo DAG teniendo buena estabilidad, larga vida en estantes y desempeño a alta temperatura.

Las enzimas (hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente y métodos según son provistos en la presente también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, v.gr., en la patente US 6,025,171. En este método ejemplar, enzimas según son provistas en la presente se inmovili-zan mediante preparar una emulsión conteniendo una fase hidrófoba continua, tal como un aceite de triacilglicérido, y una fase acuosa dispersa conteniendo una enzima anfífila, tal como una lipasa según es provista en la presente, y material vehículo que está parcialmente disuelto y parcialmente no disuelto en la fase acuosa, y remover agua a partir de la fase acuosa hasta que la fase pasa hacia partículas de vehículo revestidas con enzima sólida. La parte no disuelta del material vehículo puede ser un material que es insoluble en agua y aceite, o un material soluble en agua en forma no disuelta debido a que la fase acuosa ya está saturada con el material soluble en agua. La fase acuosa puede formarse con un líquido de fermentación de lipasa crudo conteniendo residuos de fermentación y biomasa que pueden servir como materiales vehículo. Lipasa inmovilizada es útil para re-arreglo de ásteres y desacidificación en aceites. Después de una reacción, la enzima inmovilizada puede regenerarse para una reacción subsecuente mediante añadir agua para obtener disolución parcial del vehículo, y con la enzima resultante y la fase acuosa conteniendo vehículo dispersas en un agua de evaporación de fase hidrófoba para de nuevo formar partículas de vehículo revestidas con enzima.

Las enzimas (v.gr. , lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente y métodos según son provistos en la presente también se pueden usar para preparar aceites trans-esterificados , como se describe, v.gr., en la patente US 5,288,619. Provistos en la presente son métodos para trans-esterificación enzimática para preparar un aceite de margarina teniendo contenido tanto de ácido trans bajo y de. ácido graso de cadena intermedia bajo. El método incluye los pasos de proporcionar una mezcla de reacción de trans-esterificación conteniendo un material fuente de ácido esteárico y el aceite vegetal usando una lipasa específica de posición 1,3, y luego finalmente hidrogenar la mezcla de ácidos grasos para proporcionar un material fuente de ácido esteárico reciclado para una reacción de reciclo con el aceite vegetal. Provisto en la presente es un método a contra-corriente para preparar un aceite trans-esterificado . El método incluye los pasos de proporcionar una zona de reacción de trans-esterificación conteniendo una lipasa específica de posición 1,3, introducir un aceite vegetal dentro de la zona de trans-esterificación, introducir un material fuente de ácido esteárico, conducir un fluido a contra-corriente de gas super-crítico o gas licuado sub-crítico, llevar a cabo una reacción de trans-esterificación de la corriente de triacilglicé-rido con la corriente de ácido esteárico o monoéster de ácido esteárico en la zona de reacción, retirar una corriente de aceite de margarina de triacilglicérido trans-esterificado, retirar una fase de fluido a contra-corriente, hidrogenar al ácido esteárico o monoéster de ácido esteárico trans-esterificado para proporcionar un material fuente de ácido esteárico hidrogenado de reciclo, e introducir el material fuente de ácido esteárico hidrogenado de reciclo hacia la zona de reacción.

En un aspecto, para permitir que la enzima según es provista en la presente actúe, ambas fases, la fase de aceite y la fase acuosa que contienen la enzima, deben mezclarse de manera íntima. Puede no ser suficiente meramente agitarlas. Buena dispersión de la enzima en el aceite se añade si se disuelve en una pequeña cantidad de agua, v.gr., 0.5-5% por peso (con relación al aceite) , y emulsionada en el aceite en esta forma, para formar gotas de menos de 10 mieras de diámetro (promedio por peso) . Las gotas pueden ser menores que 1 miera. Agitación turbulenta puede hacerse con velocidades radiales por encima de 100 cm/s. El aceite también se puede circular en el reactor usando una bomba giratoria externa. La fase acuosa conteniendo la enzima también se puede dispersar de manera fina mediante acción de ultra-sonido . Un aparato de dispersión se puede usar.

En un aspecto, una reacción enzimática según es provista en la presente toma lugar en la superficie limítrofe entre la fase de aceite y la fase acuosa. Es la meta de todas estas medidas que el mezclado cree la mayor posible superficie para la fase acuosa que contiene la enzima. La adición de tensioactivos incrementa la micro-dispersión de la fase acuosa. En algunos casos, por lo tanto, tensioactivos con valores de HLB por encima de 9, tales como dodecil sulfato de sodio, se añaden a la solución de enzima, como se describe, v.gr., en EP A 0 513 709. Un método efectivo similar para mejorar la emulsión es la adición de lisolecitina . Las cantidades añadidas pueden descansar en el rango de 0.001% a 1%, con referencia al aceite. La temperatura durante el tratamiento con enzima no es crítica. Temperaturas entre 20°C y 80°C pueden usarse, pero la última solamente se puede aplicar por un corto tiempo. En este aspecto, una lipasa según es provista en la presente teniendo una buena temperatura y/o baja tolerancia a pH se usa. Temperaturas de aplicación de entre 30°C y 50°C son óptimas. El periodo de tratamiento depende de la temperatura y se puede mantener mas corto con una temperatura en incremento. Tiempos de 0.1 a 10 horas, o, 1 a 5 horas son generalmente suficientes. La reacción toma lugar en un reactor, el cual se puede dividir en etapas. Por lo tanto operación continua es posible, junto con la operación por lotes. La reacción puede llevarse a cabo en diferentes etapas de temperatura. Por ejemplo, la incubación puede tomar lugar por 3 horas a 40°C, luego por 1 hora a 60°C. Si la reacción procede en etapas, esto también abre la posibilidad de ajustar diferentes valores de pH en las etapas individuales. Por ejemplo, en la primera etapa el pH de la solución se puede ajustar a 7, por ejemplo, y en una segunda etapa a 2.5, mediante añadir ácido cítrico u otros ácidos adecuados. En por lo menos una etapa, sin embargo, el pH de la solución de enzima debe estar por debajo de 4, o, por debajo de 3. Si el pH se ajustó subsecuentemente por debajo de este nivel, un deterioro del efecto se puede encontrar. Por lo tanto el ácido cítrico se puede añadir a la solución de enzima antes de que la última se mezcle en el aceite.

Las enzimas (hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según son provistas en la presente y métodos según son provistos en la presente también se pueden usar para preparar aceites, como se describe, v.gr., en la solicitud de patente US 11/567,318, incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Provistos en la presente son procesos continuos para tratamiento enzimático de lípidos . El método se refiere a un proceso y aparato para la inter-esterifi-cación enzimática continua de composiciones conteniendo lípidos usando una pluralidad de reactores de lecho fijo, en donde el flujo de la composición que contiene lípidos a través del aparato puede permanecer sustancialmente constante aun cuando la actividad enzimática de un lecho fijo disminuye con el tiempo, y aun cuando un lecho fijo es tomado fuera de línea tal como para reparación, reemplazo, o re-abastecimiento .

En una forma de realización, provisto en la presente es un método para hidrolizar un aceite o grasa mediante hacer reaccionar al aceite o grasa con una enzima palmitasa. En una forma de realización, la hidrólisis se conduce en presencia de un emulsionante teniendo HLB mayor que 12. En una forma de realización, la enzima palmitasa se codifica por una secuencia de ácidos nucleicos teniendo por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.5% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:l y teniendo i) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando al residuo de aminoácidos en la posición 95 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando a los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando al residuo de aminoácidos en la posición 83 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una forma de realización, la secuencia de ácidos nucleicos es la secuencia de la SEQ ID N0:1 y teniendo i) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando al residuo de aminoácidos en la posición 95 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando a los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando al residuo de aminoácidos en la posición 83 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una forma de realización, la enzima palmitasa es el acierto de tolerancia térmica 29 como se describe en la Tabla 9, y teniendo i) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codifican-do al residuo de aminoácidos en la posición 95 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando a los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) codificando al residuo de aminoácidos en la posición 83 (o el equivalente del mismo) como se señala en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una forma de realización, la enzima palmitasa usada en los métodos según son provistos en la presente es la enzima 29 SM con las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG como se describe en el ejemplo 12.

En ciertas formas de realización, el emulsionante tiene HLB mayor que 12, 14, 16, o 18. En ciertas formas de realización, el emulsionante se selecciona a partir de oleato de sodio, oleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, linolenato de sodio, linolenato de potasio, laureato de sodio, laureato de potasio, estearato de sodio, estearato de potasio, palmitato de sodio, palmitato de potasio, palmoleato de sodio, palmoleato de potasio, o una combinación de los mismos. En ciertas formas de realización, la mezcla de reacción comprende alrededor de 1 a 20% de agua con base en el peso total de los reactivos. En una forma de realización, la mezcla de reacción comprende alrededor de 1, 3, 5, 7, 10, 15, 17 o 20% de agua con base en el peso total de los reactivos.

En ciertas formas de realización, el aceite o grasa se mezcla con el emulsionante previo a adición de la enzima palmitasa. En ciertas formas de realización, la mezcla de aceite/grasa y emulsionante es homogeneizada antes y/o después de adición de la enzima palmitasa para asegurar emulsión uniforme.

En ciertas formas de realización, la reacción se conduce a de alrededor de 20 a 70°C. En ciertas formas de realización, la reacción se conduce a alrededor de 20, 30, 40, 50, 60 o 70°C. En ciertas formas de realización, la enzima palmitasa provista en la presente reduce el contenido de palmitato del aceite/grasa a alrededor de 5% o menos. En ciertas formas de realización, la enzima palmitasa provista en la presente reduce el contenido de palmitato del aceite/grasa a alrededor de 5, 4, 3, 2, 1% o menos. En ciertas formas de realización, la reducción deseada en contenido de palmitato toma lugar en alrededor o menos de alrededor de 48 h, 24 h, 20 h, 16 h, 12 h, 10 h, 5 h o 3 h. En ciertas formas de realización, el método además comprende un pre-tratamiento del aceite/grasa para remover goma y fase acuosa y para reducir ácidos grasos libres. Cualquier método de pre-tratamiento considerado adecuado por un técnico en la materia se puede usar. En ciertas formas de realización, el método además comprende la adición de una base (adición de cáustico) para formar jabones.

En ciertas formas de realización, el aceite usado en la reacción es aceite refinado o aceite crudo. En una forma de realización, la reacción además comprende adición de un fosfolí-pido. Cualquier fosfolípido considerado adecuado por un técnico en la materia puede usarse en las reacciones. En una forma de realización, el fosfolípido es lecitina. En una forma de realización, el aceite usado en las reacciones provistas en la presente es un aceite refinado y la reacción comprende la adición de un fosfolípido.

Nutracéu icos En un aspecto, las composiciones y los métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para hacer nutracéuticos mediante procesar o sintetizar lípidos y aceites utilizando las enzimas según son provistas en la presente, v.gr., hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearata-sas según son provistas en la presente. En un aspecto, los lípidos o aceites procesados o sintetizados incluyen ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , diacilglicéridos , v.gr., 1,3-diacilglicéridos (DAGs) , monoacilglicéridos , v.gr., 2-monoacil-glicéridos (MAGs) , y triacilglicéridos (TAGs) . En un aspecto, los nutracéuticos se hacen mediante el procesamiento de diacilglicéridos, v.gr., 1 , 3 -diacilglicéridos (DAGs), monoacilglicéridos, v.gr., 2 -monoacilglicéridos (MAGs), y/o triacilglicéridos (TAGs) a partir de fuentes de plantas (v.gr., semillas de aceite), o a partir de fuentes de animales (v.gr., aceite de pescado). En ciertas formas de realización, provistos en la presente son nutracéuticos (v.gr., composiciones dietéticas) comprendiendo polipéptidos (v.gr., enzimas, péptidos, anticuerpos) según son provistos en la presente.

En un aspecto, las composiciones y métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para fortificar las composiciones dietéticas, en especial productos basados en leche de vaca, v.gr., fórmulas para bebés basadas en leche de vaca, con hidrolasas activadas por sal biliar. Las composiciones hechas mediante los métodos y composiciones según son provistas en la presente se pueden utilizar para alimentar bebés recién nacidos y prematuros, incluyendo la administración de una hidrolasa activada por sal biliar según es provista en la presente para aumentar la digestión de grasa, y por consiguiente, el índice de crecimiento. En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones y métodos para el tratamiento de sujetos por una producción de enzima pancreática inadecuada, mediante la administración de hidrolasa activada por sal biliar en conjunto con ingestión de grasas; ver también la siguiente discusión.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones dietéticas que comprenden una hidrolasa v.gr. , hidrolasa activada por sal biliar según es provista en la presente. En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones dietéticas que comprenden una base nutricional que comprende una grasa y una cantidad efectiva de hidrolasa activada por sal biliar según es provista en la presente. En una forma de realización, provistas en la presente son fórmulas para bebé basadas en leche de vaca comprendiendo una hidrolasa, v.gr., hidrolasa activada por sal biliar según es provista en la presente. En un aspecto, la hidrolasa según es provista en la presente es activa en la digestión de ácidos grasos de cadena larga, v.gr., C12 a C22, que componen un porcentaje muy alto de la mayoría de las leches, v.gr., 99% de la leche de pecho humana. Ver, v.gr., la patente US En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones dietéticas que comprenden una grasa de aceite vegetal y una hidrolasa según es provista en la presente. En otras formas de realización, provistos en la presente son métodos para procesar productos basados en leche y/o composiciones que comprenden aceite vegetal para hacer composiciones dietéticas. En un aspecto, las composiciones procesadas comprenden un aceite de ácido láurico, un aceite de ácido oleico, un aceite de ácido palmítico y/o un aceite de ácido linoleico. En un aspecto, se puede utilizar un aceite de salvado de arroz, un aceite oleico de girasol, y/o un aceite de cañóla como aceites de ácido oleico. En un aspecto, grasas y aceites, v.gr., semillas oleaginosas, de plantas, incluyendo, v.gr., cañóla, ricino, coco, coriandro, maíz, semilla de algodón, avellana, cáñamo, linaza, espuma de la pradera, olivo, aceite de palma, semilla de palma, maní, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, pino, camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o crianza tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linolénico, o saturados bajos (cañóla alto oleico, soya bajo linolénico o girasol alto esteárico) , o mezclas físicas de cualquiera de los anteriores para utilizarse en los nutracéuticos y composiciones dietéticas se procesan o se hacen utilizando una hidrolasa según es provista en la presente. Ver, v.gr., la patente US 4,944,944.

En un aspecto, las enzimas según son provistas en la presente se proporcionan en una forma que sea estable al almacenamiento en la fórmula y/o en el estómago, pero activa cuando la formulación alcance la porción del tracto gastrointestinal en donde la fórmula normalmente sería digerida. Formulaciones (v.gr., micro-cápsulas) para liberación en el intestino son bien conocidas en la materia, v.gr., polímeros biodegradables , tales como poliláctido y poliglicólido, como se describen, v.gr. , en las patentes US 4,767,628; 4,897,268; 4,925,673; 5,902,617. Confitería, mantequilla de cacao y alimentos En un aspecto, las composiciones y métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para hacer y procesar mantequillas duras, tales como mantequilla de cacao. En otro aspecto, provistas en la presente son confiterías, mantequilla de cacao y alimentos comprendiendo polipéptidos (v.gr., enzimas, péptidos, anticuerpos) según son provistos en la presente.

Las composiciones y métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para hacer alternativos a mantequilla de cacao mediante técnicas sintéticas "estructuradas" utilizando las enzimas, v.gr., hidrolasas, v.gr., lipasas, saturasas , palmitasas y/o estearatasas según son provistas en la presente. Por ejemplo, en un aspecto, los métodos según son provistos en la presente procesan o sintetizan triacilglicéridos , diacilglicéri-dos, y/o monoacilglicéridos para uso como, v.gr., alternativos a mantequilla de cacao. En un aspecto, los métodos según son provistos en la presente generan una mantequilla dura con una "región plástica" definida, para mantener suficiente dureza por debajo de o a temperatura ambiente. En un aspecto, el lípido procesado o sintetizado se diseña para tener una "región plástica" muy estrecha, v.gr., en un aspecto, en donde se funda rápidamente a aproximadamente la temperatura corporal . La mantequilla de cacao natural empieza a reblandecerse de aproximadamente 30°C a 32°C, y se funde completamente a aproximadamente 36°C. La mantequilla de cacao natural puede contener 70% por peso o más de tres 1, 3-disaturado-2-oleoil-gliceroles, los cuales son 1, 3-dipalmitoil-2-oleoil-glicerol (POP) , l-palmitoil-2-oleoil-3 -estearoil-glicerol (POSt) , y l, 3-diestearoil-2-oleoil-glicerol (StOSt) . Estos tres gliceroles muestran un comportamiento de fusión similar entre sí y son responsables por las propiedades de fusión de la mantequilla de cacao, exhibiendo una región plástica muy estrecha. En ciertas formas de realización, provistas en la presente son mantequillas de cacao sintéticas mantequillas de cacao procesadas (sintetizadas o procesadas utilizando una hidrolasa según es provista en la presente, todas las posibles composiciones son referidas como alternativos a mantequilla de cacao) con diferentes porcentajes de 1, 3-dipalmitoil-2-oleoil-glicerol (POP) , l-palmitoil-2-oleoil-3 -estearoil-glicerol (POSt) , y 1, 3-diestearoil-2-oleoil-glicerol (StOSt) , dependiendo de las propiedades deseadas de la mantequilla de cacao sintética, y mantequillas de cacao sintéticas con más o menos del 70% por peso de los tres 1, 3-disaturado-2-oleoil-gliceroles . Las mantequillas de cacao sintéticas según son provistas en la presente pueden reemplazar parcial o completamente a mantequillas de cacao naturales o no procesadas y pueden mantener o mejorar propiedades esenciales de mantequilla dura.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son mantequillas de cacao sintéticas o mantequillas de cacao procesadas (sintetizadas o procesadas utilizando una hidrolasa según es provista en la presente) con propiedades deseadas para uso en productos de confitería, panadería, y farmacéuticos. En otras formas de realización, provistos en la presente son productos de confitería, panadería, y farmacéuticos que comprenden una hidrolasa según es provista en la presente. En un aspecto, los métodos según son provistos en la presente hacen o procesan un lípido (una grasa) a partir de una confitería (v.gr., un chocolate) o para utilizarse en una confitería. En un aspecto, se hace o se procesa un lípido tal que el chocolate muestre menos impresión de dedos que chocolate hecho a partir de mantequilla de cacao natural, mientras que todavía tenga características de fusión en la boca agudas. En un aspecto, se hace o se procesa un lípido tal que se pueda hacer una confitería (v.gr., chocolate) a una temperatura ambiental comparativamente alta, o que se pueda hacer utilizando agua de enfriamiento a una temperatura comparativamente alta. En un aspecto, el lípido se hace o se procesa tal que se pueda almacenar una confitería (v.gr., chocolate) bajo condiciones relativamente mas cálidas, v.gr., condiciones tropicales o semi-tropicales o en edificios calentados centralmente. En un aspecto, los lxpidos se hacen o se procesan tal que una confitería (v.gr., chocolate) tenga un contenido de lípido (grasa) de una composición y calidad consistentes. Las enzimas según son provistas en la presente se pueden utilizar para proporcionar una composición sustituta para mantequilla de cacao que pueda mejorar de una manera significativa su estabilidad térmica y reemplazarla en un amplio rango de aplicaciones .

Producción de margarina y manteca vegetal En ciertas formas de realización, provistas en la presente son grasas sintéticas o procesadas, v.gr., margarina y manteca vegetal sintetizada o procesada utilizando una hidrolasa según es provista en la presente. En otras formas de realización, provistas en la presente son grasas sintéticas o procesadas, v.gr., margarina y manteca vegetal, comprendiendo polipéptidos (v.gr., enzimas, péptidos, anticuerpos) según son provistos en la presente .

En una forma de realización, provistas en la presente son grasas procesadas que comprenden un aceite vegetal, tal como tipos de aceites de cañóla, ricino, coco, coriandro, maíz, semilla de algodón, avellana, cáñamo, linaza, espuma de la pradera, olivo, aceite de palma, semilla de palma, maní, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, pino, camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o "crianza" tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linolénico, o saturados bajos (cañóla alto oleico, soya bajo linolénico o girasol alto esteárico) sintetizados o procesados utilizando una hidrolasa según es provista en la presente. Las grasas sintéticas o procesadas, v.gr., margarina y manteca vegetal, se diseñan para tener una "plasticidad" deseada. Muchos de los productos de grasa plástica, tales como margarina y manteca vegetal, se producen a partir de suministros duros y de aceites líquidos como materia prima. Por ejemplo, aceites líquidos, tales como aceites de cañóla, ricino, coco, coriandro, maíz, semilla de algodón, avellana, cáñamo, linaza, espuma de la pradera, olivo, aceite de palma, semilla de palma, maní, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, pino, camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o crianza tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linolénico, o saturados bajos (cañóla alto oleico, soya bajo linolénico o girasol alto esteárico) , se mezclan físicamente con sus aceites endurecidos (suministros duros) y la mezcla física se ajusta para tener una consistencia apropiada (plasticidad) . Los productos de grasa plástica, tales como margarina y manteca vegetal así producidos tienden a ocasionar la formación de cristalinos relativamente gruesos debido a que grasas y aceites utilizados como la materia prima se componen de ácidos grasos que tienen casi la misma longitud de cadena de carbonos. En otras palabras, tienen una composición altamente unificada de ácidos grasos. Por esta razón, se puede mantener la plasticidad de estos productos en un grado apropiado solamente dentro de un rango de temperatura estrecho, tal que los aceites líquidos contenidos en los mismos tengan una tendencia a exudarse. Provistos en la presente son métodos para hacer o procesar grasas diseñadas de tal manera que tengan una composición variada (y definida) de ácidos grasos. El aceite resultante, v.gr., margarina o manteca vegetal, puede tener un rango más amplio de plasticidad.

En un aspecto, los métodos y composiciones según son provistos en la presente se utilizan para hacer o procesar aceites vegetales, tales como aceites de tipo cañóla, ricino, coco, coriandro, maíz, semilla de algodón, avellana, cáñamo, linaza, espuma de la pradera, olivo, aceite de palma, semilla de palma, maní, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, pino, camelia, variedades de aceites "naturales" teniendo composiciones de ácidos grasos alteradas mediante Organismos Modificados Genéticamente (OMG) o crianza tradicional tales como aceites alto oleico, bajo linolénico, o saturados bajos (cañóla alto oleico, soya bajo linolénico o girasol alto esteárico) utilizando las hidrolasas según son provistas en la presente, incluyendo inter-esterificación y trans-esterificación enzimática, ver, v.gr., la patente US 5,288,619 y la solicitud de patente US 11/567,318. Los métodos y composiciones según son provistos en la presente se pueden utilizar en lugar de la inter-esterificación aleatoria, como se describe, v.gr., en la patente US 3,949,105. En un aspecto, los métodos y composiciones según son provistos en la presente se utilizan en trans-esterificación enzimática para preparar un aceite, v.gr., un aceite de margarina, que tenga un contenido de ácidos grasos de cadena intermedia bajo así como de ácidos trans bajo.

En un aspecto, la estructura simétrica de un aceite, v.gr., un aceite de palma o tipo láurico, se modifica, v.gr., en una estructura aleatoria. Por consiguiente, los métodos según son provistos en la presente se pueden utilizar para modificar las propiedades de los productos de grasa plástica. En un aspecto, la modificación de aceites mediante los métodos según son provistos en la presente se puede diseñar para prevenir o hacer más lento gradualmente el endurecimiento del aceite con el tiempo, en particular cuando se estén almacenando los productos .

En un aspecto, los métodos y composiciones según son provistos en la presente en una mezcla de reacción de trans-esterificación que comprende un material fuente de ácido esteárico y un aceite vegetal líquido comestible, trans-esterifi-can al material fuente de ácido esteárico y al aceite vegetal utilizando una lipasa específica de posiciones 1,3 según es provista en la presente, y luego se hidrogena la mezcla de ácido graso para proporcionar un material fuente de ácido esteárico de reciclo para una reacción de reciclo con el aceite vegetal. Ver, v.gr., la patente US 5,288,619.

En un aspecto, se conduce una reacción de inter-esterificación con una lipasa según es provista en la presente.

En un aspecto, la lipasa según es provista en la presente tiene selectividad para las posiciones 1 y 3 del triacilglicérido para hacer más lento o inhibir un aumento en la cantidad de triacil-glicéridos tri-saturados en el aceite. En esta reacción según es provista en la presente, se pueden superar deficiencias de inter-esterificación aleatoria convencional y la dificultad de inter-esterificación con una lipasa no especifica debido a que la inter-esterificación es conducida por una enzima según es provista en la presente que tiene una especificidad para las posiciones 1 y 3 de los triacilglicéridos . En un aspecto, la exudación de los aceites líquidos contenidos en los productos es más lenta o se impide con un aumento de la temperatura en la reacción para inhibir una elevación en el punto de fusión causada por un incremento en la cantidad de triacilglicéridos tri-saturados. Esto resuelve el problema del endurecimiento de los productos durante el almacenamiento a largo plazo.

Composiciones farmacéuticas y tratamiento de deficiencias de hidrolasa En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos y composiciones (enzimas según son provistas en la presente, v.gr., esterasas, acilasas, lipasas, fosfolipa-sas, o proteasas según son provistas en la presente) que se pueden utilizar en el tratamiento de una deficiencia de hidrolasa en un animal, v.gr., un mamífero, tal como un ser humano. Por ejemplo, en un aspecto, los métodos y las composiciones según son provistos en la presente se utilizan para tratar a pacientes que sufran de una deficiencia de una lipasa pancreática. En un aspecto, la lipasa se administra oralmente. Se puede suministrar una enzima según es provista en la presente en lugar de o con una preparación de enzima pancreática de cerdo.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones farmacéuticas que comprenden polipép-tidos (v.gr., enzimas, péptidos, anticuerpos) según son provistos en la presente. Estas composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de tabletas, pildoras, geles, cápsulas, hidrogeles, rocíos, polvos, aerosoles, implantes, liposomas, cremas, ungüentos, líquidos, una micro-esfera, una partícula de núcleo en partículas múltiples, una emulsión, una suspensión, nano-estructuras y similares. Las composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos (v.gr., enzimas, péptidos, anticuerpos) según son provistos en la presente se pueden administrar en cualquier forma, v.gr ., oralmente, intradérmicamente, intraperi-tonealmente, por I.V., tópicamente, y similares. En un aspecto, las composiciones farmacéuticas según son provistas en la presente se formulan para entrega tópica, sub- lingual, oral, intravenosa, sub-cutánea, intramuscular, trans-dérmica, intraar-terial, intraarticular, o intradérmica .

