MXPA06009496A - Proteina de fusion interleukina-15/fc purificada y preparacion de la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para purificar una proteina de fusion interleukina-5/Fc de una composicion, dicho proceso comprende a) aplicar la composicion a una columna de cromatografia de afinidad y eluir un primer eluado de IL-15/Fc desde la columna y b) aplicar el eluado del paso a) a una columna de cromatografia de intercambio de iones y eluir un segundo eluado de IL-15/Fc desde la columna; y a una proteina de fusion interleukina-15/Fc purificada y una composicion, en particular una composicion farmaceutica, que comprende una proteina de fusion como tal.

Description

PROTE.NA PE FUSIÓN INTERLEUKINA-15/Fc PURIFICADA Y PREPARACIÓN DE LA M IS MA La presente invención se refiere a un proceso para purificar una proteína de fusión interleukina- 15/Fc a partir de una composición, dicho proceso comprende a) aplicar la composición a una co 'mna de cromatografía de afinidad y eluir urf¡ primer eluado de I L-15/Fc a partir de la columna y b) aplicar el eluado del paso a) a una columna de cromatografía de intercambio de iones y eluir un segundo eluado de IL-15/Fc a partir de la columna; y a una proteína de fusión interleukina-15/Fc purificada y una composición, en particular una composición farmacéutica, que comprende dicha proteína de fusión. El trasplante de órganos o tejidos se ha convertido en el método estándar y, en numerosos casos, el único tratamiento salvador de vidas de muchas enfermedades muy graves. Sin embargo, con frecuencia surgen dificultades con respecto a rechazos por el organismo receptor, que son provocadas por una respuesta inmune a los antígenos de superficie celular extraños del trasplante. Una propuesta terapéutica de suprimir el rechazo es suprimir la respuesta inmune humoral o celular por medio de jnmunssupresores, en particular por anticuerpos o agonistas de rnterleukina-15 (IL-15) o interleukina-2 (I L-2) antagonistas. Se han descrito varias terapias que usan anticuerpos para moléculas de IL-15 o IL-2. Un ejemplo de un- antagonista d 1L-15 - efectivo es una proteína- de-fusión- que- consiste de~un fragmento de IL-15 mutado o no mutado de terminal N y un fragmento de Fc de terminal C (WO 97/41232; Kim y otros (1998rJ. Immunol. 160: 5742-574&). A fin de poder emplear ias proteínas de fusión exitosamente como farmacéuticos, se necesita poder producirlas con muy alta pureza a escala grande y almacenarlas en una manera estable. Por lo general, las proteínas que ns- ocurren- de manera- natural se producen por medio de procesos- de-ingeniería genética. Con este motivo, dichas proteínas - se producen en cultivos celulares, con líneas celulares de mamífero o bacterianas habiendo sido modificadas genéticamente para un plásmido recombinante- que contiene el gen del péptido de interés que se va a introducir en las líneas celulares, a fin de producir la proteína. Estas líneas celulares después se cultivan bajo condiciones adecuadas en presencia de medios de cultivo complejos que contienen, por ejemplo, azúcares, aminoácidos, factores de crecimiento, sales, suero de diferentes animales, etc. La proteína de interés posteriormente necesita separarse de los componentes del medio, los productos metabólicos de las células y otras contaminaciones, hasta lograr una pureza que sea suficiente para usarse como un agente terapéutico. El experto en la técnica conoce bien los procesos para purificar proteínas de cultivos celulares. Algunas proteínas son liberadas por las líneas celulares directamente en el medio circundante otras se retienen dentro de la célula. Las últimas requieren primero desbaratar la célula, lo que se hace posible por una multiplicidad de procesos tales como, por ejemplo, corte mecánico, choque-osmótico o tratamiento de enzima. En este caso, el homogeneizado incluye todos los contenidos celulares y se requieren procesos adicionales a fin de eliminar fragmentos subcelulares. Los últimos procesos incluyen, por ejemplo, centrifugación o filtración diferencial. Si se obtienen las proteínas directamente del sobrenadante, dichos pasos también pueden ser necesarios a fin de eliminar partes de células muertas o similares. Después, usuaimente se purifican proteínas más mediante una combinación de varias técnicas cromatográficas. Estas técnicas separan mezclas de proteínas dependiendo de su tamaño, carga, hidrofobicidad o afinidad para substratos particulares. Para cada una de estas técnicas, un número de materiales de columna están disponibles que se usan dependiendo de la proteína de interés. El objetivo de cualquier cromatografía es que la proteína de interés exhiba un comportamiento de migración en la columna, que es diferente de aquél de las contaminaciones, y de esta manera eluir a un tiempo diferente que el último. Un objeto de la presente invención es proveer una proteína d? fusión IL-15/Fc tan pura como sea posible en una forma que se pueda almacenar. El objeto se logró mediante un proceso para purificar I L-15/Fc de una composición, dicho proceso comprende los siguientes pasos: a) aplicar la composición a una columna de cromatografía de afinidad y eluir un primer eluado de IL-15/Fc desde la columna y - , - b) aplicar el eluado del paso á) a una columna dé cromatografía de intercambio de aniones y efuir un segundo eluado de IL/15-Fc desde la columna. La proteína de fusión IL-15/Fc, como se usa en la presente, es una proteína de fusión que comprende dos porciones de fusión, a saber un componente de IL-15 y un componente de Fc. Las proteínas recombinantes que comprenden una porción de fusión de una inmunoglobulina además de una proteína funcional se describen, por ejemplo, en Capón y otros (EUA 5,428, 130). Se da preferencia a una próteína dé fusión qué consiste de una parte de I L-15 mutada o no mutada de terminal N y una parte de Fc de terminal C. Dichas proteínas se describen, por ejemplo, en WO 97/41232 y Kim y otros (1998, J . Immunol. 160: 5742-5748). La parte de IL-15 de la proteína de fusión media la fijación selectiva al receptor de IL-15 (IL-15R) que se expresa en células T expresadas, por ejemplo. Por lo tanto, la parte de IL-15 puede ser una I L-15 que ocurre de manera natural y un mutante de la misma. En una modalidad preferida, el componente de IL-15 es IL-15 de tipo silvestre. En esta conexión, la IL^15 puede ser una 1L-15 de cualquier especie tal co o, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos, ganado, cabras, ovejas, caballos, cerdos, perros, gatos o monos, de preferencia, humanos. También se incluyen diferentes variantes de empalme y variantes que ocurren de manera natural. Se da preferencia particular aquí a ácidos nucleicos de mamíferos, en particular la forma humana o múriná dé los ácidos nucleicos.

