CN111018946B - 基于IL-15/IL-15Rα的缀合物的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备包含源自样品的单体缀合物的组合物的方法，所述缀合物包含(a)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和(b)包含IL‑15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；其中，所述方法包括阴离子交换色谱、然后是疏水相互作用色谱的应用；和涉及可通过所述方法获得的药物组合物。

Description

基于IL-15/IL-15Rα的缀合物的纯化方法
本国际专利申请要求于2014年3月3日提交的欧洲专利申请EP 14000742.8的优先权，该申请以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及生物化学工程领域。更具体地，本发明涉及一种改进的生 物化学回收方法，在该方法中可以使基于IL-15/IL-15Rα的缀合物以单体 形式重折叠和回收。该组合物可以用于药物制剂。
背景技术
在免疫疗法中，人们特别感兴趣的是基于细胞因子的免疫疗法。这些为 可溶性分子的分子调节体液和/或细胞免疫。在这些分子中，人们更特别感兴 趣的是IL-2、IL-7、IL-12和IL-15，这是由于这些分子诱导NK细胞的存活 和/或增殖，因此其作为用于治疗感染或癌症的助剂而被关注。
最早在类人猿肾上皮细胞系CV-1/EBNA和T细胞白血病细胞系 HuT-102的培养物上清液中发现了细胞因子白细胞介素-15(IL-15)。IL-15的 cDNA序列编码162个氨基酸(aa)的前体蛋白，该前体蛋白由一个长的48-aa 的前导肽和一个114-aa的成熟蛋白组成。尽管IL-15与IL-2不具有序列同源 性，但是氨基酸序列分析预测，IL-15与IL-2一样，为四α螺旋束细胞因子 家族的一员。
实际上将白细胞介素-15看作是一种非常有前途的未来药物。然而，由 于IL-15的短的半衰期及其它参数，其在哺乳动物细胞系中的生产实际上是 以低产量进行的。
专利US 8,124,084 B2和EP 1,934,353 B1中描述了基于白细胞介素-15 及其受体IL-15Rα或其片段的新的缀合物。
不过，尽管这些缀合物具有显著更长的半衰期，但是其纯化由于二聚的 和多聚的复合物的形成而变得复杂。此外，由于存在高百分数的二聚的和低 聚的聚集体，因此，相应的纯化组合物不能用作药剂，因为聚集体可能参与 针对注射用生物制品的免疫原性/过敏性反应(抗药物抗体，ADA)。
因此，需要新的纯化方法从而获得能够用作药剂的缀合物组合物。
发明概述
提供一种用于单体缀合物的制备的纯化方法。该方法提供包含这种单体 缀合物的液体药物组合物。该方法包括可能增强所述缀合物在回收过程中重 折叠的条件。
发明人已经证实了一种采用阴离子交换色谱、然后采用疏水相互作用色 谱的纯化过程能够获得单体形式的缀合物；但是采用疏水相互作用色谱、然 后采用阴离子交换色谱的纯化不能获得单体形式的缀合物。此外，发明人已 经惊奇地证实疏水相互作用色谱的上样步骤必须通过如下完成：将第一洗脱 液与上样缓冲液直接混合至所述色谱柱的混合室内。事实上，这种上样程序是使能够获得高浓度的单体形式的活性融合蛋白而不具有其在色谱树脂上 的共沉淀的最有效的程序。
第一方面，因此，本发明涉及一种用于制备包含来自样品的单体缀合物 的组合物的方法，所述缀合物包含：
a)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和
b)包含IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；
其中，所述方法包括阴离子交换色谱、然后是疏水相互作用色谱对所述 样品的应用。
第二方面，本发明涉及一种包含所述单体缀合物的药物组合物。
第三方面，本发明涉及所述组合物用于治疗受试者中的癌症和/或感染的 用途。
附图说明
图1示出了在CHO细胞系中RLI生产的两个色谱洗脱曲线。
图2示出了在CHO细胞系中RLI生产的尺寸排阻色谱曲线。
图3示出了采用IL-15抗体对在CHO细胞系(第2至7泳道)或在毕 赤酵母(Pichiapastoris)(第9和10泳道)中产生的RLI的蛋白质印迹。通 过聚糖酶(PNGase)的RLI的去糖基化对应于第3、5、7和10泳道。
图4示出了RLI产品的SEC-MALLS谱图(光散射)。
图5示出了不同的RLI生产对kit225细胞系的增殖活性。
图6示出了不同的RLI生产对32DB细胞系的增殖活性。
图7示出了在小鼠注射若干RLI样品后获得的小鼠NK增殖。
发明详述
本发明涉及一种新的用于制备包含单体缀合物的药物组合物的方法。
术语“单体(的)”是指存在于组合物中的大多数缀合物是单体的而不 是聚集的。“聚集的”是指多肽分子之间的物理相互作用而形成多聚体，即 二聚体或低聚体，这些多聚体保持是可溶性的，也可从溶液中沉淀出来。大 多数时候，这种聚集的状态是不可逆的，并且导致所述缀合物的变性。在缀 合物变性之后，必须注意该缀合物可与强的免疫原性相关。
在所述组合物中，单体形式的缀合物百分数(以重量计)，即与其聚集 的形式相对的，为至少80％或更多，优选地为至少90％或更高，和更优选地 为至少95％或更高。
术语“样品”是指表达所述缀合物的转化的宿主细胞的培养基样品。用 于本发明的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选地为CHO(中国仓鼠卵巢)细 胞，如CHO Kl(ATCC编号：CCL-31，CCL-61或CRL-9618)、CHO-DHFR (ATCC CRL-9096)、CHO-DXB-11、具有ATTC编号为ATCC CRL 1610或 CHO DG44的CHO细胞；HEK293(人胚肾)，如293(ATCC编号：CRL-1573) 或HEK-293.2sus(ATCC编号：CRL-1573.3)；COS细胞，如COS-1(ATCC 编号：CRL-1650)和COS-7(ATCC编号：CRL-1651)；细胞(人 视网膜源性细胞系；DSM BIOLOGICS，CRUCELL)；SP2O，如SP2/0-Agl4 细胞(ATCC登录号：CRL-1851)，NSO细胞或源于它们的任何细胞。
优选地，所述宿主细胞对应于CHO细胞系。
在第一个优选的实施方案中，本发明所述的方法包括如下步骤：
(a)使所述样品经受阴离子交换色谱(AEX)以产生第一洗脱液；
(b)使所述第一洗脱液经受疏水相互作用色谱(HIC)以产生第二洗脱液。
