CN1201001C - 细胞重新编程方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过胞核增加来对动物细胞和动物细胞胞核重新编程。本发明还涉及用包括胞核增加的方法来产生动物细胞、细胞系、组织、器官、胚胎和非人动物。

Description

细胞重新编程方法
技术领域
本发明涉及通过细胞核增加来对动物细胞和动物细胞核重新编程。本发明还涉及用包括胞核增加的方法来产生动物的细胞、细胞系、组织、器官、胚胎和非人动物。
背景技术
胞核增加是将一个细胞的细胞核加入另一细胞的细胞核中。胞核增加与胞核转移的不同之处在于，将胞核加入未去核的细胞中，然后该细胞可能丧失或随后除去受者(即宿主细胞)的胞核或胞核DNA(去核)。胞核增加与胞核转移相比有某些优点，它能增强胞核重新编程的效率以及发育能力，从而产生用于农业、医学、兽医学和研究用途的动物细胞、细胞系、组织、器官、胚胎和动物。
胞核转移已被用来产生克隆后代，该方法是将供者胞核转移到卵母细胞中，该卵母细胞中的母体染色体被事先除去或去核。
由于能通过例如胞核转移来产生克隆的后代，因此能产生大量相同的后代，而且有机会选出所需的动物基因型。例如，可根据患者特异的或与供体匹配的主要组织相容性基因、或动物性别、抗疾病能力、增强的生产性状或任何其它理由，从动物、胚胎、培养的细胞或培养的细胞系选出胞核供体细胞来源。同样，可从基因工程改造的或修饰的细胞选出胞核供体细胞，以产生转基因细胞、胚胎和非人动物。
尽管已经描述了在一些动物中通过胞核转移来对细胞重新编程，但是所用程序通常是低效率的。
本发明的目的是克服或至少减少现有技术中的一个或多个困难或缺陷。
发明内容
本发明涉及一种制备重新编程的二倍体细胞的方法，该方法包括
提供
二倍体供体细胞或二倍体供体胞核，和
受体细胞；
将供体细胞或供体胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体胞核重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞中的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞。
在一个较佳的实施方案中，该方法是一种制备重新编程的经基因修饰的二倍体细胞的方法，所述方法包括
提供
二倍体供体细胞或二倍体供体胞核，该供体细胞或胞核已经过基因修饰而除去或降低了不希望有的活性或提供或提高了所需的活性，和
受体细胞；
将供体细胞或胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体胞核重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的经基因修饰的二倍体细胞。
本发明还涉及用上述方法产生的重新编程的二倍体细胞或所述细胞的衍生物在制备用于恢复或提高组织或器宫功能的药物中的用途，和用上述方法产生的重新编程的基因修饰的二倍体细胞或所述细胞的衍生物在制备用于基因治疗的药物中的用途。
本发明还涉及一种产生细胞系、组织、器官或非人动物胚胎的方法，该方法包括根据上述方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生细胞系、组织、器官或非人动物胚胎。
本发明还涉及一种产生非人动物的方法，该方法包括根据上述方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生非人动物胚胎，再从所述非人动物胚胎产生非人动物。
本发明还涉及一种产生经基因修饰的细胞、细胞系、组织或器官或非人转基因动物胚胎的方法，该方法包括根据上述方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生细胞系、组织、器官或非人转基因动物胚胎。
本发明还涉及一种产生非人转基因动物的方法，该方法包括根据上述方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生非人转基因动物胚胎，再从所述非人转基因动物胚胎产生非人转基因动物。
本发明还涉及用上述方法产生的重新编程的二倍体细胞、重新编程的基因修饰的二倍体细胞、细胞、细胞系或组织、或基因修饰的细胞、细胞系或组织。
本发明还涉及一种产生非人动物胚胎的方法，该方法包括
提供
二倍体供体胞核，和
受体细胞；和
将供体胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述非整倍体细胞的受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从所述重新编程的二倍体细胞产生动物胚胎。
具体而言，本发明第一方面提供一种制备重新编程的二倍体细胞的方法，该方法包括：
提供一个供体细胞或供体细胞核，和一个受体细胞；
将供体细胞或供体细胞核导入受体细胞中，以产生非整倍的细胞；
使非整倍体细胞在合适的环境下维持足以使供体细胞核重新编程的时间；和
通过所述重新编程的非整倍体细胞的受体细胞核或细胞核DNA的去除、破坏或丢失，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞。
申请人已经发现胞核增加的破坏性可能比胞核转移小。在胞核增加时，将供体胞核放入完整细胞中，使其受重新编程性因素的作用。这些重新编程性因素可能与受体细胞的中期板、细胞核、染色质、染色体或DNA有关，或与通常通过受体细胞因胞核转移程序而被除去或缺失的胞质组分有关。胞质增加使得供体细胞核虽然接触这些因素但对细胞功能破坏最少。
胞核增加包括在导入供体细胞核之后或同时，受体细胞的中期板、细胞核、染色质、染色体或DNA随后丧失、被破坏或除去。供体细胞接触重新编程性因素的时间长短可能受去核过程的影响。当供体细胞核导入受体细胞中后，产生了非整倍的细胞。出于本文的目的，该非整倍的细胞包括多倍体细胞。如果在增加供体细胞的细胞核之后，细胞的中期板、细胞核、染色质、染色体或细胞核DNA没有丢失、去除或破坏，则该细胞仍维持是非整倍体细胞。重建的二倍体细胞是在细胞核增加之后或同时，受体细胞的中期板、细胞核、染色质、染色体或细胞核DNA从细胞中丧失、从细胞去除或受破坏时的细胞。
本发明方法可用来产生重新编程的细胞，例如至少部分重新编程(例如去分化)成为另一种体细胞状态，或基本上完全重新编程(例如去分化)成为胚细胞结局。例如，在重新编程的细胞中，与重新编程状态相关的一个或多个基因可能被激活，和/或在供体细胞中表达的一个或多个基因可能被阻遏。
本发明方法可用来对经过基因工程改造的细胞进行重新编程。细胞核供体细胞可选自基因工程改造或修饰的细胞，以便产生基因工程改造的干细胞、干细胞系和干细胞衍生的细胞或细胞系，例如，多能性胚胎干细胞(ES)或ES衍生的体细胞(它们可用选择干细胞的已知方法来分离、纯化或增殖)。
因此，本发明第二方面提供了一种制备重新编程的经基因修饰的二倍体细胞的方法，所述方法包括：
提供
供体细胞或供体细胞核，该供体细胞或细胞核经过基因修饰而除去或减少了不需要的活性或具有或提高了所需的活性，和
受体细胞；
将供体细胞或细胞核导入受体细胞中，产生非整倍的细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境下维持足以使供体细胞核被重新编程的时间；和
通过使所述重新编程的非整倍体细胞中的受体细胞核或胞核DNA的去除、破坏或丢失，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的经基因修饰的二倍体细胞。
本发明第三方面提供了一种制备重新编程的遗传上异常的细胞的方法，所述方法包括
提供
供体细胞或供体细胞核，该供体细胞或细胞核从遗传上异常的细胞(如患有遗传疾病的动物或人的细胞)衍生获得，和
受体细胞；
将供体细胞或细胞核导入受体细胞中，产生非整倍的细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境下维持足以使供体细胞核被重新编程的时间；和
通过使所述重新编程的非整倍体细胞中的受体细胞核或胞核DNA去除、破坏或丢失，从所述重新编程的非整倍体细胞产生遗传组成与所述异常供体细胞核等价的重新编程的遗传异常的细胞。
重新编程的细胞可用于基础研究和应用研究、基于细胞的基因和药物筛选、诊断、和/或基因细胞的基因和组织治疗。更具体地说，重新编程的异常细胞可用于基因细胞的基因和药物筛选，以便发现和/或开发出典型和非典型的单基因和多基因疾病的新的治疗性和预防性处理方法。
供体细胞核可以是任何合适的类型，来自任何合适的种类。供体细胞核可包含在核体或细胞中。供体细胞核可以是胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成年的细胞。供体细胞核可通过从合适的供体细胞中取出(例如用显微外科手术)细胞核和供体细胞核周围的一部分细胞质和质膜来制得。可使用成熟的细胞，如成纤维细胞、卵丘细胞、淋巴细胞和神经细胞类型。在较佳的实施方案中，供体细胞核可来自体细胞，更佳的是成熟的体细胞或体干细胞。可使用细胞系。在一个特别佳的实施方案中，使用胚细胞如胚胎干细胞或其它多能性干细胞系、胚胎生殖细胞或原生殖细胞。
