JP2024503883A - 操作されたｎｋ細胞およびがんを処置する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、概して、改変されたＮＫ細胞組成物および免疫療法適用において改変された細胞組成物を使用する方法に関する。実施形態では、改変された細胞は、γ鎖およびδ鎖を発現する。実施形態では、改変されたＮＫ細胞組成物は、様々ながんを処置するために使用することができる。一態様では、少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するＮＫ細胞を含む改変されたＮＫ細胞が提供される。実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１月２１日に提出され、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＮＫ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＣＡＮＣＥＲ」という表題の米国仮特許出願第６３／１４０，１１８号の優先権を主張する。

分野
本開示は、概してがんの処置および防止のための免疫療法における操作されたＮＫ細胞の使用に関する。

背景
生物の免疫系は、ウイルス、細菌、毒素、寄生虫、および木片を含む多様な病原体および外部侵入体を検出して応答することによって生物を疾患から保護する。免疫系は、臓器、細胞、および分子の複雑なネットワークで構成されている。ヒトを含む多くの生物は、免疫系の２つの主な下位区分、すなわち自然免疫系および適応免疫系を有する。自然免疫系は、急速に活性化されて病的な細胞を認識して破壊することができる急速な応答系であるが、適応免疫系は、特定の病原体と闘うためにそれらとの以前の遭遇に依存する遅い応答系である。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、顆粒状のリンパ球であり、自然免疫系のエフェクター細胞である。それらは、リンパ系組織および非リンパ系組織の両方に存在し、ＴおよびＢ細胞などの適応免疫系のリンパ球とは異なる。ＮＫ細胞は通常、その細胞表面上にＣＤ３も抗原特異的受容体も発現しない。ヒトでは、ＣＤ５６は、ＮＫ細胞のマーカーとして働くことができる。ＮＫ細胞は、事前の免疫化を必要とすることなく、ウイルス感染細胞を検出して除去するための迅速な応答および腫瘍細胞の免疫監視に関係している。

腫瘍およびウイルス感染症に対する自然免疫応答におけるその役割を考慮すると、ＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫療法、炎症性および自己免疫障害ならびに臓器移植などの分野において革新的治療を開発するための努力において有望であり得る。

概要
一態様では、少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するＮＫ細胞を含む改変されたＮＫ細胞が提供される。実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ３タンパク質をさらに発現する。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ１鎖、δ２鎖、δ３鎖、およびδ５鎖のうちのいずれか１つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖はδ２鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのγ鎖はγ９鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ９２細胞、ＫＨＹＧ－１細胞、ＮＫＬ細胞、ＮＫＧ細胞、ＮＫ－ＹＳ細胞、ＨＡＮＫ－１細胞、またはＹＴ細胞を含む。実施形態では、ＮＫ細胞はＮＫ９２細胞を含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞を含む。他の実施形態では、ＮＫ細胞は、不死化ＮＫ細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、骨髄造血幹細胞前駆細胞（ＨＳＣＰＣ）または胚幹細胞（ＥＳ細胞）に由来する。

一態様では、実質的なＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞が提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６発現の欠如に関して選択される。一部の実施形態では、ＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞は、限界希釈およびモノクローナルＮＫ細胞株の増大によって選択される。ＣＤ１６タンパク質発現は、抗ＣＤ１６抗体を使用するウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーを含む標準的な方法によって決定することができる。ＣＤ１６ ｍＲＮＡ発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＲＴ－ＰＣＲ、または次世代ＲＮＡ配列決定（すなわち、ＲＮＡ－ｓｅｑ）を含む標準的な方法によって決定することができる。

さらなる態様では、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６発現は拮抗される。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６発現は、ＣＤ１６ ｍＲＮＡを標的として、その発現を干渉する低分子ＲＮＡによって拮抗される。一部のそのような実施形態では、低分子ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。

別の態様では、ＣＤ１６発現は、遺伝子編集系によってＣＤ１６遺伝子の１つまたは両方のコピーの発現を不活化することによって拮抗される。ある特定のそのような実施形態では、遺伝子編集系は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）系などのヌクレオチド誘導型ヌクレアーゼを含む。さらなる実施形態では、ＣＤ１６発現は、標的化タンパク質分解体（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄｅｒ）、例えばタンパク質分解標的化キメラ分子（「ＰＲＯＴＡＣ」）分解体、分子糊分解体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｌｕｅ ｄｅｇｒａｄｅｒ）、またはユビキチンリガーゼ修飾因子によって拮抗される。

一態様では、ＮＫ細胞は、患者の血液から精製された初代ＮＫ細胞である。一部のそのような実施形態では、ＮＫ細胞は、例えば白血球アフェレーシスまたは密度勾配遠心分離などの当技術分野で公知の任意の方法によって精製される。ある特定の実施形態では、精製されたＮＫ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させ、少なくとも１つのＴ細胞受容体をコードする１つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターを形質導入し、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む。さらにそのような実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む。実施形態では、精製されたＮＫ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させ、ＣＤ３タンパク質を発現させるためのベクターを細胞に形質導入する。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ１鎖、δ２鎖、δ３鎖、およびδ５鎖のうちのいずれか１つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ２鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのγ鎖はγ９鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含む。

別の態様では、精製されたＮＫ細胞は、内因性のＣＤ１６遺伝子の１つまたは両方のコピーを不活化するように遺伝子編集された後、少なくとも１つのＴ細胞受容体および／または少なくとも１つのＣＤ３タンパク質をコードするウイルスベクター（組み込み型または非組み込み型）を形質導入され、その後ＣＤ１６の発現を欠如するＮＫ細胞に関して選択された後、ｅｘ ｖｉｖｏで増大される。これらの実施形態のある特定のものでは、改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を最初に精製した患者に戻すように送達される。他の実施形態では、改変されたＮＫ細胞は、異なる患者に送達される。

他の態様では、上記の改変されたＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞の医薬組成物は、ＣＤ１６の阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ１６アンタゴニストをさらに含む。ＣＤ１６アンタゴニストは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、標的化タンパク質分解体、低分子阻害剤、抗ＣＤ１６抗体等を含み得る。実施形態では、１つまたは複数の内因性のＣＤ１６遺伝子が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するＮＫ細胞から不活化されるかまたは欠失される。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６のアンタゴニストは、医薬組成物とは別個に投与される。他の実施形態では、ＣＤ１６の阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。

さらなる態様では、医薬組成物はがんを処置するために有用であり、組成物は、アミノビスホスホネート薬；および本明細書に記載される任意の改変されたＮＫ細胞の組合せを含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、ゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。実施形態では、医薬組成物は、ＦＤＰＳの阻害剤をさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。

一態様では、アミノビスホスホネート薬；および本明細書に記載される任意の改変されたＮＫ細胞の組合せを含む、がんを処置するための医薬組成物が提供される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。実施形態では、医薬組成物は、ＦＤＰＳの阻害剤をさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される改変されたＮＫ細胞のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｕｍｏｒ）、またはその混合物のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのがんを有する。実施形態では、方法は、有効量のアミノビスホスホネート薬を対象に投与することをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたＮＫ細胞と共に投与される。実施形態では、方法は、有効量のＦＤＰＳの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、改変されたＮＫ細胞と共に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。
本開示において

図１は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含むように操作されているＮＫ９２細胞の概略図を示す。

図２は、環状型の例示的な３ベクターレンチウイルスベクター系を示す。

図３は、環状型の例示的な４ベクターレンチウイルスベクター系を示す。

図４は、（ｉ）ＣＤ３タンパク質（ガンマ、デルタ、イプシロン、およびゼータ）、および（ｉｉ）ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡを発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルス導入プラスミドを示す。

図５は、（ｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現することが可能な線形ベクターマップ、（ｉｉ）ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡを発現することが可能な線形ベクターマップ、および（ｉｉｉ）ＣＤ３を発現することが可能な線形ベクターマップを示す。

図６Ａは、フローサイトメトリーデータを示し、左のパネルと比較して、右のパネルは、γδ Ｔ細胞受容体およびＣＤ３タンパク質が富化されたＮＫ９２細胞を示す。

図６Ｂは、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体陽性ＮＫ９２細胞のみがゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞に応答したことを示すフローサイトメトリーデータを示す。

図６Ｃは、γδＴ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞が、ゾレドロン酸による処置後にＣ８１６６細胞を溶解することができたことを示すグラフを示す。

図７は、形質導入に関して陽性であった個々の細胞が増大のために選択される、形質導入されたＮＫ９２細胞の限界希釈クローニングの概略図を示す。

図８は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを使用する、形質導入細胞のいくつかの亜株のスクリーニングを示す。結果は、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株が、ゾレドロン酸によって処置したＣ８１６６細胞に曝露した場合に最も応答性の亜株であったことを示す。 同上。

図９は、ＴＮＦα発現アッセイを使用する、形質導入細胞のいくつかの亜株のスクリーニングを示す。結果は、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株が、Ｃ８１６６細胞に曝露され、ゾレドロン酸によって処置した場合の最も応答性の亜株であったことを実証している。 同上。

図１０は、Ｂリンパ芽球様細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞）を、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５（ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ）亜株に曝露した細胞傷害アッセイを示す。ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株は、Ｄａｕｄｉ細胞を死滅させることが可能であった；死滅は、ゾレドロン酸による処置後に増加した。

図１１は、Ｄａｕｄｉ細胞標的による脱顆粒アッセイを使用して、ＮＫ９２細胞 対 ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株（図１１において「ＮＫ９２－γδＴＣＲ」と表示）のスクリーニングを示す。ＮＫ９２細胞と比較して、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株は、強力な応答を示した。

図１２は、Ｄａｕｄｉ細胞標的によるＴＮＦα発現アッセイを使用して、ＮＫ９２細胞 対 ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株（図１２において「ＮＫ９２－γδＴＣＲ」と表示）のスクリーニングを示す。ＮＫ９２細胞と比較して、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株は、強力な応答を示した。

図１３は、ＴＵ１６７腫瘍細胞標的をＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露した細胞傷害アッセイを示す（図１３において「ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ」と表示）。ＴＵ１６７細胞を、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露し、ゾレドロン酸によって処置した場合に、細胞の強力な死滅が観察された。最も強力な細胞の死滅は、ＴＵ１６７細胞に、（ｉ）ファルネシル二リン酸シンターゼのｍｉＲＮＡ阻害剤（ＬＶ－ＦＤＰＳ）を発現するベクターを形質導入した場合、およびＴＵ１６７細胞を（ｉｉ）ゾレドロン酸によって処置した場合に観察された。

図１４は、Ｈｕｈ７腫瘍細胞標的をＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露した細胞傷害アッセイを示す（図１４において「ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ」と表示）。Ｈｕｈ７細胞を、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露し、ゾレドロン酸によって処置した場合に、強力な死滅が観察された。強力な死滅はまた、Ｈｕｈ７細胞を、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露し、ファルネシル二リン酸シンターゼの阻害剤（ＬＶ－ＦＤＰＳ）を発現するベクターと共にゾレドロン酸によって処置した場合にも観察された。

図１５は、ＮＫ９２（対照）およびＮＫ９２－γδＴＣＲ－５を付加したクローニングされたＮＫ９２－γδＴＣＲ細胞株のスクリーニング結果を示す。腫瘍細胞（「Ｄａｕｄｉ」）または腫瘍細胞プラスゾレドロン酸（「Ｄａｕｄｉ＋Ｚｏｌ」）に対するクローニングされた細胞株の応答を、Ｖδ２およびＣＤ１０７ａの存在に関して陽性の細胞染色のパーセンテージによって示す。ここで（および図面全体を通して）、「Ｍｅｄ」は、細胞を増殖培地のみに曝露した陰性対照を表す。 同上。 同上。 同上。

図１６は、クローニングされたＶγ２Ｖδ２ＴＣＲ／ＣＤ３操作ＮＫ９２（ＮＫ９２γδＴＣＲ）細胞のＣ８１６６細胞に対する応答によるスクリーニングの結果を示す。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現する選択されたＮＫ９２細胞クローンを、培地またはＣ８１６６細胞によって４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図１７は、クローニングされたＶγ２Ｖδ２ＴＣＲ／ＣＤ３操作ＮＫ９２（ＮＫ９２γδＴＣＲ）細胞の、異なる細胞株に対する応答によるスクリーニングの結果を示す。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現する選択されたＮＫ９２細胞クローンを、培地または異なる細胞株によって４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。 同上。 同上。

図１８は、クローニングされたＶγ２Ｖδ２ＴＣＲ／ＣＤ３操作ＮＫ９２（ＮＫ９２γδＴＣＲ）細胞の、Ｈｕｈ７またはゾレドロン酸処置Ｈｕｈ７細胞に対する応答によるスクリーニングの結果を示す。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現する選択されたＮＫ９２細胞を、培地またはＣ８１６６細胞によって４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。 同上。 同上。

図１９は、ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６およびＳ７７の、複数のがん細胞株に対する応答を比較する結果を示す。ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６およびＳ７７を、培地または異なる細胞株によって４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図２０は、ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６の、培地単独または１μＭゾレドロン酸によって処置した複数のがん細胞株に対する結果を示す。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図２１は、ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６のＤａｕｄｉ細胞に対する応答に及ぼすマイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）処置の結果を示す。ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６を、様々な濃度のＭＭＣによって１または２時間処置した。ＭＭＣ処置後、Ｓ７６を、Ｄａｕｄｉ細胞によって２：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図２２は、Ｃ８１６６細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を評価する結果を示す。Ｃ８１６６またはゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で各条件について３連のウェルで評価した。

図２３Ａ～２３Ｂは、ＳＮＵ４４７細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害および脱顆粒アッセイの結果を示す。図２３Ａは、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で各条件について３連のウェルで評価した、ＳＮＵ４４７またはゾレドロン酸処置ＳＮＵ４４７細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を示す。図２３Ｂは、培地、ＳＮＵ４４７、またはゾレドロン酸処置ＳＮＵ４４７細胞によって４時間処置したＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を示す。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図２４Ａ～２４Ｂは、Ａ５４９細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害および脱顆粒アッセイを示す。図２４Ａは、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で各条件について３連のウェルで評価した、Ａ５４９またはゾレドロン酸処置Ａ５４９細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を示す。図２４Ｂは、培地、Ａ５４９、またはゾレドロン酸処置Ａ５４９細胞によって４時間処置したＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を示す。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

図２５Ａ～２５Ｂは、ＰＣ３細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害および脱顆粒アッセイを示す。図２５Ａは、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で各条件について３連のウェルで評価した、ＰＣ３またはゾレドロン酸処置ＰＣ３細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害を示す。図２５Ｂは、培地、ＰＣ３、またはゾレドロン酸処置ＰＣ３細胞によって４時間処置したＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６を示す。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。

図２６は、Ｄａｕｄｉ細胞に対するＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ－Ｓ７６の応答に及ぼすＮＫｐ４４抗体の効果を示す。ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンＳ７６を、ブロッキング抗体またはアゴニスト抗ＮＫｐ４４抗体によって１時間処置した。処置後、Ｓ７６を、Ｄａｕｄｉ細胞によって１：１比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａは、細胞応答のマーカーとして検出された。 同上。