Los mutantes de I L-15 incluyen componentes de I L-15 que, en comparación con la IL-15 que ocurre de manera natural, tienen una mutación tal como, por ejemplo, una o más supresiones, inserciones 0 sustituciones o combinaciones de los mismos. Sin embargo, el variante de IL-15 usado debe permitir que la proteína de fusión IL- 15/Fc se fije a IL-15R. Esto se podría verificar, por ejemplo, en un ensayo de fijación- de- radioligando usando IL-15 marcada y membranas o células que tienen receptores de IL-15 (Carson WE y otros, 1994, J Exp Med. , 180(4): 1395-1403). En una modalidad preferida, el mutante puede tener una acción como I L-15 (componente de IL-1 S con acción agonista) y cuya actividad, en comparación con IL-15, puede estar al mismo nivel, un nivel reducido o incluso un nivel aumentado. Un sistema de prueba que se puede usar para proteínas de fusión IL-15/Fc que tienen un componente de I L-15 con acción agonista es la estimulación de proliferación de célula CTLL-2 murina por dicho componente de IL-1 5. Un componente de IL-15 tiene acción agonista de conformidad con la presente invención, si el componente tiene por lo menos 10% , de preferencia por lo menos 25% de actividad, más preferible por lo menos 50%, todavía más preferible 100%, aún más preferible 150% y muy preferible por lo menos 200%. La actividad de un componente de 1 L-15 con acción agonista significa el porcentaje de estimulación de la respuesta por el componente de IL-15 en comparación con la estimulación por ÍL-15 de tipo silvestre (IL-15 de tipo silvestre & corresponde a 100% de actividad). Es posible usar en las pruebas ya sea el componente de IL-15 solo o la proteína de fusión. Para los componentes de IL-15 con acción agonista, se da preferencia a reemplazos de aminoácido conservadores, con un residuo siendo reemplazado con otro teniendo propiedades similares. Las sustituciones típicas son sustituciones dentro del grupo de aminoácidos alifáticos, dentro del grupo de aminoác:dos con cadena lateral de hidroxilo alifática, dentro del grupo de aminoácidos con radicales ácidos, dentro del grupo de aminoácidos con derivados de amida, dentro del grupo de aminoácidos con radicales básicos o entre los aminoácidos con radicales aromáticos. Las sustituciones conservadoras y semi-conservadores típicas son las siguientes: En otra modalidad de la presente invención, se hace uso de componentes de I L-15 con acción antagonista. Los componentes de este tipo inhiben la acción de IL-15 o fijación de IL-15 a I L-15R, siendo posible para que la inhibición sea completa o sólo parcial. Un sistema de prueba que se puede usar para proteínas de fusión I L- 15/Fc que tienen un componente de IL-15 con acción antagonista es el sistema de prueba descrito en WO 97/41232 (ensayo de proliferación de célula BAF-BO3). Un componente de IL-15 tiene acción antagonista de conformidad con la presente invención, si el componente inhibe por lo menos 10%, de preferencia por lo menos 25%, más preferible por lo menos 50% y muy preferible por lo menos 95% de la acción medida por IL-15 o fijada de IL-15 a IL-15R. Es posible emplear en las pruebas ya sea el componente de I L-15 solo o la proteína de fusión. Para los componentes de IL-15 con acción antagonista, se da preferencia a reemplazos de aminoácido no conservadores, con un residuo siendo reemplazado con otro teniendo propiedades diferentes. Se da preferencia a aquellos reemplazos que ocurren en regiones de la molécula que son responsables por la interacción con 1L-15R o para la transducción de señal. En una modalidad preferida, los componentes de I L-15 con acción antagonista usados son los mutantes de IL-15 descritos en WO 97/41232 o un componente de IL-15 que tiene una mutación en la posición de aminoácido 56 (aspartato; AAA21551 ). Se da más preferencia a mutantes en donde se han introducido mutaciones de punto en las posiciones de aminoácido 149 y/o 156 de interleukipa-15, reemplazando glutamina con aspartato en particufar (ver WO 97/41232). En una modalidad, también es posible combinar las mutaciones descritas. En una modalidad, la parte de IL-15 mutada de la proteína de fusión es por lo menos 65%, de preferencia por lo menos 70%, más preferible por lo menos 85%, todavía más preferible por lo menos 95% y muy preferible por lo menos 99%, idéntico a IL-15 de tipo silvestre, de preferencia a una IL-15 de tipo silvestre humana (por ejemplo, base de datos del National Center for Biotechnology Information, número de acceso AAA21551 ), o de lo contrario otros variantes que ocurren de manera natural (por ejemplo, los variantes con números de acceso CAA63914 y CAA71044 de la base de datos del National Center for Biotechnology Information). La segunda unidad funcional de la proteína de fusión IL-15/Fc es un componente de Fc. La parte de Fc significa el fragmento constante (c = constante) de inmunoglobulinas, que se puede preparar por escisión de papaína y cuya secuencia de aminoácido es altamente conservada. El fragmento de Fc es el fragmento de anticuerpo que usualmente no fija ningún antígeno. Una parte de Fc de conformidad con la presente invención significa de preferencia también un fragmento de inmunoglobulina como se definió antes que, además, también comprende los dominios constantes CH2 y CH3 aparte de la región de articulación. El componente de Fc se deriva de la parte de Fc de cualquier anticuerpo, por ejemplo de un IgA, IgD, IgG, IgE o IgM, de preferencia de un IgM o un lgGr más preferible de una parte de Fc de las subclases lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. En una modalidad particular de la invención, la parte de Fc de la proteína de fusión es un fragmento de Fc de una inmunoglobulina G (IgG), que carece de cadenas ligeras y cadenas pesadas de la región variable de IgG. Ejemplos de IgGs que se pueden usar son lgG1 , IgG2, lgG2a, lgG2b, lgG3 e lgG4. Se da preferencia a lgG1 humana o murina. Es posible usar para la presente invención toda la parte de Fc del anticuerpo- o sólo una parte de la misma. Sin embargo, dicha • fflf parte de la parte de Fc se debería diseñar de preferencia de tal manera que la proteína de fusión IL-15/Fc tiene una vida media de circulación más larga en la sangre que el componente de I L-15 sin componente de inmunoglobulina. Esto se puede probar al administrar a, por ejemplo inyectando en la corriente sanguínea de, uno o más animales experimentales la proteína de fusión y el componente de IL-15 y comparando las vidas medias de circulación en la. sangre. Una vida media más larga se indica por uh aumento en la vida media por al menos 10%, más preferible por lo menos 20%, todavía más preferible por lo menos 50% y muy preferible por lo menos 100%. La parte dé Fc también puede ser una parte de Fc que tiene por lo menos una mutación. El Fc mutado se puede mutar en la manera descrita antes para la parte de I L-15. En una modalidad, la parte de Fc mutada de la proteína de fusión es por lo- menos 65%, de pref rencia por lo menos 70%, más preferible por lo menos 85%¡ todavía más preferible 95% y muy preferible por lo menos 99% idéntica a la parte de Fc de una inmunoglobulína de tipo silvestre murina o humana, de preferencia a la lgG 1 -Fc humana o como variantes que ocurren de manera natural . En una modalidad preferida de la invención, la porción de Fc de la proteína de fusión está en la forma nativa o tiene reemplazos de aminoácido conservadores y contiene sitios de fijación de FcR y/o complemento intactos. La porción de Fc de la proteína de fusión puede mediar tanto la activación del sistema de complemento como la fijación a- células que' expresan receptor Fc y; así Fesulta en lá depleción de las células reconocidas por la porción de IL-15 de la proteína de fusión. La introducción de mutaciones, en particular de reemplazos de aminoácido no conservadores, en las posiciones de aminoácido que median la activación de complemento y la fijación de receptor Fc hace posible apagar estas funciones. Ejemplos de estas mutaciones son aquellos del sitio de fijación para el receptor Fc (FcR) o los sitios de fijación de complemento (en la posiciones de aminoácido 214, 356, 358 y/o 435 en la IgGT o Leu 235 humana nativa, Glu 318, Lys 320 y/o Lys 322 en la lgG2A murina nativa). El reemplazo de aminoácidos en estas posiciones usualmente resulta en una pérdida de la función lítica y de activación de complemento de ta porción de Fc (WO 97/41232). Todavía se da más preferencia a una modalidad en donde la cisteína de aminoácido en la posición 4 de (a región de articulación de la porción de Fc humana, más preferible de la: lgG1 humana (posición 167 de lgG1 humana), se ha reemplazado con alanina, por ejemplo a fin de prevenir enlace intermolecular y así agregación de la proteína de fusión IL-15/Fc expresada. En otra modalidad preferida, la parte de Fc es la parte de Fc de la inmunoglobulina humana lgG1 o de la lgG2A de inmunoglobulina murina, que, además de la región de articulación, comprende las regiones de cadena pesada CH2 y CH3. En la proteína de fusión IL-15/Fc, el componente de IL- 15 se fusiona al componente de inmunoglobulina de forma directa o vía un enlazador. El. enlazador consiste de preferencia de no más de 25 aminoácidosr, más preferible de no más de 15 aminoácidos, todavía más preferible de no más de 10 aminoácidos y muy preferible de 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos. - En una modalidad preferida de la invención, la proteína de fusión se codifica por los ácidos nucleicos de las posiciones 905 a 2014 de la SEC ID No. 1 , de las posiciones 1911 a 3020 de SEC I D No. 2 o SEC I D No. 3, la secuencia de señal (CD5) siendo codificada en cada caso por los primeros 74 nucleótidos. Sin embargo, también puede ser una pfoteína de SEC ÍD No. 4 o SEC I D No. 5. La proteína cuya secuencia es por lo menos aproxim dam nte 60%, de preferencia aproximadamente 75%, en particular de preferencia aproximadamente 90% y en particular aproximadamente 95%, idéntica a cualquiera de las secuencias antes mencionadas también es comprendida, con la proterna- é fusión IL-15/Fc correspondiente que se fija a IL-15R y que tiene una vida media aumentada en la sangre en comparació con la proteípá de fusión IL-15/Fc correspondiente sin componente de inmunoglobulina (para sistemas de prueba, ver arriba). La proteína de fusión se puede producir al introducir un ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión en una célula y posteriormente que expresa el ácido nucleico en la célula bajo condiciones adecuadas. La proteína de fusión producida de esta manera después puede ser recuperada ya sea del sobrenadante o de las mismas células por medio del proceso de conformidad con la invención. Está involucra- aplicar 7 la composición que contiene la proteína dé fusión IL-15/Fc a una columna de cromatografía de afinidad eluir un primer eluádo de IL-15/Fc. Cromatografía de afinidad significa una forma especial de cromatografía de adsorción en donde los grupos con afinidad alta para y por lo tanto esfuerzo alto de fijación a las sustancias que deben ser eliminadas están presentes en un soport de modo que dichas sustancias son capaces de ser adsorbidas de preferencia y así eliminadas de otras sustancias. - El soporte puede ser, por ejemplo, una fase sólida de una columna de purificación, una fase discontinua o partículas discretas. Un ejemplo posible de la fase sólida es una columna dé vidrio poroso o una columna de sílice. En una modalidad de la invención, la fase sólida se puede revestir con un reactivo (tal como, por ejemplo, glicerol) a fin de suprimir fijación no específica de contaminantes a la fase sólida. En una modalidad preferida, él material de soporte usado para cromatografía es Sepharose, en particular si se usan proteína A y/o proteína G como ligandos. La pareja de fijación que se va a aislar se puede recuperar mediante a) fijación de ligando pareja de fijación que se va a recuperar bajo condiciones adecuadas, b) quitar lavando sustancias no fijadoras, en donde sea apropiado, c) separar la pareja de fijación del ligando al generar condiciones que ya no permiten fijación de las dos moléculas, por ejemplo, cambiando el pH o fuerza iónica de la solución reguladora.