阴离子交换色谱(AEX)的第一步骤可以采用选自包含以下或由以下组成 的组的AEX柱或树脂完成：Q Sepharose(如Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose XL、大珠子QSepharose、高效Q sepharose和Q sepharose XL)、 DEAE Sephadex A-25、DEAE SephadexA-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、Sourse 15Q、Sourse 30Q、Resourse Q、Capto Q、Capto DEAE、 Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q；TSKgel SuperQ、TSKgel DEAE、Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAE、 MacroprepHigh Q、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、 POROS PI、DEAE CeramicHyperD和Q Ceramic HyperD；DEAE Sepharose Fast Flow和ANX Sepharose 4Fast Flow。
有利地，所述AEX树脂或柱对应于Q Sepharose或DEAE Sepharose， 和更优选地对应于如Q Sepharose的强阴离子交换剂。
现在，所述步骤a)通常以一定数量的步骤实施，所述一定数量的步骤包 括所述柱或树脂的平衡、样品的探索(scouting)和洗脱。在上样之后和洗脱之 前可包括一个或多个洗涤步骤。
根据制造商的说明可简单地实施平衡步骤。
如发明人所确定的，所述探索步骤采用NaCl缓冲液来完成。作为一个 实例，所述探索缓冲液包含0.5M至1.5M NaCl，优选地包含0.75M至1.25M NaCl，和最优选地包含1MNaCl。
所述探索步骤优选地在采用超滤盒的浓缩和渗滤的培养上清液上实现。
阴离子交换色谱(AEX)的制造商建议采用比所述待纯化蛋白质的等电点少至少一 个pH单位的pH。
意外地，虽然RLI1(SEQ ID NO：16)或RLI2(SEQ ID NO：17)具有将近 5.5的电点，发明人已经证实了所述步骤a)必须在pH等于或大于7.0，优选地等于或大于7.5下实施。
所述阴离子交换色谱(AEX)的洗脱步骤在采用1至0M NaCl，优选地 0.75至0MNaCl的盐水缓冲液的梯度中实现。
疏水相互作用色谱(HIC)的步骤b)可以采用选自包含以下或由以下组成 的组的HIC柱或树脂完成：Phenyl Sepharose、Butyl Sepharose、Octyl Sepharose、ToyoPearlHexyl-650、ToyoPearl Ether-650、Hydrocell C3、 Hydreocell Phenyl 1500或HydrocellC4 1500。
有利地，所述HIC树脂或柱对应于Phenyl Sepharose。
如同对于步骤a)，所述步骤b)通常包括一定数量的步骤，所述一定数量 的步骤包括所述柱或树脂的平衡、样品的上样和洗脱。在上样之后和洗脱之 前可包括一个或多个洗涤步骤。
再次，根据制造商的说明可简单地实施平衡步骤。
对于所述探索步骤，所述缓冲溶液包含铵盐，如硫酸铵或醋酸铵，优选 地包含硫酸铵。例如，所述探索缓冲液包含0.75M至2.5M硫酸铵，优选地 包含1M至2M硫酸铵，和最优选地包含1.5M至2M硫酸铵。
所述探索步骤是关键的。在发明人认识到的经验中，所有的纯化都得到 了可变量的缀合物，该缀合物主要是聚集的形式。
意外地，发明人通过将自步骤a)获得的第一洗脱液与探索缓冲液直接在 所述色谱柱或树脂上，更尤其是直接在所述色谱柱或树脂的混合室内混合成 功地获得了单体形式的缀合物。
所述洗脱步骤在采用2至0M硫酸铵，优选地1.5M至0M硫酸铵的盐 水缓冲液的梯度中实现。
本发明的方法可包括一个或多个进一步的步骤。
作为一个实例，所述本发明的方法可包括使所述第二洗脱液经受尺寸排 阻色谱(SEC)以产生第三洗脱液的步骤。
所述尺寸排阻色谱(SEC)的步骤可通过采用如Superdex 200或Superdex 75的SEC柱完成。
作为另一个实例，本发明的方法还可包括使所述第二洗脱液经受另一个 阴离子交换色谱(AEX)以产生第三洗脱液的步骤。
所述阴离子交换色谱的步骤可按照前述完成。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括将获得的缀合物 用于制备药剂的步骤。
术语“缀合物”以其在本领域中的一般含义使用，是指共价或非共价复 合物，优选地是指共价复合物，且最优选地是指融合蛋白。
术语“白细胞介素15”为其在本领域的一般含义，是指具有与IL-2 的结构相似性的细胞因子(GRABSTEIN等，Science，vol.264(5161)， p：965-968，1994)。这种细胞因子也被称为IL-15、IL15或MGC9721。这种 细胞因子和IL-2共享许多生物活性，且发现它们结合相同的促红细胞生成 素受体亚基。因此，IL-15和IL-12可以竞争相同的受体，从而负调节彼此 的活性。已经证实，IL-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖，且 证明CD8+记忆细胞的数量由这种细胞因子和IL-2之间的平衡来控制。如 实施例中所公开的，IL-15的活性可以通过测定其对kit225细胞系的增殖 诱导来测量(HORI等，Blood，vol.70(4)，p：1069-72，1987)。
对于kit225细胞系的增殖诱导，所述IL-15或其衍生物具有人白细胞 介素-15的活性的至少10％，优选地至少25％，更优选地至少50％。
所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15，优选地为灵长类动物 白细胞介素15，更优选地为人白细胞介素15。
本领域技术人员可以简单地识别哺乳动物白细胞介素15。作为一个实 例，可以引用源自野猪(Sus scrofa)(登录号：ABF82250)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(登录号：NP_037261)、小家鼠(Mus masculus)(登录号： NP_032383)、牛(Bos Taurus)(登录号：NP_776515)、家兔(Oryctolagus cuniculus)(登录号：NP_001075685)、绵羊(Ovies aries)(登录号： NP_001009734)、家猫(Felis catus)(登录号：NP_001009207)、食蟹猴 (Macacafascicularis)(登录号：BAA19149)、智人(登录号：NP_000576)、 恒河猴(Macaca_Mulatta)(登录号：NP_001038196)、土拨鼠(Cavia porcellus) (登录号：NP_001166300)或绿猴(Chlorocebus sabaeus)(登录号：ACI289) 的白细胞介素15。