特别佳的是，供体细胞出于细胞周期的特定阶段，如G0，G1或S期。申请人已经发现，根据大小分拣细胞(例如用FACS)，可以分离得到富含细胞周期每一阶段的细胞群。这避免了使用对细胞有毒性的品系。可对大小分拣的各细胞群的样品进行染色，以确定该细胞群处于细胞周期的哪一阶段。
供体细胞核可以来自正常、异常或经基因修饰的细胞。供体细胞可从动物细胞、动物细胞培养物或建立的细胞系直接分离得到。异常细胞包括具有已知或未知基因突变(包括基因和其它染色体突变、缺失、重排、取代和/或复制)的细胞。
受体细胞可以有任何合适的类型、可来自任何合适的种类。受体细胞可以是体内或体外产生的卵母细胞。卵母细胞例如可以是生发泡(GV)阶段或中期I(MI)的不成熟的卵母细胞，或是停滞于减数分裂成熟的第二中期的卵母细胞(MII卵母细胞)。受体细胞的其它来源包括，受精卵、受精的卵母细胞、胚胎卵裂球(例如2细胞卵裂球)和生殖腺产生的细胞系、生殖细胞肿瘤或任何其它适合成功加入细胞核的细胞类型。另外，受体细胞可以是多能性细胞，如胚胎干细胞(ES)、胚胎生殖细胞或原生殖细胞[包括细胞系分离出的细胞，内细胞团(ICM)、胎盘(ED)、胚胎外胚层或原生殖细胞(PGC)的原代培养物或分离的细胞]、从肿瘤(包括胚胎肿瘤)衍生获得的细胞(例如胚胎癌性细胞(EC)或卵黄囊肿瘤细胞)。体细胞受体(如神经或造血干细胞)可用作受体细胞的来源。较佳的是卵母细胞，如停滞于减数分裂成熟的第二中期的卵母细胞(MII卵母细胞)。
供体细胞核或细胞可用合适的方法转移给受体细胞。这些方法包括，但不局限于，显微外科注射、细胞融合(例如由电脉冲(电融合)、化学试剂(如聚乙二醇)介导)、或使用灭活病毒(如仙台病毒)。
较佳的是，供体胞核例如是用显微外科方法在透明带下导入。
在一个特别佳的实施方案中，供体胞核或细胞可用压电辅助的显微操作转移到受体细胞中。
在本发明这些方面的较佳形式中，可对受体细胞进行预处理，但该步骤是任选的。更具体地说，可对受体细胞的中期板、胞核、染色质、前核染色体或胞核DNA进行预处理。
受体细胞的预处理可包括，在导入供体胞核的同时、或较佳的在一段时间后，将细胞培养在微丝抑制剂(如细胞松弛素B，使细胞骨架松弛，并有助于除去含有受体细胞前核、中期板、胞核、染色体或DNA的一部分膜封闭的胞质)中。化学处理例如是，但不局限于，在导入供体胞核的同时、或较佳的在一段时间后，用紫衫醇、鬼臼亚乙苷秋水仙胺和环己酰亚胺之一或组合来使受体细胞丧失或排出中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA。或者，可用非化学的方法来帮助受体细胞丧失或排出细胞的中期板、胞核、染色质、染色体或DNA。这些方法包括，但不局限于，用紫外光(UV)、激光或其它形式的辐射使中期板、前核、胞核、染色质、染色体和/或DNA失活、丧失能力、受损或受到破坏。
预处理也可包括激活。
在受精期间，当穿透性精子触发减数分裂的复苏时，发生激活。激活的特征是钙振动，释放出皮质颗粒，第二个极体压出，形成前核，最后分裂。受体细胞或非整倍体细胞可用例如(但不局限于)乙醇、钙离子运载体或电刺激来诱导激活。激活可在供体胞核转移之前、同时或之后进行。
可采用在供体胞核转移之前的初步激活步骤，它可能会影响与受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA相关的重新编程性因素。
预处理也包括使受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA丧失能力或受到破坏，从而减少或消除受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA与供体细胞的这些物质掺杂在一起。如此形成的胚胎可能不是克隆，进而可能不能发育至足月。
从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞的步骤可用任何合适的方法进行。例如，可使非整倍体细胞在合适的环境中维持足够长的时间，以使非整倍体细胞通过丢失非整倍体细胞的中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA、或非整倍体细胞中期板、胞核、染色质、染色体或DNA在非整倍体细胞子细胞中的不均衡分布来产生二倍体细胞。或者，通过除去非整倍体细胞或非整倍体细胞的子细胞中的受体细胞中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA，或破坏非整倍体细胞或非整倍体细胞的子细胞中的受体细胞中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA，来产生二倍体细胞。
在本发明这些方面的一个形式中，这些方法可进一步包括下列步骤：
基本上除去或基本上破坏受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA，较佳的在非整倍体细胞分裂之前。
受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA的除去或破坏例如可在第一个胚胎分裂之前、胞核增加程序完成后大约1-20小时(更佳的约3-12小时，最佳的约6-8小时)内进行。DNA的破坏可用化学或激光或其它基于辐射的显微外科技术等来实现。
受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA的除去或破坏可通过发育自校正机制(该机制将使一些细胞(如果不是全部细胞)恢复倍数)自发地发生。
受体细胞中期板、胞核、染色质、染色体或DNA的丧失或除去可用DNA螯合剂(例如是，但不局限于，Hoechst 33342)和UV照射来进行评价，或用Pol-Scope显影来显现受体细胞的中期板、前核、胞核、染色质或染色体。
在本发明这些方法的另一个形式中，这些方法可进一步包括下列步骤：
提供相互混杂的抑制剂，和
使非整倍体细胞接触该相互掺杂的抑制剂一段时间，该时间足以减少或消除受体细胞DNA与导入DNA的掺杂。
相互掺杂抑制剂可以是细胞骨架(细胞动力学)或核分裂抑制剂，例如但不局限于，选自细胞松弛素B、秋水仙酰胺、紫衫醇或噻氨酯哒唑中的一种或多种。非整倍体细胞接触相互掺杂抑制剂的时间例如是胞核增加后大约1-6小时，最晚到前核形成，较佳的在胚胎分裂前。
在本发明这些方面的另一形式中，受体细胞可以在供体细胞或胞核导入的几乎同时去核。较佳的是，将供体胞核导入待去核的细胞中，然后立即去核。更佳的是，通过一个切开部位将供体胞核导入待去核的细胞中，受体胞核也通过同一切开部位从细胞中取出。
本发明方法可进一步包括使受体细胞、非整倍体细胞或二倍体细胞经过激活步骤的步骤。
受体细胞、非整倍体细胞或二倍体细胞可用，例如但不局限于，乙醇、钙离子运载体或电刺激来处理，以诱导激活。激活可在供体胞核转入之前、同时或之后进行。
如上所述，可在供体胞核转移之前进行初步激活步骤，或使并列的供体和受体细胞经受细胞融合/激活步骤。例如，当用电脉冲来进行细胞融合时，可选择电压以同时引发激活。
并列的供体和受体细胞也可经受同时进行的细胞融合/激活，或是先细胞融合然后激活。
使非整倍体细胞在合适的环境中维持足够长的时间以使供体胞核或细胞被重新编程。较佳的，使非整倍体细胞在合适的环境中维持大约1-36小时，更佳的大约1-8小时。非整倍体细胞可以维持在体外合适培养基中，或转移到代孕动物中在体内维持。
用于本发明方法的供体胞核和受体胞核可以来自任何合适的来源，无须来自同一种类。本发明适用的种类包括鸟类、鱼类、爬行动物和哺乳动物(包括有蹄类和灵长类)。较佳的，细胞是猪、牛、羊、啮齿类动物、禽类、鱼类、爬行动物、鼠或人源的。
在一个较佳的实施方案中，本发明方法可进一步包括下列步骤：
从非整倍体细胞中取出供体胞核；和
将所述取出的供体胞核导入第二个受体细胞(去核或未去核的)中，产生重新编程的第二代细胞、经基因修饰的重新编程的第二代细胞或遗传上异常的重新编程的第二代细胞。
在本发明方法的较佳实施方案中，取出的供体胞核可以来自本身作为胞核增加或胞核转移产物的胚胎。前者称为连续性胞核增加(serial nuclear addition)。
连续的胞核增加或胞核增加和胞核转移的组合可提高分化的胞核指导正常发育的能力。尽管申请人不希望受理论的束缚，但是推断连续的胞核增加和/或转移能通过使卵母细胞中特异性分子组分帮助染色质重建(对胞核重新编程有利)来提高移植胞核的发育能力。连续的胞核增加或胞核增加与胞核转移的组合不局限于单个行为，它可以在多种情形下被启动来随后改善染色质重建、胞核重新编程和胚胎发育的状况。