En una modalidad preferida, la cromatografía de afinidad es una cromatografía de proteína A que usa proteína A, en particular de preferencia proteína A recombinante, como ligando. Proteína A es una proteína de pared celular bacteriana de Staphylococcus aureus, que tiene una afinidad específica para la región de Fc de inmunoglobulinas de la clase G (IgG). Proteína A tiene un peso molecular de 42 kDa (proteína Á recombinante: aproximadamente 32 a 45 kDa) y alta estabilidad de pH dé pH 2 a 10. Proteína A sé inmoviliza a la fase sólida (material de soporte). La afinidad de fijación para la parte de Fc es una función del pH y, después de fijar en presencia de reguladores neutrales o ligeramente alcalinos, las inmunoglobulinas se pueden eluir con un gradiente de pH en disminución. Un ejemplo de un material de cromatografía de proteína A es Prosep-A (BioProducing Ltd. , Reino Unido) que consiste de proteína A unida a vidrio en una estructura porosa. Otras formulaciones de proteína A adecuadas son Sepharose proteína A, por ejemplo Sepharose Fast Flow Proteípa A (Pharmacia) y Toyopearl 650 Proteína A (TosoHass). Alternativamente, la cromatografía de afinidad también puede ser una cromatografía de proteína G en donde el ligando usado es proteína G. Proteína G es una proteína de superficie de Streptococci del grupo G y tiene un espectro de afinidad diferente de aquél de proteína A. La afinidad de los anticuerpos IgG para proteína A difiere de aqueílá para proteínáJ G, de modo que es posible para éT experto en lá técnica seleccionar una cromatografía de afinidad adecuada, dependiendo de la parte de Fc usada. Además, también es posible usar anti-suero de especies heterólogas, que se dirigen a la parte de Fc o de ló contrario la parte de I L- 15 de la proteína de fusión. Para llevar a cabo el paso a) del proceso de conformidad con la invención, la columna para purificación además se puede equilibrar, por ejemplo, con una solución reguladora adecuada. Un regulador es una solución regulada que estabiliza el pH debido a sus conjugados a base de ácido. El regulador usado para equilibrar la columna es de preferencia un regulador isotónico cuyo pH usualmente está en la escala dé aproximadamente 6-8. Un ejemplo posible de un regulador de equilibrio es 20 mmol/l Tris, 25 mmol/l NaCI, 25 mmol/l EDTA, pH 7.5. La composición que contiene la proteína de fusión IL-15/Fc en un regulador adecuado entonces se aplica en cargar regulador a la columna. En una modalidad, las composiciones de regulador dé equilibrio y cargar regulador son idénticas. La columna se lava posteriormente, en donde sea apropiado, con un regulador de lavado adecuado y, después, la proteína de fusión IL-15/Fc se eluye con un regulador de elución de elección. El paso opcional de lavado que se puede llevar a cabo entre cargar la columna (aplicar la composición) y eluir sirve para eliminar contaminantes que se fijan de manera no específica a la fase sólida. El objetivo es eluir tan poca proteína de fusión- como sea posible a partir de la fase sólida. El paso de lavado usualmente se puede llevar a cabo con una solución isotónica tal como, por ejemplo, 20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCI pH 7.4, o de lo contrario al reducir el pH a un valor menor al que la proteína de fusión todavía se fija, sin embargo, por ejemplo, a pH 5.5. El reguiador de elución se usa a fin de eluir la proteína de fusión IL-15/Fc desde ia columna. El pH del regulador de elución es de preferencia bajo, así destruyendo la interacción entre el ligando, en particular proteína A, y la proteína de fusión. El pH del . regulador de elución está de preferencia en la escala de 2-5, más preferible en la escala de 3-4. Ejemplos de reguladores que controlan el pH en esta escala son reguladores de fosfato, acetato, citrato y amonio y mezclas de los mismos. Los reguladores preferidos son reguladores de citrato y acetato, con preferencia adicional siendo dada a reguladores de citrato de sodio o acetato de sodio, y más preferencia siendo dada a 0.1 mol/l citrato, pH 3.4. Sin embargo, también es posible usar reguladores de elución que tengan un pH alto (por ejemplo, pH 9 y más alto) u otros reguladores que interrumpan la interacción entre el ligando, en particular proteína A, y la proteína de fusión. El eluado del paso a), en donde sea apropiado, se diluye, aplica, en el paso b), a una columna de cromatografía de intercambio de iones o, de preferencia, una columna de cromatografía de intercambio de aniones y un segundo etuado de IL-15/Fc se eluyß desde la columna. " - En una modalidad preferida de la invención, et pH del eluado del paso a) aumenta al agregar una base o un regulador. Esto de preferencia se lleva a cabo inmediatamente después de la elución, a fin de prevenir posible inactivación de la proteína de fusión. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al agregar una décima parte del volumen de 1 mol/l Tris pH 8.0. En la cromatografía de intercambia de iones, se separan proteínas con base en su carga. Las proteínas consisten de varios aminoácidos cuyas cadenas laterales usualmente pueden llevar, además de radicales no cargados, también radicales ácidos y básicos y que así contribuyen a la carga total de la proteína. A pH bajo, debajo del punto isoeléctrico de la proteína, la carga total es positiva, debido a ia protonación de ias cadenas laterales cargadas, a pH superior es negativa, debido a las desprotonación. Ya que las proteínas llevan una multiplicidad de grupos cargados cuya carga real depende del pH y también del medio ambiente del aminoácido individual, la separación de conformidad con la carga es un método poderoso de separar proteínas. En una cromatografía de intercambio de iones, se elige el pH para así permitir a la proteína de elección fijarse a la matriz. En el caso de intercambiadores de aniones, este pH usualmente es por lo menos una unidad de pH arriba del punto isoeléctrico de la proteína (pH al cual la proteína tiene una carga neta de 0), en el caso de intercambiadores de cationes es debajo del punto isoeléctrico. La fijación a ta matriz ocurre vía interacciones electroestáticas. Las proteínas que no se fijan a la matriz se quitan lavando con regulador. La proteína fijada se eluye af agregar sales, con preferencia dada a usar NaCl. La presencia de, por ejemplo, iones de sodio y cloruro cargados detiene las interacciones electroestáticas de proteínas con la matriz, de modo que las proteínas se desprenden de la matriz. Los intercambiadores de aniones o intercambiadores de iones básicos son intercambiadores de iones en donde el grupo catiónico se fija de forma covalente a una matriz insoluble sólida, mientras que el anión neutralizante se fija sólo de forma iónica y por lo tanto se puede reemplazar con otros aniones. La cromatografía por medio de intercambiador de aniones usualmente se usa para purificar moléculas cargadas negativamente. Ejemplos de intercambiadores de aniones son aminoetilo, dietil-aminoetilo, aminoetilo cuaternario y grupos de amonio cuaternarios, acoplados a una resina de gel de poliacrilamida o a una resina de polímero de hidrocarburo tal como, por ejemplo, celulosa o dextrap. . - , - • La cromatografía de intercambio de cationes también funciona de acuerdo a un principio análogo. Aquí, las moléculas cargadas positivamente que se van a purificar se fijan a una matriz de soporte que contiene grupos cargados negativamente (por ejemplo, grupos carboxi-metilo o de ácido sulfónico). Los contraiones usados normalmente son iones de sodio o potasio que se reemplazan con ias moléculas de muestra cargadas positivamente. Ejemplos de intercambiadores de iones son grupos carboximetilo, sulfoetiio, sulfopropilo, fosfato o sulfonato, acoplados a una resina de gel de poliacrilamida o a una resina de polímero, de hidrocarburo tal como, por ejemplo, celulosa o dextran. La configuración de columna puede ser, por ejemplo, la usual con flujo vertical u otros con flujo radial. Antes de aplicar el eluado del paso a), la resina usualmente se equilibra, adecuadamente con un regulador que tiene un pH en la escala de 5-10, de preferencia 6-9, más preferible. 7-8.. Una multiplicidad de reguladores es capaz de mantener el pH en esta escala. Cada uno de estos reguladores es adecuado para usarse, pero en la actualidad se prefier un regulador Tris, más preferible un regulador con 20 mmol/l Tris, pH 8.0. ~ Después del equilibrado, el eluado del paso a) se aplica a la resina de intercambio de iones, de. preferencia la resina de intercambio de aniones. Después la columna, en donde sea apropiado, se lava y posteriormente la proteína de fusión I L-15/Fc se eluye al aumentar la resistencia iónica y/o cambiar el pH. El paso de lavado opcional normalmente usa el mismo regulador como aquél de la fase de equilibrado. Sin embargo, también es posible usar un regulador de- lavado teniendo una molaridad diferente, por ejemplo una superior, tal como, por ejemplo, 20 mmol/l Tris, 200 mmol/NaCI pH 8.0. La concentración reguladora para separación cromatográfica es usualmente, por ejemplo, por lo menos 10 mmol/l a fin de asegurar suficiente capacidad reguladora. La resistencia iónica del regulador usualmente se mantiene baja (<5 mS/cm) para así no afectar la^ fijación de las proteínas a la . matriz. Sin embargo, la resistencia - iónica no debe ser tan baja que la pr?teína se desnaturalice b precipite. El ion regulador debe tener la misma carga como la matriz, ya que una carga opuesta afecta el proceso de separación y resulta en perturbaciones de pH locales. La elución se puede llevar a cabo usando un gradiente lineal, un aumento paso a paso en la concentración del electrolito o llevarse a cabo de forma ¡socrática. U suaimente, las molaridades finales de hasta 0.5 mol/1; de preferencia hasta 0.4 mol/1, más preferible hasta 0.35 mol/1, se obtienen, el electrolito usado, por ejemplo, siendo cloruro de sodio o de lo contrario otro electrolito que tiene la misma acción. El eluado del paso a), que tiene una concentración" de regulador preferida de 10-200 mmol/l, se aplica a la columna equilibrada. El pH del eluado se ajusta a 5-9, de preferencia a 7.5-8.5. El pH se puede adaptar por medio de agentes adecuados, por ejemplo al agregar NaOH u otra base adecuada. Después, la columna se puede lavar con regulador, de preferencia el regulador de equilibrado o regulador de lavado. La' concentración de regulador es entre preferiblemente 10 y 300 mmol/l. El pH está de preferencia en la escala entre 7.0 y 9.0, más preferible entre 7.75 y 8.25. En una modalidad preferida de cromatografía de intercambio de aniones, la columna empleada es de preferencia una columna de DEA-Sepharose o una columna de Q-Sepharose, más preferible una columna de Q-Sepharose. En una modalidad preferida, la cromatografía de intercambio de aniones se lleva a cabo por medio de equipo de FPLC (Cromatografía Líquida de Proteína Rápida) o purificadores Akta (por ejemplo, Akta Pilot o BioPilot, Amersham, Reino Unido). En el caso de equipo de FPLC, la columna de intercambio de iones primero se equilibra en el regulador de partida y la mezcla de proteína que se va a separar, que está en el bucle de muestra, entonces se aplica a la columna. Las proteínas que no se fijan a la columna, se eluyen de inmediato. La resistencia iónica en el regulador aumenta lentamente al mezclar regulador de modo que las proteínas eluyep una por una desde la columna y son recogidas en un colector de fracción. En una modalidad preferida de la invención, el procesa de purificación de conformidad con la invención además comprende el paso c): c) aplicar ei eluado del paso b) a una columna de filtración de gel o a una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica y eluir un tercer eluado de IL- 15/Fc desde la columna. El eluado del paso b) aquí se purifica por medio de cromatografía de filtración de gel o interacción hidrofóbica. La filtración de gel es particularmente adecuada para separar proteínas por medio de cromatografía cuya fase estacionaria consiste de perlas de gel hinchadas y que se separa según el tamaño de partícula: las partículas grandes emigran con el líquido pasando las perlas de gel, las pequeñas son retenidas en ios poros y son lo último en aparecer en el eluado. La elución usualmente se lleva a cabo de forma isocráticaf es decir,» con sólo- un regulador sin gradiente. La composición del regulador usualmente tiene ninguna influencia en la separación y depende de los requisitos de la proteína. Los polímeros esféricos cuya porosidad depende del grado de su entrelazamiento se pueden usar como matriz de gel. Ejemplos de los mismos son Sephadex, Sepharose, Biogel A, Sephacryl y Biogel P. Proteínas más pequeñas de un tamaño adecuado se pueden difundir en los poros de estas matrices. Esto reduce su velocidad de flujo a través del gel. Si las proteínas son muy grandes, eluyen pasando los poros y con una velocidad de flujo superior a través del gei. Las proteínas de peso molecular alto así eluyen antes de ias proteínas de peso molecular bajo. Las mezclas de sustancia se separan de conformidad con diferentes radíos de Stokes que, en el caso de proteínas globulares, son usualmente proporcionales al peso molecular, de la molécula. A fin de obtener suficiente separación, el volumen aplicado es de preferencia de no más de 5%, más preferible no más de 1 %, del volumen de columna. La concentración preferiblemente puede ser hasta 50 mg/ml, más preferible 25 mg/ml y todavía más preferible 10 mg/ml. La fase estacionaria de la columna de cromatografía de filtración de gel comprende un material de columna que de preferencia se divide en la escala entre 5000-600 000 kDa. Se da preferencia a usar Superdex 200, Superdex 75, Superóse 6, Superóse 12, Sephadex G 75, Sephacryl S-200 HR, Sephacryl S-300 H R o Sephacryl S-400 HR, más preferible Superdex 200, como material de columna. * - ~ '- La columna usualmente se equilibra, antes. de aplicar el eluado del paso b), con regulador de equilibrado, por ejemplo 50 mmol/l fosfato de sodio, pH 7.0, 150 mmol/l cloruro de sodio. El eluado del paso b) después se aplica a la columna. Ya que las concentraciones de sal muy bajas pueden afectar adversamente las propiedades de separación cromatográficas de la columna, la resistencia iónica debe ser > 20 mS/cm. Como una alternativa a filtración de gel, también es posible llevar a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Las interacciones hidrofóbicas son de gran importancia bioquímica. Están sustancialmente involucradas en estabilizar estructuras terciarias tridimensionales de proteínas. Interacción hidrofóbica significa el fenómeno de 2 moléculas hidrofóbicas agregando espontáneamente en un ambiente polar (por ejemplo, agua). Disolver una sal y aumentar la resistencia iónica del medio también aumenta la interacción hidrofóbica de dos moléculas no polares. Las proteínas tienen proporciones más o menos altas de estructuras superficiales hidrofóbicas. Por lo tanto, son capaces de adherir a adsorbentes hidrofóbicos a una resistencia iónica apropiadamente alta. La resistencia de la interacción se puede controlar por el contenido de sal y, además, por la elección de adsorbente. Ejemplos de grupos funcionales usados son radicales de etilo, butilo, propiio, octilo o de lo contrario feniio. La adsorción se lleva a cabo en presencia de altas concentraciones de sal; de manera correspondiente, la elución se lleva a cabo usando un gradiente reductor de sal. La sal usada es normalmente sulfato de amonio. En una modalidad particular de la invención, la composición s el eluado se filtra y/o concentra antes o después de por lo menos uno de los pasos a) a c). A fin de concentrar proteínas en solución, se pueden usar varios procesos. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de ultrafiltración. Aquí, una solución de protema' se presiona bajo presión a través de una membrana a través de la cual sólo pueden pasar moléculas pequeñas (sales, solventes) con moléculas más grandes tales como, por ejemplo, proteínas siendo retenidas. Esto reduce el volumen de la solución, así aumentando la concentración de proteína. Es posible usar para filtración un sistema de filtración de flujo tangencial, por ejemplo. Las membranas adecuadas para esto son las membranas que retienen la proteína. La filtración se puede llevar a cabo por medio de una filtración de presión en donde la alimentación se presiona verticalmente contra la membrana. Como una alternativa a esto, se puede usar un proceso de filtración de flujo cruzado en donde la alimentación se dirige de forma tangencial a lo largo de la membrana. El filtrado pasa a través de la membrana de forma perpendicular a la dirección de flujo. El desespumado tangencial continuo de la membrana logra un efecto de purificación que reduce la formación de una capa de cubierta. Para mejora adicional, también es posible acomodar una capa de tela entre dos membranas paralelas, lo que resulta en turbulencias. - Además de la concentración o alternativamente a la misma, la composición 6 el eiuado se pueden -filtrar. Los materiales de filtro que se pueden usar son nitrato de celulosa, acetato de celulosa, PVC, Teflón o membranas de cerámica, por ejemplo, hechos de óxido de zirconio. Los filtros pueden ser membranas individuales o ensamblados en sistemas de membrana, tales como, por ejemplo, módulos. Los módulos pueden ser módulos tubulares, módulos espirales o módulos enrollados o módulos de fibra huecos. En una modalidad preferida de la invención, la composición se aclara por filtración antes del paso a) del proceso para purificación.