En un aspecto, las composiciones según son provistas en la presente utilizadas para estos tratamientos son activas bajo condiciones ácidas . En un aspecto, las composiciones según son provistas en la presente se administran oralmente en formulaciones (v.gr., tabletas, pildoras, geles, cápsulas, hidrogeles, rocíos, polvos, aerosoles) que pasen a través de las regiones ácidas del estómago y descargan la enzima solamente en el medio ambiente relativamente alcalino del yeyuno. En un aspecto, se formula una hidrolasa según es provista en la presente con un vehículo tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, derivados de celulosa o gelatina o cualquier otro tal excipiente. También se puede agregar un lubricante tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, o cera de polietileno glicol. Se puede agregar una solución de azúcar concentrada, la cual puede contener aditivos tales como talco, dióxido de titanio, gelatina, o goma arábiga, como un recubrimiento. Se pueden utilizar cápsulas blandas o duras para encapsular una hidrolasa como un líquido o como una preparación sólida. Ver, v.gr., las patentes US 5,691,181; 5,858,755.

Detergentes En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos y composiciones (enzimas, v.gr., lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas según son provistas en la presente) que se pueden utilizar para fabricar y utilizar detergentes. Una hidrolasa según es provista en la presente se puede agregar a, v.gr., mezclar físicamente con, cualquier composición detergente conocida, sólida o líquida, con o sin cambiar la composición detergente. Por ejemplo, se puede agregar una hidrolasa según es provista en la presente a cualquier jabón, v.gr., sulfatos alifáticos tales como sulfatos de alquilo o alquenilo de cadena recta o ramificada, sulfatos de amida, éter-sulfatos de alquilo o alquenilo teniendo un grupo alquilo o alquenilo de cadena recta o ramificada a los cuales se agregan uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno, y óxido de butileno, sulfonatos alifáticos tales como sulfonatos de alquilo, sulfonatos de amida, sulfosuccinatos de dialquilo, sulfonatos de alfa-olefinas , de olefinas de tipo vinilideno, y de olefinas internas, sulfonatos aromáticos tales como alquil-bencenosulfona-tos de cadena recta o ramificada, éter-carbonatos o amidas de alquilo o alquenilo teniendo un grupo alquilo o alquenilo de cadena recta o ramificada al cual se le agregan uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno, y óxido de butileno, o amidas, sales o ésteres de ácidos alfa-sulfo-grasos, tensioactivos de tipo aminoácidos, tensioactivos de fosfato tales como fosfatos ácidos de alquilo o alquenilo, y fosfatos de alquilo o alquenilo, tensioactivos anfotéricos de tipo ácido sulfónico, tensioactivos anfotéricos de tipo betaina, éteres o alcoholes de alquilo o alquenilo que tengan un grupo alquilo o alquenilo de cadena recta o ramificada al cual se le agregan uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno, y óxido de butileno, fenil-éteres de polioxi-etilenalquilo teniendo un grupo alquilo de cadena recta o ramificada al cual se le agregan uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno, y óxido de butileno, alcanolamidas de ácidos grasos superiores o aductos de óxido de alquileno de las mismas, ásteres de ácidos grasos de sacarosa, monoésteres de glicerol de ácidos grasos, óxidos de alquil- o alquenil-amina, tensioactivos catiónicos tipo sal de tetra-alquil-amonio, o una combinación de los mismos. Ver, v.gr., la patente US 5,827,718.

En algunas formas de realización, provistas en la presente son composiciones detergentes que comprenden uno o más polipéptidos (hidrolasas) según son provistos en la presente. Se pueden utilizar las formas de superficie activa y/o no de superficie activa. En un aspecto, la cantidad total de hidrolasa, superficie activa y/o no superficie activa, puede ser de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 1.0%, o de aproximadamente 0.0002% a aproximadamente 0.5% por peso de la composición detergente. En un aspecto de la composición detergente, la hidrolasa de superficie activa es de aproximadamente 5% a aproximadamente 67%, y la hidrolasa no de superficie activa es de aproximadamente 33% a aproximadamente 95% de la actividad de hidrolasa total en la mezcla enzimática. En un aspecto, el pH óptimo de la mezcla enzimática total es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10.5.

En un aspecto, las composiciones detergentes según son provistas en la presente incluyen hidrolasas alcalinas según son provistas en la presente, las cuales funcionan a valores de pH alcalinos, debido a que el pH de una solución de lavado puede estar en un rango de pH alcalino bajo condiciones de lavado ordinarias. Ver, v.gr., la patente US 5,454,971.

Los polipéptidos según son provistos en la presente (enzimas según son provistas en la presente) se pueden utilizar en una composición detergente, las cuales son bien conocidas en la materia, ver, v.gr., las patentes US 5,069,810; 6,322,595; 6,313,081. Por ejemplo, en un aspecto, se proporciona una composición detergente para lavado de ropa. Puede comprender de 0.8 ppm a 80 ppm de una lipasa según es provista en la presente.

Cualquier método para hacer y usar composiciones detergentes puede usarse con enzimas según son provistas en la presente, ver, v.gr., las patentes US 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147. Las composiciones detergentes pueden ser una composición acuosa en una y dos partes, una composición líquida no acuosa, un sólido vaciado, una forma granular, una forma de partículas, una tableta comprimida, una forma de gel, un polvo, un gel, un hidrogel, un liposoma, un aerosol, una pasta y/o una forma de lechada. Las hidrolasas según son provistas en la presente también se pueden utilizar como un producto aditivo de detergente en una forma sólida o líquida. Tales productos aditivos se pretenden para suplementar o potenciar el desempeño de las composiciones detergentes convencionales y se pueden agregar en cualquier etapa del proceso de limpieza.

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos capaces de remover la suciedad gruesa del alimento, películas de residuos de alimentos y otras composiciones alimenticias menores utilizando estas composiciones detergentes. Hidrolasas según son provistas en la presente pueden facilitar la remoción de manchas por medio de hidrólisis catalítica de lípidos, grasas o aceites. Hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en detergentes para lavado de trastes y en detergentes para lavado de textiles.

El contenido real de la enzima activa depende del método de fabricación de una composición detergente y no es crítico, asumiendo que la solución detergente tenga la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de hidrolasas presentes en la composición varía de aproximadamente 0.001 mg a 0.5 mg por gramo de la composición detergente. La enzima particular seleccionada para utilizarse en el proceso y los productos provistos en la presente depende de las condiciones de utilidad final, incluyendo la forma física del producto, pH de uso, temperatura de uso, y tipos de suciedades a ser degradadas o alteradas. La enzima se puede seleccionar para proporcionar actividad y estabilidad óptimas para cualquier conjunto dado de condiciones de servicio. En un aspecto, las hidrolasas provistas en la presente son activas en los rangos de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, y en el rango de temperaturas de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C. Los detergentes según son provistos en la presente pueden comprender tensioacti-vos catiónicos, no iónicos semi-polares , o z iteriónicos ; o mezclas de los mismos.

En una forma de realización, enzimas según son provistas en la presente se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos teniendo un pH de entre 4.0 y 12.0 en niveles de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5% (alternativamente 0.1% a 0.5%) por peso. Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas tales como proteasas, celulasas, lipasas, o endoglicosidasas, endo-beta-1, 4 -glucanasas , beta-glucanasas , endo-beta-1, 3 (4) -glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, arabinanasas , hemicelula-sas, mananasas, xiloglucanasas , xilanasas, acetil-esterasas de pectina, acetil-esterasas de ramnogalacturonano, poligalacturona-sas, ramnogalacturonasas , galactanasas, liasas de pectina, metilesterasas de pectina, celobiohidrolasas , y/o transglutamina-sas. Estas composiciones detergentes también pueden incluir mejoradores de detergencia y estabilizantes.

La adición de las hidrolasas según son provistas en la presente a composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y H adecuados para el detergente también son adecuados para las composiciones de la invención siempre que la enzima sea activa o tolerante al pH y/o temperatura del uso pretendido. Además, las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en una composición limpiadora sin detergentes, nuevamente solas o en combinación con mej oradores de detergencia y estabilizantes.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son composiciones limpiadoras, incluyendo composiciones detergentes para la limpieza de superficies duras, composiciones detergentes para la limpieza de telas, composiciones para lavado de trastes, composiciones para limpieza oral, composiciones limpiadoras de dentaduras, y soluciones limpiadoras de lentes de contacto .

En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para lavar un objeto que comprenden poner en contacto al objeto con un polipéptido según es provisto en la presente bajo condiciones suficientes para lavado. Se puede incluir una hidrolasa según es provista en la presente como un aditivo del detergente. La composición detergente según es provista en la presente puede, por ejemplo, formularse como una composición detergente para lavado de ropa a mano o a máquina comprendiendo un polipéptido según es provisto en la presente. Un aditivo de lavado de ropa adecuado para pre-tratamiento de telas manchadas puede comprender un polipéptido según es provisto en la presente. Una composición suavizante de telas puede comprender una hidrolasa según es provista en la presente. Alternativamente, una hidrolasa según es provista en la presente se puede formular como una composición detergente para utilizarse en las operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar. En aspectos alternativos, aditivos de detergente y composiciones detergentes según son provistos en la presente pueden comprender una o más enzimas diferentes, tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra proteasa, una carbohidrasa, una celulasa, una peetina, una mananasa, una arabinasa, una galacta-nasa, una xilanasa, una oxidasa, v.gr., una lactasa y/o una peroxidasa (ver también anteriormente) . Las propiedades de las enzimas según son provistas en la presente se seleccionan para ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas están presentes en cantidades efectivas. En un aspecto, enzimas según son provistas en la presente se utilizan para remover materiales de mal olor de las telas. Varias composiciones detergentes y métodos para fabricarlas que se pueden utilizar se describen, v.gr., en las patentes US 6,333,301; 6,329,333; 6,326,341; 6,297,038; 6,309,871; 6,204,232; 6,197,070; 5,856,164.

Cuando se formulan como composiciones adecuadas para utilizarse en un método para lavado en máquina lavadora de ropa, las hidrolasas según son provistas en la presente pueden comprender tanto un tensioactivo como un compuesto mejorador de detergencia. Adicionalmente pueden comprender uno o más componentes detergentes, v.gr., compuestos poliméricos orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, supresores de espumas, dispersantes, dispersantes de jabón-cal, agentes de suspensión de suciedad y contra el re-depósito e inhibidores de corrosión. Composiciones para lavado de ropa según son provistas en la presente también pueden contener agentes suavizantes, así como componentes detergentes adicionales. Composiciones conteniendo hidrolasas según son provistas en la presente pueden proporcionar limpieza de telas, remoción de manchas, mantenimiento de blancura, suavización, apariencia del color, inhibición, de transferencia de tinte, e higienización cuando se formulan como composiciones detergentes para lavado de ropa.

La densidad de las composiciones detergentes para lavado de ropa según son provistas en la presente puede estar en el rango de aproximadamente 200 a 1,500 g/1, o de aproximadamente 400 a 1,200 g/1, o de aproximadamente 500 a 950 g/1, o de 600 a 800 g/1 de la composición; ésta se puede medir a aproximadamente 20°C.

La forma "compacta" de las composiciones detergentes para lavado de ropa según son provistas en la presente se refleja mejor por la densidad, y en términos de la composición, por la cantidad de sal de relleno inorgánica. Sales de relleno inorgánicas son ingredientes convencionales de las composiciones detergentes en forma de polvo. En composiciones detergentes convencionales, las sales de relleno están presentes en cantidades sustanciales, típicamente de 17% a 35% por peso de la composición total. En un aspecto de las composiciones compactas, la sal de relleno está presente en cantidades que no exceden 15% de la composición total, o que no exceden 10%, o que no exceden 5% en peso de la composición. Las sales de relleno inorgánicas se pueden seleccionar a partir de sales de metales alcalinos y de metales alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, v.gr., sulfato de sodio .

Composiciones detergentes líquidas según son provistas en la presente también pueden estar en una "forma concentrada" . En un aspecto, las composiciones detergentes líquidas pueden contener una cantidad más baja de agua comparadas con detergentes líquidos convencionales. En aspectos alternativos, el contenido de agua del detergente líquido concentrado es menor que 40%, o menor que 30%, o menor que 20% por peso de la composición detergente. Compuestos detergentes según son provistos en la presente pueden comprender las formulaciones descritas en WO 97/01629.

Hidrolasas según son provistas en la presente pueden ser útiles en la formulación de diferentes composiciones limpiadoras. Un número de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados incluyendo detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwiteriónicos, v.gr., como se divulgan en las patentes US 4,404,128; 4,261,868; 5,204,015. Además, enzimas según son provistas en la presente se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de jabón en barra o líquido, formulaciones para el cuidado de trastes, soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de desechos, aplicaciones textiles, como enzimas de fusión-disociación en producción de proteínas, y similares. Hidrolasas según son provistas en la presente pueden proporcionar un mejor desempeño en una composición detergente según se comparan con otra proteasa detergente, esto es, el grupo enzimático puede aumentar la limpieza de ciertas manchas sensibles a enzimas tales como pasto o sangre, como se determine mediante una evaluación usual después de un ciclo de lavado convencional. Hidrolasas según son provistas en la presente se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos conocidos teniendo pH de entre 6.5 y 12.0 en niveles de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5% (por ejemplo, aproximadamente 0.1% a 0.5%) por peso. Estas composiciones limpiadoras detergentes también pueden incluir otras enzimas tales como otras esterasas, fosfolipasas , proteasas, amilasas, celulasas, lipasas, o endoglicosidasas conocidas, así como mejoradores de detergencia y estabilizantes.

Tratamiento de alimentos y procesamiento de alimentos Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar para la separación de componentes de materiales celulares de planta. Por ejemplo, hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en la separación de material rico en proteína (v.gr., células de planta) en sus componentes, v.gr., sacarosa a partir de remolacha azucarera, o almidón o azúcares a partir de papa, pulpa, o fracciones de cascara. En un aspecto, hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar para separar cultivos ricos en proteína o ricos en aceite en valiosas fracciones de proteína y aceite y cascara. El proceso de separación se puede llevar a cabo mediante la utilización de métodos conocidos en la materia.

Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en la preparación de jugos de frutas o verduras, jarabes, extractos y similares para aumentar su rendimiento. Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar en el tratamiento enzimático (v.gr., hidrólisis de proteínas) de diferentes materiales derivados de paredes celulares de plantas o de materiales de desecho, v.gr., de la producción de vino o jugo, o residuos agrícolas tales como cáscaras vegetales, cascaras de semillas, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de olivo, pulpa de papa, y similares. Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar para modificar la consistencia y apariencia de frutas o verduras procesadas. Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar para tratar material de planta para facilitar el procesamiento del material de planta, incluyendo alimentos, para facilitar purificación o extracción de componentes de plantas. Las hidrolasas según son provistas en la presente se pueden utilizar para mejorar el valor alimenticio, reducir la capacidad.de enlace de agua, mejorar la degradabilidad en plantas de aguas residuales, y/o mejorar la conversión del material de planta en ensilaje, y similares.

Alimentos para Animales y Aditivos para Alimentos o Alimentación En ciertas formas de realización, provistos en la presente son métodos para el tratamiento de alimentos para animales y aditivos de alimentos o alimentación utilizando hidrolasas según son provistas en la presente, animales incluyendo mamíferos (v.gr., humanos), aves, peces, y similares. En otras formas de realización, provistos en la presente son alimentaciones para animales, alimentos, suplementos de alimentación y de alimentos, y aditivos comprendiendo hidrolasas según son provistas en la presente.

En ciertas formas de realización, provistas en la presente son hidrolasas para uso en la modificación de alimentaciones o alimento para animales, v.gr., para procesar al alimento o alimentación ya sea in vitro (mediante la modificación de los componentes de la alimentación o alimento) o in vivo. En otro aspecto, hidrolasas según son provistas en la presente se pueden suministrar mediante expresar las enzimas directamente en cultivos de alimentación transgénicos (como, v.gr., plantas, semillas, y similares, transgénicas) , tales como maíz, frijol de soya, colza, lupina, y similares. En un aspecto, provistas en la presente son plantas transgénicas, partes de plantas y células de plantas comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según es provisto en la presente. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa tal que la hidrolasa según es provista en la presente se produzca en cantidades recuperables. La hidrolasa se puede recuperar a partir de cualquier planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta conteniendo al polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o alimentación, v.gr., mejorando el valor nutricional, sabor, y propiedades reológicas, o para destruir un factor anti-nutritivo .

Inter-esterificación En un aspecto, los métodos y composiciones según son provistos en la presente se pueden emplear para modificar las propiedades de las mezclas de triacilglicéridos , y en un aspecto, su consistencia. En un aspecto, una enzima según es provista en la presente se puede utilizar en la presencia de un catalizador tal como metal de sodio o metóxido de sodio para promover migración de acilo entre moléculas de glicérido tal que los productos consistan en mezclas de glicéridos en las cuales se distribuyan de una manera aleatoria los residuos de acilo grasos entre las moléculas de glicérido.

En un aspecto, las enzimas según son provistas en la presente se pueden utilizar para producir productos de inter-esterificación bajo condiciones de reacción en las cuales se minimice la hidrólisis de grasa tal que la inter-esterificación catalizada por lipasa llegue a ser la reacción dominante. Estas condiciones pueden incluir, por ejemplo, restringir la cantidad de agua en el sistema.

En un aspecto, enzimas según son provistas en la presente se pueden utilizar para catalizar reacciones de inter-esterificación utilizando mezclas de triacilglicéridos y ácidos grasos libres, como se describen, v.gr., en la patente EP 0 093 602 B2. En estos casos, el ácido graso libre se puede intercambiar con los grupos acilo de los triacilglicéridos para producir nuevos triacilglicéridos enriquecidos en el ácido graso agregado. En un aspecto, se pueden utilizar lipasas 1, 3-especificas según son provistas en la presente para confinar la reacción a las posiciones 1 y 3 de los glicéridos, lo cual permite obtener una mezcla de triglicéridos que no se puede obtener mediante la inter-esterificación química o la reacción con una lipasa no específica. En un aspecto, se utilizan lipasas no específicas para obtener resultados similares a los de la inter-esterificación química.

La capacidad para producir mezclas de triacilglicéridos novedosas utilizando lipasas específicas de posición según son provistas en la presente es útil para la industria de aceites y grasas debido a que algunas de estas mezclas tienen propiedades valiosas. Un ejemplo es la inter-esterificación catalizada por lipasa 1 , 3-específica de 1, 3-di-palmitoil-2-monoleína (POP), que es el triacilglicérido principal de la fracción media del aceite de palma, con ya sea ácido esteárico o triestearina para dar productos enriquecidos en las valiosas l-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) y 1, 3-diestearoil-2-monoleína (StOSt) . POSt y StOSt son los componentes importantes de la mantequilla de cacao.

Por consiguiente, un aspecto según es provisto en la presente proporciona una reacción de inter-esterificación para producir equivalentes de mantequilla de cacao a partir de materias primas baratas .

En un aspecto, provistos en la presente son métodos para la producción de un reemplazo de grasa dura utilizando las lipasas 1, 3 -especificas según son provistas en la presente. En un aspecto, un reemplazo de grasa dura comprende una mezcla de la fracción media de palmera y StOSt, POSt o StOSt/POSt de una pureza de cuando menos 85%.

La invención será descrita adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se entenderá que la invención no se limita a tales ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1: Ensayos ejemplares de lipasa-saturasa El siguiente ejemplo describe ensayos ejemplares para clasificar por una actividad de hidrolasa, v.gr., lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, estos ensayos ejemplares se pueden utilizar como clasificaciones de rutina para determinar si un polipéptido está dentro del alcance según es provisto en la presente. Tales ensayos incluyen el uso de compuestos indicadores de pH para detectar la disociación de ácidos grasos a partir de los triacilglicéridos , métodos espectro-fotométricos , HPLC, GC, MS, TLC, y otros. Jaeger (1994) FEMS Microbiol. Rev. 15:29-63; Ader (1997) Aíethods Enzy ol . 286:351-386; Vorderwülbecke (1992) Enzyme Microb. Technol . 14:631-639; Renard (1987) Lipids 22:539-541.

Clasificación para Actividad de Lipasa/Esterasa Se recogen colonias con palillos estériles y se utilizan para inocular individualmente cada uno de los pozos de las placas de micro-titulación de 96 pozos. Los pozos contenían 250 L de medio LB con 100 g/ml de ampicilina, 80 yg/ml de meticilina, y 10% v/v de glicerol (LB Amp/Meth, glicerol) . Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C sin agitación. Cada pozo por lo tanto contuvo un cultivo de material de células de E. coli, cada una de las cuales contenía un pBLUESCRIPT con un inserto de ADN único.

Las placas de 96 pozos se usaron para multiplicar el inoculado en una sola placa (la "placa condensada") conteniendo en cada pozo 200 yL de LBA Amp/Meth, glicerol. Este paso se llevó a cabo utilizando la Herramienta de Réplica de Alta Densidad (HDRT) de un BIOMEK (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, Estados Unidos) con un blanqueador al 1%, agua, isopropanol, ciclo de esterilización en aire seco entre cada inoculación. Cada pozo de la placa condensada por ende contuvo de 10 a 12 clones pBLUESCRIPT diferentes a partir de cada una de las placas de la biblioteca fuente. La placa condensada se cultivó durante 16 horas a 37°C y luego se utilizó para inocular dos placas hijas de micro-titulación de 96 pozos blancas (Polyfiltronics, Inc., Rockland, MA, Estados Unidos) conteniendo en cada pozo 250 L de LB Amp/Meth (sin glicerol) . La placa condensada original se puso en almacenamiento a -80°C. Las dos placas hijas condensadas se incubaron a 37°C durante 18 horas.

La "solución de material de sustrato 600 µ?" de esterasa de cadena corta se preparó como sigue: se disolvieron 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos en el volumen apropiado de DIVISO para producir una solución 25.2 mM. Los compuestos utilizados fueron propionato de 4 -metilumbeliferilo, butirato de 4-metilumbeliferilo, y heptanoato de metilumbeliferilo. Se agregaron 250 microlitros de cada solución de DMSO a aproximadamente 9 mi de regulador HEPES 50 mM, pH 7.5, que contenía Tritón X-100 al 0.6% y 0.6 mg por mi de dodecil maltosida (Anatrace, Maumee, OH) . El volumen se llevó hasta 10.5 mi con el regulador HEPES anterior para producir una suspensión ligeramente nebulosa.

La "solución de material de sustrato 600 µ?" de cadena larga se preparó como sigue: se disolvieron 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos en DMSO hasta 25.2 mM como anteriormente. Los compuestos utilizados fueron elaidato de 4-metilumbeliferilo, palmitato de 4-metilumbeliferilo, oleato de 4-metilumbeli-ferilo, y estearato de 4-metilumbeliferilo. Todos requirieron un breve calentamiento en un baño a 70 °C para lograr la disolución. Se agregaron 250 microlitros de cada solución de DMSO al regulador HEPES, y se diluyeron hasta 10.5 mi como anteriormente. Todos los siete derivados de umbeliferona se obtuvieron en Sigma Chemical Co., (St. Louis, Missouri, Estados Unidos).

Se agregaron 50 µ??? de la "solución de material de sustrato 600 µ?" de esterasa de cadena larga o de esterasa de cadena corta a cada uno de los pozos de una placa condensada blanca, utilizando el BIOMEK para producir una concentración final de sustrato de aproximadamente 100 µ?. Se registraron los valores de fluorescencia (excitación = 326 nm, emisión = 450 nm) en un fluorómetro de lectura de placas inmediatamente después de adición del sustrato. La placa se incubó a 70 °C durante 60 minutos en el caso de los sustratos de cadena larga, y durante 30 minutos a temperatura ambiente en el caso de los sustratos de cadena corta. Se registraron nuevamente los valores de fluorescencia. Los valores de fluorescencia inicial y final se compararon para determinar si hubo un clon activo presente.

Con el fin de aislar el clon individual que llevaba la actividad, las placas Source GenBank se descongelaron y se utilizaron los pozos individuales para inocular individualmente una nueva placa que contenía LB Amp/Meth. Como en lo anterior, la placa se incubó a 37°C para que crecieran las células, y se agregaron 50 L de la solución de material de sustrato 600 µ? utilizando el BIOMEK, y se determinó la fluorescencia. Una vez que se identificó el pozo activo a partir de la placa de fuente, las células de este pozo activo se aplicaron sobre agar con LB/Amp/Meth, y se cultivaron durante la noche a 37°C, para obtener las colonias individuales . Se recogieron ocho colonias individuales con un palillo estéril, y se utilizaron para inocular individualmente los pozos de una placa de microtitula-ción de 96 pozos. Los pozos contenían 250 µ?? de LB Amp/Meth. Las células se cultivaron durante la noche a 37°C sin agitación. Se removió una alícuota de 200 \iL de cada pozo, y se ensayó con los sustratos de cadena larga o corta apropiados como anteriormente . Se identificó el clon más activo, y se utilizaron los 50 µ?· restantes del cultivo para aplicarse a una placa de agar con LB/Amp/Meth. Ocho colonias individuales se recogieron, se cultivaron, y se ensayaron como anteriormente. Se utilizó el clon más activo para inocular 3 mL de cultivos de LB/Amp/Meth, los cuales se cultivaron durante la noche. El ADN del plásmido se aisló a partir de los cultivos, y se utilizó para la secuencia-ción.

Ejemplo 2: Protocolos Ejemplares para Determinación por LCMS de Perfil de Ácidos Grasos Liberados Resultantes de Hidrólisis Enzimática de Aceite Vegetal El siguiente ejemplo describe métodos ejemplares (protocolos) para conducir hidrólisis enzimática de aceite vegetal, tal como aceite de soya (usado en este ejemplo) , ( incluyendo preparación de enzimas) usando, por ejemplo, enzimas según son provistas en la presente. Este ejemplo también describe métodos ejemplares (protocolos) para detectar y cuantificar los ácidos grasos liberados del aceite. El método se describe usando la lipasa SEQ ID NO: 2, pero es aplicable a otras enzimas, incluyendo las enzimas según son provistas en la presente, v.gr. , las enzimas ejemplares teniendo secuencias como se señalan en la SEQ ID NO: 2 y teniendo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas o todas las modifícaciones de residuos de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23.