供体胞核可以通过修饰、缺失或加入一个或多个基因来进行基因修饰。待修饰、缺失或增加的基因可以是任何合适的类型。
修饰、加入或删除基因的方法可包括转基因的随机或定向整合。转基因可以是全功能的基因或是包含异源基因序列的表达构建物，这些异源基因序列包括增强子、阻遏子、启动子、外显子、内含子、cDNA、编码序列、反义RNA、5′或3′非编码区以及其它RNA加工信号或元件(包括翻译起始和终止信号、内部核糖体进入位点(IRES)以及聚腺苷酸化信号)。转基因可以是基因的无功能组分，或是依靠(随机或定向)整合入宿主基因组的不同基因的异源组分。这些转基因包括基因阱(traps)、启动子阱、增强子阱和有点突变或能改变内源基因表达的其它DNA构建物。
修饰基因的方法可包括将一个或多个突变引入靶基因的两个拷贝中。合适的细胞可能会摄入突变，然后可用来产生重新编程的细胞、细胞系、胚胎或非人动物。可将细胞中基因的一个拷贝破坏，然后使所得的杂合非人动物相互杂交，直至获得基因两个拷贝都突变的动物。或者，可在体外修饰基因的两个拷贝。
为了靶向内源性基因而不是将转基因导入基因组的随机位置，可采用一种DNA构建物(转基因)，该构建物包括与靶基因的至少一个或多个部分在基因上基本相同的核酸序列。
寻靶DNA可包含这样一个序列，其中所需序列经修饰侧连接了与待修饰基因组中对应靶序列基本相同基因的DNA。基本相同基因(等基因)的序列宜与对应的靶序列(除所需序列修饰外)有至少大约97-98％的相同性，更佳的有至少约99.0-99.5％的相同性，最佳的有约99.6％-99.9％的相同性。寻靶DNA和靶标DNA宜共同具有至少约75碱基对的相同性非常高的DNA序列，更佳的至少约150碱基对的有相同性非常高的DNA序列，还要佳的有至少约500碱基对的相同性非常高的DNA序列。因此，较佳的是采用从与待寻靶细胞尽可能密切相关的细胞衍生的寻靶DNA；更佳的是，寻靶DNA从基因型与待寻靶细胞相同的细胞衍生获得。最佳的是，寻靶DNA从待寻靶细胞的同一个体(动物)的细胞衍生获得。寻靶DNA序列宜包含至少约100-200碱基对的基本等基因的DNA，更佳的有至少约300-1000碱基对的基本等基因的DNA，还要佳的有至少1000-15000碱基对的基本等基因的DNA。
本文所用的术语“等基因”或“基本等基因的DNA”指DNA具有与参照DNA序列相同或基本相同的序列。两个序列基因相同的指标是它们能在最严谨的杂交条件(例如见参考文献25)下相互杂交而且不表现出序列多态性(即，它们没有不同的限制性内切酶切割位点)。术语“基本等基因”指DNA与参照DNA序列有至少约97-99％的相同性，较佳的是与参照DNA序列有至少约99.5-99.9％的相同性，在某些情况下与参照DNA序列有100％的相同性。两个序列基本等基因的指标是它们能在最严谨的杂交条件(25)下相互杂交而且仅仅很少表现出限制性片段长度多态性(RFLP)或序列多态性(相对于具有至少约97-98％序列相同性的特定长度序列作统计学预计的数目)。一般来说，寻靶DNA序列和宿主细胞序列在至少约75个连续核苷酸的窗口内进行比较。如果RFLP分析未显示出序列具有序列多态性，那么即使不能获得详细的DNA序列信息，比较高度近交品系个体之间的DNA序列通常认为是基本等基因的。
因此，可通过修饰供体胞核中的内源基因来对供体胞核作基因修饰。内源基因可这样来进行修饰：将一DNA构建物导入所述供体胞核中，该DNA构建物包括一核酸序列，该序列与内源基因的至少一个或多个部分基本等基因且具有一个或多个突变或新的基因序列，从而使该DNA构建物与内源基因之间发生同源性重组。
导入新的遗传物质以及随后对携带所需目标整合的细胞的选择需要扩展和克隆性选择每个建立的转基因细胞。将该方法应用于胞核移植程序的一个限制是转染的细胞必须经历的细胞分裂的次数，以便为每个转基因集落的分子分析以及随后提供转移用胞核提供足够的材料。大多数适合体外基因修饰和随后的胞核转移的细胞具有有限的体外增殖能力。因此，希望利用转染和选择系统，该系统能高效地产生和/或鉴别被正确寻靶的克隆，而且对于体外增殖的要求有限。
选择被正确寻靶的克隆的一种特别有效的方法是用如澳大利亚专利678234所述的IRES基因捕获寻靶载体(该专利全文纳入本文作为参考)。IRES基因捕获寻靶载体可以选自IRES-neo，IRES-lacZ，(TAA3)IRES-lacZ，(TAA3)IRES-lacZ lox neo-tk lox，(TAG3)IRES-lacZ/mclneo，SA lacZ-IRES neo，SA(TAA3)IRES-nuclear lacZ，SA(TAA3)IRES-nuclear lacZ lox Gprt lox，IRES-B-geo，(TAA3)IRES-B-geo，SA IRES-B-geo SA优化的IRES-B-geo，IRES-nuclear B-geo，SA IRES-nuclear B-geo，SA(TAA3)IRES-nuclearB-geo，SA优化的IRES-nuclear B-geo，IRES-zeo，SA IRES-zeo，IRES-hph，SA IRES-hph，IRES-hph-tk，IRES-bsd，SA IRES-bsd，IRES-puro。IRES基因捕获寻靶载体通过消除大部分随机整合行为而显著提高了基因寻靶的效率。IRES基因捕获寻靶载体依靠功能性整合到活跃转录的基因(如靶基因)中来表达可选择性标记物。不选择随机整合到基因组的非转录区域。
在一个较佳的实施方案中，可能希望除去靶标基因座中的选择性标记盒，以消除例如抗生素抗性基因的表达。一种方法是在作为重组位点的合适DNA序列的两侧连接IRES选择性标记盒，然后加入合适的点特异性重组酶。合适的重组酶位点的一个例子是对于Cre重组酶蛋白有特异性的lox位点。另一合适的重组酶例子是FLP/FRT重组酶系统(26)。
高效的基因寻靶和筛选具有显著的优点，因为适度严谨的选择系统(如IRES基因捕获寻靶载体)能消除对克隆的细胞系进行生物化学分析的需要。在这种情况下，未经特性鉴定的转基因细胞库的个别胞核应以等价于被选库的比例产生具有所需表型的后代。当需要或可能仅限于体外繁殖时，克隆选择的消除可能是特别有用的。一个这样的例子包括培养胚胎胞核用于胞核增加或胞核转移。对于通过胞核转移来产生胎生后代而言，胚胎胞核比后阶段的体细胞更有效。然而，除了小鼠、可能还有灵长类(包括人)外，其它动物种类的全能性胚细胞不能长时间培养。通过胚胎胞核的连续性胞核增加来回收胞核提供了在体外维持、繁殖和遗传操作多能性动物细胞的机会。
可将DNA构建物工程改造入细菌中，然后导入细胞内。转基因可用任何合适的方法导入细胞中。较佳的方法包括直接注射、电穿孔、脂质体或磷酸钙沉淀。
尽管申请人不希望受理论的束缚，认为突变两侧任一侧的基本等基因的DNA区域优先使转基因与靶位点对齐，它在此处重组并引入突变。还认为提高特定突变引入给定基因的效率起主要作用的因素是靶DNA与导入DNA之间的相似性程度。因此，较佳的是，在待寻靶的基因座处，DNA是等基因的(基因相同)，而不是同种异体基因(基因不相似)。
尽管许多转基因细胞含有一个或多个另一种动物的基因或其片段，但本文所用的术语“转基因”应被认为不限于指含有这样的一个或多个基因的细胞。相反，该术语更广泛地指其DNA已通过重组DNA技术作过技术干预的细胞。因此，例如，出于本发明的目的，内源基因缺失或经修饰(通过修饰基因产物或表达方式)的细胞是转基因细胞，DNA中加入外源核酸序列的许多细胞也是转基因细胞。
根据本发明重新编程的细胞可用来产生细胞、细胞系、组织、器官、动物胚胎和非人动物。这些产物可从重新编程的胚细胞(此时受体细胞是卵母细胞或其它胚细胞(如胚胎干细胞或原生殖细胞))或重新编程的体细胞(此时受体细胞是特异性干细胞类型，如肝或神经干细胞)衍生获得，并可用来使因损伤、疾病或老化而破坏的组织恢复功能。转移的细胞还可用来重新增殖(re-populate)耗尽的组织或在移植输送基因治疗前进行基因改变。
从重新编程的细胞或胚胎衍生获得的细胞和细胞系也可用于基于细胞的基因和药物筛选、用于诊断试验以测定基因、基因产物或其它生物活性化合物的存在或不存在、功能、效率、毒性或其它生物性质。从重新编程的细胞衍生获得的细胞、细胞系、组织和器官可用于医学、兽医学、农业用途和/或基础研究。从重新编程的细胞衍生获得的组织或器官、或从重新编程的胚胎发育成的动物或胚胎衍生获得的组织或器官也可用于治疗患病或具有缺陷型细胞、组织或器官的患者。细胞、细胞系、胚胎衍生的细胞系、组织和器官可用患者自身的细胞作为供体来源来建立，因此避免了移植后可能发生的组织排斥。
因此，本发明方法进一步包括从所述重新编程的细胞、或通过联合或不联合胞核转移的连续性胞核增加而重新编程的细胞来产生细胞、细胞系、组织、器官、动物胚胎或非人动物的步骤。
本发明方法还包括另一步骤：从所述基因修饰的或异常的重新编程的细胞、或从通过联合或不联合胞核转移的连续性胞核增加从基因修饰的或重新编程的异常的细胞，产生基因修饰的或遗传异常的细胞、细胞系、组织、器官、动物胚胎或非人动物。
