KR20190089988A - I형 점액다당류증에 대한 유전자 요법 - Google Patents

I형 점액다당류증에 대한 유전자 요법 Download PDF

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켄드릭 에이. 고스
제프리 비. 파슨스
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블루버드 바이오, 인코포레이티드.
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Abstract

본 발명은 MPS I를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

I형 점액다당류증에 대한 유전자 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 6일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/430,795호의 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e) 하의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된다.
서열목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본원에서 본 명세서 내에 참고로 편입된다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 BLBD_081_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 24KB이며, 2017년 12월 6일자로 생성되었고, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출 중에 있다.
기술분야
본 발명은 유전자 요법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 I형 점액다당류증(mucopolysaccharidosis, TYPE I: MPS I)을 치료하기 위한 유전자 요법 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
점액다당류증(MPS)은 라이소좀 저장 질환으로서 알려진 심각한 유전자 장애의 부류이다. MPS는 특정 점액다당류를 지속적으로 분해하고 재순환시키는 신체의 능력을 방해한다.
I형 점액다당류증(MPS I)은 신체의 다수의 부분에 영향을 미치는 병태이다. 이런 장애는 일단 3가지 별개의 증후군으로 나누어졌다: 후를러 증후군(MPS I-H), 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S), 및 샤이에 증후군(MPS I-S)(가장 중증으로부터 가장 덜 중증인 것으로 열거). 각각의 이들 3가지 증후군 간에 많은 중복이 있기 때문에, MPS I는 현재 중증의 유형 및 약화된 유형으로 나누어진다. 중증의 MPS I는 100,000명의 신생아 중에서 대략 1건으로 발생된다. 약화된 MPS I는 덜 흔하며, 500,000명의 신생아 중에서 약 1건으로 발생된다.
MPS I를 갖는 사람은 효소 알파-L 이두로니다제(iduronidase)(IDUA)를 암호화하는 알파-L 이두로니다제 유전자(IDUA)의 결함있는 복제물을 가진다. IDUA는 황산헤파란 및 황산더마탄으로 불리는 2가지 GAG로 존재하는 글리코아미노글리칸(glycosaminoglycan: GAG)에 존재하는 비황산화된 알파-L-이두론산을 가수분해시킴으로써 GAG 또는 점액다당류로서 알려진 거대 당 분자의 분해를 초래한다. IDUA 기능의 상실은 황산더마탄 및 황산헤파란이 분해되지 않게 하고, 신체 전체적으로 세포 내에서 다른 해로운 물질이 증가되게 한다.
MPS I의 형태는 둘 다 다수의 상이한 기관 및 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 중증의 MPS I를 갖는 사람은 실명, 청력손실, 학습 및 언어지체, 호흡 및 심장 문제와 함께 시작되는 신경학적 기능의 진행성 감퇴를 경험한다. 발달지연은 보통 1세에 존재하며, 종국적으로 중증으로 병에 걸린 개체는 기본적인 기능적 기술을 상실한다(발달 퇴행). 이런 형태의 장애를 갖는 아동은 보통 단축된 수명을 가지며, 때때로 후기 아동기까지만 생존한다. 약화된 MPS I는 각막 혼탁, 심장 판막 결함 및 골격 이형증을 특징으로 하고, 이런 형태의 질환을 갖는 개체는 전형적으로 성인기까지 생존하며, 단축된 수명을 가질 수도 있고 또는 갖지 않을 수도 있다. 약화된 유형을 갖는 일부 사람들은 학습 장애를 갖는 한편, 다른 사람들은 지적 장애를 갖지 않는다. 심장병 및 기도 폐쇄는 MPS I 유형을 둘 다 갖는 사람에서의 주된 사망 원인이다.
치료는 MPS I을 갖는 개체의 생존 기간 및 삶의 질을 개선시킬 수 있지만, 치유법은 없다.
본 발명은 일반적으로, 부분적으로, 유전자 요법 조성물 및 I형 점액다당류증(MPS I)의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, MPS I은 후를러 증후군(MPS I-H), 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S), 또는 샤이에 증후군(MPS I-S)이다. 특정 실시형태에서, MPS는 중증의 MPS I 또는 약화된 MPS I이다.
다양한 실시형태에서, 좌측(5') 렌티바이러스 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 렌티바이러스 LTR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스는 HIV(1형 HIV 및 2형 HIV를 비롯한, 인간 면역결핍 바이러스); 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV); 소 면역 결핍 바이러스(bovine immune deficiency virus: BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스는 HIV-1 또는 HIV-2이다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스는 HIV-1이다.
추가적인 실시형태에서, 5' LTR의 프로모터는 거대세포바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 프로모터 및 유인원 바이러스 40(Simian Virus 40: SV40) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 프로모터로 대체된다.
추가적인 실시형태에서, 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 3' LTR은 바이러스 복제의 제1 라운드 이후 바이러스 전사를 방지하는 하나 이상의 결실을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' LTR은 3' LTR의 U3 영역 내 TATA 박스 및 Sp1 및 NF-κB 전사 인자 결합 부위의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 3' LTR은 자기-비활성화(self-inactivating: SIN) LTR이다.
특정 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 인테그린 서브유닛 알파 M(ITGAM; CD11b) 프로모터, CD68 프로모터, C-X3-C 모티프 케모카인 수용체1(CX3CR1) 프로모터, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA1) 프로모터, 막관통 단백질 119(TMEM119) 프로모터, 스팔트 유사 전사 인자 1(SALL1) 프로모터, 접착 G 단백질-결합 수용체 E1(F4/80) 프로모터, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터 및 이들의 전사적으로 활성인 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터 또는 이들의 전사적으로 활성인 단편을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이들의 전사적으로 활성인 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 짧은 EF1α 프로모터이다.
일부 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 긴 EF1α 프로모터이다.
추가적인 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 cDNA이다.
특정 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현을 위해 코돈 최적화된다.
특정 실시형태에서, 좌측(5') HIV-1 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; RRE 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; MND 프로모터 또는 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 EF1α 프로모터; 및 우측(3') HIV-1 LTR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 좌측(5') CMV 프로모터/HIV-1 키메라 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; RRE 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; MND 프로모터 또는 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 EF1α 프로모터; 및 우측(3') SIN HIV-1 LTR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 또는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 포유류 세포가 제공된다.
일부 실시형태에서, 세포는 조혈세포이다.
특정 실시형태에서, 세포는 CD34+ 세포이다.
특정 실시형태에서, 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포이다.
다양한 실시형태에서, gag를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드, pol을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드, env를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 생산자 세포.
다양한 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 생산자 세포에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터가 제공된다.
다양한 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 또는 본 명세서에 상정된 포유류 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 추가적인 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 또는 본 명세서에 상정된 포유류 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
다양한 추가적인 실시형태에서, 대상체에게 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포, 또는 본 명세서에 상정된 포유류 세포를 투여하는 단계를 포함하는, MPS I을 치료하는 방법이 제공된다.
다양한 일부 실시형태에서, 대상체에게 본 명세서에 상정된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 MPS I을 치료하는 방법이 제공된다.
다양한 특정 실시형태에서, 대상체에게 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포, 또는 본 명세서에 상정된 포유류 세포를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 대상체에게 본 명세서에 상정된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, MPS I는 후를러 증후군(MPS I-H)이다.
특정 실시형태에서, MPS I는 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S)이다.
특정 실시형태에서, MPS I는 샤이에 증후군(MPS I-S)이다.
특정 실시형태에서, MPS I는 중증의 MPS I이다.
특정 실시형태에서, MPS I는 약화된 MPS I이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 증상은 GAG의 축적, 실명, 청력손실, 학습 및 언어지체, 호흡기 질환, 심장병, 골격 이형증 및 인지 기능 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1은 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 예시적 구조를 도시한 도면.　　
도 2a는 야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포, 및 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포(pMND-IDUA 및 pEF1α-IDUA)에서 IDUA 효소 활성을 분석하는 대표적인 실험으로부터의 데이터를 도시한 도면.
도 2b는 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 섬유아세포가 야생형 세포 및 비형질도입된 IDUA-/- 섬유아세포에서 분석된 배경 수준에 비해 세포 배양물 상청액 내로 약 10- 내지 20배 더 활성인 IDUA를 분비한다는 것을 도시한 도면.
도 3은 야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포(GM0798 및 GM06214), 및 IDUA(MND.IDUA 및 EF1α(EFS).IDUA)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포로부터의 세포 용해물에서 IDUA 및 액틴 발현을 위한 웨스턴 블롯을 도시한 도면.
도 4는 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입된 인간 CD34+ 세포가 모의 형질도입 세포과 비교하여 유사한 성장 역할을 나타내었다는 것을 도시한 도면.
도 5는 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입되고 7일 동안 사이토카인과 함께 배양시킨 인간 CD34+ 세포의 VCL을 도시한 도면.
도 6은 메틸셀룰로스 배양물에서 제12일에 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입된 인간 CD34+ 세포의 개개 콜로니 VCL을 도시한 도면.
도 7은 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입되고 7일 동안 사이토카인과 함께 배양시킨 인간 CD34+ 세포로부터의 세포 펠릿 및 상청액에서의 IDUA 활성을 도시한 도면.
도 8은 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터의 메틸셀룰로스 배양물에서 제12일에 세포 펠릿에서의 IDUA 활성을 도시한 도면.
도 9는 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 LVV로 형질도입되고 7일 동안 사이토카인과 함께 배양시킨 3개의 인간 CD34+ 공여자 세포의 VCN을 도시한 도면.
서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1은 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적 렌티바이러스 벡터의 서열을 제시한다.
서열번호 2는 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적 렌티바이러스 벡터의 서열을 제시한다.
서열번호 3 내지 13은 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 14 내지 16은 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
A. 개요
본 발명은 일반적으로, 부분적으로, 후를러 증후군(MPS I-H), 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S), 샤이에 증후군(MPS I-S), 중증의 MPS I, 및 약화된 MPS I을 비롯한 MPS I의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키기 위한 개선된 유전자 요법 조성물 및 방법에 관한 것이다.
MPS I을 갖는 아동은, 일부가 배꼽(제대탈장) 또는 하복부(서혜부 탈장) 주변에서 연성의 아웃-파우칭(out-pouching)을 갖지만, 출생 시 MPS I의 징후 또는 증상을 갖지 않을 수도 있다. 중증의 MPS I를 갖는 개체는 일반적으로 생애의 처음 1년 내에 장애의 다른 징후 및 증상을 나타내기 시작하지만, 약화된 MPS I를 갖는 개체는 아동기의 후기에 발생되는 더 경증의 특징을 가진다.
MPS I은 대두증, 수두증, 심장 판막 이상, 독특하게 보이는 얼굴의 특징, 간비대, 비장종대 및 대설증과 관련될 수 있다. 성대는 또한 비대해져서, 깊고, 쉰 목소리를 초래할 수 있다. 기도는 MPS I를 갖는 일부 사람에서 좁아져서, 빈번한 상 호흡관 감염 및 수면 동안 호흡의 짧은 정지(수면 무호흡)를 야기할 수 있다. MPS I을 갖는 개체는 또한 상당한 시력 상실을 야기할 수 있는 눈(각막)의 선명한 커버링의 혼탁이 진행될 수 있다. 병에 걸린 개체는 또한 청력손실 및 재발성 귀 감염을 가질 수 있다. MPS I를 갖는 일부 개체는 이동성에 영향을 미치는 짧은 신장 및 관절 기형(근육 구축)을 가진다. 중증의 MPS I를 갖는 대부분의 개체는 또한 다발성골형성 부전증, 수근관 증후군 및 척수를 압박하고 손상시킬 수 있는 경추척추관 협착증을 가진다.
MPS I의 형태는 둘 다 다수의 상이한 기관 및 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 중증의 MPS I를 갖는 사람은 1 내지 4세에 증상을 경험하며, 실명, 청력손실, 학습 및 언어지체, 호흡 및 심장 문제로 시작되어 신경학적 기능이 점진적으로 느슨해지며, 이어서, 보통 20세 전에 사망하게 된다. 약화된 MPS I를 갖는 개체는 보통 단축된 수명을 갖지 않으며, 각막 혼탁, 심장 판막 결함 및 골격 이형증을 나타낸다.
다양한 실시형태에서, 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 요법 벡터가 상정된다. 유전자 요법은 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 우선적으로 포함한다. 유전자 요법 벡터는 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 명세서에 상정된 유전자 요법 벡터로 형질도입된 세포는 또한 다양한 실시형태에서 제공된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 형질도입된 세포는 CD34+ 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 조혈세포이다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 유전자 요법 조성물은 바람직하게는 MPS I로 진단되거나 또는 이를 갖는 대상체에게 투여된다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 유전자 요법 조성물은 바람직하게는 IDUA 유전자 내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다.
특정 실시형태의 실행은, 달리 반대로 구체적으로 나타내지 않는 한, 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전자 면역 및 당업계 기술 내의 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 이 중 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 기재한다. 이러한 기법은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology];뿐만 아니라 문헌[Advances in Immunology]과 같은 저널 내의 모노그래프를 참조.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 특정 실시형태의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.
