BR112021000408A2 - vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas - Google Patents

vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas Download PDF

Info

Publication number
BR112021000408A2
BR112021000408A2 BR112021000408-4A BR112021000408A BR112021000408A2 BR 112021000408 A2 BR112021000408 A2 BR 112021000408A2 BR 112021000408 A BR112021000408 A BR 112021000408A BR 112021000408 A2 BR112021000408 A2 BR 112021000408A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
protein
rna
nuclease
cell
cells
Prior art date
Application number
BR112021000408-4A
Other languages
English (en)
Inventor
Gianluca PETRIS
Antonio CASINI
Anna CERESETO
Original Assignee
Alia Therapeutics S.R.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alia Therapeutics S.R.L. filed Critical Alia Therapeutics S.R.L.
Publication of BR112021000408A2 publication Critical patent/BR112021000408A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

VESÍCULAS PARA DISPENSAÇÃO SEM TRAÇO DE MOLÉCULAS DE RNA GUIA E/OU COMPLEXO(S) DE NUCLEASE GUIADA POR RNA/MOLÉCULA DE RNA GUIA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DAS MESMAS. A presente invenção descreve vesículas carregando gRNA(s) e/ou complexos de ribonucleoproteína de nuclease guiada por RNA associada(o)s a CRISPR (RNPs) que são eficientemente dispensada(o)s em células alvo através de proteínas de envelope fusogênico.

Description

VESÍCULAS PARA DISPENSAÇÃO SEM TRAÇO DE MOLÉCULAS DE RNA GUIA E/OU COMPLEXO(S) DE NUCLEASE GUIADA POR RNA/MOLÉCULA
DE RNA GUIA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DAS MESMAS Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a vesículas manipuladas geneticamente para dispensação direta de moléculas de RNA guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por RNA/molécula de RNA guia em uma célula alvo, bem como um método de produção das mesmas. Técnica Anterior
[002] A dispensação direta de RNA(s) guia (gRNAs) e/ou complexo(s) de ribonucleoproteína de nuclease de guia de RNA (RNP(s)) em células alvo pode encontrar várias aplicações em biotecnologia, pesquisa celular, diagnóstico e terapia. Esse processo consiste na introdução no citoplasma e/ou núcleo celular das moléculas de gRNAs e/ou RNPs desejados por métodos químicos ou físicos, reduzindo ao mínimo a toxicidade celular. Os métodos atuais incluem: transfecção por meio de reagentes à base de lipídios, reagentes à base de polímeros ou reagentes à base de proteínas; eletroporação; microinjeção; fusão com peptídeos de penetração celular; introdução por meio de partículas semelhantes a vírus (VLPs). Embora todos esses métodos sejam difundidos na prática de pesquisa, seu perfil de eficácia e toxicidade varia de acordo com o modelo de linha de célula usado nos experimentos. Além disso, a maioria dessas técnicas não é adequada para a dispensação in vivo de RNAs ou RNPs em modelos animais ou para fins terapêuticos devido à baixa eficiência na transferência de carga. Por exemplo, a eletroporação é conhecida por causar altos níveis de toxicidade celular e carece de um controle preciso da quantidade de RNPs ou RNAs dispensados, enquanto a dispensação mediada por VLP pode ser conectada a respostas imunes intensificadas contra o veículo de dispensação devido à presença de proteínas virais usadas para empacotamento.
[003] Na mesma linha, a obtenção de quantidades consideráveis de proteínas recombinantes a serem usadas para dispensação direta nas células pode ser um desafio. Alguns exemplos de problemas encontrados durante a produção da proteína recombinante podem ser: rendimento das preparações, solubilidade da proteína recombinante, recapitulação fiel das modificações pós-tradução, recapitulação fiel do dobramento da molécula original.