詳細な説明
概要
本開示は、Ｔ細胞受容体によって改変されているＮＫ細胞およびそれらを使用して様々ながんを処置する方法に関する。実施形態では、Ｔ細胞受容体は、γδ Ｔ細胞受容体である。実施形態では、処置されるがんは、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん（ｍｉｘｅｄ ｔｙｐｅ）、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちのいずれか１つまたは複数である。

定義および解釈
特に本明細書で定義していない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般的に使用される。本開示の方法および技術は一般的に、当技術分野で周知の通常の方法に従って、および特に示していない限り本明細書を通して引用および考察される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.(2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc.(2003)を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造元の仕様書に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および創薬化学に関連して使用される命名法、それらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。当業者に明白ではない用語の使用がある場合、それが使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語の最大でプラスマイナス１０％を意味する。

本明細書で使用される場合、活性剤「の投与」、または「投与すること」という用語は、処置を必要とする対象に、活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療的有効量でその個体の体に導入することができる形態で提供することを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ４１８」、「ＡＧＴ４０１」、および「ＡＧＴ４１９」は、図５に例証されるベクターを指す。

本明細書で使用される場合、「アミノビスホスホネート」という用語は、ビスホスホネートの任意のアミノ誘導体を指す。ビスホスホネートは、炭素に共有結合した２つのホスホネート基を含有する化学物質である。

本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という用語または変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載される整数または整数の群を含むことを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないと理解される。さらに、本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、限定なく含むことを意味する。「発現」、「発現された」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／またはそれによって転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングまたは転写後修飾もしくは翻訳後修飾の他の形態を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ファルネシル二リン酸シンターゼ」という用語はまた、本明細書においてＦＤＰＳとも呼ばれ、本明細書においてファルネシルピロリン酸シンターゼまたはＦＰＰＳとも呼ばれ得る。

本明細書で使用される場合、「ガンマデルタＴ細胞受容体」という用語は、少なくとも１つのガンマ鎖および少なくとも１つのデルタ鎖を含有する任意のＴ細胞受容体を指す。ガンマデルタＴ細胞受容体はまた、本明細書においてγδ Ｔ細胞受容体、ＧＤ Ｔ細胞受容体、またはｇｄ Ｔ細胞受容体とも呼ばれ得る。

「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生体内で起こるプロセスを指す。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、生体外で起こるプロセスを指す。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ処置は、患者の体内で起こる処置を指すが、ｅｘ ｖｉｖｏ処置は、患者の体外であるが、依然としてその患者の組織を使用する、または組織にアクセスする、または組織と相互作用する処置を指す。その後、ｅｘ ｖｉｖｏ処置ステップは、その後のｉｎ ｖｉｖｏ処置ステップを含み得る。

「ｍｉＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡを指し、本明細書において「ｍｉＲ」とも呼ばれ得る。「マイクロＲＮＡクラスター」という用語は、互いに密接な近位でベクター上に存在し、共に同時発現される少なくとも２つのマイクロＲＮＡを指す。

「ナチュラルキラー細胞」という用語（「ＮＫ細胞」としても公知である）は、自然免疫系において機能するタイプのリンパ球を指す。用語は、天然に存在する任意のナチュラルキラー細胞を包含する。用語はまた、任意の合成ナチュラルキラー細胞、例えば細胞株に由来するナチュラルキラー細胞も包含する。

「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現させるために使用することができる任意の細胞株を指す。

「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、最大に一致するように比較および整列させた場合に、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つ、または目視検査を使用して測定した場合に同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較の場合、典型的に１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列に関するパーセント配列同一性を計算する。

比較のための配列の最適なアライメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによるインプリメンテーションによって、または目視検査（一般的に、Ausubel et al.、下記を参照されたい）によって実行することができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト上で公開されている。

２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで入手可能）を使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のパーセント同一性はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付き残差表、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して決定することができる。

本開示の核酸およびタンパク質配列を、さらに「クエリ配列」として使用して、公共のデータベースに対して検索し、例えば近縁の配列を同定することができる。そのような検索は、Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２によって実施し、核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によって実施し、タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）」という用語は「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ Ｎｏ．）」という用語と同義である。

本明細書で使用される場合、「低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）」は、一般的に長さ約２００ヌクレオチド未満またはそれ未満であり、サイレンシングまたは干渉機能を保有する非コードＲＮＡを指す。他の実施形態では、低分子ＲＮＡは、長さが約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満である。そのようなＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。本開示の「低分子ＲＮＡ」は、例えば標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊をもたらす経路を通して、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害またはノックダウンすることが可能でなければならない。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト患者を含むが、同様に他の哺乳動物も含む。「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。

「治療有効量」という用語は、所定の病気、傷害、疾患、または状態に罹患している患者において認められる症状、進行または合併症の発症を処置または防止するために好適な組成物において好適な剤形での活性剤の十分量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度の状況、処置される対象の年齢、体重等に応じて変化する。治療有効量は、例えば投与経路、対象の状態、ならびに当業者によって理解される他の要因を含むいくつかの要因のいずれかに応じて変化し得る。

「処置」または「処置すること」という用語は、一般的に処置される対象の自然経過を変更する試みの介入を指し、予防のために、または臨床病理学の経過の間に実施され得る。所望の効果は、これらに限定されないが、疾患の発生または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾患の任意の直接または間接的な病的帰結を抑制する、減少させる、または阻害すること、疾患状態を改善または緩和すること、および寛解または改善された予後を引き起こすことを含む。

本明細書で使用される場合、「Ｖγ９Ｖδ２」という用語は、ブチロフィリンのコンフォメーション変化を認識することが可能なタイプのγδ受容体を指す。Ｖγ９Ｖδ２という用語は、Ｖｇ９Ｖｄ２と同義である。Ｖγ９Ｖδ２は、Ｖγ９ＪＰＶδ２（Ｖｇ９ＪＰＶｄ２）の略語である。Ｖは領域を指し、Ｖ２領域、Ｖ３領域、Ｖ４領域、Ｖ８領域、およびＶ９領域のうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。γは、少なくとも１つのγ鎖を指し、定常領域Ｃ１およびＣ２のうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。Ｊは、少なくとも１つのＪ領域を指し、ＪＰ１領域、ＪＰ領域、Ｊ１領域、ＪＰ２領域、およびＪ２領域のうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。

本開示の態様および実施形態の説明
一態様では、少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するＮＫ細胞を含む、改変されたＮＫ細胞が提供される。実施形態では、ＮＫ細胞は少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む。

実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ３タンパク質複合体をさらに発現する。実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体は、ＣＤ３タンパク質ガンマ、デルタ、イプシロン、およびゼータのうちのいずれか１つまたは複数を含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、それが、ＣＤ３タンパク質－ＣＤ３タンパク質ガンマ、ＣＤ３タンパク質デルタ、ＣＤ３タンパク質イプシロン、およびＣＤ３タンパク質ゼータの各々を含有するように改変される。実施形態では、ＮＫ細胞においてＣＤ３タンパク質を発現させるために使用するベクターはＡＧＴ４１９である（図５を参照されたい）。

実施形態では、ＣＤ３タンパク質を発現するベクターは、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号９と少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、ＣＤ３タンパク質を発現するベクターは配列番号９を含む。

実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ１鎖、δ２鎖、δ３鎖、およびδ５鎖のうちのいずれか１つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ２鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのγ鎖はγ９鎖を含む。

実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含む。実施形態では、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体は天然に存在する。実施形態では、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体は合成である。実施形態では、ＮＫ細胞においてＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現させるために使用するベクターはＡＧＴ４１８である（図５を参照されたい）。

実施形態では、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するベクターは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性、例えば配列番号５と少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するベクターは配列番号５を含む。

実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ９２細胞、ＫＨＹＧ－１細胞、ＮＫＬ細胞、ＮＫＧ細胞、ＮＫ－ＹＳ細胞、ＨＡＮＫ－１細胞、またはＹＴ細胞を含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ９２細胞を含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、任意の公知のＮＫ細胞株に由来するＮＫ細胞を含む。

実施形態では、ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞を含む。

一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、アミノビスホスホネート薬；および本明細書に記載される任意の改変されたＮＫ細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、ゾレドロン酸を含む。実施形態では、組合せは、固定された組合せを含む。実施形態では、組合せは、固定されない組合せを含む。

実施形態では、医薬組成物は、ＦＤＰＳの阻害剤をさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、低分子ＲＮＡである。実施形態では、低分子ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。

実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかと少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかを含む。

実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号６４、６５、または６６のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号６４、６５、または６６のいずれかと少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号６４、６５、または６６のいずれかを含む。

実施形態では、ベクターを使用して低分子ＲＮＡを発現させる。実施形態では、使用されるベクターはＡＧＴ４０１である（図５を参照されたい）。実施形態では、ＡＧＴ４０１のｓｈＲＮＡカセットを、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの代わりに使用する。実施形態では、ＡＧＴ４０１の転写のＨ１プロモーターを、転写のＥＦ１αプロモーターの代わりに使用する。

一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの競合的阻害剤；および本明細書に記載される任意の改変されたＮＫ細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。実施形態では、酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの競合的阻害剤は、ゾレドロン酸、アレンドロネート、パミドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、またはエチドロネートを含む。

一態様では、がんを処置するための医薬組成物であって、ビスホスホネートまたはアミノビスホスホネート化合物；および本明細書に記載される任意の改変されたＮＫ細胞の組合せを含む医薬組成物が提供される。

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される改変されたＮＫ細胞のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。

実施形態では、ＮＫ細胞はＶγ９Ｖδ２受容体を発現する。実施形態では、Ｖγ９Ｖδ２受容体は、ブチロフィリンを認識してこれと複合体を形成する。実施形態では、ブチロフィリンは、コンフォメーション変化を受けている。実施形態では、ブチロフィリンは、がん細胞に由来する。実施形態では、ブチロフィリンは、高レベルのイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の結果として腫瘍細胞においてコンフォメーション変化を受ける。

実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのがんを有する。実施形態では、対象は、本明細書に開示される任意のがんを有する。

実施形態では、方法は、有効量のアミノビスホスホネート薬を対象に投与することをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。

実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬は、改変されたＮＫ細胞と共に投与される。

実施形態では、方法は、有効量のＦＤＰＳの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、改変されたＮＫ細胞と共に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、任意の低分子ＲＮＡである。

実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかと少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号５０、５１、５２、または５３のいずれかを含む。

実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号６４、６５、または６６のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号６４、６５、または６６のいずれかと少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号６４、６５、または６６のいずれかを含む。

一態様では、がんを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。実施形態では、対象は、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのがんを有する。実施形態では、対象は、本明細書に記載される任意のがんを有する。

実施形態では、アミノビスホスホネート薬はゾレドロン酸を含む。実施形態では、方法は、有効量のＦＤＰＳの阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、医薬組成物とは別個に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。実施形態では、ＦＤＰＳの阻害剤はｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである。

ここで図１に注目し、これはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体によって改変されたＮＫ細胞を示す。天然に存在するＮＫ受容体、例えば中でもＮＫＧ２ｄ、ＮＫｐ３０、４４、および４６と、外因性のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体との組合せは、細胞内シグナル伝達の増強を引き起こす。実施形態では、この増強されたシグナル伝達は、腫瘍およびがん細胞の死滅において有効であるエフェクター細胞を作製する。

ここで図２に注目し、これはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するようにＮＫ９２細胞を改変するために使用することができるベクターであるレンチウイルスベクターＡＧＴ４１８を生成するための３プラスミド系を示す（図５を参照されたい）。個々のプラスミドは、ベクターパッケージングのための構造タンパク質をコードするＡＧＴヘルパープラスＲｅｖ；Ｒｅｖ調節エレメントをコードするＡＧＴ Ｒｅｖプラスミド；ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質をコードするＡＧＴエンベローププラスミド；およびＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミドである。

ここで図３に注目し、これはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するようにＮＫ９２細胞を改変するために使用することができるベクターであるレンチウイルスベクターＡＧＴ４１８を生成するための４プラスミド系を示す（図５を参照されたい）。個々のプラスミドは、ベクターパッケージングのための構造および調節タンパク質をコードするＡＧＴヘルパープラスミド：ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質をコードするＡＧＴエンベローププラスミド；およびＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミドである。

ここで図４に注目し、これは、（ｉ）ＣＤ３タンパク質（ガンマ、デルタ、イプシロンおよびゼータ）を発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミド、および（ｉｉ）ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を下方調節するためのマイクロＲＮＡを発現することが可能なトランスジーンをコードするレンチウイルスベクター導入プラスミド（ＡＧＴ４０１；図５を参照されたい）を示す。実施形態では、本明細書で記載されるように、ＣＤ３遺伝子を有するベクターを使用してＮＫ９２細胞を改変する（ＣＤ３タンパク質は、ＮＫ９２において発現されないが、Ｔ細胞受容体機能にとって必要である）。実施形態では、ベクター（ＡＧＴ４０１；図５を参照されたい）を使用して、ＮＫ９２－Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体エフェクター細胞株の特徴付けのための腫瘍細胞を改変した。これらのプラスミドを、３プラスミドパッケージング系においてＡＧＴヘルパープラスＲｅｖプラスミドおよびＡＧＴエンベローププラスミドと共に（図２を参照されたい）、または４プラスミド系においてＡＧＴヘルパープラスミド、ＡＧＴ Ｒｅｖプラスミド、およびＡＧＴエンベローププラスミド（図３を参照されたい）と共に使用して、レンチウイルスベクター粒子を製造することができる。

ナチュラルキラー細胞
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞としても公知である）は、自然免疫系において機能するタイプのリンパ球である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ分子に結合しているいかなる特定のエピトープまたはネオエピトープペプチドとも無関係に、感染した細胞表面上のＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を認識することが可能である；しかし、それらはまた、ＭＨＣを必要とすることなく、ストレスを受けた細胞を認識することも可能である。このように、アルファ／ベータ型Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞、すなわちＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、細胞表面ＭＨＣがほとんどないかまたは全くない有害な細胞を認識して破壊することが可能である。

ＮＫ細胞表面受容体は、細胞媒介性の細胞傷害およびサイトカイン産生を誘発することができる。ＮＫ細胞は、その細胞質内部に、パーフォリンおよびグランザイムなどの細胞傷害性分子を放出して標的細胞の溶解を誘導することができる細胞溶解性顆粒を産生することができる。ＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦαサイトカインも分泌することができ、これらは標的細胞のファゴサイトーシスおよび溶解をもたらし得る。さらに、ＮＫ細胞は、標的細胞が病原体抗原を認識する抗体によってタグ付けされている場合には、抗体依存性細胞傷害を通して、標的細胞、例えば腫瘍細胞を除去することができる。標的細胞を溶解するその能力の他に、ＮＫ細胞はまた、サイトカインおよびケモカイン放出を通した炎症性免疫応答の促進にも関与する。