단수의 항목은 본 명세서에서 항목의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나, 또는 하나 이상)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
일 실시형태에서, 범위, 예를 들어, 1 내지 5, 약 1 내지 5, 또는 약 1 내지 약 5는 범위에 의해 포함되는 각각의 수치적 값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 비제한적 그리고 단지 예시적인 실시형태에서, 범위 "1 내지 5"는 표현 1, 2, 3, 4, 5; 또는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0; 또는 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5.0과 동등하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 효과, 예를 들어, 생리적 효과를 생산하는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소 또는 그룹의 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들의 제외는 아니라는 것을 나타내는 것으로 이해될 것이다. "이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수라는 것, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다. "본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대해 본 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한되지 않음을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 다른 요소가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 적어도 일 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태에 관한 것은 아니다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한 일 실시형태에서 특징의 긍정적 인용은 특정 실시형태에서의 특성을 제외하기 위한 기초로서 작용한다는 것이 이해된다.
"향상시킨다" 또는 "촉진한다" 또는 "증가시킨다" 또는 "확장시킨다"는 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 비해 더 높은 생리학적 반응을 유발하거나, 야기하거나 또는 생성하는 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법의 능력을 지칭한다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 대조군 양의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이의 그리고 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등을 포함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소시키다" 또는 "저하하다" 또는 "줄이다" 또는 "감소시키다" 또는 "없애다"는 일반적으로 비히클 또는 대조군 조성물 또는 방법의 반응에 비해 감소된 생리학적 반응을 초래하는 조성물 또는 방법을 지칭한다. 형질도입된 세포의 "줄어든" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 대조군 양의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이의 그리고 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없음" 또는 "실질적 변화 없음" 또는 "실질적 감소 없음"은 일반적으로 비히클, 대조군 분자/조성물, 또는 특정 세포 내 반응에 의해 야기되는 반응과 비슷한 생리학적 반응을 지칭한다. 비슷한 반응은 기준 반응과 유의하게 상이하지 않은 또는 측정 가능하게 상이하지 않은 것이다.
"MPS I"은 I형 점액다당류증(MPS I)을 지칭하며, 특정 실시형태에서, MPS I은 IDUA의 기능, 활성 및/또는 발현을 감소시키는 알파-L 이두로니다제 유전자(IDUA) 내 하나 이상의 돌연변이를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, MPS I는 후를러 증후군(MPS I-H)을 지칭한다. 특정 실시형태에서, MPS I는 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S)을 지칭한다. 특정 실시형태에서, MPS I는 샤이에 증후군(MPS I-S)을 지칭한다. 특정 실시형태에서, MPS I는 중증의 MPS I를 지칭한다. 특정 실시형태에서, MPS I는 약화된 MPS I를 지칭한다.
다음의 설명에서, 소정의 구체적인 상세한 설명은 본 명세서에 상정된 발명의 다양한 예시적 실시형태의 철저한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 당업자는 특정 예시적 실시형태가 이들 상세한 설명 없이 실행될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 추가로, 본 명세서에 기재된 구조 및 치환체의 다양한 조합으로부터 유래된 개개 벡터 또는 벡터의 그룹은 각각의 벡터 또는 벡터의 그룹이 개개로 제시되는 것과 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 특정 벡터 구조 또는 특정 치환체의 선택은 본 개시내용의 범주 내이다.
C. 폴리펩타이드
"폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은, 달리 대조적으로 구체화되지 않는 한, 상호 호환적으로 그리고 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산 서열로서 사용된다. 일 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 융합 폴리펩타이드 및 다른 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드는 임의의 다양한 잘 공지된 재조합 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 특정 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 그들은 전장 단백질 서열, 전장 단백질의 단편 또는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형, 즉, 천연 유래와 비천연 유래 둘 다를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 폴리펩타이드가 본 명세서에 상정된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터 그리고 세포의 다른 성분과의 결합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 이는 생체내 물질과 상당하게 관련되지 않는다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에서 천연 유래 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 천연 유래일 수 있거나 또는, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 내로 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 도입함으로써 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 상정된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 변이체를 포함하며, 전형적으로 여기서 변이체는 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
폴리펩타이드 변이체는 생물학적으로 활성인 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성인 단편" 또는 "최소 생물학적으로 활성인 단편"은 천연 유래 폴리펩타이드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10% 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 폴리펩타이드 단편은 천연 유래 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 아미노-말단 결실, 카복시-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 1700개의 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700개 이상의 아미노산 길이라는 것이 인식될 것이다.
폴리펩타이드 단편의 예시적 예는 촉매적 도메인 등을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 그에 인용된 참고문헌을 참조. 관심 대상의 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은 펩타이드 화학 분야의 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 특성이 실질적으로 변하지 않는 것으로 예상하도록 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 변형은 특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 만들어질 수 있으며, 폴리펩타이드는 적어도 폴리펩타이드를 포함하고, 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 작용성 분자를 여전히 얻는다. 동등한, 또는 심지어 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경시키도록 요망될 때, 당업자는, 예를 들어, 암호화 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
생물학적 활성을 없애는 일 없이 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실되는 것을 결정하는 가이드는 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector, 또는 Vector NTI 소프트웨어를 이용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 수반한다. 천연 유래 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리로 분류된다: 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 알기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 공통적으로 방향족 아미노산으로서 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 얻어진 분자의 생물학적 활성을 변경시키는 일 없이 이루어질 수 있다. 당업자라면 일반적으로, 폴리펩타이드의 비필수 영역 내 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224] 참조).
이러한 변화를 생성함에 있어서, 아미노산의 수분공급 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질 상에서 상호작용을 하는 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수분공급 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해되고 있다(본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Kyte and Doolittle, 1982]). 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 하전 특징에 기반하여 수분공급 지수가 부여되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 이들 값은 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(0.4); 트레오닌(0.7); 세린(0.8); 트립토판(0.9); 타이로신(1.3); 프롤린(1.6); 히스티딘(3.2); 글루타메이트(3.5); 글루타민(3.5); 아스파르테이트(3.5); 아스파라긴(3.5); 라이신(3.9); 및 알기닌(4.5)이다.
특정 아미노산은 유사한 수분공급 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 여전히 초래하며, 즉, 여전히 생물학적으로 기능적으로 동등한 단백질을 얻는다는 것이 당업계에 알려져 있다. 이러한 변화를 생성함에 있어서, 수분공급 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 내인 것은 특히 바람직하고, ±0.5 내인 것은 훨씬 더 특히 바람직하다. 또한 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.
미국 특허 제4,554,101호에서 상술하는 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 알기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0　± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고, 여전히 생물학적 등가물, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 얻는다는 것이 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 내인 것이 훨씬 더 특히 바람직하다.
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 응집 접합체 및 관련없는 화학적 모이어티(예를 들어, 페길화된 분자)와의 공유 접합체를 추가로 포함한다. 공유 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이 아미노산 쇄에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립형질 변이체, 종 변이체 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능성 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실은 또한 변이체이다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 폴리펩타이드 세그먼트를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다.
다른 실시형태에서, 2 이상의 폴리펩타이드는 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 하나 이상의 자기-절단성 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 신호 펩타이드, 세포 침투성 펩타이드 도메인(CPP), DNA 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인, 염색질 리모델링 도메인, 히스톤 변형 도메인, 후성적 변형 도메인, 엑소도메인, 세포외 리간드 결합 도메인, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 다량체화 도메인, 에피토프 태그(예를 들어, 말토스 결합 단백질("MBP"), 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G 및 HA), 폴리펩타이드 링커 및 폴리펩타이드 절단 신호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 또는 세그먼트를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는, 그들이 또한 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, 또는 N-말단에서 C-말단으로 연결될 수 있지만, 전형적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서일 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한, 융합 폴리펩타이드의 목적으로 하는 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 두 모이어티 사이의 화학적 결합에 의해 생산될 수 있거나 또는 일반적으로 다른 표준 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 도메인을 연결하기 위해 사용될 수 있는 링커를 선택적으로 포함할 수 있다. 펩타이드 링커 서열은 폴리펩타이드 도메인이 그들의 목적으로 하는 기능을 발휘하도록 각각의 폴리펩타이드가 그의 적절한 2차 및 3차 구조로 폴딩되는 것을 보장하는 데 충분한 거리만큼 임의의 2개 이상의 폴리펩타이드 성분을 분리시키는 데 사용될 수 있다.
예시적인 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; GGG(서열번호 3); DGGGS(서열번호 4); TGEKP(서열번호 5)(예를 들어, 문헌[Liu et al., PNAS 5525-5530(1997)] 참조); GGRR(서열번호 6)(Pomerantz et al. 1995, 상기 참조); (GGGGS)n(여기서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5임)(서열번호 7)(Kim et al., PNAS 93, 1156-1160(1996.); EGKSSGSGSESKVD(서열번호 8)(Chaudhary et al., 1990, Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 9)(Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS(서열번호 10); LRQRDGERP(서열번호 11); LRQKDGGGSERP(서열번호 12); LRQKD(GGGS)2ERP(서열번호 13). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA-결합 부위와 펩타이드 그 자체를 둘 다 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여(문헌[Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260(1993)) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 각각의 폴리펩타이드 사이에 또는 내인성 오픈 리딩 프레임과 공여자 수선 주형에 의해 암호화된 폴리펩타이드 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드 절단 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열 내로 들어갈 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자기-절단성 리보자임 인식 부위) 및 자기-절단성 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비오바이러스 NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프타바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV (벼 퉁그로 구형 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그의 고절단 엄격성에 기인하여, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 일 실시형태, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(서열번호 14), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 15) 및 ENLYFQS(서열번호 16)에서 바람직하되, X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q와 G 또는 Q와 S 사이에서 생김).
특정 실시형태에서, 자기-절단성 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프타바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드, 또는 카디오바이러스 2A 펩타이드이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 발현 또는 안정성은 하나 이상의 단백질 탈안정화 서열 또는 단백질 분해 서열(데그론(degron))에 의해 조절된다. 단백질의 빠른 프로테아좀 전환(proteasomal turnover)을 강화하기 위해 단백질을 탈안정화시키는 몇몇 전략은 본 명세서에 상정된다.
단백질 탈안정화 서열의 예시적 예는 탈안정화 박스(D 박스)(세포주기 내에 주기를 달성하기 위해 빠르고 완전한 유비퀴틴-매개 단백질 분해를 겪어야 하는 세포 주기-의존적 단백질에 9가지 아미노산이 존재함)(예를 들어, 문헌[Yamano et al. 1998. Embo J 17:5670-8] 참조); KEN 박스(Cdh1에 의해 표적화된 APC 인식 신호)(예를 들어, 문헌[Pfleger et al. 2000. Genes Dev 14:655-65] 참조); O 박스(Fzr/Cdh1에 의해 활성화된 후기 촉진 복합체(anaphase-promoting complex: APC)에 의해 M기의 말기에 G1 내내 분해되는 본래의 인식 복합체 단백질 1(ORC1)에 존재하는 모티프)(예를 들어, 문헌[Araki et al. 2005. Genes Dev 19(20):2458-2465] 참조); A-박스(Cdh1에 의한 유사 분열 출구 동안 분해되는 Aurora-A에 존재하는 모티프)(예를 들어, 문헌[Littlepage et al. 2002. Genes Dev 16:2274-2285] 참조); PEST 도메인(프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S) 및 트레오닌(T) 잔기가 풍부하고, 빠른 프로테아좀 파괴를 위해 단백질을 표적화하는 모티프)(Rechsteiner et al. 1996. Trens Biochem Sci. 21(7):267-271); 프로테아좀 파괴를 위해 빠르게 처리되는, N-말단 룰 모티프(rule motif), N-데그론 모티프 및 유비퀴틴-융합 분해(ubiquitin-fusion degradation: UFD) 모티프(예를 들어, 문헌[Dantuma et al. 2000. Nat Biotechnol 18:538-4] 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 데그론의 추가적인 예시적 예는 리간드 제어 가능한 데그론 및 온도 조절 가능한 데그론을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리간드 제어 가능한 데그론의 비제한적 예는 쉴드 1(Shield 1)에 의해 안정화된 것(예를 들어, 문헌[Bonger et al. 2011. Nat Chem Viol. 7(8):531-537]), 옥신에 의해 탈안정화된 것(예를 들어, 문헌[Nishimura et al. 2009. Nat Methods 6(12):917-922]) 및 트라이메토프림에 의해 안정화된 것(예를 들어, 문헌[Iwamoto et al., 2010. Chem Biol. 17(9):981-8] 참조)을 포함한다.
온도 조절 가능한 데그론의 비제한적 예는 DHFRTS 데그론을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Dohmen et al., 1994. Science 263(5151):1273-1276] 참조).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 D 박스, O 박스, A 박스, KEN 모티프, PEST 모티프 사이클린 A 및 UFD 도메인/기질, 리간드 제어 가능한 데그론 및 온도 조절 가능한 데그론으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분해 서열을 포함한다.