Expresión de Proteína en Placa de 96 Pozos Profundos: 1. Cultivar clones de lipasa de E. coli durante la noche a 30°C en 1 mL de medio TB conteniendo carbenicilina (100 yg/mL) en placas de 96 pozos profundos. Registrar ubicación e identidad de los clones. 2. Inocular placas de 96 pozos profundos frescas conteniendo medio TB (1 mL; 100 pg/mL de carbenicilina) con los cultivos líquidos (10 yL/pozo) . 3. Incubar al cultivo durante la noche a 30°C mientras se agita a 200 rpm. 4. Inducir expresión de proteína por transferencia de 500 µ?? de cada cultivo durante la noche en una placa de 96 pozos fresca conteniendo medio TB (500 yL/pozo; 100 yg/mL de carbenici-lina) y tetraciclina anhidra (200 ng/mL) . 5. Incubar a 30°C por 2 horas con agitación a 200 rpm. 6. Cosechar células mediante centrifugar cada placa por 10 minutos a 3,000 x g. Remover sobrenadante. Pelotillas de células pueden usarse inmediatamente para ensayos de aceite o almacenarse a -20°C para uso posterior.

Reacción de Hidrólisis Enzimática de Aceite: 1. Añadir 100 ]iL de B-PER (Pierce Chemical, Rockford, IL, Estados Unidos) a cada pelotilla de célula. Si las pelotillas se almacenan a -20°C, permitir descongelar por 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de B-PER. 2. Añadir 400 L de aceite de soya a cada pozo de la placa de 96 pozos profundos. 3. Añadir varias perlas (vidrio 710-1,180 µp?) por pozo. Sellar placas con CAPMATS (Whatman, Florham Park, NJ, Estados Unidos) . 4. Células se lisaron y una emulsión de aceite/enzima/ -regulador se genera usando un molino mezclador (Retsch Inc., Newtown, PA, Estados Unidos) . Poner un par de placas selladas en el molino mezclador y agitar por 30 segundos a una frecuencia de 30 ciclos/segundo. 5. Reemplazar los sellos CAPMATS con un sello permeable al gas. 6. Incubar las placas por 2 horas a 37 °C mientras se agita a 200 rpm.

Extracción de Ácidos Grasos 1. Añadir 1 mL de solvente de extracción (CHCl3:MeOH:HCl 4N (2:1:0.075)) a cada pozo de la placa de 96 pozos profundos . 2. Tomar y vaciar con pipeta la mezcla varias veces hasta que parezca homogénea. 3. Cubrir las placas con un sello de hoja de aluminio. 4. Centrifugar por 5 minutos a 3,000 x g. Cortar abierto el sello usando hoja de rasurar. 5. Penetrar la punta de pipeta a través de la fase superior y transferir 5 pL de la fase inferior a una nueva placa de 96 pozos profundos conteniendo 995 pL/pozo de MeOH (es decir, una dilución 1/200 de la fase inferior) . Tener cuidado de no contaminar con la fase superior. Almacenar mezclas de extracción separadas a 4°C. 6. Transferir 150 pL de la dilución 1/200 de todas las muestras a una placa de poliestireno de 96 pozos. 7. Para prevenir evaporación, sellar en caliente las placas. Asegurarse que el sello no haga contacto con el MeOH pues esto prevendrá adhesión apropiada. 8. Analizar las muestras por LC/MS .

Análisis LC/MS: 1. Muestras sometidas en formato de placa de 96 pozos se inyectan mediante un auto-muestreador HTCPAL (LEAP Technologies, Carrboro, NC, Estados Unidos) en una mezcla isocrática de H20/MeCN (10/90, v/v) y ácido fórmico al 0.1%, entregados por bombas LC-10ADVP (Shimadzu, Kyoto, Japón) a 1.2 mL/min. 2. Separación se logra con una columna de 150 x 2.00 mm SYNERGI MAX-RP ( Phenomenex, Sutter Creek, CA, Estados Unidos) y detección. Cuantificación se completa con un espectrómetro de masa triple-quad API 4000 (Applied Biosystems, Foster, CA, Estados Unidos) usando ionización de electro-rocío (ESI) y monitorización de iones múltiples para masas 277, 279, 281, 255, 283 en el modo de iones negativos. 3. Control de instrumentación y generación de datos se logra con software A ALYST 1.3 (Applied Biosystems, Foster, CA, Estados Unidos) . 4. LC/MS calibrada para cada ácido graso en el rango de 0.5 a 50 µg usando muestras estándar (Sigma) . Este rango se ajusta mejor a una curva estándar de regresión cuadrática que se usa para calcular la cantidad de cada ácido graso liberado en muestras de enzimas.

Ejemplo 3: Protocolos Ejemplares para Clasificación HTP de Bibliotecas de Evolución de Lipasa para Selectividad Incrementada para Hidrólisis de Esteres de Palmitato o Estearato contra Esteres de Oleato El siguiente ejemplo describe métodos ejemplares (protocolos) para clasificación de alto rendimiento (HTP) de "bibliotecas de evolución" de lipasa para selectividad incrementada para hidrólisis de ásteres de palmitato o estearato contra ésteres de oleato. Este método ejemplar (protocolo/clasificación HTP) describe bibliotecas de evolución de lipasa derivadas de la SEQ ID NO: 2, pero es aplicable a otras enzimas, incluyendo las enzimas según son provistas en la presente, v.gr., las enzimas ejemplares teniendo secuencias como se señalan en la SEQ ID NO: 2 y teniendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todas las modificaciones de residuos de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y este método ejemplar (protocolo) es aplicable a otros tipos de bibliotecas.

Estas clasificaciones HTP ejemplares se conducen utilizando dos sustratos fluorógenos: metilumbeliferil ásteres de palmitato o estearato contra metilumbeliferil ésteres de oleato. Flujo de Clasificación HTP: 1. Clones de biblioteca se arreglan en placas de micro-titulación y se ensayan en una clasificación HTP primaria. 2. Clones identificados como teniendo selectividad mejorada se designan como aciertos primarios. 3. Los aciertos primarios son re-arreglados en placas de micro-titulación, y ensayados en una clasificación HTP secundaria . 4. Clones confirmados como teniendo selectividad mejorada se designan como aciertos secundarios. 5. Aciertos secundarios son secuenciados para identificar mutaciones de secuencia presentes y ensayadas en aceite (ver protocolo separado) .

Protocolo de Ensayo HTP 1. Etiquetar con código de barras placas de ensayo de 384 pozos negras; etiquetar con código de barras placas de crecimiento de 384 pozos y llenar 30 µ?/???? de medio LB (100 µg/mL de carbenicilina) . 2. Tomar con aguja o escoger clones en placas de crecimiento y hacer crecer durante la noche a 30°C en una incubadora humidificada . 3. Inducir expresión de lipasa por adición de 30 µ?,/???? de medio LB (100 µg/mL de carbenicilina) conteniendo 4 mg/ml de tetraciclina anhidra e incubar por 2 horas a 30°C. 4. Lisar células mediante añadir 20 µ?/???? de B-PER (Pierce Chemical, Rockford, IL, Estados Unidos) ; mantener a temperatura ambiente hasta que se coloque en el robot. 5. Correr ensayo de actividad de lipasa en el robot (ver mas adelante) . 6. Clones identificados como teniendo selectividad incrementada para MeUMB ésteres de palmitato o estearato sobre MeUMB ésteres de oleato se designan como aciertos. 7. Escoger clones de acierto en placas de 96 pozos profundos conteniendo medio LB (1 mL/pozo; 100 µg/mL de carbenicilina) y cultivar durante la noche a 30°C. 8. Para aciertos primarios, re-arreglar en placas de 384 pozos y repetir los pasos 1-8 en la clasificación secundaria designar clones de acierto como aciertos secundarios. 9. Para aciertos secundarios, después del paso 8 someter para secuenciación.

Protocolo de Ejemplo de Clasificación HTP Automatizado 1. Chabacano: Mezclar y transferir una alícuota (10 xh) de células Usadas a partir de la "Placa de Crecimiento" (ver pasos 1-4 anteriores) a cada una de dos placas de ensayo separadas (1 & 2) . 2. MULTIDROP (Thermo Electron Corporation, Milford, MA, Estados Unidos) : Añadir 70 de sustrato 1 (UMB-16:0) a la placa de ensayo 1; añadir 70 µ?. de sustrato 2 (UMB-18:1) a la placa de ensayo 2. 3. Incubar las placas de ensayo por 20 minutos a 37°C. 4. Leer en fluorímetro: Excitación 360 nm y Emisión 465 nm.

Clones de acierto secundarios determinados por tener secuencias únicas se arreglan y se hacen crecer en placas de 96 pozos y se ensayan en aceite de soya (ver mas adelante) .

Estructuras de Sustratos Fluorogenos usados en Clasificación HTP palmitato de 4-metilumbeliferilo oleato de 4-metilumbeliferilo Ejemplo 4: Evolución Ejemplar para Hidrólisis Mejorada de Esteres de Palmitato o Estearato Usando Tecnología GSSM El siguiente ejemplo describe y resume los resultados de los protocolos de "evolución enz mática" y clasificación ejemplares que identificaron enzimas ejemplares según son provistas en la presente, v.gr., enzimas teniendo una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 2 pero también teniendo una modificación de residuos como se señala en la Tabla 3 o Tabla 4; o enzimas codificadas por un ácido nucleico teniendo una secuencia como se señala en la SEQ ID NO:l pero también teniendo una modificación de residuos como se señala en la Tabla 3 o la Tabla 4. En un aspecto, un ensayo de clasificación ejemplar para identificar estas enzimas ejemplares según son provistas en la presente usó aceite de soya como un sustrato, y los ácidos grasos liberados (hidrolizados) a partir del aceite de soya se caracterizaron, v.gr., como ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico o ácido esteárico.

El aceite de soya tiene la siguiente distribución de ácidos grasos: Linolénico = 8%; Linoleico = 53%; Oleico = 23% Palmitico = 12%; Esteárico = 4%. Por ende, si el porcentaje de ácido palmitico liberado (hidrolizado) a partir del aceite de soya por una enzima ejemplar según es provista en la presente es mayor que 12%, entonces esa enzima tiene una preferencia para hidrolizar (liberar) ácido palmitico.

Clasificación de Palmitasa: haciendo una "Biblioteca de Palmita-sa" Una biblioteca de palmitasa de variantes de la SEQ ID NO:2 se hizo por tecnología GSSM (patente US 6,171,820). Mutaciones puntuales se introdujeron usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, tal que cada codón original se sustituya con cada uno de los 20 aminoácidos codificados naturalmente. Las variantes mutadas se transformaron en el hospedero de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Estados Unidos) para expresión y clasificación. La biblioteca se construyó en un vector de expresión pASK-5, el cual se modificó a partir del vector pASK-IBA (IBA GmbH, Alemania) . Para hacer pASK-5, el enlazador de clonación original se reemplazó con nuevos sitios de clonación, específicamente, la secuencia de Xbal a HindIII de pASK-IBA se reemplazó con la siguiente secuencia: RBS ArgSerHisHisHisHisHisHis TCTAGATAACGAGGGCAAAACCATGGGAGGATCCAGATCTCATCACCATCACCATCACTAAGCTT (SEO ID NO: 21) Xbal Ncol BamHI BglII HindIII La expresión de los variantes de GSSM se indujo con anhidrotetraciclina después de que se lograron las densidades óptimas de célula hospedera.

Enzimas teniendo secuencias de aminoácidos generadas por tecnología GSSM se clasificaron por un protocolo de clasificación de alto rendimiento (HTP) , v.gr., el protocolo descrito en el ejemplo 3, que determinó cual ácido graso se hidrolizó de manera preferencia a partir de una grasa - aceite de soya en este ensayo. La meta del proyecto de evolución fue mejorar la selectividad de palmitato de la secuencia progenitora, SEQ ID NO: 2, sobre aceite. El ensayo comprendió poner en contacto la enzima nueva/de secuencia modificada a aceite de soya, el cual comprende varios ácidos grasos, incluyendo ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico y ácido esteárico (ver % de distribución, listado anteriormente) y medir la cantidad que cada ácido graso se hidrolizó por cada enzima modificada. Una "biblioteca" de secuencias se identificó que permitió que una enzima hidrolizara preferencialmente un ácido palmítico (o un ácido esteárico, ver mas adelante) , a partir del aceite de soya (la así llamada "Biblioteca de Palmitato") : • Clasificaciones primaria y secundaria se condujeron usando clasificación HTP, v.gr., el método descrito en el ejemplo • Secuenciación de mutaciones de aminoácidos identificadas por aciertos secundarios que resultó en la selectividad mejorada para hidrólisis de palmitato contra oleato en una clasificación HTP comparada con, por ejemplo, la secuencia progenitora, SEQ ID NO: 2.

• Para cada variante de codón codificando para una mutación de aminoácidos, un clon se escogió manualmente y se arregló en placas de 96 pozos para ensayo en aceite.

• A partir de los ensayos de aceite la selectividad de las enzimas mutantes para palmitato o estearato u otros ácidos grasos se obtuvo (Tabla 3) .

• El acierto superior produjo palmitato como 59% de los ácidos grasos (FAs) liberados contra (vs) 43% para SEQ ID NO: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un incremento en el factor de selectividad de 3.6 a 4.9.

• Varios clones también mostraron incrementos en la selectividad de estearato.

La Tabla 1, siguiente, resume mutaciones GSSM (ver anteriormente) seleccionadas para inclusión en la "biblioteca de palmitato" a ser combinada por tecnología GeneReassembly (ver ejemplo 5) . En un ensayo ejemplar, catorce (14) mutaciones de un solo aminoácido se identificaron como produciendo los mayores incrementos en hidrólisis de palmitato en ensayos de aceite (ver también Tablas 1, 3 y 4, siguientes) . Residuos son marcados de acuerdo con el orden en que ocurren en la SEQ ID NO: 2 progenitora (ver figura 7) , entre residuos que produjeron incrementos significativos en hidrólisis de palmitato o estearato en ensayos de aceite. El "AA original" en la SEQ ID NO: 2 y mutaciones benéficas ("Nuevos Aminoácidos") , es decir, secuencias ejemplares según son provistas en la presente, son dados. En un aspecto, las mutaciones sencillas a arginina (R) en las posiciones de residuo 163 y 164 pueden incluirse alternativamente tal que esta biblioteca ejemplar incluya clones con las secuencias 163V-164D (SEQ ID N0:2), 163R-164D, y 163V-164R, pero no la secuencia 163R-164R.

Tabla 1 La figura 6A ilustra los efectos de mutaciones GSSM de palmitasa ejemplares sobre hidrólisis de palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora. Para cada una de las catorce (14) solas mutaciones de aminoácidos seleccionadas para inclusión en la biblioteca GeneReassembly de palmitasa, el cambio porcentual en palmitato y estearato liberados, con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora, se trazó. Muchas de estas mutaciones produjeron incrementos significativos en la hidrólisis de palmitato, acompañada por incrementos pequeños a significativos en hidrólisis de estearato. Sin embargo, varias mutaciones ocasionan ligeras disminuciones en hidrólisis de estearato. Los asteriscos denotan mutaciones identificadas como transportando selectividad de tipo saturasa incrementada.

Clasificación de Estearato: haciendo una "Biblioteca de Estearato (Estearatasa) " Una biblioteca de estearatasa de variantes de la SEQ ID N0:2 se hizo por tecnología GSSM (patente US 6,171,820). Mutaciones puntuales se introdujeron usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, tal que cada codón original se sustituya con cada uno de los 20 aminoácidos codificados naturalmente. Las variantes mutadas se transformaron en el hospedero de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Estados Unidos) para expresión y clasificación. La biblioteca se construyó en un vector de expresión pASK-5 (como se describió anteriormente) . La expresión de los variantes de GSSM se indujo con anhidrotetraciclina después de que se lograron las densidades óptimas de célula hospedera.

Enzimas teniendo secuencias de aminoácidos generadas por tecnología GSSM se clasificaron por un protocolo de clasificación de alto rendimiento (HTP) , v.gr., el protocolo descrito en el ejemplo 3, que determinó cual ácido graso se hidrolizó de manera preferencia a partir de una grasa - aceite de soya en este ensayo. El ensayo comprendió poner en contacto la enzima nueva/de secuencia modificada a aceite de soya, el cual comprende varios ácidos grasos, incluyendo ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico y ácido esteárico (ver % de distribución, listado anteriormente) y medir la cantidad que cada ácido graso se hidrolizó por cada enzima modificada. Una "biblioteca" de secuencias se identificó que permitió que una enzima hidrolizara preferencialmente un ácido esteárico (o un ácido palmítico, ver anteriormente) , a partir del aceite de soya (la así llamada "Biblioteca de Estearato") : • Clasificaciones primaria y secundaria se condujeron usando clasificación HTP, v.gr., el método descrito en el ejemplo 3.

• Secuenciación de mutaciones de aminoácidos identificadas por aciertos secundarios que resultó en la selectividad mejorada para hidrólisis de estearato contra oleato en una clasificación HTP comparada con, por ejemplo, la secuencia progenitora, SEQ ID NO: 2.

• Ensayos de aceite de aciertos secundarios secuencia-dos produjeron la selectividad de las enzimas mutantes para palmitato o estearato u otros ácidos grasos (Tabla 3) .

• El acierto superior produjo estearato como 22% de FAs liberados contra 9% para SEQ ID NO: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un incremento en el factor de selectividad de 2.3 a 5.5.

• Varios clones también mostraron incrementos en la selectividad de palmitato.

La Tabla 2, siguiente, resume mutaciones GSSM (ver anteriormente) seleccionadas para inclusión en la "biblioteca de estearatasa" a ser combinada por tecnología GeneReassembly. En un ensayo ejemplar, veintidós (22) mutaciones de un solo aminoácido se identificaron como produciendo los mayores incrementos en hidrólisis de estearato en ensayos de aceite (ver también Tablas 2, 3 y 4, siguientes) . Residuos son marcados de acuerdo con el orden en que ocurren en la SEQ ID NO: 2 "progenitora" , entre residuos que produjeron incrementos significativos en hidrólisis de palmitato o estearato en ensayos de aceite. El "Aminoácido Original" en la SEQ ID NO: 2 y mutaciones benéficas ("Nuevos Aminoácidos"), es decir, secuencias ejemplares según son provistas en la presente, son dados. En un aspecto, la una sola mutación a alanina (A) en la posición de residuo 2223 se incluye como una mutación fija tal que cada clon en esta biblioteca ejemplar contenga esta mutación.

Tabla 2 La figura 6b (ver también anteriormente) ilustra los efectos de doce (12) de las veintidós (22) principales mutaciones GSSM de estearatasa sobre hidrólisis de palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora. Para cada una de las doce (12) solas mutaciones de aminoácidos seleccionadas para inclusión en la biblioteca GeneReassembly de estearatasa, el cambio porcentual en palmitato y estearato liberados, con relación a la SEQ ID NO: 2 progenitora, se trazó. Muchas de estas mutaciones produjeron incrementos significativos en la hidrólisis de estearato, pero disminuciones pequeñas a significativas en hidrólisis de palmitato. Asteriscos denotan mutaciones identificadas como transportando selectividad tipo saturasa incrementada, es decir, incrementos para hidrólisis de palmitato y estearato contra hidrólisis de ácidos grasos insaturados en el aceite, v.gr., oleato, linoleato y linolenato.

Resumen • Clasificación de la "biblioteca GSSM" (ver anteriormente donde la tecnología GSSM se describe en detalle) con base en la SEQ ID NO: 2 progenitora produjo clones mutantes de un solo aminoácido con mejoras significativas en la selectividad de palmitato y estearato, y en selectividad de saturasa, es decir, selectividad para hidrólisis de palmitato y estearato (v.gr., hidrólisis selectiva de palmitato y/o estearato a partir de aceite de soya) .

• Clones se encontraron con mejoras significativas en la selectividad de estearato (hidrólisis selectiva de ácido esteárico sobre otros ácidos grasos) .

• Mutantes GSSM con selectividad de palmitato incrementada (hidrólisis selectiva de ácido palmítico sobre otros ácidos grasos) con relación a la enzima de la SEQ ID NO: 2 se descubrieron.

La Tabla 3 y la Tabla 4, siguientes, describen (resumen adicionalmente) las secuencias de las enzimas hidrolasas ejemplares según son provistas en la presente, v.gr., las enzimas ejemplares teniendo una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 2 y teniendo por lo menos uno (uno, varios o todos) de los cambios de residuos de aminoácidos descritos en las tablas. La Tabla 3 y la Tabla 4 también resumen datos de actividad para enzimas ejemplares seleccionadas; los datos incluyendo enzimas ejemplares particulares concordantes con su actividad de hidrolasa positiva comprendiendo catálisis de hidrólisis de (liberación de) un ácido graso de palmitato o estearato a partir de aceite de soya, según se identifica por un protocolo de clasificación de alto rendimiento (HTP) , como se describe anteriormente .

En la Tabla 3 y la Tabla 4, el término "Aminoácido Original" indica el residuo de aminoácido objetivo (indicado bajo "Residuo de Aminoácido") en la enzima SEQ ID NO: 2 "progenitora" ("objetivo" para variar); y el término "Aminoácidos Nuevos" indica el residuo de aminoácidos recién diseñado (el cual reemplaza al residuo "objetivo" correspondiente en la "secuencia vieja") en la enzima ejemplar (nueva) según es provista en la presente. Listar al residuo de "Nuevo Aminoácido" bajo la columna "estearato" contra "palmitato" indica cual de las dos clasificaciones de ácidos grasos de alto rendimiento (HTP) (es decir, liberación de ácido palmitico en una clasificación, y liberación de ácido esteárico en la otra clasificación, ver ejemplo 3) se usó para detectar (identificar) una enzima particular con la variación de residuo indicada (nueva secuencia de enzima, residuo de "Nuevo Aminoácido" ) .

Por ejemplo, en la primera fila en la Tabla 3, en el residuo de aminoácidos 7, la tirosina (o "Y") a partir de la enzima de la SEQ ID NO: 2 "progenitora" se reemplaza por un residuo de aminoácidos de arginina (o "R"), y esta nueva enzima (Y7R) tiene actividad que difiere de aquella de la enzima progenitora (ver Tabla 3) ; por ejemplo, los "Datos de Aceite" resumen la preferencia del sustrato (ácido graso) de la nueva enzima (v.gr., la enzima Y7R) mediante listar los ácidos grasos liberados (hidrolizados) cuando la enzima se expuso a (se puso en contacto con) aceite de soya (ensayos descritos anteriormente) , notando que el aceite de soya de sustrato tiene varios grupos constituyentes de ácido graso hidrolizables posibles, incluyendo ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico.

Por ejemplo, en la primera fila, para la enzima Y7R, 8.3% de los ácidos grasos liberados (a partir del aceite de soya reaccionado) fueron ácido linolénico, 22.1% de los ácidos grasos liberados fueron ácido linoleico; 19.7% de los ácidos grasos liberados fueron ácido oleico; 41.5% de los ácidos grasos liberados fueron ácido palmítico; 8.4% de los ácidos grasos liberados fueron ácido esteárico (estos cuatro números suman 100%) .

