CN107099513A - 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 - Google Patents

一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及构建表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒rHVT‑HN株，该重组病毒可以用于制备载体疫苗预防马立克氏病和鸡新城疫病。本发明同时利用rHVT‑HN株进一步构建了共表达新城疫病毒HN基因和传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用。本发明构建的一种重组火鸡疱疹病毒rHVT‑HN‑VP2株，是将新城疫病毒HN基因和传染性法氏囊VP2基因的表达盒重组到HVT中获得的重组病毒，该重组病毒可作为生产毒种用于制备病毒活载体疫苗，用于制备的载体疫苗不仅可以预防马立克氏病，还可以预防鸡新城疫和传染性法氏囊病。

Description

一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的HVT的构建及其应用
技术领域
本发明涉及一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的HVT的构建及其应用。属于动物生物制品学领域，
背景技术
鸡马立克氏病(Marek`s Disease，MD)是由属于细胞结合性疱疹病毒B群的鸡马立克氏病毒(Marek`s Disease Virus，MDV)引起鸡的一种最常见的淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征。
根据MDV的三种血清型，目前商品化MDV疫苗分为致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株、无致病性的Ⅱ型SB1株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey，HVT)FC126株。致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株对MD保护效果好，但其作为严格的细胞结合型病毒，必须液氮保存运输，极大的增加了疫苗成本。HVT可以冻干保存，节约了疫苗成本，相对于其它病毒载体，MDV作为最有潜力的疫苗载体，其突出的优点体现在：MDV是严格的细胞结合型病毒，构建的载体疫苗不受母源抗体的干扰，克服了众多活病毒载体疫苗的缺陷；MDV分子大小为180kb左右，能够容纳较大片段基因的插入，而不影响重组病毒的稳定性；MDV疫苗适合早期免疫，对多数病毒特别是免疫抑制性病毒疫苗的研发带来了曙光。基于HVT构建病毒活载体疫苗不仅具有上述优点，还可以实现一苗两防、一苗多防，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供了一种重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT-HN-VP2株，其实际上是在马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)血清Ⅲ型火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)的基础上，将新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(Haemagglutinin-neuraminidase，HN)基因的表达盒和传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的VP2基因表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防新城疫(ND)和传染性法氏囊病(IBD)。
本发明的技术方案
1.一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-HN株，该毒株已于2017年06月07日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.14292。
2.本发明所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建，其特征在于：将NDV HN基因表达盒重组到HVT基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的位于HVT087-HVT088基因之间的US2区域，该表达盒的基因序列如序列1所示。
3.本发明所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株在鸡体中诱导抗马立克氏病和新城疫的保护性免疫中的应用。
4.本发明所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株作为生产毒株在动物疫苗株的应用。
5.本发明所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将该重组病毒作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒中的应用。
6.本发明所述一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于用该病毒作为载体将鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因表达盒重组到rHVT-HN基因组中，获得的一株共表达NDV HN和IBDV VP2基因的并被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus ofturkey)rHVT-HN-VP2株，该毒株已于2017年06月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.14291，该病毒IBDV VP2的重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间,VP2基因表达盒的启动子序列、VP2基因序列和PolyA序列分别如2、序列3和序列4所示。
7.本发明所述的一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株在鸡中诱导抗鸡马立克氏病、鸡新城疫和传染性法氏囊病的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
8.本发明所述的一种共表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
本发明具体实施方式
1.毒株的构建：
(1)本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-HN)，其实际上是将NDV HN基因重组到火鸡疱疹病毒基因组中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN，该病毒通过将由启动子控制下的NDV HN基因(NDV-HN基因表达盒，序列1)插入到HVT基因组中，rHVT-HN不仅可以对鸡MD起保护作用，还可以对新城疫(ND)起免疫保护作用。