ガンマ／デルタＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞受容体
ヒトガンマ／デルタＴ細胞は、各細胞において使用される特定のデルタ鎖に従って群分けされ、特徴付けられる。最も一般的なものは、血液中および二次リンパ系組織において一般的であるデルタ２鎖（Ｖｄ２として記載）である。次に一般的であるのは、血液および粘膜上皮に出現するデルタ１細胞（Ｖｄ１）である。Ｖｄ３およびＶｄ５細胞の微量の集団は広く分布し、特化した機能を有する。最も重要なことに、ガンマ／デルタＴＣＲはしばしば、非ペプチド抗原の存在と反応し、ほとんどがＭＨＣタンパク質とは独立している。各事例は固有であるが、ガンマ／デルタＴ細胞は、それらがＭＨＣ機能を必要とせず、Ｔ細胞受容体レパートリーの多様性の強力な促進因子が存在しないことから、集団における無関係な個体の中であっても非常に類似であり得る。腫瘍のガンマ／デルタＴ細胞認識は、例えば、同じ種の細胞に限定されるが、同種性または移植片対宿主病に関与するという概念は、ガンマ／デルタＴ細胞に当てはまらない。

Ｖｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞の特定の例では、認識機構は十分に研究されている。腫瘍細胞は、正常細胞と比較して高い増殖指数を有し、しばしばブチロフィリンファミリーからの共通のタンパク質を発現することは公知である。高い増殖およびその後の高い膜合成要求のために、腫瘍細胞は、コレステロール生合成経路において炭素数５個のイソプレノイドであるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を含む中間分子を過剰産生する。異常に高い細胞質レベルのＩＰＰは、細胞表面ブチロフィリンに結合してコンフォメーション変化を引き起こす。Ｖｇ９Ｖｄ２ ＴＣＲは、このコンフォメーション変化を認識して、それが危険なシグナルであると解釈するように進化した。Ｖｇ９Ｖｄ２ ＴＣＲ：ブチロフィリン複合体の形成は、ガンマデルタＴ細胞を活性化して増殖および分化を引き起こす。活性化された細胞は、サイトカインを産生し、しばしば自然の腫瘍監視機構の一部として強力に細胞傷害性となる。ブチロフィリン遺伝子は全てのヒトにおいてほぼ同一であることから、１人の人のＶｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞は、自身の腫瘍細胞または他者からの腫瘍細胞を認識するために等しく効率的である。ブチロフィリンは、ほとんどの腫瘍細胞上に発現され、増殖（より高いＩＰＰ）は、がんの一般的な特色であることから、Ｖｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞を、ＭＨＣの差異によらず、主に腫瘍タイプによらず、がん治療のために利用することができる。Ｖｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞は、腫瘍の認識および破壊にとってほぼ普遍的であるものを構成する。

天然に存在するガンマ／デルタＴＣＲを発現する操作されたＮＫ細胞
ＮＫ細胞を、天然に存在するガンマ／デルタＴＣＲを発現するように操作することができる。実施形態では、操作された細胞は、強い活性化および強力な腫瘍細胞死滅能を実証する。実施形態では、操作されたＮＫ細胞の目的は、がん治療における天然のガンマデルタＴ細胞の代わりとなる産物を産生すること、腫瘍エフェクター細胞の無尽蔵の供給源となること、およびがんを有する全ての人において等しく機能することである。

遺伝子操作されたＮＫ細胞の最大の効力に対する重要な障壁は、形質導入された細胞集団内の不均一性である。不均一性により、細胞集団は、集団内の個々の細胞に関して認められるレベルよりはるかに低い効力で腫瘍細胞死滅に関して機能する。形質導入細胞における不均一性はまた、各形質導入が、固有の不均一な集団を生成すると予想され、臨床での使用のための適合性に関して製品の安全性の解析を複雑にすることから、製品製造の実現可能性にも影響を及ぼす。

実施形態では、不均一性の問題を軽減することは、不均一な形質導入細胞集団から出発してクローニングされた細胞株を生成することを伴う。クローニングされた細胞株は、個々の細胞から生成されることから、高レベルの均一性が維持される。さらに、クローニングされた細胞株を特徴付けて、γδＴＣＲ発現レベルおよび腫瘍細胞に対する機能的応答を決定することができる。実施形態では、クローニングされた細胞株の特徴付けは、がん治療にとって最も好適である個々のクローニングされた細胞株の選択を可能にする。

ＣＤ１６
驚くべきことに、本発明者らは、実質的なＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体の発現の増強ならびに／またはがん細胞の認識および溶解の増強を示すことを発見した。

一態様では、実質的なＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞が提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６発現の欠如に関して選択される。一部の実施形態では、ＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞は、モノクローナルＮＫ細胞株の限界希釈および増大によって選択される。ＣＤ１６タンパク質発現は、抗ＣＤ１６抗体を使用するウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーを含む標準的な方法によって決定することができる。ＣＤ１６ ｍＲＮＡ発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＲＴ－ＰＣＲ、または次世代ＲＮＡ配列決定（すなわち、ＲＮＡ－ｓｅｑ）を含む標準的な方法によって決定することができる。

さらなる態様では、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６発現は、拮抗される。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６発現は、ＣＤ１６ ｍＲＮＡを標的とし、その発現を干渉する低分子ＲＮＡによって拮抗される。一部のそのような実施形態では、低分子ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。

別の態様では、ＣＤ１６発現は、遺伝子編集によってＣＤ１６の１つまたは両方のコピーの発現を不活化することによって拮抗される。ある特定のそのような実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレオチド誘導型ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）系を含む。さらなる態様では、ＣＤ１６は、標的化タンパク質分解体、例えばタンパク質分解標的化キメラ分子（「ＰＲＯＴＡＣ」）分解体、分子糊分解体、またはユビキチンリガーゼ修飾因子によって拮抗される。

一態様では、ＮＫ細胞は、患者の血液から精製された初代ＮＫ細胞である。一部のそのような実施形態では、ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば白血球アフェレーシスまたは密度勾配遠心分離によって精製される。ある特定の実施形態では、精製されたＮＫ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで増大され、少なくとも１つのＴ細胞受容体をコードする１つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターを形質導入され、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む。さらにそのような実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む。実施形態では、精製されたＮＫ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで増大され、ＣＤ３タンパク質の発現のためのベクターを形質導入される。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖は、δ１鎖、δ２鎖、δ３鎖、およびδ５鎖のうちのいずれか１つまたは複数を含む。実施形態では、少なくとも１つのδ鎖はδ２鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのγ鎖はγ９鎖を含む。実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞受容体は、少なくとも１つのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含む。

別の態様では、精製されたＮＫ細胞は、内因性のＣＤ１６遺伝子の１つまたは両方のコピーを不活化するように遺伝子編集された後、少なくとも１つのＴ細胞受容体および／または少なくとも１つのＣＤ３タンパク質をコードするウイルスベクター（組み込み型または非組み込み型）を形質導入され、次いでＣＤ１６の発現の欠如に関してＮＫ細胞を選択した後、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させる。これらの実施形態のある特定のものでは、改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が最初に精製された患者に戻すように送達される。他の実施形態では、改変されたＮＫ細胞は、異なる患者に送達される。

他の態様では、上記の改変されたＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ１６アンタゴニストをさらに含む。ＣＤ１６アンタゴニストは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、標的化タンパク質分解体、低分子阻害剤、抗ＣＤ１６抗体等を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６のアンタゴニストは、医薬組成物とは別個に投与される。他の実施形態では、ＣＤ１６の阻害剤は、医薬組成物と共に投与される。

別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍のための治療として、ｇｄＴＣＲ発現ならびに腫瘍細胞のその後の認識および死滅を容易にするために、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６レベルを減少させる方法が提供される。方法は、阻害性ＲＮＡの最適な標的部位を規定するために自由に利用可能な標準的な生物分析ツールを使用してＣＤ１６ ｍＲＮＡコード配列のバイオインフォマティクス解析を伴う。可能性がある標的部位のコレクションを、ＣＤ１６ ｍＲＮＡ配列に関して５から２０の間の番号をつけて編集する。これらの標的と相補的な配列（ガイド配列）を有する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を、合成することができ、または供給業者から得ることができる。

ｓｉＲＮＡガイド配列は、プラスミド構築物の形態で直接的なＲＮＡトランスフェクションを介して細胞に送達され得るまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにコードされ得る。ｓｉＲＮＡを、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の骨格と組み合わせてもよい。好適なｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ骨格は、当技術分野で公知であり、必要に応じてｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡプラスプロモーター／エンハンサー領域および転写ターミネーターを含む好適な発現クローンを構築するためのプロセスは、分子生物学の当業者に公知である。ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ構築物は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で細胞または組織に送達され、細胞酵素によってプロセシングされて、ｓｉＲＮＡ配列を放出する。ｓｉＲＮＡは、標的部位でＣＤ１６ ｍＲＮＡとアニールし、ＲＮＡ切断、脱安定化、および分解を促進する。個々のｓｉＲＮＡの効果を、細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較し、細胞表面上のＣＤ１６ ｍＲＮＡ、およびＣＤ１６タンパク質レベルの低減の程度を決定することができる。さらなる試験を、標準的なアプローチを使用して行って、最も強力なｓｉＲＮＡの安全性および特異性を評価することができ、最終的なｓｉＲＮＡまたは複数のｓｉＲＮＡを、ＮＫ細胞改変のために選択する。

初代細胞および不死化細胞を含むＮＫ細胞、または骨髄造血幹細胞前駆細胞（ＨＳＣＰＣ）、または胚幹細胞（ＥＳ細胞）を使用することができる。これらの細胞を、強力、特異的、および安全なガイド配列を含有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡによって処置し、ＣＤ１６ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低減させることができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを、公知の方法を使用するトランスフェクションによってＲＮＡ形態で送達することができ、またはＤＮＡプラスミドのトランスフェクションによって送達することができ、または好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを使用する形質導入によって送達することができる。

ＣＤ１６特異的ｓｉＲＮＡによって安定にまたは一過性に処置したＮＫ細胞、細胞株、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞を、ＤＮＡプラスミドトランスフェクションまたは組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターによる形質導入を使用して、ＣＤ３タンパク質複合体をコードする遺伝子によって処置することができる。処置した細胞を、ＣＤ３タンパク質の発現およびガンマデルタＴ細胞受容体の細胞表面発現に関して試験することができる。ＣＤ３およびｇｄＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物から選択し、クローニングし、および富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。

これらの方法を使用して、ｇｄＴＣＲを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なＮＫ細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたＨＳＣＰＣまたはＥＳ細胞を、改変されたＮＫ細胞がそのがんに対して治療的であるがんに罹患している対象に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたＮＫ、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞によって処置してもよい。

別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、タンパク質の発現を防止し、このようにｇｄＴＣＲ発現、ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６遺伝子を編集する方法が提供される。方法は、自由に利用可能な標準的な生物分析ツールを使用して、ガイドＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識、またはＴＡＬＥＮ認識の最適な標的部位を規定するために、または他の公知の遺伝子編集系の標的としての、ＣＤ１６遺伝子配列のバイオインフォマティクス解析を伴う。可能性があるガイド配列のコレクションを、ＣＤ１６遺伝子に関して５から２０の間の番号をつけて編集する。ガイドＲＮＡ分子または適切に標的化されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼ系を、合成してもよく、または供給業者から得てもよい。

編集構築物は、プラスミド構築物の形態で直接的なＲＮＡトランスフェクションを介して細胞に送達され得るまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにおいてコードされ得る。ＤＮＡ編集酵素、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびその誘導体および類似の系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮ分子は、精製ＲＮＡとしてトランスフェクションによって送達してもよく、またはプラスミドＤＮＡを使用するトランスフェクションによって、または形質導入により編集機構を送達することが可能な好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを操作することによって送達され得る。好適なガイドＲＮＡおよび編集機構は当技術分野で公知であり、必要に応じてガイドＲＮＡおよび酵素コード配列プラスプロモーター／エンハンサー領域および転写ターミネーターを含む好適な発現クローンを構築するためのプロセスは、分子生物学の当業者に公知である。編集構築物は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で細胞または組織に送達される。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮ分子におけるガイドＲＮＡまたは操作された部位認識エレメントは、ＣＤ１６遺伝子における標的配列を認識し、変異および／または欠失を導入して遺伝子発現を不活化する。個々の遺伝子編集構築物を細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較して、二対立遺伝子性のＣＤ１６遺伝子改変の効率を決定する。標準的なアッセイを使用するさらなる試験を使用して、ＮＫ、細胞株、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞を編集するための最も効率的な遺伝子編集アプローチの安全性および特異性を評価することができる。

別の態様では、ＣＤ１６対立遺伝子の二対立遺伝子性の改変を有するＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞に、適切な組み込み型もしくは非組み込み型ベクターを形質導入するか、またはＣＤ３タンパク質およびガンマデルタＴ細胞受容体をコードするＲＮＡもしくはプラスミドＤＮＡをトランスフェクトする。ＣＤ３およびＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。これらの方法を使用して、ｇｄＴＣＲを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なＮＫ細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたＨＳＣＰＣまたはＥＳ細胞を、遺伝子改変されたＮＫ細胞がそのがんの処置において治療的であるがんに罹患している対象に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたＮＫ、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞によって処置してもよい。

ＣＤ３
別の態様では、液性腫瘍および固形腫瘍の治療のために、ｇｄＴＣＲ発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、ＮＫ細胞においてＣＤ３タンパク質を過剰発現させる方法が提供される。方法は、強いプロモーターの制御下でＣＤ３タンパク質コード領域を発現するプラスミドＤＮＡ、または組み込み型ウイルスベクターもしくは非組み込み型ウイルスベクターを構築することを伴う。そのようなプロモーターとしては、ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターに類似のウイルスプロモーター、ＳＶ４０前初期プロモーター、増強されたアルブミンプロモーター、増強されたグロビンプロモーター、またはＣＤ３タンパク質を持続的に高レベルで発現させることが可能な任意の起源の任意の他のウイルスもしくは非ウイルス性遺伝子プロモーターが挙げられ得る。

ＣＤ３発現構築物は、プラスミド構築物の形態で直接的なＲＮＡトランスフェクションを介して細胞に送達されるまたは好適な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターにおいてコードされる。ＣＤ３発現の定量的解析を、抗体染色およびフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または当技術分野で公知の任意の好適な技術を使用して実施し、高レベルのＣＤ３発現を確認する。

高レベルのＣＤ３タンパク質発現を有するＮＫ細胞、細胞株、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞に、適切な組み込み型もしくは非組み込み型ウイルスベクターを形質導入するか、またはガンマデルタ Ｔ細胞受容体をコードするＲＮＡもしくはプラスミドＤＮＡをトランスフェクトする。ＣＤ３およびｇｄＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解する能力に関して試験する。これらの方法を使用して、ｇｄＴＣＲを発現し、腫瘍を認識して死滅させることが可能なＮＫ細胞または不死化細胞株を生成してもよい。改変されたＨＳＣＰＣまたはＥＳ細胞を、遺伝子改変ＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで産生され得、そのがんに対して治療的であることを期待してがんに罹患している人に移植してもよい。加えて、環境の曝露または遺伝によりがんのリスクが高い人を、致死性のがんが発症する機会を低減するための予防治療として、改変されたＮＫ、ＨＳＣＰＣ、またはＥＳ細胞によって処置してもよい。