D. 폴리뉴클레오타이드
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 혼성체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 재조합, 합성이거나, 또는 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전-전령 RNA(전-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 리보자임, 합성 RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), tracrRNA, crRNA, 단일 가이드 RNA(sgRNA), 합성 mRNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭된 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 합성 DNA 또는 재조합 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유형의 변형된 형태의 길이가 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 5000, 적어도 10000, 또는 적어도 15000개 이상뿐만 아니라 모든 중간 길이인 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 인용된 값 사이의 임의의 길이, 예컨대 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체는 기준 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코돈-최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈-최적화된"은 폴리펩타이드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 내 코돈을 치환하는 것을 지칭한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 (i) 둘 이상의 유기체 사이의 코돈 편향의 변형 또는 유전자 또는 합성으로 작제된 편향 표, (ii) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내에서 코돈 편향 정도의 변형, (iii) 맥락을 포함하는 코돈의 체계적 변형, (iv) 그들의 탈암호 tRNA에 따른 코돈의 변형, (v) 전반적으로 또는 삼중 중 하나의 위치에서 GC%에 따른 코돈의 변형, (vi) 기준 서열, 예를 들어 천연 유래 서열과의 유사성 정도의 변형, (vii) 코돈 빈도 컷오프에서의 변형, (viii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성, (ix) 코돈 치환 세트의 설계에 기반한 DNA 서열의 기능에 관한 사전 지식, (x) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적 변형의 단리된 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드의 예시적 예는 서열번호 1 내지 2에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 예시적 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 바이러스 벡터, 전달 플라스미드 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
알파-L 이두로니다제(IDUA) 유전자는 단백질의 설파타제 패밀리의 구성원인 IDUA(또한 MPS I 및 IDA로서 지칭됨)를 암호화한다. 전형적으로, 인간 IDUA 단백질은 전구체 형태로서 생성된다. 인간 IDUA는 653개의 아미노산이며, 신호 펩타이드(1-26), (β/α)8 TIM 배럴 도메인(42-396), 짧은 나선-루프-나선 도메인(482-508)을 갖는 β-샌드위치 도메인(27-42 및 397-545), 및 Ig-유사 도메인(546-642)을 포함한다. IDUA는 2개의 글리코아미노글리칸, 황산더마탄 및 황산헤파란의 말단 알파-L-이두론산 잔기를 가수분해한다. 이 가수분해는 이들 글리코아미노글리칸의 라이소좀 분해에 필요하다. 효소 결핍을 초래하는 이 유전자 내 돌연변이는 상염색체 열성 질환 I형 점액다당류증(MPS I)을 야기한다. 이 유전자 내 돌연변이는 상염색체 열성 라이소좀 저장 질환 I형 점액다당류증과 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은 기준 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 또는 엄격한 조건 하에 기준 서열과 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 기준 폴리뉴클레오타이드와 구별되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되거나 또는 결실되거나, 또는 변형되거나 또는 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경은 기준 폴리뉴클레오타이드에 대해 이루어질 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드는 기준 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다는 것이 잘 이해된다.
설명 "서열 동일성" 또는, 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "에 대해 50% 동일한 서열"을 포함하는 것은 서열이 비교창에 걸쳐 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 염기 기준 또는 아미노산 대 아미노산 기준과 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 매칭된 위치의 수를 수득하기 위해 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 서열 둘 다에서 생기는 위치 수를 결정하는 단계, 매칭된 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누는 단계, 및 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함되며, 전형적으로 폴리펩타이드 변이체는 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연-유래 상태, 예를 들어, 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편에서 그것에 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 상보성 DNA(cDNA), 재조합 폴리뉴클레오타이드, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 천연에 존재하지 않고 사람의 손으로 만들어지는 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기재하는 용어는 하기를 포함한다: 5'(정상적으로는 유리 인산염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단) 및 3'(정상적으로는 유리 하이드록실(OH) 기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단). 폴리뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 주석이 달릴 수 있다. DNA 및 mRNA에 대해, 5'에서 3' 가닥은 "센스", "플러스" 또는 "암호" 가닥으로 표기되는데, 그의 서열이 전-전령(전-mRNA)의 서열과 동일하기 때문이다[DNA에서 티민(T)을 대신하는 RNA에서의 유라실(U)을 제외함]. DNA 및 mRNA에 대해, RNA 중합효소에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3'에서 5' 가닥은 "주형", "안티센스", "마이너스" 또는 "비암화" 가닥으로 표기된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "역 배향"은 3'에서 5' 배향으로 기재된 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 기재된 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기쌍 규칙과 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보성 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 후자의 서열은 종종 좌측 상에서 5' 말단 및 우측 상에서 3' 말단과 역 상보체 5' C A T G A C T 3'으로서 기재된다. 역 상보체와 동일한 서열은 회문구조 서열인 것으로 언급된다. 상보성은 "부분적"일 수 있는데, 이때 핵산의 염기 중 일부만이 염기쌍 규칭에 따라 매칭된다. 또는, 핵산 사이의 "완전한" 또는 "총" 상보성이 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 카세트" 또는 "발현 카세트"는 RNA, 및 후속적으로 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 핵산 카세트는 관심 대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리(A) 서열 및 관심대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 카세트 내 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요할 때, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되며, 형질전환 세포에서 활성에 필요한 적절한 번역후 변형을 겪으며, 적절한 세포내 구획에 대한 표적화 또는 세포외 구획으로의 분비에 의해 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전좌되도록, 핵산 카세트는 벡터 내에서 위치적으로 그리고 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로 용이한 삽입에 적합한 그의 3' 및 5' 말단을 가지며, 예를 들어, 그는 각각의 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가진다. 바람직한 실시형태에서, 핵산 카세트는 유전 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키기 위해 사용되는 치료 유전자의 서열을 함유한다. 카세트는 제거될 수 있고, 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)"는 발현되도록 요망되는 발현 백터 내로 삽입되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리펩타이드(즉, 관심 대상의 폴리펩타이드)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 벡터 및/또는 플라스미드는 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 "치료적 폴리펩타이드"로서 지칭될 수 있는, 신경 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses)의 치료, 예방 또는 개선에서 치료 효과를 제공하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 crRNA, tracrRNA, 단일 가이드 RNA(sgRNA), siRNA, miRNA, shRNA, 리보자임 또는 다른 저해 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 저해 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는, 암호 서열 그 자체의 길이와 상관없이, 그들의 전체 길이가 상당히 다를 수 있도록, 본 명세서의 다른 곳에 개시되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같이 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 전사후 반응 요소, 및 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있다. 따라서 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이가 제조의 용이함 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의해 바람직하게 제한된다는 것이 상정된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지되고 이용 가능한 임의의 다양한 잘 확립된 기법을 이용하여 제조되고/되거나 조작되고/되거나 발현되고/되거나 전달될 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
벡터의 예시적 예는 플라스미드, 자율적 복제 서열 및 전위요소, 예를 들어, 잠자는 미녀(Sleeping Beauty), 피기백(PiggyBac)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터의 추가적인 예시적 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터로서 유용한 바이러스의 예시적 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파보바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
발현 벡터의 예시적 예는 포유류 세포에서 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유류 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명) 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠(Invitrogen))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 암호 서열은 포유류 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 이러한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외로 유지되는 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜"은 숙주의 염색체 DNA 내로의 통합 없이 그리고 분할 숙주 세포로부터의 점진적 상실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하는데, 또한 이는 상기 벡터가 염색체외로 또는 에피솜으로 복제한다는 것을 의미한다.
발현 벡터에 존재하는 "발현 제어 서열", "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질화 상호작용하는 벡터의 해당 비번역 영역(복제기점, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노 서열 또는 코작 서열) 인트론, 전사후 조절 요소, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소는 그들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 편재성 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 벡터이고, 외인성, 내인성, 또는 이종성 제어 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. "내인성 제어 서열"은 게놈 내 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성 제어 서열"은 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작 수단(즉, 분자 생물학 기법)에 의해 유전자에 대한 병렬 배치로 위치되는 것이다. "이종성 제어 서열"은 유전자 조작 중인 세포와 상이한 종으로부터 유래된 외인성 서열이다. "합성" 제어 서열은 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 서열의 요소, 및/또는 특정 유전자 요법에 대해 최적의 프로모터 및/또는 인핸서 활성을 제공하는 시험관내 또는 인실리코로 결정된 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소에 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 중합효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사시킨다. 특정 실시형태에서, 포유류 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 상류의 대략 25 내지 30개 염기에 위치된 AT-풍부 영역 및/또는 전사 시작으로부터 상류의 70 내지 80개 염기로 발현되는 다른 서열, N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역을 포함한다.
용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭하며, 일부 예에서 다른 제어 서열에 비해 그들의 배향과 독립적으로 작용할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협응하여 또는 상가적으로 작용할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터와 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 병렬배치를 지칭하되, 기재된 성분인 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계이다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대 프로모터, 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 사이의 작용성 결합을 지칭하되, 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성적 발현 제어 서열"은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 계속해서 또는 지속적으로 허용하는 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서의 발현을 허용하는 "편재성" 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서 또는 제한된 각각 다양한 세포 및 조직 유형에서의 발현을 허용하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
특정 실시형태에서 사용하는 데 적합한 예시적 편재성 발현 제어 서열은 거대세포바이러스(CMV) 급초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 짧은 연장 인자 1-알파(EF1a-짧은) 프로모터, 긴 연장 인자 1-알파(EF1a-긴) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
특정 실시형태에서, 목적으로 하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 세포 유형 특이적, 계통 특이적 또는 조직 특이적 발현을 달성하기 위해(예를 들어, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직의 서브세트만의 또는 발생의 특정 단계 동안 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 핵산을 발현시키기 위해) 세포, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직 특이적 발현 제어 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
조직 특이적 프로모터의 예시적 예는 B29 프로모터(B 세포 발현), runt 전사 인자(CBFa2) 프로모터(줄기 세포 특이적 발현), CD14 프로모터(단핵구 세포 발현), CD43 프로모터(백혈구 및 혈소판 발현), CD45 프로모터(조혈세포 발현), CD68 프로모터(대식세포 발현), CYP450 3A4 프로모터(간세포 발현), 데스민 프로모터(근육 발현), 엘라스타제 1 프로모터(췌장 샘꽈리 세포 발현, 엔도글린 프로모터(내피 세포 발현), 섬유아세포 특이적 단백질 1 프로모터(FSP1) 프로모터(섬유아세포 세포 발현), 피브로넥틴 프로모터(섬유아세포 세포 발현), fms-관련 타이로신 키나제 1(FLT1) 프로모터(내피 세포 발현), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터(성상교세포 발현), 인슐린 프로모터(췌장 베타 세포 발현), 인테그린, 알파 2b(ITGA2B) 프로모터(거핵구), 세포간 부착 분자 2(ICAM-2) 프로모터(내피 세포), 인터페론 베타(IFN-β) 프로모터(조혈세포), 케라틴 5 프로모터(각질형성세포 발현), 미오글로빈(MB) 프로모터(근육 발현), 근원성 분화 1(MYOD1) 프로모터(근육 발현), 네프린 프로모터(다리세포 발현), 뼈 감마-카복시글루타메이트 단백질 2(OG-2) 프로모터(조골세포 발현), 3-옥소산 CoA 트랜스퍼라제 2B(Oxct2B) 프로모터(반수체-정자세포 발현), 계면활성제 단백질 B(SP-B) 프로모터(폐 발현), 시냅신 프로모터(뉴런 발현), 비스코트-올드리치 증후군 단백질(Wiskott-Aldrich syndrome protein: WASP) 프로모터(조혈세포 발현)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, "조건적 발현"은 유도성 발현; 억제성 발현; 특정 생리적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 제외하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 실시형태는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하며, 예를 들어, 발현은 세포, 조직, 유기체 등에 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 야기하거나 또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 실시함으로써 제어된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(대응하는 호르몬에 의한 처리에 의한 유도성), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의한 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의한 유도성), "진스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤-조절 가능 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조건적 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개된 재조합을 위한 적어도 하나의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)를 수반하는 재조합 반응에 연루된 절단 또는 통합적 단백질, 효소, 보조 요소 또는 관련 단백질을 포함하는데, 이는 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)] 참조) 또는 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 이의 단편 및 변이체일 수 있다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 위치특이성 재조합촉진효소, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 매우 다양한 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 부위는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 추가된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 부위"는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8개의 염기쌍 코어 서열에 측접하는 2개의 13개 염기쌍 역위 반복부(재조합효소 결합 부위로서 작용)를 포함하는 34개의 염기쌍 서열인 loxP이다(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)]의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511(Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995) 및 lox66(Albert et al., 1995)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
FLP 재조합효소에 대한 적합한 인식 부위는 적합한 인식 부위는 FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE)(Senecoff et al., 1988), FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
인식 서열의 다른 예는 재조합효소 λ 인테그라제, 예를 들어, 파이-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL, 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 이종성 부위 attB(길이가 34 bp)와 attP(길이가 39 bp)사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 각각 박테리아 및 파지 게놈 상의 파지 인테그라제에 대한 부착 부위에 대해 명명되는 attB 및 attP는 둘 다 φC31 동종이량체에 의해 결합될 가능성이 있는 불완전한 역위 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 산물 부위인 attL 및 attR은 추가적인 φC31-매개 재조합으로 효과적으로 비활성이 되어(Belteki et al., 2003), 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매하기 위해, attB-보유 DNA는 attP가 게놈 attB 부위 내로 삽입되는 것보다 더 용이하게 게놈 attP 부위 내로 삽입한다는 것을 발견하였다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 정해진 좌위 내로 attP-보유 "도킹 부위"의 상동성 재조합에 의해 위치가 정해지며, 이는 이어서, 삽입을 위한 attB-보유 유입 서열과 짝지어진다.