本文所用术语“哺乳动物白细胞介素15”是指共有序列SEQ ID NO：1。
本领域技术人员可以简单地识别灵长类动物白细胞介素15。作为一个 实例，可以引用源自野猪(登录号：ABF82250)、家兔(登录号： NP_001075685)、食蟹猴(登录号：BAA19149)、智人(登录号：NP_000576)、 恒河猴(登录号：NP_001038196)或绿猴(登录号：ACI289)的白细胞 介素15。
本文所用术语“灵长类动物白细胞介素15”是指共有序列SEQ ID NO： 2。
本领域技术人员可以简单地识别人白细胞介素15，且所述人白细胞介 素15是指氨基酸序列SEQ ID NO：3。
本文所用术语“白细胞介素15的衍生物”是指与选自SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少92.5％(即对应于 约10个氨基酸置换)、优选地至少96％(即对应于约5个氨基酸置换)、 更优选地至少98.5％(即对应于约2个氨基酸置换)或至少99％(即对应 于约1个氨基酸置换)同一性百分数的氨基酸序列。本领域技术人员根据其自身的知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。作为这类 衍生物的一个实例，可以引用国际专利申请PCT WO 2009/135031中描述 的那些。还应当理解的是天然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通 常，这种化学修饰的氨基酸增加多肽的半衰期。
本文所用术语两个氨基酸序列之间的“同一性百分数”是指通过待进 行比较的两个序列的最佳比对获得的所述两个序列之间相同氨基酸的百 分数，这一百分数是纯粹统计学意义的且两个序列之间的差异被随机地分布于氨基酸序列中。本文所用“最佳比对”或“最优比对”是指所确定的 同一性百分数(参见下文)最高的比对。两个氨基酸序列之间的序列比较 通常是通过比较事先已经根据最佳比对来比对过的序列而实现的；这一比 较在片段比较中实现，以便识别和比较局部区域的相似性。除通过手动方 式之外，实施比较的最佳序列比对可以通过采用由SMITH和WATERMAN 开发的全局同源算法(Ad.App.Math.，vol.2，p：482，1981)、由NEEDLEMAN和WUNSCH开发的局部同源算法(J.Mol.Biol.，vol.48，p：443，1970)、由 PEARSON和LIPMAN开发的相似法(Proc.Natl.Acd.Sci.USA，vol.85， p：2444，1988)、使用这种算法的计算机软件(Wisconsin Genetics软件包中 的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI USA)、MUSCIE多重比对算 法(Edgar，Robert C.，Nucleic Acids Research，vol.32，p：1792，2004)来实现。 为了获得最佳的局部比对，可以优选使用具有BLOSUM 62矩阵的BLAST软件。两个氨基酸序列之间的同一性百分数是通过比较最佳比对的两个序 列确定的，所述氨基酸序列能够包含相对于参考序列的添加或缺失，以便 得到两个序列之间的最佳比对。通过以下方法来计算同一性百分数：确定 两个序列中相同位点的数量，用该数量除以比较的位点的总数，然后所得 结果乘以100，从而得到两个序列之间的同一性百分数。
优选地，所述白细胞介素15的衍生物是IL-15激动剂或超激动剂。本 领域技术人员能够简单地识别IL-15-激动剂或IL-15-超激动剂。作为IL-15- 激动剂或IL-15-超激动剂的一个实例，可以引用国际专利申请WO 2005/085282或ZHU等(J.Immunol.，vol.183(6)，p：3598-607，2009)中公开的 那些。
进一步优选地，所述IL-15激动剂或超激动剂选自包含以下或由以下 组成的组：L45D、L45E、S51D、L52D、N72D、N72E、N72A、N72S、 N72Y和N72P(参考人IL-15的序列，SEQ IDNO：3)。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi结构域”具有其在本领域的一般含义， 是指起始于IL-15Rα的信号肽之后的第一个半胱氨酸残基(C1)，并终止于 所述信号肽之后的第四个半胱氨酸残基(C4)的结构域。对应于IL-15Rα的 胞外区域的一部分的所述sushi结构域是其结合至IL-15所必需的(WEI 等，J.Immunol.，vol.167(1)，p：277-282，2001)。
所述IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物具有人IL-15Rα的sushi结构 域对人白细胞介素-15的结合活性的至少10％，优选至少25％，更优选至 少50％。所述结合活性可以通过WEI等公开的方法(上述提及，2001) 简单地确定。
所述IL-15Rα的sushi结构域为哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域，优 选地为灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域，更优选地为人IL-15Rα的sushi 结构域。
本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域。作 为一个实例，可以引用源自褐家鼠(登录号：XP_002728555)、小家鼠(登 录号：EDL08026)、牛(登录号：XP_002692113)、家兔(登录号： XP_002723298)、食蟹猴(登录号：ACI42785)、豚尾猴(Macaca nemestrina) (登录号：ACI42783)、智人(登录号：CAI41801)、恒河猴(MacacaMulatta) (登录号：NP_001166315)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii)(登录号： XP_002820541)、白颈白眉猴(Cercocebus torquatus)(登录号：ACI42784)、 普通狨(Callithrix jacchus)(登录号：XP_002750073)或豚鼠(Cavia porcellus) (登录号：NP_001166314)的IL-15Rα的sushi结构域。
本文所用术语“哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域”是指共有序列SEQ ID NO：4。
优选地，包含哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多肽 是指共有序列SEQ ID NO：5。