该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示，具体如下：在本发明中，发明人将含有NDV基因HN基因表达盒插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域US区域(在HVT基因组HVT087-HVT088基因之间，附图2)。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，是以HVT基因组为模板进行扩增，设计引物HVT-US2 left sense和HVT-US2 left antisense(序列5,6)和引物HVT-US2 right sense和HVT-US2 right antisense(序列7,8)分别扩增左、右同源臂；再将左、右同源臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右同源臂的重组质粒命名为PHVT-DS。然后人工合成了含有NDV HN序列的基因表达盒(序列1)，NDV HN表达盒通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS质粒中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将NDV HN重组进HVT US2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-NDV-HN。利用重组质粒(PHVT-DS-NDV-HN)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗NDV的单因子血清进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN株，并于2017年06月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.14292。
(2)同时，本发明利用rHVT-HN为载体平台，表达了鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因，构建重组病毒rHVT-HN-VP2。上述重组病毒的DNA序列模式图如附图3所示。具体方案如下：在本发明中，发明人将含有IBDV-VP2基因表达盒插入rHVT-HN基因组中，插入的区域为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，见附图4。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，IBDV-VP2基因(序列3)参考NCBI序列(GenBank:HG974565.1)，由商业公司合成。启动子参考了疱疹病毒(Murid herpesvirus 1strain Smith)的启动子序列(序列2)，终止序列为真核表达载体中常用的PolyA终止序列(序列4)。具体构建方法如下：按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，设计引物HVT-L-F和HVT-L-R(序列9，10)扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物PROF和PROR(序列11，12)扩增启动子，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物VP2-F和VP2-R(序列13，14)扩增VP2基因，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物polyA-F和polyA-R(序列15，16)扩增PolyA(以pCMVbeta质粒为模板,GenBank:U02451)，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物HVT-R-F和HVT-R-R(序列17，序列18)扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-HN基因组中的HVT065和HVT066之间。将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R重组质粒与rHVT-HN基因组共转染CEF，借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法获得重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-HN-VP2株，该株病毒已于2017年06月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为为：CGMCCNo.14291。
2.重组病毒的验证
将rHVT-HN、rHVT-HN-VP2接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，分别用抗NDV-HN和IBDV-VP2的单抗或血清进行间接免疫荧光鉴定，结果表明，rHVT-HN中的NDV HN基因、rHVT-HN-VP2中的NDV-HN和IBDV-VP2都获得了良好的正确表达。
3.疫苗制备
发明人将上述重组病毒制备成疫苗，以方便进行免疫操作，进一步的，发明人将重组病毒应用于鸡的免疫保护实验中。
rHVT-HN对鸡预防ND免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-HN，免疫后21日各肌肉注射新城疫病毒强毒北京株0.5ml(含105EID50，中国兽医药品监察所，CVCC AV1611)，观察14d，rHVT-HN对ND的保护率达到85％。
rHVT-HN-VP2对鸡预防ND和IBD免疫保护效力评价20只1日龄SPF鸡免疫rHVT-HN-VP2，21日10只各肌肉注射新城疫病毒强毒北京株0.5ml(含105EID50，中国兽医药品监察所，CVCC AV1611)，观察14d，攻毒对照组全部死亡，rHVT-HN-VP2对ND的保护率达到90％。21日龄10只点眼攻击IBDV BC6/85株(中国兽医药品监察所，CVCC AV7)10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-HN-VP2免疫组保护8只。攻毒对照组法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)，rHVT-HN-VP2可以对IBD形成良好的保护。
综上所述，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-HN)，其实际上是将NDV HN基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN，该病毒同时也是一种良好的马立克氏病和新城疫疫苗。本发明同时利用rHVT-HN为载体，构建能够表达传染性法氏囊的VP2基因的病毒活载体疫苗，获得重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株。将该重组病毒制备疫苗，不仅可以预防MD，还能预防新城疫和传染性法氏囊病。
附图说明
图1为rHVT-HN基因组示意图；NDV-HN表达盒插入HVT基因组中的US2区域，插入位点为基因HVT087和HVT088之间。
图2为NDV-HN表达盒在HVT基因组中整合位点示意图；大写序列上游部分为基因HVT087，大写序列下游部分为基因HVT088(US2)，删除线部分为NDV-HN取代的HVT序列。
图3为rHVT-HN-VP2基因组示意图；NDV-HN表达盒插入HVT基因组中的US2区域，插入位点为基因HVT087和HVT088之间。IBDV-VP2表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。