특정 실시형태에서, 각각의 복수의 폴리펩타이드의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 IRES 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예컨대 ATG에 대한 직접 내부 리보솜 유입을 촉진시킴으로써 유전자의 캡-독립적 번역을 야기하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000] 참조. 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 IRES의 예는 미국 특허 제6,692,736호에 기재된 것을 포함한다. 당업계에 공지된 "IRES"의 추가적인 예는 피코르나 바이러스로부터 얻을 수 있는 IRES(Jackson et al., 1990) 및 바이러스 또는 세포 mRNA 공급원, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP), 혈관 내피 성장인자(VEGF)(Huez et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18(11):6178-6190), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 및 인슐린-유사 성장 인자(IGFII), 번역 개시 인자 eIF4G 및 효모 전사 인자 TFIID 및 HAP4, 노바겐(Novagen)으로부터 상업적으로 입수 가능한 뇌심근염 바이러스(EMCV)(Duke et al., 1992. J. Virol 66(3):1602-9)로부터 얻을 수 있는 IRES 및 VEGF IRES(Huez et al., 1998. Mol Cell Biol 18(11):6178-90)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. IRES는 또한 피코르나바이러스과(피코르나바이러스과), 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae) 및 플라리바이러스과(플라비바이러스과) 종의 바이러스 게놈에서 그리고 HCV, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스(FrMLV) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)에서 보고되었다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 상정된 폴리뉴클레오타이드에서 사용되는 IRES는 EMCV IRES이다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 공통 코작 서열을 갖고 목적으로 하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코작 서열"은 리보솜에 대한 mRNA의 초기 결합을 크게 용이하게 하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG(서열번호 17)이며, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48).
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"은 RNA 중합효소 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화를 둘 다 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 서열은 암호 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 첨가에 의해 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서, 증가된 번역 효율에 기여한다. 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화는 바람직한데, 폴리A 꼬리가 없는 전사체는 불안정하며, 빠르게 분해되기 때문이다. 벡터에서 사용될 수 있는 폴리A 신호의 예시적 예는 이상적인 폴리A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리(A) 서열(rβgpA) 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리(A) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 세포는 직접적인 독성 및/또는 비제어 증식의 위험을 감소시키기 위해 유도성 자살 유전자를 포함하는 자살 유전자를 이용한다. 구체적 실시형태에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 특정 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 데아미나제이다. 카스파제-9는 이량체화(CID)의 특정 화학적 유도자를 이용하여 활성화될 수 있다.　
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 상정된 유전자 변형된 세포가 생체내 음성 선택을 허용하게 하는 유전자 세그먼트를 포함한다. "음성 선택"은 개체의 생체내 조건의 변과 결과로서 제거될 수 있는 주입 세포를 지칭한다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여되는 제제, 예를 들어, 화합물에 대한 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 간사이클로비어 민감성을 부여하는 단순 포진 바이러스 I형 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자; 세포의 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자 및 박테리아 사이토신 탈아미나제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 시험관내에서 음성 선택 가능한 표현형의 세포 선택을 가능하게 하는 양성 마커를 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 양성 선택 가능 마커는 숙주 세포 내로 도입 시, 유전자를 운반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현시키는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 공지되어 있으며, 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 유전자, 아데노신 탈아미나제 유전자(ADA) 및 다제내성(MDR) 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 양성 선택 가능 마커 및 음성 선택 가능 요소는 음성 선택 가능 요소의 상실이 또한 양성 선택 가능 마커의 상실을 수반하도록 연결된다. 특정 실시형태에서, 양성 및 음성 선택 가능 마커는 하나의 상실이 다른 것의 상실을 필수적으로 야기하도록 융합된다. 발현 산물로서 상기 기재한 목적으로 하는 양성 및 음성 선택 특징을 부여하는 폴리펩타이드를 수득하는 융합된 폴리뉴클레오타이드이 예는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 티미딘 키나제 융합 유전자(HyTK)이다. 이 유전자의 발현은 시험관내 양성 선택을 위해 하이그로마이신 B 내성, 및 생체내 음성 선택을 위해 간사이클로비어 민감성을 부여하는 폴리펩타이드를 수득한다. 또한 우성 양성 선택 가능 마커를 음성 선택 가능 마커와 융합시키는 것으로부터 유래된 2작용성 선택 가능 유전자의 용도를 기재하는 S. D. Lupton에 의한 PCT US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공보를 참조한다.
바람직한 양성 선택 가능 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자로부터 유래되고, 바람직한 음성 선택 가능 마커는 사이토신 탈아미나제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자로부터 유래된다. 특정 실시형태에서 상정된 예시적인 2작용성 선택 가능한 융합 유전자는 유전자를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않되, 양성 선택 가능 마커는 hph 또는 neo로부터 유래되고, 음성 선택 가능 마커는 사이토신 탈아미나제 또는 TK 유전자 또는 선택 가능한 마커로부터 유래된다.
용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달하거나 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 이에 삽입된다. 벡터는 세포 내 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 벡터의 예시적 예는 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 예시적 방법은 전기천공법, 초음파천공법, 리포펙션, 미량주사법, 유전자총법, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 나노입자, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, DEAE-덱스트란-매개 전달, 유전자 총 및 열-충격을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템의 예시적 예는 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 맥스사이트 인코포레이티드(Maxcyte, Inc.), BTX 몰레큘러 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems) 및 코페르니쿠스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(Lipofectin)(상표명)). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180-187; 및 Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12] 참조. 항체-표적화된, 박테리아 유래된, 살아있지 않은 나노세포-기반 전달이 또한 특정 실시형태에서 상정된다.
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 치료적 폴리펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 방법에 의해 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
E. 바이러스 벡터
하나 이상의 치료적 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 비바이러스 또는 바이러스 방법에 의해 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터, 더 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 및 훨씬 더 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 이용하여 표적 세포 내로 도입된다.
당업자에게 분명한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 전형적으로 세포 게놈 내로 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 또는 바이러스 입자에 대한 핵산 분자 또는 통합의 전달을 용이하게 하는 바이러스-유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드)를 지칭하기 위해 널리 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 핵산(들)에 추가로 숙주 세포 성분을 포함할 것이다.
특정 실시형태에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터 시스템의 예시적 예는 유전자 전달을 위해 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 통상적인 도구이다(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). 본 명세서에서 사용되는 용어 "레트로바이러스"는 그의 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 복제물로 역전사시키고, 후속적으로 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내로 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일단 바이러스가 숙주 게놈 내로 통합되면, 이는 "프로바이러스"로서 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 중합효소 II에 대한 주형으로서 작용하며, 새로운 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 구조적 단백질 및 효소를 암호화하는 RNA 분자의 발현을 지시한다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 깁본 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "렌티바이러스"는 복잡한 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용성 서열 요소)이 바람직하다. 특정 실시형태에서, 렌티바이러스는 세포에 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위해 사용된다.
용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 전달된 핵산 그 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스로부터 주로 유래된 구조적 및 기능적 유전자 요소, 또는 이의 부분을 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함하는 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "혼성 벡터"는 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 서열과 비-렌티바이러스의 바이러스 서열을 둘 다 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 혼성 벡터는 레트로바이러스, 예를 들어, 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 전염성 렌티바이러스 입자를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종성 핵산 등과 같은 요소를 언급하는 경우, 이들 요소의 서열은 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하며, DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재한다는 것이 이해되어야 한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 LTR, 및 다음의 부속 요소: cPPT/FLAP, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 방출 요소, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 폴리(A) 서열 중 하나 이상 또는 모두를 포함하고, 선택적으로 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같이 WPRE 또는 HPRE, 절연체 요소, 선택 가능한 마커, 및 세포 자살 유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 통합적 또는 비통합적 또는 통합 결함 렌티바이러스일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "통합 결함 렌티바이러스"는 숙주 세포의 게놈 내로 바이러스 게놈을 통합하는 능력을 결여하는 인테그라제를 갖는 렌티바이러스를 지칭한다. 통합-부적격 바이러스 벡터는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 특허 출원 WO 2006/010834에 기재되어 있다.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "긴 말단 반복부(LTR)"는 그들의 천연 서열과 관련하여, 반복을 지시하고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치된 염기쌍의 도메인을 지칭한다. LTR은 전사 제어 요소를 포함하는 수많은 조절 신호, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 함유한다. 게놈(tRNA 프라이머 결합 부위)의 역전사를 위해 그리고 바이러스 RNA의 입자(프사이 부위) 내로의 효율적인 패키징을 위해 필수적인 서열이 5' LTR에 인접한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열", "프사이" 및 기호 "Ψ"는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화를 위해 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치되는 비암호 서열을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조).
렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 LTR 변형의 결과로서 몇몇 안전성 향상을 함유한다. "자가-비활성화"(Self-inactivating: SIN) 벡터는, 예를 들어, U3 영역으로서 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역은 바이러스 복제의 제1 라운드 이후 바이러스 전사를 방지하기 위해 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 복제-결함 벡터를 지칭한다. 추가 실시형태에서, U5 영역이, 예를 들어, 이상적인 폴리(A) 서열로 대체되도록 3' LTR은 변형된다. 추가적인 안전성 향상은 바이러스 입자의 생성 동안 바이러스 게놈의 전사를 유도하기 위해 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들어, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어, 급초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 고수준의 전사를 유도할 수 있다. 이 대체는 바이러스 생성 시스템에서 완전한 U3 서열이 없기 때문에 복제-적격 바이러스를 생성하는 재조합의 가능성을 감소시킨다. LTR에 대한 변형, 예컨대 3' LTR, 5' LTR, 또는 3'과 5' LTR 둘 다에 대한 변형이 또한 포함된다는 것이 주목되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "FLAP 요소" 또는 "cPPT/FLAP"는 서열이 레트로바이러스, 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관 및 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호에 그리고 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역전사 동안에, 중심 폴리퓨린관(cPPT)에서 플러스-가닥 DNA의 중심 개시 및 중심 종결 서열(CTS)에서 중심 종결은 3가닥 DNA 구조의 형성을 야기한다: HIV-1 중심 DNA 플랩. 임의의 이론에 의해 구속되는 것을 바라지는 않지만, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 유입의 시스-활성 결정소로서 작용할 수 있고/있거나 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 골격은 벡터 내 관심 대상의 이종성 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 전달 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 일 실시형태에서, 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 및/또는 CTS 요소에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 FLAP 요소를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소 중 하나를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소를 포함하지 않는다.
용어 "방출 요소"는 세포의 핵으로부터 세포질까지 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사후 조절 요소를 지칭한다. RNA 방출 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터 내 이종성 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 선택적으로, 전사 종결 신호를 벡터 내로 혼입함으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소, 예를 들어, 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); B형 간염 바이러스에 존재하는 전사후 조절 요소(HPRE)(Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); 등(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)은 단백질에서 이종성 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 전사후 조절 요소, 예컨대 WPRE 또는 HPRE를 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 전사후 조절 요소, 예컨대 WPRE 또는 HPRE를 결여하거나 또는 포함하지 않는다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 벡터에서 사용될 수 있는 폴리A 신호의 예시적 예는 이상적인 폴리A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
특정 구체적 실시형태에 따르면, 대부분의 또는 모든 바이러스 벡터 골격 서열은 렌티바이러스, 예를 들어, HIV-1로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 사용되거나 또는 조합될 수 있고, 특정 렌티바이러스 서열의 수많은 치환 및 변경은 본 명세서에 기재된 기능을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키는 일 없이 수용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 다양한 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며(문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호 참조), 이들 중 다수는 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생산하기에 적합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 렌티바이러스 LTR을 포함한다. 특정 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 바람직하게는 렌티바이러스 벡터, 더 바람직하게는 HIV 렌티바이러스 벡터, 및 훨씬 바람직하게는, HIV-1 렌티바이러스 벡터이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하되, LTR의 프로모터 영역은 이종성 프로모터; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 렌티바이러스 LTR로 대체된다. 특정 실시형태에서, 이종성 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 비변형 LTR에 비해 하나 이상의 변형을 포함하는 우측(3') 렌티바이러스 LTR을 포함한다. 특정 실시형태에서, 3' LTR은 바람직하게는 바이러스 복제의 제1 라운드 이후 바이러스 전사를 방지하는 하나 이상의 결실을 포함하고, 더 바람직하게는 3' LTR의 U3 영역 내 TATA 박스 및 Sp1 및 NF-κB 전사 인자 결합 부위의 결실을 포함하고, 훨씬 더 바람직하게는 자기-비활성화 (SIN) LTR이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하되, LTR의 프로모터 영역은 이종성 프로모터; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 렌티바이러스 SIN LTR로 대체된다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하되, LTR의 프로모터 영역은 이종성 프로모터; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 인간 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터 또는 이들의 전사적으로 활성인 단편; 및 우측(3') 렌티바이러스 SIN LTR로 대체된다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하되, LTR의 프로모터 영역은 이종성 프로모터; 프사이(ψ) 패키징 신호; 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 인간 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이들의 전사적으로 활성인 단편; 및 우측(3') 렌티바이러스 SIN LTR로 대체된다. 바람직한 실시형태에서, EF1α 프로모터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 결여하며, "EF1α 짧은 프로모터"로서 지칭된다. 다른 실시형태에서, EF1α 프로모터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하고, "EF1α 긴 프로모터"로서 지칭된다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') CMV 프로모터/HIV-1 키메라 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; RRE 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 인간 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터 또는 EF1α-짧은 프로모터; 및 우측(3') 렌티바이러스 SIN LTR을 포함한다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 좌측(5') CMV 프로모터/HIV-1 키메라 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; RRE 레트로바이러스 방출 요소; cPPT/FLAP; 인간 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터 또는 EF1α-짧은 프로모터; 우측(3') 렌티바이러스 SIN LTR; 및 이종성 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리아데닐화 신호는 인공 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 또는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호이다.
