JP2024503883A - 操作されたnk細胞およびがんを処置する方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、概して、改変されたNK細胞組成物および免疫療法適用において改変された細胞組成物を使用する方法に関する。実施形態では、改変された細胞は、γ鎖およびδ鎖を発現する。実施形態では、改変されたNK細胞組成物は、様々ながんを処置するために使用することができる。一態様では、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む改変されたNK細胞が提供される。実施形態では、NK細胞は、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、2021年1月21日に提出され、「ENGINEERED NK CELLS AND METHODS OF TREATING CANCER」という表題の米国仮特許出願第63/140,118号の優先権を主張する。
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、2021年1月21日に提出され、「ENGINEERED NK CELLS AND METHODS OF TREATING CANCER」という表題の米国仮特許出願第63/140,118号の優先権を主張する。
分野
本開示は、概してがんの処置および防止のための免疫療法における操作されたNK細胞の使用に関する。
本開示は、概してがんの処置および防止のための免疫療法における操作されたNK細胞の使用に関する。
背景
生物の免疫系は、ウイルス、細菌、毒素、寄生虫、および木片を含む多様な病原体および外部侵入体を検出して応答することによって生物を疾患から保護する。免疫系は、臓器、細胞、および分子の複雑なネットワークで構成されている。ヒトを含む多くの生物は、免疫系の2つの主な下位区分、すなわち自然免疫系および適応免疫系を有する。自然免疫系は、急速に活性化されて病的な細胞を認識して破壊することができる急速な応答系であるが、適応免疫系は、特定の病原体と闘うためにそれらとの以前の遭遇に依存する遅い応答系である。
生物の免疫系は、ウイルス、細菌、毒素、寄生虫、および木片を含む多様な病原体および外部侵入体を検出して応答することによって生物を疾患から保護する。免疫系は、臓器、細胞、および分子の複雑なネットワークで構成されている。ヒトを含む多くの生物は、免疫系の2つの主な下位区分、すなわち自然免疫系および適応免疫系を有する。自然免疫系は、急速に活性化されて病的な細胞を認識して破壊することができる急速な応答系であるが、適応免疫系は、特定の病原体と闘うためにそれらとの以前の遭遇に依存する遅い応答系である。
ナチュラルキラー(NK)細胞は、顆粒状のリンパ球であり、自然免疫系のエフェクター細胞である。それらは、リンパ系組織および非リンパ系組織の両方に存在し、TおよびB細胞などの適応免疫系のリンパ球とは異なる。NK細胞は通常、その細胞表面上にCD3も抗原特異的受容体も発現しない。ヒトでは、CD56は、NK細胞のマーカーとして働くことができる。NK細胞は、事前の免疫化を必要とすることなく、ウイルス感染細胞を検出して除去するための迅速な応答および腫瘍細胞の免疫監視に関係している。
腫瘍およびウイルス感染症に対する自然免疫応答におけるその役割を考慮すると、NK細胞は、抗腫瘍免疫療法、炎症性および自己免疫障害ならびに臓器移植などの分野において革新的治療を開発するための努力において有望であり得る。
概要
一態様では、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む改変されたNK細胞が提供される。実施形態では、NK細胞は、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。実施形態では、NK細胞は、CD3タンパク質をさらに発現する。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖はδ2鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのγ鎖はγ9鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む。実施形態では、NK細胞は、NK92細胞、KHYG-1細胞、NKL細胞、NKG細胞、NK-YS細胞、HANK-1細胞、またはYT細胞を含む。実施形態では、NK細胞はNK92細胞を含む。実施形態では、NK細胞は、初代NK細胞を含む。他の実施形態では、NK細胞は、不死化NK細胞を含む。ある特定の実施形態では、NK細胞は、骨髄造血幹細胞前駆細胞(HSCPC)または胚幹細胞(ES細胞)に由来する。
一態様では、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む改変されたNK細胞が提供される。実施形態では、NK細胞は、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。実施形態では、NK細胞は、CD3タンパク質をさらに発現する。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖はδ2鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのγ鎖はγ9鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む。実施形態では、NK細胞は、NK92細胞、KHYG-1細胞、NKL細胞、NKG細胞、NK-YS細胞、HANK-1細胞、またはYT細胞を含む。実施形態では、NK細胞はNK92細胞を含む。実施形態では、NK細胞は、初代NK細胞を含む。他の実施形態では、NK細胞は、不死化NK細胞を含む。ある特定の実施形態では、NK細胞は、骨髄造血幹細胞前駆細胞(HSCPC)または胚幹細胞(ES細胞)に由来する。
一態様では、実質的なCD16発現を欠如するNK細胞が提供される。ある特定の実施形態では、NK細胞は、CD16発現の欠如に関して選択される。一部の実施形態では、CD16発現を欠如するNK細胞は、限界希釈およびモノクローナルNK細胞株の増大によって選択される。CD16タンパク質発現は、抗CD16抗体を使用するウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーを含む標準的な方法によって決定することができる。CD16 mRNA発現は、定量的RT-PCR、デジタルRT-PCR、または次世代RNA配列決定(すなわち、RNA-seq)を含む標準的な方法によって決定することができる。
さらなる態様では、NK細胞におけるCD16発現は拮抗される。ある特定の実施形態では、CD16発現は、CD16 mRNAを標的として、その発現を干渉する低分子RNAによって拮抗される。一部のそのような実施形態では、低分子RNAは、siRNA、miRNA、またはshRNAである。
別の態様では、CD16発現は、遺伝子編集系によってCD16遺伝子の1つまたは両方のコピーの発現を不活化することによって拮抗される。ある特定のそのような実施形態では、遺伝子編集系は、例えば、CRISPR/Cas系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(「TALEN」)系などのヌクレオチド誘導型ヌクレアーゼを含む。さらなる実施形態では、CD16発現は、標的化タンパク質分解体(targeted protein degrader)、例えばタンパク質分解標的化キメラ分子(「PROTAC」)分解体、分子糊分解体(molecular glue degrader)、またはユビキチンリガーゼ修飾因子によって拮抗される。
一態様では、NK細胞は、患者の血液から精製された初代NK細胞である。一部のそのような実施形態では、NK細胞は、例えば白血球アフェレーシスまたは密度勾配遠心分離などの当技術分野で公知の任意の方法によって精製される。ある特定の実施形態では、精製されたNK細胞を、ex vivoで増大させ、少なくとも1つのT細胞受容体をコードする1つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターを形質導入し、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む。さらにそのような実施形態では、NK細胞は、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。実施形態では、精製されたNK細胞を、ex vivoで増大させ、CD3タンパク質を発現させるためのベクターを細胞に形質導入する。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ2鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのγ鎖はγ9鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む。
別の態様では、精製されたNK細胞は、内因性のCD16遺伝子の1つまたは両方のコピーを不活化するように遺伝子編集された後、少なくとも1つのT細胞受容体および/または少なくとも1つのCD3タンパク質をコードするウイルスベクター(組み込み型または非組み込み型)を形質導入され、その後CD16の発現を欠如するNK細胞に関して選択された後、ex vivoで増大される。これらの実施形態のある特定のものでは、改変されたNK細胞は、NK細胞を最初に精製した患者に戻すように送達される。他の実施形態では、改変されたNK細胞は、異なる患者に送達される。
他の態様では、上記の改変されたNK細胞を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、NK92γδTCR細胞の医薬組成物は、CD16の阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、CD16アンタゴニストをさらに含む。CD16アンタゴニストは、siRNA、miRNA、shRNA、標的化タンパク質分解体、低分子阻害剤、抗CD16抗体等を含み得る。実施形態では、1つまたは複数の内因性のCD16遺伝子が、Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するNK細胞から不活化されるかまたは欠失される。ある特定の実施形態では、CD16のアンタゴニストは、医薬組成物とは別個に投与される。他の実施形態では、CD16の阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。
さらなる態様では、医薬組成物はがんを処置するために有用であり、組成物は、アミノビスホスホネート薬;および本明細書に記載される任意の改変されたNK細胞の組合せを含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、ゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。実施形態では、医薬組成物は、FDPSの阻害剤をさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、siRNA、shRNA、またはmiRNAを含む。
一態様では、アミノビスホスホネート薬;および本明細書に記載される任意の改変されたNK細胞の組合せを含む、がんを処置するための医薬組成物が提供される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。実施形態では、医薬組成物は、FDPSの阻害剤をさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、shRNAまたはmiRNAを含む。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される改変されたNK細胞のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫(neuroblastic tumor)、またはその混合物のうちの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのがんを有する。実施形態では、方法は、有効量のアミノビスホスホネート薬を対象に投与することをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたNK細胞とは別個に投与される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたNK細胞と共に投与される。実施形態では、方法は、有効量のFDPSの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、改変されたNK細胞とは別個に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤は、改変されたNK細胞と共に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤は、siRNA、shRNA、またはmiRNAを含む。
本開示において
本開示において
図6Bは、Vγ9Vδ2 T細胞受容体陽性NK92細胞のみがゾレドロン酸処置C8166細胞に応答したことを示すフローサイトメトリーデータを示す。
詳細な説明
概要
本開示は、T細胞受容体によって改変されているNK細胞およびそれらを使用して様々ながんを処置する方法に関する。実施形態では、T細胞受容体は、γδ T細胞受容体である。実施形態では、処置されるがんは、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん(mixed type)、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちのいずれか1つまたは複数である。
概要
本開示は、T細胞受容体によって改変されているNK細胞およびそれらを使用して様々ながんを処置する方法に関する。実施形態では、T細胞受容体は、γδ T細胞受容体である。実施形態では、処置されるがんは、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん(mixed type)、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちのいずれか1つまたは複数である。
定義および解釈
特に本明細書で定義していない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般的に使用される。本開示の方法および技術は一般的に、当技術分野で周知の通常の方法に従って、および特に示していない限り本明細書を通して引用および考察される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.(2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc.(2003)を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造元の仕様書に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および創薬化学に関連して使用される命名法、それらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。
特に本明細書で定義していない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般的に使用される。本開示の方法および技術は一般的に、当技術分野で周知の通常の方法に従って、および特に示していない限り本明細書を通して引用および考察される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.(2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc.(2003)を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造元の仕様書に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および創薬化学に関連して使用される命名法、それらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。当業者に明白ではない用語の使用がある場合、それが使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語の最大でプラスマイナス10%を意味する。
本明細書で使用される場合、活性剤「の投与」、または「投与すること」という用語は、処置を必要とする対象に、活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療的有効量でその個体の体に導入することができる形態で提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、「AGT418」、「AGT401」、および「AGT419」は、図5に例証されるベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「アミノビスホスホネート」という用語は、ビスホスホネートの任意のアミノ誘導体を指す。ビスホスホネートは、炭素に共有結合した2つのホスホネート基を含有する化学物質である。
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という用語または変化形、例えば「含む(comprises)」または「含むこと(comprising)」は、記載される整数または整数の群を含むことを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないと理解される。さらに、本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、限定なく含むことを意味する。「発現」、「発現された」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセスおよび/またはそれによって転写されたmRNAがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングまたは転写後修飾もしくは翻訳後修飾の他の形態を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ファルネシル二リン酸シンターゼ」という用語はまた、本明細書においてFDPSとも呼ばれ、本明細書においてファルネシルピロリン酸シンターゼまたはFPPSとも呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「ガンマデルタT細胞受容体」という用語は、少なくとも1つのガンマ鎖および少なくとも1つのデルタ鎖を含有する任意のT細胞受容体を指す。ガンマデルタT細胞受容体はまた、本明細書においてγδ T細胞受容体、GD T細胞受容体、またはgd T細胞受容体とも呼ばれ得る。
「in vivo」という用語は、生体内で起こるプロセスを指す。「ex vivo」という用語は、生体外で起こるプロセスを指す。例えば、in vivo処置は、患者の体内で起こる処置を指すが、ex vivo処置は、患者の体外であるが、依然としてその患者の組織を使用する、または組織にアクセスする、または組織と相互作用する処置を指す。その後、ex vivo処置ステップは、その後のin vivo処置ステップを含み得る。
「miRNA」という用語は、マイクロRNAを指し、本明細書において「miR」とも呼ばれ得る。「マイクロRNAクラスター」という用語は、互いに密接な近位でベクター上に存在し、共に同時発現される少なくとも2つのマイクロRNAを指す。
「ナチュラルキラー細胞」という用語(「NK細胞」としても公知である)は、自然免疫系において機能するタイプのリンパ球を指す。用語は、天然に存在する任意のナチュラルキラー細胞を包含する。用語はまた、任意の合成ナチュラルキラー細胞、例えば細胞株に由来するナチュラルキラー細胞も包含する。
「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現させるために使用することができる任意の細胞株を指す。
「パーセント同一性」という用語は、2つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、最大に一致するように比較および整列させた場合に、下記の配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTPおよびBLASTN、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム)の1つ、または目視検査を使用して測定した場合に同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する2つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較の場合、典型的に1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列に関するパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、Wis.中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータによるインプリメンテーションによって、または目視検査(一般的に、Ausubel et al.、下記を参照されたい)によって実行することができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されるBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイト上で公開されている。
2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(http://www.gcg.comで入手可能)を使用し、NWSgapdna.CMP行列、ならびに40、50、60、70、または80のギャップ重みおよび1、2、3、4、5、または6の長さ重みを使用して決定することができる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム(バージョン2.0)の中に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、PAM120重み付き残差表、ギャップ長さペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して決定することもできる。加えて、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを使用して、Blossum62行列またはPAM250行列のいずれか、および16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重み、および1、2、3、4、5、または6の長さ重みを使用して決定することができる。
本開示の核酸およびタンパク質配列を、さらに「クエリ配列」として使用して、公共のデータベースに対して検索し、例えば近縁の配列を同定することができる。そのような検索は、Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実施することができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12によって実施し、核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3によって実施し、タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「配列番号(SEQ ID NO)」という用語は「配列番号(Sequence ID No.)」という用語と同義である。
本明細書で使用される場合、「配列番号(SEQ ID NO)」という用語は「配列番号(Sequence ID No.)」という用語と同義である。