本领域技术人员可简单地识别灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域。 作为一个实例，可以引用来自家兔、食蟹猴、豚尾猴、智人、恒河猴、苏 门答腊猩猩、白颈白眉猴或普通狨的IL-15Rα的sushi结构域。
本文所用术语“灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域”指共有序列SEQ ID NO：6。
优选地，包含灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多 肽是指共有序列SEQ ID NO：7。
本领域技术人员可简单地识别人IL-15Rα的sushi结构域，并且所述 人IL-15Rα的sushi结构域是指氨基酸序列SEQ ID NO：8。
优选地，包含人IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多肽是指SEQ ID NO：9。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi结构域的衍生物”是指与选自SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和 SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少92％(即对应于约5个氨基酸置换)、 优选地至少96％(即对应于约2个氨基酸置换)、更优选地至少98％(即 对应于约1个氨基酸置换)同一性百分数的氨基酸序列。这类衍生物包含L-15Rα的sushi结构域的四个半胱氨酸残基，且本领域技术人员根据其自 身的一般知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。还应当理 解的是天然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰 的氨基酸能够增加多肽的半衰期。
根据优选的实施方案，所述缀合物包含(ii)包含IL-15Rα的sushi和铰 链结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽。
所述IL-15Rα铰链结构域定义为开始于sushi结构域后的第一个氨基 酸残基并终止于第一个糖基化潜在位点前的最后一个氨基酸残基的氨基 酸序列。在人IL-15Rα中，所述铰链区的氨基酸序列由十四个氨基酸组成， 所述十四个氨基酸位于该IL-15Rα的sushi结构域之后，位于相对于所述 sushi结构域的C末端位置，即所述IL-15Rα铰链区开始于所述(C4)半 胱氨酸残基后的第一个氨基酸且终止于第十四个氨基酸(以标准的“从 N-末端到C-末端”方向计数)。
所述IL-15Rα的sushi和铰链结构域为哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰 链结构域，优选地为灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域，更优选 地为人IL-15Rα的sushi和铰链结构域。
本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰链结构 域的氨基酸序列。本文所用术语“哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰链结构 域”是指共有序列SEQ ID NO：10。
本领域技术人员可简单地识别灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链结 构域的氨基酸序列。本文所用术语“灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链 结构域”是指共有序列SEQ IDNO：11。
本领域技术人员可简单地识别人IL-15Rα的sushi和铰链结构域的氨 基酸序列。本文所用术语“人IL-15Rα的sushi和铰链结构域”是指共有 序列SEQ ID NO：12。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi和铰链结构域的衍生物”是指与选自 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少93％(即对应于约5个氨基酸置换)、优选地至少97％(即对应于约2个 氨基酸置换)、更优选地至少98％(即对应于约1个氨基酸置换)同一性 百分数的氨基酸序列。这类衍生物包含IL-15Rα的sushi结构域的四个半胱氨酸残基，且本领域技术人员根据其自身的一般知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。还应当理解的是天然的氨基酸可以被化学 修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸能够增加多肽的半衰期。
缀合物的多肽a)和多肽b)都可以是非共价连接的，例如在专利US 8，124,084B2中公开的复合物中。可通过提供合适量的多肽a)，提供合适 量的多肽b)，在合适的pH和离子条件下混合这两种多肽足以允许复合物 (即缀合物)形成的持续时间，并可选地浓缩或纯化所述复合物，简单地 获得所述缀合物或复合物。例如，根据标准方法采用肽合成仪；通过在细 胞或细胞提取物中分别表达每种多肽，然后分离和纯化所述多肽，可形成 所述复合物(即缀合物)的多肽。可选地，通过在相同细胞或细胞提取物 中表达多肽i)和多肽ii)，然后例如采用色谱技术，例如具有针对淋巴因子 部分、淋巴因子受体部分或复合物的抗体的亲和色谱，分离和纯化该复合 物，可形成本发明的治疗性多肽复合物。
缀合物的多肽a)和多肽b)还可以是采用双功能蛋白质偶联剂或在融合 蛋白中共价连接的。
所述缀合物的多肽a)和多肽b)可以是糖基化的或非糖基化的。事实上， 发明人已经证实糖基化的RLI或非糖基化的RLI都具有相同的体外特异性 活性。不过，所述缀合物的多肽a)和多肽b)优选为糖基化的。
双功能蛋白质偶联剂是本领域技术人员所熟知的，如使用它们的方 法，并且所述双功能蛋白质偶联剂包括例如N-琥珀酰亚胺基(2-吡啶基二 硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸 酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如盐酸 二甲基己二酰亚胺)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酸亚胺)、醛(例如戊二 醛)、双-叠氮化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生 物(例如双-(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰 酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