がん
本明細書に提供される組成物および方法はがんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞、がん性組織であってもよく、がん性組織を有してもよく、または疾患もしくは状態を発症していると診断されたもしくは発症するリスクがある対象もしくは患者であってもよい。ある特定の態様では、細胞は、上皮、内皮、中皮、グリア、間質、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、これらに限定されないが、脳、ニューロン、血液、子宮内膜、髄膜、食道、肺、心血管、肝臓、リンパ系、乳房、骨、結合組織、脂肪、網膜、甲状腺、腺、副腎、膵臓、胃、腸、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）、精巣、脾臓、皮膚、平滑筋、心筋、または横紋筋細胞を含み得、これらはまた、前述のいずれかからのがん細胞集団を含み得、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、または前述の混合物の１つまたは複数に関連し得る。なおさらなる態様では、がんは、これらに限定されないが、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、肝芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、神経鞘腫、小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。

本明細書に提供される組成物および方法はまた、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、小児悪性疾患、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされるまたは促進される子宮頸部または他の腫瘍、黒色腫、バレット食道（前悪性症候群）、副腎および皮膚のがん、および自己免疫、新生物性皮膚疾患を処置するためにも使用される。

治療ベクター
本構築物は、これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスベクター、タンパク質および／または脂質複合体、リポソーム、ミセル、およびその他を含む公知のトランスフェクションおよび／または形質導入ベクターを介して送達することができる。

ウイルスベクターは、本開示の方法にとって有用な細胞タイプ（すなわち、腫瘍細胞または骨髄性細胞）を優先的に標的とすることができる。ウイルスベクターは、特定のウイルスエンベロープ－宿主細胞受容体相互作用およびウイルスの遺伝子発現機構により、遺伝子を標的細胞に形質導入するために使用することができる。その結果、ウイルスベクターは、胚全体、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ ｓｉｔｕでの組織標的、および培養細胞株を含む多くの異なる細胞タイプに遺伝子を導入するためのビヒクルとして使用されている。細胞において外来遺伝子を導入して発現させる能力は、遺伝子発現研究、細胞株列の解明、ならびに遺伝子治療、人工多能性幹細胞の体細胞リプログラミング、および様々なタイプの免疫療法などの治療介入の潜在性を提供するために有用である。パポバウイルス科（例えば、ウシパピローマウイルスまたはＢＰＶ）またはヘルペスウイルス科（例えば、エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、またはヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）、またはワクシニアを含むポックスベクターのようなウイルスに由来するウイルス成分を、本開示のベクターに使用してもよい。

レンチウイルスベクターは、本開示の組成物および方法にとって好ましいタイプのベクターであるが、本開示は、レンチウイルスベクターに具体的に限定されない。レンチウイルスは、宿主細胞に有意な量のウイルス核酸を送達することができるウイルス属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染／形質導入する固有の能力を有するとして特徴付けられ、形質導入後、レンチウイルスは、宿主細胞の染色体にその核酸を組み込む。

感染性のレンチウイルスは、ビルレンスタンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードする３つの主な遺伝子、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの制御遺伝子を有する。特定の血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の制御、合成、および／またはプロセシング、ならびに他の複製機能に関係するタンパク質をコードする追加のアクセサリ遺伝子が存在し得る。

その上、レンチウイルスは、末端反復配列（ＬＴＲ）領域を含有し、これはおよそ６００ｎｔ長であり得る。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域に分割され得る。ＬＴＲは、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体にレトロウイルスＤＮＡの組み込みを媒介することができる。あるいは、機能的インテグラーゼが存在しない場合、ＬＴＲを使用して、ウイルス核酸を環状化してもよい。

レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質は、逆転写酵素およびインテグラーゼを含む。逆転写酵素はウイルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。酵素は、相補的ＤＮＡコピーを合成するための鋳型として、ウイルスＲＮＡゲノムを使用する。逆転写酵素はまた、ＲＮＡ鋳型を破壊するためのＲＮａｓｅＨ活性も有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されたウイルスｃＤＮＡと宿主ＤＮＡの両方に結合する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主ＤＮＡに挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。ｔａｔは、開始および伸長を増強するために転写の際のトランス活性化剤として作用する。ｒｅｖ応答エレメントは、転写後に作用して、ｍＲＮＡスプライシングおよび細胞質への輸送を調節する。

ウイルスベクターは、一般的に糖タンパク質を含み、様々な糖タンパク質が特異的親和性を提供し得る。例えば、ＶＳＶＧペプチドは、骨髄細胞へのトランスフェクションを増加させることができる。あるいは、ウイルスベクターはまた、そのシェルペプチドに結合した抗体などの標的化部分も有し得る。標的化抗体は、例えばＨＥＲ－２、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｍ２－ＰＫ、およびＣＡ１９－９などの、腫瘍において過剰発現される抗原に対して特異的であり得る。

他のウイルスベクターの特異性もまた、当技術分野で公知であり、特定の細胞集団を標的化するために使用することができる。例えば、ポックスウイルスベクターは、マクロファージおよび樹状細胞を標的とする。

レンチウイルスベクター系
レンチウイルスビリオン（粒子）は、必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現され、ビリオン（ウイルス粒子）を産生する。プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組み込みのために必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも１つのベクターが存在する。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結されたウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターもまた存在する。一実施形態では、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくとも一部とは別個のベクターに存在する。別の実施形態では、ｇａｇ核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別個のベクターに存在する。

複数の改変をベクターに行ってもよく、それらを使用して、野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小限にするための粒子を作製する。これらとしては、これらに限定されないが、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失、およびマトリックス（ＭＡ）欠失が挙げられる。

ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖベクター（複数可）は、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれるレンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノムからのヌクレオチドを含有しない。

粒子を形成するベクター（複数可）は、好ましくはエンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノムからの核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターを使用する。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列はレンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。

別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルスに由来せず、異なるウイルスに由来する。得られた粒子はシュードタイプ粒子と呼ばれる。エンベロープを適切に選択することによって、実質的に任意の細胞に「感染させる」ことができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ－Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（ムンプスまたは麻疹）およびオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）の区画などのエンドサイトーシス区画を標的とするエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。好ましくは使用することができる他のエンベロープは、モロニー白血病ウイルスのエンベロープ、例えばＭＬＶ－Ｅ、ＭＬＶ－ＡおよびＧＡＬＶを含む。これらの後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合には特に好ましい。所望の宿主細胞に応じて他のエンベロープタンパク質を選択することができる。例えば、ドーパミン受容体などの特定の受容体の標的化を、脳への送達のために使用することができる。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用して標的化することができる。例えば、エボラのＧＰは、転写後修飾によって、ＧＰおよびＧＰ_２糖タンパク質となる。別の実施形態では、シュードタイプエンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶシュードタイプベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。

本明細書において詳述されるように、レンチウイルスベクター系は、典型的にｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子の少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子の各々は、個々のプラスミドに提供されてもよく、または１つもしくは複数の遺伝子を同じプラスミドに共に提供してもよい。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は同じプラスミドに提供される（例えば、図２）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は第１のプラスミドに提供され、ｒｅｖ遺伝子は第２のプラスミドに提供される（例えば、図３）。したがって、３ベクターおよび４ベクター系の両方を使用して、実施例の節および本明細書の他所で記載されるようにレンチウイルスを産生することができる。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が最終的に産生される。

別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター；細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって産生され、レンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することが可能であるか、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列を標的化することが可能である。

別の態様では、ならびに図２および３に詳述するように、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号４４～４５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号４６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号４７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号４８）、ＥＦ１アルファプロモーター（配列番号７）、ＶＧ９（配列番号１および３）、ＩＲＥＳ（配列番号６）、Ｖｄ２（配列番号２および４）ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号５４）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号５５）を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。

別の態様では、および図４に詳述されるように、ＣＤ３を発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号４４～４５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号４６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号４７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号４８）、ＣＭＶプロモーター（配列番号８）、ＣＤ３（配列番号９）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号５４）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号５５）を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。

別の態様では、および図４に詳述されるように、ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号４４～４５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号４６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号４７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号４８）、Ｈ１プロモーター（配列番号４９）、ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ（配列番号５０～５３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号５４）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号５５）を含み得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。

別の態様では、および本明細書に詳述されるように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメント：ＣＡＧプロモーター（配列番号５６）；ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号５７）；ＨＩＶ ｐｏｌ（配列番号５８）；ＨＩＶインテグラーゼ（配列番号５９）；ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号６０）；およびＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号６１）を含むように設計されている。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２のかつ別個のプラスミドを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。

別の態様では、および本明細書に詳述されるように、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメント：ＣＭＶプロモーター（配列番号６２）および水疱口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）（配列番号６３）を含むように設計されている。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変動を使用して、本明細書に記載される配列参照を改変することができる。

別の態様では、レンチウイルスパッケージングのために使用されるプラスミドを、類似のエレメントによって改変することができ、イントロン配列を、ベクター機能を失うことなく潜在的に除去することができる。例えば、以下のエレメントを、パッケージング系を含むプラスミドにおける類似のエレメントと交換することができる：伸長因子－１アルファ（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターを、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターと交換することができる。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡを、ウサギベータグロビンポリＡと交換することができる。ヘルパープラスミドにおけるＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築することができる。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）の膜糖タンパク質で置換することができる。

注目すべきは、レンチウイルスパッケージング系を、商業的に取得することができ（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのＬｅｎｔｉ－ｖｐａｋパッケージングキット）、また、本明細書に記載されるように設計することもできる。その上、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の産生効率を含む任意の数の関連する要因を改善することも当業者の技術範囲内である。

用量および剤形
本開示のベクターは、目的の遺伝子または配列の短期間、中期間、または長期間の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームでの維持を可能にする。したがって、投与レジメンは、処置される状態および投与方法に基づいて変化し得る。

一実施形態では、形質導入ベクターは、それを必要とする対象に様々な用量で投与され得る。具体的には、対象は、約≧１０^６感染用量（１個の標的細胞を形質導入するために平均で１用量が必要である）を投与され得る。より具体的には、対象は、約≧１０^７、約≧１０^８、約≧１０^９、または約≧１０^１０感染用量を投与され得るか、またはこれらの値の間の任意の数の用量を投与され得る。形質導入ベクター投与の上限は、各疾患の適応に関して決定され、各個々の製品または製品ロットに関する毒性／安全性プロファイルに依存する。

加えて、本開示のベクターは、定期的に、例えば１日１回または２回、または任意の他の好適な期間、投与され得る。例えば、ベクターは、それを必要とする対象に１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ月毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、９ヶ月毎に１回、１年毎に１回、１８ヶ月毎に１回、２年毎に１回、３０ヶ月毎に１回、または３年毎に１回に投与され得る。

一実施形態では、本開示のベクターは、医薬組成物として投与される。一部の実施形態では、本開示のベクターを含む医薬組成物は、これらに限定されないが、臨床適用のための鼻、肺、経口、表面（topical）、または非経口剤形を含む多様な剤形で製剤化することができる。剤形の各々は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、増量剤、増粘剤、結合剤、希釈剤、例えば湿潤剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ベクターを含む医薬組成物はまた、注射、ガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、注入、または皮内曝露のために製剤化することができる。例えば、注射可能製剤は、好適なｐＨおよび張度の水溶液または非水溶液中に本開示のベクターを含み得る。

本開示のベクターは、腫瘍部位または感染部位への直接注射によって対象に投与され得る。一部の実施形態では、ベクターを、全身投与することができる。一部の実施形態では、ベクターを、腫瘍部位または感染部位のすぐ周囲の組織にガイドされたカニューレ挿入を介して投与することができる。

本開示のベクター組成物は、任意の薬学的に許容される方法、例えば鼻腔内、口腔内、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）、肺、膣内、局所投与、表面投与、乱切後の表面投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースもしくはゼラチンなどの半固体培地中で、または口腔内もしくは鼻腔内噴霧製剤を介して投与することができる。

さらに、本開示のベクター組成物は、任意の薬学的に許容される剤形、例えば固体剤形、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、液体分散剤、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤に製剤化することができる。さらに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはその任意の組合せであり得る。さらに、組成物は、経皮送達システムであってもよい。

一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形に製剤化することができ、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、または丸剤であり得る。一部の実施形態では、固体剤形は、１つまたは複数の賦形剤、例えば炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロース、またはゼラチンを含み得る。加えて、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出型または改変放出型であり得る。改変放出剤形は、制御放出または延長放出、腸溶放出およびその他を含む。改変放出剤形に使用される賦形剤は一般的に当業者に公知である。

さらなる実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、舌下または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌の下に投与される舌下錠または溶液組成物、および頬と歯肉の間に配置される口腔錠を含む。

一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、鼻剤形として製剤化され得る。本開示のそのような剤形は、鼻送達のための液剤、懸濁剤、およびゲル組成物を含む。

一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のための液体剤形、例えば懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤に製剤化され得る。一部の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンなどの一般的に使用される単純な希釈剤に加えて、様々な賦形剤、例えば保湿剤、甘味料、芳香剤、または保存剤を含み得る。特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、小児患者への投与にとって好適であるように製剤化され得る。

一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のための剤形、例えば滅菌の水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性の液剤または坐剤に製剤化することができる。一部の実施形態では、液剤または懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、または注射可能エステル、例えばオレイン酸エチルを含み得る。

医薬組成物の投薬量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および投与様式、排泄速度、および疾患の重症度に応じて変化し得る。

一部の実施形態では、がんの処置は、針、または静脈内カニューレ挿入を使用して、本開示のベクター構築物の腫瘍へのガイドされた直接注射によって達成される。一部の実施形態では、本開示のベクターは、静脈または動脈カニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達または疾患部位近傍の排出臓器への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環に投与される。

以下の実施例は、本開示の例示的な態様および実施形態を例証するために与えられる。しかしながら、態様および実施形態は、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されないことを理解すべきである。本明細書で言及した全ての印刷された刊行物は、具体的に参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例１）
レンチウイルスベクター系の開発
レンチウイルス粒子は、治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入）において産生された。機能的なウイルス粒子を産生する２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞のトランスフェクションは、試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用して、プラスミドＤＮＡ取り込み効率を増加させた。プラスミドおよびＤＮＡを、最初に、血清を含まない培養培地に３：１の比率（ＰＥＩのＤＮＡに対する質量比）で別個に添加した。２～３日後、細胞培地を収集し、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および／または濾過後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度を、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）に関して表現することができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ ｐ２４（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子に組み込まれる）レベルを測定すること、定量的ＰＣＲによって細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数を測定すること、または細胞を感染させて光（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）を使用することによって達成された。

上記のように、３ベクター系（すなわち、２ベクターレンチウイルスパッケージング系）を、レンチウイルス粒子の産生のために設計した。３ベクター系の概略図を図２に示す。簡単に説明すると、図２を参照して、一番上のベクターは、この場合、Ｒｅｖを含むヘルパープラスミドである。図２の中央に現れるベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書に記載される治療ベクターである。