La columna P+S suma ambos de los puntos de datos P y S para resumir cuando de los ácidos grasos totales liberados fueron ácido palmítico y ácido esteárico (41.5% mas 8.4% = 49.9% de los ácidos grasos hidrolizados fueron ácido palmítico y ácido esteárico, o "P + S") . t t o TABLA 3 Aciertos de Clasi icación HTP Residuo de Nuevo Aminoácido de Nuevo Aminoácido de Aminoácidos Aminoácido Original Palmitato Estearato P + s 7 Y R 49.9% 8 G E, A213R 12 F 47.8% K 54.2% L 45.4% M 43.4% 16 D M 43.2% 18 P G 41.8% 20 I L 50.3% to V 44.6% 22 T M, G215V 52.1% 27 G Q 57.2% S 43.6% 29 A G 51.5% 32 G E escala D, L180E 44.6% 34 L E 45.8% V escala 36 D A 51.0% G 50.9% 40 V P 32.2% 42 V I 47.2% O 43 L L 47.8% V 51.5% 45 G A 44.4% L 52.7% 48 A G 45.4% V 70.1% V 55.7% T 33.6% 54 S H 55.6% 61 D A 60.5% E 55.0% S 49.8% 62 V E E 53.0% A 56.6% G 56.5% M 51.9% N 49.7% Q 52.4% s 55.5% T 50.7% D 52.5% L W 50.2% 66 A N 54.2% R 52.1% 12 R E 58.3% K 61.0% P 27.2% s 55.3% T 55.9% Y 50.1% o 92 A D 47.3% E 59.3% R 42.6% S 48.7% T 52.1% V 57.5% 93 V M 48.2% 96 A c C 51.4% I I escala s s 46.8% 98 G A 45.0% L escala 101 K A 49.8% 103 I L 36.8% 107 W P 46.20% A 39.51 C 39.4% G 47.5% H 42.0% R 68.0% S 36.8% L 64.8% P, E217Q 46.2% V 37.8% V, E217Q 44.80% 108 S paro 19.0% A 43.0% C 26.0% G 47.5% K 57.8% L 44.0% P 56.9% Q 58.6% R 54.7% V 53.4% T, ?218? E, E217Q 46.50% 109 L M 49.0% 110 G L 54.4% 113 Y E 35.8% G 39.8% F 36.5% 116 E A 66.6% F 54.7% G 53.8% H 57.9% L 58.5% L 55.1% P 58.0% Q 59.6% Q 60.5% R, H140R 60.6% R 61.8% S 58.6% S 59.7% T 67.6% V 67.8% R, H140R 117 L R, I161L 54.1% R 51.6% t- o 120 K I 46.7% L L 60.8% F 52.6% M 49.9% S S 53.3% 132 G D, S212A 56.2% 133 S A 53.2% A 55.8% G 45.6% P 56.0% R 51.7% T 54.9% V, L139H 53.2% 134 P G 7.2% R 135 F K 51.8% 139 L H, S133V 53.2% 140 H K 45.5% R, E116R 141 A R 40.2% T 43.3% 142 N M 46.1% R 53.8% S 43.2% T 64.3% 146 K s 50.2% G 49.4% L 51.6% A 52.2% o 147 I F 56.5% F 50.5% L 52.2% 150 A L 59.7% L 53.3% 151 I A 48.6% G 53.0% H 60.0% P 33.7% S 52.2% T 49.2% 152 N E 28.0% G 53.0% H 46.7% M 35.7% R 21.1% 155 T C 51.1% 157 D S 50.4% G 48.7% T 54.7% 158 K A 51.2% 159 L M 51.5% 160 P T 52.8% 161 I I, L117R 54.1% L 51.6% 162 P K escala R escala 163 V E 55.7% R 63.9% T 49.7% O 164 D A 42.1% E escala H 39.8% K 49.4% L escala R 61.3% S 47.9% T 53.0% V 42.3% w escala 166 Q G 49.9% N 41.3% R escala 167 I R R 53.3% S S 47.3% 170 P Q 45.6% ñ 52.5% A, S212H 34.7% 171 V K 34.1% 172 R F 51.7% B 54.9% s 40.2% 178 S K 50.6% 180 L ? 54.0% ? 44.6% Q escala F, G32D 44.6% 183 V I escala 193 P 49.4% t o o 215 G A A 56 6% I 54 1% L 29 9% H 50 2% S 52 1% M 47 9% V 55 6% P 47 3% c 60 4% w 52 8% paro 53 9% V, T22M 52 1% 216 A T T 50 9% 41 9% Y 34 8% V 56 9% C 59 7% S 55 0% L 55 6% 217 E Q 36 6% R 59 4% S 53 5% A 46 2% G 44 8% P 46 2% 218 A M 42 5% H H 49 1% Q Q 47 7% R 53 4% W 51 9% s 51 1% T 50 0% K 52 4% R, GBE R, 228K o TABLA 3 (continuación) Residuo de Ácidos Grasos Librados a partir de Aceite por Enzima P+S Aminoácidos Linolénico L noleico Oleico Palmi ico Esteárico 7 8.3% 22.1% 19.7% 41.5% 8.4% 49.9% 8 12 11.5% 13.0% 27.7% 38.5% 9.3% 47.8% 5.2% 22.1% 18.5% 47.2% 7.1% 54.2% 14.7% 13.9% 26.0% 34.4% 11.0% 45.4% 10.3% 12.8% 33.6% 34.0% 9.4% 43.3% 16 7.2% 25.1% 24.6% 36.1% 7.1% 43.2% o 18 12.5% 20.0% 25.7% 36.2% 5.6% 41.8% 20 8.2% 21.2% 20.3% 38.5% 11.7% 50.3% 12.2% 23.2% 20.0% 40.1% 4.5% 44.6% 22 8.0% 19.5% 20.4% 47.1% 5.0% 52.1% 27 7.5% 17.6% 17.6% 47.4% 9.8% 57.2% 9.1% 23.2% 24.0% 35.8% 7.8% 43.6% 29 9.0% 19.9% 19.6% 40.9% 10.7% 51.5% 32 19.8% 29.1% 34.0% escala 17.1% escala 14.6% 12.1% 28.7% 36.6% 7.9% 44.6% 34 5.6% 31.0% 17.5% 40.9% 4.9% 45.8% 21.1% 35.3% 37.1% escala 6.5% escala 36 7.1% 22.1% 19.9% 43.8% 7.1% 51.0% 8.7% 22.9% 17.6% 48.2% 2.7% 50.9% 40 0.0% 51.4% 16.4% 22.4% 9.7% 32.2% 42 14.8% 12.1% 25.8% 34.6% 12.6% 47.2% 43 7.7% 13.9% 30.7% 34.8% 5.9% 44.4% 8.9% 19.9% 19.7% 49.7% 3.0% 52.7% 45 10.3% 23.8% 21.5% 38.5% 5.9% 44.4% 5.9% 22.3% 19.1% 49.7% 3.0% 52.7% 48 15.0% 18.0% 21.7% 38.1% 7.2% 45.4% 4.3% 11.5% 14.2% 61.0% 9.1% 70.1% 7.6% 17.3% 19.4% 43.8% 12.0% 55.7% 23.6% 13.4% 29.3% 22.5% 11.1% 33.60% 54 8.1% 19.3% 17.0% 48.4% 7.3% 55.6% 61 5.6% 19.8% 14.1% 53.9% 6.6% 60.5% 6.4% 20.1% 18.5% 47.3% 7.7% 55.0% 7.7% 19.9% 22.6% 41.5% 8.3% 49.8% O 62 7.6% 18.8% 20.7% 44.6% 8.3% 53.0% 9.2% 17.6% 16.6% 45.6% 11.0% 56.6% 6.7% 20.3% 16.5% 47.6% 8.8% 56.5% 7.7% 20.9% 19.5% 44.9% 6.9% 51.9% 7.9% 21.7% 20.7% 40.7% 9.0% 49.7% 8.5% 20.8% 18.4% 42.6% 9.8% 52.4% 5.4% 26.0% 13.1% 37.0% 18.5% 55.5% 10.0% 21.9% 17.5% 40.2% 10.5% 50.7% 6.1% 23.2% 18.2% 47.1% 5.4% 52.5% 9.9% 21.3% 18.6% 46.7% 3.6% 50.2% 66 7.5% 16.8% 21.5% 48.0% 6.2% 54.2% 11.4% IB.0% 18.5% 47.2% 4.8% 52.1% 72 7.9% 16.5% 17.3% 54.2% 4.1% 58.3% 4.4% 20.7% 13.9% 52.2% 8.7% 61.0% 6.8% 44.6% 21.4% 20.2% 7.0% 27.2% 8.6% 17.3% 18.8% 45.7% 9.6% 55.3% 7.5% 17.4% 19.3% 45.1% 10.7% 55.9% 6.7% 23.1% 20.1% 40.2% 9.9% 50.1% 4 74 7.4% 19.6% 19.3% 45.4% 8.4% 53.8% 8.0% 19.3% 18.0% 44.8% 10.0% 54.8% 8.7% 20.5% 18.6% 42.2% 10.1% 52.3% 7.1% 21.7% 20.7% 41.1% 9.4% 50.5% 77 10.3% 41.0% 10.6% 17.8% 20.4% 38.1% 78 9.3% 22.5% 20.6% 43.8% 3.4% 47.1% 26.2% 23.0% 13.8% 15.4% 21.7% 37.1% 14.4% 13.2% 31.4% 32.3% 3.6% 40.9% 80 7.4% 21.0% 19.7% 42.9% 9.0% 51.9% 82 13.0% 28.3% 21.4% 33.3% 4.0% 37.3% 83 7.5% 20.0% 24.7% 31.1% 16.6% 47.7% 6.8% 18.6% 15.3% 51.5% 7.8% 59.3% 84 0.0% 32.4% 27.4% 21.0% 19.2% 40.2% t O 87 12.7% 11.9% 26 2% 39.7% 9.5% 49.2% 14.5% 11.8% 27 6% 33.1% 13.0% 46.1% 9.3% 12.3% 34 5% 32.7% 11.2% 43.9% 12.2% 10.5% 30 8% 33.6% 13.0% 46.6% 10.6% 9.9% 26 .2% 40.6% 12.7% 53.3% 14.4% 12.4% 27 .9% 36.0% 9.2% 45.2% 6.7% 25.8% 24 .7% 39.5% 3.3% 42.8% 4.4% 23.2% 19 4% 48.5% 4.5% 52.9% 11.7% 11.3% 26 7% 31.5% 18.8% 50.3% 88 14.1% 13.4% 27 .9% 34.7% 9.9% 44.6% 13.4% 15.2% 21 .0% 36.7% 13.6% 50.3% 13.3% 12.5% 28 .3% 32.5% 13.4% 45.9% 13.0% 9.2% 28 .7% 40.3% 8.8% 49.1% 2.9% 22.5% 15 .0% 59.0% 0.7% 59.6% 4.2% 35.5% 11 .4% 35.6% 13.3% 48.9% 14.7% 9.7% 28 .5% 34.9% 12.2% 47.1% 89 0.0% 35.4% 10 .1% 39.0% 15.5% 54.5% 92 13.1% 16.1% 23 .5% 36.4% 10.9% 47.3% 12.0% 10.4% 18 .2% 48.0% 11.4% 59.3% 13.5% 11.3% 32 .6% 34.8% 7.7% 42.6% 8.3% 25.1% 17 .9% 46.1% 2.6% 48.7% 13.7% 9.8% 24 .4% 39.6% 12.5% 52.1% 4.9% 20.0% 17 5% 51.7% 5.8% 57.5% 93 11.7% 9.3% 30 .8% 40.8% 7.4% 48.2% 96 10.3% 12.4% 25 .9% 37.8% 13.6% 51.4% 17.5% 35.4% 35 .5% escala 11.6% escala 12.5% 12.0% 28 .7% 33.3% 13.6% 46.8% 98 13.4% 19.9% 21 .7% 39.7% 5.3% 45.0% 18.5% 30.8% 36 8% escala 13.9% escala 101 9.8% 12.5% 27 .9% 39.7% 10.1% 49.8% t o 107 11.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.20% 0.0% 20.4% 40.1% 12.1% 27.4% 39.5% 0.0% 29.6% 30.9% 6.8% 32.6% 39.4% 0.0% 29.6% 22.9% 9.5% 38.0% 47.5% 2.2% 12.0% 43.9% 22.0% 19.9% 42.0% 30.4% 12.5% 46.2% 10.9% 57.1% 68.0% 12.0% 20.5% 30.7% 5.2% 31.6% 36.8% 5.0% 16.0% 14.2% 62.2% 2.6% 64.3% 11.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.2% 0.0% 15.6% 46.5% 10.2% 27.6% 37.8% 13.2% 21.6% 20.4% 31.3% 13.5% 44.80% 108 9.0% 49.0% 23.0% 12.3% 6.7% 19.0% 0.0% 51.0% 6.1& 33.1% 9.9% 43.0% 11.0% 18.4% 44.6% 4.1% 21.9% 26.0% 0.0% 29.6% 22.9% 9.5% 38.0% 47.5% 0.0% 32.0% 10.2% 53.5% 4.3% 57.8% 0.0% 45.6% 10.4% 38.2% 5.8% 44.0% 0.0% 28.4% 14.7% 51.2% 5.7% 56.9% 5.4% 18.9% 17.2% 52.8% 5.8% 58.6% 0.0% 10.6% 34.7% 5.9% 48.8% 54.7% 0.0% 21.9% 24.7% 32.7% 20.8% 53.4% 12.1% 13.9% 27.6% 33.8% 12.7% 46.50% 109 10.9% 8.8% 31.3% 37.7% 11.3% 49.0% 110 0.4% 21.4% 23.9% 54.4% 0.0% 54.4% 113 5.0% 44.1% 15.1% 21.0% 14.8% 35.8% 13.6% 14.6% 32.0% 15.2% 24.6% 39.8% 13.9% 25.9% 23.7% 36.5% 0.0% 36.5% t o 116 4.8% 17.4% 11.2% 55.5% 11.1% 66.6% 7.8% 17.7% 19.8% 47.0% 7.7% 54.7% 3.3% 26.7% 16.1% 33.1% 20.7% 53.8% 7.3% 18.3% 16.5% 47.8% 10.1% 57.9% 4.3% 22.9% 14.2% 54.3% 4.2% 58.5% 4.6% 26.8% 13.5% 41.6% 13.5% 55.1% 0.0% 32.4% 9.6% 38.3% 19.8% 58.0% 8.1% 16.1% 16.2% 50.4% 9.3% 59.6% 7.3% 20.5% 11.7% 49.2% 11.2% 60.5% 6.9% 19.6% 12.9% 52.1% 8.5% 60.6% 5.4% 17.4% 15.4% 50.8% 11.0% 61.8% 8.7% 18.7% 13.9% 49.1% 9.5% 58.6% 6.7% 22.8% 10.8% 46.3% 13.4% 59.7% 6.4% 17.2% 8.8% 50.3% 17.2% 67.6% 5.6% 17.6% 9.0% 59.0% 8.8% 67.8% 117 6.2% 21.4% 18.3% 46.0% 8.0% 54.1% 8.9% 21.8% 17.7% 40.6% 11.0% 51.6% 120 15.3% 17.9% 20.1% 44.4% 2.3% 46.7% 7.5% 15.4% 16.3% 51.3% 9.5% 60.8% 17.3% 4.4% 25.7% 44.0% 8.6% 52.6% 4.1% 25.5% 20.5% 36.9% 13.0% 49.9% 15.7% 10.1% 20.9% 36.8% 16.5% 53.3% 132 0.0% 32.8% 10.9% 56.2% 0.0% 56.2% 133 6.6% 20.7% 19.5% 49.9% 3.3% 53.2% 9.3% 18.3% 16.5% 45.1% 10.8% 55.8% 3.3% 30.4% 20.7% 45.6% 0.0% 45.6% 0.0% 34.3% 9.6% 56.0% 0.0% 56.0% 13.2% 12.9% 22.2% 42.7% 9.0% 51.7% 10.1% 11.6% 23.3% 46.5% 3.4% 54.9% 0.0% 35.9% 10.9% 46.9% 6.3% 53.2% 134 0.0% 56.2% 36.6% 7.2% 0.0% 7.2% 135 0.0% 41.1% 7.2% 51.8% 0.0% 51.8% 139 0.0% 35.9% 10.9% 46.9% 6.3% 53.2% t o 140 9.7% 23.4% 21.4% 32.7% 12. B% 45.5% 141 11.2% 12.1% 36.5% 28.2% 12.1% 40.2% 14.7% 13.9% 28.1% 38.3% 5.0% 43.3% 142 16.3% 18.8% 18.8% 10.3% 35.7% 46.1% 0.0% 34.5% 11.7% 43.4% 10.5% 53.8% 8.6% 15.8% 32.5% 22.8% 20.4% 43.2% 2.4% 9.6% 23.7% 47.7% 16.7% 64.3% 144 0.0% 14.9% 51.2% 13.4% 20.4% 33.9% 146 13.6% 10.3% 26.0% 31.4% 18.7% 50.2% 12.6% 12.4% 25.5% 36.5% 12.9% 49.4% 6.6% 22.4% 19.5% 48.2% 3.4% 51.6% 9.0% 19.7% 19.0% 41.7% 10.5% 52.2% 147 8.0% 17.9% 17.6% 48.8% 7.7% 56.5% 7.2% 24.5% 17.9% 33.0% 17.4% 50.5% 9.5% 20.6% 17.7% 42.2% 9.9% 52.2% 150 7.7% 15.1% 17.5% 50.4% 9.2% 59.7% 7.5% 20.6% 18.6% 41.3% 12.0% 53.3% 151 7.8% 26.1% 17.5% 46.4% 2.2% 48.6% 5.0% 29.6% 12.4% 48.9% 4.1% 53.0% 0.0% 25.5% 14.5% 55.5% 4.5% 60.0% 0.0% 14.2% 52.1% 20.0% 13.7% 33.7% 0.0% 17.3% 30.5% 43.3% 8.9% 52.2% 8.0% 22.7% 20.2% 44.0% 5.1% 49.2% 152 0.0% 56.3% 15.7% 23.6% 4.4% 28.0% 8.0% 12.7% 26.3% 22.5% 30.5% 53.0% 0.0% 27.1% 26.2% 26.2% 20.5% 46.7% 0.0% 20.1% 44.2% 24.8% 10.8% 35.7% 9.5% 31.2% 38.3% 2.2% 18.9% 21.1% 155 18.4% 4.9% 25.6% 41.5% 9.5% 51.1% o 157 7.9% 19.5% 22 2% 41.2% 9.2% 50.4% 9.6% 21.7% 20 1% 39.1% 9.6% 48.7% 7.2% 25.2% 13 0% 34.9% 19.8% 54.7% 158 14.0% 1.2% 33 5% 42.8% 8.5% 51.2% 159 6.3% 28.4% 13 8% 36.7% 14.8% 51.5% 160 5.6% 20.8% 20 8% 46.6% 6.2% 52.8% 161 6.2% 21.4% 18 3% 46.0% 8.0% 54.1% e.9% 21.8% 17 7% 40.6% 11.0% 51.6% 162 10.2% 45.6% 33 4% escala 5.7% escala 22.1% 39.2% 32 7% escala 6.0% escala 163 5.9% 22.9% 15 5% 47.4% 8.3% 55.7% 8.6% 17.1% 10 4% 61.4% 2.5% 63.9% 6.4% 23.5% 20 4% 45.7% 4.0% 49.7% 164 8.4% 26.9% 22 6% 39.2% 2.9% 42.1% 13.0% 38.4% 37 5% escala 11.2% escala 9.6% 29.5% 21 1% 35.1% 4.7% 39.8% 17.6% 12.3% 20 5% 38.7% 10.7% 49.4% 23.3% 23.1% 39 1% escala 14.5% escala 6.5% 15.2% 17 1% 58.0% 3.3% 61.3% 9.1% 23.1% 19 8% 40.1% 7.8% 47.9% 9.2% 20.1% 17 7% 41.2% 11.8% 53.0% 15.6% 17.7% 24 4% 29.9% 12.4% 42.3% 15.9% 37.0% 35 5% escala 11.7% escala 166 5.5% 21.8% 22 8% 44.5% 5.4% 49.9% 14.6% 22.3% 21 8% 33.2% 8.1% 41.3% 22.3% 33.3% 36 8% escala 7.6% escala 167 7.2% 19.4% 20 1% 44.6% 8.4% 53.3% 10.0% 21.9% 20 7% 36.3% 11.0% 47.3% 170 12.5% 12.4% 29 4% 37.8% 7.8% 45.6% 8.5% 18.2% 20 8% 43.0% 9.5% 52.5% 3.5% 22.0% 39 8% 8.9% 25.9% 34.7% O 171 8.0% 22 4% 35 5% 33 4% 0.7% 34.1% 172 8.0% 18 8% 21 4% 43 6% 8.1% 51.7% 7.4% 19 .1% 18 6% 45 1% 9.8% 54.9% 22.5% 0. 0% 37 3% 40 2% 0.0% 40.2% 178 14.5% 12 9% 22 0% 32 3% 18.3% 50.6% 180 8.6% 19 .0% 18 5% 42 1% 11.8% 54.0% 11.8% 14 .2% 29 3% 32 1% 12.5% 44.6% 11.5% 40 .0% 36 3% escala 12.2% escala 14.6% 12 .1% 28 7% 36 6% 7.9% 44.6% 183 10.6% 35 .4% 40 7% escala 13.3% escala 193 3.0% 32 .4% 15 2% 49 4% 0.0% 49.4% 194 10.9% 38 .7% 42 0% escala 8.4% escala 9.6% 21 .8% 20 7% 34 6% 13.2% 47.9% 12.6% 31 .0% 37 8% escala 18.6% escala 3.0% 32 .4% 15 2% 49 4% 0.0% 49.4% 197 9.8% 0. 0% 50 9% 39 .4% 0.0% 39.4% 198 7.7% 19 .7% 16 6% 46 8% 9.3% 56.1% 200 8.5% 16 .8% 19 3% 48 7% 6.7% 55.3% 204 13.7% 12 .8% 27 6% 32 .2% 13.7% 45.9% 9.9% 14 .0% 30 5% 23 .2% 22.5% 45.7% 210 7.2% 22 .0% 20 7% 39 .0% 11.2% 50.2% <-> o 211 9.0% 16.2% 39.4% 24.0% 11.2% 35.3% 10.2% 17.0% 24.7% 35.7% 12.4% 48.1% 13.8% 10.4% 36.5% 24.1% 15.3% 39.4% 6.5% 12.2% 36.3% 30.5% 14.5% 45.0% 6.9% 26.6% 16.1% 32.7% 17.7% 50.3% 3.4% 36.2% 27.7% 32.6% 0.0% 32.6% 6.9% 26.5% 20.5% 28.9% 17.3% 46.1% 0.0% 35.1% 15.6% 39.6% 9.7% 49.2% 0.0% 25.3% 19.5% 46.8% 8.4% 55.2% 6.6% 19.7% 25.9% 37.2% 10.6% 47.8% 7.7% 22.8% 20.7% 36.6% 12.3% 48.9% 16.3% 4.6% 28.2% 49.1% 1.7% 50.8% 8.0% 22.1% 17.2% 41.2% 11.5% 52.7% 8.0% 22.1% 17.2% 41.2% 11.5% 52.7% 18.2% 3.2¾ 28.7% 42.4% 7.5% 49.8% 11.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.2% 212 7.5% 25.6% 17.6% 36.5% 12.8% 49.3% 19.1% 0.9% 29.7% 46.8% 3.5% 50.3% 8.B% 28.4% 9.6% 33.7% 19.5% 53.2% 19.4% 24.8% 18.9% 33.5% 3.3% 36.8% 19.1% 26.9% 17.5% 31.6% 4.9% 36.6% 5.5% 42.3% 7.9% 30.8% 13.5% 44.3% 4.6% 23.9% 25.1% 35.5% 11.0% 46.5% 8.8% 28.4% 9.6% 33.7% 19.5% 53.2% 0.0% 65.4% 22.4% 10.5% 1.7% 12.2% 3.3% 14.2% 40.6% 30.7% 11.1% 41.8% 11.2% 13.6% 25.0% 40.3% 9.9% 50.2% 10.6% 16.6% 19.1% 42.7% 11.0% 53.7% 21.1% 22.7% 17.4% 17.5% 21.2% 3B.7% 7.6% 24.0% 20.0% 38.9% 9.5% 48.4% 10.3% 20.4% 22.2% 33.7% 13.4% 47.1% 3.5% 22.0% 39.8% 8.9% 25.9% 34.7% 213 7.6% 28.2% 16.3% 30.4% 17.5% 47.9% 5.3% 18.8% 18.1% 41.3% 16.4% 57.7% 7.5% 21.0% 14.8% 48.5% 8.2% 56.7% 8.3% 17.8% 18.5% 44.6% 10.9% 55.5% O 214 9.1% 20.2% 19 1% 47.0% 4.5% 51.6% 8.3% 19.8% 18 9% 44.6% 8.4% 53.0% 7.7% 20.5% 19 6% 45.3% 7.0% 52.2% 7.1% 21.5% 16 9% 42.4% 12.1% 54.5% 7.0% 25.9% 15 1% 39.9% 12.0% 51.9% 6.9% 18.0% 18 3% 48.5% 8.4% 56.9% 7.4% 19.2% 18 2% 45.6% 9.5% 55.1% 5.3% 21.1% 10 9% 47.3% 15.4% 62.7% 5.3% 21.1% 10 9% 47.3% 15.4% 62.7% 215 7.8% 19.8% 15 8% 46.4% 10.2% 56.6% 7.9% 20.2% 17 7% 40.6% 13.6% 54.1% 20.0% 24.8% 25 4% 25.7% 4.1% 29.9% 4.4% 26.2% 19 2% 45.1% 5.1% 50.2% 8.1% 19.6% 20 1% 42.7% 9.4% 52.1% 2.3% 30.1% 19 7% 31.8% 16.1% 47.9% 5.9% 23.7% 14 8% 39.3% 16.3% 55.6% 9.6% 26.0% 17 0% 36.5% 10.9% 47.3% 4.7% 20.8% 14 1% 42.2% 18.2% 60.4% 4.2% 31.0% 12 0% 40.7% 12.1% 52.8% 6.7% 21.3% 18 1% 41.7% 12.3% 53.9% 8.0% 19.5% 20 4% 47.1% 5.0% 52.1% 216 8.3% 21.9% 18 9% 40.9% 10.0% 50.9% 0.0% 28.0% 30 1% 22.8% 19.1% 41.9% 34.6% 0.0% 30 6% 33.7% 1.1% 34.8% 7.3% 17.8% 17 9% 47.0% 10.0% 56.9% 6.6% 16.6% 17 2% 50.0% 9.7% 59.7% 7.7% 18.1% 19 2% 44.5% 10.5% 55.0% 7.5% 20.3% 16 5% 45.0% 10.6% 55.6% 217 0.0% 42.3% 21 0% 24.3% 12.3% 36.6% 6.8% 16.7% 17 1% 50.1% 9.3% 59.4% 7.4% 20.5% 18 7% 44.1% 9.4% 53.5% 11.9% 10.1% 31 8% 30.5% 15.7% 46.2% 13.2% 21.6% 20 4% 31.3% 13.5% 44.8% 12.1% 13.9% 27 6% 33.8% 12.7% 46.2% O 218 0.7% 39.0% 17.8% 30.3% 12.1% 42.5% 4.7% 26.8% 19.4% 30.5% 18.7% 49.1% 7.1% 22.8% 22.4% 38.3% 9.4% 47.7% 7.2% 19.9% 19.6% 44.1% 9.2% 53.4% 8.5% 19.7% 19.9% 42.2% 9.7% 51.9% 7.2% 25.9% 15.8% 37.6% 13.5% 51.1% 3.0% 21.1% 20.9% 41.9% 8.2% 50.0% 8.7% 19.9% 19.0% 42.9% 9.4% 52.4% 223 4.5% 29.5% 17.2% 15.8% 33.0% 48.8% 0.0% 38.4% 30.1% 31.6% 0.0% 31.6% 20.2% 22.8% 33.6% 17.3% 6.0% 23.4% 19.0% 37.0% 34.9% escala 9.1% escala 224 8.0% 20.5% 22.1% 41.0% 8.4% 49.5% 6.6% 18.2% 17.1% 51.4% 6.8% 58.2% 7.9% 22.1% 21.6% 37.0% 11.4% 48.4% 14.4% 19.0% 24.9% 33.1% 8.5% 41.7% 3.1% 26.3% 24.2% 40.8% 5.6% 46.4% 10.3% 20.1% 25.8% 38.1% 5.7% 43.7% 225 9.7% 22.2% 18.8% 41.8% 7.5% 49.3% 4.3% 23.5% 17.8% 47.9% 6.4% 54.3% 12.0% 21.9% 17.1% 39.1% 9.9% 49.0% 12.9% 23.8% 17.5% 34.1% 11.7% 45.8% 15.9% 22.6% 18.3% 38.0% 5.2% 43.2% 226 4.9% 24.9% 21.9% 45.8% 2.5% 48.3% 6.5% 29.5% 22.8% 32.4% 8.8% 41.2% 227 13.6% 23.1% 21.9% 38.3% 3.2% 41.4% La Tabla 4 es un resumen, o compilación adicional, de datos mostrados en la Tabla 3 (anterior) . Por ejemplo, el término "posición" indicado en la posición de residuo de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2; el término "Aminoácido Original", como en la Tabla 3, indica el residuo "progenitor" no alterado", mientras que el término "Aminoácido Nuevo" como en la Tabla 3, indica el residuo de aminoácido alterado (nuevo) en esa posición. Los términos "WT_P" y "WT_S" indican la preferencia (liberación de ácidos grasos) del sustrato de la enzima "progenitora" , v.gr., la SEQ ID NO: 2 para un sustrato (ácido graso) particular mediante indicar la cantidad de ácido graso liberado (hidrolizado) a partir del aceite de soya (como en la Tabla 3) , donde "P" es ácido palmítico, y "S" es ácido esteárico.