本明細書で使用される場合、「低分子RNA(small RNA)」は、一般的に長さ約200ヌクレオチド未満またはそれ未満であり、サイレンシングまたは干渉機能を保有する非コードRNAを指す。他の実施形態では、低分子RNAは、長さが約175ヌクレオチドもしくはそれ未満、約150ヌクレオチドもしくはそれ未満、約125ヌクレオチドもしくはそれ未満、約100ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約75ヌクレオチドもしくはそれ未満である。そのようなRNAは、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、および短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を含む。本開示の「低分子RNA」は、例えば標的遺伝子mRNAの破壊をもたらす経路を通して、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害またはノックダウンすることが可能でなければならない。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト患者を含むが、同様に他の哺乳動物も含む。「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「治療有効量」という用語は、所定の病気、傷害、疾患、または状態に罹患している患者において認められる症状、進行または合併症の発症を処置または防止するために好適な組成物において好適な剤形での活性剤の十分量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度の状況、処置される対象の年齢、体重等に応じて変化する。治療有効量は、例えば投与経路、対象の状態、ならびに当業者によって理解される他の要因を含むいくつかの要因のいずれかに応じて変化し得る。
「処置」または「処置すること」という用語は、一般的に処置される対象の自然経過を変更する試みの介入を指し、予防のために、または臨床病理学の経過の間に実施され得る。所望の効果は、これらに限定されないが、疾患の発生または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾患の任意の直接または間接的な病的帰結を抑制する、減少させる、または阻害すること、疾患状態を改善または緩和すること、および寛解または改善された予後を引き起こすことを含む。
本明細書で使用される場合、「Vγ9Vδ2」という用語は、ブチロフィリンのコンフォメーション変化を認識することが可能なタイプのγδ受容体を指す。Vγ9Vδ2という用語は、Vg9Vd2と同義である。Vγ9Vδ2は、Vγ9JPVδ2(Vg9JPVd2)の略語である。Vは領域を指し、V2領域、V3領域、V4領域、V8領域、およびV9領域のうちのいずれか1つまたは複数を含み得る。γは、少なくとも1つのγ鎖を指し、定常領域C1およびC2のうちのいずれか1つまたは複数を含み得る。Jは、少なくとも1つのJ領域を指し、JP1領域、JP領域、J1領域、JP2領域、およびJ2領域のうちのいずれか1つまたは複数を含み得る。
本開示の態様および実施形態の説明
一態様では、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む、改変されたNK細胞が提供される。実施形態では、NK細胞は少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。
一態様では、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む、改変されたNK細胞が提供される。実施形態では、NK細胞は少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。
実施形態では、NK細胞は、CD3タンパク質複合体をさらに発現する。実施形態では、CD3タンパク質複合体は、CD3タンパク質ガンマ、デルタ、イプシロン、およびゼータのうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、NK細胞は、それが、CD3タンパク質-CD3タンパク質ガンマ、CD3タンパク質デルタ、CD3タンパク質イプシロン、およびCD3タンパク質ゼータの各々を含有するように改変される。実施形態では、NK細胞においてCD3タンパク質を発現させるために使用するベクターはAGT419である(図5を参照されたい)。
実施形態では、CD3タンパク質を発現するベクターは、配列番号9と少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号9と少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、CD3タンパク質を発現するベクターは配列番号9を含む。
実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ2鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのγ鎖はγ9鎖を含む。
実施形態では、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む。実施形態では、Vγ9Vδ2 T細胞受容体は天然に存在する。実施形態では、Vγ9Vδ2 T細胞受容体は合成である。実施形態では、NK細胞においてVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現させるために使用するベクターはAGT418である(図5を参照されたい)。
実施形態では、Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するベクターは、配列番号5と少なくとも80%の配列同一性、例えば配列番号5と少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するベクターは配列番号5を含む。
実施形態では、NK細胞は、NK92細胞、KHYG-1細胞、NKL細胞、NKG細胞、NK-YS細胞、HANK-1細胞、またはYT細胞を含む。実施形態では、NK細胞は、NK92細胞を含む。実施形態では、NK細胞は、任意の公知のNK細胞株に由来するNK細胞を含む。
実施形態では、NK細胞は、初代NK細胞を含む。
一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、アミノビスホスホネート薬;および本明細書に記載される任意の改変されたNK細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、ゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。
実施形態では、医薬組成物は、FDPSの阻害剤をさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、低分子RNAである。実施形態では、低分子RNAは、siRNA、shRNA、またはmiRNAを含む。
実施形態では、shRNAは、配列番号50、51、52、または53のいずれかと少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号50、51、52、または53のいずれかと少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、shRNAは、配列番号50、51、52、または53のいずれかを含む。
実施形態では、マイクロRNAは、配列番号64、65、または66のいずれかと少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号64、65、または66のいずれかと少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、マイクロRNAは、配列番号64、65、または66のいずれかを含む。
実施形態では、ベクターを使用して低分子RNAを発現させる。実施形態では、使用されるベクターはAGT401である(図5を参照されたい)。実施形態では、AGT401のshRNAカセットを、siRNAまたはmiRNAの代わりに使用する。実施形態では、AGT401の転写のH1プロモーターを、転写のEF1αプロモーターの代わりに使用する。
一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの競合的阻害剤;および本明細書に記載される任意の改変されたNK細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。実施形態では、酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの競合的阻害剤は、ゾレドロン酸、アレンドロネート、パミドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、またはエチドロネートを含む。
一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、ビスホスホネートまたはアミノビスホスホネート化合物;および本明細書に記載される任意の改変されたNK細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される改変されたNK細胞のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。
実施形態では、NK細胞はVγ9Vδ2受容体を発現する。実施形態では、Vγ9Vδ2受容体は、ブチロフィリンを認識してこれと複合体を形成する。実施形態では、ブチロフィリンは、コンフォメーション変化を受けている。実施形態では、ブチロフィリンは、がん細胞に由来する。実施形態では、ブチロフィリンは、高レベルのイソペンテニルピロリン酸(IPP)の結果として腫瘍細胞においてコンフォメーション変化を受ける。
実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのがんを有する。実施形態では、対象は、本明細書に開示される任意のがんを有する。
実施形態では、方法は、有効量のアミノビスホスホネート薬を対象に投与することをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。
実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたNK細胞とは別個に投与される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたNK細胞と共に投与される。
実施形態では、方法は、有効量のFDPSの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、改変されたNK細胞とは別個に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤は、改変されたNK細胞と共に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤は、shRNA、マイクロRNA、またはsiRNAを含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、任意の低分子RNAである。
実施形態では、shRNAは、配列番号50、51、52、または53のいずれかと少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号50、51、52、または53のいずれかと少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、shRNAは、配列番号50、51、52、または53のいずれかを含む。
実施形態では、マイクロRNAは、配列番号64、65、または66のいずれかと少なくとも80%の配列同一性、例えば、配列番号64、65、または66のいずれかと少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。実施形態では、マイクロRNAは、配列番号64、65、または66のいずれかを含む。
一態様では、がんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのがんを有する。実施形態では、対象は、本明細書に記載される任意のがんを有する。
実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、方法は、有効量のFDPSの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、FDPSの阻害剤は、医薬組成物とは別個に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。実施形態では、FDPSの阻害剤はshRNAまたはマイクロRNAである。
ここで図1に注目し、これはVγ9Vδ2 T細胞受容体によって改変されたNK細胞を示す。天然に存在するNK受容体、例えば中でもNKG2d、NKp30、44、および46と、外因性のVγ9Vδ2 T細胞受容体との組合せは、細胞内シグナル伝達の増強を引き起こす。実施形態では、この増強されたシグナル伝達は、腫瘍およびがん細胞の死滅において有効であるエフェクター細胞を作製する。
ここで図2に注目し、これはVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するようにNK92細胞を改変するために使用することができるベクターであるレンチウイルスベクターAGT418を生成するための3プラスミド系を示す(図5を参照されたい)。個々のプラスミドは、ベクターパッケージングのための構造タンパク質をコードするAGTヘルパープラスRev;Rev調節エレメントをコードするAGT Revプラスミド;VSV-Gエンベロープ糖タンパク質をコードするAGTエンベローププラスミド;およびVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミドである。
ここで図3に注目し、これはVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するようにNK92細胞を改変するために使用することができるベクターであるレンチウイルスベクターAGT418を生成するための4プラスミド系を示す(図5を参照されたい)。個々のプラスミドは、ベクターパッケージングのための構造および調節タンパク質をコードするAGTヘルパープラスミド:VSV-Gエンベロープ糖タンパク質をコードするAGTエンベローププラスミド;およびVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミドである。
ここで図4に注目し、これは、(i)CD3タンパク質(ガンマ、デルタ、イプシロンおよびゼータ)を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミド、および(ii)ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を下方調節するためのマイクロRNAを発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミド(AGT401;図5を参照されたい)を示す。実施形態では、本明細書で記載されるように、CD3遺伝子を有するベクターを使用してNK92細胞を改変する(CD3タンパク質は、NK92において発現されないが、T細胞受容体機能にとって必要である)。実施形態では、ベクター(AGT401;図5を参照されたい)を使用して、NK92-Vγ9Vδ2 T細胞受容体エフェクター細胞株の特徴付けのための腫瘍細胞を改変した。これらのプラスミドを、3プラスミドパッケージング系においてAGTヘルパープラスRevプラスミドおよびAGTエンベローププラスミドと共に(図2を参照されたい)、または4プラスミド系においてAGTヘルパープラスミド、AGT Revプラスミド、およびAGTエンベローププラスミド(図3を参照されたい)と共に使用して、レンチウイルスベクター粒子を製造することができる。
ナチュラルキラー細胞
ナチュラルキラー細胞(NK細胞としても公知である)は、自然免疫系において機能するタイプのリンパ球である。NK細胞は、MHC分子に結合しているいかなる特定のエピトープまたはネオエピトープペプチドとも無関係に、感染した細胞表面上のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を認識することが可能である;しかし、それらはまた、MHCを必要とすることなく、ストレスを受けた細胞を認識することも可能である。このように、アルファ/ベータ型T細胞受容体を発現するT細胞、すなわちCD4およびCD8 T細胞とは異なり、NK細胞は、細胞表面MHCがほとんどないかまたは全くない有害な細胞を認識して破壊することが可能である。
ナチュラルキラー細胞(NK細胞としても公知である)は、自然免疫系において機能するタイプのリンパ球である。NK細胞は、MHC分子に結合しているいかなる特定のエピトープまたはネオエピトープペプチドとも無関係に、感染した細胞表面上のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を認識することが可能である;しかし、それらはまた、MHCを必要とすることなく、ストレスを受けた細胞を認識することも可能である。このように、アルファ/ベータ型T細胞受容体を発現するT細胞、すなわちCD4およびCD8 T細胞とは異なり、NK細胞は、細胞表面MHCがほとんどないかまたは全くない有害な細胞を認識して破壊することが可能である。
NK細胞表面受容体は、細胞媒介性の細胞傷害およびサイトカイン産生を誘発することができる。NK細胞は、その細胞質内部に、パーフォリンおよびグランザイムなどの細胞傷害性分子を放出して標的細胞の溶解を誘導することができる細胞溶解性顆粒を産生することができる。NK細胞はまた、IFN-γおよびTNFαサイトカインも分泌することができ、これらは標的細胞のファゴサイトーシスおよび溶解をもたらし得る。さらに、NK細胞は、標的細胞が病原体抗原を認識する抗体によってタグ付けされている場合には、抗体依存性細胞傷害を通して、標的細胞、例えば腫瘍細胞を除去することができる。標的細胞を溶解するその能力の他に、NK細胞はまた、サイトカインおよびケモカイン放出を通した炎症性免疫応答の促進にも関与する。
ガンマ/デルタT細胞およびガンマ/デルタT細胞受容体
ヒトガンマ/デルタT細胞は、各細胞において使用される特定のデルタ鎖に従って群分けされ、特徴付けられる。最も一般的なものは、血液中および二次リンパ系組織において一般的であるデルタ2鎖(Vd2として記載)である。次に一般的であるのは、血液および粘膜上皮に出現するデルタ1細胞(Vd1)である。Vd3およびVd5細胞の微量の集団は広く分布し、特化した機能を有する。最も重要なことに、ガンマ/デルタTCRはしばしば、非ペプチド抗原の存在と反応し、ほとんどがMHCタンパク質とは独立している。各事例は固有であるが、ガンマ/デルタT細胞は、それらがMHC機能を必要とせず、T細胞受容体レパートリーの多様性の強力な促進因子が存在しないことから、集団における無関係な個体の中であっても非常に類似であり得る。腫瘍のガンマ/デルタT細胞認識は、例えば、同じ種の細胞に限定されるが、同種性または移植片対宿主病に関与するという概念は、ガンマ/デルタT細胞に当てはまらない。
ヒトガンマ/デルタT細胞は、各細胞において使用される特定のデルタ鎖に従って群分けされ、特徴付けられる。最も一般的なものは、血液中および二次リンパ系組織において一般的であるデルタ2鎖(Vd2として記載)である。次に一般的であるのは、血液および粘膜上皮に出現するデルタ1細胞(Vd1)である。Vd3およびVd5細胞の微量の集団は広く分布し、特化した機能を有する。最も重要なことに、ガンマ/デルタTCRはしばしば、非ペプチド抗原の存在と反応し、ほとんどがMHCタンパク質とは独立している。各事例は固有であるが、ガンマ/デルタT細胞は、それらがMHC機能を必要とせず、T細胞受容体レパートリーの多様性の強力な促進因子が存在しないことから、集団における無関係な個体の中であっても非常に類似であり得る。腫瘍のガンマ/デルタT細胞認識は、例えば、同じ種の細胞に限定されるが、同種性または移植片対宿主病に関与するという概念は、ガンマ/デルタT細胞に当てはまらない。
Vg9Vd2 T細胞の特定の例では、認識機構は十分に研究されている。腫瘍細胞は、正常細胞と比較して高い増殖指数を有し、しばしばブチロフィリンファミリーからの共通のタンパク質を発現することは公知である。高い増殖およびその後の高い膜合成要求のために、腫瘍細胞は、コレステロール生合成経路において炭素数5個のイソプレノイドであるイソペンテニルピロリン酸(IPP)を含む中間分子を過剰産生する。異常に高い細胞質レベルのIPPは、細胞表面ブチロフィリンに結合してコンフォメーション変化を引き起こす。Vg9Vd2 TCRは、このコンフォメーション変化を認識して、それが危険なシグナルであると解釈するように進化した。Vg9Vd2 TCR:ブチロフィリン複合体の形成は、ガンマデルタT細胞を活性化して増殖および分化を引き起こす。活性化された細胞は、サイトカインを産生し、しばしば自然の腫瘍監視機構の一部として強力に細胞傷害性となる。ブチロフィリン遺伝子は全てのヒトにおいてほぼ同一であることから、1人の人のVg9Vd2 T細胞は、自身の腫瘍細胞または他者からの腫瘍細胞を認識するために等しく効率的である。ブチロフィリンは、ほとんどの腫瘍細胞上に発現され、増殖(より高いIPP)は、がんの一般的な特色であることから、Vg9Vd2 T細胞を、MHCの差異によらず、主に腫瘍タイプによらず、がん治療のために利用することができる。Vg9Vd2 T細胞は、腫瘍の認識および破壊にとってほぼ普遍的であるものを構成する。
天然に存在するガンマ/デルタTCRを発現する操作されたNK細胞
NK細胞を、天然に存在するガンマ/デルタTCRを発現するように操作することができる。実施形態では、操作された細胞は、強い活性化および強力な腫瘍細胞死滅能を実証する。実施形態では、操作されたNK細胞の目的は、がん治療における天然のガンマデルタT細胞の代わりとなる産物を産生すること、腫瘍エフェクター細胞の無尽蔵の供給源となること、およびがんを有する全ての人において等しく機能することである。
NK細胞を、天然に存在するガンマ/デルタTCRを発現するように操作することができる。実施形態では、操作された細胞は、強い活性化および強力な腫瘍細胞死滅能を実証する。実施形態では、操作されたNK細胞の目的は、がん治療における天然のガンマデルタT細胞の代わりとなる産物を産生すること、腫瘍エフェクター細胞の無尽蔵の供給源となること、およびがんを有する全ての人において等しく機能することである。
遺伝子操作されたNK細胞の最大の効力に対する重要な障壁は、形質導入された細胞集団内の不均一性である。不均一性により、細胞集団は、集団内の個々の細胞に関して認められるレベルよりはるかに低い効力で腫瘍細胞死滅に関して機能する。形質導入細胞における不均一性はまた、各形質導入が、固有の不均一な集団を生成すると予想され、臨床での使用のための適合性に関して製品の安全性の解析を複雑にすることから、製品製造の実現可能性にも影響を及ぼす。
実施形態では、不均一性の問題を軽減することは、不均一な形質導入細胞集団から出発してクローニングされた細胞株を生成することを伴う。クローニングされた細胞株は、個々の細胞から生成されることから、高レベルの均一性が維持される。さらに、クローニングされた細胞株を特徴付けて、γδTCR発現レベルおよび腫瘍細胞に対する機能的応答を決定することができる。実施形態では、クローニングされた細胞株の特徴付けは、がん治療にとって最も好適である個々のクローニングされた細胞株の選択を可能にする。
CD16
驚くべきことに、本発明者らは、実質的なCD16発現を欠如するNK細胞が、Vγ9Vδ2 T細胞受容体の発現の増強ならびに/またはがん細胞の認識および溶解の増強を示すことを発見した。
驚くべきことに、本発明者らは、実質的なCD16発現を欠如するNK細胞が、Vγ9Vδ2 T細胞受容体の発現の増強ならびに/またはがん細胞の認識および溶解の増強を示すことを発見した。
一態様では、実質的なCD16発現を欠如するNK細胞が提供される。ある特定の実施形態では、NK細胞は、CD16発現の欠如に関して選択される。一部の実施形態では、CD16発現を欠如するNK細胞は、モノクローナルNK細胞株の限界希釈および増大によって選択される。CD16タンパク質発現は、抗CD16抗体を使用するウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーを含む標準的な方法によって決定することができる。CD16 mRNA発現は、定量的RT-PCR、デジタルRT-PCR、または次世代RNA配列決定(すなわち、RNA-seq)を含む標準的な方法によって決定することができる。
さらなる態様では、NK細胞におけるCD16発現は、拮抗される。ある特定の実施形態では、CD16発現は、CD16 mRNAを標的とし、その発現を干渉する低分子RNAによって拮抗される。一部のそのような実施形態では、低分子RNAは、siRNA、miRNA、またはshRNAである。
別の態様では、CD16発現は、遺伝子編集によってCD16の1つまたは両方のコピーの発現を不活化することによって拮抗される。ある特定のそのような実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレオチド誘導型ヌクレアーゼ、例えばCRISPR/Cas系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(「TALEN」)系を含む。さらなる態様では、CD16は、標的化タンパク質分解体、例えばタンパク質分解標的化キメラ分子(「PROTAC」)分解体、分子糊分解体、またはユビキチンリガーゼ修飾因子によって拮抗される。