より具体的に図２を参照して、ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１０）；ＣＡＧプロモーター（配列番号１１）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号１２）；ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１３）；ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１４）；ＨＩＶインテグラーゼ（配列番号１５）；ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号１６）；ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号１７）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号１８）を含む。

エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号１９）；ベータグロビンイントロン（配列番号２０）；ＶＳＶ－Ｇ（配列番号１２）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２１）を含む。

ヘルパー（プラスＲｅｖ）およびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成

材料および方法
ヘルパープラスミドの構築：ヘルパープラスミドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４－３ ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）からのＤＮＡ断片の最初のＰＣＲ増幅によって構築された。プライマーは、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するように設計され、これを使用してｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同じ部位に挿入することができる。フォワードプライマーは配列番号２２であり、リバースプライマーは配列番号２３であった。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は配列番号２４であった。

次に、Ｒｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有し、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位が隣接するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎが合成した。次に、ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位でプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は配列番号２５であった。

最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列と交換した。ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有し、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎが合成した。次に、ＤＮＡ断片を、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位でプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は配列番号２６であった。

ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドの構築
ＥｃｏＲＩ制限部位が隣接する水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎが合成した。次に、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＥｃｏＲＩ制限部位で挿入し、正しい配向を、ＣＭＶ特異的プライマーを使用する配列決定によって決定した。ＤＮＡ配列は配列番号２７であった。

４ベクター系（すなわち、３ベクターレンチウイルスパッケージング系）もまた、設計され、本明細書に記載される方法および材料を使用して産生されている。４ベクター系の概略図を図３に示す。簡単に、図３を参照して説明すると、一番上のベクターは、この場合Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドである。上から２番目のベクターは、別個のＲｅｖプラスミドである。下から２番目のベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、既に記載された治療ベクターである。

部分的に図３を参照して、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１０）；ＣＡＧプロモーター（配列番号１１）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号１２）；ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１３）；ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１４）；ＨＩＶインテグラーゼ（配列番号１５）；ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号１６）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号１８）を含む。

Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号２８）；ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号２９）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号１８）を含む。

エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号１９）；ベータグロビンイントロン（配列番号２０）；ＶＳＶ－Ｇ（配列番号１２）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号１８）を含む。

ヘルパー、Ｒｅｖ、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成

材料および方法
Ｒｅｖを有しないヘルパープラスミドの構築
Ｒｅｖを有しないヘルパープラスミドを、ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって構築した。ＮｏｔＩおよびＳｔｕＩ制限部位が隣接するこの配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎが合成した。次に、ＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、ＮｏｔＩおよびＳｔｕＩ制限部位でヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は、配列番号６７であった。

Ｒｅｖプラスミドの構築
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎが、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位が隣接する単一のＤＮＡ断片として合成した。次に、ＤＮＡ断片を、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位でｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ここではＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターに交換されている。ＤＮＡ配列は配列番号３０であった。

２ベクターおよび３ベクターパッケージング系を、類似のエレメントによって改変することができ、イントロン配列を、ベクター機能を失うことなく潜在的に除去することができる。例えば、以下のエレメントを、２ベクターおよび３ベクターパッケージング系において類似のエレメントと交換することができる：

プロモーター：伸長因子－１アルファ（ＥＦ１α）（配列番号３１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号３２）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号３３）を、ＣＭＶ（配列番号１９）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１１）と交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。

ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号３４）およびｂＧＨポリＡ（配列番号３５）を、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号１８）と交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。

ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミドにおけるＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株のＨＩＶ Ｇａｇ（配列番号１３）；ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１４）；およびＨＩＶインテグラーゼ（配列番号１５）を、本明細書で概説したヘルパー／ヘルパープラスＲｅｖプラスミドに含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と相互交換することができる。これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。

エンベロープ：ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号３６）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号３７）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号３８）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号３９）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号４０）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号４１）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号４２）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号４３）の膜糖タンパク質で置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書における配列部分において同定される。さらに、これらの配列をまた、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることができる。

要約すると、３ベクター系と４ベクター系とを、以下のように部分的に比較および対比することができる。３ベクターレンチウイルスベクター系は：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに３．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’δ ＬＴＲを含有する。４ベクターレンチウイルスベクター系は：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに４．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲを含有する。上記のエレメントに対応する配列は、本明細書における配列表部分において同定される。

（実施例２）
γδ Ｔ細胞受容体およびＣＤ３タンパク質によるＮＫ９２細胞の形質導入
ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位が隣接するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔ細胞受容体ガンマ９可変鎖（ＴＲＧＶ９）（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ：ＫＣ１７０７２７．１）のＤＮＡ断片を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）が合成した。ＮｏｔＩおよびＮｓｉＩ制限酵素部位が隣接する、上流の配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔ細胞受容体デルタ鎖（ＴＲＤＶ２）（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ： ＡＹ３１２９５６．１）のＤＮＡ断片を、合成した。ＴＲＧＶ９を、ＢｓｒＧＩ／ＮｏｔＩ酵素によって消化し、ＴＲＤＶ２を、ＮｏｔＩ／ＮｓｉＩ酵素によって消化し、ＥＦ１αプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドにライゲーションした。ＴＲＧＶ９断片をレンチウイルスプラスミドに挿入した後に、ＴＲＤＶ２断片を挿入した。同様に、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＣＤ３のＤＮＡ断片を合成し、ＣＭＶプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミドに挿入した。

レンチウイルスプラスミドを、ＢｓｒＧＩ／ＮｏｔＩまたはＮｏｔＩ／ＮｓｉＩ制限酵素のいずれかによって消化した。消化された産物を、１％アガロースゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で電気泳動し、切り出し、ゲルをＰｕｒｅＬｉｎｋ ＤＮＡゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって抽出した。ＤＮＡ濃度を決定した後、ベクターのインサートに対する比３：１を使用して、消化したＤＮＡ断片と混合した。混合物をＴ４ ＤＮＡリガーゼによって室温で１６時間ライゲーションした。ライゲーションミックス３μＬを、ＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞２３μＬに添加した。４２℃でのヒートショックによって形質転換を行った。細菌細胞を、アンピシリンを含有する寒天プレート上で画線した後、コロニーをＬＢブロス中で増大させた。ＤＮＡ断片の挿入をチェックするために、プラスミドＤＮＡを、収集した細菌培養物からＤＮＡプラスミド ｍｉｎｉ ｐｒｅｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって抽出した。挿入されたＤＮＡ断片を、ＤＮＡ配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって確認した。次に、確認された配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、２９３Ｔ細胞においてレンチウイルス粒子をパッケージングし、フローサイトメーターによる抗体検出によって、それらがＶγ２Ｖδ２ ＴＣＲまたはＣＤ３のいずれかを発現する能力に関して試験した。ＮＫ９２細胞の形質導入に関して、細胞を、２４ウェルプレートにおいて２×１０^５細胞／ｍＬで播種し、ＣＤ３を発現するレンチウイルスベクターをｍｏｉ５で形質導入した。４日後、ＣＤ３発現を、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ３抗体によって検出した。次に、ＣＤ３を発現するＮＫ９２細胞に、Ｖγ２Ｖδ２ ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。４日後、Ｖγ２Ｖδ２ ＴＣＲの発現を、フローサイトメトリーによって抗Ｖγ９または抗Ｖδ２抗体によって検出した（図６Ａの左のパネルを参照されたい）。

（実施例３）
抗Ｖδ２ビーズ選択を使用する、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体およびＣＤ３タンパク質を含有するＮＫ９２細胞の富化
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体およびＣＤ３タンパク質を発現するＮＫ９２細胞を、抗Ｖδ２ビーズを使用して富化した。

実験方法
ＮＫ９２細胞に、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（配列番号５）を発現するレンチウイルスベクターおよびＣＤ３タンパク質（配列番号９）を発現するレンチウイルスベクターをｍｏｉ５で形質導入した。５日後、ＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－フィコエリスリン（ＰＥ）クローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ３－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）クローンＵＣＨＴ１によって染色した。細胞を、染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図６Ａに示すように、富化を行わない場合、ＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性細胞の頻度は３．８１％であった（図６Ａの左のパネルを参照されたい）。形質導入された細胞を特徴付けるために、細胞を、抗Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ抗体および磁気ビーズ選択によってさらに富化した。富化後、ＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性細胞の頻度は２３．５％（図６Ａの右のパネルを参照されたい）であった。

（実施例４）
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞は、ゾレドロン酸によって処置したＣ８１６６細胞に応答性である
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞を試験して、Ｃ８１６６細胞に対して応答性であるか否かを決定した。Ｃ８１６６細胞は、ヒトＴ細胞白血病のモデルである。ＣＤ１０７ａは、細胞活性のマーカーとして使用した。

実験方法
ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）を阻害し、これによって細胞にイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）が蓄積し、これはＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲによる認識を増加させる。ＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲがＮＫ９２細胞において機能的である場合、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２は、ゾレドロン酸処置細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にＣＤ１０７ａを発現する。Ｃ８１６６細胞をゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。富化したＮＫ９２細胞を、培地、Ｃ８１６６腫瘍細胞、または１０μＭゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーによって測定した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図６Ｂに示すように、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２細胞は、ＣＤ１０７ａの発現の増加を通してゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞に応答し、２０．８％の細胞がＣＤ１０７ａに関して陽性であった。しかしながら、非ゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞は、ＣＤ１０７ａ応答を誘導することができず、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２の４．２２％のみが、ＣＤ１０７ａの発現に関して陽性であったが、これは、対照処置におけるＣＤ１０７ａの発現に関して陽性であったＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２の４．４３％に匹敵し得る（図６Ｂを参照されたい）。

（実施例５）
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞にゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞を曝露すると、細胞溶解をもたらした
Ｖγ９Ｖδ２受容体によって操作されたＮＫ９２細胞を、Ｃ８１６６細胞を溶解するその能力に関して試験した。

実験方法
カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＫ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Ｃ８１６６細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイを３連で実施した。インキュベーション後、上清を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

Ｃ８１６６細胞またはゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞に対するＮＫ９２細胞またはＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ操作ＮＫ９２細胞の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で評価した。３連のウェルを各条件に使用した。図６Ｃに示すように、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲを発現するＮＫ９２細胞に曝露したゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞は、最高レベルの細胞溶解をもたらした（ＮＫ９２ｇｄＴＣＲ＋Ｃ８１６６／ＺＯＬ－１０μＭに対応する線を参照されたい）。具体的には、４：１のエフェクターの標的に対する比では、４５％～５０％の間のＣ８１６６細胞が溶解された；細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比を１：１に低減させると、約２５％に低減された（図６Ｃを参照されたい）。

（実施例６）
限界希釈単一細胞クローニングを通して形質導入について陽性であった個々のＮＫ９２細胞の単離
必ずしも全てのＮＫ９２細胞が、Ｖγ２Ｖδ２ ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターによって形質導入されたわけではなかった。その結果、形質導入に関して陽性の個々の細胞を単離し、亜株をそれらの単離された細胞から成長させた。陽性に形質導入された細胞の単離およびそれらの単離された細胞からの亜株の成長を、限界希釈単一細胞クローニングを使用して行った。

ＮＫ９２細胞に、γδ Ｔ細胞受容体遺伝子またはＣＤ３タンパク質遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。得られた細胞を希釈し、９６ウェルプレートに細胞０．４個／ウェルの密度で播種した。この条件は、単一細胞のみが個々のウェルに入れられ、クローニングされた細胞株として成長することを確実にする。３～４週間の培養後、単一の細胞が増殖し、その成長により培養培地は黄色になった。個々のウェルからの細胞を２５ｍＬ培養フラスコに移し、クローニングされた細胞株の持続的な成長および増大を可能にした。２５ｍＬ培養物からの細胞を使用して、細胞表面タンパク質発現に基づいて表現型を特徴付け、細胞傷害アッセイに基づいて生物学的機能を特徴付けた。この方法の概略図を図７に示す。

（実施例７）
限界希釈クローニングによって生成されたＮＫ９２ Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体クローンの亜株のスクリーニングは、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株が腫瘍細胞の存在下でＣＤ１０７ａおよびＴＮＦαの高い発現を生じることを示した
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するＮＫ９２細胞の亜株を、Ｃ８１６６細胞またはゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞にＮＫ９２細胞を曝露することを通してスクリーニングした。ＣＤ１０７ａおよびＴＮＦαは、細胞活性を検出するためのマーカーとして使用した。

実験方法
Ｃ８１６６細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現する選択されたＮＫ９２細胞クローンを、Ｃ８１６６細胞または１０μＭゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａまたはＴＮＦαをフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞内ＴＮＦαを検出するため、細胞を、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトＴＮＦα－ＡＰＣと共に４℃で４５分間インキュベートした。細胞内染色溶液は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づいてゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料について獲得した。全てのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図８に示すように、ＣＤ１０７ａをマーカーとして使用する場合、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株は、最も強い応答を示した。具体的には、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株を、Ｃ８１６６細胞に曝露すると、１７．８％の細胞が、ＣＤ１０７ａマーカーに関して陽性であった（図８を参照されたい）。ＣＤ１０７ａ陽性細胞のこのパーセンテージは、ＮＫ９２－γδＴＣＲ亜株を、ゾレドロン酸によって処置したＣＤ１８６６細胞に曝露すると、６８．２％に増加した（図８を参照されたい）。

同様に、図９に示すように、ＴＮＦαをマーカーとして使用した場合、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株は、最高レベルの発現を有した。具体的には、ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株をＣ８１６６細胞に曝露すると、１．０３％の細胞がＴＮＦαマーカーに関して陽性であった（図９を参照されたい）。ＴＮＦα陽性細胞のこのパーセンテージは、ＮＫ９２－γδＴＣＲ亜株を、ゾレドロン酸によって処置したＣＤ１８６６細胞に曝露すると１５．６％に増加した（図９を参照されたい）。

図８および９は、クローニングした細胞株のほとんどが細胞表面ＴＣＲを発現することができなかったこと、および／または腫瘍細胞標的に対して生物応答を実証することができなかったことを示している。２つのクローニングされた細胞株（ＮＫ９２－γδＴＣＲ５亜株およびＮＫ９２－γδＴＣＲ１２亜株）は全ての試験において陽性であったが、なおも効力は異なった。

１つのクローン細胞株、ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ－５亜株を、以下の実施例に示すようにさらなる試験のために選択した。

（実施例８）
Ｄａｕｄｉ細胞をＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞を試験して、細胞がＤａｕｄｉ細胞またはゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。