图4为IBDV-VP2表达盒整合位点示意图；大写序列上游部分为HVT065,大写序列下游部分为HVT066，删除线部分为IBDV-VP2表达盒取代的HVT序列。
本发明涉及生物材料资源信息
本发明构建的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN株和rHVT-HN-VP2株2株病毒已于2017年06月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为：CGMCC No.14292和CGMCCNo.14291；鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus)Md5株(ATCC，VR-987)购自美国菌种保藏中心(American type culture collection,ATCC)；鸡新城疫病毒(Newcastle vdisease virus)强毒北京株(CVCC AV1611)和鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursaldisease virus)BC6/85株(CVCC AV7)请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142和135。
本发明的积极意义
本发明涉及表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用，该病毒不仅是一种良好的马立克氏病疫苗，还可以对新城疫起到良好的免疫保护效果。本发明同时利用rHVT-HN为载体，构建了能够表达传染性法氏囊病毒的VP2基因的病毒活载体疫苗rHVT-HN-VP2株，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防新城疫和传染性法氏囊病，真正实现一苗三防的作用。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明请求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——重组病毒rHVT-HN的构建
1.重组质粒PHVT-DS的构建
首先构建用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，引物(序列5、序列6、序列7和序列8)；
HVT-US2 left sense：5-GATgaattcA CATCGGGCCA CGTTCCGCC-3 29(序列5)；
HVT-US2 left antisense：5-ATAGTCGACt taattaaGAT GAGCTGACGT GTGGAAT-337(序列6)。
HVT-US2 right sense：5-ATCgtcgacA CTAATATGGG CACACCCAC-3 29(序列7)；
HVT-US2 right antisense：5-ATCaagcttT GGCCCATCTA GGTGATTAT-3 29(序列8)。
以HVT基因组为模板进行扩增，扩增后的左右臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右臂的重组质粒命名为PHVT-DS。
2.PHVT-DS-NDV-HN的构建
根据NDV HN基因序列，商业合成NDV HN基因的表达盒(序列1)，通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将NDV HN重组进HVT US2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-NDV-HN。
3.重组病毒rHVT-HN株的构建
利用重组质粒(PHVT-DS-NDV-HN)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗NDV单因子血清进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒株被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN株(CGMCC No.14292)。
实施例2
——重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2的构建
利用重组病毒rHVT-HN为载体平台，表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因。具体构建方法如下：
按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，设计引物(序列9和序列10)扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物(序列11和序列12)扩增启动子(序列2)，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物(序列13和序列14)扩增VP2基因(序列3)，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物(序列15和序列16)扩增PolyA(序列4)，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物HVT-R-F(序列17)和HVT-R-R(序列18)扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，参考rHVT-HN的构建方法，将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R重组质粒与rHVT-HN基因组共转染CEF，使该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-HN基因组中的HVT 065和HVT 066之间。借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法获得重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株(CGMCC No.14291)。
HVT-L-F:5-GTTCCTTGAA ATGCCGACAA CTCTAAAAAC GGTATTCG-3 38(序列9)；
HVT-L-R:5-GCTAGCGCGG CCGCGAATTC GTTTAATGTT AGTTTATT-3 38(下游引物5’端含有Nhe I/NotI/EcoRI酶切位点，序列10)；
PRO-F:-GGGGAATTCA CTAGTGGATC CCCCAACTCC GCCCGTTTTA TGACTAGA-3 48(EcoRI，序列11)；
PRO-R:5-AAATTGCGGC CGCCTGCAGC GAGGAGCTCT GCGTTCTACG GTGGT-3 45(Not I，序列12)
Vp2-F:5-aatGCGGCCG CTCTAGAACT CGTCGATCGC AGCGATGACA AACCTGCAAG-3 50(Not I，序列13)；
Vp2-R:5-GGCGCTAGCA AGCTTACCTC CTTATAGCCC GGATTATGTC TTTGAAGCCA-3 50(HindIII/Nhe I，序列14),
polyA-F:5-AATAAGCTTG ATCTAGAGCG GCCGCGG-3 27(HindIII，序列15)；
polyA-R:5-AATGCTAGCG TCGACTCTAG AGGATCCG-3 28(Sal I/Nhe I，序列16)，