[004] Outro grande obstáculo para a dispensação de gRNAs e RNPs nas células é representado pelo fato de que os métodos padrão para a expressão de RNA não são adequados ou mostram baixa eficiência na incorporação de certos tipos de transcritos em vesículas derivadas do citoplasma. Além disso, várias modificações pós-transcricionais de RNA podem ser prejudiciais ou necessárias para que o gRNA seja dispensado. Como consequência, as mesmas dificuldades estão presentes ao acondicionar RNPs contendo esses tipos de transcritos em tais vesículas. Em particular, os RNAs sem uma capa 5’, uma cauda 3’-poli-A ou RNAs que não foi(ram) submetida(o)s em splicing ou não (é)são processada(o)(s) pela maquinaria de processamento de miRNA de interferência de RNA que são transcritos no núcleo não atingem o citoplasma de forma eficiente. Os transcritos obtidos a partir de promotores de RNA polimerase III (por exemplo, promotor U6, promotor H1, promotores tRNA etc.), que são comumente usados para aplicações biotecnológicas, caem nessa categoria e, portanto, são mal empacotados em vesículas derivadas de citoplasma. Os transcritos de RNA polimerase II são geralmente exportados para o citoplasma para tradução, mas são modificados por capeamento 5’, splicing de íntron, edição de base e A tailing de 3’poli antes de serem exportados do núcleo, mas tais modificações podem ser indesejáveis para várias aplicações e esses RNAs são frequentemente presos em subcompartimentos citosólicos (por exemplo, corpos de RNA) ou na maquinaria de translação celular (por exemplo, ribossomos).
[005] A expressão de transcritos sem cobertura e não poliadenilados no citoplasma pode ser obtida pela expressão de uma RNA polimerase ectópica no citoplasma de uma célula desejada. Um promotor correspondente precisa ser adicionado a montante do transcrito alvo, enquanto a terminação da transcrição pode ser alcançada pela presença de uma sequência terminadora adequada ou pela transcrição de escoamento superficial de um molde linear de DNA. Os RNAs transcritos são frequentemente autoprocessados para remover parte do transcrito (por exemplo, sequências terminadoras) pela presença de ribozimas (por exemplo, ribozimas do HDV e HH). Um exemplo de tal polimerase é a T7 RNA polimerase obtida do bacteriófago T7 em combinação com o promotor T7.
[006] Usualmente a transcrição da RNA polimerase T7 tem sido usada para a transcrição livre de células in vitro de RNAs que são frequentemente combinadas com proteínas para a formação de RNPs antes de sua dispensação direta em células alvo ou em ensaios in vitro.
[007] Entre as diferentes aplicações que exploram a dispensação direta de RNPs nas células, uma de particular interesse é a edição de genoma mediada por CRISPR nuclease.
Nucleases associadas a CRISPR, geralmente chamadas de CRISPR-Cas (por exemplo, CRISPR-Cas9, CRISPR- Cpf1, CRISPR-Cas13), são famílias de nucleases (a mais famosa é Streptococcus pyrogenes Cas9, SpCas9) que em sua forma natural usam uma ou mais de moléculas de RNA, formando um RNA-guia (gRNA), para reconhecer seu ácido nucleico alvo.
As tecnologias de CRISPR nuclease têm um potencial tremendo tanto para aplicações básicas quanto clínicas (Cong et al. 2013; Casini et al. 2018). O resultado da edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9 depende altamente da eficiência da dispensação de nuclease guiada por RNA em células alvo e sua especificidade (extensão da atividade fora do alvo). Uma vez que as clivagens não específicas de Cas9 se correlacionam com altos níveis de proteína e expressão de longo prazo em células receptoras (Tsai & Joung 2016; Petris et al. 2017), as estratégias de dispensação são de importância crucial para a eficiência e a especificidade da edição do genoma Cas9. Consistentemente, uma vez que a natureza transitória dos RNPs em células alvo reduz clivagens inespecíficas em sítios fora do alvo, a edição do genoma é, de preferência, realizada por meio da dispensação de complexos de Cas9-ribonucleoproteína de gRNA (RNPs) (Ramakrishna et al. 2014; Zuris et al. 2015; S.