一態様では、NK細胞は、患者の血液から精製された初代NK細胞である。一部のそのような実施形態では、NK細胞は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば白血球アフェレーシスまたは密度勾配遠心分離によって精製される。ある特定の実施形態では、精製されたNK細胞は、ex vivoで増大され、少なくとも1つのT細胞受容体をコードする1つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターを形質導入され、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む。さらにそのような実施形態では、NK細胞は、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む。実施形態では、精製されたNK細胞は、ex vivoで増大され、CD3タンパク質の発現のためのベクターを形質導入される。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖は、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも1つのδ鎖はδ2鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのγ鎖はγ9鎖を含む。実施形態では、少なくとも1つのT細胞受容体は、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む。
別の態様では、精製されたNK細胞は、内因性のCD16遺伝子の1つまたは両方のコピーを不活化するように遺伝子編集された後、少なくとも1つのT細胞受容体および/または少なくとも1つのCD3タンパク質をコードするウイルスベクター(組み込み型または非組み込み型)を形質導入され、次いでCD16の発現の欠如に関してNK細胞を選択した後、ex vivoで増大させる。これらの実施形態のある特定のものでは、改変されたNK細胞は、NK細胞が最初に精製された患者に戻すように送達される。他の実施形態では、改変されたNK細胞は、異なる患者に送達される。
他の態様では、上記の改変されたNK細胞を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、CD16アンタゴニストをさらに含む。CD16アンタゴニストは、siRNA、miRNA、shRNA、標的化タンパク質分解体、低分子阻害剤、抗CD16抗体等を含み得る。ある特定の実施形態では、CD16のアンタゴニストは、医薬組成物とは別個に投与される。他の実施形態では、CD16の阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。
別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍のための治療として、gdTCR発現ならびに腫瘍細胞のその後の認識および死滅を容易にするために、NK細胞におけるCD16レベルを減少させる方法が提供される。方法は、阻害性RNAの最適な標的部位を規定するために自由に利用可能な標準的な生物分析ツールを使用してCD16 mRNAコード配列のバイオインフォマティクス解析を伴う。可能性がある標的部位のコレクションを、CD16 mRNA配列に関して5から20の間の番号をつけて編集する。これらの標的と相補的な配列(ガイド配列)を有する短鎖干渉RNA(siRNA)分子を、合成することができ、または供給業者から得ることができる。
siRNAガイド配列は、プラスミド構築物の形態で直接的なRNAトランスフェクションを介して細胞に送達され得るまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにコードされ得る。siRNAを、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)またはマイクロRNA(miRNA)の骨格と組み合わせてもよい。好適なshRNAまたはmiRNA骨格は、当技術分野で公知であり、必要に応じてsiRNA、shRNA、またはmiRNAプラスプロモーター/エンハンサー領域および転写ターミネーターを含む好適な発現クローンを構築するためのプロセスは、分子生物学の当業者に公知である。shRNAおよびmiRNA構築物は、RNAまたはDNAの形態で細胞または組織に送達され、細胞酵素によってプロセシングされて、siRNA配列を放出する。siRNAは、標的部位でCD16 mRNAとアニールし、RNA切断、脱安定化、および分解を促進する。個々のsiRNAの効果を、細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較し、細胞表面上のCD16 mRNA、およびCD16タンパク質レベルの低減の程度を決定することができる。さらなる試験を、標準的なアプローチを使用して行って、最も強力なsiRNAの安全性および特異性を評価することができ、最終的なsiRNAまたは複数のsiRNAを、NK細胞改変のために選択する。
初代細胞および不死化細胞を含むNK細胞、または骨髄造血幹細胞前駆細胞(HSCPC)、または胚幹細胞(ES細胞)を使用することができる。これらの細胞を、強力、特異的、および安全なガイド配列を含有するsiRNA、shRNA、またはmiRNAによって処置し、CD16 mRNAおよびタンパク質レベルを低減させることができる。siRNA、shRNA、またはmiRNAを、公知の方法を使用するトランスフェクションによってRNA形態で送達することができ、またはDNAプラスミドのトランスフェクションによって送達することができ、または好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを使用する形質導入によって送達することができる。
CD16特異的siRNAによって安定にまたは一過性に処置したNK細胞、細胞株、HSCPC、またはES細胞を、DNAプラスミドトランスフェクションまたは組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターによる形質導入を使用して、CD3タンパク質複合体をコードする遺伝子によって処置することができる。処置した細胞を、CD3タンパク質の発現およびガンマデルタT細胞受容体の細胞表面発現に関して試験することができる。CD3およびgdTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物から選択し、クローニングし、および富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。
これらの方法を使用して、gdTCRを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なNK細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたHSCPCまたはES細胞を、改変されたNK細胞がそのがんに対して治療的であるがんに罹患している対象に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたNK、HSCPC、またはES細胞によって処置してもよい。
別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、タンパク質の発現を防止し、このようにgdTCR発現、ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞におけるCD16遺伝子を編集する方法が提供される。方法は、自由に利用可能な標準的な生物分析ツールを使用して、ガイドRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識、またはTALEN認識の最適な標的部位を規定するために、または他の公知の遺伝子編集系の標的としての、CD16遺伝子配列のバイオインフォマティクス解析を伴う。可能性があるガイド配列のコレクションを、CD16遺伝子に関して5から20の間の番号をつけて編集する。ガイドRNA分子または適切に標的化されたジンクフィンガーまたはTALENヌクレアーゼ系を、合成してもよく、または供給業者から得てもよい。
編集構築物は、プラスミド構築物の形態で直接的なRNAトランスフェクションを介して細胞に送達され得るまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにおいてコードされ得る。DNA編集酵素、例えばCRISPR/Cas9およびその誘導体および類似の系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALEN分子は、精製RNAとしてトランスフェクションによって送達してもよく、またはプラスミドDNAを使用するトランスフェクションによって、または形質導入により編集機構を送達することが可能な好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを操作することによって送達され得る。好適なガイドRNAおよび編集機構は当技術分野で公知であり、必要に応じてガイドRNAおよび酵素コード配列プラスプロモーター/エンハンサー領域および転写ターミネーターを含む好適な発現クローンを構築するためのプロセスは、分子生物学の当業者に公知である。編集構築物は、RNAまたはDNAの形態で細胞または組織に送達される。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALEN分子におけるガイドRNAまたは操作された部位認識エレメントは、CD16遺伝子における標的配列を認識し、変異および/または欠失を導入して遺伝子発現を不活化する。個々の遺伝子編集構築物を細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較して、二対立遺伝子性のCD16遺伝子改変の効率を決定する。標準的なアッセイを使用するさらなる試験を使用して、NK、細胞株、HSCPC、またはES細胞を編集するための最も効率的な遺伝子編集アプローチの安全性および特異性を評価することができる。
別の態様では、CD16対立遺伝子の二対立遺伝子性の改変を有するNK細胞、NK細胞株、HSCPC、またはES細胞に、適切な組み込み型もしくは非組み込み型ベクターを形質導入するか、またはCD3タンパク質およびガンマデルタT細胞受容体をコードするRNAもしくはプラスミドDNAをトランスフェクトする。CD3およびTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。これらの方法を使用して、gdTCRを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なNK細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたHSCPCまたはES細胞を、遺伝子改変されたNK細胞がそのがんの処置において治療的であるがんに罹患している対象に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたNK、HSCPC、またはES細胞によって処置してもよい。
CD3
別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍の治療のために、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞においてCD3タンパク質を過剰発現させる方法が提供される。方法は、強いプロモーターの制御下でCD3タンパク質コード領域を発現するプラスミドDNA、または組み込み型ウイルスベクターもしくは非組み込み型ウイルスベクターを構築することを伴う。そのようなプロモーターとしては、CMV前初期遺伝子プロモーターに類似のウイルスプロモーター、SV40前初期プロモーター、増強されたアルブミンプロモーター、増強されたグロビンプロモーター、またはCD3タンパク質を持続的に高レベルで発現させることが可能な任意の起源の任意の他のウイルスもしくは非ウイルス性遺伝子プロモーターが挙げられ得る。
別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍の治療のために、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞においてCD3タンパク質を過剰発現させる方法が提供される。方法は、強いプロモーターの制御下でCD3タンパク質コード領域を発現するプラスミドDNA、または組み込み型ウイルスベクターもしくは非組み込み型ウイルスベクターを構築することを伴う。そのようなプロモーターとしては、CMV前初期遺伝子プロモーターに類似のウイルスプロモーター、SV40前初期プロモーター、増強されたアルブミンプロモーター、増強されたグロビンプロモーター、またはCD3タンパク質を持続的に高レベルで発現させることが可能な任意の起源の任意の他のウイルスもしくは非ウイルス性遺伝子プロモーターが挙げられ得る。
CD3発現構築物は、プラスミド構築物の形態で直接的なRNAトランスフェクションを介して細胞に送達されるまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにおいてコードされる。CD3発現の定量的解析を、抗体染色およびフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または当技術分野で公知の任意の好適な技術を使用して実施し、高レベルのCD3発現を確認する。
高レベルのCD3タンパク質発現を有するNK細胞、細胞株、HSCPC、またはES細胞に、適切な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを形質導入するか、またはガンマデルタ T細胞受容体をコードするRNAもしくはプラスミドDNAをトランスフェクトする。CD3およびgdTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解する能力に関して試験する。これらの方法を使用して、gdTCRを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なNK細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたHSCPCまたはES細胞を、遺伝子改変NK細胞がin vivoで産生され得、そのがんに対して治療的であることを期待してがんに罹患している人に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたNK、HSCPC、またはES細胞によって処置してもよい。
がん
本明細書に提供される組成物および方法はがんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞、がん性組織であってもよく、がん性組織を有してもよく、または疾患もしくは状態を発症していると診断されたもしくは発症するリスクがある対象もしくは患者であってもよい。ある特定の態様では、細胞は、上皮、内皮、中皮、グリア、間質、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、これらに限定されないが、脳、ニューロン、血液、子宮内膜、髄膜、食道、肺、心血管、肝臓、リンパ系、乳房、骨、結合組織、脂肪、網膜、甲状腺、腺、副腎、膵臓、胃、腸、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸部(cervical)、精巣、脾臓、皮膚、平滑筋、心筋、または横紋筋細胞を含み得、これらはまた、前述のいずれかからのがん細胞集団を含み得、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、または前述の混合物の1つまたは複数に関連し得る。なおさらなる態様では、がんは、これらに限定されないが、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、血管肉腫、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、肝芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、神経鞘腫、小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
本明細書に提供される組成物および方法はがんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞、がん性組織であってもよく、がん性組織を有してもよく、または疾患もしくは状態を発症していると診断されたもしくは発症するリスクがある対象もしくは患者であってもよい。ある特定の態様では、細胞は、上皮、内皮、中皮、グリア、間質、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、これらに限定されないが、脳、ニューロン、血液、子宮内膜、髄膜、食道、肺、心血管、肝臓、リンパ系、乳房、骨、結合組織、脂肪、網膜、甲状腺、腺、副腎、膵臓、胃、腸、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸部(cervical)、精巣、脾臓、皮膚、平滑筋、心筋、または横紋筋細胞を含み得、これらはまた、前述のいずれかからのがん細胞集団を含み得、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、または前述の混合物の1つまたは複数に関連し得る。なおさらなる態様では、がんは、これらに限定されないが、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、血管肉腫、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、肝芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、神経鞘腫、小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
本明細書に提供される組成物および方法はまた、NSCLC(非小細胞肺がん)、小児悪性疾患、ヒトパピローマウイルス(HPV)によって引き起こされるまたは促進される子宮頸部または他の腫瘍、黒色腫、バレット食道(前悪性症候群)、副腎および皮膚のがん、および自己免疫、新生物性皮膚疾患を処置するためにも使用される。
治療ベクター
本構築物は、これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスベクター、タンパク質および/または脂質複合体、リポソーム、ミセル、およびその他を含む公知のトランスフェクションおよび/または形質導入ベクターを介して送達することができる。
本構築物は、これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスベクター、タンパク質および/または脂質複合体、リポソーム、ミセル、およびその他を含む公知のトランスフェクションおよび/または形質導入ベクターを介して送達することができる。
ウイルスベクターは、本開示の方法にとって有用な細胞タイプ(すなわち、腫瘍細胞または骨髄性細胞)を優先的に標的とすることができる。ウイルスベクターは、特定のウイルスエンベロープ-宿主細胞受容体相互作用およびウイルスの遺伝子発現機構により、遺伝子を標的細胞に形質導入するために使用することができる。その結果、ウイルスベクターは、胚全体、受精卵、単離された組織試料、in situでの組織標的、および培養細胞株を含む多くの異なる細胞タイプに遺伝子を導入するためのビヒクルとして使用されている。細胞において外来遺伝子を導入して発現させる能力は、遺伝子発現研究、細胞株列の解明、ならびに遺伝子治療、人工多能性幹細胞の体細胞リプログラミング、および様々なタイプの免疫療法などの治療介入の潜在性を提供するために有用である。パポバウイルス科(例えば、ウシパピローマウイルスまたはBPV)またはヘルペスウイルス科(例えば、エプスタインバーウイルスまたはEBV)、またはヘパドナウイルス科(例えば、B型肝炎ウイルスまたはHBV)、またはワクシニアを含むポックスベクターのようなウイルスに由来するウイルス成分を、本開示のベクターに使用してもよい。
レンチウイルスベクターは、本開示の組成物および方法にとって好ましいタイプのベクターであるが、本開示は、レンチウイルスベクターに具体的に限定されない。レンチウイルスは、宿主細胞に有意な量のウイルス核酸を送達することができるウイルス属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染/形質導入する固有の能力を有するとして特徴付けられ、形質導入後、レンチウイルスは、宿主細胞の染色体にその核酸を組み込む。
感染性のレンチウイルスは、ビルレンスタンパク質gag、pol、およびenvをコードする3つの主な遺伝子、ならびにtatおよびrevを含む2つの制御遺伝子を有する。特定の血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の制御、合成、および/またはプロセシング、ならびに他の複製機能に関係するタンパク質をコードする追加のアクセサリ遺伝子が存在し得る。
その上、レンチウイルスは、末端反復配列(LTR)領域を含有し、これはおよそ600nt長であり得る。LTRは、U3、R、およびU5領域に分割され得る。LTRは、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体にレトロウイルスDNAの組み込みを媒介することができる。あるいは、機能的インテグラーゼが存在しない場合、LTRを使用して、ウイルス核酸を環状化してもよい。
レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質は、逆転写酵素およびインテグラーゼを含む。逆転写酵素はウイルスによりコードされるRNA依存性DNAポリメラーゼである。酵素は、相補的DNAコピーを合成するための鋳型として、ウイルスRNAゲノムを使用する。逆転写酵素はまた、RNA鋳型を破壊するためのRNaseH活性も有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されたウイルスcDNAと宿主DNAの両方に結合する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主DNAに挿入する前にLTRをプロセシングする。tatは、開始および伸長を増強するために転写の際のトランス活性化剤として作用する。rev応答エレメントは、転写後に作用して、mRNAスプライシングおよび細胞質への輸送を調節する。
ウイルスベクターは、一般的に糖タンパク質を含み、様々な糖タンパク質が特異的親和性を提供し得る。例えば、VSVGペプチドは、骨髄細胞へのトランスフェクションを増加させることができる。あるいは、ウイルスベクターはまた、そのシェルペプチドに結合した抗体などの標的化部分も有し得る。標的化抗体は、例えばHER-2、PSA、CEA、M2-PK、およびCA19-9などの、腫瘍において過剰発現される抗原に対して特異的であり得る。
他のウイルスベクターの特異性もまた、当技術分野で公知であり、特定の細胞集団を標的化するために使用することができる。例えば、ポックスウイルスベクターは、マクロファージおよび樹状細胞を標的とする。
レンチウイルスベクター系
レンチウイルスビリオン(粒子)は、必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現され、ビリオン(ウイルス粒子)を産生する。プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組み込みのために必要なレンチウイルスpolタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも1つのベクターが存在する。別の実施形態では、polタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結されたウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスgagタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターもまた存在する。一実施形態では、このgag核酸配列は、pol核酸配列の少なくとも一部とは別個のベクターに存在する。別の実施形態では、gag核酸は、polタンパク質をコードする全てのpol核酸配列とは別個のベクターに存在する。
レンチウイルスビリオン(粒子)は、必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現され、ビリオン(ウイルス粒子)を産生する。プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組み込みのために必要なレンチウイルスpolタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも1つのベクターが存在する。別の実施形態では、polタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結されたウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスgagタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターもまた存在する。一実施形態では、このgag核酸配列は、pol核酸配列の少なくとも一部とは別個のベクターに存在する。別の実施形態では、gag核酸は、polタンパク質をコードする全てのpol核酸配列とは別個のベクターに存在する。