术语“融合蛋白”指通过连接最初编码单独的蛋白质的两个或更多个 基因产生的蛋白质。其也被称为嵌合蛋白。这种融合基因的翻译产生具有 衍生自每种初始蛋白的功能特性的单一多肽。通过应用于生物学研究或治 疗的DNA重组技术人工产生重组融合蛋白。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程化产生的蛋白质。这通常涉及从编码第一个蛋白质的cDNA 序列中移除终止密码子，然后通过连接PCR或重叠延伸PCR在框架中附 加第二个蛋白质的cDNA序列。然后，由细胞将该DNA序列表达为单一 蛋白质。所述蛋白质可以工程化为包括两种初始蛋白质的全序列或任一个 初始蛋白质序列的仅一部分。
在一个优选的实施方案中，所述缀合物为融合蛋白。
白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列可以位于相对于IL-15Rα的 sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端或N-末端位置。优选地， 白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列位于相对于IL-15Rα的sushi结构 域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端位置。
白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列与IL-15Rα的sushi结构域或 其衍生物的氨基酸序列可被“连接子”氨基酸序列隔开。所述“连接子” 氨基酸序列可以具有足以确保融合蛋白形成合适的二级和三级结构的长 度。
在不显著影响融合蛋白生物活性的情况下，连接子氨基酸序列的长度 可以变化。通常，所述连接子氨基酸序列包含至少1个、但是少于30个 氨基酸，如5-30个氨基酸的连接子，优选10-30个氨基酸的连接子，更优 选15-30个氨基酸的连接子，进一步优选15-25个氨基酸的连接子，最优 选18-22个氨基酸的连接子。
优选的连接子氨基酸序列是那些允许所述缀合物采用合适构象(即允 许通过IL-15Rβ/γ信号传导通路的合适的信号传导活动的构象)的序列。
最合适的连接子氨基酸序列(1)将采用柔性延伸构象，(2)不会显示出 发展有序二级结构的倾向，所述有序二级结构可与融合蛋白的功能结构域 相互作用，和(3)将具有最小的疏水性或带电特性，所述疏水性或带电特 性可促进与功能蛋白结构域的相互作用。
优选地，所述连接子氨基酸序列包含选自包含Gly(G)、Asn(N)、Ser (S)、Thr(T)、Ala(A)、Leu(L)和Gln(Q)的组的近中性氨基酸，最优选地， 所述连接子氨基酸序列包含选自包含Gly(G)、Asn(N)和Ser(S)的组的近中性氨基酸。
连接子序列的实例描述于美国专利No.5,073,627和No.5,108,910中。
更特别地适用于本发明的示例性柔性连接子包括由SEQ ID NO：13(SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ)、SEQ ID NO：14(SGGSGGGGSGGGSGG GGSGG)或SEQ ID NO：15(SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)的序列编码的那些连接子。
进一步优选地，所述缀合物为具有序列SEQ ID NO：16或SEQ ID NO： 17的融合蛋白。
第二方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含最终与药学上 可接受的媒介物(carrier)结合的所述单体缀合物。
表述“药学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物：其是生理可 耐受的，并且当给药于人时通常不产生过敏反应或类似的不良反应，例如 反胃、头晕等。优选地，本文所用表述“药学上可接受的”指联邦或州政 府的管理机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的用于动物、更特别是 用于人类的药典中列出的。
术语“媒介物”指与化合物一起给药的溶剂、助剂、赋形剂或溶媒。 这样的药物媒介物可以为无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物 或合成来源的油，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
优选地，本发明的组合物(combination)的给药途径为肠胃外的；本文 所用术语“肠胃外的”包含静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹腔给药。 因此，药物组合物含有对于旨在被注射的剂型为药学上可接受的溶媒。特 别地，这些可以是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠， 氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情形加入无菌水或生理盐水时，允许构成 可注射的溶液。合适的药物媒介物描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。
在所有这些给药途径中，静脉内给药是最优选的。
所述缀合物可以溶解在缓冲液或水中，或者包含在乳液、微乳液、水 凝胶(例如基于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的水凝胶)、微球、纳米 球、微粒、纳米粒(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒(例如，聚乳酸(PLA)； 聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)；聚谷氨酸酯微球、纳米球、微粒或纳米 颗粒)、脂质体或其它盖仑制剂中。在所有情形中，制剂必须是注射可接受程度的无菌和流体的。制剂必须在制备和贮存条件下稳定，并且必须防 止例如细菌和真菌的微生物的污染作用而防腐。
分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在一般 的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