可用任何合适的技术从重新编程的细胞产生细胞、细胞系、组织和器官。
细胞、细胞系、组织和器官也可从所述重新编程的细胞发育产生的动物胚胎产生。细胞、细胞系、组织、器官、动物胚胎或从该胚胎衍生获得的细胞系也可从通过联合或不联合胞核转移的连续性胞核增加而重新编程的细胞产生。
在本发明的一个特别佳的实施方案中，可对正常、异常、有疾病或经基因修饰的细胞进行重新编程，从这些重新编程的细胞建立细胞、细胞系、组织、器官、胚胎、非人胎儿或动物。另外，细胞、细胞系、组织和器官可从重新编程细胞发育产生的动物胚胎、非人胎儿或动物产生。这些细胞和细胞系也可用于基于细胞的基因和组织治疗、基于细胞的基因和药物筛选、诊断、基础研究和应用研究以及用于产生非人动物。
可将从重新编程细胞衍生获得的重新编程的细胞或细胞系转移给动物，以恢复因受损伤(例如由于疾病、受伤或老化)或因遗传病而功能异常的组织或器官的功能、或改善该功能。
在一个特别佳的实施方案中，可从患者自身的细胞建立细胞或细胞系。也可通过对患者自身细胞进行重新编程而产生的胚胎或胚细胞建立细胞或细胞系。这种方法称为治疗性克隆，它提供了治疗各种医学病情(包括但不局限于，脊髓受损、糖尿病和阿尔茨海默疾病)的机会。用治疗性克隆方法建立的细胞或细胞系在遗传上与患者相同，因此在移植后有很少或没有免疫排斥。
申请人已经发现，通过将部分或完全分化的供体细胞或胞核培养在合适受体细胞环境下，供体细胞或胞核可能被重新编程。例如，它可能去分化产生例如多能性细胞(如胚胎干细胞)。更具体地说，申请人已经发现，可通过胞核增加介导的成年体细胞胞核重新编程来产生ES细胞，而且，卵丘细胞经NA介导的重新编程所衍生获得的ES细胞(CC-ES细胞)保留了在体外和体内分化成多种细胞类型的能力(见图1、2和3)。
虽然不希望受理论的束缚，但申请人假设受体细胞可能提供了使供体细胞被重新编程的因素，例如使其至少部分去分化，形成多能性细胞系。
因此，本发明另一个方面提供了一种恢复或改良组织或器官功能的方法，所述方法包括：
提供
一种动物，和
一种或多种本发明的重新编程的细胞或所述重新编程细胞的衍生物；
将细胞或重新编程的细胞的衍生物转移给动物，较佳的是转移到所述组织或器官部位或附近；和
使转移的细胞或重新编程细胞的衍生物重新增殖所述组织或器官。
本发明还提供了本发明的重新编程细胞或其衍生物在制备药物上的用途，该药物可通过基于细胞的治疗恢复或改良组织或器官的功能。
可将经过基因修饰的细胞或细胞系可转移给动物，以输送基因治疗。基因治疗能治疗下列疾病，例如但不局限于，镰刀细胞贫血症、血友病、代谢失调、肝病、AIDS和其它传染性疾病，还能帮助已受破坏(例如因疾病、受伤或老化)的组织或器官修复和重建。
在本发明的还有一个方面，提供了一种基因治疗方法，所述方法包括
提供
一个动物，和
一种或多种本发明的经基因修饰的重新编程的细胞或所述细胞的衍生物；
将所述细胞或重新编程细胞的衍生物转移给动物；和
使所述细胞或重新编程细胞的衍生物在所述动物体内重新繁殖。
本发明还提供了本发明的经基因修饰或异常的重新编程细胞或其衍生物在制备基因治疗药物上的用途。
本发明的细胞还可用于研究疾病过程，以及在基因和药物筛选试验中用来对已定性或未经性质鉴定的多基因疾病作性质鉴定。在这种情况下，细胞或细胞系宜根据患者或疾病特异性来衍生。在对动物细胞、从患遗传疾病的动物建立的细胞培养物或细胞系重新编程后，可建立这样的细胞或细胞系。异常细胞包括具有已知或未知基因或染色体突变、缺失、重排和/或复制的细胞。重新编程的细胞、从重新编程细胞衍生获得的细胞、组织和器官可用于研究疾病过程、评价具体药物、基因或治疗方案的治疗价值、效果或毒性，随后进行基因校正或修饰，进行基因和组织治疗。
因此，本发明另一方面提供了一种研究疾病机理、过程和潜在或现有的治疗的方法，该方法通过建立基于细胞的筛选试验来鉴定和评价候选药物靶标和治疗性基因、鉴定和评价药物和候选药物，所述方法包括
提供
一种或多种本发明的重新编程的细胞或所述细胞的衍生物；
监测、增加、除去或研究或改变细胞过程，这些细胞过程包括但不局限于，所研究的细胞中的基因表达和表达的基因产物；和/或
增加、除去或研究化学物质和潜在的药物对于重新编程的细胞或其衍生物的细胞过程的生物学作用。
本发明还提供了本发明的重新编程细胞或其衍生物用于评价药物治疗多基因疾病有效性的用途。
本发明还提供了本发明的重新编程细胞或其衍生物用于制备医学和/或基础研究用的细胞、细胞系或其衍生物的用途。
因此，本发明另一方面提供了一种建立医学和/或基础研究用细胞或细胞系的方法，所述方法包括
提供
一种或多种本发明的重新编程的细胞或所述细胞的衍生物；
监测、增加、除去或研究或改变细胞过程，以便研究作为潜在治疗性靶标或试剂的基因产物和化学物质，所述细胞过程包括，但不局限于，基因表达和该细胞或其衍生物表达的基因产物。
本发明还提供了本发明的重新编程细胞或其衍生物在医学和/或基础研究中的用途。
本发明方法还可进一步包括从所述重新编程的动物细胞或胚胎产生非人动物或从所述转基因动物细胞或胚胎产生非人转基因动物的步骤。
动物胚胎可用任何合适的方法由重新编程的细胞产生。胚胎发育可最初在体外，随后在代孕者体内。这样，非整倍体细胞最初可在体外培养，以产生由二倍体细胞或二倍体细胞与非整倍体细胞的混合物组成的胚胎，然后将该胚胎转移到代孕者体内，随后发育成非人动物。细胞的体外培养可在任何合适的培养基中进行。
动物胚胎可以是任何类型，包括鸟类、鱼类、爬行动物和哺乳动物(包括有蹄类和灵长类)，例如是鼠、牛、绵羊或猪胚胎。非人动物也可以是任何类型，包括鸟类、鱼类、爬行动物和哺乳动物(包括有蹄类和灵长类)，例如鼠、牛、绵羊或猪。较佳的，动物胚胎或动物是猪胚胎或猪、牛胚胎或牛、绵羊胚胎或绵羊或鼠胚胎或鼠。
本发明另一方面提供了用本发明方法制得的重新编程的细胞或细胞系、基因修饰的重新编程的细胞或细胞系、或遗传上异常重新编程的细胞或细胞系。该细胞或细胞系可以是人或非人细胞或细胞系。较佳的细胞或细胞系是猪、鼠、绵羊、牛、山羊或人的细胞或细胞系。
可用本发明方法制得的细胞和细胞系例子包括多能性细胞如胚胎和躯体干细胞和前体细胞或其衍生物(包括任何终末阶段分化的细胞)。
本发明另一方面提供一种用本发明方法制备的或改良的分离的组织或器官。这些组织或器官可以来自任何种类的动物。较佳的是，组织或器官是猪、鼠、绵羊、牛、山羊、灵长类或人的组织或器官。
本发明另一方面提供了用本发明方法制得的或改良的动物胚胎或转基因动物胚胎。动物胚胎或转基因动物胚胎可以是人的或不是人的。较佳的是，动物胚胎或转基因动物胚胎是猪、鼠、绵羊、牛、山羊、灵长类或人的胚胎。
本发明还有一个方面提供了用本发明方法制得的或改良的非人动物或转基因非人动物。较佳的非人动物或转基因非人动物是猪、鼠、绵羊、牛或山羊。这些非人动物可提供用于移植给人或其它异体移植形式的器官。
本发明还有一个方面提供了用本发明方法制得的非人动物或非人转基因动物的动物产品。该动物产品可以是人或其它动物的蛋白或基因产物，或是人和非人动物产品的混合物。
本发明另一方面提供了一种产生动物胚胎的方法，该方法包括
提供
供体胞核，和
受体细胞；
将该供体胞核导入受体细胞中，产生非整倍体细胞；
任选地使该非整倍体细胞经受激活步骤；
通过除去、破坏或使非整倍体细胞丧失受体细胞胞核或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从所述重新编程的二倍体细胞产生动物胚胎。
因此，本发明方法涉及胞核增加，即，将一个细胞的胞核加入另一细胞中。
尽管不希望受理论的束缚，但是申请人假设，受体细胞的中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA在非整倍体细胞的子细胞中不均匀地分布，或是非整倍体细胞或非整倍体细胞的一个或多个子细胞排出受体细胞的中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA，结果导致形成二倍体动物胚胎和胎盘或二倍体动物胚胎和非整倍体胎盘。非整倍体胎盘可能提供优于正常二倍体胎盘的好处。例如，非整倍体胎盘可能更大，更强壮，进而提高了胎盘的生命力。或者，受体细胞的胞核可能被驱逐出细胞，不再参与胚胎发育。
本发明方法还包括从动物胚胎产生非人动物的步骤。
在还有一个方面，本发明提供了一种产生转基因动物胚胎的方法，所述方法包括：
提供
供体胞核，该供体胞核已经过基因修饰而消除或降低了不希望的活性，或提供或升高了所需的活性，和
受体细胞；
将供体胞核加入受体细胞中，产生经基因修饰的非整倍体细胞；
任选地使该非整倍体细胞经受激活步骤；
通过除去、破坏或使所述非整倍体细胞丧失受体细胞胞核或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从所述重新编程的二倍体细胞产生转基因动物胚胎。
在本发明的一个较佳方面，该方法可包括