複数の改変をベクターに行ってもよく、それらを使用して、野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小限にするための粒子を作製する。これらとしては、これらに限定されないが、LTRのU3領域の欠失、tat欠失、およびマトリックス(MA)欠失が挙げられる。
gag、polおよびenvベクター(複数可)は、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれるレンチウイルスRNAをパッケージングするレンチウイルスゲノムからのヌクレオチドを含有しない。
粒子を形成するベクター(複数可)は、好ましくはエンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノムからの核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターを使用する。このenvベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、env核酸配列はレンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルスに由来せず、異なるウイルスに由来する。得られた粒子はシュードタイプ粒子と呼ばれる。エンベロープを適切に選択することによって、実質的に任意の細胞に「感染させる」ことができる。例えば、インフルエンザウイルス、VSV-G、アルファウイルス(セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス)、アレナウイルス(リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス)、フラビウイルス(ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、C型肝炎ウイルス、GBウイルス)、ラブドウイルス(水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス)、パラミクソウイルス(ムンプスまたは麻疹)およびオルトミクソウイルス(インフルエンザウイルス)の区画などのエンドサイトーシス区画を標的とするエンベロープタンパク質をコードするenv遺伝子を使用することができる。好ましくは使用することができる他のエンベロープは、モロニー白血病ウイルスのエンベロープ、例えばMLV-E、MLV-AおよびGALVを含む。これらの後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合には特に好ましい。所望の宿主細胞に応じて他のエンベロープタンパク質を選択することができる。例えば、ドーパミン受容体などの特定の受容体の標的化を、脳への送達のために使用することができる。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用して標的化することができる。例えば、エボラのGPは、転写後修飾によって、GPおよびGP2糖タンパク質となる。別の実施形態では、シュードタイプエンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる(例えば、FIVまたはSHIV[米国特許第5,654,195号])。SHIVシュードタイプベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
本明細書において詳述されるように、レンチウイルスベクター系は、典型的にgag、pol、またはrev遺伝子の少なくとも1つを含む少なくとも1つのヘルパープラスミドを含む。gag、polおよびrev遺伝子の各々は、個々のプラスミドに提供されてもよく、または1つもしくは複数の遺伝子を同じプラスミドに共に提供してもよい。一実施形態では、gag、pol、およびrev遺伝子は同じプラスミドに提供される(例えば、図2)。別の実施形態では、gagおよびpol遺伝子は第1のプラスミドに提供され、rev遺伝子は第2のプラスミドに提供される(例えば、図3)。したがって、3ベクターおよび4ベクター系の両方を使用して、実施例の節および本明細書の他所で記載されるようにレンチウイルスを産生することができる。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも1つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、293T/17 HEK細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも1つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が最終的に産生される。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター;細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミド;ならびにgag、pol、およびrev遺伝子を発現させるための少なくとも1つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも1つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって産生され、レンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体CCR5の産生を阻害することが可能であるか、またはHIV RNA配列を標的化することが可能である。
別の態様では、ならびに図2および3に詳述するように、Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント:ハイブリッド5’末端反復配列(RSV/5’LTR)(配列番号44~45)、Psi配列(RNAパッケージング部位)(配列番号46)、RRE(Rev応答エレメント)(配列番号47)、cPPT(ポリプリントラクト)(配列番号48)、EF1アルファプロモーター(配列番号7)、VG9(配列番号1および3)、IRES(配列番号6)、Vd2(配列番号2および4)ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号54)、および3’デルタLTR(配列番号55)を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。
別の態様では、および図4に詳述されるように、CD3を発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント:ハイブリッド5’末端反復配列(RSV/5’LTR)(配列番号44~45)、Psi配列(RNAパッケージング部位)(配列番号46)、RRE(Rev応答エレメント)(配列番号47)、cPPT(ポリプリントラクト)(配列番号48)、CMVプロモーター(配列番号8)、CD3(配列番号9)、ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号54)、および3’デルタLTR(配列番号55)を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。
別の態様では、および図4に詳述されるように、FDPS shRNAを発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント:ハイブリッド5’末端反復配列(RSV/5’LTR)(配列番号44~45)、Psi配列(RNAパッケージング部位)(配列番号46)、RRE(Rev応答エレメント)(配列番号47)、cPPT(ポリプリントラクト)(配列番号48)、H1プロモーター(配列番号49)、FDPS shRNA(配列番号50~53)、ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号54)、および3’デルタLTR(配列番号55)を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。
別の態様では、および本明細書に詳述されるように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメント:CAGプロモーター(配列番号56);HIV gag(配列番号57);HIV pol(配列番号58);HIVインテグラーゼ(配列番号59);HIV RRE(配列番号60);およびHIV Rev(配列番号61)を含むように設計されている。別の態様では、ヘルパープラスミドは、gagおよびpol遺伝子を発現させるための第1のヘルパープラスミド、ならびにrev遺伝子を発現させるための第2のかつ別個のプラスミドを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。
別の態様では、および本明細書に詳述されるように、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメント:CMVプロモーター(配列番号62)および水疱口内炎ウイルスG糖タンパク質(VSV-G)(配列番号63)を含むように設計されている。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。
別の態様では、レンチウイルスパッケージングのために使用されるプラスミドを、類似のエレメントによって改変することができ、イントロン配列を、ベクター機能を失うことなく潜在的に除去することができる。例えば、以下のエレメントを、パッケージング系を含むプラスミドにおける類似のエレメントと交換することができる:伸長因子-1アルファ(EF1α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、およびユビキチンC(UbC)プロモーターを、CMVまたはCAGプロモーターと交換することができる。SV40ポリAおよびbGHポリAを、ウサギベータグロビンポリAと交換することができる。ヘルパープラスミドにおけるHIV配列は、異なるHIV株またはクレードから構築することができる。VSV-G糖タンパク質を、ネコ内在性ウイルス(RD114)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、狂犬病(FUG)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、インフルエンザA家禽ペストウイルス(FPV)、ロスリバーアルファウイルス(RRV)、マウス白血病ウイルス10A1(MLV)、またはエボラウイルス(EboV)の膜糖タンパク質で置換することができる。
注目すべきは、レンチウイルスパッケージング系を、商業的に取得することができ(例えば、OriGene Technologies,Inc.、Rockville、MDのLenti-vpakパッケージングキット)、また、本明細書に記載されるように設計することもできる。その上、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の産生効率を含む任意の数の関連する要因を改善することも当業者の技術範囲内である。
用量および剤形
本開示のベクターは、目的の遺伝子または配列の短期間、中期間、または長期間の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームでの維持を可能にする。したがって、投与レジメンは、処置される状態および投与方法に基づいて変化し得る。
本開示のベクターは、目的の遺伝子または配列の短期間、中期間、または長期間の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームでの維持を可能にする。したがって、投与レジメンは、処置される状態および投与方法に基づいて変化し得る。
一実施形態では、形質導入ベクターは、それを必要とする対象に様々な用量で投与され得る。具体的には、対象は、約≧106感染用量(1個の標的細胞を形質導入するために平均で1用量が必要である)を投与され得る。より具体的には、対象は、約≧107、約≧108、約≧109、または約≧1010感染用量を投与され得るか、またはこれらの値の間の任意の数の用量を投与され得る。形質導入ベクター投与の上限は、各疾患の適応に関して決定され、各個々の製品または製品ロットに関する毒性/安全性プロファイルに依存する。
加えて、本開示のベクターは、定期的に、例えば1日1回または2回、または任意の他の好適な期間、投与され得る。例えば、ベクターは、それを必要とする対象に1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、1ヶ月毎に1回、2ヶ月毎に1回、3ヶ月毎に1回、6ヶ月毎に1回、9ヶ月毎に1回、1年毎に1回、18ヶ月毎に1回、2年毎に1回、30ヶ月毎に1回、または3年毎に1回に投与され得る。
一実施形態では、本開示のベクターは、医薬組成物として投与される。一部の実施形態では、本開示のベクターを含む医薬組成物は、これらに限定されないが、臨床適用のための鼻、肺、経口、表面(topical)、または非経口剤形を含む多様な剤形で製剤化することができる。剤形の各々は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、増量剤、増粘剤、結合剤、希釈剤、例えば湿潤剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ベクターを含む医薬組成物はまた、注射、ガス注入(insufflation)、注入、または皮内曝露のために製剤化することができる。例えば、注射可能製剤は、好適なpHおよび張度の水溶液または非水溶液中に本開示のベクターを含み得る。
本開示のベクターは、腫瘍部位または感染部位への直接注射によって対象に投与され得る。一部の実施形態では、ベクターを、全身投与することができる。一部の実施形態では、ベクターを、腫瘍部位または感染部位のすぐ周囲の組織にガイドされたカニューレ挿入を介して投与することができる。
本開示のベクター組成物は、任意の薬学的に許容される方法、例えば鼻腔内、口腔内、舌下、経口、直腸、眼、非経口(静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内)、肺、膣内、局所投与、表面投与、乱切後の表面投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースもしくはゼラチンなどの半固体培地中で、または口腔内もしくは鼻腔内噴霧製剤を介して投与することができる。
さらに、本開示のベクター組成物は、任意の薬学的に許容される剤形、例えば固体剤形、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、液体分散剤、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤に製剤化することができる。さらに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはその任意の組合せであり得る。さらに、組成物は、経皮送達システムであってもよい。
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形に製剤化することができ、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、または丸剤であり得る。一部の実施形態では、固体剤形は、1つまたは複数の賦形剤、例えば炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロース、またはゼラチンを含み得る。加えて、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出型または改変放出型であり得る。改変放出剤形は、制御放出または延長放出、腸溶放出およびその他を含む。改変放出剤形に使用される賦形剤は一般的に当業者に公知である。
さらなる実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、舌下または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌の下に投与される舌下錠または溶液組成物、および頬と歯肉の間に配置される口腔錠を含む。
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、鼻剤形として製剤化され得る。本開示のそのような剤形は、鼻送達のための液剤、懸濁剤、およびゲル組成物を含む。
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のための液体剤形、例えば懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤に製剤化され得る。一部の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンなどの一般的に使用される単純な希釈剤に加えて、様々な賦形剤、例えば保湿剤、甘味料、芳香剤、または保存剤を含み得る。特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、小児患者への投与にとって好適であるように製剤化され得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のための剤形、例えば滅菌の水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性の液剤または坐剤に製剤化することができる。一部の実施形態では、液剤または懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、または注射可能エステル、例えばオレイン酸エチルを含み得る。
医薬組成物の投薬量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および投与様式、排泄速度、および疾患の重症度に応じて変化し得る。
一部の実施形態では、がんの処置は、針、または静脈内カニューレ挿入を使用して、本開示のベクター構築物の腫瘍へのガイドされた直接注射によって達成される。一部の実施形態では、本開示のベクターは、静脈または動脈カニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達または疾患部位近傍の排出臓器への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環に投与される。
以下の実施例は、本開示の例示的な態様および実施形態を例証するために与えられる。しかしながら、態様および実施形態は、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されないことを理解すべきである。本明細書で言及した全ての印刷された刊行物は、具体的に参照により本明細書に組み込まれる。
(実施例1)
レンチウイルスベクター系の開発
レンチウイルス粒子は、治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に293T/17 HEK細胞(American Type Culture Collection、Manassas、VAから購入)において産生された。機能的なウイルス粒子を産生する293T/17 HEK細胞のトランスフェクションは、試薬ポリ(エチレンイミン)(PEI)を使用して、プラスミドDNA取り込み効率を増加させた。プラスミドおよびDNAを、最初に、血清を含まない培養培地に3:1の比率(PEIのDNAに対する質量比)で別個に添加した。2~3日後、細胞培地を収集し、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および/または濾過後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度を、形質導入単位/ml(TU/ml)に関して表現することができる。TUの決定は、培養液中のHIV p24(p24タンパク質はレンチウイルス粒子に組み込まれる)レベルを測定すること、定量的PCRによって細胞あたりのウイルスDNAコピー数を測定すること、または細胞を感染させて光(ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合)を使用することによって達成された。
レンチウイルスベクター系の開発
レンチウイルス粒子は、治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に293T/17 HEK細胞(American Type Culture Collection、Manassas、VAから購入)において産生された。機能的なウイルス粒子を産生する293T/17 HEK細胞のトランスフェクションは、試薬ポリ(エチレンイミン)(PEI)を使用して、プラスミドDNA取り込み効率を増加させた。プラスミドおよびDNAを、最初に、血清を含まない培養培地に3:1の比率(PEIのDNAに対する質量比)で別個に添加した。2~3日後、細胞培地を収集し、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および/または濾過後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度を、形質導入単位/ml(TU/ml)に関して表現することができる。TUの決定は、培養液中のHIV p24(p24タンパク質はレンチウイルス粒子に組み込まれる)レベルを測定すること、定量的PCRによって細胞あたりのウイルスDNAコピー数を測定すること、または細胞を感染させて光(ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合)を使用することによって達成された。
上記のように、3ベクター系(すなわち、2ベクターレンチウイルスパッケージング系)を、レンチウイルス粒子の産生のために設計した。3ベクター系の概略図を図2に示す。簡単に説明すると、図2を参照して、一番上のベクターは、この場合、Revを含むヘルパープラスミドである。図2の中央に現れるベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書に記載される治療ベクターである。
より具体的に図2を参照して、ヘルパープラスRevプラスミドは、CAGエンハンサー(配列番号10);CAGプロモーター(配列番号11);ニワトリベータアクチンイントロン(配列番号12);HIV gag(配列番号13);HIV Pol(配列番号14);HIVインテグラーゼ(配列番号15);HIV RRE(配列番号16);HIV Rev(配列番号17);およびウサギベータグロビンポリA(配列番号18)を含む。
エンベローププラスミドは、CMVプロモーター(配列番号19);ベータグロビンイントロン(配列番号20);VSV-G(配列番号12);およびウサギベータグロビンポリA(配列番号21)を含む。
ヘルパー(プラスRev)およびエンベローププラスミドを含む2ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法
ヘルパープラスミドの構築:ヘルパープラスミドは、Gag、Pol、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するpNL4-3 HIVプラスミド(NIH Aids Reagent Program)からのDNA断片の最初のPCR増幅によって構築された。プライマーは、EcoRIおよびNotI制限部位を有する断片を増幅するように設計され、これを使用してpCDNA3プラスミド(Invitrogen)の同じ部位に挿入することができる。フォワードプライマーは配列番号22であり、リバースプライマーは配列番号23であった。Gag、Pol、インテグラーゼ断片の配列は配列番号24であった。
ヘルパープラスミドの構築:ヘルパープラスミドは、Gag、Pol、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するpNL4-3 HIVプラスミド(NIH Aids Reagent Program)からのDNA断片の最初のPCR増幅によって構築された。プライマーは、EcoRIおよびNotI制限部位を有する断片を増幅するように設計され、これを使用してpCDNA3プラスミド(Invitrogen)の同じ部位に挿入することができる。フォワードプライマーは配列番号22であり、リバースプライマーは配列番号23であった。Gag、Pol、インテグラーゼ断片の配列は配列番号24であった。
次に、Rev、RRE、およびウサギベータグロビンポリA配列を含有し、XbaIおよびXmaI制限部位が隣接するDNA断片を、MWG Operonが合成した。次に、DNA断片を、XbaIおよびXmaI制限部位でプラスミドに挿入した。DNA配列は配列番号25であった。