Las columnas "palmitato" y "estearato" indican la cantidad de ácido palmítico y ácido esteárico liberada (por hidrólisis enzimática) a partir del aceite de soya, el cual comprende ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, como se discute anteriormente. "P+S" muestra las cantidades combinadas de ácidos grasos hidrolizados que fueron ácido palmítico y ácido esteárico, o "P+S". Los términos "delta_P" y "delta_S" indican el cambio en la preferencia de una enzima ejemplar según es provista en la presente (v.gr., D61A de la primera fila) para hidrolizar ácido palmítico y ácido esteárico, respectivamente, según se compara con la actividad correspondiente de la SEQ ID NO: 2. El término "delta P+S" indica el cambio total o sumado en preferencia de una enzima ejemplar según es provista en la presente (v.gr., D61A de la primera fila) para hidrolizar ácido palmítico y ácido esteárico según se compara con la actividad correspondiente de la SEQ ID N0:2. La sección "mutaciones de palmitato" resume las enzimas ejemplares según son provistas en la presente teniendo una preferencia de actividad (hidrólisis de ácidos graos) para liberar ácido palmítico contra otros ácidos grasos. La sección "mutaciones de estearato" resume las enzimas ejemplares según son provistas en la presente teniendo una preferencia de actividad (hidrólisis de ácidos graos) para liberar ácido esteárico contra otros ácidos grasos (a partir de aceite de soya, ensayo descrito anteriormente) .

ABLA. 4 Mutaciones de Palmitato Ejemplares Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido WT_P WT_S Palmitato Estearato 61 D A 45% 6% 54% 7% 61 D E 45% 6% 47% 8% 72 R E 45% 6% 54% 4% 72 R K 45% 6% 52% 9% 116 E A 45% 6% 56% 11% 116 E Q 45% 6% 50% 9% 116 E R 45% 6% 52% 9% 116 E T 45% 6% 50% 17% 116 E V 45% 6% 59% 9% 133 S A 45% 6% 45% 11% 151 I G 45% 6% 49% 4% 151 I A 45% 6% 46% 2% 163 V R* 45% 6% 61% 2% 164 D R* 45% 6% 58% 3% TABLA 4 ( CONTINUACIÓN) Mutaciones de Estearato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido WT_P WT_S Palmitato Estearato 20 I L 45% 6% 39% 12% 62 V S 45% 6% 37% 18% 77 G P 45% 6% 18% 20% O TABLA 4 (CONTINUACIÓN) Mutaciones de Palmltato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido P+S delta_P delta_S delta_P+S 61 D A 60% 9% 1% 9% 61 D E 55% 2% 2% 4% 72 R E 58% 9% -2% 7% 12 R K 61% 7% 3% 10% 116 E A 67% 11% 5% 16% 116 E Q 60% 5% 3% 9% 116 E R 61% 7% 3% 10% 116 E T 68% 5% 11% 17% 116 E V 68% 14% 3% 17% 133 S A 56% 0% 5% 5% 151 I G 53% 4 % -2% 2% 151 I A 9% 1% -4% -2% 163 V R* 64% 16% -4% 13% 164 D R* 61% 13% -3% 10% TABLA 4 (CONTINUACIÓN) Mutaciones de Estearato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido WT_P WT_S Palm t to P+S 20 I L 51% -6% 6% 0% 62 V S 55% -8% 12% 4% 77 G P 38% -27% 14 % -13% Ejemplo 5: Evolución Ejemplar para Hidrólisis Mejorada de Palmitato Usando Tecnología GeneReassembly Catorce (14) mutaciones de aminoácidos sencillas identificadas a partir de la clasificación GSSM que cubren siete (7) posiciones de aminoácidos se combinaron por la tecnología GeneReassembly (patente US 6,605,449). Las secuencias de ácido nucleico de longitud completa generadas a partir de la fase GeneReassembly se clonaron hacia un vector de expresión pASK-5 (ver descripción anterior) para expresión en hospedero Escheri-chia coli HMS175 (Novagen, Estados Unidos) . La expresión de los variantes GeneReassembly se indujo con anhidrotetraciclina después de que se lograron las densidades de célula hospedera óptimas .

Las 14 mutaciones que produjeron los mayores incrementos en hidrólisis de palmitato, identificadas en la Tabla 2, se seleccionaron para inclusión en una biblioteca GeneReassembly de palmitasa generada por métodos descritos anteriormente. Clones iniciales se clasificaron sobre umbeliferil palmitato para actividad produciendo alrededor de 145 clones de secuencia única, los cuales fueron ensayados para actividad sobre aceite de soya, como se describió anteriormente.

La figura 8 muestra datos de clasificación primarios y secundarios para ensayos de aceite de soya sobre clones seleccionados a partir de la biblioteca de palmitasa. Clones que produjeron palmitato en mas de 70% de FAs hidrolizados en el ensayo primario (bajo las condiciones de tasa iniciales estándar del método de ensayo) se seleccionaron a ser re-ensayaron sobre aceite de soya. Para cada ensayo de aceite de soya, los FAs extraídos se diluyeron 50 veces y 100 veces para análisis por LCMS o GC. Donde mutaciones no objetivo, adicionales, se encontraron, esto también se indica. Las tasas de hidrólisis de FA detectadas y las cantidades detectadas de cada FA se presentan. En la figura, "alto" y "bajo" indican valores que estuvieron por fuera del rango de la curva de calibración. Las filas se clasifican en orden de palmitato porcentual liberado en el ensayo secundario, y luego por palmitato total liberado. Numerosos clones mostraron selectividad de palmitato significativamente incrementada (hasta 100%) comparada con la SEQ ID NO: 2 progenito-ra (61.2%) .

Los 25 aciertos de palmitasa superiores con base en el ensayo secundario descrito anteriormente se sub-clonaron en sistemas de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20050130160 y Dow Global Technologies, Inc. , publicación de solicitud US 20050186666) . La secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima o polipéptido se insertó ya sea en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20050130160) o en el vector pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20080058262) y luego se introdujo en el hospedero de Pseudomonas fluorescens por electroporación. Las células transformadas se seleccionaron ya sea por crecimiento en medio mínimo para las construcciones de pDO 1169 o en medio rico mas tetraciclina para las construcciones pMYC. La expresión de la enzima o polipéptido se indujo con IPTG después de que las densidades de células hospederas óptimas se lograron.

La Tabla 5 muestra datos a partir de ensayos sobre aceite de soya, corridos en duplicado, de los 25 aciertos superiores expresados en los sistemas de Pseudomonas. Los 4 aciertos construidos en el vector pDOW1169 se listan en letras negritas subrayadas , todos los otros aciertos construidos en el vector pMYC. La enzima se añadió a 5 g de aceite crudo resultando en 20% del contenido de agua final. La mezcla entonces se homogeneizó con una sonda de 7 mm y se incubó por 40 horas a 25°C con agitación con barra de agitación. Alícuotas se removieron y se analizaron para FA mediante convertir FA a FAME y cuantificar FAME por GC como se describe en el ejemplo 8. Las 25 enzimas se cargaron en los 5 g de aceite de soya con base en unidades de actividad de UMB-palmitato iguales. En estas reacciones palmitato en aceite se redujo significativamente de 11% en aceite sin tratar a 5% o menos en aceites tratados con enzimas indicando una preferencia incrementada para hidrólisis de palmitato comparada con la enzima progenitora SEQ ID NO: 2. t o Tabla 5 O ND (No Determinado) La Tabla 6 siguiente muestra datos para la termo-estabilidad de los 25 aciertos de palmitasa superiores con base en el ensayo secundario descrito anteriormente. Estos datos se obtuvieron usando los aciertos expresados en el hospedero de E. coli HMS174. Clones se arreglaron en placas de 96 pozos y se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente (RT) , 45, 50 o 55 °C luego se ensayaron a RT sobre MeUMB-palmitato . El porcentaje de actividad residual se determina mediante dividir la actividad después de incubación a cada temperatura por la actividad después de incubación a RT. También mostrada para cada palmitasa son mutaciones presentes, y ejemplos de selectividad y actividad de palmitato sobre aceite de soya. La SEQ ID NO: 2 retuvo aproximadamente 15% de la actividad después de incubación por 10 minutos a 50°C, pero no tuvo actividad después de incubación a 55°C.

Tabla 6 % de Estabilidad Posición de aminoácido & aminoácido presente Enzima 55C 50C 45C 61 72 116 133 151 163 164 Otra 27 23.0% 62.7% E K V 28 22.8% 62.1% E K V R 29 55.9% E K R 30 24.1% 68.8% 75.6% E E V A 31 22.0% 68.1% 82.5% E E V A R 32 27.1% 58.4% E E V R 33 26.1% 56.6% E E V A R 34 24.7% 54.0% E E V A R 35 8.1% 64.1% 67.6% E E T R 36 10.3% 53.8% 75.7% E E A A R 37 9.2% 54.8% 61.5% E E A R 45 4% 68.4% E E A A A 22 9% 61. 9% E E A A R 35 3% 77 1% E V A R 30 6% 70. 2% E V A 20 3% 71 8% 79. 3% E A A G R 64. 2% E A A 63. 2% A V 56 0% A K V A A R 80. 7% A K A R 22 2% 71 8% 88. 1% A E V A R 60 6% 83. 2% A E V A R 50 7% 68. 0% A E V 50 2% 77. 2% A E V R 21 1% 53. 6% A E V A R 56. 5% A E Q A A R 73 6% 118 .3% A E A A 69 2% 110 .7% A E A A R 82. 2% A V 51. 4% A A A 82 2% K V A G 60. 1% K V R 58. 3% K V A P162S 57. 9% K V A R V62F 56. 3% K V A R 51. 9% K Q A R 74. 8% K A 58. 8% K A A 49 6% 72. 0% E V R 46 3% 66. 0% E V 55 1% E V A R 51 7% E V A A 23 6% 54 6% E A 76. 2% E A R 71 59.2% V A 72 51.8% V A Ejemplo 6: Protocolo de Laboratorio para Evaluación de Enzimas Palmitasa, Estearatasa o Saturasa Candidatas Enzimas y polipéptidos ejemplares según son provistos en la presente se expresaron en el sistema de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20050130160) . El ácido nucleico codificando la enzima o polipép-tido se inserta en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20050130160) y luego se introdujo en el hospedero auxotrófico Pseudomonas fluorescens por electropora-ción. Las células transformadas se seleccionaron por crecimiento en medio mínimo. La expresión de la enzima o polipéptido se indujo con IPTG después de que se lograron las densidades óptimas de célula hospedera.

El siguiente procedimiento se debe usar para evaluar la habilidad de una enzima u otro polipéptido según es provisto en la presente para hidrolizar una muestra de aceite. Enzima palmitasa se añade a 1 kg de aceite crudo resultando en un contenido de agua final de 20%. La mezcla entonces se homogeneiza con un mezclador superior y se incuba a temperatura ambiente con mezclado constante usando un mezclador de paleta. Alícuotas (0.5 mL) se removieron a Oh, 21h, 43h, 65h, y 72h y se trataron para conversión de FAME & análisis de GC según se describe en el ejemplo 8.

El procedimiento anterior se usó con la SEQ ID NO: 2, la muestra de aceite fue un aceite de soya crudo. Después de 72 h, muestras de tanto el aceite sin tratar y el aceite tratado con enzima produjeron los resultados mostrados en la Tabla 7.

Tabla 7 Composición de Ácido Graso Aceite Sin Tratar (%) Aceite Tratado con Enzima (%) C16:0 11.1 3.7 C18:0 4.1 4.2 C18:l 22.1 24.3 C18:2 54.5 59.5 C18:3 8.2 8.3 Los resultados muestran una disminución significativa en la cantidad de ácido palmítico (C16:0) , tal una disminución siendo considerada deseable.

Ejemplo 7: Evaluación de Lipasas, Saturasas o Palmitasas con homología de secuencias con el polipéptido ejemplar de la SEQ ID NO: 2 Varias secuencias de lipasa homologas se sub-clonaron en el vector pMAL-c2x (New England Biolabs, Estados Unidos) por el método de clonación xi (Genlantis, Estados Unidos) . Las construcciones conteniendo SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 16 se transformaron en el hospedero de Escherichia coli ArcticExpress RP (Stratagene, Estados Unidos) para expresión. La expresión de las lipasas es bajo el control de un promotor el cual se induce con IPTG después de que se logran las densidades de célula hospedera óptimas. Las enzimas recombi-nantes se probaron sobre aceite de soya para selectividad de FA (Tabla 8). Las lipasas comprendiendo SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 16 se expresaron y disociaron a partir del marcador de fusión MBP usando condiciones estándar. Una sola colonia se inoculó en medio LB conteniendo 20 ug/ml de gentamici-na y se agitó a 200 rpm durante la noche a 30°C. Este cultivo durante la noche se inoculó en medio LB fresco conteniendo 20 g/ml de gentamicina a una lectura de OD600 de 0.05. Este cultivo se agitó a 200 rpm y 30°C hasta que una lectura de OD600 de 0.5 se obtuviera. Cultivos se transfirieron a 12°C agitando a 200 rpm y se les permitió equilibrar a la temperatura mas baja antes de inducción de expresión de lipasa por adición de IPTG 0.5 mM, seguida por crecimiento adicional por 24 horas. Células se colectaron por centrifugación, se suspendieron en regulador Tris pH8, conteniendo NaCl, CaCl2, DNasel, y lisozima, y luego se Usaron por tratamiento sónico. Lisados celulares se clarificaron por centrifugación. Enzimas se disociaron a partir del MBP por incubación de la fusión de lipasa-MBP con FactorXa por 6 horas a temperatura ambiente, seguido por 18 horas adicionales a 12°C. Los lisados clarificados con enzimas recombinantes activas, intactas, todas mostraron preferencias fuertes y similares para hidrólisis de palmitato sobre otros FA cuando se ensayaron sobre aceite de soya (Tabla 8) .

Tabla 8 Ejemplo 8: Método para Conversión de ácidos grasos libres o triglicéridos a metil ésteres de ácidos grasos (FAME) y cuantifi-cación de FAME por Cromatografía de Gases Ácidos grasos liberados a partir de lípidos, triglicéridos, grasas o aceites por la acción de lipasas, v.gr., saturasas, palmitasas y/o estearatasas pueden cuantificarse directamente por LCMS usando el método descrito en el ejemplo 2. Alternativamente estos ácidos grasos hidrolizados pueden convertirse a Metil Ésteres de Ácidos Grasos (FAME) usando metanólisis catalizada por ácido, y luego cuantificarse por Cromatografía de Gases (GC) . En este ejemplo: • El aceite después de reacción con lipasas, v.gr., saturasas, palmitasas y/o estearatasas se trata por adición de 1 mL de solvente de extracción (CHC13 :MeOH:HCl 4N (2:1:0.075)) por 0.5 mL de volumen de reacción.

· Una alícuota de 45 L de aceite extraído se transfiere a un frasco de taparrosca de 4 mL. A cada frasco se añade una barra de agitación pequeña, seguido por 2 mL de hexano y 400 L de MeOH al 20% (v/v) en HCl .

• Los frascos son entonces sellados y calentados con agitación por 15 minutos. Los frascos entonces son removidos del calor y se les permite enfriar antes de añadir 800 µL de H20.

• La mezcla entonces se somete a vórtice y una muestra (500 de la capa de hexano superior conteniendo FAMES se transfiere a un frasco de auto-muestreador para la GC A cada muestra 500 yL de 0.5 mg/mL de FAME C15:0 se añade como un estándar interno.

El FAME sintetizado usando este método entonces se analiza por Cromatografía de Gases usando los siguientes parámetros de operación: • El equipo es un GC Hewlett Packard Serie 6890 con auto-muestreador • La columna usada es una columna capilar de sílice fusionada Supelco SP-2380 de 30 m x 0.25 mm y 0.2 µ?? de grosor de película.

• El inyector y el detector se fijan a 260°C; flujo de gas portador helio se fija a 0.6 mL/min; el horno se fija a una temperatura inicial de 150°C.

• Muestras (1 mL) se inyectan con una división de inyección 10:1. El método de GC usado tiene: - Rampa 1: 4°C/min por 10 min = 190°C - Rampa 2: 15°C/min por 4 min = 250°C - Retención: 250°C por 2 min FA de triglicérido se puede analizar también por conversión a FAME, aun en presencia de ácidos grasos hidroliza-dos . Usando el método anterior y el método siguiente en combinación, esto se puede usar para determinar la selectividad de ácidos grasos de una lipasa, v.gr., saturasa, palmitasa y/o estearatasa, y el efecto de la enzima sobre el aceite. El método para análisis de FA ligado a glicerol (u otros alcoholes) utiliza metanólisis catalizada por base: • El aceite después de reacción con lipasas, v.gr., saturasas, palmitasas y/o estearatasas es tratado por adición de 1 mL de solvente de extracción (CHC13 : MeOH : HC1 4N (2:1:0.075)) por 0.5 mL de volumen de reacción.

• Una alícuota de 45 de aceite extraído se transfiere en un tubo de micro-centrífuga. Los 500 yL de heptano se añaden seguidos por 50 L de KOH metanólico 2 N.

• La mezcla se somete a vórtice vigorosamente por 30 segundos, luego es centrifugada.

• Una alícuota (50 yL) de la capa de heptano superior conteniendo FAME se transfiere a un frasco de auto-toma de muestras y se combina con 450 yL de hexano conteniendo al estándar interno C15:0.

• Análisis de FAME por GC es como se delinea anteriormente .

Ejemplo 9: Evolución Ejemplar para Tolerancia Térmica Mejorada de Palmitasa usando Tecnología GSSM La palmitasa ejemplar de la invención que incluyó mutaciones D61E, R72K, y V163R de la SEQ ID NO: 2 (enzima 17, Tabla 5, anterior) se eligió como el mutante de selectividad principal a partir de las rondas previas de evolución (ejemplos 4 y 5, anteriores) . Evolución adicional para mejorar la tolerancia térmica de la enzima selectiva principal (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) se condujo usando tecnología GSSM (ver, v.gr., patente US 6,171,820).

En breve, la evolución GSSM se llevó a cabo mediante introducir mutaciones puntuales usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, tal que cada codón original pudiera sustituirse con cada uno de los 20 aminoácidos codificados naturalmente. La biblioteca se construyó en el vector pDOW-Kan, se analizó por gel de agarosa, se trató con DPNI y luego se transformó en células competentes de E. coli XLIBlue.

Colonias se hicieron crecer, se tomaron y se secuenciaron. Las colonias se conjuntaron y ADN se preparó usando el kit de mini-preparación Qiagen (# de catálogo 27106, Qiagen, Valencia, Canadá) . Células competentes de Pseudomonas fluorescens se transformaron entonces con el ADN. El hospedero de Pseudomonas fluorescens se obtuvo de Dow Global Technologies Inc. (publicación de solicitud US 20050130160, publicación de solicitud US 20050186666 y publicación de solicitud US 20060110747) . El vector pDOW-Kan se construyó mediante añadir un marcador de resistencia a kanamicina a pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., publica-ción de solicitud US 20080058262) . Las células se hicieron crecer en un medio mínimo M9 (Dow Global Technologies Inc., publicación de solicitud US 20050186666) suplementado con uracilo y kanamici-na. Todos los ejemplos que siguen describen el uso del vector pDOW-kan, Pseudomonas fluorescens, y medio M9, todos se refieren al mismo vector pDOW-kan, Pseudomonas fluorescens, y medio M9 descritos anteriormente.

La biblioteca de GSSM se clasificó en un formato de 384 pozos. Clasificaciones HTP primaria y secundaria se llevaron a cabo usando UMB-Palmitato (como se describe anteriormente en el ejemplo 3) . Para identificar mutaciones que mantienen actividad mientras la enzima está a una temperatura elevada el ensayo se condujo mediante incubar al sustrato fluorogeno con el lisado de células entero a 54 °C por 30 minutos, precedido por una incuba-ción de 30 minutos del lisado celular completo con regulador por 30 minutos a 54 °C para asegurar que la enzima alcanzara 54 °C previo a cargar sustrato. Fluorescencia de cada mutante se midió (ver columna 2, Tabla 9) y cualquier mutante con una lectura de fluorescencia de mas de 2 desviaciones estándar por encima del control se determinó siendo un "acierto" - esto es, un mutante con tolerancia térmica suficientemente incrementada. 117 aciertos con cambios de aminoácidos únicos se identificaron a partir de la clasificación de UMB-Palmitato (ver Tabla 9, siguiente) . Los cambios de aminoácidos en los 117 aciertos de una sola mutación ocurrieron en 50 residuos; 22% de los cambios de aminoácidos desplegados en proteína. Los 117 aciertos se evaluaron adicional-mente por desempeño en aceite crudo usando ensayos de 5g estándar (ver ejemplo 5) a 25°C y 45°C. Los resultados se muestran en la Tabla 10, siguiente.