Kim et al. 2014). Em oposição a esses métodos, os vetores virais, incluindo aqueles de origem retroviral, são amplamente usados para dispensação eficiente de genes de nuclease e gRNA tanto in vitro quanto in vivo (Long et al. 2016; Yang et al. 2016; Diao et al. 2016). No entanto, essas ferramentas de dispensação geralmente não são ideais para abordagens terapêuticas transitórias, devido à expressão do transgene de longo prazo e aos riscos potenciais de mutagênese de inserção (Petris et al. 2017; Chick et al. 2012). Os vetores virais não integrados, tais como os derivados de vírus adenoassociados (AAV), são eficientes para a dispensação de genes e, em princípio, devem prevenir a integração mutagênica (Nakai et al. 2001; Lombardo et al. 2007; Zacchigna et al. 2014; Ruozi et al. 2015). No entanto, esses vetores são mais adequados para a expressão de longo prazo de pequenos transgenes (não maiores que ~4kb) e, portanto, não são totalmente compatíveis com a tecnologia de CRISPR nuclease, em particular, com as nucleases SpCas9 e AsCpf1 mais usadas.
Para contornar a genotoxicidade gerada por vetores retrovirais, enquanto preserva a eficiência de dispensação viral, um vetor lentiviral não integrante (IDLV) portando o cassete de expressão de gRNA empacotado com a proteína SpCas9 foi desenvolvido (Choi et al. 2016). Uma grande melhoria em direção à dispensação completa sem traço de cargas de proteína exógena nas células é potencialmente oferecida pelo desenvolvimento de partículas semelhantes a vírus (VLPs) (Voelkel et al. 2010). A origem viral das VLPs garante a transdução eficiente das células alvo, mesmo que nenhum DNA genômico viral seja transportado pelas partículas, permitindo assim a rápida eliminação da proteína e dos RNAs transportados.
As VLPs têm sido usadas principalmente na última década para fins de vacinação (Ramqvist et al. 2007) ou para a dispensação de proteínas exógenas (Voelkel et al. 2010). Para minimizar os elementos virais, a dispensação de carga de proteína pode ser obtida com vesículas feitas exclusivamente com a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) (Mangeot et al. 2011).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] O objetivo dessa revelação é fornecer novos sistemas capazes de distribuir de uma forma transitória gRNA(s) e/ou complexos de gRNA(s)/nuclease guiada por RNA em uma célula alvo.
[009] De acordo com a invenção, o objetivo acima é alcançado graças ao assunto reivindicado especificamente nas reivindicações subsequentes, que são entendidas como fazendo parte integrante dessa revelação.
[0010] A presente invenção descreve uma vesícula que é carregada com gRNAs ou gRNAs complexados com uma nuclease e um método para produzir a referida vesícula. Os gRNAs são acumulados no citoplasma da célula usando um sistema de transcrição citoplasmática para obter uma incorporação altamente eficiente do gRNA na vesícula. Esse sistema de transcrição citoplasmático pode ser operado exclusivamente em células permissivas.
[0011] A presente invenção fornece uma vesícula que compreende: i) um envelope lipídico associado a pelo menos uma proteína associada à membrana; ii) pelo menos uma molécula de RNA guia; e iii) opcionalmente pelo menos uma nuclease guiada por RNA; em que a vesícula tem pelo menos uma das seguintes características: - a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma quantidade de pelo menos 0,2% p/p da massa total da proteína da vesícula; e - se a vesícula contém também a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, a pelo menos uma molécula de RNA guia é complexada com a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, em que a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma razão molar em relação à pelo menos uma nuclease guiada por RNA igual ou maior que 0,85:1.
[0012] É descrito nesse documento um novo método que permite empacotamento eficiente de complexos de ribonucleoproteína nuclease (RNPs) e/ou moléculas de gRNA dentro de estruturas derivadas de citoplasma liberadas de uma célula, isto é, vesículas.