대규모 바이러스 입자 생성은 종종 합리적인 바이러스 역가를 달성하는 데 필수적이다. 바이러스 입자는 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자, 예를 들어, gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포 내로 전달 벡터를 형질감염시킴으로써 생성된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "패키징 벡터"는 패키징 신호를 결여하고 1, 2, 3, 4개 이상의 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되며, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염을 위한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는 생산자 세포 또는 세포주를 생성하기 위해 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입될 수 있다. 패키징 벡터는, 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공법을 포함하는 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 벡터는 우성 선택 가능 마커, 예컨대 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 합성효소 또는 ADA와 함께 세포 내로 도입된 후에, 적절한 약물 존재 하에 선택되고, 클론이 단리된다. 선택 가능 마커 유전자는 패키징 벡터에 의해, 예를 들어, IRES 또는 자기-절단성 바이러스 펩타이드에 의해 암호화하는 유전자에 생리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 세포주로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 궁극적으로 감염되고 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. 렌티바이러스, 예컨대 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV의 경우에, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게는, 패키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 앞서 기재한 바와 같이 바이러스 gag 및 pol 유전자로부터의 별개의 벡터 상에서 암호화된다.
특정 실시형태에서 사용될 수 있는 레트로바이러스-유래 env 유전자의 예시적 예는 MLV 외피, 10A1 외피, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라, 센다이(Sendai), FPV(조류 흑사병 바이러스) 및 인플루엔자 바이러스 외피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 칼시바이러스과(Calciviridae), 아스트로바이러스과(Astroviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 버나바이러스과(Birnaviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae)의 RNA 바이러스과)로부터의 외피뿐만 아니라 DNA 바이러스(헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 파보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxyiridae) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)의 바이러스과)로부터의 외피를 암호화하는 유전자가 이용될 수 있다. 이들 바이러스의 대표적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 및 EIAV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 바이러스를 위형별(pseudotyping)하기 위한 외피 단백질은 다음의 바이러스 중 어떤 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 인플루엔자, 예컨대 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류 독감), 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스, 노워크 바이러스 그룹의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원두, 모노네가바이러스(Mononegavirales), 리사바이러스, 예컨대 광견병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 모콜라 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 유럽 박쥐 바이러스 1 및 2 및 호주 박쥐 바이러스, 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 수포성바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스, 예컨대 단순 포진 바이러스 1 및 2형, 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타임-바르 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 6 및 8형, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 뮤린 감마헤르페스바이러스, 아레나바이러스, 예컨대 아르헨티나 출혈열 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아-연관 출혈열 바이러스, 베네수엘라 출혈열 바이러스, 랏사열 바이러스, 마츄포 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 분야바이러스과, 예컨대 크림-콩고 출혈열 바이러스, 한타바이러스, 신증후성 출혈열 원인 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르부르크(Marburg) 출혈열을 포함하는 필로바이러스과(filovirus), 카야사나 삼림병 바이러스를 포함하는 플라비바이러스과, Omsk 출혈열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 원인 바이러스 및 파라믹소바이러스과, 예컨대 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스, 대두창 및 소두창(천연두), 알파바이러스, 예컨대 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 동부말 뇌염 바이러스, 서부말 뇌염 바이러스, SARS-연관 코로나바이러스(SARS-CoV), 웨스트 나일 바이러스, 임의의 뇌염 원인 바이러스.
일 실시형태에서, 재조합 레트로바이러스, 예를 들어, VSV-G 당단백질로 위형별된 렌티바이러스를 생성하는 패키징 세포가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "위형" 또는 "위형별"은 바이러스 외피 단백질이 바람직한 특징을 갖는 다른 바이러스의 외피 단백질로 치환된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 암호화)이 정상적으로는 바이러스를 CD4+ 제시 세포로 표적화하기 때문에, HIV가 매우 다양한 세포를 감염시키도록 허용하는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질에 의해 HIV는 위형화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G로 위형화된다. 일 실시형태에서, 재조합 레트로바이러스, 예를 들어, VSV-G 외피 당단백질로 위형화된 렌티바이러스를 생성하는 패키징 세포가 제공된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "패키징 세포주"는 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 정확한 패키징에 필수적인 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어, gag, pol 및 env)를 안정하게 또는 일시적으로 발현시키는 세포주와 관련하여 사용된다. 임의의 적합한 세포주는 패키징 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유류 세포이다. 특정 실시형태에서, 패키징 세포주를 생성하기 위해 사용되는 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포주는, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, 프사이-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 패키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 세포는 A549 세포이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "생산자 세포주"는 패키징 세포주 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 작제물을 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있는 세포주를 지칭한다. 전염성 바이러스 입자 및 바이러스 저장액 용액의 생성은 통상적인 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 바이러스 저장 용액을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, 및 N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 의해 예시된다. 전염성 바이러스 입자는 통상적인 기법을 이용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 전염성 입자는 당업계에 공지된 바와 같이 세포 용해 또는 세포 배양물 상청액의 수집에 의해 수집될 수 있다. 선택적으로, 수집된 바이러스 입자는 요망된다면 정제될 수 있다. 적합한 정제 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 후를러 증후군의 적어도 하나의 증상을 치료 및/또는 예방 및/또는 개선시키기 위해 대상체에게 투여되는 유전자 변형 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현시키는 바이러스 벡터가 숙주 세포에 형질도입된다. 소정의 실시형태에 따라 이용될 수 있는 유전자 요법에서 바이러스 벡터의 사용에 관한 다른 방법은, 예를 들어, 문헌[Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; 및 Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8]에서 찾을 수 있다.
"숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드로 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포는 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 용어 "표적 세포"는 숙죽 세포와 상호 호환적으로 사용되며, 목적으로 하는 세포 유형의 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포이다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 체세포, 예를 들어, 성체 줄기 세포, 전구체 세포 또는 분화된 세포이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 조혈세포, 예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 또는 CD34+ 세포이다. 추가적인 치료적 표적 세포는 본 명세서에서 논의된다.
F. 유전자 변형 세포
다양한 실시형태에서, 세포는 IDUA 폴리펩타이드를 발현시키도록 유전자 변형되고, 그리고 유전자 변형된 세포는 신경 세로이드 리포푸신증을 치료하기 위해 사용된다. 세포는 생체외, 시험관내 또는 생체외에서 유전자 변형될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"은 세포 내 총 유전자 물질 내로 DNA 또는 RNA 형태의 여분 유전자 물질의 첨가를 지칭한다. 용어 "유전자 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "유전자 조작된 세포"는 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 요법"은 유전자의 발현을 회복시키거나, 수정하거나 또는 변형시키거나, 또는 치료적 폴리펩타이드, 예를 들어, IDUA를 발현시킬 목적을 위한, 세포 내 총 유전자 물질 내로 DNA 또는 RNA 형태의 여분의 유전자 물질의 도입을 지칭한다.
세포는 자가/자율("자기") 또는 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종성)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 "동종이계"는 비교하는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "동계"는 비교하는 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "이종성"은 비교하는 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 동종이계이다.
특정 실시형태에서, IDUA를 암호화하는 벡터는 하나 이상의 동물 세포, 바람직하게는 포유류, 예를 들어, 비-인간 영장류 또는 인간, 및 더 바람직하게는 인간에게 도입된다.
특정 실시형태에서, 세포 집단은 본 명세서에 상정된 벡터로 형질도입된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포의 집단"은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 다수의 그리고/또는 상동성 또는 이종성 세포 유형의 조합을 구성할 수 있는 복수의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구체 세포의 형질도입을 위해, 세포의 집단은 제대혈, 태반혈액, 골수 또는 말초 혈액으로부터 단리되거나 또는 얻어질 수 있다. 세포의 집단은 형질도입될 표적 세포 유형의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조혈 줄기 또는 전구체 세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 이종성 세포 집단으로부터 단리되거나 또는 정제될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포는 1차 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "1차 세포"는 조직으로부터 단리되고 시험관내 또는 생체외에서 성장을 위해 확립된 세포를 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 대응하는 세포는, 만약에 있다면, 매우 소수의 임의의 집단 배가를 겪었으며, 따라서 인접한 세포주에 비해 그들이 유래된 조직의 주요 기능성 성분을 더욱 대표하고, 그에 따라 생체내 상태에 대해 더 대표적인 모델을 나타낸다. 1차 세포주를 확인하기 위한 다양한 조직 및 방법으로부터 샘플을 얻기 위한 방법은 당업게에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Jones and Wise, Methods Mol Biol. 1997] 참조). 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 1차 세포는, 예를 들어, 혈액, 림프종 및 상피 종양으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 1차 세포는 조혈 줄기 또는 전구체 세포이다.
용어 "줄기 세포"는 (1) 긴 말단 자기-재생, 또는 본래 세포의 적어도 하나의 동일한 복제물을 생성하는 능력, (2) 단일 세포 수준을 다중으로 분화, 일부 예에서, 단지 하나의, 전문화된 세포 유형 및 (3) 조직의 생체내 기능성 재생을 가능하게 하는 비분화 세포인 세포이다. 줄기 세포는 분화전능, 만능성, 다능성 및 올리고/단분화능으로서 그들의 발생 잠재력에 따라 다시 분류된다. "자기-재생"은 비변경 딸 세포를 생성하고 전문화된 세포 유형을 생성하는 독특한 능력(효능)을 갖는 세포를 지칭한다. 자기-재생은 2가지 방법으로 달성될 수 있다. 비대칭적 세포 분화는 모 세포와 동일한 하나의 딸 세포 및 모 세포와 상이하고 전구체 또는 분화된 세포인 하나의 딸 세포를 생성한다. 대칭적 세포 분화는 2개의 동일한 딸 세포를 생성한다. 세포의 "증식" 또는 "확장"은 대칭적으로 분화하는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전구체" 또는 "전구체 세포"는 자기 재생하며 더 성숙한 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 다수의 전구체 세포는 단일 계통을 따라서 분화하지만, 상당히 광대한 증식 능력을 가질 수 있다.
조혈 줄기 세포(HSC)는 유기체의 수명에 걸쳐 성숙 혈액 세포의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 열성적인 조혈 전구체 세포(HPC)를 생기게 한다. 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 골수성(예를 들어, 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프구 계통(예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함하는, 유기체의 모든 혈액 세포 유형이 생기게 하는 다능성 줄기 세포, 및 당업계에 공지된 다른 것을 지칭한다(Fei, R., et al., 미국 특허 제5,635,387호; McGlave, et al., 미국 특허 제5,460,964호; Simmons, P., et al., 미국 특허 제5,677,136호; Tsukamoto, et al., 미국 특허 제5,750,397호; Schwartz, et al., 미국 특허 제5,759,793호; DiGuisto, et al., 미국 특허 제5,681,599; Tsukamoto, et al., 미국 특허 제5,716,827호). 일 실시형태에서, HSC는 CD34+ 세포이다. 치명적으로 방사선 조사된 동물 또는 인간에게 이식될 때, 조혈 줄기 및 전구체 세포는 적혈구, 호중구-대식세포, 거핵구 및 림프구 조혈세포 풀을 다시 모을 수 있다.
본 명세서에 상정된 조성물 및 방법으로 형질도입된 바람직한 표적 세포 유형은 조혈세포, 바람직하게는 인간 조혈세포, 더 바람직하게는 인간 조혈 줄기 및 전구체 세포, 및 훨씬 더 바람직하게는 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포를 포함한다.
본 명세서에 상정된 방법 및 조성물로 형질도입된 조혈세포를 얻기 위한 예시적 공급원은 제대혈, 골수 또는 동원된 말초 혈액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 IDUA를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된 조혈세포는 CD34+ 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CD34+ 세포"는 그의 세포 표면 상에서 CD34 단백질을 발현시키는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "CD34"는 세포-세포 부착 인자로서 종종 작용하는 세포 표면 당단백질(예를 들어, 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. CD34+는 조혈 줄기 세포와 전구체 세포 둘 다의 세포 표면 마커이다.
본 명세서에 상정된 방법 및 조성물에 의한 형질도입에 적합한 조혈 줄기 또는 전구체 세포의 추가적인 예시적 예는 CD34+CD38LoCD90+CD45RA-인 조혈세포, CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38Lo/-, C-키트/CD117+ 및 Lin(-)인 조혈세포, 및 CD133+인 조혈세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 IDUA를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된 조혈세포는 CD34+CD133+ 세포를 포함한다.
조혈 체계를 특성규명하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 한 가지 특성규명 방법은 SLAM 암호이다. SLAM(신호전달 림프구 활성화 분자) 패밀리는 염색체 1 상의 단일 좌위(마우스)에서 유전자가 대부분 나란히 위치된 10개 초과의 분자 그룹이며, 모두 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리에 속하고, 본래 T-세포 자극에 연루되는 것으로 생각된다. 이 패밀리는 CD48, CD150, CD244 등을 포함하며, CD150은 시작 구성원이고, 따라서 또한 slamF1, 즉, SLAM 패밀리 구성원 1로 불린다. 조혈 체계를 위한 서명 SLAM 암호는 조혈 줄기 세포(HSC) - CD150+CD48-CD244-; 다능성 전구체 세포(MPP) - CD150-CD48-CD244+; 계통-제한된 전구체 세포(LRP) - CD150-CD48+CD244+; 공통 골수성 전구체(CMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32mid; 과립구-대식세포 전구체 (GMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32hi; 및 거핵구-적혈구 전구체 (MEP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD16/32low이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 IDUA를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된 조혈세포는 CD150+CD48-CD244- 세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 바와 같은 IDUA를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC)를 포함하는 조혈세포의 집단이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, HSPC는 CD34+ 조혈세포이다.