Los filtros usados para la filtración clarificante tienen un tamaño-; de poro de hasta aproximadamente 5 µm, de preferencia 4 µm, más preferible 3 µm y muy preferible 1 µm. El tamaño de poro del filtro usado para ultrafiltración es preferiblemente no más de 100 000 NMGT, más preferible no más de 75 000 NMGT, todavía más preferible no más de 50 000 NMGT y muy preferible no más de 30 000 NMGT. * El tamaño de poro de los filtros usados para filtración estéril es de preferencia no más de 0.8 µm, más preferible no más de 0.6 µm, todavía más preferible no más de 0.4 µm y muy preferible no más de 0.22 µm. . - _ En una modalidad preferida de la invención, el pH del eluado del paso a) se hace ácido antes del paso b). Un pH ácido es un pH debajo de 7.0, de preferencia debajo de 5.5, más preferible debajo de 4.0 y muy preferible debajo de 3.5. Los valores de pH debajo de 3.5 son adecuados para inactivación de virus. Después . de la inactivación de virus, el pH se eleva una vez más al agregar una base, por ejemplo, una décima parte del volumen de 1 mol/l Tris pH 8.0. Además de reducir el pH, la composición o cualquiera de los eluados se puede filtrar usando un filtro adecuado, a fin de eliminar virus. Los filtros adecuados son conocidos al experto en la técnica. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la columna de cromatografía de afinidad usada en el proceso para purificación es una columna de cromatografía de proteína A, la columna de cromatografía de intercambio de aniones usada en el proceso para purificación es una columna de Q-Sepharose y ia columna de filtración de gel usada en el proceso para purificación es una columna de Superdex-200. Se da más preferencia particular a un proceso para purificación usando los pasos a) a c) antes descritos, en donde sea apropiado, incorporando las modalidades descritas, con la proteína de fusión IL-15/Fc, después de purificación, teniendo una pureza de por lo menos 90%, de preferencia una pureza de por lo menos 95%, muy preferible teniendo una pureza de por lo menos 99%. La pureza se puede revisar, por ejemplo, por HPLC-SEC, como se describe en los ejemplos. La presente invención además se refiere a una proteína de fusión IL- 15/Fc purificada que tiene una pureza de por lo menos 90%, de preferencia una pureza de por lo menos 95%, muy preferible una pureza de por lo menos 99%f siendo posible para la pureza a ser revisada, por ejemplo, por HPLC-SEC, como-, se describe en los ejemplos. En otra modalidad preferida, la sialilación promedio por N-glican, es decir, la proporción de N-glicanos ocupada por ácido siálico, en la proteína de fusión IL-15/Fc purificada es por lo menos 70%, más preferible por lo menos 80%, todavía más preferible por lo menos 90% y muy preferible por lo menos 95%. : * Todavía en otra modalidad preferida, la sialilación por antena, es decir, la proporción de antenas ocupada por ácido, siálico, en la proteína de fusión IL-15/Fc purificada es por lo menos 50%, más preferible por lo menos 70%, todavía más preferible por lo menos 80% y muy preferible por lo menos 90%, el número de antenas correspondiendo al número de ramificaciones en N-glican. Asimismo, la sialilación promedio se puede determinar por medio de HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio de aniones de alto rendimiento y detección amperométrica pulsada), con el número de antenas siendo determinado por medio de H PLC. El ácido siálico es el nombre del grupo para derivados de ácido N- y O-acilados neuramínicos- Debido a su posición expuesta como grupo terminal de una multiplicidad de cadenas de oligosacárido de glicoconjugados, los ácidos siálicos hacen una considerable contribución a las propiedades biológicas de ios últimos. Ya que la escisión enzimática de ácido siálico en glicoproteínas resulta en un acortamiento considerable de su vida media de plasma, es ventajoso para la síaHIaci?n ser tan alta como sea posible; Esto: permite a IL^I d/Fc administrarse en dosis menores y/o a intervalos más largos. El proceso de purificación de conformidad con la invención provee un proceso gentil que se puede usar para preparar una proteína de fusión I L-1 5/Fc que tiene una siaiilación promedio de los valores indicados antes. Acido N-acetilneurámico es el ácido siálico que ocurre con mayor frecuencia y un componente importante de glicoproteínas. Como los otros ácidos siálicos, protege. contra la inactivación, y esto es la razón por una proporción alta de ácido N-acetilneuram ínico siendo ventajosa. . „ _ _ _ En otra modalidad de la invención, la porción de ácido N-glicolilneuramínico de la suma de ácidos N-acetilneuramínicos, ácidos N-gl icolilneuram ínicos y asialo-N-glicanos en la proteína de fusión 1 L-1 5/Fc purificada es no más de 20%, de preferencia no más de 1 5%, más preferible no más de 10%. El ácido N-glicolilneuramínico es un ácido neuramínico que usualmente no está presente en humanos, lo que sugiere que puede tener acción antigénica. Por lo tanto, su proporción debe ser tan baja como sea posible. La cantidad de ácidos N-glicolilneuramípicos como parte de la suma de ácidos N-acetilneuramínicos, ácidos N-glicoli lneuram ínicos y asialo-N-glicanos se pueden determinar, por ejemplo, por medio de H PAEC-PA D (cromatografía de intercambio de aniones de alto rendimiento y detección amperométrica pulsada) al determ inar el área de porcentaje de ácidos N-glicosilneuramínicos del área total de ácidos: N-acetilneurámínicos, ácidos N-glicolilneuramínicos y asialo- N-glicanos: " En principio, se describe un número grande de varias funciones biológicas de glicosilación de proteína. De esta manera, es posible para los oligosacáridos ejercer una función' protectora o enmascaramiento al prevenir reconocimiento de la - proteína por proteasas, microorganismos y anticuerpos. En' muchos casos, la glicosilación juega una parte estructural y estabilizadora al asistir el doblamiento correcto de polipéptidos en el retículo endoplásmico severo y mantener la conformación de una proteína. Además, la glicosilación de una. proteína puede, modular la interacción con ligandos o receptores y jugar una parte en ef reconocimiento de célula-célula y célula-matriz. Por lo tanto, se desea proveer una proteína de fusión IL-15/Fc que tenga tantas glicosilaciones que ocurren de manera natural o producidas por célula como sean posibles. El número de sitios de glicosilación, el número de moléculas - de azúcar y/o el número de antenas, puede servir como una medida de esto. La presente invención además se refiere a una composición que comprende una proteína IL-15/Fc purificada y también excipientes y aditivos. Excipientes y. aditivos adecuados que sirven, por ejemplo, para estabilizar proteínas, son bien conocidos al experto en la técnica (por ejemplo, Sucker l+. y otros (1991) Pharmazeutische Technologie, 2a e ición-,: '. Georg Thiemé - r Verlag, Stuttgart, Alemania). - Ellos incluyen, por ejemplo, salinas fisiológicas, dextrosa Ringer, lactato Ringer, agua desmineralizada, estabilizadores, antioxidantes, agentes de complejación, compuestos antimicrobianos, inhibidores de proteinasa y/o gases inertes. En una modalidad preferida, los excipientes y aditivos son manitol, sacarosa y/o glicina. En una modalidad preferida, la composición tiene un pH de 7.4 a 8.0, ya que las composiciones líquidas que contienen IL-15/Fc y que tienen este pH han probado ser particularmente estables. En otra modalidad preferida, la composición de conformidad con (a invención es una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica es una composición que está destinada " y adecuada para usarse como medicamento. Por lo tanto, comprende excipientes y aditivos que son farmacéuticamente adecuados. Ejemplos de estos son Aqua sterilisata (agua esterilizada), sustancias que influyen en el pH, tales como, por ejemplo, ácidos orgánicos e inorgánicos y bases y sales de los mismos, sustancias reguladoras para ajustar el pH , agentes isotónicos tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, glucosa y fructosa, agentes tensoactivos o sustancias de superficie activa y emulgentes, tales como, por ejemplo, esteres de ácido graso parciales de polioxietilensorbitan (Tween®) o, por ejemplo, esteres de ácido graso de polioxietileno (Cremophor®), aceites grasos tales como, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite de ricino, esteres de ácido graso sintéticos tales co o, por ejemplo, etii oteats, isopropil miristato y aceite neutral (Migiyol®), y también excipientes poliméricos - tales como, por ejemplo, gelatina, dextran, polivinilpirrstidona, aditivos que aumentan la solubilidad de solventes orgánicos tales como, por ejemplo, propilen glicol, etanol, N , N-dimetilacetamida, propílen glicol o agentes de complejación tales como, por ejemplo, citratos y urea, conservadores tales como, por ejemplo, hidroxipropilo y metil benzoato, alcohol bencílico, antioxidantes tales como, por ejemplo, sulfito de sodio, y estabilizadores tales como, por ejemplo, EDTA, PVP, esteres de celulosa como agentes granulados o reductores de liberación tales como, por ejemplo, sustancias de tipo , cera y/o poliméricas basadas en Eudragit®, celulosa o Cremophor®, antioxidantes, edulcorantes tales como, por ejemplo, sacarosa, xilitol o manitol, saborizantes, aromatizantes, conservadores, colorantes, sustancias reguladoras, agentes para pastilla directa tales como, por ejemplo, celulosa microcristaiina, almidón y hidrolisatos de almidón (por ejemplo, Celutab®), lactosa, polietilen glicoles, polivinilpirrolidonda y fosfato de dicalcio, lubricantes, complementos tales como, por ejemplo, lactosa o almidón, aglutinantes en la forma de lactosa, tipos de almidón tales como, por ejemplo, almidón de trigo o maíz o arroz, derivados de celulosa tales como, por ejemplo, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o tierra silícea, talco, estearatos tales como, por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de calcio, talco, talco siliconizado,- ácido esteárico, alcohol cetílico o grasas hidrogenadas. La invención será ilustrada a continuación por ejemplos y figuras que no deben ser limitantes.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra un mapa de la construcción de expresión pcADN3.1 hCD5.6Ala7. Las figuras 2 y 3 ilustran la secuencia de la construcción de expresión pcADN3.1 hCD5.6Ala7 (SEC ID No. 1 ). La figura 4 ilustra un mapa- de la construcción de expresión pMGI OAIaT. - ' ' Las figuras 5 y 6 ilustran la secuencia de la construcción de expresión pMG10Ala7 (SEC ID No. 2). - La figura 7A ilustra la secuencia de aminoácido de Ta IL-15/Fc mutada humana con líder CD5 (SEC I D No. 3). - La figura 7B ilustra la secuencia de aminoácido de la IL-15/Fc mutada humana con líder CD5 (SEC ID No. 4). La figura 7C ilustra la secuencia de aminoácido de la IL-15/Fc mutada humana con líder CD5 (SEC ID No. 5). La figura 8 ilustra el contenido de IL-15/Fc en los sobrenadantes de cultivo celular de células CHO-K1 después de transfección con el plásmido pcADN3.1 hCD5.6Ala7 que contenía la secuencia líder indicada en cada caso. La figura 9 ilustra el- contenido de IL-15/Fc en sobrenadantes de cultivo celular de células CHO-K1 después de transfección con varias construcciones de expresión. Cada barra representa el promedio + SEM de determinaciones en duplicado de en cada caso dos experimentos independientes. pcADN3.1 corresponde al Vector pcADN3.1 hCD5.6Ala7. pVS8-Ala7 corresponde al plásmido pSwitch (Valentis) con la construcción para construcción de IL-15/Fc. pMG-Ala7 corresponde al plásmido pMG (Invivogen) con la construcción para construcción de IL-15/Fc. pCINeo-Aia7 corresponde al plásmido pCI-Neo (Promega) con la construcción para construcción de I L-15/Fc.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : PRODUCCIÓN DE IL-15/Fc EN CÉLULAS CHO-Kl, Para producir una línea celular productora de CHO-K1 para I L- 15/Fc se debe formar y optimizar una construcción de expresión para I L-15/Fc con respecto a sus propiedades de secreción, a la identidad/integridad de los fragmentos que contiene y a genes de resistencia adecuados. a) Materiales de partida Una construcción de expresión IL-15/Fc humana (IL-15 mutada/Fc humana) se proveyó por el Departamento de Inmunología del "Centro Médico de la Diaconisa de Israel Beth" (Harvard Medical School, Boston, EUA). Se obtuvieron los oligonucleótidos de MWG-Biotech (Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los péptidos de señal relevantes se obtuvieron de genotecas. - . . - . - Las enzimas de restricción (Bglll, Xbal, BamHI, Smal, BstXI , Apal) , Lipfectamin2000, otros reactivos moleculares-bíológicos (T4- ADN ligasa, T4-polinucleótido kinasa) y los plásmidos pSecTagA, pcADN3.1 se obtuvieron de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania) o Amersham-Pharmacia (Nhel, Proteína A Sefarosa Uppsala, Suecia). Se obtuvieron células E. coli XL10-Gold competentes de Stratagene (La Jolla, EUA). Se adquirió ef equipo BCA (Pierce) de KMF Laborchemie (Sankt Augustin, Alemania). Los equipos de purificación "de plásmído-ADN (Endofree-Maxi Kit, Endofree-G?ga Kit) fueron de Qíagen (Hilden, Alemania). Se obtuvieron los anticuerpos de BD-Pharmingen (ratón anti-hlL-15; número de catálogo 554712; Heidelberg, Alemania) y Dianota (cabra-anti-ratón-POD; número de catálogo 15-036-003; cabra-anti-humano-POD; número de catálogo 109-036-088; Hamburg, Alemania). b) Métodos/Resultados Los plásmidos de partida contenidos dentro de la columna de vector pSecTagA, el cADN de una proteína de fusión que comprende una I L-15 humana mutada se fusionó a la parte de Fc (región de articulación y regiones CH2, CH3) de lgG1 humano. La estructura del plásmido corresponde a aquél descrito por Kin y otros (J. Immunol. , 160: 5742-5748; 1998), excepto que la parte de Fc citada en esta solicitud es un Ig?2a murino. El líder Igk que ya está presente en el vector pSecTagA se usó para secreción de la proteína de fusión por clonación dentro del marco de la parte de IL-15/Fc. Para, esto, la secuencia de señal intrínseca se eliminó de la secuencia de IL-15 nativa. Sin embargo, debido a la clonación, se introdujeron 10 aminoácidos adicionales entre el extremo 3' de la secuencia líder Igk y el extremo 5' de la secuencia codificadora I L-15, que se retuvieron en la proteína secretada después dé procesar la proteína. A fin de eliminar estos aminoácidos no específicos para mejorar Tas propiedades de secreción de la proteína, se probaron varias secuencias líderes de otras proteínas de secreción o superficie celular: Igk murino (Coloma y otros, J. Immun. Methods 152: 89-104; 1992; número de acceso X91670), CD5 humano (Jones y otros, Nature 323: 346-349; 1986; número de acceso X04391 ), CD4 (Hodge y otros, Hum. Immunol. 30; 99-104; 1991 ; número de acceso M35160), MCP-1 (Yoshimura y otros Je. FEBS Lett. 244: 487-493; 1989r número de acceso M24545) e IL-2 (Taniguchi y otros, Nature 302: 305-310; 1983; número de acceso K02056) (números de acceso se basan en el "Centro: Nacional para I nformación de Biotecnología"). Después de eliminar el líder Igk y los aminoácidos adicionales, se reemplazó el líder con ias secuencias de péptido de señal mencionadas al clonar oligonucleótidos bicentenaríos. Se revisó la identidad mediante secuenciación. Posteriormente, se probaron las construcciones resultantes por transfección transitoria de células HEK-293, usando Lipfectamin2000. El contenido de proteína de los sobrenadantes de cultivo celular de las células que han sido transfectadas con las varias construcciones se midió por medio del ensayo BCA, después de una purificación de proteína-A-safarosa de conformidad con el método por Molí y Vestweber (Methods in Molecular Biology, 96: 77-84, 1999). La identidad de la proteína se revisó por medio de cementación con plata del gel SDS y técnica de Western blot contra el Fc o la parte de IL-15, a fin de asegurar la presencia de ambos componentes de la proteína de fusión. Los mejores resultados se obtuvieron en los experimentos descritos cuando se usó el líder CD5. El último se seleccionó para optimización adicional del vector, con el líder ya no estando presente en la proteína de fusión secretada. Se probó más, ya sea reemplazando ei cADN de la parte de Fc con el ADN genómico que contiene estructuras de exón/intrón también contribuye a expresión de proteína mejorada. La presencia de intrones que han sido eliminados por el aparato de corte y empalme del núcleo puede mejorar la exportación de ARN desde el núcleo y también la estabilidad de ARN. Por lo tanto, la parte de Fc genómica se ligó a la secuencia de cADN IL-15 al insertar sitios donadores de corte y empalme y aceptadores de corte y empalme. Los plásmidos resultantes asimismo se modificaron por varias secuencias líderes y se probaron como se describió antes. Sin embargo, el análisis de proteína por Western blot, reveló que varios variantes de corte y empalme no deseados estuvieron presentes de modo que se decidió seguir usando la forma de cADN de la parte de Fc. Por consiguiente, el plásmido resultante comprende un líder CD5 humano y una parte de cADN-Fc.