Tabla 9 Enzima U B- codón codón aminoácido aminoácido posicifin de mutaciones Palmitato original nuevo original nuevo residuo de adicionales aminoácidos TT1 43670 TAC CTT Y L 7 TT2 40432 GCC CTG A L 15 TT3 21247 GCC ATG A 15 TT4 65535 GAT TGG D W 16 TT5 23779 ATG ATT M I 31 T 6 65535 GGC GAG G E 32 T 7 65535 GGC CCT G P 32 TT8 26222 CTG ATG L M 34 TT9 60900 CTG ATT L I 43 TT10 28008 TTC TTT F F 46 TT11 65535 GCC TGT A C 48 TT12 55409 GCC ATG A M 48 TT13 65535 GCC ACT A T 48 TT14 65535 GAC AAT D N 49 TT15 57979 GAC CGT D R 49 TT16 65535 GAC CT D S 49 TT17 23108 GCC ATG A M 52 TT18 65535 TCG TTT S F 68 TT19 65535 TCG TAT S Y 68 TT20 24003 CGG GCT R A 85 TT21 37005 CGG GAT R D 85 TT22 65535 CGG CAG R Q 85 TT23 39478 CGG TCT R S 85 TT24 65535 CGG ACG R T 85 TT93 65535 GAA AAG E 190 T 94 65535 GAA ATG E ? 190 TT95 65535 GAA CAG E Q 190 TT96 65535 GAA AGG E R 190 TT97 17914 CTA ATT L I 200 TT98 18910 CTA GTA L V 200 E201Y TT99 35222 CTA GTT L V 200 TT100 38817 GAG TAT E Y 201 TT101 65535 GCG CAT A ? 203 TT102 65535 GCG CCG A ? 203 TT103 65535 GCG AGG A R 203 TT10 47048 ATG CTT M L 207 TT105 65535 ACC CAT T ? 214 TT106 65535 ACC AAG T 214 TT107 48095 ACC AGG ? R 214 TT108 35774 ACC TCG ? S 214 TT109 65535 ACC GTT ? V 214 TT110 53546 GGG GCG G A 215 TT111 65535 CTG ATT L I 222 TT112 24987 GCG TCT A S 225 TT113 26618 CGG TAT R Y 163 TT114 22246 CGG ATG R ? 163 TT115 42199 CGG ACG R ? 163 TT116 42127 CGG TTG R L 163 TT117 33933 CGG TGT R C 163 Tabla 10 Palmi ato Palmitato 3 HORAS Palmitato 24 HORAS 45C 25C 25C 45C 55C 45C 25C 55C 45C 25C Enzima Mutación 24H 24H 48H 48H 3H 3H 3H 24H 24H 24H E116I, TT 1 (TTC) 135 (TTT) 8.0% 9.9% 9.4% 7.2% 9.4% 9.3% 10.7% 9.3% 1.1% 9.5% ??43 E116L 7.3% 7.6% 6.8% 6.5% 9.0% 9.1% 9.8% 6.3% 6.8% 8.1% ??44 E116N 5.9% 6.5% 5.3% 4.9% 8.9% 9.9% 10.3% 7.1% 6.4% 8.1% TT59 A144I 9.7% 10.1% 9.7% 9.2% 10.4% 10.3% 9.8% 9.5% 10.2% TT61 A144 9.0% 9.2% 8.4% 8.4% 10.6% 10.5% 10.3% 9.8% 10.1% 9.5% TT62 A144V 7.4% 7.5% 6.7% 9.2% 9.7% 9.9% 7.7% 8.6% 7.6% TT63 E149H 9.0% 10.2% 9.5% 8.8% 10.2% 9.8% 10.7% 9.4% 8.7% 9.6% TT64 A1S0I 6.9% 7.3% 6.8% 6.5% 7.4% 7.0% 8.8% 6.6% 5.9% 6.8% TT118 N158D, P162G 7.5% 8.2% 6.7% 9.7% 10.2% 10.4% 8.3% 6.7% 9.1% TT70 P162G 8.5% 9.7% 7.9% 7.3% 9.7% 10.2% 10.9% 7.6% 6.6% 9.4% TT71 P162K 6.6% 8.7% 6.9% 6.3% 9.0% 9.1% 10.4% 8.2% 6.1% 7.9% TT113 P163Y 6.4% 7.3% 6.0% 5.6% 7.6% 7.0% 9.7% 6.4% 6.1% 6.2% TT84 R172H 6.3% 6.4% 5.5% 5.2% 8.1% 8.0% 9.5% 6.% 6.9% 7.5% TT86 R172L 6.1% 6.8% 6.1% 5.8% 8.7% 8.6% 9.6% 68% 6.3% 6.9% TT105 T214H 6.4% 7.3% 6.1% 6.1% 8.3% 7.8% 9.5% 6.7% 7.3% 7.0% TT112 A225S 8.6% 9.2% 8.6% 8.1% 9.9% 9.8% 10.3% 8.9% 7.9% 8.9% TT7 G32P 6.1% 8.7% 8.3% 5.8% 8.6% 8.5% 9.0% 8.1% 7.1% 7.0% TT11 A48C 8.0% 8.2% 7.5% 7.3% 8.7% 9.3% 10.1% 6.5% 6.7% 7.5% TT25 R85Y 6.8% 8.7% 6.8% 7.8% 7.6% 9.9% 8.0% 6.0% 7.1% E95K, TT26 (GCG) 92 (GCT) 7.5% 8.9% 5.9% 6.8% 8.1% 7.9% 9.8% 6.7% 5.7% 7.1% Control negativo negativa 10.7% 10.8% 10.8% 10.5% Control negativa negativo 10.7% 10.8% 10.7% 10.6% Control negativo negativa 10.8% 10.8% 10.8% 10.7% TT35 V104L 6.0% 7.3% 5.6% 5.7% 7.9% 7.7% 9.1% 6.3% 6.3% 6.5% TT36 V113L 7.1% 7.3% 6.5% 6.7% 8.9% 8.8% 9.3% 7.1% 6.9% 6.6% TT37 E116A 8.0% 8.2% 7.3% 7.6% 9.6% 9.5% 10.2% 8.5% 7.4% 8.6% TT38 E116C 7.1% 7.5% 5.7% 6.5% TT39 E116D 6.4% 6.6% 5.8% 5.9% TT48 E116V 6.9% 7.5% 6.2% 6.6% TT52 K120R 5.7% 6.0% 5.1% 6.5% TT56 L139M 7.6% 8.1% 6.9% 7.1% 9.9% 10.1% 9.9% 9.5% 9.5% 8.5% TT65 A150M 6.2% 6.4% 5.6% 5.9% TT 4 P162S 7.0% 7.0% 5.8% 6.1% TT116 R163L 6.3% 6.4% 5.8% 6.1% TT80 I167K 6.5% 6.9% 5.6% 6.4% TT4 D16W 6.3% 6.7% 5.7% 6.4% TT92 E190A 6.7% 6.7% 5.9% 5.9% TT95 E190Q 6.7% 6.9% 5.9% 6.3% TT100 E201Y 6.5% 7.4% 5.8% 6.4% TT101 A203H 6.2% 6.5% 5.8% 6.3% TT104 M207L 7.8% 7.8% 6.8% 7.4% 9.5% 9.3% 10.3% 8.7% 6.9% 7.9% TT107 T214R 6.6% 6.9% 5.5% 6.1% TT109 T214V 6.3% 7.8% 5.4% 5.7% TT6 G32E 6.6% 6.9% 5.7% 6.5% TT8 L34M 6.8% 7.2% 6.2% 6.6% TT12 A48M 10.2% 10.8% 10.1% 10.4% TT14 D49N 6.7% 7.6% 5.3% 6.4% 8.5% 7.8% 8.9% 7.7% 5.4% 5.8% TT1 Y7L 6.5% 7.2% 5.0% 6.2% TT120 P162S, R163F 6.6% 7.5% 6.3% 6.4% 8.7% 9.1% 10.3% 6.9% 6.6% 7.5% Control negativo negativa 10.6% 10.7% 10.6% 10.7% SEQ ID NO: 2 con D61E, R72K, y V163R progenitora 6.1% 6.1% 4.8% 6.2% SEQ ID NO: 2 con D61E, R72K, y V163R progenitora 6.0% 6.2% 5.4% 6.0% TT 5 E116Q 5.9% 5.7% 5.6% 4.9% 8.2% 8.4% 8.4% 7.4% 7.1% 7.0% TT47 E116T 5.7% 4.7% 5.4% 4.2% 8.0% 8.6% 8.6% 6.9% 7.9% 6.2% T 52 K120R 6.0% 5.7% 5.6% S.0% 8.4% 9.4% 8.8% 9.7% 8.6% 6.4% TT57 H140R 7.1% 6.8% 6.8% 6.0% 8.8% 8.7% 9.5% 7.9% 8.2% 7.2% TT58 N142W 10.3% 3.5% 10.3% 10.2% TT59 A144I 10.5% 10.2% 10.3% 9.8% TT60 A144L 9.1% 8.4% 9.9% 8.1% TT66 A150W 7.1% 6.5% 6.5% 7.3% 7.7% 9.0% 6.9% 6.1% 6.7% TT2 A15L 7.5% 6.7% 7.1% 6.5% TT3 A15M 7.7% 7.3% 7.4% 7.3% TT115 R163T 7.1% 6.5% 6.3% 5.9% TT78 Q166T 5.8% 4.5% 5.5% 4.0% TT79 I167F 6.7% 5.4% 6.2% 4.7% 8.5% 8.7% 9.4% 8.0% 7.2% 6.2% TT83 I167Y 5.8% 5.7% 5.2% 4.9% 8.6% 9.0% 8.6% 8.0% 9.2% 6.3% TT89 L180R 6.1% 5.2% 5.8% 4.6% TT75 V183I 6.1% 5.6% 5.6% 5.0% TT90 A185C 7.2% 6.2% 6.9% 8.8% 8.1% 9.2% 8.3% 6.5% 6.8% TT89 L180R 6.2% 5.4% 5.4% 4.4% TT108 T214S 6.6% 5.6% 5.0% 8.5% 8.5% 8.5% 7.8% 9.1% 6.2% TT110 G215A 6.2% 6.1% 5.4% 5.1% TT9 L43I 6.2% 5.9% 5.5% 4.9% 8.0% 7.6% 9.2% 7.0% 5.9% 5.8% TT15 D49R 7.9% 7.1% 8.0% 9.0% 8.6% 9.7% 8.3% 7.5% 8.6% TT16 D49S 6.8% 5.8% 6.5% 4.7% TT18 S68F 6.2% 5.6% 6.1% 4.9% TT19 S68Y 6.5% 5.5% 7.0% 4.7% TT22 R85Q 6.8% 6.2% 6.3% 5.3% TT23 R85S 6.6% 6.0% 6.3% 5.3% TT24 R85T 6.9% 5.9% 6.7% 5.2% TT31 A96 6.7% 5.5% 6.4% 4.8% SEQ ID NO : 2 con D61E, R72K, y V163R progenitora 6.4% 5.7% 6.1% 4.7% TT34 K101R 6.9% 5.6% 4.4% 6.3% TT40 E116F 7.1% 6.4% 5.7% 6.8% TT46 E116S 7.1% 7.0% 5.9% 7.0% TT49 E11SW 7.5% 7.4% 6.6% 7.6% TT50 E116Y 6.9% 6.6% 5.4% 6.3% TT53 S133A 7.2% 7.2% 6.0% 7.1% TT54 A136S 7.1% 6.6% 5.8% 6.9% TT55 G137F 7.7% 6.6% 5.6% 7.2% TT60 A144L 10.5% 10.0% 9.3% 9.8% TT68 S153G 6.9% 6.4% 5.5% 6.5% TT3 A15M 7.3% 6.9% 5.8% 6.9% TT13 A48T 7.2% 6.0% 5.1% 7.0% TT115 R163T 8.2% 8.1% 6.8% 7.8% TT73 P162S, I167L 6.4% 6.3% 5.4% 6.4% TT117 R163C 6.7% 6.1% 5.2% 6.4% TT114 R163M 8.2% 7.3% 7.2% 7.2% TT115 R163T 5.7% 5.1% 4.4% 5.0% TT113 R163Y 6.9% 6.6% 5.8% 6.6% TT77 Q166E 6.2% 5.8% 5.0% 6.0% TT81 I167L 7.1% 6.9% 6.1% 6.6% TT82 I167R 7.8% 7.2% 6.2% 7.2% TT85 R172K 6.4% 5.7% 5.0% 5.9% TT87 R172Y 6.5% 6.4% 5.2% 6.0% TT88 L180K 6.2% 6.1% 5.2% 6.7% TT89 L180R 7.2% 6.0% 5.1% 6.9% TT93 E190K 7.3% 6.7% 5.6% 7.1% TT94 E190 6.9% 6.8% 5.5% 6.0% ??96 E190R 6.9% 6.8% 5.5% 6.0% TT97 L200I 5.7% 5.7% 5.0% 5.9% TT5 31I 6.8% 5.8% 5.0% 5.9% TT102 A203P 7.5% 6.6% 5.9% 6.8% TT103 A203R 6.6% 6.2% 5.4% 6.2% TT5 M31I 7.4% 7.1% 6.2% 7.1% TT6 G32E 7.2% 6.7% 6.3% 6.4% TT13 A48T 7.1% 6.8% 5.8% 6.9% TT17 A52M 6.9% 5.7% 5.0% 6.4% TT1 Y7L 6.5% 6.5% 5.8% 6.6% TT20 R85A 7.1% 5.7% 5.1% 6.3% TT28 A92E 7.3% 5.8% 5.0% 6.7% ??27 A92V 6.9% 5.5% 4.8% 6.3% TT30 E95A 7.9% 5.7% 4.9% 7.2% TT29 E95D 7.6% 5.6% 5.0% 6.9% TT32 A96R 6.7% 6.6% 5.8% 6.2% TT33 A97S 7.4% 5.4% 4.8% 6.7% TT114 R163M 7.2% 5.8% 5.8% 7.6% 7.5% 7.0% 8.9% 6.0% 7.2% 5.8% TTX16 R163L 7.0% 5.9% 5.1% 7.2% 8.1% 7.4% 9.4% 7.8% 7.0% 5.9% Un cambio de codón en un residuo dado que no resulta en un cambio de aminoácido es referido como una mutación silenciosa. Mutaciones silenciosas se obtienen como aciertos debido a expresión incrementada con relación a la enzima progenitora, y se observaron en 37 sitios en la clasificación GSSM (Tabla 11, siguiente) .

Tabla 11 sitio de codón original codón nuevo aminoácido aminoácido aminoácido GCG GCT A A 35 GGC GGT G G 37 CTG CTT L L 41 GGC GGA G G 45 GCC GCT A A 52 CGG CGA R R 89 GCC GCT A A 97 GTG GTT V V 102 AGC AGT S S 108 CTC TTG L L 109 GCG GCT A A 114 CGC CGG R R 115 CTG CTT L L 117 CTG TTG L L 124 CGG AGG R R 126 GTC GTG V V 128 GTC GTG V V 129 AGT TCT S S 133 GGC GGT G G 137 GAC GAT D D 138 CTC CTT L L 139 AAC AAT N N 142 CGC AGG R R 172 GTG GTT V V 183 ACC ACG T T 188 TCG AGT S S 192 CCC CCT P P 193 CTG CTT L L 202 GCG GCT A A 203 ACC ACT T T 205 CAC CAT H H 206 GGC GGT G G 208 TCG TCT S S 212 CTG CTT L L 222 GTC GTG V V 223 CGG AGG R R 226 CTC TTG L L 227 Ejemplo 10: Evolución Ejemplar para Tolerancia Térmica de Palmitasa usando Tecnología TMCA Las mutaciones de desempeño superior identificadas durante evolución GSSM (ejemplo 3 , anterior) se evaluaron en ensayos de aceite primario y secundario para inclusión en evolución TMCA. Ensayos de 5 g de aceite crudo se condujeron, como se describe en el ejemplo 5, pero en 10% de contenido de agua, con los 117 aciertos únicos a 25°C y 45°C. El perfil de aceite se evaluó siguiendo 24 y 48 horas de reacción. Aciertos primarios se sometieron a ensayos de aceite secundarios a 25 °C, 45°C y 55°C. Alícuotas se removieron a 3, 24, y 48 horas para evaluar perfiles de aceite. Los mejores representantes se listan en la Tabla 12 siguiente con el palmitato restando en el aceite listado como un porcentaje de los ácidos grasos ligados totales. Para evaluar el impacto de una refinación cáustica intermedia, los ensayos a 45°C fueron refinados con cáustico por adición de NaOH al 11% (estimado para FFA al 7%) y se calentaron con agitación continua a 60 °C. Enzima fresca se añadió al aceite refinado a 20% de contenido de agua, se homogeneizó y la reacción de aceite procedió con agitación por 24 horas adicionales a 45°C. El contenido de palmitato final en muestras refinadas con cáustico se muestra en la última columna, "CR 24H" .

De los mejores representantes mostrados en la Tabla 12, 15 mutantes (mostrados en negritas cursivas en la Tabla 12) se seleccionaron para combinación usando tecnología TMCA. La biblioteca TMCA se construyó como se describe en la publicación PCT O 2009/018449 y como se describe mas adelante. Esta biblioteca comprendió 9,216 variantes únicas.

O Tabla 12 Tecnología de Ensamblaje de Combinaciones de Múltiples Sitios a la Medida (TMCA) , tecnología TMCA (ver publicación PCT O 09/018449) , comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos de progenie teniendo diferentes combinaciones de varias mutaciones en múltiples sitios. El método puede llevarse a cabo, en parte, por una combinación de por lo menos uno o mas de los siguientes pasos: Obtener información de secuencia de un polinucleótido ("primero" o "de plantilla") . Por ejemplo, la secuencia primera o de plantilla puede ser una secuencia de tipo silvestre (v.gr., la SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) o imitada. La información de secuencia puede ser del polinucleótido completo (v.gr., un gen o un cuadro de lectura abierto) o de regiones de interés parciales, tales como una secuencia codificando un sitio para ligadura, especificidad de ligadura, catálisis, o especificidad de sustrato.

Identificar tres o mas mutaciones de interés junto con la secuencia de polinucleótido primera o de plantilla. Por ejemplo, mutaciones pueden estar n 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 o mas posiciones dentro de la secuencia primera o de plantilla. Las posiciones pueden ser predeterminadas por posición absoluta o por el contexto de residuos circundantes u homología. Por ejemplo, para TMCA de polipéptidos de palmitasa, los cambios de aminoácidos termo-tolerantes superiores que resultaron en desempeño mejorado de enzima se incluyeron como mutaciones de interés. Las secuencias flanqueando a las posiciones de mutación en cualquier lado pueden ser conocidas. Cada posición de mutación puede contener dos o mas mutaciones, tal como para diferentes aminoácidos. Tales mutaciones pueden identificarse mediante usar tecnología de Mutagénesis de Saturación de Sitio Genético (GSSM) , como se describe en la presente y en, v.gr., las patentes US 6,171,820; 6,562,594; y 6,764,835.

Proporcionar cebadores (v.gr., oligonucleótidos sintéticos) que comprenden las mutaciones de interés. En una forma de realización, un cebador es provisto para cada mutación de interés. Por ende, un polinucleótido primero o de plantilla teniendo 3 mutaciones de interés puede usar 3 cebadores en esa posición. El cebador también puede ser provisto como un conjunto de cebadores conteniendo una posición degenerada tal que la mutación de interés esté en el rango de cualquier nucleótido o aminoácido como aparece en la naturaleza, o un sub-conjunto de ese rango. Por ejemplo, un conjunto de cebadores puede ser provisto que favorece mutaciones para residuos de aminoácidos alif ticos .

Los cebadores pueden prepararse como cebadores hacia adelante o de reversa, o los cebadores pueden prepararse como por lo menos un cebador hacia adelante y por lo menos un cebador de reversa. Cuando las mutaciones son colocadas de manera cercana juntas, puede ser conveniente usar cebadores que contienen mutaciones para mas de una posición o diferentes combinaciones de mutaciones en múltiples posiciones.

Proporcionar un polinucleotido conteniendo la secuencia de plantilla. El polinucleotido primero o de plantilla puede ser circular, o puede ser super-espirado, tal como un plásmido o vector para clonación, secuenciación o expresión. El polinucleotido puede ser de una sola cadena ( "ADNss" ) , o puede ser de doble cadena ("ADNds") . Por ejemplo, el método TCMA somete al ADNds super-espirado ("se") a un paso de calentamiento a 95°C por 1 minuto (ver Levy, Nucleic Acid Res., 28 (12) : e57 (i-vii) (2000)).

Añadir los cebadores al polinucleotido de plantilla en una mezcla de reacción. Los cebadores y el polinucleotido de plantilla se combinan bajo condiciones que permiten que los cebadores templen al polinucleotido de plantilla. En una forma de realización del protocolo de TMCA, los cebadores se añaden al polinucleotido en una sola mezcla de reacción, pero pueden añadirse en múltiples reacciones.

Llevar a cabo reacciones de extensión de polimerasa. Los productos de extensión (v.gr., como un "polinucleotido extendido modificado" o "de progenie") pueden amplificarse por medios convencionales. Los productos pueden analizarse por longitud, secuencia, propiedades de ácido nucleico deseadas, o expresarse como polipéptidos . Otros métodos de análisis incluyen hibridación in situ, clasificación de secuencia o clasificación de expresión. El análisis puede incluir una o mas rondas de clasificación y selección por una propiedad deseada.

Los productos también se pueden transformar en un sistema de expresión celular u otro, tal como un sistema libre de células. El sistema libre de células puede contener enzimas relacionadas con replicación, reparación, recombinación, transcripción, o traducción de ADN. Hospederos ejemplares incluyen células y líneas celulares bacterianas, de levadura, de plantas y de animales, e incluyen E. coli, Pseudomonas flúores-cens, Pichia pastoris y Aspergillus niger. Por ejemplo, cepas XLl-Blue o Stbl2 de E. coli pueden usarse como hospederos.

El método de la invención puede usarse con los mismos o diferentes cebadores bajo diferentes condiciones de reacción para promover productos teniendo diferentes combinaciones o números de mutaciones.

Mediante llevar a cabo el método ejemplar descrito anteriormente, este protocolo también proporciona uno o mas polinucleótidos producidos por este método de evolución TMCA, los cuales pueden entonces clasificarse o seleccionarse para una propiedad deseada. Uno o mas de los polinucleótidos de progenie pueden expresarse como polipéptidos , y opcionalmente clasificarse o seleccionarse para una propiedad deseada. Por ende, esta forma de realización del protocolo de evolución TMCA proporciona polinucleótidos y los polipéptidos codificados, así como bibliotecas de tales polinucleótidos codificando a tales polipéptidos. Esta forma de realización del protocolo de evolución TMCA además proporciona para clasificar las bibliotecas mediante clasificar o seleccionar la biblioteca para obtener uno o mas polinucleótidos codificando uno o mas polipéptidos teniendo la actividad deseada.

Otra forma de realización del protocolo de evolución TMCA descrito en la publicación PCT WO 2009/018449 comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados. Tales métodos generalmente incluyen (a) añadir por lo menos tres cebadores a un polinucleótido de plantilla de doble cadena en una sola mezcla de reacción, en donde los por lo menos tres cebadores no se traslapan, y en donde cada uno de los por lo menos tres cebadores comprende por lo menos una mutación diferente de los otros cebadores, en donde por lo menos un cebador es un cebador hacia adelante que puede templar a una cadena menos de la plantilla y por lo menos un cebador es un cebador en reversa que puede templar a una cadena mas de la plantilla, y (b) someter a la mezcla de reacción a una reacción de extensión de polimerasa para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos a partir de los por lo menos tres cebadores .

Otra forma de realización del protocolo de evolución TMCA descrito en la publicación PCT WO 2009/018499 comprende un método en donde una célula es transformada con la pluralidad de productos extendidos que no han sido tratados con una ligasa. En otra forma de realización de la invención, la pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos se recupera a partir de la célula. En otra forma de realización, la pluralidad recuperada de polinucleótidos modificados extendidos se analiza, por ejemplo, mediante expresar por lo menos uno de la pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos y analizar al polipéptido expresado a partir de los mismos. En otra forma de realización, la pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos comprendiendo las mutaciones de interés se selecciona.

En otra forma de realización del protocolo de evolución TMCA, información de secuencia respecto del polinucleótido de plantilla se obtiene, y tres o mas mutaciones de interés a lo largo del polinucleótido de plantilla pueden identificarse. En otra forma de realización, productos obtenidos por la extensión de polimerasa pueden analizarse antes de transformar la pluralidad de productos modificados extendidos en una célula.

En una forma de realización del protocolo de evolución TMCA, productos obtenidos por la extensión de polimerasa son tratados con una enzima, v.gr., una enzima de restricción, tal como una enzima de restricción Dpnl, con lo cual destruyendo la secuencia de polinucleótido de plantilla. Los productos tratados pueden transformarse en una célula, v.gr., una célula de E. coli.

En una forma de realización del protocolo de evolución TMCA, por lo menos dos, o por lo menos tres, o por lo menos cuatro, o por lo menos cinco, o por lo menos seis, o por lo menos siete, o por lo menos ocho, o por lo menos nueve, o por lo menos diez, o por lo menos once, o por lo menos doce o mas cebadores pueden usarse. En una forma de realización, cada cebador comprende una mutación de un solo punto. En otra forma de realización, dos cebadores hacia adelante o dos en reversa comprenden un cambio diferente en la misma posición sobre el polinucleótido de plantilla. En otra forma de realización, por lo menos un cebador comprende por lo menos dos cambios en diferentes posiciones sobre el polinucleótido de plantilla. En aun otra forma de realización, por lo menos un cebador comprende por lo menos dos cambios en diferentes posiciones y por lo menos dos cebadores hacia adelante o dos en reversa comprenden un cambio diferente en la misma posición sobre el polinucleótido de plantilla .

En una forma de realización del protocolo de evolución TMCA, los cebadores hacia adelante se agrupan en un grupo hacia adelante y los cebadores en reversa se agrupan en un grupo en reversa, y los cebadores en el grupo hacia adelante y los cebadores en el grupo en reversa, independientes entre sí, se normalizan para estar en concentración igual en el grupo correspondiente independiente de las posiciones sobre el polinucleótido de plantilla, y en donde después de la normalización una cantidad igual de los cebadores hacia adelante y en reversa se añaden a la reacción. En este método de normalización, una combinación de algunas posiciones puede polarizarse. La polarización puede ser debida a, por ejemplo, una concentración de cebador relativamente baja en una posición conteniendo un solo cebador comparada con una posición conteniendo múltiples cebadores. "Polarización posicional" se refiere a polinucleótidos resultantes que muestran una fuerte preferencia para la incorporación de cebadores en una sola posición con relación a las otras posiciones dentro de su grupo cebador hacia adelante o en reversa. Esto resulta en una combinación de polinucleótidos modificados los cuales pueden tener un alto porcentaje de mutaciones dentro de una sola posición de cebador pero un porcentaje bajo de mutaciones en otra posición dentro de su grupo cebador hacia adelante o en reversa. Esta polarización es desfavorable cuando la meta del TMCA es generar polinucleótidos de progenie comprendiendo todas las combinaciones posibles de cambios a la plantilla. La polarización puede ser corregida, por ejemplo, mediante normalizar los cebadores como un conjunto en cada posición a ser iguales.

En una forma de realización del protocolo de evolución TMCA, la normalización del cebador se lleva a cabo mediante organizar a los cebadores en múltiples grupos dependiendo de su ubicación sobre el polinucleótido de plantilla, en donde los cebadores cubriendo la misma región seleccionada sobre la plantilla están en un grupo; normalizar los cebadores agrupados dentro de cada grupo a la misma concentración; conjuntar los cebadores hacia adelante dentro de un grupo hacia un grupo hacia adelante y normalizar la concentración entre cada grupo de los cebadores hacia adelante a ser la misma; conjuntar los cebadores en reversa dentro de un grupo hacia un grupo en reversa y normalizar la concentración entre cada grupo de los cebadores en reversa a ser la misma; y añadir una cantidad igual de los cebadores hacia adelante y en reversa conjuntados hacia la reacción. Ninguna polarización ha sido observada para combinaciones de posiciones.

En una forma de realización del protocolo de evolución TMCA, un conjunto de cebadores degenerados comprendiendo cada uno una posición degenerada es provisto, en donde la mutación de interés está en un rango de diferentes nucleótidos en la posición degenerada. En otra forma de realización, un conjunto de cebadores degenerados es provisto comprendiendo por lo menos un codón degenerado correspondiente a por lo menos un codón del polinucleótido de plantilla y por lo menos una secuencia adyacente que es homologa a una secuencia adyacente al codón de la secuencia de polinucleótidos de plantilla. En otra forma de realización, el codón degenerado es ?,?,? y codifica cualquiera de los 20 aminoácidos que aparecen en la naturaleza. En otra forma de realización, el codón degenerado codifica menos de 20 aminoácidos que aparecen en la naturaleza.

Otra forma de realización del protocolo de evolución TMCA descrito en la publicación PCT WO 2009/018449 comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados comprendiendo las mutaciones de interés. Tales métodos generalmente incluyen (a) añadir por lo menos dos cebadores a un polinucleótido de plantilla de doble cadena en una sola mezcla de reacción, en donde los por lo menos dos cebadores no se traslapan, y en donde cada uno de los por lo menos dos cebadores comprende por lo menos una mutación diferente de los otros cebadores, en donde por lo menos un cebador es un cebador hacia adelante que puede templar a una cadena menos de la plantilla y por lo menos un cebador es un cebador en reversa que puede templar a una cadena mas de la plantilla, (b) someter la mezcla de reacción a una reacción de extensión de polimerasa para producir una pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos a partir de los por lo menos dos cebadores, (c) tratar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos con una enzima, con lo cual destruyendo al polinucleótido de plantilla, (d) transformar a los polinucleotidos modificados extendidos tratados que no han sido tratados con una ligasa hacia una célula, (e) recuperar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos a partir de la célula, y (f) seleccionar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos comprendiendo las mutaciones de interés.

En este ejemplo, las 15 mutaciones seleccionadas para inclusión en la biblioteca TMCA termo-tolerante se muestran en la Tabla 13, siguiente. Seis plantillas de ADN fueron usadas: SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R (progenitora) , progenitora con mutación E95K, progenitora con mutación P162G, progenitora con mutación P162K, progenitora con mutaciones E95K y P162G, y progenitora con mutaciones E95K & P162K. Los plásmidos de la progenitora con mutación E95K, progenitora con mutación P162G, y progenitora con mutación P162K se pasaron a través de células competentes E. coli XLl-Blue para metilar el ADN. Seis evolucio-nes TCMA separadas se llevaron a cabo, una para cada una de las seis plantillas en combinación con los oligos listados en la Tabla 14 siguiente.

Tabla 13 MUTACIÓN CODÓN NUEVO A48C TGT D49R CGT R85Y TAT E95K AAG E116I ATT E116L CTT E116N AAT A144I ATT E149H CAT A150I ATT P162G GGT P162K AAG R172H CAT R172L CTT A225S TCT > o Tabla 14 o Miembros de biblioteca se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa, y se trataron con DPNI. Las muestras entonces se transformaron en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se tomaron, se cultivaron y se secuenciaron. Los resultados de secuenciación indicaron que la mutación E116L y las mutaciones en los aminoácidos 144, 149 y 150 estuvieron sub-representadas comparadas con el máximo teórico. Por lo tanto, otra biblioteca TMCA fue creada usando una mezcla normalizada de todas las seis plantillas. Las reacciones de TMCA se repitieron usando todos los oligos listados en la Tabla 14, excepto por aquellos para las mutaciones E116I y E116N. La cantidad de cebadores usados para la mutación E116L y para la región 4 (aminoácidos 144, 149 & 150) se duplicó. Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa, y se trataron con DPNI. ADN de muestra se transformó en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se tomaron, cultivaron y secuenciaron. La incorporación de mutaciones en los aminoácidos 144, 149 y 150 se mejoró pero E116L aun estuvo sub-representada comparada con el máximo teórico. El ADN de ambas bibliotecas se transformó en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se conjuntaron y ADN se preparó usando el kit de mini-preparación Qiagen. El ADN entonces se usó para transformar células competentes de Pseudomonas fluorescens . Las células se cultivaron en medio LB suplementado con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 g/ml) . Un número suficiente de colonias se obtuvo para sobre-muestrear la biblioteca por 10 veces. La biblioteca fue sobre-muéstreada por diez veces para tomar en cuenta la sub-representación de E116L.