最後に、pCDNA3.1のCMVプロモーターを、CAGエンハンサー/プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列と交換した。CAGエンハンサー/プロモーター/イントロン配列を含有し、MluIおよびEcoRI制限部位が隣接するDNA断片を、MWG Operonが合成した。次に、DNA断片を、MluIおよびEcoRI制限部位でプラスミドに挿入した。DNA配列は配列番号26であった。
VSV-Gエンベローププラスミドの構築
EcoRI制限部位が隣接する水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質(VSV-G)配列を、MWG Operonが合成した。次に、DNA断片をpCDNA3.1プラスミド(Invitrogen)にEcoRI制限部位で挿入し、正しい配向を、CMV特異的プライマーを使用する配列決定によって決定した。DNA配列は配列番号27であった。
EcoRI制限部位が隣接する水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質(VSV-G)配列を、MWG Operonが合成した。次に、DNA断片をpCDNA3.1プラスミド(Invitrogen)にEcoRI制限部位で挿入し、正しい配向を、CMV特異的プライマーを使用する配列決定によって決定した。DNA配列は配列番号27であった。
4ベクター系(すなわち、3ベクターレンチウイルスパッケージング系)もまた、設計され、本明細書に記載される方法および材料を使用して産生されている。4ベクター系の概略図を図3に示す。簡単に、図3を参照して説明すると、一番上のベクターは、この場合Revを含まないヘルパープラスミドである。上から2番目のベクターは、別個のRevプラスミドである。下から2番目のベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、既に記載された治療ベクターである。
部分的に図3を参照して、ヘルパープラスミドは、CAGエンハンサー(配列番号10);CAGプロモーター(配列番号11);ニワトリベータアクチンイントロン(配列番号12);HIV gag(配列番号13);HIV Pol(配列番号14);HIVインテグラーゼ(配列番号15);HIV RRE(配列番号16);およびウサギベータグロビンポリA(配列番号18)を含む。
Revプラスミドは、RSVプロモーター(配列番号28);HIV Rev(配列番号29);およびウサギベータグロビンポリA(配列番号18)を含む。
エンベローププラスミドは、CMVプロモーター(配列番号19);ベータグロビンイントロン(配列番号20);VSV-G(配列番号12);およびウサギベータグロビンポリA(配列番号18)を含む。
ヘルパー、Rev、およびエンベローププラスミドを含む3ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法
Revを有しないヘルパープラスミドの構築
Revを有しないヘルパープラスミドを、RREおよびウサギベータグロビンポリA配列を含有するDNA断片を挿入することによって構築した。NotIおよびStuI制限部位が隣接するこの配列を、MWG Operonが合成した。次に、RRE/ウサギポリAベータグロビン配列を、NotIおよびStuI制限部位でヘルパープラスミドに挿入した。DNA配列は、配列番号67であった。
Revを有しないヘルパープラスミドの構築
Revを有しないヘルパープラスミドを、RREおよびウサギベータグロビンポリA配列を含有するDNA断片を挿入することによって構築した。NotIおよびStuI制限部位が隣接するこの配列を、MWG Operonが合成した。次に、RRE/ウサギポリAベータグロビン配列を、NotIおよびStuI制限部位でヘルパープラスミドに挿入した。DNA配列は、配列番号67であった。
Revプラスミドの構築
RSVプロモーターおよびHIV Rev配列を、MWG Operonが、MfeIおよびXbaI制限部位が隣接する単一のDNA断片として合成した。次に、DNA断片を、MfeIおよびXbaI制限部位でpCDNA3.1プラスミド(Invitrogen)に挿入し、ここではCMVプロモーターがRSVプロモーターに交換されている。DNA配列は配列番号30であった。
RSVプロモーターおよびHIV Rev配列を、MWG Operonが、MfeIおよびXbaI制限部位が隣接する単一のDNA断片として合成した。次に、DNA断片を、MfeIおよびXbaI制限部位でpCDNA3.1プラスミド(Invitrogen)に挿入し、ここではCMVプロモーターがRSVプロモーターに交換されている。DNA配列は配列番号30であった。
2ベクターおよび3ベクターパッケージング系を、類似のエレメントによって改変することができ、イントロン配列を、ベクター機能を失うことなく潜在的に除去することができる。例えば、以下のエレメントを、2ベクターおよび3ベクターパッケージング系において類似のエレメントと交換することができる:
プロモーター:伸長因子-1アルファ(EF1α)(配列番号31)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)(配列番号32)、およびユビキチンC(UbC)(配列番号33)を、CMV(配列番号19)またはCAGプロモーター(配列番号11)と交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。
ポリA配列:SV40ポリA(配列番号34)およびbGHポリA(配列番号35)を、ウサギベータグロビンポリA(配列番号18)と交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。
HIV Gag、Pol、およびインテグラーゼ配列:ヘルパープラスミドにおけるHIV配列は、異なるHIV株またはクレードから構築することができる。例えば、Bal株のHIV Gag(配列番号13);HIV Pol(配列番号14);およびHIVインテグラーゼ(配列番号15)を、本明細書で概説したヘルパー/ヘルパープラスRevプラスミドに含有されるgag、pol、およびint配列と相互交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。
エンベロープ:VSV-G糖タンパク質を、ネコ内在性ウイルス(RD114)(配列番号36)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)(配列番号37)、狂犬病(FUG)(配列番号38)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)(配列番号39)、インフルエンザA家禽ペストウイルス(FPV)(配列番号40)、ロスリバーアルファウイルス(RRV)(配列番号41)、マウス白血病ウイルス10A1(MLV)(配列番号42)、またはエボラウイルス(EboV)(配列番号43)の膜糖タンパク質で置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書における配列部分において同定される。さらに、これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。
要約すると、3ベクター系と4ベクター系とを、以下のように部分的に比較および対比することができる。3ベクターレンチウイルスベクター系は:1.ヘルパープラスミド:HIV Gag、Pol、インテグラーゼ、およびRev/Tat;2.エンベローププラスミド:VSV-G/FUGエンベロープ;ならびに3.治療ベクター:RSV 5’LTR、Psiパッケージングシグナル、Gag断片、RRE、Env断片、cPPT、WPRE、および3’δ LTRを含有する。4ベクターレンチウイルスベクター系は:1.ヘルパープラスミド:HIV Gag、Pol、およびインテグラーゼ;2.Revプラスミド:Rev;3.エンベローププラスミド:VSV-G/FUGエンベロープ;ならびに4.治療ベクター:RSV 5’LTR、Psiパッケージングシグナル、Gag断片、RRE、Env断片、cPPT、WPRE、および3’デルタLTRを含有する。上記のエレメントに対応する配列は、本明細書における配列表部分において同定される。
(実施例2)
γδ T細胞受容体およびCD3タンパク質によるNK92細胞の形質導入
BsrGIおよびNotI制限酵素部位が隣接するHomo sapiens T細胞受容体ガンマ9可変鎖(TRGV9)(Gen Bank:KC170727.1)のDNA断片を、Integrated DNA Technologies(IDT)が合成した。NotIおよびNsiI制限酵素部位が隣接する、上流の配列内リボソーム侵入部位(IRES)配列を有するHomo sapiens T細胞受容体デルタ鎖(TRDV2)(Gen Bank: AY312956.1)のDNA断片を、合成した。TRGV9を、BsrGI/NotI酵素によって消化し、TRDV2を、NotI/NsiI酵素によって消化し、EF1αプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドにライゲーションした。TRGV9断片をレンチウイルスプラスミドに挿入した後に、TRDV2断片を挿入した。同様に、XbaIおよびSalI制限酵素部位を有するHomo sapiens CD3のDNA断片を合成し、CMVプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドに挿入した。
γδ T細胞受容体およびCD3タンパク質によるNK92細胞の形質導入
BsrGIおよびNotI制限酵素部位が隣接するHomo sapiens T細胞受容体ガンマ9可変鎖(TRGV9)(Gen Bank:KC170727.1)のDNA断片を、Integrated DNA Technologies(IDT)が合成した。NotIおよびNsiI制限酵素部位が隣接する、上流の配列内リボソーム侵入部位(IRES)配列を有するHomo sapiens T細胞受容体デルタ鎖(TRDV2)(Gen Bank: AY312956.1)のDNA断片を、合成した。TRGV9を、BsrGI/NotI酵素によって消化し、TRDV2を、NotI/NsiI酵素によって消化し、EF1αプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドにライゲーションした。TRGV9断片をレンチウイルスプラスミドに挿入した後に、TRDV2断片を挿入した。同様に、XbaIおよびSalI制限酵素部位を有するHomo sapiens CD3のDNA断片を合成し、CMVプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドに挿入した。
レンチウイルスプラスミドを、BsrGI/NotIまたはNotI/NsiI制限酵素のいずれかによって消化した。消化された産物を、1%アガロースゲル(Thermo Fisher Scientific)上で電気泳動し、切り出し、ゲルをPureLink DNAゲル抽出キット(Thermo Fisher Scientific)によって抽出した。DNA濃度を決定した後、ベクターのインサートに対する比3:1を使用して、消化したDNA断片と混合した。混合物をT4 DNAリガーゼによって室温で16時間ライゲーションした。ライゲーションミックス3μLを、STBL3コンピテント細菌細胞23μLに添加した。42℃でのヒートショックによって形質転換を行った。細菌細胞を、アンピシリンを含有する寒天プレート上で画線した後、コロニーをLBブロス中で増大させた。DNA断片の挿入をチェックするために、プラスミドDNAを、収集した細菌培養物からDNAプラスミド mini prepキット(Thermo Fisher Scientific)によって抽出した。挿入されたDNA断片を、DNA配列決定(Eurofins Genomics)によって確認した。次に、確認された配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、293T細胞においてレンチウイルス粒子をパッケージングし、フローサイトメーターによる抗体検出によって、それらがVγ2Vδ2 TCRまたはCD3のいずれかを発現する能力に関して試験した。NK92細胞の形質導入に関して、細胞を、24ウェルプレートにおいて2×105細胞/mLで播種し、CD3を発現するレンチウイルスベクターをmoi5で形質導入した。4日後、CD3発現を、フローサイトメトリーによって抗CD3抗体によって検出した。次に、CD3を発現するNK92細胞に、Vγ2Vδ2 TCRを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。4日後、Vγ2Vδ2 TCRの発現を、フローサイトメトリーによって抗Vγ9または抗Vδ2抗体によって検出した(図6Aの左のパネルを参照されたい)。
(実施例3)
抗Vδ2ビーズ選択を使用する、Vγ9Vδ2 T細胞受容体およびCD3タンパク質を含有するNK92細胞の富化
Vγ9Vδ2 T細胞受容体およびCD3タンパク質を発現するNK92細胞を、抗Vδ2ビーズを使用して富化した。
抗Vδ2ビーズ選択を使用する、Vγ9Vδ2 T細胞受容体およびCD3タンパク質を含有するNK92細胞の富化
Vγ9Vδ2 T細胞受容体およびCD3タンパク質を発現するNK92細胞を、抗Vδ2ビーズを使用して富化した。
実験方法
NK92細胞に、Vγ9Vδ2 T細胞受容体(TCR)(配列番号5)を発現するレンチウイルスベクターおよびCD3タンパク質(配列番号9)を発現するレンチウイルスベクターをmoi5で形質導入した。5日後、CD3およびVγ9Vδ2 TCRの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-フィコエリスリン(PE)クローンB6およびマウス抗ヒトCD3-アロフィコシアニン(APC)クローンUCHT1によって染色した。細胞を、染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
NK92細胞に、Vγ9Vδ2 T細胞受容体(TCR)(配列番号5)を発現するレンチウイルスベクターおよびCD3タンパク質(配列番号9)を発現するレンチウイルスベクターをmoi5で形質導入した。5日後、CD3およびVγ9Vδ2 TCRの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-フィコエリスリン(PE)クローンB6およびマウス抗ヒトCD3-アロフィコシアニン(APC)クローンUCHT1によって染色した。細胞を、染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図6Aに示すように、富化を行わない場合、CD3およびVγ9Vδ2 TCR陽性細胞の頻度は3.81%であった(図6Aの左のパネルを参照されたい)。形質導入された細胞を特徴付けるために、細胞を、抗Vγ9Vδ2 TCR抗体および磁気ビーズ選択によってさらに富化した。富化後、CD3およびVγ9Vδ2 TCR陽性細胞の頻度は23.5%(図6Aの右のパネルを参照されたい)であった。
(実施例4)
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、ゾレドロン酸によって処置したC8166細胞に応答性である
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞を試験して、C8166細胞に対して応答性であるか否かを決定した。C8166細胞は、ヒトT細胞白血病のモデルである。CD107aは、細胞活性のマーカーとして使用した。
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、ゾレドロン酸によって処置したC8166細胞に応答性である
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞を試験して、C8166細胞に対して応答性であるか否かを決定した。C8166細胞は、ヒトT細胞白血病のモデルである。CD107aは、細胞活性のマーカーとして使用した。
実験方法
ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ(FDPS)を阻害し、これによって細胞にイソペンテニルピロリン酸(IPP)が蓄積し、これはVγ9Vδ2 TCRによる認識を増加させる。CD3およびVγ9Vδ2 TCRがNK92細胞において機能的である場合、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92は、ゾレドロン酸処置細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にCD107aを発現する。C8166細胞をゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。富化したNK92細胞を、培地、C8166腫瘍細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aをフローサイトメトリーによって測定した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ(FDPS)を阻害し、これによって細胞にイソペンテニルピロリン酸(IPP)が蓄積し、これはVγ9Vδ2 TCRによる認識を増加させる。CD3およびVγ9Vδ2 TCRがNK92細胞において機能的である場合、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92は、ゾレドロン酸処置細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にCD107aを発現する。C8166細胞をゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。富化したNK92細胞を、培地、C8166腫瘍細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aをフローサイトメトリーによって測定した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図6Bに示すように、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92細胞は、CD107aの発現の増加を通してゾレドロン酸処置C8166細胞に応答し、20.8%の細胞がCD107aに関して陽性であった。しかしながら、非ゾレドロン酸処置C8166細胞は、CD107a応答を誘導することができず、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92の4.22%のみが、CD107aの発現に関して陽性であったが、これは、対照処置におけるCD107aの発現に関して陽性であったVγ9Vδ2 TCR陽性NK92の4.43%に匹敵し得る(図6Bを参照されたい)。
(実施例5)
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞にゾレドロン酸処置C8166細胞を曝露すると、細胞溶解をもたらした
Vγ9Vδ2受容体によって操作されたNK92細胞を、C8166細胞を溶解するその能力に関して試験した。
Vγ9Vδ2 T細胞受容体によって操作されたNK92細胞にゾレドロン酸処置C8166細胞を曝露すると、細胞溶解をもたらした
Vγ9Vδ2受容体によって操作されたNK92細胞を、C8166細胞を溶解するその能力に関して試験した。
実験方法
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。C8166細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを3連で実施した。インキュベーション後、上清を、96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、BioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセント(percent specific lysis)を、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。C8166細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを3連で実施した。インキュベーション後、上清を、96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、BioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセント(percent specific lysis)を、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
C8166細胞またはゾレドロン酸処置C8166細胞に対するNK92細胞またはVγ9Vδ2 TCR操作NK92細胞の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する(E:T)比で評価した。3連のウェルを各条件に使用した。図6Cに示すように、Vγ9Vδ2 TCRを発現するNK92細胞に曝露したゾレドロン酸処置C8166細胞は、最高レベルの細胞溶解をもたらした(NK92gdTCR+C8166/ZOL-10μMに対応する線を参照されたい)。具体的には、4:1のエフェクターの標的に対する比では、45%~50%の間のC8166細胞が溶解された;細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比を1:1に低減させると、約25%に低減された(図6Cを参照されたい)。
(実施例6)
限界希釈単一細胞クローニングを通して形質導入について陽性であった個々のNK92細胞の単離
必ずしも全てのNK92細胞が、Vγ2Vδ2 TCRを発現するレンチウイルスベクターによって形質導入されたわけではなかった。その結果、形質導入に関して陽性の個々の細胞を単離し、亜株をそれらの単離された細胞から成長させた。陽性に形質導入された細胞の単離およびそれらの単離された細胞からの亜株の成長を、限界希釈単一細胞クローニングを使用して行った。
限界希釈単一細胞クローニングを通して形質導入について陽性であった個々のNK92細胞の単離
必ずしも全てのNK92細胞が、Vγ2Vδ2 TCRを発現するレンチウイルスベクターによって形質導入されたわけではなかった。その結果、形質導入に関して陽性の個々の細胞を単離し、亜株をそれらの単離された細胞から成長させた。陽性に形質導入された細胞の単離およびそれらの単離された細胞からの亜株の成長を、限界希釈単一細胞クローニングを使用して行った。
NK92細胞に、γδ T細胞受容体遺伝子またはCD3タンパク質遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。得られた細胞を希釈し、96ウェルプレートに細胞0.4個/ウェルの密度で播種した。この条件は、単一細胞のみが個々のウェルに入れられ、クローニングされた細胞株として成長することを確実にする。3~4週間の培養後、単一の細胞が増殖し、その成長により培養培地は黄色になった。個々のウェルからの細胞を25mL培養フラスコに移し、クローニングされた細胞株の持続的な成長および増大を可能にした。25mL培養物からの細胞を使用して、細胞表面タンパク質発現に基づいて表現型を特徴付け、細胞傷害アッセイに基づいて生物学的機能を特徴付けた。この方法の概略図を図7に示す。
(実施例7)
限界希釈クローニングによって生成されたNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンの亜株のスクリーニングは、NK92-γδTCR-5亜株が腫瘍細胞の存在下でCD107aおよびTNFαの高い発現を生じることを示した
Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するNK92細胞の亜株を、C8166細胞またはゾレドロン酸処置C8166細胞にNK92細胞を曝露することを通してスクリーニングした。CD107aおよびTNFαは、細胞活性を検出するためのマーカーとして使用した。
限界希釈クローニングによって生成されたNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンの亜株のスクリーニングは、NK92-γδTCR-5亜株が腫瘍細胞の存在下でCD107aおよびTNFαの高い発現を生じることを示した
Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するNK92細胞の亜株を、C8166細胞またはゾレドロン酸処置C8166細胞にNK92細胞を曝露することを通してスクリーニングした。CD107aおよびTNFαは、細胞活性を検出するためのマーカーとして使用した。
実験方法