对受体细胞的中期板、胞核、前核、染色质、染色体或DNA进行如上所述的预处理步骤。
在本发明该方面的一种形式中，方法可进一步包括如上所述的基本除去或基本破坏受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或DNA的步骤(较佳的在非整倍体细胞分裂之前)。
在另一形式中，该方法进一步包括下列步骤：
提供相互掺杂的抑制剂，和
如上所述使非整倍体细胞接触该相互掺杂的抑制剂足够长时间，以便减少或消除受体细胞DNA与导入DNA的相互掺杂。
可如上所述进行评估受体细胞的中期板、胞核、染色质、染色体或DNA的丧失或除去。
在本发明该方面的另一形式中，如上所述，受体细胞可在将供体细胞或胞核导入的同时去核。
本发明方法可进一步包括如上所述的对受体细胞、非整倍体细胞或二倍体细胞进行激活的步骤。
如上所述，非整倍体细胞宜在合适的环境中维持足够长的时间，以使供体胞核或细胞被重新编程。
用于本发明方法的供体胞核和受体细胞可以来自上述任何合适的来源。
在较佳的实施方案中，本发明方法可包括如上所述的产生重新编程的第二代细胞，并采用连续的胞核增加或胞核增加联合胞核转移。
在较佳的实施方案中，本发明方法可进一步包括下列步骤：
在激活前，使非整倍体细胞在合适的培养基中维持足够长的时间，以使细胞恢复至基本正常的形状。
申请人已经发现，通过使非整倍体细胞在培养物中维持足够长的时间以使细胞恢复至基本正常的形状(例如通常是圆形)，可使所产生的活胚胎数显著增加。该培养步骤可用类似于本文所述的方式进行。
尽管不希望受理论的束缚，但是申请人假设该培养时间使得非整倍体细胞恢复成较正常的或稳定的状态。
非整倍体细胞宜在合适的培养基中维持大约3-8小时，更佳的维持大约4.5-6小时。然而，希望保证培养时间在大量分裂发生之前结束。
本发明还有一个方面提供了一种制备非整倍体或重新编程的二倍体细胞的方法，该方法包括
提供供体胞核；外源核酸分子，和受体细胞；
将供体胞核和外源核酸分子导入受体细胞中，产生非整倍体细胞；和
任选地，通过除去、破坏或丧失受体细胞胞核或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞。
本发明还有一个方面是提供一种产生转基因动物胚胎的方法，该方法包括
提供供体胞核、外源核酸分子和受体细胞；
将供体胞核和外源核酸分子导入受体细胞中，产生非整倍体细胞；和
任选地，通过除去、破坏或失去受体细胞胞核或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从该二倍体细胞产生转基因动物胚胎。
将供体细胞和外源核酸分子一起导入去核或未去核细胞的步骤宜通过以下任一方法来进行：
1)将外源核酸分子导入供体胞核，然后将供体胞核导入受体细胞；
2)将外源核酸分子与供体胞核结合，将结合的核酸和胞核导入受体细胞内；或
3)将外源核酸和供体胞核分别导入受体细胞。
外源核酸分子可用任何合适的方法导入供体胞核或受体细胞。例如，可采用直接注射、电穿孔或使胞核或细胞在外源核酸溶液中的简单地浸泡。
在特别佳的实施方案中，可在加入胞核前将外源核酸直接导入供体胞核；或者，将供体胞核和外源核酸混合，然后注入受体细胞。
外源核酸分子可以是任何合适的类型。较佳的，它是裸露的DNA分子。另外可采用外源RNA、mRNA、DNA和RNA的杂合物以及核酶。尽管申请人不希望受理论的束缚，但是认为当这些分子导入供体胞核或被供体胞核摄入时，可通过随机整合或同源重组发生基因转移。
或者，可采用定向基因转移，在此情况下，外源核酸分子包括指引核酸分子到达供体胞核基因组中特定位点的5′和/或3′末端。
本发明方法可进一步包括从转基因动物胚胎产生非人转基因动物的步骤。
供体胞核可以是上述任何合适类型的细胞，来自任何合适种类的动物。
受体细胞可以是上述任何合适类型的细胞，来自任何合适种类的动物。
供体胞核可用上述任何合适的方法转移给受体细胞。
在供体胞核融合之前、之后或大致同时，可通过将没有透明带的受体细胞与去核的卵母细胞或其它胞质体融合来增加受体细胞的体积。
动物胚胎可用上述任何合适方法从重建细胞产生。
动物胚胎或非人动物可以是上述任何类型。
可用于本发明方法的供体胞核和受体细胞可以来自上述任何合适的来源。
本发明方法可用来产生上述转基因的非人动物。
本发明另一方面提供了用本发明方法产生的重建的动物细胞。该细胞可以是人的或非人的。重建的动物细胞宜为猪、鼠、绵羊、牛、山羊或人的细胞。
本发明另一方面提供了用本发明方法产生的转基因动物胚胎。该胚胎可以是人的或非人的。该转基因动物胚胎宜为猪、鼠、绵羊、牛、山羊或入的胚胎。
本发明还有一个方面提供了用本发明方法产生的非人转基因动物。该转基因动物宜为猪、鼠、绵羊、牛或山羊。
附图简述
下面将参照所附实施例和附图来更完整地描述本发明。然而，应当理解，下列描述仅仅是描述性的，而不应以任何方式理解为对上述发明普遍性的限制。
在该图中：
图1：亲代CC-ES细胞显示出特征性的小鼠ES细胞集落形态(a)、SSEA-1表达(b)和碱性磷酸酶活性(c)。独特的X-gal染色的胞核(d)和雌性(40，XX)染色体组型(e)确证了转基因供体细胞胞核的分布。亲代CC-ES细胞和四个克隆衍生的CC-ES细胞亚系(f)没有Y染色体特异性PCR产物(较低的条带)。对照：雄性ZIN40 ES细胞，雄性胎儿成纤维细胞(mFF)和没有DNA(水)。比例条为100微米。
图2：克隆衍生的CC-ES细胞体外分化产生的神经(a-d)和肌源性(e-f)细胞。对神经元特异性蛋白的间接免疫荧光证实形态：神经丝160和68kDa(b和c)和MAP-2(d)和肌肉特异性蛋白：肌动蛋白(e)和结蛋白(f)。比例条为50微米。
图3：CC-ES细胞体内分化。亲代CC-ES畸胎癌的组织学检查(H&E)显示存在外胚层：神经上皮(a)和成层鳞状上皮(b)；中胚层：肌肉和骨(c)；和内胚层：纤毛上皮(d)。嵌合幼崽中亲代CC-ES细胞的广泛的体细胞分布(左和右)用皮毛颜色表示(e)，在大脑(f)、心脏(g)和肠(h)中用独特的X-gal染色胞核证实(PAS复染)。比例条，100微米。
                            具体实施方案
                             实施例1
                小鼠胞核转移中去核和直接注射次序的比较
常规次序：先去核再注射
在五次重复实验中：
·操作的卵母细胞去核后存活(84/138)
·压电辅助直接注射卵丘细胞胞核后的存活数(16/78)
·果导致只有12％操作的卵母细胞置于培养中(16/138)
相反的次序：先注射后去核
在五次重复实验中：
·压电辅助直接注射卵丘细胞胞核后存活的卵母细胞数(129/236)
·去核后的存活数(86/118)
·导致35％操作的卵母细胞置于培养中(86/236)
所有实验均用标准1(C57BL/6xCBA)小鼠的卵母细胞和卵丘细胞来进行。
                                  实施例2
从重新编程的成年体细胞胞核分离多能性胚胎干细胞：人治疗性克隆的鼠模型
从早期胚胎分离获得的人多能性干细胞是用于基于细胞的基因和组织治疗的许多不同细胞类型的潜在的非限制性来源(1-3)。然而，如果要明白供体胚胎衍生的细胞系的全部潜力，就需要解决供体-受体组织匹配这一重要的问题。避免移植排斥问题的一种方法是通过治疗性克隆从患者自身细胞建立干细胞系(3，4)。最近的研究表明，可以从成年体细胞中取出胞核，将该胞核转移到没有母本染色体的未受精卵母细胞中，由转移的胞核来指导胚胎发育(5，6)。从该克隆胚胎分离出的干细胞在遗传上与患者相同，因而不会有免疫排斥的危险。在这里，我们报道从重新编程的成年体细胞胞核分离出多能性鼠干细胞。通过用机械方法将分离出的卵丘细胞胞核直接注入成熟卵母细胞中，产生胞核增加的胚胎。从胞核增加的胚泡分离出的胚胎干细胞(ES)显示出特征性的形态和标记表达，并在肿瘤、嵌合胚和幼崽中大量分化成胚胎所有三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。胞核增加的ES细胞还很容易在培养中分化成神经元和肌肉。该研究表明多能性干细胞可从终末分化的成年体细胞胞核衍生获得，并且为研究胞核供体在自体的人多能性干细胞治疗发展中的潜力提供了一个模型系统。
结果和讨论
用以前描述的方法(6)的改进方案，用卵丘细胞胞核代替成熟卵母细胞的遗传物质，产生胚泡。从遍在表达胞核局限性lacZ报道基因的转基因小鼠(ZIN40)收集卵丘细胞，当用X-gal底物处理时，它显示出独特的蓝色(7)。由于受体卵母细胞是从非转基因品系(B6D2F1)收集得到的，因此用lacZ转基因标记的存在来证实转移后卵丘细胞胞核的贡献(8)。在21次重复实验中，39％(362/926)的操作的卵母细胞在注射和去核后存活。在用锶激活后，75％(270/362)的重新构建的卵母细胞在培养24小时后分裂成二细胞阶段。在培养96小时后，形成了10个(3％)形态上正常的卵丘细胞(CC)衍生的胚泡，将其放入培养中用于分离ES细胞。8个胚泡孵化并在首代中形成了具有3个表现出推定ES细胞形态的明显的内部细胞团块突起(outgrowth)。建立一个细胞系(亲代CC衍生的ES细胞系)，当其在有或没有成纤维细胞滋养层的添加了白血病抑制因子(LIF)的培养基中生长时，它继续表现出特征性的小鼠ES细胞形态(图1a)。从48个独立的从亲代CC衍生的ES(CC-ES)细胞系机械分离出的细胞建立四个亚系。