La secuenciación de la construcción de expresión de I L-15/Fc mutada reveló que la parte de Fc contuvo 3 mutaciones que ya estaban presentes en la construcción original. Dos de estas mutaciones se relacionaron con aminoácidos en posiciones altamente conservadas. La tercera mutación fue una mutación Cys-Ala en la posición 4 en la región . de articulación, que se insertó deliberadamente a fin de detener la formación de puentes de cisteína intra- e intermolecular. A fin de eliminar las dos mutaciones no deseadas al retener la mutación Cys-Ala, el cADN Fc se subclonó por medio de RT-PCR. La fuente de ARN usada fue una línea celular CHO-K1 transfectada con una construcción que codifica para una proteína de fusión VCAM-1 -Fc. El fragmento de Fc-ADN amplificado se clonó en el plásmido CD5-mulL-15, y la parte de Fc se, eliminó mediante restricción de BamH I/Xbal. Se analizó el plásmido resultante una vez más en la base de patrones de restricción distintos y por medio de secuenciación posterior y con referencia a CD5-6Ala7. Ya que el uso de zeocina como agente intercalador de ADN podría causar mutaciones, el cásete de expresión para IL-15/Fc se eliminó de la columna de pSecTagA original y se clonó en pcADN3.1 que contiene el gen de resistencia a neomicina bajo el control del promotor SV40. Ambas cadenas del plásmido resultante se secuenciaron y revelaron correspondencia completa con el cásete de expresión de IL-15/Fc.

La construcción una vez más se probó para su expresión de proteína por medio de transfección transitoria de células CHO-K1 y análisis Western blot del sobrenadante de cultivo celular. Como un control positivo, una transfección con el plásmido CD5-6Ala7 se llevó a cabo en un experimento paralelo. A este extremo, se sembraron las células en triplicados a una densidad de células por pozo de 5 x 105 en placas de cultivo de tejido con 6 pozos. 2 µg de plásmido y 4 µl de Lipofectamin2000, cada uno de los cuales se diluyó en 250 µl de medio Optimem l , se usaron para transfección. Ambas soluciones se mezclaron y, después de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla se pipeteó en el medio de cultivo de las placas de cultivo de tejido. 2 días después de la transfección, el medio de cultivo se eliminó y analizó para su contenido de IL-15/Fc por medio de un Western blot contra la parte de IL-15 humana: 20 µl del sobrenadante de cultivo celular se agregó con 5 µl de regulador 5 x Laemmli y se incubó a 85°C durante 5 minutos. Las muestras después se llevaron a cabo en un gel de 12% de poliacrilamida. Entonces, el gel se transfirió usando una cámara de transferencia semi-seca. La transferencia se trató con solución de bloqueo que contiene 5% de leche en polvo en PBS, 0.1 % de Tween20 durante la noche. Después se incubó la transferencia con un anticuerpo monoclonal de ratón-anti-humano-I L-15 en una dilución de 1 : 1000 en solución de bloqueo durante 4 horas. Después de 3 pasos de lavado (10 minutos PBS, 0.1 % de Tween20), se incubó la transferencia con el anticuerpo secundario, cabra-anti-ratón peroxidasa (dilución 1 :5000), a temperatura ambiente durante otras 2 horas. La transferencia se lavó otra vez 3 veces y después la solución de Lumilight se aplicó en forma de gotas a la superficie de transferencia y se expuso una película de rayos X a la transferencia. Las señales de Western blot específicas dentro de la escala de señales obtenidas después de la transfección con CD5-6Ala7 revelaron que los sobrenadantes de cultivo celular de todas las tres transfecciones paralelas contuvieron IL-15/Fc como proteína. Por lo tanto, se mostró que el plásmido pcADN3.1 hCD5.6Ala7 (figuras 1 a 3) se puede usar para expresión de proteína en células CHO-K1 . c) Conclusiones Un plásmido de IL-15/Fc, pcADN3.1 hCD5.6Ala7, se preparó, que contuvo un cásete de expresión conteniendo un líder CD5 con una I L-15 humana mutada fusionada al cADN de lgG 1 -Fc humano bajo el control del promotor CMV. Para seleccionar clones celulares eucarióticos estables, se introdujo un gen de resistencia a neomicina. El plásmido se secuenció y reveló 100% de correspondencia en las regiones codificadoras relevantes, con sólo una ligera discrepancia (repetició de 3 pares base) sin ninguna relevancia en la columna de vector. La funcionalidad de la construcción fue revisada por transfección transitoria de células CHO-K1.