C8166細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現する選択されたNK92細胞クローンを、C8166細胞または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aまたはTNFαをフローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞内TNFαを検出するため、細胞を、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトTNFα-APCと共に4℃で45分間インキュベートした。細胞内染色溶液は、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づいてゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料について獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
C8166細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。Vγ9Vδ2 T細胞受容体を発現する選択されたNK92細胞クローンを、C8166細胞または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aまたはTNFαをフローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞内TNFαを検出するため、細胞を、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトTNFα-APCと共に4℃で45分間インキュベートした。細胞内染色溶液は、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づいてゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料について獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図8に示すように、CD107aをマーカーとして使用する場合、NK92-γδTCR-5亜株は、最も強い応答を示した。具体的には、NK92-γδTCR-5亜株を、C8166細胞に曝露すると、17.8%の細胞が、CD107aマーカーに関して陽性であった(図8を参照されたい)。CD107a陽性細胞のこのパーセンテージは、NK92-γδTCR亜株を、ゾレドロン酸によって処置したCD1866細胞に曝露すると、68.2%に増加した(図8を参照されたい)。
同様に、図9に示すように、TNFαをマーカーとして使用した場合、NK92-γδTCR-5亜株は、最高レベルの発現を有した。具体的には、NK92-γδTCR-5亜株をC8166細胞に曝露すると、1.03%の細胞がTNFαマーカーに関して陽性であった(図9を参照されたい)。TNFα陽性細胞のこのパーセンテージは、NK92-γδTCR亜株を、ゾレドロン酸によって処置したCD1866細胞に曝露すると15.6%に増加した(図9を参照されたい)。
図8および9は、クローニングした細胞株のほとんどが細胞表面TCRを発現することができなかったこと、および/または腫瘍細胞標的に対して生物応答を実証することができなかったことを示している。2つのクローニングされた細胞株(NK92-γδTCR5亜株およびNK92-γδTCR12亜株)は全ての試験において陽性であったが、なおも効力は異なった。
1つのクローン細胞株、NK92-gdTCR-5亜株を、以下の実施例に示すようにさらなる試験のために選択した。
(実施例8)
Daudi細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
NK92またはNK92γδTCR-5細胞を試験して、細胞がDaudi細胞またはゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。
Daudi細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
NK92またはNK92γδTCR-5細胞を試験して、細胞がDaudi細胞またはゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。
実験方法
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートし;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をBioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートし;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をBioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
いくつかのエフェクターの標的に対する(E:T)比を、各条件について3連のウェルで試験した。図10に示すように、NK92はDaudiおよびゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して類似の低レベル死滅を示した(図10においてNK92+DaudiおよびNK92+Daudi/ZOL-10μMに対応する線を参照されたい)。しかしながら、NK92γδTCR-5亜株は、NK92細胞と比較してDaudi細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した(図10におけるNK92-gdTCR+Daudiに対応する線を参照されたい)。20:1のエフェクターの標的に対する比では、およそ45%の細胞が溶解された。細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比が0.625:1であった場合10%未満に低下した。ゾレドロン酸処置は、NK92γδTCR-5亜株によって引き起こされる細胞死滅をさらに増強した(図10におけるNK92-gdTCR+Daudi/ZOL-10μMに対応する線を参照されたい)。20:1のエフェクターの標的に対する比では、65%を超える細胞が溶解された(図10を参照されたい)。驚くべきことに、高い割合のゾレドロン酸処置Daudi細胞が、NK92γδTCR-5亜株によって2.5:1のE:T比であっても10:1または20:1の比でも観察された死滅と非常に類似のパーセントで溶解された(図10を参照されたい)。典型的に、通常のNKまたはγδ T細胞死滅アッセイに関して、in vitroアッセイに関して十分に高い効力を確実にするためには20:1または10:1のE:T比を使用することが一般的である。エフェクターの標的に対する比が0.625:1であった場合、パーセント細胞溶解は低下したが、なおもほぼ50%であった(図10を参照されたい)。
(実施例9)
γδ T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、Daudi細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じた
NK92またはNK92γδTCR-5を試験して、Daudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じるか否かを決定した。脱顆粒は、グランザイム応答を測定し、細胞傷害性細胞活性化の代用マーカーである。脱顆粒応答は、CD107a発現を使用して評価した。
γδ T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、Daudi細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じた
NK92またはNK92γδTCR-5を試験して、Daudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じるか否かを決定した。脱顆粒は、グランザイム応答を測定し、細胞傷害性細胞活性化の代用マーカーである。脱顆粒応答は、CD107a発現を使用して評価した。
実験方法
Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。NK92またはNK92γδTCR-5を、培地、C8166細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。NK92またはNK92γδTCR-5を、培地、C8166細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図11に示すように、NK92細胞は、Daudiおよびゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して類似の低レベルの応答を示した。しかしながら、NK92γδTCR-5細胞は、NK92細胞と比較してDaudi細胞に対してはるかに高い応答を示した(図11を参照されたい)。具体的には、Daudi細胞に曝露すると、13.8%のNK92-γδTCR-5細胞がCD107aマーカーを発現し、これに対しNK92細胞をDaudi細胞に曝露するとCD107aマーカーの発現は無視できる程度であった(図11を参照されたい)。ゾレドロン酸処置は、NK92γδTCR-5亜株の応答をさらに増強した(図11を参照されたい)。具体的には、ゾレドロン酸によって処置したDaudi細胞に曝露すると、62.8%のNK92-γδTCR-5細胞がCD107aマーカーを発現し、これに対しNK92細胞をゾレドロン酸によって処置したDaudi細胞に曝露すると、CD107aマーカーの発現は無視できる程度であった(図11を参照されたい)。
(実施例10)
γδ T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、Daudi細胞に曝露した場合にTNFα応答を生じた
NK92またはNK92γδTCR-5を試験して、それらがDaudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞に曝露された場合にサイトカイン応答を生じるか否かを決定した。サイトカイン応答を、細胞内TNFα発現を使用して評価した。サイトカインTNFαの産生は、細胞活性化のマーカーである。本明細書において、サイトカイン応答は、腫瘍細胞のNK92-γδTCR認識に関するシグナルの強度を反映する。
γδ T細胞受容体によって操作されたNK92細胞は、Daudi細胞に曝露した場合にTNFα応答を生じた
NK92またはNK92γδTCR-5を試験して、それらがDaudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞に曝露された場合にサイトカイン応答を生じるか否かを決定した。サイトカイン応答を、細胞内TNFα発現を使用して評価した。サイトカインTNFαの産生は、細胞活性化のマーカーである。本明細書において、サイトカイン応答は、腫瘍細胞のNK92-γδTCR認識に関するシグナルの強度を反映する。
実験方法
Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。NK92またはNK92γδTCR-5を、培地、C8166細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。TNFαを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトTNF-α-APCと共に4℃で45分間インキュベートした。細胞内染色溶液を、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。NK92またはNK92γδTCR-5を、培地、C8166細胞、または10μMゾレドロン酸処置C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。TNFαを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトTNF-α-APCと共に4℃で45分間インキュベートした。細胞内染色溶液を、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences)から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全てのデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図12に示すように、NK92細胞は、Daudiおよびゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して類似の低レベルの応答を示した。しかしながら、NK92γδTCR-5亜株は、NK92細胞と比較してDaudi細胞に対してはるかに高い応答を示した(図12を参照されたい)。具体的には、Daudi細胞に曝露すると、2.94%のNK92-γδTCR-5細胞がTNFαマーカーを発現したが、これに対し、NK92細胞をDaudi細胞に曝露すると、TNFαマーカーの発現は無視できる程度であった(図12を参照されたい)。ゾレドロン酸処置は、NK92γδTCR-5亜株による細胞応答をさらに増強した(図12を参照されたい)。具体的には、ゾレドロン酸によって処置したDaudi細胞に曝露すると、42.3%のNK92-γδTCR-5細胞がTNFαマーカーを発現したが、これに対し、NK92細胞をゾレドロン酸によって処置したDaudi細胞に曝露すると、TNFαマーカーの発現は無視できる程度であった(図12を参照されたい)。
(実施例11)
TU167細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
NK92-γδTCR-5亜株を試験して、これがTU167細胞に対する細胞傷害効果を有するか否かを決定した。TU167細胞(UM-SCC細胞株の亜株)は、頭頸部扁平上皮癌のモデルである。
TU167細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
NK92-γδTCR-5亜株を試験して、これがTU167細胞に対する細胞傷害効果を有するか否かを決定した。TU167細胞(UM-SCC細胞株の亜株)は、頭頸部扁平上皮癌のモデルである。
実験方法
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。TU167細胞に、ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を阻害するshRNAを発現するレンチウイルスベクターを形質導入しなかったかまたは形質導入し(AGT401;図5を参照されたい)、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をBioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。TU167細胞に、ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を阻害するshRNAを発現するレンチウイルスベクターを形質導入しなかったかまたは形質導入し(AGT401;図5を参照されたい)、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をBioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
異なる条件でのTU167に対するNK92またはNK92γδTCR-5の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する(E:T)比で各条件に関して3連のウェルで評価した。図13に示すように、NK92は、全ての条件でTU167に対して類似の低レベル死滅を示した;特に、レンチウイルスベクターAGT401の形質導入によるFDPSノックダウンは、NK92γδTCR-5による細胞死滅に影響を及ぼさなかった(図13におけるNK92細胞を使用した実験条件に対応する全ての線を参照されたい)。しかしながら、NK92γδTCR-5細胞は、NK92細胞と比較してTU167細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した(図13におけるNK92-gdTCR細胞を使用した実験条件に対応する線を参照されたい)。具体的には、ゾレドロン酸によって処置しなかったTU167細胞をNK92γδTCR-5細胞に曝露すると、20:1のエフェクターの細胞に対する比でTU167細胞の40%弱の細胞溶解をもたらした(図13を参照されたい)。低濃度のゾレドロン酸(1μM)またはより高い濃度のゾレドロン酸(10μM)処置と組み合わせたAGT401レンチウイルスベクター(図5を参照されたい)の形質導入は、NK92γδTCR-5亜株による細胞死滅を有意に増強した(NK92-gdTCR細胞をZOL-1μmおよびZOL-10μmと共に使用した実験条件に対応する線を参照されたい;図13)。具体的には、1μMゾレドロン酸によって処置したTU167細胞をNK92γδTCR-5細胞に曝露すると、20:1のエフェクターの細胞に対する比でTU167細胞の100%弱の細胞溶解をもたらした;細胞溶解は、エフェクターの細胞に対する比を0.625:1に低減すると40%未満に減少した(図13を参照されたい)。同様に、10μMゾレドロン酸によって処置したTU167細胞をNK92γδTCR-5細胞に曝露すると、20:1のエフェクターの細胞に対する比でTU167細胞の80%強の細胞溶解をもたらした;細胞溶解は、エフェクターの細胞に対する比を0.625:1に低減するとおよそ25%に減少した(図13を参照されたい)。
要約すると、NK92γδTCR-5は、様々な条件下でTU167細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した。LV-FDPSは、細胞におけるファルネシル二リン酸シンターゼ(FDPS)のレベルを低減するように設計された。FDPSを低減させると、γδ T細胞に腫瘍細胞を認識して死滅させるために重要であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)の蓄積を引き起こす。ゾレドロン酸は、FDPSの競合的阻害剤である。このように、LV-FDPSおよびゾレドロン酸はいずれも、IPPの増加を引き起こし、NK92-γδTCR細胞株のTCR依存的活性化を増強した。
(実施例12)
Huh7細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると細胞溶解をもたらした
NK92-γδTCR-5亜株を試験して、Huh7細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。Huh7細胞は、肝細胞癌のモデルである。
Huh7細胞をNK92-γδTCR-5亜株に曝露すると細胞溶解をもたらした
NK92-γδTCR-5亜株を試験して、Huh7細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。Huh7細胞は、肝細胞癌のモデルである。
実験方法
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Huh7細胞に、FDPSタンパク質産生を阻害することが可能なmiRNA(配列番号50、51、52、および53)を発現するレンチウイルスベクターAGT401を形質導入しなかったかまたは形質導入し、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSで1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、BioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OK)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Huh7細胞に、FDPSタンパク質産生を阻害することが可能なmiRNA(配列番号50、51、52、および53)を発現するレンチウイルスベクターAGT401を形質導入しなかったかまたは形質導入し、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSで1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、BioTek Synergy HTプレートリーダー(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
異なる条件下でのHuh7に対するNK92またはNK92γδTCR-5の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する(E:T)比で、各条件に関して3連のウェルで評価した。図14に示すように、NK92細胞は、いかなる条件下でもHuh7を死滅させることができなかった(図14におけるNK92細胞の使用に対応する線を参照されたい)。NK92γδTCR-5は、TU167細胞に対して低レベルの細胞傷害を示した(図14におけるNK92-gdTCR+Huh7に対応する線を参照されたい)。レンチウイルスベクターAGT401の形質導入によるFDPSノックダウン(図5を参照されたい)は、NK92γδTCR-5による細胞死滅を増加させた(図14におけるNK92-gdTCR+Huh7/LV-FDPSに対応する線を参照されたい)。具体的には、20:1のE:T比では、およそ20%の細胞が溶解された(図14)。AGT401レンチウイルスベクター形質導入を1μM濃度のゾレドロン酸または10μM濃度のゾレドロン酸と組み合わせると、NK92γδTCR-5による細胞死滅を有意に増強した(図14におけるZOL-1μMおよびZOL 10μMと共にNK92-gdTCRによる処置に対応する線を参照されたい)。具体的には、1μMおよび10μM濃度のゾレドロン酸の両方で、エフェクターの標的に対する比が20:1でHuh7細胞のおよそ55%の細胞溶解が存在した;細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比が0.625:1に低減された場合であってもなおおよそ30%であった(図14を参照されたい)。
(実施例13)
NK92γδTCR細胞の単一細胞クローンのスクリーニング
NK92細胞に、Vγ9Vδ2 T細胞受容体(TCR)またはCD3タンパク質を発現するレンチウイルスをmoi5で形質導入した。高レベルのCD3およびVγ9Vδ2 TCRを発現する単一細胞をBD細胞選別システム(BD FACSAria III Cell Sorter)によって単離した。単離された単一細胞を、96ウェルプレート中、37℃、5%CO2でインキュベートした。3~4週間後、細胞を24ウェルプレートに移した。細胞機能を、Daudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞によって試験した。Daudiは、Vγ9Vδ2 TCRの標的細胞である。NK92細胞におけるCD3およびVγ9Vδ2 TCRが機能的である場合、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92は、Daudi細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にCD107aを発現する。ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ(FDPS)を遮断し、細胞におけるイソペンテニルピロリン酸(IPP)蓄積をもたらし、これはVγ9Vδ2 TCR陽性NK92細胞の応答を増強する。
NK92γδTCR細胞の単一細胞クローンのスクリーニング
NK92細胞に、Vγ9Vδ2 T細胞受容体(TCR)またはCD3タンパク質を発現するレンチウイルスをmoi5で形質導入した。高レベルのCD3およびVγ9Vδ2 TCRを発現する単一細胞をBD細胞選別システム(BD FACSAria III Cell Sorter)によって単離した。単離された単一細胞を、96ウェルプレート中、37℃、5%CO2でインキュベートした。3~4週間後、細胞を24ウェルプレートに移した。細胞機能を、Daudiまたはゾレドロン酸処置Daudi細胞によって試験した。Daudiは、Vγ9Vδ2 TCRの標的細胞である。NK92細胞におけるCD3およびVγ9Vδ2 TCRが機能的である場合、Vγ9Vδ2 TCR陽性NK92は、Daudi細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にCD107aを発現する。ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ(FDPS)を遮断し、細胞におけるイソペンテニルピロリン酸(IPP)蓄積をもたらし、これはVγ9Vδ2 TCR陽性NK92細胞の応答を増強する。
Daudi細胞を、ゾレドロン酸(10μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。NK92またはNK92γδTCR単一細胞クローンを、培地、Daudi、または10μMゾレドロン酸処置Daudi細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aをフローサイトメトリーによって測定した(図15)。細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