所述缀合物可以以中性或盐形式配制到组合物中。药学上可接受的盐 包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，所述酸加成盐是与例如盐酸 或磷酸的无机酸或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。 与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢 氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁，以及来源于有机碱，例如异丙胺、三甲 胺、组氨酸、普鲁卡因等。
所述媒介物还可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 和液体聚乙二醇等)、它们合适的混合物及植物油的溶剂或分散介质。本发 明的缀合物也可以被修饰，例如被聚乙二醇化，以提高其生物可分布性 (biodisponibility)。
例如，通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所 需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过多种抗细 菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞 等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例 如糖或氯化钠。
可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂， 例如单硬脂酸铝、明胶、多元醇、增长半衰期的共价和非共价制剂实现。
肽不稳定或降解的原因有许多，包括水解和变性。疏水性相互作用可 引起分子集合到一起(即聚集)。可以加入稳定剂从而减少或防止这类问 题。
稳定剂包括环糊精及其衍生物(参见美国专利No.5,730,969)。还可 加入合适的防腐剂如蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡聚糖和甘油以稳 定最终制剂。可将选自离子型和非离子型表面活性剂、D-葡萄糖、D-半乳 糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、及其混合物 的稳定剂添加至所述制剂中。碱金属盐或氯化镁的添加可以稳定肽。所述 肽还可通过使其与选自葡聚糖、硫酸软骨素、淀粉、糖原、糊精和海藻酸 盐的糖接触而被稳定。其它可添加的糖包括单糖、二糖、糖醇及它们的混 合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、木糖醇)。多元醇可稳定肽，且是可与水混溶的或水溶性的。合适 的多元醇可以是多羟基醇、单糖和二糖，包括甘露醇、甘油、乙二醇、丙二醇、三甲基二醇、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、 麦芽糖、蔗糖及它们的聚合物。各种赋形剂也可稳定肽，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性剂、金属、多元醇、还原剂、金 属螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮、水解明胶和硫酸铵。
第三方面，本发明涉及所述药物组合物在治疗受试者的癌症、感染和 /或免疫缺陷障碍中的用途。
本文所用术语“受试者”是指哺乳动物，比如啮齿类动物、猫科动物、 犬科动物或灵长类动物，最优选为人。
在本发明的上下文中，本文所用术语“治疗”指逆转、减缓、抑制应 用该术语的障碍或病症或这样的障碍或病症的一个或多个症状的发展，或 预防所述障碍或病症或这样的障碍或病症的一个或多个症状。
本文所用术语“治疗癌症”是指癌细胞的生长抑制。优选地，所述治 疗还导致肿瘤生长的消退，即，可测量肿瘤的尺寸的减小。最优选地，这 种治疗导致肿瘤的完全消退。
本文所用术语“治疗感染”是指微生物的复制/增殖的抑制。
本文所用术语“治疗免疫缺陷障碍”是指NK细胞和/或T细胞的诱导。
缀合物的“有效量”是足以诱导肿瘤生长或微生物复制的消退的量。用 于给药的剂量可作为多种参数的函数而采用，特别是作为使用的给药模 式、相关病理学或可选地期望的治疗持续时间的函数而采用。自然地，药 物组合物的形式、给药途径、剂量和治疗方案自然地取决于将被治疗的病 症、疾病的严重程度、受试者的年龄、体重和性别等。下文中提供的有效剂量的范围不旨在限制本发明和代表优选的剂量范围。然而，如本领域技 术人员理解和可确定，可为单独的受试者定制优选的剂量，而无需过多实 验。
在下文中，参照氨基酸序列、核酸序列和实施例更详细地描述本发明。 然而，本发明不旨在受实施例的细节的限制。相反，本发明涉及包括在本 文实施例中未明确提及的、但本领域技术人员无需过多努力即可发现的细 节的任何实施方案。
实施例
1)RLI生产概况分析
采用GENEART在pcDNA3.1质粒中克隆编码RLI1和RLI2的核苷酸 序列(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)。由POLYSCIENCE获得40kDa 的线性PEI。通过在加热下在水中溶解PEI，用NaOH中和，并通过0.22μm 过滤器过滤来灭菌，制备1mg/mL的储备溶液。将储备溶液等分并储存在 -20℃下。采用质粒纯化试剂盒，根据制造商的说明(MACHEREY-NAGEL)，并通过0.22μm过滤器过滤来灭菌，纯化用于转染的质粒DNA。
将常规维持的CHO-S(INVITROGEN)细胞以1×106细胞/mL的密度 接种在PowerCHO2培养基(LONZA)中，并且在具有5％CO2的振荡培养箱 (100rpm)中于37℃下培养过夜。为了转染，然后将细胞在CD-CHO培养基 (INVITROGEN)中稀释至2×106细胞/mL。以10％的培养体积，使用150mM 的NaCl制备转染复合物。将表达构建体DNA(2.5mg/L培养体积)与在 NaCl中稀释的PEI(10mg/L的最终培养体积)混合，并在室温下孵育10 分钟，之后加到培养物中。在振荡培养箱(130rpm)中于37℃下培养细胞5 小时，然后用PowerCHO2培养基使培养体积翻倍。转染后5天，收集上 清液。
在4℃下，将收集的上清液以3000rpm离心20分钟，用NaOH平衡 在pH为7.8，并通过0.22μm过滤器过滤，然后分析。采用SUPERDEX 200 5/150GL，根据制造商的说明分析RLI表达模式。该分析采用稀释的(0.15 mg/mL)和未稀释的样品。流速为0.2mL/min且流动缓冲液(running buffer) 为PBS。通过在215nm处的吸光度监测蛋白质洗脱。
不同的纯化的结果示于表I和图1。
表I
结果表明了色谱图上两个明显峰的存在。第一峰对应于尺寸大于 2000kDa的聚集体。第二峰对应于RLI单体。不过，所述第二峰有时含有 可代表RLI的二聚体的肩峰(箭头所示)。
因此，RLI产品中含有很少部分的聚集体.这一结论并不让人惊讶， 因为已知在培养上清液中IL15本身会在低浓度下聚集.不过，这种聚集 是有问题的，因为所获得的组合物不能用作药物组合物.