実験方法
カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＫ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Ｄａｕｄｉ細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートし；アッセイは３連で実施した。インキュベーション後、上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比を、各条件について３連のウェルで試験した。図１０に示すように、ＮＫ９２はＤａｕｄｉおよびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に対して類似の低レベル死滅を示した（図１０においてＮＫ９２＋ＤａｕｄｉおよびＮＫ９２＋Ｄａｕｄｉ／ＺＯＬ－１０μＭに対応する線を参照されたい）。しかしながら、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株は、ＮＫ９２細胞と比較してＤａｕｄｉ細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した（図１０におけるＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ＋Ｄａｕｄｉに対応する線を参照されたい）。２０：１のエフェクターの標的に対する比では、およそ４５％の細胞が溶解された。細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比が０．６２５：１であった場合１０％未満に低下した。ゾレドロン酸処置は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株によって引き起こされる細胞死滅をさらに増強した（図１０におけるＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ＋Ｄａｕｄｉ／ＺＯＬ－１０μＭに対応する線を参照されたい）。２０：１のエフェクターの標的に対する比では、６５％を超える細胞が溶解された（図１０を参照されたい）。驚くべきことに、高い割合のゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞が、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株によって２．５：１のＥ：Ｔ比であっても１０：１または２０：１の比でも観察された死滅と非常に類似のパーセントで溶解された（図１０を参照されたい）。典型的に、通常のＮＫまたはγδ Ｔ細胞死滅アッセイに関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに関して十分に高い効力を確実にするためには２０：１または１０：１のＥ：Ｔ比を使用することが一般的である。エフェクターの標的に対する比が０．６２５：１であった場合、パーセント細胞溶解は低下したが、なおもほぼ５０％であった（図１０を参照されたい）。

（実施例９）
γδ Ｔ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じた
ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を試験して、Ｄａｕｄｉまたはゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に曝露した場合に脱顆粒応答を生じるか否かを決定した。脱顆粒は、グランザイム応答を測定し、細胞傷害性細胞活性化の代用マーカーである。脱顆粒応答は、ＣＤ１０７ａ発現を使用して評価した。

実験方法
Ｄａｕｄｉ細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を、培地、Ｃ８１６６細胞、または１０μＭゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全てのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１１に示すように、ＮＫ９２細胞は、Ｄａｕｄｉおよびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に対して類似の低レベルの応答を示した。しかしながら、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞は、ＮＫ９２細胞と比較してＤａｕｄｉ細胞に対してはるかに高い応答を示した（図１１を参照されたい）。具体的には、Ｄａｕｄｉ細胞に曝露すると、１３．８％のＮＫ９２－γδＴＣＲ－５細胞がＣＤ１０７ａマーカーを発現し、これに対しＮＫ９２細胞をＤａｕｄｉ細胞に曝露するとＣＤ１０７ａマーカーの発現は無視できる程度であった（図１１を参照されたい）。ゾレドロン酸処置は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株の応答をさらに増強した（図１１を参照されたい）。具体的には、ゾレドロン酸によって処置したＤａｕｄｉ細胞に曝露すると、６２．８％のＮＫ９２－γδＴＣＲ－５細胞がＣＤ１０７ａマーカーを発現し、これに対しＮＫ９２細胞をゾレドロン酸によって処置したＤａｕｄｉ細胞に曝露すると、ＣＤ１０７ａマーカーの発現は無視できる程度であった（図１１を参照されたい）。

（実施例１０）
γδ Ｔ細胞受容体によって操作されたＮＫ９２細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞に曝露した場合にＴＮＦα応答を生じた
ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を試験して、それらがＤａｕｄｉまたはゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に曝露された場合にサイトカイン応答を生じるか否かを決定した。サイトカイン応答を、細胞内ＴＮＦα発現を使用して評価した。サイトカインＴＮＦαの産生は、細胞活性化のマーカーである。本明細書において、サイトカイン応答は、腫瘍細胞のＮＫ９２－γδＴＣＲ認識に関するシグナルの強度を反映する。

実験方法
Ｄａｕｄｉ細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５を、培地、Ｃ８１６６細胞、または１０μＭゾレドロン酸処置Ｃ８１６６細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＴＮＦαを、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６によって染色した後、固定し、透過処理し、マウス抗ヒトＴＮＦ－α－ＡＰＣと共に４℃で４５分間インキュベートした。細胞内染色溶液を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全てのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１２に示すように、ＮＫ９２細胞は、Ｄａｕｄｉおよびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に対して類似の低レベルの応答を示した。しかしながら、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株は、ＮＫ９２細胞と比較してＤａｕｄｉ細胞に対してはるかに高い応答を示した（図１２を参照されたい）。具体的には、Ｄａｕｄｉ細胞に曝露すると、２．９４％のＮＫ９２－γδＴＣＲ－５細胞がＴＮＦαマーカーを発現したが、これに対し、ＮＫ９２細胞をＤａｕｄｉ細胞に曝露すると、ＴＮＦαマーカーの発現は無視できる程度であった（図１２を参照されたい）。ゾレドロン酸処置は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株による細胞応答をさらに増強した（図１２を参照されたい）。具体的には、ゾレドロン酸によって処置したＤａｕｄｉ細胞に曝露すると、４２．３％のＮＫ９２－γδＴＣＲ－５細胞がＴＮＦαマーカーを発現したが、これに対し、ＮＫ９２細胞をゾレドロン酸によって処置したＤａｕｄｉ細胞に曝露すると、ＴＮＦαマーカーの発現は無視できる程度であった（図１２を参照されたい）。

（実施例１１）
ＴＵ１６７細胞をＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露すると、細胞溶解をもたらした
ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株を試験して、これがＴＵ１６７細胞に対する細胞傷害効果を有するか否かを決定した。ＴＵ１６７細胞（ＵＭ－ＳＣＣ細胞株の亜株）は、頭頸部扁平上皮癌のモデルである。

実験方法
カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＫ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。ＴＵ１６７細胞に、ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を阻害するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入しなかったかまたは形質導入し（ＡＧＴ４０１；図５を参照されたい）、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイは３連で実施した。インキュベーション後、上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

異なる条件でのＴＵ１６７に対するＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で各条件に関して３連のウェルで評価した。図１３に示すように、ＮＫ９２は、全ての条件でＴＵ１６７に対して類似の低レベル死滅を示した；特に、レンチウイルスベクターＡＧＴ４０１の形質導入によるＦＤＰＳノックダウンは、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅に影響を及ぼさなかった（図１３におけるＮＫ９２細胞を使用した実験条件に対応する全ての線を参照されたい）。しかしながら、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞は、ＮＫ９２細胞と比較してＴＵ１６７細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した（図１３におけるＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ細胞を使用した実験条件に対応する線を参照されたい）。具体的には、ゾレドロン酸によって処置しなかったＴＵ１６７細胞をＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞に曝露すると、２０：１のエフェクターの細胞に対する比でＴＵ１６７細胞の４０％弱の細胞溶解をもたらした（図１３を参照されたい）。低濃度のゾレドロン酸（１μＭ）またはより高い濃度のゾレドロン酸（１０μＭ）処置と組み合わせたＡＧＴ４０１レンチウイルスベクター（図５を参照されたい）の形質導入は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５亜株による細胞死滅を有意に増強した（ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ細胞をＺＯＬ－１μｍおよびＺＯＬ－１０μｍと共に使用した実験条件に対応する線を参照されたい；図１３）。具体的には、１μＭゾレドロン酸によって処置したＴＵ１６７細胞をＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞に曝露すると、２０：１のエフェクターの細胞に対する比でＴＵ１６７細胞の１００％弱の細胞溶解をもたらした；細胞溶解は、エフェクターの細胞に対する比を０．６２５：１に低減すると４０％未満に減少した（図１３を参照されたい）。同様に、１０μＭゾレドロン酸によって処置したＴＵ１６７細胞をＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞に曝露すると、２０：１のエフェクターの細胞に対する比でＴＵ１６７細胞の８０％強の細胞溶解をもたらした；細胞溶解は、エフェクターの細胞に対する比を０．６２５：１に低減するとおよそ２５％に減少した（図１３を参照されたい）。

要約すると、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５は、様々な条件下でＴＵ１６７細胞に対してはるかに高い細胞傷害を示した。ＬＶ－ＦＤＰＳは、細胞におけるファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）のレベルを低減するように設計された。ＦＤＰＳを低減させると、γδ Ｔ細胞に腫瘍細胞を認識して死滅させるために重要であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の蓄積を引き起こす。ゾレドロン酸は、ＦＤＰＳの競合的阻害剤である。このように、ＬＶ－ＦＤＰＳおよびゾレドロン酸はいずれも、ＩＰＰの増加を引き起こし、ＮＫ９２－γδＴＣＲ細胞株のＴＣＲ依存的活性化を増強した。

（実施例１２）
Ｈｕｈ７細胞をＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株に曝露すると細胞溶解をもたらした
ＮＫ９２－γδＴＣＲ－５亜株を試験して、Ｈｕｈ７細胞に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。Ｈｕｈ７細胞は、肝細胞癌のモデルである。

実験方法
カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＫ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。Ｈｕｈ７細胞に、ＦＤＰＳタンパク質産生を阻害することが可能なｍｉＲＮＡ（配列番号５０、５１、５２、および５３）を発現するレンチウイルスベクターＡＧＴ４０１を形質導入しなかったかまたは形質導入し、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイを３連で実施した。インキュベーション後、上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

異なる条件下でのＨｕｈ７に対するＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５の細胞傷害を、いくつかのエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で、各条件に関して３連のウェルで評価した。図１４に示すように、ＮＫ９２細胞は、いかなる条件下でもＨｕｈ７を死滅させることができなかった（図１４におけるＮＫ９２細胞の使用に対応する線を参照されたい）。ＮＫ９２γδＴＣＲ－５は、ＴＵ１６７細胞に対して低レベルの細胞傷害を示した（図１４におけるＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ＋Ｈｕｈ７に対応する線を参照されたい）。レンチウイルスベクターＡＧＴ４０１の形質導入によるＦＤＰＳノックダウン（図５を参照されたい）は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅を増加させた（図１４におけるＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ＋Ｈｕｈ７／ＬＶ－ＦＤＰＳに対応する線を参照されたい）。具体的には、２０：１のＥ：Ｔ比では、およそ２０％の細胞が溶解された（図１４）。ＡＧＴ４０１レンチウイルスベクター形質導入を１μＭ濃度のゾレドロン酸または１０μＭ濃度のゾレドロン酸と組み合わせると、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅を有意に増強した（図１４におけるＺＯＬ－１μＭおよびＺＯＬ １０μＭと共にＮＫ９２－ｇｄＴＣＲによる処置に対応する線を参照されたい）。具体的には、１μＭおよび１０μＭ濃度のゾレドロン酸の両方で、エフェクターの標的に対する比が２０：１でＨｕｈ７細胞のおよそ５５％の細胞溶解が存在した；細胞溶解は、エフェクターの標的に対する比が０．６２５：１に低減された場合であってもなおおよそ３０％であった（図１４を参照されたい）。

（実施例１３）
ＮＫ９２γδＴＣＲ細胞の単一細胞クローンのスクリーニング
ＮＫ９２細胞に、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＣＤ３タンパク質を発現するレンチウイルスをｍｏｉ５で形質導入した。高レベルのＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲを発現する単一細胞をＢＤ細胞選別システム（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ）によって単離した。単離された単一細胞を、９６ウェルプレート中、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。３～４週間後、細胞を２４ウェルプレートに移した。細胞機能を、Ｄａｕｄｉまたはゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞によって試験した。Ｄａｕｄｉは、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲの標的細胞である。ＮＫ９２細胞におけるＣＤ３およびＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲが機能的である場合、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２は、Ｄａｕｄｉ細胞に応答し、脱顆粒のマーカーとして細胞表面上にＣＤ１０７ａを発現する。ゾレドロン酸は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）を遮断し、細胞におけるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）蓄積をもたらし、これはＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ陽性ＮＫ９２細胞の応答を増強する。

Ｄａｕｄｉ細胞を、ゾレドロン酸（１０μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。ＮＫ９２またはＮＫ９２γδＴＣＲ単一細胞クローンを、培地、Ｄａｕｄｉ、または１０μＭゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーによって測定した（図１５）。細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

１００個を超える単一細胞クローンを、単一細胞選別によってスクリーニングした。５個の細胞クローンは、強い応答を示した。図１５に示すように、ＮＫ９２細胞は、Ｄａｕｄｉおよびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞に対して類似の低レベルの応答を示した（０．０７４％および０．０８８％のＮＫ９２細胞がそれぞれ、Ｄａｕｄｉ細胞およびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞においてＣＤ１０７ａに関して陽性であったことを示す、図１５のデータの最初の縦列を参照されたい）。しかしながら、ＮＫ９２γδＴＣＲの一部の単一細胞クローンは、ＮＫ９２細胞と比較してＤａｕｄｉ細胞に対してより高い応答を示した（４０．２％、８．２３％、４３．３％、７７．３％、５３．３％、７５．７％、および５９．１％の細胞がそれぞれ、ＣＤ１０７ａを発現することを示す、異なるスクリーニングされた亜株を表す、図１５の縦列２～８の真ん中の行を参照されたい）。ゾレドロン酸処置は、クローニングされたＮＫ９２γδＴＣＲ細胞株による細胞応答をさらに増強した（細胞の４６．４％、１５．８％、８６．９％、９１．９％、７６．７％、８６．４％、および８１．０％がそれぞれＣＤ１０７ａを発現することを示す、異なるスクリーニングされた亜株を表す、図１５の縦列２～８の下の行を参照されたい）。ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ２９は、強い応答を示さなかった代表的な細胞クローンであり、８．２３％および１５．８％の細胞が、Ｄａｕｄｉ細胞およびゾレドロン酸処置Ｄａｕｄｉ細胞による処置後にそれぞれ、ＣＤ１０７ａに関して陽性であった（図１５の縦列３の中央および下の行を参照されたい）。

データを、限界濃度希釈（実施例６に記載される方法を参照されたい）またはフローサイトメトリー単一細胞選別によって得たクローニングされたＮＫ９２γδＴＣＲ細胞株に関して編集した。ＣＤ１０７ａ陽性細胞のパーセンテージを、腫瘍細胞に対する曝露後または腫瘍細胞プラスゾレドロン酸に対する曝露後の様々なクローニングされたＮＫ９２γδＴＣＲ細胞株に関して示す（表１を参照されたい）。値の範囲は、クローニングされた細胞株における実質的な不均一性を実証する。腫瘍単独によって除算した腫瘍＋ゾレドロン酸に関するＣＤ０１７ａ陽性細胞の比は、腫瘍細胞認識の特異性を説明する１つの手段である。理想的なＮＫ９２γδＴＣＲエフェクター細胞は、腫瘍細胞プラスゾレドロン酸（６５％より高い陽性）に対して強力な応答を実証し、腫瘍単独と比較して腫瘍プラスゾレドロン酸に関する応答の実質的な増加を実証する。矢印で示した４つのクローニングされた細胞株は、ゾレドロン酸によって処置した腫瘍細胞に対する強力な応答および特異性を実証した。これらのクローニングされた細胞株は、がん免疫療法における臨床適用のために好ましい選択である。

表１は、腫瘍細胞に対する曝露後、または腫瘍細胞プラスゾレドロン酸に対する曝露後のＣＤ１０７ａに関して陽性のクローニングされた細胞のパーセンテージを示す１１個のクローニングされた細胞株に関するデータを表す。ゾレドロン酸を添加後の相対的増加を示す。