G. 조성물 및 제형
본 명세서에 상정된 조성물 및 제형은 본 명세서에 상정된 다수의 형질도입 또는 비형질도입 세포 또는 이들의 조합, 바이러스 벡터, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 조합물을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "약제학적 조성물"은 단독으로 또는 한 가지 이상의 치료 양상과 조합하여 세포 또는 동물에게 투여를 위한 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한 원한다면, 조성물은 마찬가지로 다른 제제, 예컨대 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 프로드러그, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적 활성제와 조합하여 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 또한 조성물 중에 포함될 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 사실상 없으며, 단, 추가적인 제제는 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 유해하게 영향을 미치지 않는다.
본 명세서에 상정된 특정 생체외 및 시험관외 제형 및 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 조합하여 세포, 조직, 기관 또는 동물에 대한 투여를 위해 제형화되는 형질도입 또는 비-형질도입된 세포 또는 이들의 조합, 및 바이러스 벡터의 조합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 상정된 특정 생체내 제형 및 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 조합하여 세포, 조직, 기관 또는 동물에 대한 투여를 위해 제형화되는 형질도입 또는 비-형질도입된 세포 또는 이들의 조합, 및 바이러스 벡터의 조합물을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은, 예를 들어, 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 치료적 유효량의 형질도입된 세포, 예를 들어, 조혈세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, CD34+ 세포, CD133+ 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다.
소정의 다른 실시형태에서, 본 발명은 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서에 상정된 약제학적 조성물은 본 명세서에 상정된 IDUA를 암호화하는 벡터 또는 프로바이러스를 포함하는 형질도입된 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 유해/유익비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 본 명세서에서 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 치료 세포와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 약제학적 담체의 예시적 예는 멸균 액체, 예컨대 세포 배양 배지, 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사용 용액으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 활성 성분에 적합하지 않은 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 그의 용도가 상정된다. 보충적 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 대상체에 대한 투여에 적합하다. 특정 실시형태에서, 담체를 포함하는 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 심실내, 척수내 또는 척추강내에 적합하다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 멸균 수용액, 세포 배양 배지 또는 분산물을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 형질도입 세포에 적합하지 않은 경우를 제외하고, 약제학적 조성물 중의 이의 용도가 상정된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 상정되는 조성물은 유전자 변형된 조혈 줄기 및/또는 전구체 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에 상정된 세포 기반 조성물을 포함하는 조성물은 장용 또는 비경구 투여 방법에 의해 별개로 또는 목적으로 하는 치료 목적을 달성하기 위한 다른 적합한 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 치료 중인 인간 대상체에 대한 투여에 적합하도록 충분히 고순도 그리고 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 추가로 조성물의 안정성을 유지하거나 또는 증가시켜야 한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 조성물의 다른 성분과 조합될 때 목적으로 하는 벌크, 점조도 등을 제공하기 위해, 유념해둔 계획한 투여 방식으로 선택된다. 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 결합제(예를 들어, 전호화된 메이즈 전분, 폴리비닐필로리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등), 충전제(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 인산수소칼슘 등), 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탤크, 실리카, 콜로이드 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성유, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 등), 붕해제(예를 들어, 전분, 글리콜산나트륨전분 등) 또는 습윤제(예를 들어, 라우릴황산나트륨 등)일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 조성물에 대한 다른 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 탤크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이러한 담체 용액은 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "완충제"는 화학적 구성이 pH의 상당한 변화없이 산 또는 염기를 중화시키는 용액 또는 액체를 지칭한다. 본 명세서에 상정된 완충제의 예는 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS), 링거 용액, 수 중 5% 덱스트로스(D5W), 정상/생리식염수(0.9% NaCl)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물의 pH를 약 7로 유지하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 약 6.8 내지 약 7.4, 예를 들어, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 7.4 범위의 pH를 가진다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 7.4의 pH를 가진다.
본 명세서에 상정된 조성물은 비독성의 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함할 수 있다. 조성물은 현탁액일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "현탁액"은 세포가 고체 지지체에 부착되지 않는 비부착 상태를 지칭한다. 예를 들어, 현탁액으로서 유지된 세포는 교반되거나 또는 휘저어질 수 있고, 지지체, 예컨대 배양 접시에 부착되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 조혈 줄기 및/또는 전구체 세포가 정맥내 (IV) 등에서 허용 가능한 액체 배지 또는 용액, 예를 들어, 식염수 또는 무혈청 배지 내에서 분산되는 현탁액 중에서 제형화된다. 허용 가능한 희석제는 물, 링거용액, 등장성 염화나트륨(식염수) 용액, 무혈청 세포 배양 배지 및 저온 저장에 적합한 배지, 예를 들어, Cryostor(등록상표) 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 인간 또는 동물 유래의 천연 단백질이 실질적으로 없고, 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 및 전구체 세포의 집단을 포함하는 조성물을 저장하는 데 적합하다. 치료 조성물은 인간 환자에게 투여되도록 의도되고, 따라서 세포 배양 성분, 예컨대 소 혈청 알부민, 말 혈청 및 소태아 혈청이 실질적으로 없다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지에서 제형화된다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.
무혈청 배지는 단순화된 그리고 더 잘 한정된 조성물, 감소된 정도의 오염물질, 감염제의 잠재적 공급원의 제거 및 보다 저비용을 포함하는, 혈청 함유 배지 이상의 몇몇 이점을 가진다. 다양한 실시형태에서, 무혈청 배지는 무동물이며, 선택적으로 무단백질일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. "무 동물" 배지는 성분이 비동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무 동물 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양분은 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻어진다. "무 단백질" 배지는 대조적으로 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다.
특정 조성물에서 사용되는 무혈청 배지의 예시적 예는 QBSF-60(퀄러티 바이올로지컬 인코포레이티드(Quality Biological, Inc.)), 스템프로-34(StemPro-34)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 X-VIVO 10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 조혈 줄기 및/또는 전구체 세포를 포함하는 조성물은 PlasmaLyte에서 제형화된다.
다양한 실시형태에서, 조혈 줄기 및/또는 전구체 세포를 포함하는 조성물은 동결보존 배지에서 제형화된다. 예를 들어, 동결보존제가 있는 동결보존 배지는 해동 후 높은 세포 생존도 결과를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 특정 조성물에서 사용되는 동결보존 배지의 예시적 예는 CryoStor CS10, CryoStor CS5 및 CryoStor CS2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 조성물은 50:50 PlasmaLyte A 대 CryoStor CS10을 포함하는 용액에서 제형화된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 마이코플라스마, 내독소 및 미생물 오염물질이 실질적으로 없다. 내독소와 관련하여 "실질적으로 없는"은 생물제제에 대해 FDA에 의해 허용되는 것(5 EU/㎏ 체중/일의 총 내독소, 평균 70㎏의 사람은 세포의 총 용량 당 350 EU임)보다 세포의 용량 당 내독소가 더 적다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 형질도입된 조혈 줄기 또는 조상 세포를 포함하는 조성물은 약 0.5 EU/㎖, 내지 약 5.0EU/㎖, 또는 약 0.5EU/㎖, 1.0EU/㎖, 1.5EU/㎖, 2.0EU/㎖, 2.5EU/㎖, 3.0EU/㎖, 3.5EU/㎖, 4.0EU/㎖, 4.5 EU/㎖, 또는 5.0 EU/㎖를 함유한다.
특정 실시형태에서, 바이러스 시스템(즉, 바이러스-매개 형질도입)의 전달에 적합한 조성물 및 제형은 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
생체외 전달을 위한 예시적인 제형은 또한 당업계에 공지된 다양한 형질감염제, 예컨대 인산칼슘, 전기천공법, 열 충격 및 다양한 리포좀 제형(즉, 지질-매개 형질감염)의 사용을 포함할 수 있다. 이하에 더 상세하게 기재하는 리포좀은 수성 유치의 분획을 붙잡는 지질 이중층이다. DNA는 양이온성 리포좀의 외면에 (그의 하전에 의해) 결합하고, 이들 리포좀은 세포막과 상호작용할 것이다.
특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 용액은, 예를 들어, 장용 및 비경구, 예를 들어, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 골내, 심실내, 대뇌내, 두개내, 척수내, 척추강내 및 골수내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 이용하기 위한 적합한 투약 및 치료 요법의 개발과 같이, 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 명세서에 상정된 특정 실시형태는 다른 제형, 예컨대 약제학적 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2005]에 기재되어 있는 것을 포함할 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.
H. 유전자 요법 방법
본 명세서에 상정된 유전자 변형된 세포는 MPS I의 예방, 치료 및 개선 또는 MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 또는 IDUA 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 또는 없애는 IDUA 유전자 내 돌연변이를 갖는 대상체에서 사용하기 위한 개선된 약물 제품을 제공한다. 일 실시형태에서, MPS I는 후를러 증후군(MPS I-H)이다. 일 실시형태에서, MPS I는 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S)이다. 일 실시형태에서, MPS I는 샤이에 증후군(MPS I-S)이다. 일 실시형태에서, MPS I는 중증의 MPS I이다. 일 실시형태에서, MPS I는 약화된 MPS I이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약물 제품"은 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법을 이용하여 생산된 유전자 변형된 세포를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 약물 제품은 유전자 변형된 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 예를 들어, CD34+ 세포를 포함한다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 약물 제품에서 치료적 유전자의 양을 증가시키는 것은 생체내 대응하는 유전자의 발현이 없거나 또는 최소인 대상체의 치료를 허용할 수 있고, 이에 의해 유전자 요법은 이전에 실행 가능한 치료 선택사항이 아닌 대상체에 대해 유전자 요법을 초래하는 기회를 상당히 확장시킨다.
본 명세서에 상정된 형질도입된 세포 및 대응하는 레트로바이러스 벡터는 유전자 요법의 개선된 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 요법"은 세포 게놈 내로 유전자의 도입을 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 MPS I로 진단되거나 또는 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 또는 IDUA 발현 및/또는 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IDUA 유전자를 갖는 대상체에 대한 근치적, 예방적 또는 개선적 유익을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 치료적 이식유전자를 발현시키는 발현 제어 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 생체내에서 유전자 요법이 필요한 대상체의 세포, 조직 또는 기관에 직접 주사에 의해 투여된다. 다양한 다른 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 상정된 벡터로 시험관내 또는 생체외에서 형질도입되고, 생체외에서 선택적으로 확장된다. 이어서, 형질도입된 세포는 유전자 요법이 필요한 대상체에게 투여된다.
본 명세서에 상정된 유전자 요법 방법에서 형질도입 및 투여에 적합한 세포는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 줄기 세포, 전구체 세포 및 분화된 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 세포는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 조혈 줄기 또는 전구체 세포이다.
본 명세서에 상정된 유전자 요법 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 바람직한 세포는 자가/자율("자기") 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "개체" 및 "대상체"는 종종 상호 호환적으로 사용되고, 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 방법으로 치료될 수 있는 신경 세로이드 리포푸신증의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 기닉픽), 농장 동물, 및 가축 동물 또는 반려동물(예컨대 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는 MPS I를 갖거나, MPS I로 진단되었거나, 또는 MPS I를 가질 위험에 있는 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "환자"는 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료, 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질환, 장애 또는 병태로 진단된 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리적 병태의 증상 또는 병리에 대해 임의의 유리한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커에서의 심지어 최소의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 질환 또는 병태의 감소 또는 질환 또는 병태 진행의 지연을 수반할 수 있다. "치료"는 질환 또는 병태, 또는 이의 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 나타내지는 않는다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은, "예방하다" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방되는", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나 또는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "예방" 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "의 적어도 하나의 증상을 개선시키는"은 대상체에 대해 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 치료 중인 질환 또는 병태는 MPS I이되, 적어도 하나의 증상은, 일부 실시형태에서, GAG의 축적, 실명, 청력손실, 학습 및 언어지체, 호흡기 질환, 심장병, 골격 이형증 및 인지 기능 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 후를러 증후군의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키는 데 충분한 유전자 변형된 세포 또는 유전자 요법의 양이 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 후를러-샤이에 증후군(MPS I-H/S)의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키는 데 충분한 유전자 변형된 세포 또는 유전자 요법 벡터의 양이 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 샤이에 증후군(MPS I-S)의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키는 데 충분한 유전자 변형된 세포 또는 유전자 요법 벡터의 양이 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 중증의 MPS I의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키는 데 충분한 유전자 변형된 세포 또는 유전자 요법 벡터의 양이 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 약화된 MPS I의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키는 데 충분한 유전자 변형된 세포 또는 유전자 요법 벡터의 양이 투여된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "양"은 임상 결과를 비롯한, 유리한 또는 목적으로 하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 "유효량" 또는 "효과적인 양"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 목적으로 하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 질환 전에 또는 질환의 초기에 대상체에서 예방적 용량이 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 더 적다.
바이러스 또는 형질도입된 치료 세포의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적으로 하는 반응을 유발하는 줄기 및 전구체 세포의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입 치료적 세포의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유리한 효과보다 더 커지는 것이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료"하는데 효과적인 양을 포함한다.
임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 본 발명의 벡터, 조성물 및 방법에 의해 제공되는 중요한 이점은 기존의 방법에 비해 높은 백분율의 형질도입된 세포를 포함하는 세포 집단을 투여함으로써 달성될 수 있는 고효능의 유전자 요법이다.