[0013] De acordo com a presente invenção, a vesícula é produzida por um método que compreende as seguintes etapas: i) fornecer uma célula de empacotamento, em que a célula de empacotamento tem as seguintes características: a) a célula é tolerante a altos níveis de transcrição citosólica direta, em que a tolerância da célula é determinada por: uma falta de expressão na célula de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, DDX58, MDA-5, IPS-1, RIPI, FADD, TRAF6, TRAF3, TANK, NAP, NEMO, IKKα, IKKβ, IKKε, IKKγ, TBK1, DDX3, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, p65, p50, RIP1, TLR3, TLR7, TLR8, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3, Caspase-1; e/ou uma capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou a capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’; e b) a célula expressa de forma estável ou transiente uma RNA polimerase no citoplasma; ii) transfecção da célula de empacotamento com pelo menos um primeiro cassete de expressão e pelo menos um segundo cassete de expressão e opcionalmente pelo menos um terceiro cassete de expressão, em que: a) o primeiro cassete de expressão compreende uma primeira sequência de nucleotídeos para transcrever pelo menos uma molécula de RNA guia; b) o segundo cassete de expressão compreende uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana; e c) o terceiro cassete de expressão compreende uma terceira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma nuclease guiada por RNA; iii) produção da vesícula a partir da célula de empacotamento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] A invenção será agora descrita em detalhes, puramente por meio de exemplo ilustrativo e não limitativo, com referência às figuras anexas, em que: - FIGURA 1. Projeto e atividade de edição do genoma de VEsiCas.
[0015] (a) Ensaio de rompimento de EGFP com vesículas VSV-G/SpCas9 produzidas em células HEK293T. Porcentagens de células HEK293-EGFP com inativação de EGFP geradas por transfecção de SpCas9 (plasmídeo SpCas9) juntamente com sgRNA de direcionamento de EGFP (sgEGFP5) ou controle
(sgCtr), ou por transdução com vesículas VSV-G/SpCas9 transportando sgRNA transcrito por U6. Quando indicado, as células HEK293-EGFP foram pré-transfectadas com sgEGFP5 ou sgCtr (+ pré-sgRNA) antes do tratamento com vesículas VSV- G/SpCas9. Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. (b) Esquema de produção de VEsiCas a partir de células BSR-T7/5. A RNA polimerase T7, expressada no citosol, regula a expressão do sgRNA citosólico por meio do promotor T7. Vesículas decoradas com VSV-G, expressadas pelas células produtoras BSR-T7/5, que incorporam SpCas9 complexado com sgRNA para formar VEsiCas.
Em células alvo, as VEsiCas liberam complexos de SpCas9-sgRNA ativos, que entram nos núcleos por meio de duas sequências de localização nuclear introduzidas em SpCas9. (c) Atividade genômica de VEsiCas produzidos em BSR-T7/5 nas células HEK293-EGFP.
Porcentagens de células HEK293-EGFP não fluorescentes após transfecção de SpCas9 (plasmídeo SpCas9) juntamente com sgRNAs (sgEGFP5 ou sgCtr) ou tratamentos com VEsiCas portando sgRNAs (sgEGFP5 ou sgCtr) com ou sem pré-transfecção com sgRNAs como indicado.
Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. (d, e) Edição mediada por VEsiCas dos loci genômicos CXCR4 (d) e sítio VEGFA3 (e). As porcentagens de formação de indels em células HEK293T medidas através da análise de TIDE após a transfecção de SpCas9 (plasmídeo Cas9) juntamente com sgRNAs (sgCXCR4, sítio de sgVEGFA 3 ou sgCtr) ou após três tratamentos sequenciais com VEsiCas portando sgRNAs (sgCXCR4, sítio de sgVEGFA 3 ou sgCtr) ou após três tratamentos sequenciais com VEsiCas portando sgRNAs (sgCXCR4, sítio de sgVEGFA 3 ou sgCtr). Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. - Figura 2. Desenvolvimento de vesículas VSV-G para dispensação de SpCas9.