HVT-R-F:5-GGCGGTCGAC AATTATTTTA TTTAAT-3 26(序列17)；
HVT-R-R:5-GGCGCTAGCC TAGTGTTTCA ATTAT-3 25(序列18)
实施例3
——重组病毒的验证
1.rHVT-HN重组病毒
将50PFU病毒量的rHVT-HN和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-HN和HVT接种孔中分别加入0.5mL(1:100稀释)抗NDV单因子血清，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mL FITC标记抗IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，细胞蚀斑出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，结果表明NDV-HN基因能够良好的正确表达。
2.rHVT-HN-VP2重组病毒
将50PFU病毒量的rHVT-HN-VP2和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-HN-VP2和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)抗NDV单因子血清，另外rHVT-HN-VP2和HVT接种孔中加入0.5mL抗IBDV-VP2单抗。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-HN-VP2接种孔中细胞蚀斑，加入NDV单因子血清或抗IBDV-VP2单抗后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明NDV HN基因和IBDVVP2基因均能够良好的正确表达。
实施例4
——重组病毒制备疫苗
将重组病毒接种鸡胚成纤维细胞，制备种子病毒；用转瓶进行扩大培养，接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，接种后约50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干成活疫苗。
实施例5
——rHVT-HN-VP2活疫苗对鸡预防ND免疫保护效力评价
40只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-HN-VP2，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种HVT，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第4组为空白对照(非免疫非攻毒)组。免疫后21日，1、2、3组鸡各肌肉注射新城疫北京株强毒0.5ml(含105EID50)，观察14d，rHVT-HN-VP2保护率达到90％(见表1)。
表1 rHVT-HN-VP2活疫苗对SPF鸡的免疫保护效果
组别 试验动物数 攻毒用毒株 ND发病或死亡 保护率(％)
rHVT-HN-VP2疫苗免疫组 10 NDV(北京株) 1 90
HVT疫苗免疫组 10 NDV(北京株) 10 0
攻毒对照组- 10 NDV(北京株) 10 0
空白对照组- 10 - 0 100(存活)
实施例6
——rHVT-HN-VP2活疫苗对鸡预防IBD免疫保护效力评价
40只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-HN-VP2活疫苗，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种HVT，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第4组为空白对照(非免疫非攻毒)组。21日龄每只点眼攻击BC6/85株10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-HN-VP2免疫组保护8只。第2组(HVT免疫组)和第3组(攻毒对照组)法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)(见表2)。
表2 rHVT-HN-VP2活疫苗对SPF鸡的免疫保护效果
组别 试验动物数 攻毒用毒株 IBD病变数 保护率(％)
rHVT-HN-VP2疫苗免疫组 10 IBDV BC6/85株 2 80
HVT疫苗免疫组 10 IBDV BC6/85株 10 0
攻毒对照组 10 IBDV BC6/85株 10 0
空白对照组 10 - 0 100(存活)
序列表
　　<110> 北京邦卓生物科技有限公司
　　<120> 一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的HVT的构建及其应用
　　<210> 1
　　<211> 2267
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：NDV HN基因表达盒序列。
　　<400> 1
ttaattaatt attttgtgca gcgatggggg Cggggggggg Gggggcgcgc gccaggcggg 060
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 120
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 180
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc 240
gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tacgcggccg ggcatgcctg 300
caggcccggg taccatggac cgcgcggtta acagagtcgt gctggagaat gaggaaagag 360
aagcaaagaa cacatggcgc ctggttttcc ggatcgcagt cttactttta atggtaatga 420
ctctagctat ctccgcagct gccctggcat acagtatgga ggccagtacg ccgcacgacc 480
ttgcaggcat atcgactgtg atctctaaga cagaagataa ggttacgtct ttactcagtt 540
cgagtcaaga tgtgatagat aggatataca agcaggtggc tcttgaatcc ccgctggcgc 600
tactaaacac tgaatctaca attatgaatg cgataacctc tctttcttat caaattaacg 660
gggctgcgaa caatagcgga tgtggggcgc ctgttcatga cccagattat atcgggggga 720
taggcaaaga actcatagtg gacgacatca gtgatgtcac atcattttat ccttctgcat 780
atcaagaaca cctgaatttc atcccggcgc ctactacagg atccggttgc actcggatac 840
cctcatttga catgagcacc acccattatt gttatactca caatgtaata ctatccgatt 900
gcagagatca ctcacactca catcaatact tagcgcttgg tgtgcttcgg acatctgcaa 960