La biblioteca TMCA termo-tolerante resultante se cultivó en medio mínimo M9 suplementado con uracilo (750 g/ml) y kanamicina (50 pg/ml) y se clasificó usando la clasificación HTP descrita en el ejemplo 3, anterior. La biblioteca se incubó a 60°C por 30 minutos antes y después de adición de UMB-Palmita-to. Las placas de 384 pozos se leyeron con excitación a 365 nm y emisión a 460 nm. Cada placa se enfrió rápidamente por centrifugación y el espectro-fotómetro se pre-calentó para minimizar artefactos en lecturas. Los valores de fluorescencia a través de cada placa de 384 pozos se desplegaron. Aciertos se identificaron como aquellos teniendo desviaciones estándar >2 por encima del control positivo (mutación sola E116L) . Una clasificación HTP secundaria ensayó aciertos HTP primarios a dos temperaturas, 60°C y 63 °C. Aciertos secundarios se definieron como desviaciones estándar >4 por encima del control positivo promedio en la placa de 63°C y reteniendo >50% de actividad entre 60°C y 63°C. 318 aciertos HTP secundarios únicos de secuencia se identificaron. Estos aciertos contienen entre 2 y 9 mutaciones. Ensayos de 5 g de aceite crudo estándar (como se describen en el ejemplo 5) se condujeron con lisados clarificados de los 318 aciertos. De los 318 aciertos HTP secundarios, aquellos que redujeron palmitato mas efectivamente a las temperaturas elevadas (45°C o 60°C) que a 25°C en el ensayo de aceite, se eligieron como "aciertos de aceite" de tolerancia térmica. 57 aciertos de aceite de tolerancia térmica primarios se identificaron y caracterizaron por ensayos de aceite adicionales (ver Tablas 15 y 16, siguientes) . Ensayos de 5 g de aceite adicionales se llevaron a cabo y 9 aciertos de aceite se identificaron que tuvieron perfiles de desempeño de temperatura preferidos además de niveles de actividad total variables (ver Tabla 17, siguiente) . o Tabla 15 O O • Aciertos de tolerancia térmica 29, 40, 41 y 74 también contienen mutaciones adicionales (ver mutaciones adicionales listadas en la Tabla 16, siguiente) .

Tabla 16: Mutaciones adicionales también contenidas en aciertos de tolerancia térmica 29, 40, 41 y 74.

Oí O Tabla 17 Ejemplo 11: Evolución Ejemplar para Expresión Mejorada de Palmitasa usando Tecnología TMCA Las 37 mutaciones silenciosas individuales identificadas durante la clasificación GSSM (ver Tabla 11, ejemplo 9, anterior) se evaluaron para expresión (ver Tabla 18, siguiente) . Cultivos de 50 mL se expresaron en medio M9 , suplementado con uracilo y kanamicina, en matraces de 250 mL. Aciertos se cultivaron a 30°C por 16 a 20 horas antes y después de inducción con IPTG 0.3 mM. Células se formaron en pelotillas por centrifugación y se lisaron con B-PER (número de catálogo 78248, Pierce Protein Research Products, Rockford, IL) . Una porción del lisado entero se centrifugó para clarificar. Tanto el lisado de células enteras y los lisados clarificados se ensayaron para concentración de proteínas totales usando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos, # de catálogo 500-0006) con base en el método Bradford, y para actividad sobre el sustrato fluorógeno de UMB-Palmitato, y por SDS-PAGE. Los valores se normalizaron con el valor progenitor fijo en 100%. 16 aciertos se identificaron mediante demostrar actividad incrementada sobre el progenitor.

Tabla 18 % de actividad de progenitor % soluble sitio de aa entero clarificado Actividad Proteína 35 352 247 53 79 37 191 126 50 83 41 163 103 48 91 45 706 640 68 89 52 252 161 48 57 89 281 190 51 47 97 167 102 46 77 102 617 525 64 72 108 583 452 58 60 109 373 244 49 72 114 238 147 46 72 115 n . d 117 653 555 64 70 124 442 336 57 62 126 509 368 55 70 128 416 327 59 70 129 354 260 55 73 133 511 455 67 47 137 339 240 53 54 138 266 186 53 75 139 135 101 56 105 142 221 175 60 63 172 243 210 65 59 183 433 356 62 65 188 455 325 54 97 192 253 179 53 60 193 117 59 38 57 202 196 121 47 63 203 339 247 55 68 205 63 31 37 68 206 125 78 47 63 208 232 162 53 99 212 320 238 56 87 222 126 75 45 86 223 149 88 45 99 226 213 110 39 81 227 183 174 71 71 Positivo 100 100 75 71 Negativo 0 1 Las 11 mutaciones silenciosas individuales superiores (Tabla 19, siguiente) se combinaron usando tecnología TMCA, como se describe en la publicación PCT WO 2009/018449 y se describe adicionalmente mas adelante.

Tabla 19 Para la evolución TMCA, cuatro plantillas de ADN se usaron: (1) palmitasa "Progenitora A" (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) , (2) palmitasa "Progenitora B" (Progenitora A con mutaciones adicionales (GGC) 45 (GGA) y (CTG) 117 (CTT) ) , (3) palmitasa "Progenitora C" (Progenitora A con mutación adiciona (GGC) 45 (GGA) ) , y (4) "Progenitora D" (Progenitora A con mutación adicional (CTG) 117 (CTT) ) . Nota: Mutaciones son listadas mediante proporcionar al codón original, seguido por el número de posición del aminoácido modificado, seguido por el codón nuevo. Por ejemplo, (GGC)45(GGA) indica que el codón para el aminoácido en posición 45 de la SEQ ID NO: 2 se cambió de (GGC) a (GGA) .

Una primera ronda de reacciones TMCA se completó con cada una de las cuatro plantillas de ADN y los cebadores para las regiones 1 y 4 (ver Tabla 20, siguiente; región 1: aminoácido 35; región 4: aminoácidos 183 y 188) , con lo cual creando cuatro sub-bibliotecas. Los productos de sub-biblioteca se purificaron usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. Cada sub-biblioteca, conteniendo una mezcla de productos purificados y por lo tanto, conteniendo múltiples plantillas, entonces se usó en una sola segunda reacción TMCA por sub-biblioteca con cebadores para las regiones 2 y 3 (ver Tabla 21, siguiente; región 2: aminoácidos 102 y 108; región 3: aminoácidos 124, 126, 128 y 133).

Tabla 20 t O Tabla 21 Las muestras fueron amplificadas en el vector pDOW-kan, analizadas por gel de agarosa, tratadas con DPNI y luego transformadas en células competentes de E. coli XLi-Blue. Colonias fueron cultivadas, tomadas y secuenciadas . Las colonias se conjuntaron y el ADN se preparó para cada sub-biblioteca usando el kit de mini-preparación Qiagen (# de catálogo 27106, Qiagen, Valencia, CA, Estados Unidos) . Células competentes de Pseudomonas fluorescens fueron transformadas entonces con el ADN. Las células se cultivaron en medio LB suplementado con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml) . Un número suficiente de colonias se obtuvo para una sobre-muestra de siete veces de la biblioteca (por lo menos 14,000 colonias).

La biblioteca se arregló, se cultivó en medio mínimo M9 suplementado con uracilo (750 g/ml) y kanamicina (50 yg/ml) y se ensayó con palmitato de 4-metilumbeliferilo 400 µ? en HEPES 80 mM a pH 7.5. Muestras se incubaron por 30 minutos a 54°C antes y después de la adición del sustrato. La fluorescencia se leyó a Ex360 nm & Em465 nm. 46 muestras de mutación silenciosa produjeron secuencias únicas (ver Tabla 22, siguiente). La lectura de fluorescencia para cada una de las 46 muestras de mutación silenciosa también se lita en la Tabla 22, primera columna "Actividad UMB" . Muestras de mutación silenciosa 2, 7, 9, 10, 13, 16, 23, 25, 40, y 44 tuvieron cambios de aminoácidos (AA) además de las mutaciones silenciosas (ver Tabla 23, siguiente).

O O Tabla 22 (continuación) Tabla 23 Las 46 muestras de mutación silenciosa únicas se cultivaron en matraces de agitación de 250 mL. Lisados clarificados se cuantificaron usando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos, # de catálogo 500-0006) con base en el método Bradford y después normalizados para expresión de proteínas totales. La expresión se analizó por SDS-PAGE.

El progenitor (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) , control negativo, y las 4 mutaciones silenciosas superiores se expresaron en escala 1L. Cada muestra fue lisada por micro- fluidizador o en la presencia del detergente BPER. Concentración de proteínas se cuantificó para lisados crudos y clarificados usando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos, # de catálogo 500-0006) con base en el método Bradford. Cada carril del gel de SDS-PAGE se cargó entonces con proteína total equivalente. Niveles de palmitasa similares se observaron bajo todas las condiciones de solubilidad y lisis probadas. Aciertos de mutaciones silenciosas 26, 34, 35 y 37 (Tablas 22 y 23, anteriores) desplegaron una mayor expresión porcentual de la palmitasa, según se compara con el progenitor (SEQ ID NO:2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) . El acierto de mutación silenciosa 35 tuvo el mayor porcentaje de expresión de palmitasa. El acierto de mutación silenciosa 35 tuvo las siguientes siete mutaciones silenciosas según se compara con el progenitor: (GCG) 35 (GCT) , (GTG) 102 (GTT) , (AGC) 108 (AGT) , (CTG) 117 (CTT) , (CGG) 126 (AGG) , (AGT) 133 (TCT) , y (ACC) 188 (ACG) . Ejemplo 12: Evolución Ejemplar para Expresión Mejorada de Palmitasas Tolerantes Térmicas Para evaluar la expresión de los 9 candidatos líderes de palmitasa tolerante térmica (ejemplo 10, Tablas 15, 16 y 17), las 7 mutaciones silenciosas superiores (ejemplo 11) se incorporaron en cada líder tolerante térmico como se describe a continuación. El resultado fue que cada líder tolerante térmico (aciertos de tolerancia térmica 29, 40, 41, 74, 81, 202, 204, 238, y 244) tuvo las siguientes mutaciones silenciosas incorporadas (35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, 188ACG) dentro de cada uno. Con las mutaciones silenciosas incorporadas, cada líder tolerante térmico fue re-nombrado mediante añadir "SM" al final del número de acierto de tolerante térmico. Por ejemplo, el acierto tolerante térmico 29 con las mutaciones silenciosas incorporadas fue re-nombrado "29 SM" . De manera similar, el acierto 40 se volvió "40 SM" , el acierto 41 se volvió "41 SM" , el acierto 74 se volvió "74 SM" , el acierto 81 se volvió "81 SM" , el acierto 202 se volvió "202 SM" , el acierto 204 se volvió "204 SM" , el acierto 238 se volvió "238 SM" , y el acierto 244 se volvió "244 SM" .

Para incorporar las 7 mutaciones silenciosas superiores dentro de los 9 líderes tolerantes térmicos, tecnología TMCA como se describe en la publicación PCT WO 2009/018499 y como se describe adicionalmente mas adelante se usó.

Para la primera ronda de evolución TMCA, los 9 líderes tolerantes térmicos superiores y el acierto de expresión líder (acierto de mutación silenciosa #35) se pasaron a través de células competentes de E. coli XLl-Blue para metilar el ADN. El acierto de mutación silenciosa #35 se usó como la plantilla de ADN. Los oligos listados en la Tabla 24 siguiente se usaron para incorporar combinaciones de mutaciones dentro de la plantilla de ADN.

Tabla 24 Nombre de Oligo Secuencia de Oligo - 5' -3' 1-ForJC TGGTGCTGCCCGGCTTCCTGTGTGACGACAACGCCACCTCGGT (SEQ ID NO: 62) 2-ForJC TTCGTGGCGACCTCGTGGACTATCTGGTCGACCGGCTGCGG (SEQ ID NO: 63) 2-Alt-ForJC TCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTATCTGGTCGACCGGCTGCGG (SEQ ID NO: 64) 3-ForJC CTGGTCGACCGGCTGCGGGCTGTGTCGAAGGCGGCCGGTGGTCAGAAG (SEQ ID NO: 65) 4-Re JC TCGGGCGCCTTGTGGCCAAGAATGCGCGCATAGAGGCCGCCGA (SEQ ID NO: 66) 4-Alt-RevJC TCGGGCGCCTTGTGGCCAAGATTGCGCGCATAGAGGCCGCCGA (SEQ ID NO: 67) 4-Alt2-RevJC TCGGGCGCCTTGTGGCCAAGAAGGCGCGCATAGAGGCCGCCGA (SEQ ID NO: 68) 5-RevJC CGGCTTAATCTGGAAATCCCGACCGATCGGCAGGTTGTCGACCG (SEQ ID NO: 69) 6-RevJC GGCGACCACACCGCGATGGTATGCACCGGCGGCTTAATCTGGA (SEQ ID NO: 70) 7-RevJC TTGGGCTCGAGTCAGAGCCGAGACGCGACCAGCCGGACCACAG (SEQ ID NO: 71 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa, y se trataron con DPNI . Muestras se transformaron en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se tomaron, cultivaron y secuenciaron. La secuenciación identificó varias combinaciones de mutaciones. Sin embargo, algunas combinaciones fueron sub-representadas . Por lo tanto, algunas de las nuevas construcciones a partir de la primera ronda de evolución TMCA se seleccionaron para uso como plantillas para la siguiente ronda de evolución TMCA. Las plantillas usadas se listan en la Tabla 25 siguiente.

Tabla 25 Las combinaciones de plantillas y oligos usados en la segunda ronda de evolución TMCA se listan en la Tabla 26 siguiente. Una reacción TMCA separada se corrió para cada fila en la Tabla 26, creando una biblioteca individual para cada fila.

Por ejemplo, una corrida consistió de la plantilla F8 y los cebadores 2For y 7Rev. Una segunda corrida consistió de la plantilla F8 y los cebadores 2For y 6Rev. Nota, varios de los mismos cebadores se usaron como en la primera ronda. Dos cebadores adicionales se ordenaron para la segunda ronda de PCR.

Estos oligos se nombraron 116LF y 162F. El oligo 116LF tiene la secuencia en reversa y complementaria del oligo 4 -Alt2-RevJC. El oligo 162F tiene la secuencia en reversa y complementaria de 5-RevJC .

Tabla 26 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa, y se trataron con DPNI . Las muestras se transformaron en células competentes de E. coli XL1-Blue. Las colonias se tomaron, se cultivaron y se secuenciaron. La secuenciación identificó representación suficientemente alta de 7 de las 9 construcciones deseadas. Sin embargo, como las otras dos construcciones fueron sub-representadas , una ronda adicional de evolución TMCA se requirió para obtener los líderes tolerantes térmicos restantes en combinación con las siete mutaciones silenciosas. Dos nuevas construcciones se usaron como plantillas par la tercera ronda de evolución TMCA. Estas plantillas son listadas en la Tabla 27 siguiente. Las combinacio-nes de plantillas y oligos usados en la tercera ronda se listan en la Tabla 28 siguiente. Una reacción TMCA separada se corrió para cada fila en la Tabla 28, creando una biblioteca individual para cada fila. Por ejemplo, una corrida consistió de la plantilla F3 y cebadores 162F y 7Rev. La segunda corrida consistió de la plantilla B5 y cebadores 162F y 6Rev.

Tabla 27 Tabla 28 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron por gel de agarosa, y se trataron con DPNI . Muestras se transformaron en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se tomaron, cultivaron y secuenciaron. Suficiente representación de las dos construcciones restantes se obtuvo. ADN para todas las construcciones deseadas de E. coli XLl-Blue se preparó y se transformó en células competentes de Pseudomonas fluorescens . Las células se cultivaron en medio LB suplementado con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml) . Las muestras se confirmaron por secuenciación .

Para clasificación, la biblioteca se cultivó en medio mínimo M9 suplementado con uracilo (750 ug/ml) y kanamicina (50 yg/ml) . Ensayos de aceite estándar se llevaron a cabo medainte cargar lisados clarificados a 10% de contenido de agua usando regulador de fosfato en ensayos de aceite crudo a los niveles de actividad de UMB-Palmitato listados en la columna izquierda de la Tabla 29. Ensayos de aceite se cargaron, se homogeneizaron y subsecuentemente se mezclaron continuamente como para reacciones estándar, a 25°C, 45°C, y 60°C. Alícuotas de 50 µ?, de NaOH al 11% se añadieron a 3 y 20 horas para cada reacción de aceite, luego se homogeneizaron . Alícuotas se removieron a 20, 44, y 68 horas y se sometieron a la extracción con cloroformo y metanol estándar y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el ejemplo 8 anterior) . El palmitato restante en el aceite se listó para cada alícuota en la Tabla 29. El acierto 29 SM de mutación silenciosa tolerante térmica redujo palmitato dramáticamente a través del curso de tiempo a 25°C (Tabla 29) . to o Oí Tabla 29 4^ Ejemplo 13: Sal de potasio de ácido oleico como emulsionante permite que la enzima genere 1% de aceite de palmitato Muestras de aceite se incubaron con oleato de potasio al 10% para evaluar el impacto de este emulsionante sobre reacciones de aceite con palmitasa. Lisados clarificados del acierto 29SM o control negativo se cargaron a 5% de contenido de agua en ensayos de aceite pre-tratado (A y B) y aceite crudo (C) . El pre-tratamiento fue llevado a cabo por tratamiento con enzimas, calentamiento, centrifugado y luego filtrado del aceite para remover la goma y fase acuosa y para reducir ácidos grasos libres, como se describe en el ejemplo 14, para generar un aceite de <5% de palmitato libre de goma. El aceite fue homogeneizado antes y después de adición de enzimas para asegurar emulsiones uniformes. 0.5 g de sal de potasio de ácido oleico obtenida comercialmente se pesaron en 5 g de aceite, se mezclaron a 60°C para solubilizar, y luego se homogeneizaron. Adición de cáustico para neutralización de FFA al 1% se añadió a las reacciones listadas "cáustico" . Ensayos de aceite se cargaron con enzima, se re-homogeneizaron y subsecuentemente se mezclaron continuamente como para reacciones estándar. Alícuotas se removieron a 3, 24, 48, 72, y 120 horas. Alícuotas se sometieron a extracción con cloroformo y metanol y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el ejemplo 8, anterior) . El palmitato restante en el aceite se lista para cada alícuota en la Tabla 30 siguiente. Los aceites pre-tratados se impulsaron exitosamente a un nivel de 1% de palmitato.

Tabla 30 Ejemplo 14: 2 kg de aceite con centrifugación intermedia y emulsión de oleato logra aceite de palmitato al 1% El impacto combinado del polipéptido, un paso de filtración intermedio, y adición de oleato de potasio para alcanzar aceite de palmitato al 1% se evaluaron a escala de laboratorio. 2 kg de aceite crudo se hicieron reaccionar con 29 SM a 5% de contenido de agua. La reacción de aceite se homogenei-zó por 1 minuto con un IKA a velocidad 6 logrando una temperatura de 25 °C. Un mezclador superior se ajustó con una paleta de mezclado de pintura y mezcló la reacción de aceite a 390 rpm. Después de 1 hora de reacción, la velocidad de mezclado se aceleró a 530 rpm. La temperatura de reacción se monitorizó y fluctuó de 21°C a 29°C con calentamiento intermitente a partir de un bloque de calor. Muestras se removieron para seguir cambios en el perfil de aceite. Después de 28 horas, la reacción se aceite se calentó a 66 °C y se centrifugó en un giro-probador . La fracción de aceite se enfrió a temperatura ambiente durante la noche con mezclado con paleta luego se enfrió con un baño de hielo a menos de 10 °C. Tierra diatomácea se añadió y los TAGS y DAGS se separaron de los ácidos grasos libres por filtración a través de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman. 1 kg de este aceite de palmitato reducido se usó para iniciar reacciones con oleato de potasio como un emulsionante. 100 g de oleato de potasio se añadieron al aceite. Las reacciones se calentaron a 60°C con agitación para asegurar solubilidad. El aceite se enfrió a 23 °C, luego 50 mi de enzima se añadieron para lograr 5% de contenido de agua. El aceite fue homogeneizado antes y después de la adición de enzima 29 SM para asegurar emulsiones uniformes. Alícuotas se removieron a 6, 21, 24, 28, postfiltración, post-adición de oleato, al inicio de nuevo ensayo y 3, 20, y 22 horas dentro del segundo ensayo. Alícuotas se sometieron a extracción estándar con cloroformo y metanol y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el ejemplo 8, anterior). Ácidos grasos libres restantes ligados en el aceite se listan para cada alícuota en la Tabla 31, siguiente. El acierto 29 SM fue capaz de llevar los niveles de palmitato a 1% en el aceite.

Tabla 31 Palmitato Estearato Oleato Linoleato Linolenato aceite 10 .7% 4 8% 23 2% 52 9% 8 4% 6h 7 5% 4 7% 23 7% 55 4% 8 7% 21h 5 0% 4 7% 24 2% 57 5% 8 7% 24h 4 9% 4 7% 24 2% 57 6% 8 7% 28h 4 7% 4 6% 24 2% 57 9% 8 6% aceite filtrado 4 8% 4 6% 24 2% 57 8% 8 6% aceite+oleato 4 9% 4 6% 24 2% 57 7% 8 6% +0h 4 7% 4 6% 24 2% 57 9% 8 5% +3h 2 6% 4 6% 24 5% 59 9% 8 4% +20h 1 0% 4 3% 24 4% 62 7% 7 7% +22h 1 0% 4 2% 24 3% 62 8% 7 6% Ejemplo 15: Doble Centrifugación y Filtración produce aceite bajo en palmitato La habilidad para separar al oleato de potasio después de reacciones de aceite se demostró a continuación. 2 kg de aceite crudo se hicieron reaccionar con 29 SM a 5% de contenido de agua. La reacción de aceite se homogeneizo por 1 minuto con un IKA a velocidad 6 logrando una temperatura de 25 °C. Un mezclador superior se ajustó con una paleta mezcladora de pintura y mezcló la reacción de aceite a 390 rpm. Después de 1 hora de reacción, la velocidad de mezclado se aceleró a 530 rpm. La temperatura de reacción se monitorizó y fluctuó de 21°C a 29°C con calentamiento intermitente a partir de un bloque de calor. Muestras se removieron para seguir cambios en el perfil de aceite. Después de 28 horas, la reacción se aceite se calentó a 80°C y se centrifugó en un giro-probador. La fracción de aceite se enfrió a temperatura ambiente durante la noche con mezclado con paleta luego se enfrió con un baño de hielo a menos de 10°C. Tierra diatomácea se añadió y los TAGS y DAGS se separaron de los ácidos grasos libres por filtración a través de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman. 1 kg de este aceite tratado se usó para iniciar reacciones con oleato de potasio como un emulsionante. 50 g de oleato de potasio se añadieron para lograr 5%. Esto se mezcló y se homogeneizó. 50 mi de enzima se cargaron para lograr 5% de contenido de agua y se homogeneizaron por 1 minuto a 6 en el IKA logrando 26.6°C. Esta reacción de aceite se mezcló con una paleta mezcladora de pintura ajustada a un mezclador superior a 400 rpm. Calentamiento intermitente con bloque de calor se utilizó. Alícuotas se removieron a 3, 20, 24, y a 8, 28, y 48 horas después del inicio del segundo ensayo. Alícuotas se sometieron a extracción estándar de cloroformo y metanol y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el ejemplo 8, anterior) . Ácidos grasos permaneciendo ligados en el aceite se listan para cada alícuota en la Tabla 32, siguiente. 29 SM llevó los niveles de palmitato a 1.5%. Este aceite se calentó a 85°C y se centrifugó removiendo los desechos de proteína. La fracción de aceite se enfrió a 6°C con mezclado con paleta, tierra diatomácea se añadió y el material se separó sobre un embudo Buchner. La filtración se continuó a 25 °C.

Tabla 32 Palmitato Estearato Oleato Linoleato Linolenato aceite 10 .7% 4 8% 23 2% 52 9% 8 4% 3h 8. 3% 4 7% 23 5% 54 8% 8 7% 20h 4. 9¾ 4 7% 24 3% 57 4% 8 7% 24h 4. 7% 4 6% 24 1% 57 9% 8 7% +8h 3. 2% 4 6% 24 4% 59 3% 8 5% +28h 1. 9% 4 5% 24 4% 60 9% 8 3% +48h 1. 5% 4 4% 24 5% 61 5% 8 1% Ejemplo 16: Optimización de Codones Versiones optimizadas de codones para expresión en Pseudowonas fluorescens del acierto 29 SM de mutación silenciosa tolerante térmica líder (ejemplo 12) se diseñaron mediante dos métodos diferentes. La primera versión optimizada de codón reemplazó todos los codones en el acierto 29 SM con aquellos preferidos por Pseudomonas fluorescens, incluyendo las 7 mejores mutaciones silenciosas incorporadas (ejemplo 12) . Esta versión fue nombrada 29SM-PÍ (SEQ ID NO: 22) . Uso de codón preferido para Pseudomonas fluorescens se determinó por revisión de la Base de Datos de Uso de Codones disponible en línea en el sitio web de Kazusa DNA Research Institute (2-6-7 Kazusa-kamatari , Kisarazu, Chiba 292-0818 Japón, recuperada en 2009 de Internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html>). En particular, los patrones de uso de codones para Pseudomonas fluorescens PfO-1 (recuperada en 2009 de Internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/ codon/cgi-bin/showcodon. cgi?species=205922>) y Pseudo onas fluorescens Pf-5 (recuperada en 2009 de Internet <URL: h t t p : / / w w w . k a z u s a . o r . j p / c o d o n / c g i -bin/showcodon. cgi?species=220664>) se usaron para diseñar la secuencia optimizada de codones, SEQ ID NO: 22.

La segunda versión optimizada de codones también reemplazó todos los codones en el acierto 29SM con aquellos preferidos por Pseudomonas fluorescens, excepto que mantuvo las 7 mutaciones silenciosas líderes (ejemplo 11) . Esta versión se nombró 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23) . 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23) es el mejor candidato sobre 29SM-Pf (SEQ ID NO:22).