[0016] (a) Produção e dispensação de vesículas Cas9/VSV- G em células HEK293T. Análise de Western blot da expressão de SpCas9 em extratos celulares de células produtoras (painel esquerdo), no sobrenadante de células produtoras (painel do meio) e em células alvo 6 horas após a transdução (painel direito). Ctr corresponde a células transfectadas com um plasmídeo de controle vazio, SpCas9 corresponde a células que superexpressam SpCas9 e sgRNA (sgEGFP5), SpCas9/VSV-G corresponde a células que superexpressam SpCas9, sgEGFP5 e VSV-G. Western blot é representativo de n = 2 experimentos independentes. (b) Ensaio de rompimento de EGFP em diferentes linhas de células usando sistemas de expressão de sgRNA do promotor U6 ou T7. Imagens de microscopia por fluorescência obtidas a partir de HEK293T, BHK21, BSR-T7/5 (um clone BHK21 expressando estavelmente a RNA polimerase T7) e linhas de células Vero transfectadas com plasmídeos de expressão EGFP e SpCas9 juntamente com plasmídeos que expressam sgRNAs direcionados a EGFP (sgEGFP5) ou não direcionados a EGFP (sgCtr) de um promotor U6 ou T7, como indicado. Todas as células, exceto BSR-T7/5, também foram cotransfectadas com um plasmídeo que expressa a RNA polimerase T7. A inativação de EGFP foi detectada com intensidade variável em todas as linhas de células que expressam sgRNAs (sgEGFP5) conduzida pelo promotor U6 (painéis da direita). Por outro lado, o sgRNA conduzido pelo sistema RNA polimerase T7 foi capaz de induzir a inativação de EGFP apenas em células permissivas
(células BHK-21, BSR-T7/5 e Vero), mas não em células HEK293T. Barra de escala: 100 μm. Os dados são representativos de n = 2 experimentos independentes. (c) Análise de Western blot de SpCas9 detectado no sobrenadante de células produtoras de BSR-T7/5 (VEsiCas) ou HEK293T (SpCas9/VSV-G). O gel foi carregado com quantidades similares de proteína SpCas9. Western blots foram desenvolvidos com anticorpos anti-SpCas9 ou anti-tubulina. Western blot é representativo de n = 2 experimentos independentes. - Figura 3. Partículas semelhantes a vírus de base lentiviral (lenti-VLPs) para dispensação de SpCas9.
[0017] (a) Esquema das quimeras Gag-SpCas9 (Gag-Cas9) e MinimalGag-SpCas9 (MinGag-Cas9). Os domínios de Gag, Matriz (MA), Capsídeo (CA), Nucleocapsídeo (NC) e os peptídeos p1, p2 e p6 estão indicados. Um peptídeo ligante separa Gag de SpCas9. A posição dos sinais de localização nuclear (NLS) e a etiqueta 3xFLAG são indicadas. A fusão MinGag-Cas9 inclui o sinal de miristilação N-terminal de MA, a parte C-terminal de CA e o peptídeo p2. O NC foi substituído pelo domínio zíper de leucina de GCN4 (Z) para manter a montagem das partículas. O peptídeo p2b de RSV substitui p6 para a formação de partículas (Accola et al. 2000). (b) Análise de Western blot de Gag-SpCas9 e MinGag-SpCas9. As células foram transfectadas com plasmídeo que codifica Gag-SpCas9 e MinimalGag-SpCas9 (MinGag-SpCas9) contendo (+Met) ou não (- Met) uma metionina entre o FLAG e o peptídeo ligante. A ponta da seta indica SpCas9 livre provavelmente gerado pela tradução a partir do Met interno. Ctr corresponde a células transfectadas com um plasmídeo de controle vazio. Western blot é representativo de n = 2 experimentos independentes. (c) Atividade de quimeras Gag-SpCas9 e MinGag-SpCas9 no ensaio de rompimento de EGFP. As células HEK293-EGFP foram transfectadas com plasmídeos que expressam Gag-SpCas9 ou MinGag-SpCas9 com ou sem a metionina entre o FLAG e o peptídeo ligante. As células também foram cotransfectadas com sgEGFP5 ou sgCtr. NT = não tratadas. Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. (d) Análise de Western blot de células produtoras (células) e sobrenadantes derivados (VLPs) após a superexpressão de SpCas9, Gag-SpCas9 ou MinGag-SpCas9 como indicado. Ctr corresponde a células transfectadas com um plasmídeo de controle vazio. Western blot é representativo de n = 2 experimentos independentes. (e-g) Edição de genoma com lenti-VLPs. Atividade de edição induzida por lenti-VLPs Gag- SpCas9 ou MinGag-SpCas9 decorada com VSV-G que tem como alvo (e) o EGFP (porcentagem de células EGFP negativas), (f) o CXCR4 ou (g) os loci de sítio de VEGFA 3 em células HEK293T. A percentagem de indels foi analisada por TIDE). Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. - Figura 4. Edição de genoma por VEsiCas de multiplexação
[0018] (a) Eliminação do gene usando VEsiCas. Análise de eletroforese em gel da eliminação do locus de EGFP obtida em células HEK293-EGFP por meio de tratamento Multi-VEsiCas (painel esquerdo) ou por transfecção com SpCas9 juntamente com sgRNAs específicos (sgEGFP5 e sgEGFPBi) (painel direito). A quantidade de eliminação (%) foi quantificada por densitometria. As pontas de setas indicam a banda esperada correspondente à amplificação por PCR do locus de
EGFP eliminado. (b) Atividade de VEsiCas dispensando SpCas9 nickase. Porcentagens de células de inativação de EGFP após incubação com VEsiCas-n, portando SpCas9 nickase carregada com sgRNA em direção a dois sítios no locus de EGFP (sgEGFP3gW e sgEGFPBi) ou com sgCtr. NT = não tratadas. Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. - Figura 5. Titulação de VEsiCas e comparação com um método de dispensação de RNPs Cas9-sgRNA amplamente usadas.
[0019] Ensaio de rompimento de EGFP em células HEK293- EGFP tratadas com quantidades escalares de SpCas9 dispensadas por eletroporação de VEsiCas ou RNPs. Ambos RNPs e VEsiCas foram carregadas com o mesmo sgRNA (sgEGFP5) transcrito pela RNA polimerase T7 in vitro ou em células BSR-T7/5, respectivamente. Os dados são representativos de n = 2 experimentos independentes. - Figura 6. Inativação de EGFP mediada por VEsiCas em células J-Lat-A1 e HeLa.
[0020] J-Lat-A1 e HeLa expressando EGFP de forma estável foram tratados com VEsiCas que portam sgRNAs direcionados a EGFP (sgEGFP5) ou de controle (sgCtr). O gráfico mostra as porcentagens de células não fluorescentes sete dias após o tratamento. Os dados são representativos de n = 2 experimentos independentes. - Figura 7. Atividade de edição de genoma em iPSCs e no coração de um modelo de camundongo com EGFP.
[0021] (a) Atividade de VEsiCas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Porcentagem de células iPSC não fluorescentes que expressam de forma estável EGFP após o tratamento com VEsiCas portando um sgRNA de controle
(sgCtr) ou um RNA guia direcionado a GFP (sgGFPI2). NT = células não tratadas. Dados apresentados como média ± s.e.m. para n = 2 experimentos independentes. (b) Rompimento gênico mediado por VEsiCas no músculo cardíaco de camundongos com EGFP. Imagens de microscopia por fluorescência de seções de tecido cardíaco de camundongos transgênicos com EGFP 10 dias após a injeção intracardíaca de VEsiCas portando um sgRNA de controle (sgCtr) ou um guia direcionado a EGFP (sgEGFPBi). O DAPI foi usado como contracoloração nuclear. A imunocoloração para α-actinina foi realizada para identificar cardiomiócitos (painéis inferiores). Uma amostra representativa de n = 5 experimentos é mostrada. Barra de escala: 100 μm. - Figura 8. Análise da atividade no alvo/fora do alvo gerada por VEsiCas no locus de VEGFA.