所有检查的CC-ES细胞系显示出特征性的ES细胞形态(图1a)，并表达特征性的小鼠ES细胞标记(包括阶段特异性胚胎抗原-1)(SSEA-1)(图1b)和碱性磷酸酶活性(图1c)Oct4mRNA在未分化的ES细胞中高度表达，在分化的ES细胞培养中下调(未显示)。独特的蓝色X-gal染色胞核(图1d)和正常雌性(40，XX)染色体组型(图1e)证明NT-ES细胞是从重新编程的体细胞胞核衍生获得的。除了细胞学检查外，亲代CC-ES细胞以及克隆衍生的亚系显示出缺少Y染色体特异性基因组PCR产物(图1f)。在我们的实验室中，其它雌性ES细胞没有生长。CC胚泡分化产生的ES细胞的比例与从55个体内产生的胚泡(性交后(dpc)3.5天)建立5个ES细胞系的初步实验相似。
对亲代CC-ES细胞系和两个克隆衍生的亚系的多能性进行体外和体内研究。发现所有CC-ES细胞系很容易在体外分化成神经元和搏动的肌肉，其频率与对照ES细胞相似。用神经元和肌肉特异性抗体对分化的CC-ES细胞培养物作间接免疫荧光，以证实形态学观察结果。在产生lacZ阳性畸胎瘤的免疫功能低下的小鼠中所有CC-ES细胞注射部位(12/12)未呈现对分化的限制，它们均广泛分化成胚胎所有三种层，这三种胚层包括：神经上皮和复层鳞状上皮(外胚层)：肌肉、软骨和骨(中胚层)和纤毛分泌性上皮(内胚层)(图3a-d)。
体细胞胞核恢复多能性通过体细胞在嵌合胎和幼崽中的作用得到进一步证实。6个妊娠中期(10dpc)胎儿中有四个含有X-gal阳性细胞。一个胎儿看来单独由NT-ES细胞衍生物组成(未显示)。14个幼崽中有6个经明显的皮毛和眼颜色鉴定为是嵌合的(图3e)。通过lacZ基因组PCR(未显示)和对所有分析器官(包括小脑、心脏和肠)冷冻切片的X-gal染色(图3f-h)作显微镜分析，证实了多谱系CC-ES细胞的贡献。
该报道描述了第一次从成年体细胞胞核中分离出多能性干细胞。尽管已经从胎儿成纤维细胞胞核衍生的牛胞核转移胚胎中分离出ES-样细胞(9)，但是本报道描述的小鼠体细胞衍生的ES细胞研究为体外和体内研究胞核重新编程和发育能力提供了一个更易理解和多样化的模型系统。例如，可从不同的供体细胞类型建立ES细胞系，并用建立的体外和体内ES细胞分化程序来评价对多能性可能的限制。这些分析可能有助于解释从神经元和足细胞胞核衍生的胞核转移胚泡的受限制的发育(6)。还可通过使用建立的转基因小鼠品系来加强这些研究，这些小鼠品系携带了调控发育或遍在表达的报道基因，以便监测分子水平的重新编程或显示嵌合胚中的细胞贡献(8)。同样，可用具有特定基因缺失或基因修饰的突变型小鼠系作为胞核供体来源，以研究该特定基因在胞核重新编程或多能性干细胞分化中的作用。
胞核重新编程与ES细胞衍生相结合的最大潜力可能在于开发自身人多能性干细胞用于基于细胞的基因和组织治疗。ES细胞衍生的体细胞移植可使患病或受损的组织恢复功能，或可在移植输送基因治疗之前作遗传上的改变。小鼠移植研究表明ES衍生的心肌细胞(10)、神经前体细胞(11)、造血前体细胞(12)和胰岛素分泌性细胞(13)能在受体动物中存活并发挥作用。本报道中描述的研究为在模型系统中的人治疗性克隆提供了主要证据。
补充材料和方法
通过直接胞核注射产生胚泡
分别从超排卵的成年C6D2F1(C57BL/6J×DBA/2)和ZIN40/129Sv雌小鼠收集卵母细胞和卵丘细胞。机械分离各卵丘细胞胞核，用压电辅助的显微操作(Piezo impactmicromanipulation system，PMM-150FU；Prime Tech Ltd.，Ibaraki，Japan)将其注入完整的中期II卵母细胞(给予人绒毛膜促性腺激素后13-15小时)中。然后在细胞松弛素B(Sigma，St.Louis，MO)存在下除去含有各注射卵母细胞中期板的胞质，用bisBENZIMIDE(Hoechst 33342；Sigma)染料染色，在紫外光下评估是否仅除去了卵母细胞染色体。3-4小时后，在细胞松弛素B存在下，使重建的卵母细胞在10mM氯化锶(Sigma)中化学激活5小时，然后在G1/G2培养基(14)中37℃5％CO2下培养4天，每日评价胚胎的发育。
ES细胞的衍生
ES细胞基本上如(15)所述那样分离，只是将所有胚胎培养在96孔组织培养板(Falcon，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)的单个孔内。用细玻璃移液管切开一些胚泡上的透明带，以帮助孵化。在高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基(TraceBioscientfic，Castle Hill，Australia)中分离ES细胞，该培养基含有20％胎牛血清(CSL，Melbourne，Australia)和2×103U/毫升LIF(Lindsay Williams赠与，Monash University，Clayton，Australia)，并含有标准浓度的非必需氨基酸、谷氨酰胺、青霉素/链霉素(LifeTechnologies，Gaitherburg，MD)和2-巯基乙醇(Sigma)。一旦建立，就将ES细胞培养在明胶覆盖的平皿中不加饲养细胞、含有10％胎牛血清的ES细胞培养基中。用机械方法将第6代无饲养细胞的亲代CC-ES细胞培养物的单个细胞转移到96孔板的分开的明胶覆盖孔内，建立克隆亚系。
ES细胞的性质鉴定
如前所述(17)，测定碱性磷酸酶活性。
用SSEA-1特异性单克隆抗体(MC-480；Developmental Studies Hybridoma Bank，Iowa City，IA)检测SSEA-1表达，并用与山羊抗小鼠免疫球蛋白偶联的异硫氰酸荧光素(Dako，Carpinteria，CA)显色。
如前(18)所述进行Oct4 RT-PCR，采用改进的引物：5′-GTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3′(正向)和5′-ACTCGAACCACATCCTTCTC-3′(反向)，其中预计的Oct4 RT/PCR产物大小为311bp。作为mRNA质量的对照，我们用相同的RT-PCR条件和下列引物测定polyA转录物：5′-GTTGCAGGGTAACCGATGAA-3′(正向)和5′-TGTTGTGGGTATGCTGGTGT-3′(反向)，预计产物大小为361bp。
用标准的G显带技术来显示染色体组型(计数到50个中期伸展体(spreads))。用基因组PCR测得缺少Smcy(19)，进一步确证缺少Y染色体，该PCR技术采用的引物是：5′-TGAATCTTTGGCTTTGAG-3′(正向)和5′-CCGCTGCCAAATTCTTTGG-3′(反向)，PCR条件如下：35轮的95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒(Dr David Threadgill，Department of Cell Biology，Vanderbilt University，Nashville，TN；个人通讯地址)。从Smcy(约290bp)及其X染色体同源的Smcx(约330bp)产生PCR产物。
畸癌瘤形成
在4-6周龄严重复合性免疫缺陷(SCID)小鼠的睾丸囊下注射CC-ES(亲代和克隆的)单细胞悬液，建立畸癌瘤。外科手术后18-20天，取下睾丸，一部分作急速冷冻用于X-gal染色或以Bouinis固定剂固定，包埋在石腊内，苏木精和伊红染色后作组织学检查。
嵌合胎和幼崽的产生
通过桑椹胚聚集(20)或胚泡注射(21)产生嵌合体。在转移至假孕受体B6CBF1(C57BI/6J×CBA)小鼠(2.5dpc)之前，使亲代CC-ES细胞与8细胞CD1胚胎一起聚集，或注射入C57BL/6J胚泡(3.5dpc)。
体外分化和性质鉴定
用视黄酸处理CC-ES细胞聚集体以便神经元分化(22)，或使CC-ES细胞聚集体自发分化成搏动的肌肉(23)。用特异性的小鼠第一单抗和与抗小鼠免疫球蛋白偶联的FITC(Dako)通过间接荧光免疫检测分化的ES细胞中的特征性抗原，按照生产商说明书采用下列的抗体稀释度：抗肌动蛋白(1∶20；M0635，Dako)、抗结蛋白(1∶30；M0760，Dako)、抗MAP 2a，b(1∶100；AP20，Neomarkers，Union City，CA)和抗神经丝蛋白68kDa和160kDa(纯的；分别来自Amersham Pharmacia Biotech，Amersham，UK和BoehringerMannheim Biochemica，Indianapolis，IN)。