根据文献记载，聚集的原因可以是多种多样的。如自细胞培养过程至 最后的填充操作都可能发生这种聚集。这种聚集可能是由于培养基组分(由于宿主细胞蛋白、RLI浓度或溶解的氧)、纯化过程(由于纯化技术 (HIC、AEX、Affinity...))、洗脱条件(pH、离子强度、蛋白质浓度...)、 超滤/渗滤过程(剪应力、表面浓度)或配方(由于缓冲液(pH、离子强度、赋形剂....))引起的。由于这一多参数方程，在整个过程中聚集原因的识别是一项很有挑战性的工作，该项工作并不总是成功的。
2)通过分级分析
为了确定纯化组分的色谱行为并分析每一洗脱峰的含量，采用 SUPERDEX 75 10/300 GL，根据制造商的说明分析前述纯化的蛋白质样 品。该分析采用50μl样品。流速为1mL/min且流动缓冲液为PBS。通过 在215nm处的吸光度监测所述蛋白质洗脱。
SEC(尺寸排阻色谱)谱图示于图2，一些洗脱级分的蛋白质印迹分 析示于图3且该纯化结果汇总于表II。
表II
结果确证了对应于色谱柱的排阻限制的第一峰的存在(图2)。该峰包 含RLI蛋白的可溶性聚集体(＞110kDa)，所述聚集体包含糖基化的和非 糖基化的RLI蛋白(图3)。第二峰对应于RLI二聚体，第三峰对应于与 RLI单体对应的28.5kDa球状蛋白(图2)。毛细管电泳表明，该第三峰包 含糖基化和非糖基化的形式，但是具有轻微偏移(offset)洗脱(图3)。作为 对照，采用自毕赤酵母中纯化的蛋白质。与预期相同，糖基化的形式在非 糖基化的形式之前被洗脱。
最后，种类分布与前述分析一致，其中低聚体和/或聚集体占49％，单 体占51％。
已经注意到，贮存温度，即4℃或-80℃，不会影响RLI的低聚化状态。 此外，这些结果还表明，当贮存在4℃下时RLI是非常稳定的，并且在-80℃ 下经6个循环的冷冻/解冻后RLI仍然是非常稳定的。
采用SEC-MALLS(尺寸排阻色谱-多角度激光光散射联用仪)以更好 地表征RLI产品的聚集状态。这种方法能够确定包含在所述蛋白质样品中 的不同多聚体种类的尺寸分布。通过这种方法，首先采用SEC将不同种类 分离并稀释，然后用MALLS分析。
上述分析采用约35μg的蛋白质样品。根据制造商的说明，20℃下， SHODEX(kW402.5-4F)上SEC缓冲液(4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、 2.7mM KCl、137mM NaCl)的流速为0.35mL/min。将INFINITY 1260色 谱系统用作HPLC检测器，将DAW-HELEOS 8+(WYATTTECHNOLOGIES) 用作MALLS检测器并采用OPTILAB-rEX。
图4示出了RLI产品的SEC-MALLS谱图的实例(光散射)。
表III公开了在室温下进行三小时孵育后，两个RLI批次的不同蛋白峰 的分布。
表III
结果证实了在多数样品中存在对应于不同形式的RLI的六种蛋白质 峰，其中某些占较少的部分。不过，在室温下孵育3小时后，这些峰的分 布无显著改变。
这些结果确证了与单体形式相关的多聚体形式的存在。
3)第一纯化步骤
建立第一纯化步骤用于在毕赤酵母中生产RLI。在第一澄清步骤中， 用0.22μm膜(纤维素)过滤通过在CHO细胞中进行RLI生产获得的不 同的上清液。然后用pH7.5的TrisHCl渗滤这些上清液。然后将硫酸铵(AS ＝(NH4)2SO4)溶解于所述渗滤的上清液中，从而获得对应于结合缓冲液的 1.5M的AS终浓度为。然后用获得的结合缓冲液探索疏水相互作用色谱柱 (Phenyl Sepharose FF)。
然后根据制造商的说明进行洗脱。
与毕赤酵母生产相比，所述第一纯化步骤产量非常低且重现性差。
由于一次错误的实验，将阴离子交换色谱(AEX)用在了第一步骤.令 人惊奇的是，发明人观察到这种特定的色谱能够获得非常好的产量.通过 进一步的实验表明观察到了这种非常好的产量具有很好的重现性.
DEAE-Sepharose与Q-Sepharose之间的比较实验表明采用Q Sepharose 获得了最高的产量和用于Q-Sepharose或DEAE-Sepharose上探索的最优缓 冲液为20mM Tris HClpH 7.5；1M NaCl。然而，制造商的说明建议在使 用探索缓冲溶液时，其pH比待纯化蛋白的pI至少小一个单位，而结果无 法预期地表明在pH等于或大于7.5(Tris HCl缓冲液)(该pH比RLI蛋白 高近两个单位)时获得了最好的探索.不过，较低的pH导致了非常差的 探索，并且从而导致了RLI蛋白纯化的产量低且重现性差.
此外，似乎所述HO细胞的DNA结合至RLI且所述第一纯化步骤之 后获得的洗脱液被该DNA污染。
4)第二纯化步骤
为了获得一种无核苷酸且无内毒素的组合物，发明人启动了第二轮的 纯化。
采用疏水相互作用色谱柱(Phenyl Sepharose Butyl Sepharose，OctylSepharose)和20mM TrisHCl pH7.5-2M硫酸铵(AS＝(NH4)2SO4)获得了 最好的结果。
不过，对于第一步骤纯化的经验，这些经验能够以非常低的产量和重 现性获得RLI蛋白。
偶然地，发明人观察到在获得混合物(即样品与硫酸铵的混合物)后 越快地使其带电，产量及重现性越好.似乎所述蛋白质的盐稳定窗取决于 许多参数，包括影响纯化过程的温度.因此，发明人将硫酸铵(即以0.75 M)与第一洗脱液在疏水相互作用色谱柱上直接混合用于探索步骤.