100個を超える単一細胞クローンを、単一細胞選別によってスクリーニングした。5個の細胞クローンは、強い応答を示した。図15に示すように、NK92細胞は、Daudiおよびゾレドロン酸処置Daudi細胞に対して類似の低レベルの応答を示した(0.074%および0.088%のNK92細胞がそれぞれ、Daudi細胞およびゾレドロン酸処置Daudi細胞においてCD107aに関して陽性であったことを示す、図15のデータの最初の縦列を参照されたい)。しかしながら、NK92γδTCRの一部の単一細胞クローンは、NK92細胞と比較してDaudi細胞に対してより高い応答を示した(40.2%、8.23%、43.3%、77.3%、53.3%、75.7%、および59.1%の細胞がそれぞれ、CD107aを発現することを示す、異なるスクリーニングされた亜株を表す、図15の縦列2~8の真ん中の行を参照されたい)。ゾレドロン酸処置は、クローニングされたNK92γδTCR細胞株による細胞応答をさらに増強した(細胞の46.4%、15.8%、86.9%、91.9%、76.7%、86.4%、および81.0%がそれぞれCD107aを発現することを示す、異なるスクリーニングされた亜株を表す、図15の縦列2~8の下の行を参照されたい)。NK92γδTCR-S29は、強い応答を示さなかった代表的な細胞クローンであり、8.23%および15.8%の細胞が、Daudi細胞およびゾレドロン酸処置Daudi細胞による処置後にそれぞれ、CD107aに関して陽性であった(図15の縦列3の中央および下の行を参照されたい)。
データを、限界濃度希釈(実施例6に記載される方法を参照されたい)またはフローサイトメトリー単一細胞選別によって得たクローニングされたNK92γδTCR細胞株に関して編集した。CD107a陽性細胞のパーセンテージを、腫瘍細胞に対する曝露後または腫瘍細胞プラスゾレドロン酸に対する曝露後の様々なクローニングされたNK92γδTCR細胞株に関して示す(表1を参照されたい)。値の範囲は、クローニングされた細胞株における実質的な不均一性を実証する。腫瘍単独によって除算した腫瘍+ゾレドロン酸に関するCD017a陽性細胞の比は、腫瘍細胞認識の特異性を説明する1つの手段である。理想的なNK92γδTCRエフェクター細胞は、腫瘍細胞プラスゾレドロン酸(65%より高い陽性)に対して強力な応答を実証し、腫瘍単独と比較して腫瘍プラスゾレドロン酸に関する応答の実質的な増加を実証する。矢印で示した4つのクローニングされた細胞株は、ゾレドロン酸によって処置した腫瘍細胞に対する強力な応答および特異性を実証した。これらのクローニングされた細胞株は、がん免疫療法における臨床適用のために好ましい選択である。
表1は、腫瘍細胞に対する曝露後、または腫瘍細胞プラスゾレドロン酸に対する曝露後のCD107aに関して陽性のクローニングされた細胞のパーセンテージを示す11個のクローニングされた細胞株に関するデータを表す。ゾレドロン酸を添加後の相対的増加を示す。
クローニングされたNK92細胞株5、S36、S72、およびS77を、さらなる開発のために選択した。これらのクローンを選択する基準は:腫瘍プラスゾレドロン酸を使用して>65のパーセンテージCD107a陽性細胞および比(表1の縦列4)>1.2を有するVγ9Vδ2 T細胞受容体を発現するクローニングされた細胞株であった。
(実施例14)
選別されたNK92 Vγ9Vδ2 TCR細胞クローンのC8166細胞に対するその応答に従うスクリーニング
先の実施例からの特定のクローニングされたNK92細胞株を、C8166細胞に対するその応答に従ってスクリーニングした。C8166細胞株はT細胞白血病に由来した。選択されたクローニングされた細胞株を、C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
選別されたNK92 Vγ9Vδ2 TCR細胞クローンのC8166細胞に対するその応答に従うスクリーニング
先の実施例からの特定のクローニングされたNK92細胞株を、C8166細胞に対するその応答に従ってスクリーニングした。C8166細胞株はT細胞白血病に由来した。選択されたクローニングされた細胞株を、C8166細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図16に示すように、クローニングされた細胞株S63、S68、S72、S76、およびS77は、C8166細胞に対して良好な応答を示した。これらのクローンの中で、クローンS76は、C8166細胞に対して最も良好な応答を示した。
(実施例15)
より多くの細胞株(TU167、Hela、MDA-MB-231、およびA549)に対する応答による、選別したNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンのスクリーニング
先の実施例に記載したクローニングされたNK92細胞株を、TU167、Hela、MDA-MB-231およびA549細胞株に対するその応答に関してスクリーニングした。HeLaは、ヒトパピローマウイルス感染症に関連する子宮頸癌のモデルである。MDA-M B-231は、トリプルネガティブ乳がんの細胞株モデルであり、およびA549は、肺腺癌のモデルである。
より多くの細胞株(TU167、Hela、MDA-MB-231、およびA549)に対する応答による、選別したNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンのスクリーニング
先の実施例に記載したクローニングされたNK92細胞株を、TU167、Hela、MDA-MB-231およびA549細胞株に対するその応答に関してスクリーニングした。HeLaは、ヒトパピローマウイルス感染症に関連する子宮頸癌のモデルである。MDA-M B-231は、トリプルネガティブ乳がんの細胞株モデルであり、およびA549は、肺腺癌のモデルである。
選択されたNK92細胞クローンを、異なる細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図17に示すように、全てのクローニングされたNK92細胞株の中でも、クローンS76は、試験した細胞株に対して全体として最も良好な応答を示した。
(実施例16)
Huh7またはゾレドロン酸(1μM)処置Huh7細胞に対する応答による選別されたNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンのスクリーニング
上記の実施例に記載されたクローニングされたNK92細胞株を、Huh7またはゾレドロン酸(1μM)処置Huh7細胞に対するその応答に関してスクリーニングした。
Huh7またはゾレドロン酸(1μM)処置Huh7細胞に対する応答による選別されたNK92 Vγ9Vδ2 T細胞受容体クローンのスクリーニング
上記の実施例に記載されたクローニングされたNK92細胞株を、Huh7またはゾレドロン酸(1μM)処置Huh7細胞に対するその応答に関してスクリーニングした。
Huh7細胞を、ゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置した。選別したNK92細胞クローンを、Huh7、または1μMゾレドロン酸処置Huh7細胞と共に1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を、染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図18に示すように、クローンS76は、Huh7またはゾレドロン酸処置Huh7細胞に対して最も良好な応答を示した。
(実施例17)
いくつかの異なるがん細胞株に対するS76およびS77の応答の比較
クローニングされたNK92細胞株S76およびS77を、いくつかの細胞株に対するその応答に基づいて比較した。Jurkatは、T細胞白血病のモデルであり、J1.1細胞は、HIV感染後のJurkatに由来した。K562は、赤白血病細胞株である。SupT1は、T細胞リンパ腫細胞株であり、THP1は、単球性白血病細胞株である。
いくつかの異なるがん細胞株に対するS76およびS77の応答の比較
クローニングされたNK92細胞株S76およびS77を、いくつかの細胞株に対するその応答に基づいて比較した。Jurkatは、T細胞白血病のモデルであり、J1.1細胞は、HIV感染後のJurkatに由来した。K562は、赤白血病細胞株である。SupT1は、T細胞リンパ腫細胞株であり、THP1は、単球性白血病細胞株である。
クローニングされたNK92細胞株S76およびS77を、異なるがん細胞株とE:T比1:1で4時間混合した。CD107aをフローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図19に示すように、クローンS76は、試験した複数のがん細胞株に対してS77より良好に応答した。
(実施例18)
複数の細胞株に対するS76の応答の試験
S76細胞株の応答を、ゾレドロン酸による処置後の複数のがん細胞株に対して試験した。PC3は、University of Maryland、Baltimoreから得た前立腺がん細胞亜株である。PC3-ATCCは、American Type Culture Collectionから得た。
複数の細胞株に対するS76の応答の試験
S76細胞株の応答を、ゾレドロン酸による処置後の複数のがん細胞株に対して試験した。PC3は、University of Maryland、Baltimoreから得た前立腺がん細胞亜株である。PC3-ATCCは、American Type Culture Collectionから得た。
S76細胞株を、いくつかのがん細胞株のいずれかと1:1の比で4時間混合した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図20に示すように、S76細胞株は、全ての試験した細胞株に対する応答を示し、応答は通常、低用量ゾレドロン酸の後ではより高かった。ゾレドロン酸は、本試験において試験した唯一のT細胞標的であるDaudiまたはC8166細胞に対する応答にはほとんど効果を有しなかった。
(実施例19)
Daudi細胞株に対するS76細胞株の応答に及ぼすマイトマイシンCの効果の試験
クローニングされたS76細胞を、増殖を防止するために不活化した後、細胞をがん患者に注射した。マイトマイシンC(「MMC」)を使用して照射を模倣し、細胞がMMC処置後でもなおも機能的であるか否かを試験した。照射も同様に使用してもよい。
Daudi細胞株に対するS76細胞株の応答に及ぼすマイトマイシンCの効果の試験
クローニングされたS76細胞を、増殖を防止するために不活化した後、細胞をがん患者に注射した。マイトマイシンC(「MMC」)を使用して照射を模倣し、細胞がMMC処置後でもなおも機能的であるか否かを試験した。照射も同様に使用してもよい。
クローニングされたS76細胞を、MMCの様々な濃度で1または2時間処置した。MMC処置後、S76を、Daudi細胞と2:1の比で4時間混合した。CD107aをフローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
図21に示すように、MMC処置は、本明細書で試験した最高用量による2時間の処置後であってもクローンS76細胞の機能を有意に損なわなかった。
(実施例20)
C8166細胞に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
クローンS76を、CD107a発現に基づいていくつかの細胞株に対して最も良好な応答を示したことからさらなる開発のための候補として選択した。本発明者らは次に、細胞傷害アッセイを使用して結果を確認しようとした。本発明者らは、本アッセイにおいてクローニングされたS76細胞株(本明細書において、「NK92γδTCR-S76」とも呼ばれる)およびNK92γδTCR-5細胞株を比較した。
C8166細胞に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
クローンS76を、CD107a発現に基づいていくつかの細胞株に対して最も良好な応答を示したことからさらなる開発のための候補として選択した。本発明者らは次に、細胞傷害アッセイを使用して結果を確認しようとした。本発明者らは、本アッセイにおいてクローニングされたS76細胞株(本明細書において、「NK92γδTCR-S76」とも呼ばれる)およびNK92γδTCR-5細胞株を比較した。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OR)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株を、ゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する比(E:T)で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Wallac Victor2 1420マルチチャネルカウンター(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
図22に示すように、NK92γδTCR-S76は、NK92γδTCR-5と比較して、C8166細胞またはゾレドロン酸(1μM)処置C8166細胞に対して高い細胞傷害を示した。1μM濃度のゾレドロン酸は、NK92γδTCR-S76またはNK92γδTCR-5による細胞死滅を変化させなかった。これらは、以前のCD107aアッセイと一致する。
(実施例21)
SNU447細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、SNU447細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。SNU447は白血病細胞株であり、細胞は、エプスタインバーウイルスによって形質転換された。
SNU447細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、SNU447細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。SNU447は白血病細胞株であり、細胞は、エプスタインバーウイルスによって形質転換された。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OR)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する比(E:T)で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Wallac Victor2 1420マルチチャネルカウンター(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
図23Aに示すように、NK92γδTCR-S76は、SNU447細胞またはゾレドロン酸(1μM)処置SNU447細胞に対してNK92γδTCR-5より高レベルの細胞傷害を示した。1μM濃度のゾレドロン酸は、NK92γδTCR-S76またはNK92γδTCR-5による細胞死滅を有意に増強した。これらは、CD107aアッセイと一致する(図23B)。
(実施例22)
A549細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、A549細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。A549細胞株は、肺腺癌のモデルである。
A549細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、A549細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。A549細胞株は、肺腺癌のモデルである。
カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OR)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する比(E:T)で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイは3連で実施した。インキュベーション後、上清を、96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Wallac Victor2 1420マルチチャネルカウンター(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
図24Aに示すように、A549は、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5に対して耐性である。1μM濃度のゾレドロン酸は、NK92γδTCR-S76またはNK92γδTCR-5による細胞死滅を増強した。NK92γδTCR-S76は、ゾレドロン酸(1μM)処置A549細胞に対してNK92γδTCR-5より高レベルの細胞傷害を示した。これらは、CD107aアッセイの結果と一致する(図24B)。
これらの結果は、A549がNK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5に耐性であることを実証する。A549をゾレドロン酸(1μM)によって処置すると、低レベルの細胞死滅が観察された。NK92γδTCR-S76は、ゾレドロン酸(1μM)処置A549に対してNK92γδTCR-5より高い細胞傷害効果を示した。その後の実験(示していない)では、10μM用量のゾレドロン酸は、クローニングされたNK92γδTCR-S76エフェクター細胞株によるA549細胞死滅を実質的に増加させた。
(実施例23)
PC3細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、PC3(UMB)細胞に対して細胞傷害性であるか否かを決定した。カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OR)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを、3連で実施した。インキュベーション後、上清を、96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をWallac Victor2 1420マルチチャネルカウンター(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
PC3細胞株に対するNK92γδTCR-S76の細胞傷害の決定
NK92γδTCR-S76が、PC3(UMB)細胞に対して細胞傷害性であるか否かを決定した。カルセイン-アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ(Molecular Probes、Eugene、OR)を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸(1μM)の非存在下または存在下で24時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、2mMカルセイン-アセトキシメチルによって37℃で15分間標識した後、PBSによって1回洗浄した。細胞を、96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Corning、NY)中、様々なエフェクターの標的に対する(E:T)比で組み合わせ、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした;アッセイを、3連で実施した。インキュベーション後、上清を、96ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をWallac Victor2 1420マルチチャネルカウンター(485/535nm)を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、(試験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)×100として計算した。
図25Aに示すように、NK92γδTCR-S76は、PC3細胞において低レベルを示した。1μM濃度のゾレドロン酸は、NK92γδTCR-S76による細胞死滅を有意に増強した。これらは、以前のCD107aアッセイ結果と一致している(図25B)。
(実施例24)
選択されたNK92γδTCR細胞クローンの表現型特徴付け
上記のように、単一細胞クローンをスクリーニングすることによって、本発明者らは、Daudiまたは他のがん細胞株に対して高い応答を示したクローンを選択した。これらのクローンの中で、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、最も良好な機能を示した。さらに、NK92γδTCR-S76は、複数の試験においてNK92γδTCR-5より良好であった。異なるクローンが異なるエフェクター機能を示した理由を理解するために、表現型解析を使用して、NK92、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5細胞におけるNK関連受容体の発現を比較した。
選択されたNK92γδTCR細胞クローンの表現型特徴付け
上記のように、単一細胞クローンをスクリーニングすることによって、本発明者らは、Daudiまたは他のがん細胞株に対して高い応答を示したクローンを選択した。これらのクローンの中で、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、最も良好な機能を示した。さらに、NK92γδTCR-S76は、複数の試験においてNK92γδTCR-5より良好であった。異なるクローンが異なるエフェクター機能を示した理由を理解するために、表現型解析を使用して、NK92、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5細胞におけるNK関連受容体の発現を比較した。
NK92、NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5細胞におけるNK関連受容体の発現を比較した。エフェクター細胞効力の差についての機序上の説明を探索した。NK92、NK92γδTCR-S76またはNK92γδTCR-5細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、異なる抗体によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。NK活性化受容体発現の相対レベルを、平均蛍光強度によって決定し、結果は以下の通りであった:
NKp30:NK92γδTCR-S76=NK92γδTCR-5>NK92
NKp44:NK92γδTCR-S76>NK92γδTCR-5>NK92
NKp46およびNKG2D:3細胞株において類似の結果
CD16:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は陰性である。頻度が低いNK92細胞はCD16陰性であり、NK92がモノクローナル細胞株ではないことを示している。驚くべきことに、本発明者らは、Daudi刺激に応答しなかった全てのγδTCR陽性NK92クローンがCD16陽性であったことを観察し、CD16が完全に予見できない機構によってγδTCRシグナル伝達を阻害することを示唆している。CD16陽性初代γδ T細胞がIPP刺激に応答しないという観察もまた、驚くべきことであった。
NK共受容体:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、NK92細胞より、2B4およびNTB-Aの低い発現を示した。
CD59、DNAM-1およびNKp80:発現は3つの細胞株において類似であった。
NK阻害性受容体:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、元のNK92細胞と比較して低レベルのNKG2AおよびTIM3を発現した。
PD1およびTIGIT:3つ全ての細胞株はPD1およびTIGITの発現を欠如した。
NKp30:NK92γδTCR-S76=NK92γδTCR-5>NK92
NKp44:NK92γδTCR-S76>NK92γδTCR-5>NK92
NKp46およびNKG2D:3細胞株において類似の結果
CD16:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は陰性である。頻度が低いNK92細胞はCD16陰性であり、NK92がモノクローナル細胞株ではないことを示している。驚くべきことに、本発明者らは、Daudi刺激に応答しなかった全てのγδTCR陽性NK92クローンがCD16陽性であったことを観察し、CD16が完全に予見できない機構によってγδTCRシグナル伝達を阻害することを示唆している。CD16陽性初代γδ T細胞がIPP刺激に応答しないという観察もまた、驚くべきことであった。
NK共受容体:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、NK92細胞より、2B4およびNTB-Aの低い発現を示した。