형질도입된 세포는 골수 제거 요법을 받았거나 또는 받지 않은 개체에서 골수 또는 제대혈 이식의 부분으로서 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 형질도입된 세포는 화학적 제거 또는 방사선 제거 골수 요법을 받은 개체에 대한 골수 이식에서 투여된다.
일 실시형태에서, 형질도입된 세포의 용량은 대상체에게 정맥내로 전달된다. 바람직한 실시형태에서, 형질도입된 조혈 줄기 세포는 대상체에게 정맥내로 투여된다.
일 예시적 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 형질도입된 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/㎏, 적어도 3 x 106개의 세포/㎏, 적어도 4 x 106개의 세포/㎏, 적어도 5 x 106개의 세포/㎏, 적어도 6 x 106개의 세포/㎏, 적어도 7 x 106개의 세포/㎏, 적어도 8 x 106개의 세포/㎏, 적어도 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 그 이상의 세포/㎏(모든 사이에 있는 세포의 용량을 포함)이다.
다른 예시적 실시형태에서, 대상체에 제공된 형질도입된 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106개의 세포/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏, 약 6 x 106개의 세포/㎏, 약 7 x 106개의 세포/㎏, 약 8 x 106개의 세포/㎏, 약 9 x 106개의 세포/㎏, 또는 약 10 x 106개의 세포/㎏, 또는 그 이상의 세포/㎏(모든 사이에 있는 세포의 용량을 포함)이다.
다른 예시적 실시형태에서, 대상체에게 제공된 형질도입된 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 약 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 10 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 2 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 3 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 4 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 6 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 7 x 106개의 세포/㎏, 5 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏, 또는 6 x 106개의 세포/㎏ 내지 약 8 x 106개의 세포/㎏(모든 사이에 있는 세포의 용량을 포함)이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 1 x 106개의 세포/㎖, 2 x 106개의 세포/㎖, 3 x 106개의 세포/㎖, 4 x 106개의 세포/㎖, 5 x 106개의 세포/㎖, 6 x 106개의 세포/㎖, 7 x 106개의 세포/㎖, 8 x 106개의 세포/㎖, 9 x 106개의 세포/㎖, 10 x 106개의 세포/㎖ 및 상기 범위 내의 모든 정수값을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 102　내지 1010개의 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105　내지 107개의 세포/㎏ 체중의 투약량으로 투여될 수 있다는 것이 일반적으로 언급될 수 있다. 세포의 수는 조성물이 그에 포함된 세포 유형에 의도되는 궁극적 용도에 의존할 것이다. 일부 실시형태에서 제공되는 용도에 대해, 세포는 일반적으로 1리터 이하의 용적이며, 500㎖ 이하, 심지어 250㎖ 또는 100㎖ 이하일 수 있다. 따라서, 목적으로 하는 세포의 밀도는 특정 실시형태에서, 106개의 세포/㎖ 또는 107개의 세포/㎖ 또는 108개의 세포/㎖ 초과이다. 임상적으로 적절한 세포수는 누적적으로 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012개의 세포 이상인 다중 주입으로 나누어질 수 있다. 세포 기반 조성물은 이들 범위 내의 투약량으로 다회로 투여될 수 있다. 세포는 요법을 받는 환자에 대해 동종이계, 공통 유전자, 이종 발생성일 수 있다.
투약량의 일부 변화는 치료될 대상체의 병태에 따라서 반드시 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 임의의 사건에서, 개개 대상체에 대해 적절한 용량을 결정할 것이다.
당업자는 적절한 투여 경로 및 본 명세서에 상정된 형질도입된 세포 또는 유전자 요법 벡터를 포함하는 유효량의 조성물의 정확한 투약량을 결정하기 위해 일상적인 방법을 사용할 것이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 약제학적 조성물의 다회 투여는 요법을 달성하는 데 필요할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약물 제품은 1회 투여된다. 특정 실시형태에서, 약물 제품은 1년, 2년, 5년, 10년 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상 투여된다.
본 명세서의 모든 간행물, 특허 출원 및 공개된 특허는 각각의 개개 간행물, 특허 출원 또는 공개된 특허가 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되도록 포함되는 것과 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.
앞서 언급한 실시형태는 이해의 분명함의 목적을 위해 예시 및 실시예로 일부 상세하게 기재하였지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다는 것은 본 명세서에 상정된 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 분명할 것이다. 다음의 실시예는 단지 예로서 제한의 방법에 의하지 않고 제공한다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 수득하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
IDUA 벡터의 작제
키메라 5' LTR; 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터 또는 짧은 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터; 알파-L 이두로니다제(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 자기-비활성화(SIN) 3' LTR을 함유하는 3세대 렌티바이러스 벡터를 작제하였다. 예를 들어, 도 1 및 서열번호 1 및 2 참조. 표 1 및 표 2는 IDUA를 암호화하는 예시적 렌티바이러스 벡터의 다양한 뉴클레오타이드 세그먼트에 대한 식별자, 젠뱅크 참조번호, 공급원 명칭 및 인용을 나타낸다.
pMND-IDUA LVV
뉴클레오타이드 식별자 젠뱅크 참조번호 공급원 명칭 출처
1-185 pUC19 플라스미드 골격 수탁 번호 L09137.2
nt 1 - 185		 pUC19 New England Biolabs (부록 1)
185-222 링커 해당 없음 합성 해당 없음1
223-800 CMV 해당 없음 pHCMV (1994) PNAS 91: 9564-68
801-1136 R, U5, PBS 및 패키징 서열 수탁 번호 M19921.2nt 454-789 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1137-1139 Gag 개시 코돈(ATG)이 정지 코돈(TAG)으로 변함 해당 없음1 합성 해당 없음
1140-1240 HIV-1 gag 서열 수탁 번호 M19921.2nt 793-893 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1241-1243 HIV-1 gag 서열이 제2 정지 코돈으로 변함 해당 없음 합성 해당 없음
1244-1595 HIV-1 gag 서열 수탁 번호 M19921.2nt 897-1248 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1596-1992 HIV-1 polcPPT/CTS 수탁 번호 M19921.2
nt 4745-5125		 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1993-2517 HIV-1(HXB3 env 영역(RRE)을 단리함) 수탁 번호 M14100.1nt 1875-2399 PgTAT-CMV Malim, M. H.
Nature (1988) 335:181-183
2518-2693 HIV-1 env 서열 S/A 수탁 번호 M19921.2nt 8290-8470 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
2694-2708 링커 해당 없음 합성 해당 없음1
2709-3096 MND 해당 없음 pccl-c-MNDU3c-x2 Challita et al. (1995)J.Virol. 69: 748-755
3097-3124 링커 해당 없음 합성 해당 없음
3125-5092 IDUA, 인간 해당 없음 합성 해당 없음
5093-5200 HIV-1 ppt 및 U3의 부분 수탁 번호 M19921.2nt 9005-9110 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
5201-5317 U3(399bp 결실) 및 R의 HIV-1 부분 수탁 번호 M19921.2nt 9511-9627 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
5318-5341 합성 폴리A 해당 없음 합성 Levitt, N. Genes & Dev (1989) 3:1019-1025
5342-5360 링커 해당 없음 합성 해당 없음
5361-7833 pUC19 골격 수탁 번호 L09137.2nt 2636-2686 pUC19 New England Biolabs (부록 1)
pEF1αIDUA LVV
뉴클레오타이드 식별자 젠뱅크 참조번호 공급원 명칭 출처
1-185 pUC19 플라스미드 골격 수탁 번호 L09137.2
nt 1 - 185		 pUC19 New England Biolabs (Attachment 1)
185-222 링커 해당 없음 합성 해당 없음
223-800 CMV 해당 없음 pHCMV (1994) PNAS 91: 9564-68
801-1136 R, U5, PBS, 및 패키징 서열 수탁 번호 M19921.2nt 454-789 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1137-1139 Gag 개시 코돈 (ATG)이 정지 코돈 (TAG)으로 변함 해당 없음 합성 해당 없음
1140-1240 HIV-1 gag 서열 수탁 번호 M19921.2nt 793-893 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1241-1243 HIV-1 gag 서열이 제2 정지 코돈으로 변함 해당 없음 합성 해당 없음
1244-1595 HIV-1 gag 서열 수탁 번호 M19921.2nt 897-1248 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1596-1992 HIV-1 polcPPT/CTS 수탁 번호 M19921.2
nt 4745-5125		 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
1993-2517 HIV-1(HXB3 env 영역 (RRE)을 단리) 수탁 번호 M14100.1nt 1875-2399 PgTAT-CMV Malim, M. H.
Nature (1988) 335:181-183
2518-2693 HIV-1 env 서열 S/A 수탁 번호 M19921.2nt 8290-8470 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
2694-2698 링커 해당 없음 합성 해당 없음
2699-3242 EF1alpha/HTLV 프로모터 해당 없음 합성 Takebe et al. (1988)MCB: 8(1): 466-472
Kim DW et al. (1990), Gene: 91(2): 217-223
3243-3258 링커 해당 없음 합성 해당 없음
3259-5226 IDUA, 인간 해당 없음 합성 해당 없음
5227-5333 HIV-1 ppt 및 U3의 부분 수탁 번호 M19921.2nt 9005-9110 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
5334-5451 U3(399bp 결실) 및 R의 HIV-1 부분 수탁 번호 M19921.2nt 9511-9627 pNL4-3 Maldarelli, et.al. (1991)
J Virol: 65(11):5732-43
5452-5475 합성 폴리A 해당 없음 합성 Levitt, N. Genes & Dev (1989) 3:1019-1025
5476-5494 링커 해당 없음 합성 해당 없음
5495-7967 pUC19 골격 수탁 번호 L09137.2nt 2636-2686 pUC19 New England Biolabs (부록 1)
실시예 2
IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 섬유아세포
IDUA 유전자 내 동형접합적 돌연변이에 기인하는 IDUA 활성이 결여된 인간 섬유아세포(IDUA-/- 세포)를 코리엘 인스티튜트 셀 리포지토리(Coriell Institute Cell Repository)로부터 획득하였고(세포주 GM6214(W402X/W402X), GM798(W402X/W402X)), 형질도입 전 24시간 동안 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) + 10% 소 태아 혈청(FBS)에서 배양시켰다. 배양시킨 IDUA-/- 세포를 5.0E4개의 세포/㎖의 DMEM + 10% FBS에서 재현탁시키고 나서, 2㎖의 이 세포 현탁액을 6-웰 조직 배양 플레이트에서 웰마다 플레이팅시키고 나서, 37℃에 두었다. 세포 파종 후 24시간에, 세포를 1㎖의의 비정제 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 1㎖의 DMEM + 10% FBS를 대조군 웰에 첨가하고 나서, 세포를 37℃ 인큐베이터에 다시 넣는다. 형질도입 후 24시간에, 완전 배지 교환을 수행하였다. 형질도입 후 48시간에, 각각의 웰로부터의 250㎕의 상청액을 멸균 에펜도르프관에 대해 제거하고 나서, 멸균 에펜도르프관에 대해 제거하고 -80℃에서 냉동시켰다. 세포를 1㎖의 인산염 완충 식염수로 세척하고 나서, 0.5㎖의 1X TryplE 익스프레스 효소(써모 피셔(Thermo Fisher))를 이용하여 들어올렸다. 세포를 샘플 당 2개의 멸균 에펜도르프 관에 대해 제거하고 나서, 1500rpm에서 5분 동안 펠릿화하였다. 상청액을 흡입하고 나서, 세포 펠릿을 -80℃에서 냉동시켰다.
실시예 3
IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포 내 단백질 발현
야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포(GM0798 및 GM06214), 및 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포 (MND.IDUA 및 EF1α(EFS).IDUA)로부터의 냉동 세포 펠릿을 웨스턴 블롯팅을 위해 얼음 상에서 해동시켰다. 300㎕의 포유류 단백질 추출 시약 및 3㎕의 100X HALT 프로테아제 저해제 칵테일(써모피셔(ThermoFisher))을 각각의 세포 펠릿에 첨가하였다. 부드럽게 위 아래로 피펫팅함으로써 펠릿을 재현탁시키고 나서, 세포를 플레이트 로커(plate rocker) 상에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 15분 동안 4℃에서 14,000rpm으로 원심분리시키고 나서, 상청액을 멸균 에펜도르프 관에 대해 제거하였다. 475㎕ 4X Laemmli 샘플 완충제(바이오-라드(Bio-Rad))에 25㎕ β-머캅토에탄올을 첨가함으로써 부하 염료를 준비하였다. 샘플을 3:1 샘플 대 부하 염료 비로 30㎕의 준비된 부하 염료 대 90㎕ 샘플 중에서 혼합하였다. 20㎕의 각각의 샘플 및 8㎕ 프리시전 플러스 프로테인 칼레이도스코프 래더(Precision Plus Protein Kaleidoscope ladder)를 NuPage 4-12 비스-트리스 단백질 겔의 웰에 부하하였다. 200V에서 40분 동안 겔을 1X MES SDS 실행 완충제 중에서 실행한다.
iBlot 7분 전달 시스템 상에서 iBlot 전달 스택을 이용하여 겔을 옮겼다. 실온에서 5분 동안 막을 1X 트리스-완충 식염수 중에서 린스하였다. 막을 오디세이(Odyssey) 차단 완충제 + 뮤린 항-IDUA 항체(MAB4119(R&D 시스템즈(RSystems))의 1:500 희석물 및 4℃에서 마우스 항-β-액틴 항체(에이비캠(Abcam) ab3280)의 1:1000 희석물에서 인큐베이션시켰다. 다음날 아침, 막을 실온에서 5분 동안 트리스-완충 식염수 중에서 3회 린스하였다. 2차 항체 칵테일은 오디세이 차단 완충제 중에서 800RD 당나귀 항-마우스 IgG(리코르(Licor) 926-32212)의 1:1000 희석물을 함유한다. 막을 2차 항체 칵테일 중에서 실온으로 1시간 동안 인큐베이션시키고, 실온에서 5분 동안 트리스-완충 식염수로 3회 린스하였다. 리코르 오디세이 CLX 이미징 시스템 상에서 블롯을 이미징하였다.