クローニングされたＮＫ９２細胞株５、Ｓ３６、Ｓ７２、およびＳ７７を、さらなる開発のために選択した。これらのクローンを選択する基準は：腫瘍プラスゾレドロン酸を使用して＞６５のパーセンテージＣＤ１０７ａ陽性細胞および比（表１の縦列４）＞１．２を有するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を発現するクローニングされた細胞株であった。

（実施例１４）
選別されたＮＫ９２ Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ細胞クローンのＣ８１６６細胞に対するその応答に従うスクリーニング
先の実施例からの特定のクローニングされたＮＫ９２細胞株を、Ｃ８１６６細胞に対するその応答に従ってスクリーニングした。Ｃ８１６６細胞株はＴ細胞白血病に由来した。選択されたクローニングされた細胞株を、Ｃ８１６６細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１６に示すように、クローニングされた細胞株Ｓ６３、Ｓ６８、Ｓ７２、Ｓ７６、およびＳ７７は、Ｃ８１６６細胞に対して良好な応答を示した。これらのクローンの中で、クローンＳ７６は、Ｃ８１６６細胞に対して最も良好な応答を示した。

（実施例１５）
より多くの細胞株（ＴＵ１６７、Ｈｅｌａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＡ５４９）に対する応答による、選別したＮＫ９２ Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体クローンのスクリーニング
先の実施例に記載したクローニングされたＮＫ９２細胞株を、ＴＵ１６７、Ｈｅｌａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＡ５４９細胞株に対するその応答に関してスクリーニングした。ＨｅＬａは、ヒトパピローマウイルス感染症に関連する子宮頸癌のモデルである。ＭＤＡ－Ｍ Ｂ－２３１は、トリプルネガティブ乳がんの細胞株モデルであり、およびＡ５４９は、肺腺癌のモデルである。

選択されたＮＫ９２細胞クローンを、異なる細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１７に示すように、全てのクローニングされたＮＫ９２細胞株の中でも、クローンＳ７６は、試験した細胞株に対して全体として最も良好な応答を示した。

（実施例１６）
Ｈｕｈ７またはゾレドロン酸（１μＭ）処置Ｈｕｈ７細胞に対する応答による選別されたＮＫ９２ Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体クローンのスクリーニング
上記の実施例に記載されたクローニングされたＮＫ９２細胞株を、Ｈｕｈ７またはゾレドロン酸（１μＭ）処置Ｈｕｈ７細胞に対するその応答に関してスクリーニングした。

Ｈｕｈ７細胞を、ゾレドロン酸（１μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置した。選別したＮＫ９２細胞クローンを、Ｈｕｈ７、または１μＭゾレドロン酸処置Ｈｕｈ７細胞と共に１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を、染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１８に示すように、クローンＳ７６は、Ｈｕｈ７またはゾレドロン酸処置Ｈｕｈ７細胞に対して最も良好な応答を示した。

（実施例１７）
いくつかの異なるがん細胞株に対するＳ７６およびＳ７７の応答の比較
クローニングされたＮＫ９２細胞株Ｓ７６およびＳ７７を、いくつかの細胞株に対するその応答に基づいて比較した。Ｊｕｒｋａｔは、Ｔ細胞白血病のモデルであり、Ｊ１．１細胞は、ＨＩＶ感染後のＪｕｒｋａｔに由来した。Ｋ５６２は、赤白血病細胞株である。ＳｕｐＴ１は、Ｔ細胞リンパ腫細胞株であり、ＴＨＰ１は、単球性白血病細胞株である。

クローニングされたＮＫ９２細胞株Ｓ７６およびＳ７７を、異なるがん細胞株とＥ：Ｔ比１：１で４時間混合した。ＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図１９に示すように、クローンＳ７６は、試験した複数のがん細胞株に対してＳ７７より良好に応答した。

（実施例１８）
複数の細胞株に対するＳ７６の応答の試験
Ｓ７６細胞株の応答を、ゾレドロン酸による処置後の複数のがん細胞株に対して試験した。ＰＣ３は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅから得た前立腺がん細胞亜株である。ＰＣ３－ＡＴＣＣは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。

Ｓ７６細胞株を、いくつかのがん細胞株のいずれかと１：１の比で４時間混合した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図２０に示すように、Ｓ７６細胞株は、全ての試験した細胞株に対する応答を示し、応答は通常、低用量ゾレドロン酸の後ではより高かった。ゾレドロン酸は、本試験において試験した唯一のＴ細胞標的であるＤａｕｄｉまたはＣ８１６６細胞に対する応答にはほとんど効果を有しなかった。

（実施例１９）
Ｄａｕｄｉ細胞株に対するＳ７６細胞株の応答に及ぼすマイトマイシンＣの効果の試験
クローニングされたＳ７６細胞を、増殖を防止するために不活化した後、細胞をがん患者に注射した。マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）を使用して照射を模倣し、細胞がＭＭＣ処置後でもなおも機能的であるか否かを試験した。照射も同様に使用してもよい。

クローニングされたＳ７６細胞を、ＭＭＣの様々な濃度で１または２時間処置した。ＭＭＣ処置後、Ｓ７６を、Ｄａｕｄｉ細胞と２：１の比で４時間混合した。ＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

図２１に示すように、ＭＭＣ処置は、本明細書で試験した最高用量による２時間の処置後であってもクローンＳ７６細胞の機能を有意に損なわなかった。

（実施例２０）
Ｃ８１６６細胞に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害の決定
クローンＳ７６を、ＣＤ１０７ａ発現に基づいていくつかの細胞株に対して最も良好な応答を示したことからさらなる開発のための候補として選択した。本発明者らは次に、細胞傷害アッセイを使用して結果を確認しようとした。本発明者らは、本アッセイにおいてクローニングされたＳ７６細胞株（本明細書において、「ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６」とも呼ばれる）およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞株を比較した。

カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株を、ゾレドロン酸（１μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する比（Ｅ：Ｔ）で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイは３連で実施した。インキュベーション後、上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０マルチチャネルカウンター（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

図２２に示すように、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－５と比較して、Ｃ８１６６細胞またはゾレドロン酸（１μＭ）処置Ｃ８１６６細胞に対して高い細胞傷害を示した。１μＭ濃度のゾレドロン酸は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅を変化させなかった。これらは、以前のＣＤ１０７ａアッセイと一致する。

（実施例２１）
ＳＮＵ４４７細胞株に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害の決定
ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６が、ＳＮＵ４４７細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。ＳＮＵ４４７は白血病細胞株であり、細胞は、エプスタインバーウイルスによって形質転換された。

カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸（１μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する比（Ｅ：Ｔ）で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイは３連で実施した。インキュベーション後、上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０マルチチャネルカウンター（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

図２３Ａに示すように、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、ＳＮＵ４４７細胞またはゾレドロン酸（１μＭ）処置ＳＮＵ４４７細胞に対してＮＫ９２γδＴＣＲ－５より高レベルの細胞傷害を示した。１μＭ濃度のゾレドロン酸は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅を有意に増強した。これらは、ＣＤ１０７ａアッセイと一致する（図２３Ｂ）。

（実施例２２）
Ａ５４９細胞株に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害の決定
ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６が、Ａ５４９細胞株に対して細胞傷害効果を有するか否かを決定した。Ａ５４９細胞株は、肺腺癌のモデルである。

カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸（１μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する比（Ｅ：Ｔ）で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイは３連で実施した。インキュベーション後、上清を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０マルチチャネルカウンター（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

図２４Ａに示すように、Ａ５４９は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５に対して耐性である。１μＭ濃度のゾレドロン酸は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５による細胞死滅を増強した。ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、ゾレドロン酸（１μＭ）処置Ａ５４９細胞に対してＮＫ９２γδＴＣＲ－５より高レベルの細胞傷害を示した。これらは、ＣＤ１０７ａアッセイの結果と一致する（図２４Ｂ）。

これらの結果は、Ａ５４９がＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５に耐性であることを実証する。Ａ５４９をゾレドロン酸（１μＭ）によって処置すると、低レベルの細胞死滅が観察された。ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、ゾレドロン酸（１μＭ）処置Ａ５４９に対してＮＫ９２γδＴＣＲ－５より高い細胞傷害効果を示した。その後の実験（示していない）では、１０μＭ用量のゾレドロン酸は、クローニングされたＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６エフェクター細胞株によるＡ５４９細胞死滅を実質的に増加させた。

（実施例２３）
ＰＣ３細胞株に対するＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６の細胞傷害の決定
ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６が、ＰＣ３（ＵＭＢ）細胞に対して細胞傷害性であるか否かを決定した。カルセイン－アセトキシメチルによる蛍光測定細胞傷害アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、標的細胞に対する細胞傷害を測定した。標的細胞株をゾレドロン酸（１μＭ）の非存在下または存在下で２４時間処置し、標的細胞として使用した。標的細胞を、２ｍＭカルセイン－アセトキシメチルによって３７℃で１５分間標識した後、ＰＢＳによって１回洗浄した。細胞を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、様々なエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした；アッセイを、３連で実施した。インキュベーション後、上清を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移し、カルセイン含有量をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０マルチチャネルカウンター（４８５／５３５ｎｍ）を使用して測定した。特異的溶解パーセントを、（試験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。

図２５Ａに示すように、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、ＰＣ３細胞において低レベルを示した。１μＭ濃度のゾレドロン酸は、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６による細胞死滅を有意に増強した。これらは、以前のＣＤ１０７ａアッセイ結果と一致している（図２５Ｂ）。

（実施例２４）
選択されたＮＫ９２γδＴＣＲ細胞クローンの表現型特徴付け
上記のように、単一細胞クローンをスクリーニングすることによって、本発明者らは、Ｄａｕｄｉまたは他のがん細胞株に対して高い応答を示したクローンを選択した。これらのクローンの中で、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５は、最も良好な機能を示した。さらに、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、複数の試験においてＮＫ９２γδＴＣＲ－５より良好であった。異なるクローンが異なるエフェクター機能を示した理由を理解するために、表現型解析を使用して、ＮＫ９２、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞におけるＮＫ関連受容体の発現を比較した。

ＮＫ９２、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞におけるＮＫ関連受容体の発現を比較した。エフェクター細胞効力の差についての機序上の説明を探索した。ＮＫ９２、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６またはＮＫ９２γδＴＣＲ－５細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、異なる抗体によって染色した。細胞を染色緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＮＫ活性化受容体発現の相対レベルを、平均蛍光強度によって決定し、結果は以下の通りであった：
ＮＫｐ３０：ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６＝ＮＫ９２γδＴＣＲ－５＞ＮＫ９２
ＮＫｐ４４：ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６＞ＮＫ９２γδＴＣＲ－５＞ＮＫ９２
ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄ：３細胞株において類似の結果
ＣＤ１６：ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５は陰性である。頻度が低いＮＫ９２細胞はＣＤ１６陰性であり、ＮＫ９２がモノクローナル細胞株ではないことを示している。驚くべきことに、本発明者らは、Ｄａｕｄｉ刺激に応答しなかった全てのγδＴＣＲ陽性ＮＫ９２クローンがＣＤ１６陽性であったことを観察し、ＣＤ１６が完全に予見できない機構によってγδＴＣＲシグナル伝達を阻害することを示唆している。ＣＤ１６陽性初代γδ Ｔ細胞がＩＰＰ刺激に応答しないという観察もまた、驚くべきことであった。
ＮＫ共受容体：ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５は、ＮＫ９２細胞より、２Ｂ４およびＮＴＢ－Ａの低い発現を示した。
ＣＤ５９、ＤＮＡＭ－１およびＮＫｐ８０：発現は３つの細胞株において類似であった。
ＮＫ阻害性受容体：ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６およびＮＫ９２γδＴＣＲ－５は、元のＮＫ９２細胞と比較して低レベルのＮＫＧ２ＡおよびＴＩＭ３を発現した。
ＰＤ１およびＴＩＧＩＴ：３つ全ての細胞株はＰＤ１およびＴＩＧＩＴの発現を欠如した。

このように、最も強力なＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６は、活性化受容体ＮＫｐ４４の最高レベルの発現を有し、阻害性受容体ＮＫＧ２Ａの最低レベルの発現を有した。このプロファイルは、エフェクターの効力と一致し、γδＴＣＲおよびＮＫ受容体の両方による腫瘍死滅の制御を反映する。

（実施例２５）
ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６機能に及ぼすＮＫｐ４４の試験
表現型アッセイは、ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６が、はるかに高いレベルのＮＫｐ４４を発現したことを示した。本発明者らは次に、ＮＫｐ４４が、ブロッキングまたはアゴニスト抗ＮＫｐ４４抗体によって１時間前処置したＮＫ９２－γδＴＣＲ－Ｓ７ＮＫ９２γδＴＣＲ－Ｓ７６のより高いエフェクター機能の原因であるか否かを試験した。処置後、Ｓ７６をＤａｕｄｉ細胞によって１：１の比で４時間処置した。ＣＤ１０７ａを、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａを検出するために、細胞を洗浄し、５０～１００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、マウス抗ヒトＶδ２－ＰＥクローンＢ６およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣクローンＨ４Ａ３によって染色した。細胞を洗浄緩衝液によって洗浄し、再懸濁した。少なくとも１×１０^４個のリンパ球（前方散乱および側方散乱プロファイルに基づくゲート設定）のデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において各試料から獲得した。全ての試料を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図２６に示すように、ＮＫｐ４４抗体は、Ｄａｕｄｉが誘導したＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ－Ｓ７６応答を有意に増強した。いずれの抗体も、単独ではＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ－Ｓ７６応答を誘導しなかった。結果は、ＮＫｐ４４が、共刺激性受容体として作用して、ＮＫ９２－ｇｄＴＣＲ－Ｓ７６応答を増強することができることを示した。

（実施例２６）
レンチウイルスの組み込み部位解析およびＣＤ１６の発現
ＮＫ９２細胞を、外因性ＣＤ１６遺伝子（Ｆｃ受容体）のレトロウイルス媒介組み込みによって改変されたＮＫ９２細胞株について記載されたように、ＡＴＣＣから得た。外因性ＣＤ１６は、腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を実施するために、これらの細胞が抗体に結合することを可能にすることを意味する。親ＮＫ９２細胞は、ＡＴＣＣを通して利用可能ではなく、得られなかった。

本明細書に記載される場合、本発明者らは、ＣＤ１６を親ＮＫ９２細胞に導入するために当初使用されたレトロウイルスベクターとは異なるレンチウイルスベクターを利用してこれらのＮＫ９２－ＣＤ１６細胞を改変した。本発明者らのレンチウイルスベクターは、ＣＤ３遺伝子を細胞のＤＮＡに組み込み、次にガンマデルタＴ細胞受容体の遺伝子を組み込んだ。細胞をスクリーニングして、ｇｄＴＣＲを発現する細胞を同定した後、腫瘍細胞株に対する効力に関して試験した。本明細書で記載されるように、本発明者らは、さらなる試験のために３つのクローン（Ｓ７６、５、およびＳ６８）を選択し、がん細胞のそれらの認識およびｇｄＴＣＲの重要な機能を証明するデータを提供した。別のクローンＳ２９を、形質導入されたが腫瘍細胞と反応しなかったために対照として選択した。