CD59、DNAM-1およびNKp80:発現は3つの細胞株において類似であった。
NK阻害性受容体:NK92γδTCR-S76およびNK92γδTCR-5は、元のNK92細胞と比較して低レベルのNKG2AおよびTIM3を発現した。
PD1およびTIGIT:3つ全ての細胞株はPD1およびTIGITの発現を欠如した。
このように、最も強力なNK92γδTCR-S76は、活性化受容体NKp44の最高レベルの発現を有し、阻害性受容体NKG2Aの最低レベルの発現を有した。このプロファイルは、エフェクターの効力と一致し、γδTCRおよびNK受容体の両方による腫瘍死滅の制御を反映する。
(実施例25)
NK92γδTCR-S76機能に及ぼすNKp44の試験
表現型アッセイは、NK92γδTCR-S76が、はるかに高いレベルのNKp44を発現したことを示した。本発明者らは次に、NKp44が、ブロッキングまたはアゴニスト抗NKp44抗体によって1時間前処置したNK92-γδTCR-S7NK92γδTCR-S76のより高いエフェクター機能の原因であるか否かを試験した。処置後、S76をDaudi細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を洗浄緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。図26に示すように、NKp44抗体は、Daudiが誘導したNK92-gdTCR-S76応答を有意に増強した。いずれの抗体も、単独ではNK92-gdTCR-S76応答を誘導しなかった。結果は、NKp44が、共刺激性受容体として作用して、NK92-gdTCR-S76応答を増強することができることを示した。
NK92γδTCR-S76機能に及ぼすNKp44の試験
表現型アッセイは、NK92γδTCR-S76が、はるかに高いレベルのNKp44を発現したことを示した。本発明者らは次に、NKp44が、ブロッキングまたはアゴニスト抗NKp44抗体によって1時間前処置したNK92-γδTCR-S7NK92γδTCR-S76のより高いエフェクター機能の原因であるか否かを試験した。処置後、S76をDaudi細胞によって1:1の比で4時間処置した。CD107aを、フローサイトメトリーによって測定した。CD107aを検出するために、細胞を洗浄し、50~100μlの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトVδ2-PEクローンB6およびマウス抗ヒトCD107a-APCクローンH4A3によって染色した。細胞を洗浄緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも1×104個のリンパ球(前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定)のデータを、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)において各試料から獲得した。全ての試料を、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。図26に示すように、NKp44抗体は、Daudiが誘導したNK92-gdTCR-S76応答を有意に増強した。いずれの抗体も、単独ではNK92-gdTCR-S76応答を誘導しなかった。結果は、NKp44が、共刺激性受容体として作用して、NK92-gdTCR-S76応答を増強することができることを示した。
(実施例26)
レンチウイルスの組み込み部位解析およびCD16の発現
NK92細胞を、外因性CD16遺伝子(Fc受容体)のレトロウイルス媒介組み込みによって改変されたNK92細胞株について記載されたように、ATCCから得た。外因性CD16は、腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を実施するために、これらの細胞が抗体に結合することを可能にすることを意味する。親NK92細胞は、ATCCを通して利用可能ではなく、得られなかった。
レンチウイルスの組み込み部位解析およびCD16の発現
NK92細胞を、外因性CD16遺伝子(Fc受容体)のレトロウイルス媒介組み込みによって改変されたNK92細胞株について記載されたように、ATCCから得た。外因性CD16は、腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を実施するために、これらの細胞が抗体に結合することを可能にすることを意味する。親NK92細胞は、ATCCを通して利用可能ではなく、得られなかった。
本明細書に記載される場合、本発明者らは、CD16を親NK92細胞に導入するために当初使用されたレトロウイルスベクターとは異なるレンチウイルスベクターを利用してこれらのNK92-CD16細胞を改変した。本発明者らのレンチウイルスベクターは、CD3遺伝子を細胞のDNAに組み込み、次にガンマデルタT細胞受容体の遺伝子を組み込んだ。細胞をスクリーニングして、gdTCRを発現する細胞を同定した後、腫瘍細胞株に対する効力に関して試験した。本明細書で記載されるように、本発明者らは、さらなる試験のために3つのクローン(S76、5、およびS68)を選択し、がん細胞のそれらの認識およびgdTCRの重要な機能を証明するデータを提供した。別のクローンS29を、形質導入されたが腫瘍細胞と反応しなかったために対照として選択した。
予想外に、クローンS76、5およびS68は、CD16を発現することができなかったが、非機能的S29クローンは、CD16を発現した。ATCCから得たNK92-CD16細胞の元の細胞集団では、>99%の細胞がCD16を発現し、これらの結果は驚くべきものであった。さらに調べるために、レンチウイルス組み込み部位解析を、Clontech LaboratoriesのLenti-X(商標)組み込み部位解析キットによって実施した。この解析を通して、クローニングされた細胞株S76、5およびS68は、レンチウイルスベクターの形質導入後の同じ細胞に由来したことが決定された。その結果、これらの3つのクローニングされた細胞株のレンチウイルス組み込み部位は同一である(S68において追加の組み込み部位を検出したことを除き)。CD16を発現するクローニングされたS29細胞株は、S76、5およびS68細胞株とは明らかに異なる2つのレンチウイルスベクター組み込み部位を有した。さらに、S76、5およびS68は、検出可能なレトロウイルス組み込みを有さず、それらがCD16レトロウイルスベクターによって決して形質導入されなかったこと、または形質導入されたベクターが欠失されたが、S29細胞株が、そのCD16+表現型を説明する予想されるレトロウイルス組み込みを保有したことを示唆した。
驚くべきことに、CD16の発現は、NK細胞が、gdTCRを使用することを不可能にし、CD16レトロウイルス陰性NK細胞のみが機能的gdTCRを発現することができることが発見された。本発明者らは、実質的なCD16発現を欠如するNK細胞がVγ9Vδ2 T細胞受容体の発現の増強ならびに/またはがん細胞の認識および溶解の増強を示すことを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることを望まないが、CD16発現は、CD3がVγ9Vδ2 T細胞受容体をNK細胞の細胞表面に輸送する能力を妨害し、それによってがん細胞抗原の認識を防止すると考えられる。
(実施例27)
CD16発現の下方調節
NK細胞におけるCD16のレベルは、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびに腫瘍細胞のその後の認識および死滅を容易にするために下方調節される。
CD16発現の下方調節
NK細胞におけるCD16のレベルは、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびに腫瘍細胞のその後の認識および死滅を容易にするために下方調節される。
バイオインフォマティクス解析を、CD16 mRNAコード配列標準分析ツールで実施し、阻害性RNAの最適な標的部位を規定した。20個の可能性がある標的部位のコレクションをCD16遺伝子に関して編集する。これらの20個の標的(ガイド配列)と相補的な配列を有する短鎖干渉RNA(siRNA)分子を合成し、供給業者から得る。
1つの実験に関して、siRNAガイド配列を、組み込み型ウイルスベクターにコードされるプラスミド構築物の形態で細胞に送達する。20個のsiRNAの各々が短鎖ヘアピンRNA(shRNA)の骨格内で個々に構築物の1つにコードされる、20個の構築物27A1-27A20の1セットを作製した。プロモーター/エンハンサー領域は、shRNAの上流に位置し、転写ターミネーターは、shRNAの下流に位置する。20個の追加の構築物の別のセット27B1-27B20に関して、マイクロRNA(miRNA)の骨格内に20個のsiRNAの各々が構築物の1つに個々にコードされる構築物を作製する。プロモーター/エンハンサー領域は、miRNAの上流に位置し、転写ターミネーターはmiRNAの下流に位置する。40個の構築物、27A1-27A20および27B-27B2の各々をNK細胞に個々に送達し、そこでshRNAまたはmiRNAをそれぞれ発現させ、細胞酵素によってプロセシングしてsiRNA配列の各々を放出させる。siRNA配列は、そのそれぞれの標的部位でCD16 mRNAにアニールし、CD16 mRNAのRNA切断、脱安定化、および分解を促進する。細胞形質導入アッセイを実施して、細胞表面上のCD16 mRNA、およびCD16タンパク質レベルの低減の程度を決定する。最も強力なsiRNA(すなわち、CD16 mRNAおよびCD16タンパク質発現の最低レベルをもたらすsiRNA)を、さらなる実験およびNK細胞改変のために選択する。
多様なNK細胞を試験するために選択する。初代NK細胞、不死化NK細胞、骨髄造血幹細胞前駆細胞(HSCPC)、および胚幹細胞(ES細胞)を得、先の節で選択した最も強力なsiRNAをコードする構築物によって改変した。CD16 mRNAおよびタンパク質レベルを決定し、最低レベルのCD16発現を有するNK細胞を選択した。CD16の発現が最低である細胞を、先の実施例で記載したアッセイを使用してがん細胞株を認識および溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変NK細胞を、in vivoでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。
(実施例28)
CD16遺伝子の編集
CD16遺伝子は、CD16タンパク質の発現を防止するために、このように、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞において編集される。
CD16遺伝子の編集
CD16遺伝子は、CD16タンパク質の発現を防止するために、このように、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞において編集される。
第1の実験では、CD16 mRNA配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、CRISPRガイドRNAの最適な標的部位を規定した。第2の実験では、CD16 mRNA配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識にとって最適な標的部位を規定する。第1の実験では、CD16 mRNA配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、TALEN認識部位の最適な標的部位を規定する。20個のガイド配列のコレクションを、3つの実験の各々のために編集する。
編集構築物をNK細胞に送達し、これらの編集構築物は、CD16遺伝子におけるそのそれぞれの標的配列を認識し、変異(欠失を含む)を導入して、遺伝子発現を不活化する。個々の遺伝子編集構築物を、細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較し、二対立遺伝子性のCD16遺伝子改変の効率を決定する。限界希釈を使用して、クローン性の細胞株を単離および成長させ、CD16 mRNAおよびCD16タンパク質の発現を、先の実施例に記載したように各々の単離された細胞株について決定する。ゲノムDNAを、最低レベルのCD16発現を有する細胞から精製し、CD16遺伝子の二対立遺伝子性の不活化を確認する。
1つの実験では、CD16対立遺伝子の二対立遺伝子性の改変を有するNK細胞に、CD3タンパク質およびガンマデルタT細胞受容体をコードする組み込み型ベクターを形質導入する。CD3およびTCRに関して陽性の細胞を出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。
別の実験では、CD16対立遺伝子の二対立遺伝子性改変を有するNK細胞に、CD3タンパク質およびガンマデルタT細胞受容体をコードする非組み込み型ベクターを形質導入する。CD3およびTCRに関して陽性の細胞を出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変されたNK細胞を、in vivoでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。
(実施例29)
ガンマデルタTCRの発現および機能を容易にするための、CD3タンパク質の過剰発現
CD3タンパク質を、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞において過剰発現させる。
ガンマデルタTCRの発現および機能を容易にするための、CD3タンパク質の過剰発現
CD3タンパク質を、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、gdTCR発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、NK細胞において過剰発現させる。
第1の実験では、NK細胞に、CMVプロモーターの制御下でCD3タンパク質コード領域を発現する組み込み型ウイルスベクターを形質導入する。CD3タンパク質の高レベル発現が得られる。第2の実験では、NK細胞に、CMVプロモーターの制御下でCD3タンパク質コード領域を発現する非組み込み型ウイルスベクターを形質導入する。CD3タンパク質の高レベル発現を得る。CD3発現の定量的分析を、抗体染色およびフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または当技術分野で公知の任意の好適な技術を使用して実施し、高レベルのCD3発現を確認する。
さらなる実験では、高レベルのCD3タンパク質発現を有するNK細胞に、ガンマデルタT細胞受容体をコードする組み込み型を形質導入する。CD3およびgdTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。別の実験では、高レベルのCD3タンパク質発現を有するNK細胞に、ガンマデルタT細胞受容体をコードする非組み込み型を形質導入する。CD3およびgdTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。
CD3およびgdTCRに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変されたNK細胞を、in vivoでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。
配列
以下の配列を本明細書において参照する:
配列
以下の配列を本明細書において参照する:
ある特定の好ましい実施形態を記載し、上記で具体的に例証してきたが、本開示は、そのような好ましい実施形態に限定されないと意図される。本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変をそれらに行ってもよい。
Claims (60)
- 少なくとも1つのT細胞受容体を発現するNK細胞を含む改変されたNK細胞であって、前記少なくとも1つのT細胞受容体が少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む、改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、CD3タンパク質をさらに発現する、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記少なくとも1つのδ鎖が、δ1鎖、δ2鎖、δ3鎖、およびδ5鎖のうちのいずれか1つまたは複数を含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記少なくとも1つのδ鎖がδ2鎖を含む、請求項4に記載の改変されたNK細胞。
- 前記少なくとも1つのγ鎖がγ9鎖を含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記少なくとも1つのT細胞受容体が、少なくとも1つのVγ9Vδ2 T細胞受容体を含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記少なくとも1つのT細胞受容体がCD16を発現しない、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、NK92細胞、KHYG-1細胞、NKL細胞、NKG細胞、NK-YS細胞、HANK-1細胞、またはYT細胞を含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、NK92細胞を含む、請求項9に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、初代NK細胞を含む、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- アミノビスホスホネート薬;および
請求項1に記載の改変されたNK細胞
の組合せを含む、がんを処置するための医薬組成物。 - 前記アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記組合せが、固定された組合せを含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記組合せが、固定されない組合せを含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- FDPSの阻害剤をさらに含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記FDPSの阻害剤がshRNAまたはマイクロRNAを含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- CD16のアンタゴニストをさらに含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記CD16のアンタゴニストが、siRNA、shRNAまたはmiRNAを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の請求項1に記載の改変されたNK細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのがんを有する、請求項20に記載の方法。
- 前記対象に、有効量のアミノビスホスホネート薬を投与することをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記アミノビスホスホネート薬が、前記改変されたNK細胞とは別個に投与される、請求項22に記載の方法。
- 前記アミノビスホスホネート薬が、前記改変されたNK細胞と共に投与される、請求項22に記載の方法。
- 有効量のFDPSの阻害剤を投与することをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤が、前記改変されたNK細胞とは別個に投与される、請求項26に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤が、前記改変されたNK細胞と共に投与される、請求項26に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤が、shRNAまたはマイクロRNAを含む、請求項26に記載の方法。
- 有効量のCD16のアンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、前記改変されたNK細胞とは別個に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、前記改変されたNK細胞と共に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、siRNA、shRNAまたはmiRNAを含む、請求項30に記載の方法。
- 有効量の請求項12に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんを処置する方法。
- 前記対象が、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの1つまたは複数から選択される少なくとも1つのがんを有する、請求項34に記載の方法。
- アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項34に記載の方法。
- 有効量のFDPSの阻害剤を投与することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤が、前記医薬組成物とは別個に投与される、請求項37に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤が、前記医薬組成物と共に投与される、請求項37に記載の方法。
- 前記FDPSの阻害剤がshRNAまたはマイクロRNAを含む、請求項37に記載の方法。
- 有効量のCD16の阻害剤を投与することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、前記医薬組成物とは別個に投与される、請求項41に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、前記医薬組成物と共に投与される、請求項41に記載の方法。
- 前記CD16のアンタゴニストが、shRNAまたはマイクロRNAを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記NK細胞が、実質的なCD16発現の欠如に関して選択される、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- NK細胞が、モノクローナル細胞株の限界希釈および増大によって選択される、請求項46に記載の改変されたNK細胞。
- CD16発現が拮抗される、請求項46に記載の改変されたNK細胞。
- CD16発現が、CD16 mRNAを標的としてその発現を干渉する低分子RNAによって拮抗される、請求項46に記載の改変されたNK細胞。
- 前記低分子RNAが、siRNA、miRNAまたはshRNAである、請求項48に記載の改変されたNK細胞。
- CD16発現が、遺伝子編集系によってCD16遺伝子の1つまたは両方のコピーを不活化することによって拮抗される、請求項47に記載の改変されたNK細胞。
- 前記遺伝子編集系が、CRISPR/Cas系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(「TALEN」)系を含む、請求項50に記載の改変されたNK細胞。
- CD16発現が、標的化タンパク質分解体によって拮抗される、請求項47に記載の改変されたNK細胞。
- 前記標的化タンパク質分解体が、タンパク質分解標的化キメラ分子(「PROTAC」)分解体、分子糊分解体、またはユビキチンリガーゼ修飾因子を含む、請求項52に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、患者の血液から精製された初代NK細胞である、請求項1に記載の改変されたNK細胞。
- 前記NK細胞が、白血球アフェレーシスおよび/または密度勾配遠心分離によって精製される、請求項54に記載の改変されたNK細胞。
- 精製された前記NK細胞がex vivoで増大される、請求項55に記載の改変されたNK細胞。
- 前記改変されたNKが、少なくとも1つのT細胞受容体をコードする1つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターをさらに形質導入され、前記少なくとも1つのT細胞受容体が少なくとも1つのγ鎖および少なくとも1つのδ鎖を含む、請求項47に記載の改変されたNK細胞。
- 少なくとも1つのNK細胞受容体をさらに含む、請求項57に記載の改変されたNK細胞。
- 少なくとも1つのCD3タンパク質をさらに含む、請求項58に記載の改変されたNK細胞。
- 請求項45~59のいずれかに記載の改変されたNK細胞を含む医薬組成物。
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