在洗涤步骤和采用了缓冲溶液A2(20mM Tris HCl，pH 7.5)和缓冲溶液 B2(20mMTris HCl，2M硫酸铵，pH 7.5)之间的梯度的洗脱步骤之后，在 梯度的37.5％以非常好的产量和重现性获得了所述RLI蛋白。糖基化的形 式稍晚于非糖基化的形式而被洗脱，并与非糖基化的形式的洗脱窗部分重 叠。最后，在具有MWCO 5kDa的超滤盒上将所述样品浓缩至0.5至1mg/l， 并针对PBS缓冲液渗滤。
最后，通过本发明人的纯化过程获得的结果显示，获得的RLI蛋白纯 度大于98％，其中无可检测的内毒素、热休克蛋白或残留的DNA。此外， 对获得的组合物的分析表明超过90％的所述RLI蛋白处于满足其在药物组 合物中使用的单体形式。
5)获得的药物组合物的增殖活性
为了测定所述纯化蛋白的白细胞介素-15的增殖活性，通过[3H]胸苷掺 入测量Kit 225和32Dβ细胞对ICK对所述蛋白的增殖反应。
将细胞维持在培养基中3天，洗涤两次，然后使Kit 225和32Dβ在不 含细胞因子的培养基中分别挨饿24小时或4小时。然后，按104个细胞/ 孔以100μl接种在多孔培养板中，并在补充浓度渐增的若干RLI CHO样品 的培养基中培养48小时。人rIL-15和源自杆状病毒和源自毕赤酵母的RLI 用作对照。
将细胞用0.5μCi/孔的[3H]胸苷脉冲处理16h，收获至玻璃纤维过滤器 上，并测定细胞相关的放射性。
图5和图6显示了分别用浓度渐增的rIL-15、源自杆状病毒的RLI、 源自毕赤酵母的RLI和源自若干CHO生产的RLI纯化形式培养的Kit 225 和32Dβ细胞的[3H]胸苷掺入。
结果表明采用本发明的纯化方法纯化的RLI蛋白的生物活性具有与部 分纯化的RLI蛋白可媲美的活性。因此，本发明的纯化方法不会改变RLI 的生物活性。
6)获得的药物组合物在体内模型中在小鼠中的生物活性
在第0天和第1天，向自Harlan实验室获得的C57BL/6小鼠腹腔内(i.p) 注射100μL的PBS(作为阴性对照)、源自杆状病毒的RLI(2μg/小鼠)、源 自毕赤酵母的RLI(2μg/小鼠)和自CHO生产中纯化的RLI(2μg/小鼠)。 每组采用5只小鼠。
在第4天将小鼠通过颈椎脱臼法处死并取出脾脏。在100μm-细胞滤网 (strainer)上，用注射器的背面将脾脏分离成单细胞悬浮液。然后采用ACK溶 液(铵-氯-钾)将血细胞裂解。在完全培养基中洗涤脾细胞两次并采用Kova 载玻片进行活细胞计数。采用如下抗体：抗-CD3、CD4、CD8、NKp46和Fixable Aqua将两百万脾细胞染色从而筛选活细胞。然后，根 据制造商的说明使脾细胞透化(EBIOSCIENCE POXP3透化缓冲液)，并用抗-FoxP3和Ki67使其染色。采用同种型的Ki67来识别阳性细胞。在 FACSCANTO II流式细胞仪上迅速获得染色的细胞，并采用FLOWJO SOFTWARE(TREE STAR)进行分析。NK细胞为CD3阴性NKp46阳性细胞。
图7代表增殖的NK细胞、CD8+T细胞、Foxp3+CD4+T细胞和 Foxp3-CD4+T细胞的比例。
图7显示了每组NK细胞与NK细胞绝对数的比率。
图7还显示了与总的NK细胞和增殖的NK细胞的绝对数相比，增殖的NK细胞的百分数。
结果表明，与在杆状病毒中生产的RLI相比，在毕赤酵母中生产的RLI 具有差的体内活性。令人满意的是，在CHO中生产的RLI和通过本发明的 方法纯化的RLI对NK细胞显示出了非常好的体内活性。

Claims (10)

1.一种用于制备包含来自样品的单体缀合物的组合物的方法，所述缀合物包含：
a)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和
b)包含IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；
其中，所述缀合物的氨基酸序列由SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示，
其中，所述方法包括以下步骤：
a)使所述样品经受阴离子交换色谱(AEX)以产生第一洗脱液；其中，在等于或大于7.0的pH下进行所述阴离子交换色谱，然后
b)使所述第一洗脱液经受疏水相互作用色谱(HIC)以产生第二洗脱液，其中上样步骤在含有硫酸铵的缓冲溶液中进行，其中所述上样步骤通过在HIC之前直接将所述第一洗脱液与上样缓冲液混合实现和其中洗脱通过采用包含2至0M硫酸铵的缓冲溶液的梯度实现，
其中所述样品对应于表达所述缀合物的转化的宿主细胞的培养基样品，所述宿主细胞对应于选自包含CHO细胞、HEK293细胞、COS细胞、细胞、SP2O细胞、NSO细胞或源于它们的任何细胞的组的哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述洗脱通过采用包含1.5至0M硫酸铵的缓冲溶液的梯度实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在等于或大于7.5的pH下进行所述阴离子交换色谱。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子交换色谱(AEX)的步骤a)采用选自包含以下的组的AEX柱或树脂完成：Q Sepharose、DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、Sourse 15Q、Sourse 30Q、Resourse Q、Capto Q、Capto DEAE、Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、TSKgel SuperQ、TSKgel DEAE、Fractogel EMD TMAE、FractogelEMD DEAE、Fractogel EMD DMAE、Macroprep High Q、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROSPI、DEAE Ceramic HyperD、Q Ceramic HyperD、DEAE SepharoseFast Flow和ANX Sepharose 4Fast Flow。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述Q Sepharose选自包含以下的组：Q SepharoseFast Flow、Q Sepharose XL、大珠子Q Sepharose、高效Qsepharose、Q sepharose XL。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述Fractogel EMD TMAE为Fractogel EMD TMAEHiCap。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将获得的缀合物用于制备药剂的步骤。
9.一种能够通过权利要求1至8中任一项所述的方法获得的药物组合物，所述组合物包含至少80％的单体缀合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其用于治疗受试者的癌症、感染和/或免疫缺陷障碍。
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