EJEMPLO 2 La transfección de líneas celulares eucarióticas (por ejemplo, células CHO-K1 ) con un plásmido que contiene el ADN para el producto deseado es un proceso estándar para- producir proteínas terapéuticas. No obstante, los niveles bajos de productividad de los clones celulares estables producidos de esta manera son un problema ampliamente conocido. Por lo tanto, hay varias estrategias para aumentar la productividad de una línea celular existente. Aparte del intento por aumentar el número de copias de plásmido en la célula (por ejemplo, vía el sistema de metotrexato/DH FR), además es posible modificar la construcción de expresión por sí misma. Además de un promotor fuerte (por ejemplo, el promotor CMV), introduci r un intrón posiblemente resulta en mejor estabilidad de ARN y mejor exportación de ARN desde el núcleo, dicha exportación se lleva a cabo por el aparato de corte y empalme de la célula. Sin embargo, se debe llevar a cabo una prueba en cuanto a cuál combinación de intrón/transgen es adecuada. Para este propósito, se combinaron varios intrones con la IL-15/Fc humana a fin de encontrar una combinación que aumente la producción de IL-15/Fc por las células CHO-K1. a) Materiales El plásmido usado como piásmido de partida fue el plásmido pcADN3.1 hCD5.6Ala7. Se ilustra esquemáticamente en la figura 1 . Su secuencia se describe como SEC ID No. 1. El sistema de prueba usado fue células CHO-K1 (DSM, Braunschweig, Alemania, número de acceso: ACC1 10) o células H EK-293 (Qbiogene, Grünberg, Alemania, AE80503, QBI-293A). También se usaron células E. coli (XL10-Gold, Stratagene, La Jolla, EUA). Las células se cultivaron bajo condiciones de cultivo estándar (5% de CO2, 37°C, atmósfera húmeda). Las células CHO-K1 pasaron dos veces una semana a una relación de 1 :20, con las células H EK-293 siendo pasadas a una relación de 1 :6. El medio usado fue DMEM-F 12+ 10% FKS+ 1 % PEN/Strep, para las células CHO-K1 , y DMEM+Glutamax+10% FKS+1 % PEN/Strep, para las células HEK-293. Se usó el medio Optirñeml para transfección. Todos los medios se obtuvieron de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania (números de catálogo 31331 -028; 32430-027; 51985-018). El plásmido usado fue pCI-Neo (Promega) conteniendo un promotor CMV y un intrón quimérico, un sitio donador de corte y empalme en 5' del gen beta-globina humano y un sitio aceptador de corte y empalme en 3' de la cadena pesada de IgG de la región variable. pMG (Invivogen) es un promotor CMV prolongado que contiene un intrón A de CMV. pSwitch (Valentis) es un intrón sintético, IVS8. Además, se usaron las siguientes enzimas y enzimas de restricción: Apal, EcoRV, Xbal, Nru l , Pací , Smal, Xhol, T4-ADN ligasa, T4-ADN polimerasa, fosfatasa alcalina de intestino de becerro. Estos y otros reactivos moleculajes-biológicos (Lipofectamin2000) se obtuvieron dßr Invitrogen. Nhel se obtuvo de Amersham-Pharmacia (Uppsala. Suecia) los equipos de purificación de plásmido se obtuvieron de Qiagen, Hilden, Alemania. El sistema "Expand High Fidelity PCR" (número de catálogo 1 732 641 ) se obtuvo de Roche, Mannheim, Alemania. b) Métodos i) El inserto IL-15/Fc del plásmido pcADN3.1 hCD5.6Ala7 se aisló por medio del compendia Nhel/Apal. El plásmido primero se linearizó por restricción de • - Apa!, y los extremos salientes en 5' se despuntaron por tratamiento con T4-polimerasa. El inserto IL-15/Fc después se aisló por digestión posterior con Nhel. El fragmento se ligó con pcl Neo que se había digerido con Nhel y Smal. ii) El promotor CMV de pcADN3.1 hCD5.6Ala7 se eliminó y reemplazó con el promotor CMV extendido con intrón A, que se derivó de pMG: el plásmido pMG se desprendió con Pací y los extremos salientes se despuntaron por _ medio de tratamiento con T4-polimerasa. Después de un segundo tratamiento con Xbal, el fragmento de 1.7 kb obtenido de esta manera, que contuvo el promotor CMV + intrón A, se purificó por electroforesis de gel de azarosa. El promotor CMV se eliminó, de pcADN3.1 hCD5.6Ala7 por medio de digestiones de restricción con Nhel y, posteriormente-. Nru l . El fragmento resultante se ligó con el promotor-intrón pMG durante la noche a 4°C. iii) El intrón IVS8 se amplificó por medio de PCR y se clonó entre el extremo 3' y el promotor CMV y el extremo 5' del inserto I L-1 5 en pcAD N3. 1 hCD5.6Ala7. El plásmido se linearizó por medio de digestión de restricción con N hel y posteriormente se trató con fosfatasa alcalina de intestino, de becerro. El intrón se amplificó por medio de PCR usando cebadores que contienen sitios de desprendimiento de restricción de Xbal , usando eF sistema Expand High Fidélity PCR bajo las siguientes- condiciones: la mezcla de reacción usada consistió de 2 µl de d NTPs (Qiagen , equi po de núcleo Taq , 2 mmol/l cada uno), 25 pmol de cebadores, 5 µl de 10 x regulador, 0.75 µl de polimerasa Taq de alta, fidelidad, 1 µl- (aproximadamente 15 ng) de fragmento pSwitch- Xhol/EcoRV, con. agua siendo agregada a un volumen final de 50 µl. El programa PCR (25 ciclos) fue de la siguiente manera: 5 minutos a 95°C, 1 5 s a 94°C , 30 s a 55°C, 30 s a 72°C, 5 minutos a 72°C. El producto de PCR se desprendió con Xba l , eluyó de un gel de 0.8% de azarosa y se ligó con ei plásmido linearizado. Los plásmidos resultantes se transformaron en E. coli XL 1 0 Gold y los plásmidos se analizaron por medio de miniprep. U n clon de cada plásmido que exhibió un patrón de restricción apropiado se usó para preparación de plásmido libre de endotoxina posterior. . Se analizó la expresión de IL-15/Fc después de la transfección transitoria de células HEK-293 o CHO-K1. Un día antes de la transfección, las células se sembraron a una densidad de células por pozo de 5 x 105 en placas de cultivo celular con seis pozos en duplicados. Para la transfección de conformidad con Felgner y otros (Proc. Nati. Acad. Sci. EUAr 84: 7413- 417; 1987), 2 µg de plásmido y 4 µl de Lipofectamin2000 se diluyeron en cada caso en 250 µl de medio Optimeml . Ambas soluciones se mezclaron y,, después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla se pipeteó en el medio de cultivo celular en las placas de cultivo celular. Dos días después de la transfección, el medio de cultivo fue eliminado y su contenido de IL-15/Fc se determinó por una prueba ELISA esperando conseguir la parte Fc de IL-15/Fc. c) Resultados La secreción de IL-15/Fc por células H EK-293 transfectadas con varias construcciones de expresión difícilmente fue influenciada por otros componentes de vector. En contraste, la expresión de IL-15/Fc por células CHO-K1 ha aumentado por un factor de 200-300 después de la inserción de- un intrón en la construcción de IL-15/Fc. La construcción original, pcADN3.1 hCD5.6Ala7, resultó en niveles de secreción de proteína que difícilmente fueron, detectables (debajo de 10 ng/ml), con inserción de un- intrón resultando en niveles de IL- 15/Fc de aproximadamente 300 ng/ml, después las células habían sido transfectadas con pMG10Ala7 (figuras 4 a 6; SEC ID No. 2). Los datos de ELISA que indican que los niveles de expresión de I L-15/Fc en células CHO-K1 se ilustran en la figura 4. Ya que los niveles de expresión fueron los más altos después de la transfección con la construcción pMG, la última fue elegida para producir una línea celular de expresión CHO-K1 estable. : , .-..- A este punto, el plásmido se sometió primero a secuenciación de una sola cadena. Ambas cadenas de la construcción se secuenciaron en la región que contenta el cásete de I L-15/Fc, el promotor CMV recientemente insertado y el fragmento de intrón. Ef plásmido contenía el cásete de IL-15/Fc bajo el control del promotor CMV. El intrón A que se derivó de CMV (plásmido MG) se colocó entre el promotor y el inicio de la traducción. El plásmido contenía un sitio BGHpoliA descendente del fragmento de I L-15/Fc; el gen resistente a neomicina se controló por un promotor SV40 y también contenía un sitio SV40poliA. El plásmido contenía un gen resistente a ampicilina para la selección y amplificación en E. coli. d) Discusión conclusiones A fin de aumentar el rendimiento de proteína de- transfectantes de CHO-K1 I L- 15/Fc, el plásmido de expresión, se modificó al introducir un intrón entre el promotor y el cásete de IL-15/Fc. La combinación de intrón-transgen-célula huésped influye- en gran manera en la expresión de pcoteína, y por lo; tanto ns es posible predecir el intrón que es eí más efectivo en aumentar la expresión de IL- 15/Fc en los dos tipos de célula analizados. M ientras que las células H EC-293 difícilmente fueron influenciadas por introducción del intrón, se detectó un aumento grande en secreción de IL-15/Fc en células CHO-K1. La expresión de la proteína IL-15/Fc en células CHO-K1 aumentó por más de un orden de magnitud en comparación con el vector de expresión de I L- 15/Fc original, usando un plásmido que contenía el promotor CMV e intrón A de pMG. El plásmido se puede usar para producir una línea celular productora de IL-15/Fc que se puede usar para producir IL-15/Fc para estudios pre-clínicos y clínicos o para producción industrial de IL-15/Fc.

EJEMPLO 3: PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN 1L-15/Fc a) Clarificación y concentración Aproximadamente 3100 litros del sobrenadante del ejemplo 2 (plásmido pMG10Ala7) se clarificó, concentró y filtró estéril en 6 vueltas. Esto involucró clarificar el sobrenadante por medio de filtros Profile Star (3 µm, aproximadamente 50 cm, Pall Corporation, East Hills, NY, EUA). Posteriormente, el sobrenadante se concentró 10 a 15 veces por medio de un sistema de filtración de flujo tangencial usando 2.0 m2 de membrana Biomax-30 (Millipore, Billerica, MA, EUA) en total. La presión de entrada fue 2-2.5 bar, la presión de salida fue 1.5 bar. Después de la concentración, los concentrados se filtraron -estériles a través de un sistema de filtro que consiste de un prefiltro (Polysep II (0.2 µm, aproximadamente 25 cm, Millipore, Billerica, MA, EUA) y un filtro final (Durapore (0.22 µ m , aproximadamente. 25 cm, Millipore, Billerica, MA, EUA)). La concentración de las seis diferentes vueltas tardó entre 4.5 y 8.5 horas. b) Cromatografía de rProteína-A - Se aplicaron aproximadamente 240 litros del rendimiento reunido de ios pasos de clarificación y concentración a una columna de rProteína-A (2.6 litros). La velocidad de flujo durante la carga fue entre 10 y 15.4 l/h (65-100 cm/h). Posteriormente, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de 20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCI, pH 7.5, seguido por 10 volúmenes de columna dé 0.1 mol/l citrato, pH 5.0. IL-15/FC: eluyó a 5 volúmenes de columna dé 0.1 mol/l citrato, pH .3.4, y la columna fue despojada con 5 volúmenes de columna de 0.1 mol/l citrato, pH 3.0. IL-15/Fc eluyó en un único pico agudo. El eluado fue amarillento y contuvo componentes de partícula. El eluado se ajustó de inmediato a pH 3.5 con 1 mol/l citrato. La inactivación de virus a pH bajo se llev? a cabo con agitación continua a temperatura ambiente durante 1 hora; El tratamiento se detuvo al agregar 1 mol/l Tris y ajustar el pH a 8.0. El eluado (8.6 litros) se filtró estéril usando filtros Millipak-20 y se almacenó en botellas Schott de 10 litros a 2-8°C. c) Cromatografía de Q-Sépharos " - • Se empaquetó una columna de Q-Sepharose FF a una altura de 12.7 cm , correspondiendo a un volumen de columna de 1 .9 litros. Después del equilibrado, el HETP (equivalente de altura a una placa teórica) fue 0.041 y la asimetría fue 1.1. El eluado de la cromatografía de rProteína-A se diluyó 1 :5 con 20 mmol/l Tris, pH . 8.0, en una bolsa Stedim de 50 litros. Se aplicaron 42.2 g de eluado de rProteína-A Sepharose de 1.9 litros. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna d -20 m oí/í Tris, 0.1 mol/l NaCI, pH 8.0, seguido por 5 volúmenes de columna dé 20 mmol/l Tris, 0.2 mol/l NaCI, pH 8.0. IL-~ 15/Fc eluyó con 5 volúmenes de columna de 20 mmol/l Tris, 0.35 mol/l NaCI, pH 8.0. La columna fue despojada con 5 volúmenes de columna de 20 . mmol/l Tris, 1.0 mol/l NaCI, pH 8.0. El eluado de la cromatografía de Q-Sepharose (5.0 litros) se. filtró estéril en una botella Schott de 10 litros, usando un filtro, Millipak-20, y se almacenó s 2-8°C. El eluado todavía estaba ligeramente amarillento, aunque ha sido eliminada una parte grande de la contaminación amarilla. El monitoreo de la densidad , óptica a 280 nm reveló que ÍL- 15/Fc eluyó en un único pico agudo hacia el final de la elución. d) Concentración del eluado desde cromatografía de Q-Sepharose por ultrafiltración El eluado de cromatografía de Q-Sepharose se concentró a una concentración finaK de 8.85 g/l, basado en OD28o (densidad óptica medida a 280 nm). Esto involucró el uso de una membrana 10-kD Biomax 0.1 m2. La presión de entrada se ajustó a 1.0 bar y la presión de salida a 0.5 bar. El concentrado (1.9 litros) se filtró estéril en 5 alícuotas en botellas de PETG 0.5 litros. e) Cromatografía de Superdex-200 : Las columnas se llenaron con el material de columna bajo una presión de 3 bar, La columna usada tuvo un HETP de 0.013 cm y una asimetría de 3.0. Se purificaron las 5 alícuotas de los concentrados mediante 5 vueltas sucesivas vía la columna de Superdex-200 de 13.5 litros. Los cromatogramas ilustran un pico pequeño a pesos moleculares altos y un pico principal en IL-15/Fc monomérico. Las fracciones se recolectaron, resultando en las siguientes fracciones.