予想外に、クローンＳ７６、５およびＳ６８は、ＣＤ１６を発現することができなかったが、非機能的Ｓ２９クローンは、ＣＤ１６を発現した。ＡＴＣＣから得たＮＫ９２－ＣＤ１６細胞の元の細胞集団では、＞９９％の細胞がＣＤ１６を発現し、これらの結果は驚くべきものであった。さらに調べるために、レンチウイルス組み込み部位解析を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）組み込み部位解析キットによって実施した。この解析を通して、クローニングされた細胞株Ｓ７６、５およびＳ６８は、レンチウイルスベクターの形質導入後の同じ細胞に由来したことが決定された。その結果、これらの３つのクローニングされた細胞株のレンチウイルス組み込み部位は同一である（Ｓ６８において追加の組み込み部位を検出したことを除き）。ＣＤ１６を発現するクローニングされたＳ２９細胞株は、Ｓ７６、５およびＳ６８細胞株とは明らかに異なる２つのレンチウイルスベクター組み込み部位を有した。さらに、Ｓ７６、５およびＳ６８は、検出可能なレトロウイルス組み込みを有さず、それらがＣＤ１６レトロウイルスベクターによって決して形質導入されなかったこと、または形質導入されたベクターが欠失されたが、Ｓ２９細胞株が、そのＣＤ１６＋表現型を説明する予想されるレトロウイルス組み込みを保有したことを示唆した。

驚くべきことに、ＣＤ１６の発現は、ＮＫ細胞が、ｇｄＴＣＲを使用することを不可能にし、ＣＤ１６レトロウイルス陰性ＮＫ細胞のみが機能的ｇｄＴＣＲを発現することができることが発見された。本発明者らは、実質的なＣＤ１６発現を欠如するＮＫ細胞がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体の発現の増強ならびに／またはがん細胞の認識および溶解の増強を示すことを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることを望まないが、ＣＤ１６発現は、ＣＤ３がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体をＮＫ細胞の細胞表面に輸送する能力を妨害し、それによってがん細胞抗原の認識を防止すると考えられる。

（実施例２７）
ＣＤ１６発現の下方調節
ＮＫ細胞におけるＣＤ１６のレベルは、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、ｇｄＴＣＲ発現ならびに腫瘍細胞のその後の認識および死滅を容易にするために下方調節される。

バイオインフォマティクス解析を、ＣＤ１６ ｍＲＮＡコード配列標準分析ツールで実施し、阻害性ＲＮＡの最適な標的部位を規定した。２０個の可能性がある標的部位のコレクションをＣＤ１６遺伝子に関して編集する。これらの２０個の標的（ガイド配列）と相補的な配列を有する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を合成し、供給業者から得る。

１つの実験に関して、ｓｉＲＮＡガイド配列を、組み込み型ウイルスベクターにコードされるプラスミド構築物の形態で細胞に送達する。２０個のｓｉＲＮＡの各々が短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の骨格内で個々に構築物の１つにコードされる、２０個の構築物２７Ａ１－２７Ａ２０の１セットを作製した。プロモーター／エンハンサー領域は、ｓｈＲＮＡの上流に位置し、転写ターミネーターは、ｓｈＲＮＡの下流に位置する。２０個の追加の構築物の別のセット２７Ｂ１－２７Ｂ２０に関して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の骨格内に２０個のｓｉＲＮＡの各々が構築物の１つに個々にコードされる構築物を作製する。プロモーター／エンハンサー領域は、ｍｉＲＮＡの上流に位置し、転写ターミネーターはｍｉＲＮＡの下流に位置する。４０個の構築物、２７Ａ１－２７Ａ２０および２７Ｂ－２７Ｂ２の各々をＮＫ細胞に個々に送達し、そこでｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをそれぞれ発現させ、細胞酵素によってプロセシングしてｓｉＲＮＡ配列の各々を放出させる。ｓｉＲＮＡ配列は、そのそれぞれの標的部位でＣＤ１６ ｍＲＮＡにアニールし、ＣＤ１６ ｍＲＮＡのＲＮＡ切断、脱安定化、および分解を促進する。細胞形質導入アッセイを実施して、細胞表面上のＣＤ１６ ｍＲＮＡ、およびＣＤ１６タンパク質レベルの低減の程度を決定する。最も強力なｓｉＲＮＡ（すなわち、ＣＤ１６ ｍＲＮＡおよびＣＤ１６タンパク質発現の最低レベルをもたらすｓｉＲＮＡ）を、さらなる実験およびＮＫ細胞改変のために選択する。

多様なＮＫ細胞を試験するために選択する。初代ＮＫ細胞、不死化ＮＫ細胞、骨髄造血幹細胞前駆細胞（ＨＳＣＰＣ）、および胚幹細胞（ＥＳ細胞）を得、先の節で選択した最も強力なｓｉＲＮＡをコードする構築物によって改変した。ＣＤ１６ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを決定し、最低レベルのＣＤ１６発現を有するＮＫ細胞を選択した。ＣＤ１６の発現が最低である細胞を、先の実施例で記載したアッセイを使用してがん細胞株を認識および溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変ＮＫ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。

（実施例２８）
ＣＤ１６遺伝子の編集
ＣＤ１６遺伝子は、ＣＤ１６タンパク質の発現を防止するために、このように、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、ｇｄＴＣＲ発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、ＮＫ細胞において編集される。

第１の実験では、ＣＤ１６ ｍＲＮＡ配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの最適な標的部位を規定した。第２の実験では、ＣＤ１６ ｍＲＮＡ配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識にとって最適な標的部位を規定する。第１の実験では、ＣＤ１６ ｍＲＮＡ配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析し、ＴＡＬＥＮ認識部位の最適な標的部位を規定する。２０個のガイド配列のコレクションを、３つの実験の各々のために編集する。

編集構築物をＮＫ細胞に送達し、これらの編集構築物は、ＣＤ１６遺伝子におけるそのそれぞれの標的配列を認識し、変異（欠失を含む）を導入して、遺伝子発現を不活化する。個々の遺伝子編集構築物を、細胞トランスフェクションまたは形質導入アッセイにおいて比較し、二対立遺伝子性のＣＤ１６遺伝子改変の効率を決定する。限界希釈を使用して、クローン性の細胞株を単離および成長させ、ＣＤ１６ ｍＲＮＡおよびＣＤ１６タンパク質の発現を、先の実施例に記載したように各々の単離された細胞株について決定する。ゲノムＤＮＡを、最低レベルのＣＤ１６発現を有する細胞から精製し、ＣＤ１６遺伝子の二対立遺伝子性の不活化を確認する。

１つの実験では、ＣＤ１６対立遺伝子の二対立遺伝子性の改変を有するＮＫ細胞に、ＣＤ３タンパク質およびガンマデルタＴ細胞受容体をコードする組み込み型ベクターを形質導入する。ＣＤ３およびＴＣＲに関して陽性の細胞を出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。

別の実験では、ＣＤ１６対立遺伝子の二対立遺伝子性改変を有するＮＫ細胞に、ＣＤ３タンパク質およびガンマデルタＴ細胞受容体をコードする非組み込み型ベクターを形質導入する。ＣＤ３およびＴＣＲに関して陽性の細胞を出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変されたＮＫ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。

（実施例２９）
ガンマデルタＴＣＲの発現および機能を容易にするための、ＣＤ３タンパク質の過剰発現
ＣＤ３タンパク質を、液性腫瘍および固形腫瘍の治療として、ｇｄＴＣＲ発現ならびにその後の腫瘍細胞の認識および死滅を容易にするために、ＮＫ細胞において過剰発現させる。

第１の実験では、ＮＫ細胞に、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣＤ３タンパク質コード領域を発現する組み込み型ウイルスベクターを形質導入する。ＣＤ３タンパク質の高レベル発現が得られる。第２の実験では、ＮＫ細胞に、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣＤ３タンパク質コード領域を発現する非組み込み型ウイルスベクターを形質導入する。ＣＤ３タンパク質の高レベル発現を得る。ＣＤ３発現の定量的分析を、抗体染色およびフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または当技術分野で公知の任意の好適な技術を使用して実施し、高レベルのＣＤ３発現を確認する。

さらなる実験では、高レベルのＣＤ３タンパク質発現を有するＮＫ細胞に、ガンマデルタＴ細胞受容体をコードする組み込み型を形質導入する。ＣＤ３およびｇｄＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。別の実験では、高レベルのＣＤ３タンパク質発現を有するＮＫ細胞に、ガンマデルタＴ細胞受容体をコードする非組み込み型を形質導入する。ＣＤ３およびｇｄＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。

ＣＤ３およびｇｄＴＣＲに関して陽性の細胞を、出発培養物からクローニングするかまたは富化し、培養して細胞数を増加させ、腫瘍細胞に対する曝露による活性化に関しておよび細胞傷害を通して腫瘍細胞を溶解するその能力に関して試験する。最も強力な改変されたＮＫ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏでがんを有する対象に移植し、治療効果を生じる。
配列
以下の配列を本明細書において参照する：

ある特定の好ましい実施形態を記載し、上記で具体的に例証してきたが、本開示は、そのような好ましい実施形態に限定されないと意図される。本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変をそれらに行ってもよい。

Claims (60)

1. 少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するＮＫ細胞を含む改変されたＮＫ細胞であって、前記少なくとも１つのＴ細胞受容体が少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む、改変されたＮＫ細胞。
2. 前記ＮＫ細胞が、少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
3. 前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３タンパク質をさらに発現する、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
4. 前記少なくとも１つのδ鎖が、δ１鎖、δ２鎖、δ３鎖、およびδ５鎖のうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
5. 前記少なくとも１つのδ鎖がδ２鎖を含む、請求項４に記載の改変されたＮＫ細胞。
6. 前記少なくとも１つのγ鎖がγ９鎖を含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
7. 前記少なくとも１つのＴ細胞受容体が、少なくとも１つのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体を含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
8. 前記少なくとも１つのＴ細胞受容体がＣＤ１６を発現しない、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
9. 前記ＮＫ細胞が、ＮＫ９２細胞、ＫＨＹＧ－１細胞、ＮＫＬ細胞、ＮＫＧ細胞、ＮＫ－ＹＳ細胞、ＨＡＮＫ－１細胞、またはＹＴ細胞を含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
10. 前記ＮＫ細胞が、ＮＫ９２細胞を含む、請求項９に記載の改変されたＮＫ細胞。
11. 前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞を含む、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
12. アミノビスホスホネート薬；および
    請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞
    の組合せを含む、がんを処置するための医薬組成物。
13. 前記アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記組合せが、固定された組合せを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
15. 前記組合せが、固定されない組合せを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
16. ＦＤＰＳの阻害剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
17. 前記ＦＤＰＳの阻害剤がｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. ＣＤ１６のアンタゴニストをさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
19. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
21. 前記対象が、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのがんを有する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記対象に、有効量のアミノビスホスホネート薬を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記アミノビスホスホネート薬が、前記改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される、請求項２２に記載の方法。
25. 前記アミノビスホスホネート薬が、前記改変されたＮＫ細胞と共に投与される、請求項２２に記載の方法。
26. 有効量のＦＤＰＳの阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
27. 前記ＦＤＰＳの阻害剤が、前記改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＦＤＰＳの阻害剤が、前記改変されたＮＫ細胞と共に投与される、請求項２６に記載の方法。
29. 前記ＦＤＰＳの阻害剤が、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
30. 有効量のＣＤ１６のアンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
31. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、前記改変されたＮＫ細胞とは別個に投与される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、前記改変されたＮＫ細胞と共に投与される、請求項３０に記載の方法。
33. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項３０に記載の方法。
34. 有効量の請求項１２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんを処置する方法。
35. 前記対象が、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、中皮腫、混合型がん、神経膠腫、神経芽腫、またはその混合物のうちの１つまたは複数から選択される少なくとも１つのがんを有する、請求項３４に記載の方法。
36. アミノビスホスホネート薬がゾレドロン酸を含む、請求項３４に記載の方法。
37. 有効量のＦＤＰＳの阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
38. 前記ＦＤＰＳの阻害剤が、前記医薬組成物とは別個に投与される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記ＦＤＰＳの阻害剤が、前記医薬組成物と共に投与される、請求項３７に記載の方法。
40. 前記ＦＤＰＳの阻害剤がｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
41. 有効量のＣＤ１６の阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
42. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、前記医薬組成物とは別個に投与される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、前記医薬組成物と共に投与される、請求項４１に記載の方法。
44. 前記ＣＤ１６のアンタゴニストが、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
45. 前記ＮＫ細胞が、実質的なＣＤ１６発現の欠如に関して選択される、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
46. ＮＫ細胞が、モノクローナル細胞株の限界希釈および増大によって選択される、請求項４６に記載の改変されたＮＫ細胞。
47. ＣＤ１６発現が拮抗される、請求項４６に記載の改変されたＮＫ細胞。
48. ＣＤ１６発現が、ＣＤ１６ ｍＲＮＡを標的としてその発現を干渉する低分子ＲＮＡによって拮抗される、請求項４６に記載の改変されたＮＫ細胞。
49. 前記低分子ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項４８に記載の改変されたＮＫ細胞。
50. ＣＤ１６発現が、遺伝子編集系によってＣＤ１６遺伝子の１つまたは両方のコピーを不活化することによって拮抗される、請求項４７に記載の改変されたＮＫ細胞。
51. 前記遺伝子編集系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）系を含む、請求項５０に記載の改変されたＮＫ細胞。
52. ＣＤ１６発現が、標的化タンパク質分解体によって拮抗される、請求項４７に記載の改変されたＮＫ細胞。
53. 前記標的化タンパク質分解体が、タンパク質分解標的化キメラ分子（「ＰＲＯＴＡＣ」）分解体、分子糊分解体、またはユビキチンリガーゼ修飾因子を含む、請求項５２に記載の改変されたＮＫ細胞。
54. 前記ＮＫ細胞が、患者の血液から精製された初代ＮＫ細胞である、請求項１に記載の改変されたＮＫ細胞。
55. 前記ＮＫ細胞が、白血球アフェレーシスおよび／または密度勾配遠心分離によって精製される、請求項５４に記載の改変されたＮＫ細胞。
56. 精製された前記ＮＫ細胞がｅｘ ｖｉｖｏで増大される、請求項５５に記載の改変されたＮＫ細胞。
57. 前記改変されたＮＫが、少なくとも１つのＴ細胞受容体をコードする１つまたは複数のウイルス組み込み型または非組み込み型ベクターをさらに形質導入され、前記少なくとも１つのＴ細胞受容体が少なくとも１つのγ鎖および少なくとも１つのδ鎖を含む、請求項４７に記載の改変されたＮＫ細胞。
58. 少なくとも１つのＮＫ細胞受容体をさらに含む、請求項５７に記載の改変されたＮＫ細胞。
59. 少なくとも１つのＣＤ３タンパク質をさらに含む、請求項５８に記載の改変されたＮＫ細胞。
60. 請求項４５～５９のいずれかに記載の改変されたＮＫ細胞を含む医薬組成物。