도 3은 야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포, (GM0798 및 GM06214), 및 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포(MND.IDUA 및 EF1α(EFS).IDUA)로부터의 세포 용해물 중에서 IDUA 및 액틴 밸현에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 4
IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포 내 IDUA 활성의 회복
야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포, 및 IDUA(pMND-IDUA 및 pEF1α-IDUA)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포로부터의 세포 펠릿을 150㎕의 아세트산염 완충제(0.1M 아세트산나트륨(NaAc), 0.15M 염화나트륨(NaCl)(pH 4.0), 10μM 각각 펩스타틴 A 및 트랜스-에폭시석신일-L-류실아미도-(4-구아니디노)부탄(E64)) 중에서 재현탁시켰다. IDUA 활성의 형광분석 측정을 문헌[Ou et al., 2014. Mol Gen Met. 111:113-5]에 기재된 방법에 기반하여 4-MU-αL-이두로나이드 기질의 절단에 기반하여 계산한다. 세포 용리액 또는 세포 상청액의 15 내지 25㎍의 총 단백질을 37℃에서 20시간 동안 62.5μM 4-MU-αL-이두로나이드의 최종 농도로 150㎕ 아세트산염 완충제 중에서 인큐베이션시켰다. 100㎕ 0.5M EDTA(pH 12.0)의 첨가에 의해 분석을 중단하였다. 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax) M2 분광 형광계(Ex. 355, Em. 460)를 이용하여 형광을 측정하였다.
도 2a는 야생형 대조군 세포, IDUA-/- 세포, 및 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 IDUA-/- 세포(pMND-IDUA 및 pEF1α-IDUA)에서 IDUA 효소 활성을 분석하는 대표적 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 형질도입된 세포 내 IDUA 과발현은 또한 세포 배양물 상청액 중의 효소적으로 활성인 IDUA의 분비를 야기하였다. 환자와 야생형 섬유아세포 둘 다에서의 IDUA 활성은 배경 수준으로 남아있는 반면; 형질도입된 IDUA-/-섬유아세포에서 IDUA의 과발현은 상청액 중의 IDUA 활성을 10- 내지 20-배로 증가시켰다. 도 2b. 따라서, IDUA 유전자 요법은 형질도입 세포를 수정할 뿐만 아니라, 이웃하는 세포에서 IDUA 결핍을 수정하는 잠재력을 가진다.
실시예 5
IDUA를 암호화하는 LVV로 형질도입된 hCD34+ 세포 내 활성 효소 발현
인간 CD34+ 세포는 IDUA(MPS I)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터(LVV)로 형질도입하였다. 세포를 48시간 동안 사이토카인 함유 배지에서 사전추정하였고, 200㎍/㎖ 폴록사머 338 및 10μM PGE2를 이용하여 5, 15 또는 30 중 하나의 MOI에서 24시간 동안 형질도입하였다. 형질도입 후에, 세포를 메틸셀룰로스에 플레이팅하고 나서, 12일 동안 배양시켜 조혈 전구체 콜로니 형성을 허용하거나 또는 7일 동안 사이토카인 함유 배지에서 배양시켰다. 샘플을 펠릿 및 상청액에서 세포 성장, VCN, 개개 콜로니 VCN 및 LVV+ 세포%, 및 IDUA 활성에 대해 분석하였다.
배양물 중의 세포는 모의에 비교하여 유사한 성장 역학을 나타내었는데, 이는 LVV 중 어떤 것도 독성을 야기하지 않았다는 것을 나타낸다. 도 4.
VCN은 7일 동안 사이토카인 중에서 배양시킨 형질도입된 세포에서 측정하였다. 각각의 벡터에 의한 형질도입은 모든 MOI에 걸쳐 높은 VCN을 야기하였다. MND-함유 벡터는 EF1α-함유 벡터보다 더 높은 VCN에 도달되었다. 도 5.
MOI 5 샘플로부터의 개개 콜로니를 제12일 메틸셀룰로스 배양물로부터 꺼내고, VCN 및 LVV+ 세포%에 대해 qPCR로 분석하였다. 벡터는 둘 다 3 초과의 평균 VCN 및 높은 LVV+%를 초래하였다. MND 벡터는 약간 더 효율적으로 세포에 형질도입되었다. 도 6.
형질도입된 세포를 7일 동안 사이토카인에서 배양시킨 후에, 세포 펠릿 및 상청액을 IDUA 활성에 대해 분석하였다. IDUA 활성은 벡터 둘 다에 대해 MOI에 걸쳐 세포 펠릿에서 동등하였다. 도 7, 좌측 패널. MND 벡터는 EF1α 벡터보다 상청액 중에서 더 고수준의 IDUA 활성을 가졌다. 도 7, 우측 패널.
제12일 메틸셀룰로스로부터의 총 풀링된 콜로니에서 IDUA 활성을 또한 측정하였다. 형질도입된 세포는 MOI 및 벡터에 걸쳐 동등한 IDUA 활성을 나타내었다. 도 8.
실시예 6
IDUA를 암호화하는 LVV로 형질도입된 hCD34+ 세포 및 뮤린 Lin- 세포
3명의 공여자 및 마우스 Lin- 세포로부터의 인간 CD34+ 세포를 IDUA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 MND 또는 EF1α 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터(LVV)로 형질도입하였다. 세포를 48시간 동안 사이토카인 함유 배지에서 사전추정하고 나서, 200㎍/㎖ 폴록사머 338 및 10μM PGE2를 이용하여 2 내지 60 범위의 MOI에서 24시간 동안 형질도입하였다. 형질도입 후에, 세포를 7일동안 사이토카인 함유 배지에서 배양시켰다.
7일 동안 사이토카인 중에서 배양시킨 형질도입된 세포에서 VCN을 측정하였다. 모든 공여자에 걸쳐 MOI가 증가함에 따라 VCN은 증가하는 경향이 있다. 도 9.
실시예 7
생체내 IDUA 유전자 요법 모델
IDUA 돌연변이를 갖는 마우스에 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HSC를 투여하고 나서 표현형으로 특성규명할 것이다. IDUA 돌연변이체 마우스는 골수 조혈 줄기 세포를 없애기 위한 치료를 받고, 2주령 이하로 IDUA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HSC를 투여할 것이다.
개시 치료 후 제1일에 시작해서 임상 평가를 수행할 것이며, 대략 4주령의 마우스는 떨림, 일반적 신체 상태, 체중 증가(매주, 대략 4주령에 시작), 악력(2주마다, 대략 8주령에 시작), 로타로드(rotarod)(대략 제13주령, 제18주령), 및 보행 분석(대략 제16주령 및 대략 제24주령)에 대한 관찰을 포함하는 임상 평가를 받을 것이다.
거동 분석에 추가로, 마우스는 완전한 임상 혈액 화학 패널, 저장 물질을 평가하기 위한 CNS 외형 및 조직학적 분석, 뉴런 및 신경아교세포 수, 및 시상단면 내 형태(예를 들어, 축삭변성)(각각의 단면에서 다중 뇌 영역을 포획하기 위함), IDUA 결핍에 의해 영향받는 조직 내 교차-수정(cross-correction)(발현)의 증거, 혈액/뇌/조직 용해물 중의 IDUA 효소 활성, 골수 형태, 모든 실험의 마지막에 마우스 골수의 벡터 복제수 측정; 및 생착 세포의 동정을 포함하는 조혈 줄기 세포 요법 후에 그들의 일반적 건강상태 및 면역계 재구성을 평가하기 위하여 다른 매개변수에 대해 이식 후에 검사할 것이다.
일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용하는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위가 자격을 부여하는 균등론의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> BLUEBIRD BIO, INC. <120> GENE THERAPY FOR MUCOPOLYSACCHARIDOSIS, TYPE I <130> IPA190719-US <150> US 62/430,795 <151> 2016-12-06 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7833 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized lentiviral vector encoding an alpha-L iduronidase (IDUA) polypeptide <400> 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600 gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780 cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840 ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900 tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960 cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020 agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080 gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140 gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200 ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260 aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320 gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380 tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga 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tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 5280 ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatctgctt 5340 tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 5400 ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca atgtgtgtgt 5460 tggttttttg tgtgtcgaaa ttctagcgat tctagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 5520 tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 5580 aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 5640 ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 5700 gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5760 cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 5820 tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5880 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5940 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 6000 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 6060 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 6120 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 6180 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 6240 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6300 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6360 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6420 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6480 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6540 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 6600 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 6660 tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 6720 cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 6780 ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 6840 tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 6900 gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 6960 agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 7020 atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 7080 tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 7140 gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 7200 agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 7260 cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 7320 ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 7380 ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 7440 actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 7500 ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 7560 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 7620 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgggactag ctttttgcaa 7680 aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg 7740 gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa 7800 ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa 7860 ttgagatgag cttgcatgcc gacattgatt attgactagt ccctaagaaa ccattcttat 7920 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7967 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 3 Gly Gly Gly 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 4 Asp Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 5 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 6 Gly Gly Arg Arg 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 8 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 9 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 10 Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 11 Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 12 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 13 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Gly or Ser <400> 14 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <400> 15 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <400> 16 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Kozak sequence <400> 17 gccrccatgg 10

Claims (33)

  1. 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 좌측(5') 렌티바이러스 LTR(long terminal repeat);
    (b) 프사이(ψ) 패키징 신호;
    (c) 레트로바이러스 방출 요소;
    (d) 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT/FLAP);
    (e) 알파-L 이두로니다제(iduronidase)(IDUA) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및
    (f) 우측(3') 렌티바이러스 LTR
    을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 렌티바이러스는 HIV(1형 HIV 및 2형 HIV를 비롯한 인간 면역결핍 바이러스); 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV); 소 면역 결핍 바이러스(bovine immune deficiency virus: BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV)로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 렌티바이러스는 HIV-1 또는 HIV-2인, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스는 HIV-1인, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR의 프로모터는 거대세포바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 프로모터 및 유인원 바이러스 40(Simian Virus 40: SV40) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 프로모터로 대체된, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 바이러스 복제의 제1 라운드 이후 바이러스 전사를 방지하는 하나 이상의 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 상기 3' LTR의 U3 영역 내 TATA 박스 및 Sp1 및 NF-κB 전사 인자 결합 부위의 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 자기-비활성화(self-inactivating: SIN) LTR인, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 인테그린 서브유닛 알파 M(ITGAM; CD11b) 프로모터, CD68 프로모터, C-X3-C 모티프 케모카인 수용체1(CX3CR1) 프로모터, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA1) 프로모터, 막관통 단백질 119(TMEM119) 프로모터, 스팔트(spalt) 유사 전사 인자 1(SALL1) 프로모터, 접착 G 단백질-결합 수용체 E1(F4/80) 프로모터, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터 및 이들의 전사적으로 활성인 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 전사적으로 활성인 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 짧은 EF1α 프로모터인, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 긴 EF1α 프로모터인, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 cDNA인, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 발현을 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 좌측(5') HIV-1 LTR;
    (b) 프사이(ψ) 패키징 신호;
    (c) RRE 레트로바이러스 방출 요소;
    (d) cPPT/FLAP;
    (e) IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터 또는 EF1α 프로모터; 및
    (f) 우측(3') HIV-1 LTR
    을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 좌측(5') CMV 프로모터/HIV-1 키메라 LTR;
    (b) 프사이(ψ) 패키징 신호;
    (c) RRE 레트로바이러스 방출 요소;
    (d) cPPT/FLAP;
    (e) IDUA 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터 또는 EF1α 프로모터; 및
    (f) 우측(3') SIN HIV-1 LTR
    을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 또는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 포유류 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포는 조혈세포인, 포유류 세포.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 세포인, 포유류 세포.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포인, 포유류 세포.
  23. 생산자 세포(producer cell)로서, gag를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드, pol을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드, env를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오타이드, 및 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 생산자 세포.
  24. 제23항의 생산자 세포에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 포유류 세포를 포함하는 조성물.
  26. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 포유류 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. MPS I(mucopolysaccharidosis type I)의 치료 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터; 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포; 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 포유류 세포를 투여하는 단계를 포함하는, MPS I의 치료 방법.
  28. MPS I의 치료 방법으로서, 대상체에게 제26항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, MPS I의 치료 방법.
  29. 대상체에서 MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터; 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포; 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 포유류 세포를 투여하는 단계를 포함하는, MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
  30. 대상체에서 MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제26항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 MPS I는 후를러 증후군(Hurler syndrome)(MPS I-H), 후를러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie syndrome)(MPS I-H/S) 또는 샤이에 증후군(Scheie syndrome)(MPS I-S)인, MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 MPS I는 중증의 MPS I 또는 약화된 MPS I인, MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 증상은 GAG의 축적, 실명, 청력손실, 학습 및 언어지체, 호흡기 질환, 심장병, 골격 이형증 및 인지 기능 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택된, MPS I와 관련된 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
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