CV: volumen de columna f) Reunir fracciones de Superdex Las fracciones de las purificaciones de Superdex-200 se usaron para el proceso de preparación adicional con base en su pureza determinada en análisis HP-SEC. Usualmente, las fracciones 5 a 1 1 se reunieron para este propósito. La cantidad de IL-15/Fc se calculó en la base de las áreas pico de los análisis H P-SEC. g) Filtración de virus Las fracciones de Superdex reunidas de todas las 5 vueltas se transfirieron a una bolsa Stedim, reunidas y diluidas con PBS (p H 7.4) a una concentración final de IL-15/Fc de 0.88 g/l. Las fracciones de Superdex diluidas, reunidas se filtraron sucesivamente a través de un filtro 1 -m2 Planova-35N y un filtro 1 -m2 Planova-15N. La presión de trabajo fue 0.5 bar en el caso del filtro Planota-35N . Después de la filtración, los filtros se enjuagaron con 2 I de PBS (pH 7.4). El flujo a través del filtro de virus fue entre 12 y 15 litros por hora durante la carga a 0.5 bar. Durante el lavado, el flujo disminuyó a aproximadamente 10 litros por hora, ya que el lavado se llevó a cabo a 0.4 bar. h) Filtración estéril Se filtraron estériles 16.4 kg de productos finales- usando un filtro Millipak de 0.22 µm y se introdujeron en botellas dp PETG de 1 litro. Las botellas se almacenaron a 2-8°C hasta uso adicional.

EJEMPLO 4: ESPECIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA PE FUSIÓN IL-15/Fc a) Análisis SDS-PAGE/Western-blot Los análisis en SDS-PAGE reducido con manchado de plata posterior indicaron que IL-15/Fc en el eluado Q, en las fracciones de Superdex reunidas y en el producto final tuvieron un comportamiento de migración similar a IL-15/Fc del control. En pocos geles, las bandas adicionales a pesos moleculares -menores y superiores fueron visibles en el eluado Q, que después, no obstante, también estuvieron presentes en el control. Dos bandas con pesos moleculares superiores fueron visibles en algunas de las fracciones de Superdéx reunidas. Estas bandas también se detectaron después en el control. Las bandas adicionales con pesos moleculares altos probablemente ; se deben a una reducción.- insuficiente de las muestras antes de^ cargar el gel, probablemente provocada por tiempos de reposo más largos. Aparte de la banda de IL-15/Fc principal,;- ninguna banda adicional fue detectable en el caso del producto final de IL-15/Fc en un SDS-PAGE no reducido con manchado de nitrato de plata posterior. El Western blot no reducido con detección posterior de Fc también mostró sólo la banda principal de IL-15/Fc? Esto prueba el hecho de que la calidad de 1L-15/Fc es^comparable durante todos los pasos del proceso. b) N-Glicosilación de IL-15/Fc Se determinaron las propiedades de N-glicosilación de IL-15/Fc en el extracto crudo, los pasos de clarificación y purificación, de los intermediarios dé purificación y del producto final. La sialilación promedio por N-glican nativo y eL área..- de porcentaje de ácido N-acetiineuramínico en relación a la suma de las áreas de ácido N-acetilneuramínico, ácido N-glicosilneuramínico y los asialo- N-glicanos se determinaron por medio de análisis HPAEC-PAD (HPLC: BioLC, detector PAD, columna: CarboPacPA 100 Analítico (2 x 250 mm), regulador A: 01 mol/l NaOH; regulador B: 0.1 mol/l NaOH, 0.6 mol/l acetato de sodio, para determinar N-glicanos nativos, o regulador A: 0.2 mol/l NaOH; regulador B: 0.2 mol/l NaOH, 0.6 moi/l acetato de sodio, para determinar as?alo-N-glicanos). Los resultados se resumen en la tabla a continuación: . .. -- - . . . : -• : -:- : - ' • - ..-. ^... . , /• . . . - • - - • ' - .

Una disminución en la sialilación promedio y el porcentaje de ácido N-acetilneuram ínico se observó entre la clarificación y concentración y cromatografía de rProteína-A, cuando las muestras se dejarorr reposar durante un tiempo más largo. La glicosilación de todos los otros pasos de purificación es comparable. c) Proteínas de célula huésped La prueba para proteínas de célula huésped se llevó a cabo en NewLab AG en dos días diferentes, usando una prueba I LA convencional. Esto resultó en encontrar 2.1 x 103 y 3.9 x 103 ng/ml de proteína de célula huésped, correspondiendo a 2.0 x 103 ppm y 5.3 x 103 ppm, respectivamente. Una prueba adicional para proteínas de célula huésped en el producto final, usando la prueba Cygnus (artículo- No-. - F015), dio— 240 ng/ml- de - proteín — extraña,- correspondiendo a 3.3 x 102 ppm. A tiempos de reposo más cortos, también se midieron valores menores. d) Secuencia N-terminal La secuencia de IL-15/Fc terminal se determinó en el producto final. Esta prueba reveló una secuencia N-terminal de (Asn/Asp) 1-Trp2-Val3-Asn4-Val5-lle6-Ser7-Asp8-Leu9-Lys10. La secuencia de aminoácido determinada en esta prueba corresponde a la secuencia de I L-15/Fc N-terminal esperada, excepto que ASN de N-terminal se desamida por aproximadamente 10% (a veces también valores superiores, pero no más de 20%), una desamidación estándar de 10% , debido al proceso Edman, habiendo sido considerado. Los tiempos de reposo más largos resultaron en una desaminación de aproximadamente .45%, . . e) Potencia 0 La potencia de IL-15/Fc en el producto final se determinó por medio de una prueba de bioactividad. Esta prueba detecta la bioactividad de la IL-15/Fc antagonista de 1L-15 al estudiar la acción inhibidora de proliferación en células CTLL-2 murinas estimuladas por IL-15 como una función de la dosis. El ED5o fue 1.65 ng/pozo. f) Retazos de Proteína-A rProteína-A que se había quitado lavando de la columna de rProteína-A se determinó en el producto final por medio de una ELISA específica de rProteína-A. Este retazo se descubrió ser aquí < 0.001 % . _ _ g ) AD N El contenido de ADN residual en el producto final se determinó por medio de Q-One. Se encontró menos de 5 pg/0.5 ml de ADN residual, de manera correspondiente menos de 14 pg de ADN resid ual por mg de I L-15/Fc. h) Geneticina Se ag regó geneticina durante el precultivo del proceso de fermentación . Por lo tanto, se investigó si se había el iminado geniticina lo suficiente. La concentración de geneticina se determinó ser menos de 30 ng/ml en el producto final de IL-15/Fc. i) Especificaciones El producto de I L-1 5/Fc obtenido por medio del proceso descrito antes tuvo las siguientes especificaciones: Concentración de producto 0.70 mg/ml Pureza de producto 99% pH 7.4 ED50 < 0.1 µg/pozo La identidad del producto se confirmó por medio de detectar tanto la parte de IL-15 como la parte de Fc. Las bandas en SDS- PAGE reducidas y no reducidas también corresponden a las bandas de control.

EJEMPLO 5: PREPARACIÓN PE FORMULACIONES a) Influencia del pH Se diluyó I L-15/Fc con variasr sustancias reguladoras y aditivos a 1 mg/ml, como se indica en la tabla. Después de su preparación, los reguladores se habían filtrado aquí usando un filtro de 0.2 µm (Acrodisc Syringe Filter, Pall). Las preparaciones terminadas se almacenaron en recipientes de vidrio de 10 ml (4 ml/recipiente) a 40°C y 75% de humedad relativa.