SEQ ID NO: 22: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGATATCCC GGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCA GATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGACGACAACGCGA CCAGCGTGCTGCGGAAGACCTTCGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTG GGAAAAGGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCG ACCGCCTGCGCGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTAATCGTGG TCGGCTGGTCCCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGTTGGGCCACAAGGCCCC CGAACTGATCCGTATGGTCGTCACGCTCGGCTCCCCGTTCGCCGGCGACCTCC ACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCATCAACTCCCACACGGTCGAC AACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGC CGTGTGGAGCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAG CCCCGAGCAGAGCGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTT GCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA SEQ ID NO: 23: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGATATCCC GGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCT GATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGACGACAACGCGA CCAGCGTGCTGCGGAAGACCTTCGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTG GGAAAAGGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCG ACCGCCTGCGCGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTTATCGTGG TCGGCTGGAGTCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGCTTGGCCACAAGGCCCC CGAACTGATCAGGATGGTCGTCACGCTCGGCTCTCCGTTCGCCGGCGACCTCC ACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCATCAACTCCCACACGGTCGAC AACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGC CGTGTGGAGCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAG CCCCGAGCAGAGCGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTT GCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA Las secuencias de ambas versiones optimizadas de codones del gen se enviaron a DNA 2.0 Incorporated (Menlo Park, CA, Estados Unidos) para síntesis de ADN. Los genes fueron sintetizados en el vector pJ201 con un sitio de restricción Spel y Xhol en cualquier lado del gen. Cuando los genes sintetizados se entregaron, los plásmidos se cortaron con enzimas de restricción. ADN de vector pDOW-Kan también se cortó con las mismas enzimas de restricción y se trataron con fosfatasa alcalina intestinal de becerro (New England Biolabs Producto #M0290L) . Todas las muestras se purificaron con gel y se extrayeron usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Producto #28706) . El vector y los insertos entonces se ligaron usando el kit de Ligación Rápida Roche (Roche, # de Producto 11635379001) . Productos de ligación entonces se transformaron en células competentes de E. coli XLl-Blue. Colonias se tomaron, cultivaron y ADN se prepararon usando el kit de mini-preparación Qiagen. Las muestras de ADN se confirmaron con secuencia y ADN entonces se usó para transformar Pseudomonas fluorescens . 29SM-PÍ (SEQ ID NO:22), 29SM-PÍ+SM (SEQ ID NO:23), 29SM, el progenitor (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) y el control de hospedero/vector se cultivaron e indujeron en matraces de agitación de 250 mL. Concentración de proteínas en los lisados clarificados se cuantificaron usando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, # de catálogo 500-0006) con base en el método Bradford y luego normalizado para expresión de proteínas totales. Expresión se analizó por SDS-PAGE, con cada carril del gel de SDS-PAGE cargado con proteínas totales iguales. 29SM-Pf y 29SM-PÍ+SM tuvieron un mayor porcentaje de proteína palmitasa expresada según se compara con 29SM y el progenitor. 29SM-PÍ+SM tuvo un ligeramente mayor porcentaje de expresión de palmitasa que 29SM-Pf . La mejora en expresión fue ligeramente mas pronunciada en la presencia de las mutaciones silenciosas.

Un número de formas de realización según son provistas en la presente han sido descritas. Sin embargo, se entenderá que varias modificaciones pueden hacerse sin salir del espíritu y alcance según son provistas en la presente. De manera acorde, otras formas de realización están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende (a) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido en donde el ácido nucleico comprende una secuencia teniendo por lo menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% , 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 , 83%, 84%, 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99%, o mas , o identidad de secuencia completa (100%) con: (i) SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, o (ii) el ácido nucleico de la SEQ ID NO:l teniendo uno o mas cambios de nucleótidos (o los equivalentes de los mismos) codificando uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de aminoácidos (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico de (i) o (ii) codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, o codifica un polipéptido o péptido capaz de generar un anticuerpo específico de hidrolasa (un polipéptido o péptido que actúa como un epí opo o inmunógeno) , (b) el ácido nucleico (polinucleótido) de (a) , donde las identidades de secuencia se determinan: (A) por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, o (B) sobre una región de por lo menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,050, 1,100, 1,150, 1,200, 1,250, 1,300, 1,350, 1,400, 1,450, 1,500, 1,550 o mas residuos o la longitud completa de un ADNc, transcripción (ARNm) o gen, (c) el ácido nucleico (polipéptido) de (a) o (b) , en donde, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 en donde una configuración de filtrado se fija en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se fijan en predeterminadas, (d) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido o péptido teniendo una actividad de hidrolasa, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida bajo condiciones severas al complemento del ácido nucleico de (a) , (b) o (c) , donde las condiciones severas comprenden un paso de lavado que comprende un lavado en 0.2X SSC a una temperatura de alrededor de 65°C por alrededor de 15 minutos, (e) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de aminoácidos (o los equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, (f) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica por lo menos un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO.-14, SEQ ID NO.-16, SEQ ID NO.-18, o SEQ ID NQ.-20 o fragmentos enzimáticamente activos de los mismos, (g) (A) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (f) y codificando un polipéptido teniendo por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos y reteniendo su actividad de hidrolasa, o (B) el ácido nucleico de (g) (A) , en donde la por lo menos una sustitución conservadora de aminoácidos comprende sustituir un aminoácido con otro aminoácido de características similares; o, una sustitución conservadora comprende: reemplazo de un aminoácido alif tico con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo portando un grupo amida con otro residuo portando un grupo amida; intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, (h) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (g) codificando un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa pero careciendo de una secuencia de señal, (i) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (h) codificando un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa comprendiendo además una secuencia heterologa, (j) el ácido nucleico (polinucleótido) de (i), donde la secuencia heterologa comprende, o consiste de una secuencia que codifica: (A) una secuencia de señal heterologa, (B) la secuencia de (A) , donde la secuencia de señal heterologa se deriva de una enzima heterologa, o (C) , un marcador, un epítopo, un péptido que apunta, una secuencia disociable, una fracción detectable o una enzima, o (k) una secuencia de ácidos nucleicos (polinucleótido) enteramente (completamente) complementaria a la secuencia de cualquiera de (a) a (j) .

2. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, en donde la actividad de hidrolasa comprende actividad de lipasa, saturasa, estearatasa o palmitasa, en donde opcionalmente , la actividad de saturasa comprende hidrolizar selectivamente por lo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ésteres de ácidos grasos saturados, en donde opcionalmente , los ésteres hidrolizados pueden ser ésteres de ácidos grasos saturados y glicerol, umbeliferol u otros alcoholes, en donde opcionalmente, la actividad de palmitasa comprende selectivamente hidrolizar ácidos grasos tal que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 8 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido palmítico, o en donde opcionalmente, la actividad de estearatasa comprende selectivamente hidrolizar ácidos grasos tal que al menos ¡ 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido esteárico .

3. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, en donde la actividad de hidrolasa comprende (a) hidrolizar un triacilglicerol a un diacilglicerol y un ácido graso libre, o, hidrolizar un triacilglicerol a un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, o, hidrolizar un diacilglicerol a un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, o, hidrolizar un monoacilglicerol a un ácido graso libre y un glicerol, o, comprende hidrolizar un triacilglicerol (TAG) , un diacilglicerol (DAG) o un monoacilglicerol (MAG) , (b) sintetizar un triacilglicerol a partir de un diacilglicerol o un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, (c) sintetizar 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1 , 3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS), l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2 , 3 -dimiristoilglicerol (OMM) , ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga, ácido araquidóni-co, ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) , (d) actividad de hidrolasa que es específica de posición de triacilglicerol (TAG) , diacilglicerol (DAG) o monoacilglicerol (MAG) , en donde opcionalmente la actividad de hidrolasa es específica de Sn2, específica de Snl o Sn3, (e) actividad de hidrolasa que es específica de ácidos grasos, en donde opcionalmente el ácido graso es un ácido graso palmítico, esteárico, u otro saturado, (f) modificar aceites por hidrólisis, alcohólisis, esterificación, trans-esterificación o inter-esterificación, (g) actividad de hidrolasa que es regio-específica o quimioselectiva, en donde opcionalmente la actividad de hidrolasa comprende síntesis de productos quirales enantioméricamente puros, o, (h) síntesis de ásteres de umbeliferil ácido graso (FA) .

4. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, en donde la actividad de hidrolasa es termo-estable, en donde opcionalmente el polipéptido retiene una actividad de lipasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperaturas de entre alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20°C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25°C a alrededor de 37 °C, alrededor de 37°C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55°C, alrededor de 55°C a alrededor de 70°C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75°C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90°C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110°C, alrededor de 110°C a alrededor de 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C O mas .

5. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, en donde la actividad de hidrolasa es termo-tolerante, en donde opcionalmente el polipéptido retiene una actividad de lipasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperaturas de entre alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20°C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25°C a alrededor de 37 °C, alrededor de 37 °C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55°C, alrededor de 55°C a alrededor de 70°C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75°C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90 °C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110°C, alrededor de 110°C a alrededor de 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C O mas .

6. Un cartucho de expresión, un vector o un vehículo de clonación que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1, en donde opcionalmente el vehículo de clonación comprende un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial, en donde opcionalmente el vector viral comprende un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adeno-asociado, y opcionalmente el vehículo de clonación comprende un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un plásmido, un vector derivado de bacteriófago Pl (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) .

7. Una célula transformada comprendiendo un ácido nucleico comprendiendo una secuencia como se señala en la reivindicación 1, o un cartucho de expresión, vector o vehículo de clonación como se señala en la reivindicación 6, en donde opcionalmente la célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de planta.

8. Un animal no humano transgénico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1, en donde opcionalmente el animal es un ratón.

9. Una planta transgénica comprendiendo una secuencia como se señala en la reivindicación 1, en donde opcionalmente la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de papa, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de semilla oleaginosa, una planta de colza, una planta de soya, una planta de arroz, una planta de cebada, un pasto, o una planta de tabaco .

10. Una semilla transgénica comprendiendo una secuencia como se señala en la reivindicación 1, en donde opcionalmente la semilla es arroz, una semilla de maíz, una semilla de trigo, una semilla oleaginosa, una colza, una semilla de soya, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de ajonjolí, un arroz, una cebada, un maní o una semilla de planta de tabaco.

11. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante comprendiendo una secuencia (a) teniendo por lo menos alrededor de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% , 99% , o mas , o identidad de secuencia completa (100%) con: (i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, y teniendo por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de residuos de aminoácidos (o equivalentes de los mismos) como se señalan en la Tabla3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 20, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en donde el polipéptido o péptido de (i) o (ii) tiene una actividad de hidrolasa, o el polipéptido o péptido es capaz de generar un anticuerpo específico de hidrolasa (un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno) , (b) el polipéptido o péptido de (a) , en donde las identidades de secuencia se determinan: (A) por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por una inspección visual, o (B) sobre una región de por lo menos alrededor de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 o mas residuos de aminoácidos, o sobre la longitud completa del polipéptido o péptido o enzima, y/o sub-secuencias enzimáticamen-te activas (fragmentos) de las mismas, (c) el polipéptido o péptido de (b) , donde el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde una configuración de filtrado se fija en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se fijan a predeterminadas ; (d) una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene (i) una actividad de hidrolasa, o, (ii) tiene actividad inmunógena en que es capaz de generar un anticuerpo que se liga específicamente a un polipéptido teniendo una secuencia de (a) , y/o sub-secuencias enzimáticamente activas (fragmentos) de la misma; (e) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (d) , y comprendiendo por lo menos una sustitución conservadora de residuos de aminoácidos, y el polipéptido o péptido retiene una actividad de hidrolasa; (f) la secuencia de aminoácidos de (e) , en donde la sustitución conservadora comprende reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo portando un grupo amida con otro residuo portando un grupo amida; intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, o una combinación de los mismos , (g) la secuencia de aminoácidos de (f ) , en donde el residuo alifático comprende alanina, valina, leucina, isoleucina o un equivalente sintético de los mismos; el residuo ácido comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo comprendiendo un grupo amida comprendiendo asparagina, glutamina o un equivalente sintético de los mismos; el residuo básico comprende lisina, arginina, histidina o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo aromático comprende fenilalanina, tirosina, triptofano o un equivalente sintético de los mismos; (h) el polipéptido de cualquiera de (a) a (f) teniendo una actividad de hidrolasa pero careciendo de una secuencia de señal , (i) el polipéptido de cualquiera de (a) a (h) teniendo una actividad de hidrolasa, v.gr., actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprendiendo además una secuencia heteróloga; (j) el polipéptido de (i), en donde la secuencia heteróloga comprende, o consiste de: (A) una secuencia de señal heteróloga, (B) la secuencia de (A) , en donde la secuencia de señal heteróloga se deriva de una enzima heteróloga, y/o (C¡ un marcador, un epítopo, un péptido que apunta, una secuencia disociable, una fracción detectable o una enzima; o (m) comprendiendo una secuencia de aminoácidos codificada por cualquier secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1.

12. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde la actividad de hidrolasa comprende una actividad de lipasa, actividad de saturasa, estearatasa o palmitasa, en donde opcionalmente, la actividad de saturasa comprende hidrolizar selectivamente por lo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% O 100% de los ésteres de ácidos grasos saturados, en donde opcionalmente, los ésteres hidrolizados pueden ser ésteres de ácidos grasos saturados y glicerol, umbeliferol u otros alcoholes, en donde opcionalmente, la actividad de palmitasa comprende selectivamente hidrolizar ácidos grasos tal que menosi 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido palraítico, o en donde opcionalmente, la actividad de estearatasa comprende selectivamente hidrolizar ácidos grasos tal que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 s / 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados sean ácido esteárico .

13. El polipéptido aislado, sintético, o recombinante de la reivindicación 11, en donde la actividad de hidrolasa comprende (a) hidrolizar un triacilglicerol a un diacilglicerol y un ácido graso libre, o, hidrolizar un triacilglicerol a un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, o, hidrolizar un diacilglicerol a un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, o, hidrolizar un monoacilglicerol a un ácido graso libre y un glicerol, o comprende hidrolizar un triacilglicerol (TAG) , un diacilglicerol (DAG) o un monoacilglicerol (MAG) , (b) sintetizar un triacilglicerol a partir de un diacilglicerol o un monoacilglicerol y ácidos grasos libres, (c) sintetizar 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1, 3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS), l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2 , 3 -dimiristoilglicerol (OMM) , ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga, ácido araquidóni-co, ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) , (d) actividad de hidrolasa que es específica de posición de triacilglicerol (TAG) , diacilglicerol (DAG) o monoacilglicerol (MAG) , en donde opcionalmente la actividad de hidrolasa es específica de Sn2, específica de Snl o Sn3, (e) actividad de hidrolasa que es específica de ácidos grasos, en donde opcionalmente el ácido graso es un ácido graso palmítico, esteárico, u otro saturado, (f) modificar aceites por hidrólisis, alcohólisis, esterificación, trans-esterificación o inter-esterificación, (g) actividad de hidrolasa que es regio-específica o quimioselectiva, en donde opcionalmente la actividad de hidrolasa comprende síntesis de productos quirales enantioméricamente puros, o, (h) síntesis de ásteres de umbeliferil ácido graso (FA) .

14. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde la actividad de hidrolasa es termo-estable, en donde opcionalmente el polipéptido retiene una actividad de hidrolasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperaturas de entre alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20°C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25°C a alrededor de 37°C, alrededor de 37°C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55 °C, alrededor de 55°C a alrededor de 70 °C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75 °C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90°C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110°C, alrededor de 110°C a alrededor de 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C( 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o mas .

15. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde la actividad de hidrolasa es termo-tolerante, en donde opcionalmente el polipéptido retiene una actividad de hidrolasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperaturas de entre alrededor de -100°C a alrededor de -80°C, alrededor de -80°C a alrededor de -40°C, alrededor de -40°C a alrededor de -20°C, alrededor de -20 °C a alrededor de 0°C, alrededor de 0°C a alrededor de 5°C, alrededor de 5°C a alrededor de 15°C, alrededor de 15°C a alrededor de 25°C, alrededor de 25°C a alrededor de 37°C, alrededor de 37°C a alrededor de 45°C, alrededor de 45°C a alrededor de 55°C, alrededor de 55°C a alrededor de 70°C, alrededor de 70°C a alrededor de 75°C, alrededor de 75°C a alrededor de 85°C, alrededor de 85°C a alrededor de 90°C, alrededor de 90°C a alrededor de 95°C, alrededor de 95°C a alrededor de 100°C, alrededor de 100°C a alrededor de 105°C, alrededor de 105°C a alrededor de 110°C, alrededor de 110°C a alrededor de 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C O mas .

16. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde la actividad de hidrolasa comprende una actividad específica a alrededor de 37°C en el rango de alrededor de 100 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 500 a alrededor de 750 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 500 a alrededor de 1,200 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 750 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína .

17. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde el polipéptido comprende por lo menos un sitio de glicosilación, en donde opcionalmente la glicosilación es un glicosilación N-enlazada y opcionalmente el polipéptido es glicosilado después de ser expresado en un P. pasto is o un S. pombe.

18. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 11, en donde el polipéptido retiene una actividad de hidrolasa bajo condiciones que comprenden pH 3.0, alrededor de pH 3.5, alrededor de pH 4.0, alrededor de pH 4.5, alrededor de pH 5.0, alrededor de pH 5.5, alrededor de pH 6.0, alrededor de pH 6.5, alrededor de pH 7.0, alrededor de pH 7.5, alrededor de pH 8.0, alrededor de pH 8.5, alrededor de pH 9.0, alrededor de pH 9.5, alrededor de pH 10.0, alrededor de pH 10.5, alrededor de pH 11.0, alrededor de pH 11.5, alrededor de pH 12.0 o mas.

19. Una preparación de proteína que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido o un gel.

20. Un heterodímero que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11 y un segundo dominio, en donde opcionalmente el segundo dominio es un polipéptido y el heterodímero es una proteína de fusión, o el segundo dominio es un epítopo o un marcador.

21. Un homodímero que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11.

22. Un polipéptido inmovilizado, en donde el polipéptido comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 11, o una sub-secuencia de la misa, en donde opcionalmente el polipéptido es inmovilizado en una célula, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un micro-electrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, un arreglo o un tubo capilar.

23. Un arreglo comprendiendo (i) un polipéptido inmovilizado como se señala en la reivindicación 11.

24. Un anticuerpo aislado, sintético o recombinante que se liga específicamente a un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, en donde opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

25. Un hibridoma que comprende un anticuerpo que se liga específicamente a un polipéptido como se señala en la reivindicación 11.

26. Un alimento, alimentación, suplemento alimenticio, suplemento de alimentación, auxiliar dietario o composición dietaria que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, o una sub-secuencia del mismo, en donde opcionalmente el polipéptido es glicosilado.

27. Una matriz de entrega de enzimas comestible que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, en donde opcionalmente la matriz de entrega comprende una pelotilla, y opcionalmente el polipéptido es glicosilado, o el polipéptido tiene una actividad de hidrolasa termo-tolerante o termo-estable .

28. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1; y (b) expresar al ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permiten expresión del polipéptido, con lo cual produciendo un polipéptido recombinante, en donde opcionalmente el método además comprende transformar una célula hospedera con el ácido nucleico del paso (a) seguido por expresar al ácido nucleico del paso (a) , con lo cual produciendo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

29. Un método para identificar un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa comprendiendo los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en la reivindicación 11; (b) proporcionar un sustrato de hidrolasa; y (c) poner en contacto al polipéptido con el sustrato del paso (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, en donde opcionalmente el sustrato es un ácido graso, un triacilglicerol (TAG) , un diacilglicerol (DAG) o un monoacilglicerol (MAG) .

30. Un método para incrementar termo-tolerancia o termo-estabilidad de un polipéptido de hidrolasa, el método comprendiendo glicosilar un polipéptido de hidrolasa, en donde el polipéptido comprende por lo menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, con lo cual incrementando la termo-tolerancia o termo-estabilidad del polipéptido de hidrolasa, en donde opcionalmente la actividad específica de hidrolasa es termo-estable o termo-tolerante a una temperatura en el rango de mas de alrededor de -100°C a alrededor de 115°C.

31. Una composición detergente que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11, en donde el polipéptido comprende una actividad de hidrolasa, en donde opcionalmente la hidrolasa es una hidrolasa no de superficie activa o una hidrolasa de superficie activa, u opcionalmente la hidrolasa se formula en una composición líquida no acuosa, un sólido forjado, una forma granular, una forma en partículas, una tableta comprimida, una forma de gel, un polvo, un gel, un hidrogel, un liposoma, un aerosol, una pasta o una forma de lechada.

32. Un método para lavar un objeto que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido teniendo una actividad de hidrolasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 11; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) y al objeto del paso (b) bajo condiciones en donde la composición puede lavar al objeto.

33. Un método para hidrolizar estéreo-selectivamente mezclas de ásteres de ácidos 2-sustituidos que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una hidrolasa como se señala en la reivindicación 11, en donde la hidrolasa es estéreo-selectiva; (b) proporcionar una composición que comprende una mezcla racémica de esteres de ácidos 2 -sustituidos; y (c) poner en contacto al polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido del paso (b) puede hidrolizar selectivamente los ésteres, en donde opcionalmente la hidrolasa es inmovilizada, y opcionalmente el ácido 2-sustituido comprende un ácido 2-ariloxi sustituido, un ácido R-2- (4 -hidroxifenoxi ) propiónico o un ácido 2-arilpropiónico, en donde opcionalmente el ácido 2-sustituido comprende un cetoprofeno.

34. Una composición que comprende una hidrolasa como se señala en la reivindicación 11, la hidrolasa variante de la reivindicación 35, o la enzima generada por el método de la reivindicación 37, en donde opcionalmente la composición es un alimento, alimentación, suplemento alimenticio, suplemento de alimentación, auxiliar dietario o composición dietaria, y en donde opcionalmente el alimento, alimentación, suplemento alimenticio, suplemento de alimentación, auxiliar dietario o composición dietaria además comprende una base nutrimental comprendiendo una grasa o una grasa y nada o poca hidrolasa, u opcionalmente la hidrolasa es activada por una sal biliar, u opcionalmente el alimento, alimentación, suplemento alimenticio, suplemento de alimentación, auxiliar dietario o composición dietaria comprendiendo una fórmula infantil a base de leche de vaca, u opcionalmente la hidrolasa puede hidrolizar ácidos grasos de cadena larga.

35. Un método para generar un variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de hidrolasa comprendiendo los pasos de : (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla como se señala en la reivindicación 1; y (b) modificar, suprimir o añadir uno o mas nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar un variante del ácido nucleico de plantilla, en donde opcionalmente el método además comprende expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de hidrolasa variante, y opcionalmente las modificaciones, adiciones o supresiones se introducen por un método comprendiendo PCR susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleó-tido, PCR de ensamble, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cartucho, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR o GeneReassembly) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de los mismos.

36. El método de la reivindicación 35, en donde el método es repetido iterativamente hasta que (a) (i) una hidrolasa teniendo una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de aquella de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla se produce en donde opcionalmente el polipéptido de hidrolasa variante es termo-tolerante, y retiene alguna actividad después de estar expuesto a una temperatura elevada, u, opcionalmente el polipéptido de hidrolasa variante tiene glicosilación incrementada según se compara con la hidrolasa codificada por un ácido nucleico de plantilla, u opcionalmente el polipéptido de hidrolasa variante tiene una actividad de hidrolasa bajo una alta temperatura, en donde la hidrolasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no está activa bajo la alta temperatura, (ii) una secuencia de codificación de hidrolasa teniendo un uso de codón alterado de aquel del ácido nucleico de plantilla se produce, en donde opcionalmente el método se repite iterativamente hasta que un gen de hidrolasa teniendo mayor o menor nivel de expresión de mensaje o estabilidad de aquellos del ácido nucleico de plantilla se produce, o, (iii) una hidrolasa teniendo especificidad de sustrato alterada o preferencia de sustrato se produce, en donde opcionalmente la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la hidrolasa variante comprende hidrólisis preferen-cial o incrementada de ácido palmítico de un aceite, o, la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la hidrolasa variante comprende hidrólisis preferencial o incrementada de ácido esteárico a partir de un aceite, o la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la hidrolasa variante comprende hidrólisis preferencial o incrementada de ácido palmítico o esteárico a partir de un aceite, o, (b) la hidrolasa de (a), en donde el variante tiene, por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o mas o todos los cambios de residuos de aminoácidos (o el equivalente de los mismos) como se señalan en la Tabla 3 o la Tabla 4.

37. Un método para hacer una enzima teniendo una especificidad de sustrato alterada o preferencia de sustrato comprendiendo : (a) proporcionar una hidrolasa progenitora como se señala en la reivindicación 11; y (b) hacer por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o mas modificaciones de residuos de aminoácidos a la enzima hidrolasa progenitora, en donde opcionalmente las modificaciones de residuo de aminoácidos corresponden a las mutaciones de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2 como se muestran en la Tabla 3 o Tabla 4 (o el equivalente de las mismas) , con ello generando una enzima teniendo una especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alteradas, en donde opcionalmente la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alteradas comprendiendo hidrólisis preferencial o incrementada de ácido palmítico, en donde opcionalmente la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alteradas comprendiendo hidrólisis preferencial o incrementada de ácido esteárico, en donde opcionalmente la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato alterada comprende hidrólisis preferen-cial de un ácido graso particular, en donde opcionalmente el ácido graso es un ácido graso saturado, en donde opcionalmente el ácido graso es un ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico.

38. Una lipasa comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se señala en la SEQ ID NO: 2 pero también comprendiendo (a) por lo menos modificación de residuos de aminoácidos A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; A225S, o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos; (b) por lo menos una codificación de codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 45 (GGA) ; (GCG) 92 (GCT) ; (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CGT) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG) ; (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (ATG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) , o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos; o (c) la lipasa de (a) comprendiendo además por lo menos una modificación de codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 45 (GGA) ; (GCG) 92 (GCT) ; (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CGT) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG) ; (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (ATG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) O el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas.

39. Una lipasa comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se señala en la SEQ ID NO: 2 pero también comprendiendo por lo menos una modificación de residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, O el equivalente de las mismas, o una combinación de las mismas.

40. La lipasa de la reivindicación 38 o 39, en donde la especificidad de sustrato o preferencia de sustrato de la nueva lipasa comprende hidrólisis preferencial o incrementada de un ácido graso según se compara con la SEQ ID NO: 2 "progenitora" , en donde opcionalmente el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico.

41. Un cosmético o una crema comprendiendo una lipasa de la reivindicación 38 o la reivindicación 39, o un polipéptido como se señala en la reivindicación 11.

42. Un fármaco, un liposoma, una tableta, una cápsula, una formulación o un agente de entrega de fármacos que comprende una lipasa de la reivindicación 38 o la reivindicación 39, o una enzima como se señala en la reivindicación 11.