cagggagggt attcttctct actctgcgct ccatcaattt agatgacacc caaaatcgga 1020
agtcctgcag tgtgagtgca acccctttag gttgtgatat gctgtgctct aaggtcacag 1080
ggactgaaga ggaggattac aagtcagctg ccccaacatc aatggtgcac ggaaggctaa 1140
ggtttgacgg tcaataccat gagaaggact tagacaccac ggtcttattt aaggattggg 1200
tggccaatta cccaggagtg ggaggagggt cttttattga cgaccgtgta tggttcccag 1260
tttacggagg gctcaaaccc aattcaccca gtgacactgc acaagaaggg aaatatgtaa 1320
tatacaagcg ccataacaac acatgccccg atggacaaga ttaccaaatt cggatggcta 1380
agtcttcata taaacccggg cgatttggtg gaaagcgcgt acagcaagcc atattatcca 1440
tcaaagtgtc aacatccttg ggtaaggacc cggtgctgac tattccacct aatacaatca 1500
cactcatggg agccgaaggc agaatcctca cagtagggac atctcacttc ttgtaccaac 1560
gagggtcttc atatttctcc cctgccttat tatatcccat gacagtaaat aacaaaacgg 1620
ctacactcca tagtccttat acgtttaatg ctttcactcg gccaggtagt gtcccttgcc 1680
aggcatcagc aagatgcccc aactcatgca tcactggggt ctatactgat ccatatccct 1740
taatcttcta taggaatcat actctacgag gggtctttgg gacgatgctt gatgatgaac 1800
aagcgagact taaccccgta tctgcagtat tcgacaacat atcccgcagt cgtgtcaccc 1860
gggtgagttc aagcagcacc aaggcagcat acacgacatc gacatgtttt aaagttgtca 1920
agaccaataa agcttattgt cttagtattg cagagatatc caatacccta ttcggggaat 1980
ttaggatcgt tcccttatta gttgagatcc tcaaggatga tagagtttaa gagctctaag 2040
cttgatctag agcggccgcg gggatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 2100
aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctctatttgt gaaatttgtg atgctattgc 2160
tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcatct 2220
tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttct taattaa 2267
　　<210> 2
　　<211> 1391
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2中VP2基因所用启动子序列
　　<400> 2
aactccgccc gttttatgac tagaaccaat agtttttaat gccaaatgca ctgaaatccc 060
ctaatttgca aagccaaacg ccccctatgt gagtaatacg gggacttttt acccaatttc 120
ccaagcggaa agccccctaa tacactcata tggcatatga atcagcacgg tcatgcactc 180
taatggcggc ccatagggac tttccacata gggggcgttc accatttccc agcatagggg 240
tggtgactca atggccttta cccaagtaca ttgggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt 300
tttcccatta ctggcaagca cactgagtca aatgggactt tccactgggt tttgcccaag 360
tacattgggt caatgggagg tgagccaatg ggaaaaaccc attgctgcca agtacactga 420
ctcaataggg actttccaat gggtttttcc attgttggca agcatataag gtcaatgtgg 480
gtgagtcaat agggactttc cattgtattc tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 540
atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acactgcgtc aatagggact ttccattggg 600
ttttgcccag tacataaggt caatagggga tgagtcaatg ggaaaaaccc attggagcca 660
agtacactga ctcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 720
gggtgagtca acaggaaagt cccattggag ccaagtacat tgagtcaata gggactttcc 780
aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt tttcccatta 840
ctggcacgta tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 900
aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt caatagggac 960
tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc 1020
cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080
aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140
cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200
aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260
tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320
ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380
cctcgctgca g 1391
　　<210> 3
　　<211> 1359
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：IBDV-VP2基因序列