X-gal染色/lacZ PCR
固定胚胎和冷冻组织切片，用如前(24)所述的5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal；Promega，Madison，WI)底物染色。用基因组PCR检测lacZ的存在，PCR采用下列引物：5′-ACTATCCCGACCGCCTTACT-3′(正向)和5′-TAGCGGCTGATGTTGAACTG-3′(反向)，在下列条件下：30轮的95℃30秒、52℃30秒、72℃2分钟。预计产物大小为172bp。
                           实施例3
               猪中胞核转移和胞核增加的效率
                            表1
组   卵母细胞   融合(％)   分裂(％)   胚泡(％)
NT   97   44(45.4)   21(47.7)   6(13.6)
NA   112   54(48.2)   44(81.5)   17(31.5)
在NT和NA后，在进行激活/融合前放置6小时。
NT：胞核转移NA：胞核增加
                              实施例4
        胞核增加的猪中的效率和激活、融合以及后处理对其的作用
重复实施例3的胞核增加，只是引入一系列变化以调节它们对效率的影响。这些变化包括用完整的MI卵母细胞代替MII卵母细胞，改变激活和融合步骤的次序和排列，用化学抑制剂来防止相互掺杂，以及除去或破坏基因组DNA。结果显示在表2中。
                                                        表2
                                                      胞核增加
卵母细胞来源           胞核操作 后处理1 倍数纠正干涉   重建的胚胎   发育至胚泡(％)
完整的MII卵母细胞(未去核) 同时融合2和激活3 不作进一步干涉，使发育继续   360   116(32)
5除去或破坏基因组DNA   120   28(23)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B)   60   15(25)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B) 5除去或破坏基因组DNA   65   14(21)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇)   57   14(25)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇) 5除去或破坏基因组DNA   43   6(14)
1+2的组合   48   7(15)
1+2的组合 5除去或破坏基因组DNA   36   4(12)
完整的MII卵母细胞 激活3 融合2 不作进一步干涉，使发育继续   126   30(24)
5除去或破坏基因组DNA   48   8(17)
完整的MII卵母细胞 细胞插入/注射(没有融合4) 激活3 不作进一步干涉，使发育继续   53   16(30)
5除去或破坏基因组DNA   48   12(25)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B)   36   3(8)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B) 5除去或破坏基因组DNA   29   3(10)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇)   31   5(16)
卵母细胞来源           胞核操作 后处理1 倍数纠正干涉   重建的胚胎     发育至胚泡(％)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇) 5除去或破坏基因组DNA   26     4(15)
1+2的组合   24     3(12)
1+2的组合 5除去或破坏基因组DNA   18     2(11)
完整的MI卵母细胞(未去核) 同时融合2和刺激3 不作进一步干涉，使发育继续   65     3(5)
5除去或破坏基因组DNA   46     2(4)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B)   38     1(3)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B) 5除去或破坏基因组DNA 27 2(7)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇)   26     3(44)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇) 5除去或破坏基因组DNA   18     1(4)
1+2的组合   23     1(6)
1+2的组合 5除去或破坏基因组DNA   17     1(6)
完整的MI卵母细胞 激活3 融合2 不作进一步干涉，使发育继续   42     3(7)
5除去或破坏基因组DNA   28     2(7)
完整的MI卵母细胞 细胞插入/注射(没有融合4) 激活 不作进一步干涉，使发育继续   43     3(7)
3除去或破坏基因组DNA   36     2(5)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B)   27     1(4)
1.细胞动力学抑制剂(例如细胞松弛素B) 5除去或破坏基因组DNA   25     1(4)
  卵母细胞来源     胞核操作 后处理1 倍数纠正干涉   重建的胚胎   发育至胚泡(％)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇)   19   1(5)
2.核分裂抑制剂(如Colcemid，噻氨酯哒唑或紫衫醇) 5除去或破坏基因组DNA   15   1(7)
1+2的组合   16   1(6)
1+2的组合 5除去或破坏基因组DNA   12   1(8)
注意：
1.后处理通常在激活之后，较佳的在1小时(或在12小时)之后，但是应在正常的胚胎分裂前停止，后处理用来防止基因组和导入的DNA掺杂。
2.融合宜采用所述的电学、病毒或PEG方法。
3.激活宜采用所述的化学(乙醇、锶钙离子运载体等)或电学方法。
4.细胞注射/插入是用显微注射方法(压电显微注射)插入新的DNA(不是融合)而不破坏MI或MII板。
5.中期DNA的除去或破坏宜采用去核(显微操作/抽提、压电等)或化学或激光显微外科方法。除去宜在第一次分裂前进行，或用来停止中期DNA与插入/融合的核体DNA的结合。
                          实施例5
              延迟激活在猪卵母细胞中的效果
                            表3
    延迟的时间     卵母细胞数   融合的卵母细胞数(％)
    1-2小时     131   57(43.5)
    4-6小时     104   63(60.6)
                                   实施例6
            胞核转移(NT)和胞核增加(NA)产生的猪胚胎中的基因转移效率
    组   卵母细胞   融合(％)   分裂(％)   胚泡(％)   转基因(％)
    NT   196   87(44.4)   42(48.2)   12(13.7)   1(8.3)
    NA   210   101(48.1)   50(79.2)   26(25.7)   3(11.5)
所用DNA构建物是基于猪α1，3-半乳糖基转移酶基因的pGalloway。
                                   参考文献
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14.Barnes FL，Crombie A，Gardner DK，Kausche A，Lacham-Kaplan O，Suikkari A-M，Tiglias J，Wood C，Trounson AO：“人原代卵母细胞的体外成熟、胞质内精子注射和辅助性孵化后的胚泡发育和生育”Hum Reprod 1995，10：3243-3247.