La pureza de las formulaciones de IL-15/Fc se determinó por medio de HP-SEC. Una columna TSK-GEL G300ÓSWXL (300 x 7.8 mm) y, como una columna de guardia, una columna TSK-GELSWXL (40 x 6 mm) se usaron para estelpropósito. Se operaron a 25°C y una velocidad de flujo de 1 ml por minuto. El volumen de inyección fué 50 µl. La detección "se llevó a cabo por medio de un detector a 214 nm. Al momento 0, lá pureza sólo fue 85%, ya que la muestra de IL-15/Fc usada contuvo aproximadamente 15% de productos de agregación. Por lo tanto, 85% del material de partida están en la forma de dímero act'vo. A pH 4,~~et área pico def dímers de IL-15/Fc disminuyó de aproximadamente 85% a aproximadamente 40% después de 7 días. Una disminución en pureza también se observó a pH 5.5 y pH 6. Las formulaciones a pH 8 y pH 7.4 probaron ser estables a 40°C sobre el periodo de 7 días. Esto sugiere una disminución en la estabilidad de IL-15/Fc con pH en disminución. Las formulaciones se sometieron más a un SDS-PAGE no reducido a 40°C después de almacenamiento de 7 días. La formulación, a pH 4 contuvo , dos bandas con productos de degradación a aproximadamente 70 y 50 kD: Las formulaciones a pH 6 y pH 5.5 también contuvieron dos bandas con productos de degradación, pero estas bandas tuvieron un peso molecular aparente de aproximadamente 60 y 80 kD. Las diferencias en los pesos moleculares aparentes de los productos de degradación a pH 4, 5.5 y 6 indican diferentes procesos de degradación a, valores de pH diferentes. Las formulaciones a pH 7.4 y 8 mostraron ninguna banda adicional debajo de la band principal. En ninguna de las formulacio.nes, ;, se observó un aumento en las bandas arriba de la 5.é banda principal, indicando que la agregación no aumentó en el SDS- PAGE no reducido durante el almacenamiento de 7 días á 40°C b) Influencia de pH y aditivos Se prepararon y almacenaron varias formulaciones como se describió antes bajo a). Los siguientes valores de pH y aditivos se usaron aquí: Para cada una de las formulaciones, se midió la osmolalidad al tiempo t = 0 y el pH a 40°C se midió a tiempo t = 4 semanas: pH ajustado antes de adición de argínina En ~ todas las formulaciones, er pH de la formulación correspondió a aquella esperada, excepto por las formulaciones que contienen L-argmina. Las formulaciones de L-argmma tuvieron un pH mucho más alto en comparación con el pH esperado, y esto fue provocada por la acción de la L-arginina de aminoácido" muy básica". El pH extremadamente alto de las formulaciones de L-arginina se ha tenido que considerar al analizar los resultados de estabilidad de las formulaciones. Todas las formulaciones, excepto para las formulaciones que contienen glicina a pH 7.4, fueron isotónicas (= osmolalidad de entre 0.270 y 0.330 osmol/kg). La formulación de glicina a pH 7.4 fue débilmente hipotónica. Las varias formulaciones se sometieron a cromatografía de H P- SEC como se describió antes. Algunas de las muestras mostraron un cambio en forma de pico (ampliando o haciendo cola del pico). Aunque la forma del pico fue diferente, toda el área de pico se interpretó como área de pico del dímero y se usó para determinar la pureza. Por lo tanto, la pureza de estos picos probablemente es un sobreestimado. Las muestras concernientes se marcaron en la tabla con un asterisco-(-*). - - _ . — — Los resultados muestran que ninguna de las formulaciones en regulador de citrata, pH 6, fue estable a 40°C. Se observó por lo menos una pérdida de 20% de dímero de, lL-15/Fc. Ninguno de los aditivos tuvo una actividad protectora en las formulaciones con regulador de citrato, pH 6. Asimismo, ninguna de las formulaciones que contienen L-arginina (pH alto) fue estable a 40°C. Las formulaciones a pH 7.4 que contienen sacarosa y glicina fueron estables a 40°C durante 3 semanas. La fuerte disminución en pureza en las formulaciones con regulador de fosfato a pH 7.4 y manitol después de 4 semanas se debe a una contaminación microbiana. Una disminución ligera pero continua (de 85-70%). en pureza se observó en las formulaciones con regulador de Tris, pH 8. Ninguna diferencia entre los excipientes sacarosa, manitol o glicina se observó en la formulación con regulador de Tris pH 8. Lo mismo también se observó para las formulaciones con regulador de citrato a pH 7.4. * = forma del pico principal de IL-15/Fc había cambiado nt = no probado La pureza de las formulaciones individuales también se revisó por medio de RP-HPLC. Para este propósito, se usó una columna Vydac-214TP54 (250 x 4.6 mm, 5 µm) que se operó a 25°C y una velocidad de flujo de 1 ml por minuto. El eluado usado fue un gradiente lineal de 100% de agua que contiene 0.1 % de TFA a 100% de acetonitrilo que contiene 0.1 % de TFA. Se llevó a cabo la detección a 214 nm. Como en cromatografía de HP-SEC, la forma de pico también cambió. Las muestras afectadas se marcan en la tabla una vez más por un asterisco (*). En general, los resultados RP- H PLC indican que las formulaciones a pH 6 y aquellos que contienen L-arginina no fueron estables a 40°C. Las formulaciones a pH 7.4 y 8 que contienen sacarosa y glicina y a pH 8 que contienen manitol son estables a 40°C durante por lo menos 3 semanas. La disminución fuerte en pureza de la formulación que contiene manitol a pH 7.4 se puede atribuir a una contaminación microbiana'.- * = forma del pico principal de IL-15/Fc había cambiado nt = no probado Además, las muestras se estudiaron por medio de SDS-PAGE (reducidas y no reducidas). Los geles que contienen 3-8% de Tris acetato se usaron para este propósito. Se llevó a cabo electrofóresis a 0.5 µg de proteína en 20 µl se había aplicado al gel. Las bandas se visualizaron por medio de manchado con plata. Las bandas arriba de la banda principal de IL-15/Fc indicaron agregación y aquellas debajo de la banda principaL indicaron degradación:' En las muestras: almacenadas a pH 6, ocurrió degradación después de una semana a 40°C, mientras que a. pH 8_ se observó agregación, en . aumento después de 2 semanas. Las formulaciones de 2 semanas a pH 7.4 exhibieron degradación y, después de 3 semanas, tanto degradación como agregación. Las formulaciones de I L-15/Fc a pH 7.4 u 8, que contienen sacarosa o glicina, y a pH 8, que contiene manitol, fueron estables a 40°C durante 2 semanas. La degradación en la formulación que contiene manitol, pH 7^4, una vez más fue provocada por una contaminación microbiana. Se revisaron seis formulaciones (correspondientes a Jas muestras con pH 6. 7.4 y 8, que contienen en cada caso sacarosa y glicina) para su estabilidad después de 4 semanas y se estudiaron en una prueba de proliferación de célula T en comparación con regulador sin IL-15/Fc. Con este motivo, se revisó la actividad biológica de I L-15/Fc al estudiar la acción inhibidora de proliferación en células CTLL-2 murinas estimuladas por IL-15 como una función de la dosis. Para este propósito, las células CTLL-2 fueron estimuladas con una concentración de IL-15 a máximo medio y se incubaron con concentraciones de I L-15/Fc en aumento. La proliferación de célula T se detectó por medio de una prueba colorimétrica (prueba XTT de Roche). La inhibición de máximo medio (ED50) se calculó sobre la escala de dosis activa por medio de progreso lineal. Cada muestra se midió en duplicado. Los resultados fueron los siguientes: Formulación ED 50 I L-15/Fc en regulador de citrato pH 51 ± 13 ng/3 x 104 células 6 + sacarosa sembradas " I L-15/Fc en regulador de fosfato pH 21.9 ± 10.2 ng/3 x 104 células 6 + glicina sembradas I L-15/Fc en regulador de fosfato pH 2.5 ± 1.7 ng/3 x 104 células 7.4 + sacarosa- ' sembradas IL-15/Fc en regulador de fosfato pH 4.2 ± 0.8 ng/3 x 104 células 7.4 + glicina sembradas I L-15/Fc en regulador de Tris pH 8 7.0 ± 0.5 ng/3 x 104 células + sacarosa sembradas I L-15/Fc en regulador de Tris pH 8 9.2 ± 3.8 ng/3 x 104 células + glicina sembradas Regulador de fosfato pH 7.4 + Sin influencia sacarosa Regulador de fosfato pH 7.4 + Sin influencia glicina Regulador de Tris pH 8 + sacarosa Sin influencia Regulador de Tris pH 8 + glicina Sin influencia Regulador de citrato pH 6 + Sin influencia sacarosa Regulador de citrato pH 6 + glicina Sin influencia Control: I L-15/Fc en PBS pH 7.4 12 ± 0.5 ng/3 x 104 células sembradas Estos resultados muestran que - IL-15/Fc fue biológicamente activa en todas las formulaciones, que exhiben la actividad más alta en regulador de fosfato, pH 7.4, que contiene sacarosa o glicina. Una actividad ligeramente menor que, no obstante, no fue significativamente diferente, se observó a pH 8. En contraste a esto, las formulaciones almacenadas a pH 6 resultaron en una bioactividad I L-15/Fc significativamente menor. La formulación, reguladora no tiene influencia en la bioprueba. Algunas formulaciones también se probaron para su estabilidad por medio de análisis de giicosilación de HPAEC-PAD. En este caso,. la proporción de estructuras de disialo, trisialo y tetrasialo en las varias formulaciones se estudió después de almacenar durante cuatro semanas a 40°C: Como la tabla anterior muestra, todas las formulaciones probadas fueron comparables con respecto a las proporciones relativas de estructuras de di-, tri- y tetrasialo. Las estructuras asialo y monosialo difirieron entre las varias formulaciones. Las formulaciones con sacarosa comprenden una pluralidad de picos a estos tiempos dé retención específicos en comparación con las formulaciones sin sacarosa y con el * control de IL-15/Fc. Las formulaciones de glicina y el control de IL-15/Fc fueron comparables con respecto a. las cantidades relativas de estructuras de sialo y monosialo. La diferencia , entre formulacione de sacarosa y formulaciones de glicina probablemente es provocada por la presencia de sacarosa en las formulaciones, ya que el regulador de la formulación de control (sin IL-15/Fc), que contenía sacarosa, también comprendió esté pico extra a los tiempos- de retención específicos. Por lo general se puede concluir que la formulación de IL-15/Fc a pH 6, 7:4 u 8 en presencia de glicina s sacarosa no tiene ¡nflluencia en - las propiedades de glicosilación de IL-15/Fc. I ncluso después de almacenamiento a 40°C por más de 4 semanas, no se observó cambio alguno en el patrón de glicosilación. - . . _ _- . c) Conclusiones Los estudios de estabilidad con IL-15/Fc sugieren que la estabilidad de ia formulación es altamente dependiente de pH en la escala de pH 4-8. La estabilidad disminuye con bajar el pH dentro de esta escala. Las formulaciones a pH de alrededor de 10 son menos estables que las formulaciones a pH de alrededor de 8. No se encontraron ningunas diferencias específicas en estabilidad entre las formulaciones de IL-15/Fc que contienen sacarosa, manitol o glicina como aditivo.

EJEMPLO 6: PATRONES DE GLICOSILACIÓN DE VARIOS CLONES En otro experimento, se estudiaron los patrones de glicosilación de proteínas de fusión IL-15/Fc teniendo diferentes niveles de expresión. Se preparó el clon K 146 usando pcADN3.1 con promotor CMV sin intrón, con todos los otros clones siendo preparados usando pMGI0Ala7 con promotor CMV e intrón A. El nivel de expresión en clon K 146 fue de aproximadamente 3 a 5 pg de proteína/(célula*día), el nivel de expresión en clones KN 10 y KN 13 fue de aproximadamente 9 a 13 pg de proteína/(célula*día), y finalmente, el nivel de expresión en clones KN 1 10 y KN 120 fue de aproximadamente 30 a 50 pg de proteína/(célula*día). Los datos de glicosilación se resumen en la siguiente tabla:

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1.- Proceso para purificar una proteína de fusión IL-15/Fc de una composición líquida, dicho proceso comprende: a) aplicar ia composición a una columna de cromatografía de afinidad y eluir un primer eluado de IL-15/Fc desde la columna y b) aplicar el eluado del paso a) a una columna de cromatografía de intercambio de iones y eluir un segundo eluado de IL-15/Fc desde la columna.

2.- Proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la columna de cromatografía de intercambio de iones es una columna de cromatografía de intercambio de aniones o una columna de cromatografía de intercambio de cationes.

3.- Proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, que comprende el paso adicional c): c) aplicar el eluado del' paso b) a una columna de filtración de gel o a una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica y eluir un tercer eluado de IL- 15/Fc desde la columna.

4.- Proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde la composición se filtra y/o concentra antes de o después de por lo menos uno de los pasos a) y b).

5.- Proceso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la composición se filtra y/o concentra antes de o después de por lo menos uno de los pasos a), b) y c) .

6.- Proceso de conformidad. ; con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el pH del eluado del paso a) se hace ácido antes del paso b). 7 '.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la columna de cromatografía de afinidad es una columna de cromatografía de proteína-A o una columna de cromatografía de proteína-G, de preferencia una columna de cromatografía de proteína-A. 8.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la columna de cromatografía de intercambio de aniones es una columna de DEA-Sepharose o una columna de Q-Sepharose, de preferencia una columna de Q- Sepharose. 9.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde la columna de filtración de gel es una columna de Sephadex, Sepharose, Biogel-A, Sephacryl o Biogel-P, de preferencia una columna de Superdex-200. 10.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la proteína de fusión IL-15/Fc, después de purificación, tiene una pureza de por lo menos 90%, de preferencia una pureza de por lo menos 95%, muy preferible una pureza de por lo menos 99%. 1 1 .- Proteína de fusión I L-15/Fc purificada, que tiene una pureza de por lo menos 90%, de preferencia una pureza de por lo menos 95% , muy preferible una pureza de por lo menos 99%. 12.- Proteína de fusión I L-15/Fc purificada de conformidad con la reivindicación 1 1 , en donde la sialilación promedio por N-g lican es por lo menos 70%, más preferible por lo menos 80%, todavía más preferible por lo menos 90% y muy preferible por lo menos 95% . 13.- Proteína de fusión IL-15/Fc purificada de conformidad con la reivindicación 1 1 ó 12, en donde la sialilación promedio por antena es por lo menos 50%, más preferible por lo menos 70%, todavía más preferible por lo menos 80% y muy preferible por lo menos 90%. 14.- Proteína de fusión I L-15/Fc purificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 13, en donde la porción de ácido N-glicolil-neuramínico de la suma de ácidos N-acetil-neuramínicos, ácidos N-glicolilneuramínicos y asialo-N-glicanos es no más de 20%, de preferencia no más de 15%, más preferible no más de 10%. 15.- Composición que comprende una proteína de fusión I L-15/Fc purificada de conformidad con por lo menos una de las reivindicaciones 1 1 a 14 y también excipientes y aditivos. 16.- Composición de conformidad con la reivindicación 15, que tiene un pH de

7.4 a

8.0. 17.- Composición de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, que es una composición farmacéutica. RESU M EN DE LA I NVENCIÓ N La presente invención se refiere a un proceso para purificar u na proteína de fusión inte? leukina-15/Fc de una composición, dicho proceso comprende a) aplicar la composición a una columna de cromatografía de afinidad y eluir un primer eluado de I L- 15/Fc desde la columna y b) aplicar el eluado del paso a) a una columna de cromatografía de intercambio de iones y eluir un segundo eluado de I L-15/Fc desde la columna; y a una proteína de fusión interleukina-15/Fc purificada y una composición, en particular una composición farmacéutica, que comprende una proteína de fusión como tal.