　　<400> 3
Atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 060
Ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120
Gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
Cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240
Aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga 300
Ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360
Aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa tgtcctggta 480
ggggaagggg tcactgtcct cagcctaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540
ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagctacatg cgacagcagt 600
gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660
caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc 720
agcattgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgccacc 780
atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc cgcagataat 840
gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960
gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080
tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga ttccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260
gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggagg 1359
　　<210> 4
　　<211> 232
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：PolyA序列
　　<400> 4
tctagagcgg ccgcggggat ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 060
Caactagaat gcagtgaaaa aaatgctcta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 120
ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt catcttatgt 180
ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttcggatcc tctagagtcg ac 232
　　<210> 5
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 left sense
　　<400> 5
GATgaattcA CATCGGGCCA CGTTCCGCC-3 29
　　<210> 6
　　<211> 37
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增US2基因左右臂序列的引物 HVT-US2 leftantisense
<400> 6
ATAGTCGACt taattaaGAT GAGCTGACGT GTGGAAT-3 37
　　<210> 7
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 right sense
　　<400> 7
　　ATCgtcgacA CTAATATGGG CACACCCAC-3 29；
　　<210> 8
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 rightantisense
<400> 8
ATCaagcttT GGCCCATCTA GGTGATTAT-3 29
　　<210> 9
　　<211> 38
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增左同源臂上游引物HVT-L-F
　　<400> 9
　　gttccttgaa atgccgacaa ctctaaaaac ggtattcg 38
　　<210> 10
　　<211> 38
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增左同源臂下游引物HVT-L-R
　　<400> 10
　　GCTAGCGCGG CCGCGAATTC gtttaatgtt agtttatt (下游引物5’端含有Nhe I/NotI/EcoRI酶切位点) 38
　　<210> 11
　　<211> 48
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增启动子的上游引物PRO-F
　　<400> 11
　　GGGGAATTCA CTAGTGGATC CCCCAACTCC GCCCGTTTTA TGACTAGA (EcoRI) 48
　　<210> 12
　　<211> 45
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述： 扩增启动子的下游引物PRO-R
　　<400> 12
　　AAATTGCGGC CGCCTGCAGC GAGGAGCTCT GCGTTCTACG GTGGT(Not I) 45
　　<210> 13
　　<211> 50
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增VP2基因的上游引物VP2-F
　　<400> 13
　　aatGCGGCCG CTCTAGAACT CGTCGATCGC AGCGATGACA AACCTGCAAG (Not I) 50
　　<210> 14
　　<211> 50
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增VPP2基因的下游引物VP2-R
　　<400> 14
　　GGCGCTAGCA AGCTTACCTC CTTATAGCCC GGATTATGTC TTTGAAGCCA (HindIII/NheI) 50
　　<210> 15
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增polyA的上游引物polyA-F
　　<400> 15
　　AATAAGCTTG ATCTAGAGCG GCCGCGG (HindIII) 27
　　<210> 16
　　<211> 28
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增polyA的下游引物polyA-R