15.Robertson EJ：《畸癌瘤和胚胎干细胞：实用方法》Oxford：IRL Press；1987.
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25.Sambrook，L.，Fritsch，E.E，Maniatis，T.，(1989)《分子克隆实验手册》Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)；
26.(O′Gorman，S.，Fox，D.T.，WahI，G.M.(1991)“重组酶介导的基因激活和哺乳动物细胞中的定点整合”Science 251(4999)，1351-5).
最后，应当理解在不脱离本文所述发明精神的情况下可作出各种变化、改变和/或添加。

Claims (33)

1.一种制备重新编程的二倍体细胞的方法，该方法包括
提供
二倍体供体细胞或二倍体供体胞核，和
受体细胞；
将供体细胞或供体胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体胞核重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞中的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中受体细胞是卵母细胞、受精卵或胚胎卵裂球。
3.根据权利要求2所述的方法，其中卵母细胞是中期II卵母细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中受体细胞是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、原生殖细胞或胚胎癌细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中供体细胞是体细胞，所述供体胞核是从体细胞衍生得到的胞核。
6.根据权利要求5所述的方法，其中供体细胞是卵丘细胞，所述供体胞核是从卵丘细胞衍生获得的胞核。
7.根据权利要求1所述的方法，其中供体细胞是胚细胞，所述供体胞核是从胚细胞衍生获得的胞核。
8.根据权利要求1所述的方法，其中供体细胞是生殖细胞，所述供体胞核是从生殖细胞衍生获得的胞核。
9.根据权利要求1所述的方法，其中供体细胞是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、原生殖细胞或躯体干细胞，所述供体胞核是从胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、原生殖细胞或躯体干细胞衍生获得的胞核。
10.根据权利要求1所述的方法，其中供体胞核或细胞通过压电辅助的显微操作转移至受体细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在非整倍体细胞分裂之前除去或破坏受体细胞胞核或胞核DNA。
12.根据权利要求1所述的方法，其中供体细胞重新编程至胚胎细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中重新编程的细胞能形成含有多能性胚胎细胞的动物胚胎。
14.根据权利要求13所述的方法，其中多能性干细胞从多能性胚细胞衍生获得。
15.根据权利要求14所述的方法，其中产生了胚胎干细胞系。
16.根据权利要求1所述的方法，其中该方法是一种制备重新编程的经基因修饰的二倍体细胞的方法，所述方法包括
提供
二倍体供体细胞或二倍体供体胞核，该供体细胞或胞核已经过基因修饰而除去或降低了不希望有的活性或提供或提高了所需的活性，和
受体细胞；
将供体细胞或胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体胞核重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的经基因修饰的二倍体细胞。
17.根据权利要求1所述的方法，该方法是一种制备重新编程的遗传上异常的细胞的方法，所述方法包括
提供
二倍体供体细胞或二倍体供体胞核，该供体细胞或胞核从遗传上异常的细胞衍生获得，和
受体细胞；
将供体细胞或胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体胞核重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的遗传上异常的细胞，该细胞与所述异常的供体细胞胞核有相同的基因组成。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述遗传上异常的细胞是患遗传疾病的动物或人的细胞。
19.根据权利要求1所述的方法，该方法是一种制备非整倍体细胞或重新编程的二倍体细胞的方法，所述方法包括
提供
二倍体供体胞核，
外源核酸分子，和
受体细胞；
将供体胞核和外源核酸分子导入受体细胞，产生非整倍体细胞；和
任选地通过除去或破坏受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞。
20.根据权利要求1所述的方法，该方法是一种制备重新编程的二倍体胚细胞或非人胚胎的方法，该方法包括
提供
二倍体供体细胞或供体细胞胞核，和
受体卵母细胞或胚细胞；
将供体细胞或供体细胞胞核导入受体卵母细胞或胚细胞中，产生非整倍体细胞；
使该非整倍体细胞在合适的环境中维持足以使供体细胞胞核被重新编程的时间；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述重新编程的非整倍体细胞或其一个或多个子细胞中的受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述重新编程的非整倍体细胞产生重新编程的二倍体胚细胞或非人胚胎。
21.用权利要求1所述的方法产生的重新编程的二倍体细胞或所述细胞的衍生物在制备用于恢复或提高组织或器官功能的药物中的用途。
22.用权利要求16所述的方法产生的重新编程的基因修饰的二倍体细胞或所述细胞的衍生物在制备用于基因治疗的药物中的用途。
23.一种产生细胞系、组织、器官或非人动物胚胎的方法，该方法包括根据权利要求1所述的方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生细胞系、组织、器官或非人动物胚胎。
24.一种产生非人动物的方法，该方法包括根据权利要求1所述的方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生非人动物胚胎，再从所述非人动物胚胎产生非人动物。
25.一种产生经基因修饰的细胞、细胞系、组织或器官或非人转基因动物胚胎的方法，该方法包括根据权利要求16所述的方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生细胞系、组织、器官或非人转基因动物胚胎。
26.一种产生非人转基因动物的方法，该方法包括根据权利要求16所述的方法制备重新编程的二倍体细胞，然后从所述重新编程的二倍体细胞产生非人转基因动物胚胎，再从所述非人转基因动物胚胎产生非人转基因动物。
27.一种用权利要求1所述的方法产生的重新编程的二倍体细胞。
28.一种用权利要求16所述的方法产生的重新编程的基因修饰的二倍体细胞。
29.一种用权利要求23所述的方法产生的细胞、细胞系或组织。
30.一种用权利要求25所述的方法产生的基因修饰的细胞、细胞系或组织。
31.一种产生非人动物胚胎的方法，该方法包括
提供
二倍体供体胞核，和
受体细胞；和
将供体胞核导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述非整倍体细胞的受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从所述重新编程的二倍体细胞产生动物胚胎。
32.根据权利要求31所述的方法，该方法是一种产生非人转基因动物胚胎的方法，所述方法包括
提供
二倍体供体胞核，它经过基因修饰而除去或减少了不需要的活性或提供或提高了所需的活性，和
受体细胞；
将供体胞核导入受体细胞，产生基因修饰的非整倍体细胞；
任选地使非整倍体细胞经历激活步骤；和
通过除去或破坏所述非整倍体细胞的受体细胞胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从所述重新编程的二倍体细胞产生转基因动物胚胎。
33.根据权利要求31所述的方法，该方法是一种产生非人转基因动物胚胎的方法，该方法包括
提供
二倍体供体胞核，
外源核酸分子，和
受体细胞；
将供体胞核和外源核酸分子导入受体细胞，产生非整倍体细胞；
任选地通过除去或破坏受体细胞的胞核、前核、中期板、染色质、染色体或胞核DNA，从所述非整倍体细胞产生重新编程的二倍体细胞；和
从非整倍体细胞或重新编程的二倍体细胞产生转基因动物胚胎。
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