　　<400> 16
　　AATGCTAGCG TCGACTCTAG AGGATCCG (Sal I/Nhe I) 28
　　<210> 17
　　<211> 26
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增右同源臂的上游引物HVT-R-F
　　<400> 17
　　GGCGGTCGAC aattatttta tttaat 26
　　<210> 18
　　<211> 32
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：扩增右同源臂的下游引物HVT-R-R
　　<400> 18
　　GGCGCTAGCc tagtgtttca attat 25
7

Claims (8)

1.一种表达新城疫病毒(NDV)HN基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-HN株，该毒株已于2017年06月07日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.14292。
2.如权利要求1所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建，其特征在于：将NDV HN基因表达盒重组到HVT基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的位于HVT087-HVT088基因之间的US2区域，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株在鸡体中诱导抗马立克氏病和新城疫的保护性免疫中的应用。
4.如权利要求3所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株作为生产毒株在动物疫苗株的应用。
5.如权利要求1所述的一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将该重组病毒作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒中的应用。
6.如权利要求1，5所述一种表达NDV HN基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于用该病毒作为载体将鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因表达盒重组到rHVT-HN基因组中，获得的一株共表达NDV HN和IBDV VP2基因的并被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-HN-VP2株，该毒株已于2017年06月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.14291，该病毒IBDV VP2的重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间,VP2基因表达盒的启动子序列、VP2基因序列和PolyA序列分别如2、序列3和序列4所示。
7.如权利要求6所述一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株在鸡中诱导抗鸡马立克氏病、鸡新城疫和传染性法氏囊病的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
8.如权利要求6所述的一种共表达NDV HN和IBDV VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-HN-VP2株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593136A (zh) * 2018-12-26 2019-04-09 天康生物股份有限公司 禽副粘病毒融合蛋白及其制备方法、应用和用于鸽子的apmv疫苗
CN112048484A (zh) * 2020-07-27 2020-12-08 华南农业大学 一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1225685A (zh) * 1996-07-19 1999-08-11 梅瑞尔公司 禽多核苷酸疫苗制剂
CN1278299A (zh) * 1995-09-27 2000-12-27 尼克斯特兰公司 用于具有降低的抗体介导的排斥的异种移植的转基因动物
CN103260643A (zh) * 2009-12-28 2013-08-21 梅里亚有限公司 重组ndv抗原及其用途
WO2016087560A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Intervet International B.V. Immortalised chicken embryo fibroblasts
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine
CN105920598A (zh) * 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
CN106701693A (zh) * 2017-01-19 2017-05-24 北京邦卓生物科技有限公司 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1278299A (zh) * 1995-09-27 2000-12-27 尼克斯特兰公司 用于具有降低的抗体介导的排斥的异种移植的转基因动物
CN1225685A (zh) * 1996-07-19 1999-08-11 梅瑞尔公司 禽多核苷酸疫苗制剂
CN103260643A (zh) * 2009-12-28 2013-08-21 梅里亚有限公司 重组ndv抗原及其用途
CN105920598A (zh) * 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
WO2016087560A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Intervet International B.V. Immortalised chicken embryo fibroblasts
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine
CN106701693A (zh) * 2017-01-19 2017-05-24 北京邦卓生物科技有限公司 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵军等: "表达新城疫病毒HN 基因的重组火鸡疱疹病毒的构建", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593136A (zh) * 2018-12-26 2019-04-09 天康生物股份有限公司 禽副粘病毒融合蛋白及其制备方法、应用和用于鸽子的apmv疫苗
CN112048484A (zh) * 2020-07-27 2020-12-08 华南农业大学 一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗

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