[0022] (a) Dispensação sem traço de SpCas9 por meio de VEsiCas. Análise de curso de tempo de níveis intracelulares de SpCas9 por análise de Western blot em células HEK293T transduzidas com VEsiCas ou transfectadas com um plasmídeo que expressa SpCas9. Os momentos relatados correspondem ao tempo de análise após os tratamentos (transdução ou transfecção). Western blot é representativo de n = 2 experimentos independentes. (b) Comparação direcionada da especificidade de edição do genoma usando VEsiCas ou plasmídeo que expressa SpCas9 em combinação com o sgVEGFA sítio3. As porcentagens de formação de indels medidos por TIDE no locus VEGFA sítio3 e em dois sítios sgVEGFA sítio3 previamente validados (OT1 e OT3) em células HEK293T. A barra tracejada representa a referência TIDE. (c) Especificidade em todo o genoma de VEsiCas direcionados ao locus do VEGFA sítio3 (nucleotídeos 4-26 de SEQ ID No: 17). Análise GUIDE- seq para o sgRNA direcionado ao locus sítio sgVEGFA 3 em células HEK293T transfectadas com SpCas9 ou tratadas com VEsiCas. O quadrado preto indica sítios no alvo. O DNA de três réplicas biológicas foi misturado antes da preparação da biblioteca. O painel direito relata o número total de alvos não identificados para o sgVEGFA sítio3 com transfecção de SpCas9 ou tratamentos com VEsiCas. - Figura 9. Ativação da expressão gênica pelo regulador transcricional VEsiCas.
[0023] Ativação da expressão de EGFP com ativador de VEsiCas. As células transfectadas com plasmídeos repórteres pTRE-EGFP foram tratadas com VEsiCas dispensando sgRNA específico de promotor (sgTetO), ou de controle (sgCtr) e dSpCas9-VP64. O gráfico mostra a porcentagem de células EGFP positivas dois dias após a transdução. - Figura 10. Dispensação de moléculas de gRNA por meio de VEsiCas.
[0024] VEsiCas derivados de células que expressam sgRNAs direcionados (sgEGFPBi) ou não direcionados (sgCtr) ao locus de EGFP foram transduzidos em células HEK293-EGFP, que foram transfectadas com plasmídeo que expressa SpCas9 24 horas antes da transdução. O gráfico mostra a porcentagem de células EGFP negativas sete dias após a transdução. - Figura 11. Eficácia de edição de VEsiCas carregadas com SpCas9 miristilado.
[0025] Ensaio de rompimento de EGFP em células HEK293- EGFP usando VEsiCas incorporando SpCas9 miristilado (myr- VEsiCas) e carregadas com o RNA guia sgEGFPBi. A porcentagem de células EGFP negativas obtidas com o tratamento é relatada no gráfico. As células não tratadas servem como controle de referência. - Figura 12. Comparação da eficácia de edição de vesículas U6 e VEsiCas.
[0026] (a) Ensaio de rompimento de EGFP em HEK293-EGFP usando vesículas U6 ou VEsiCas carregadas com o RNA guia sgEGFPBi. O gráfico relata as porcentagens de células EGFP negativas geradas com cada tratamento, como indicado. As células não tratadas servem como controle de referência. (b) Eficácia de edição relativa de vesículas U6 em relação a VEsiCas obtidas através da normalização dos dados em (a) para a quantidade total de SpCas9 usada para tratar células alvo. - Figura 13. Comparação da eficácia de edição de Gesículas e VEsiCas.
[0027] Porcentagens de células EGFP negativas geradas após o tratamento de HEK293-EGFP com vesículas U6, Gesículas ou VEsiCas9, cada uma carregada com o sgRNA sgEGFPBi. As células foram tratadas com uma fração de cada preparação contendo a mesma quantidade de SpCas9, como medido por Western blot. - Figura 14. Quantificação da incorporação de sgRNA em VEsiCas e vesículas U6.
[0028] (a) Curva padrão usada para quantificação absoluta de sgRNA por RT-qPCR obtida usando um sgRNA transcrito in vitro idêntico ao incorporado em cada preparação de vesícula. A equação da linha de tendência e o valor R quadrado correspondente são relatados no gráfico. (b) Quantidade total de sgRNA incorporado em vesículas U6 e VEsiCas medido por RT-qPCR usando a curva padrão em (a) para as interpolações. (c) Quantidade relativa de sgRNA incorporada por vesículas U6 em relação a VEsiCas calculada a partir da normalização dos dados em (b) para a quantidade total de SpCas9 presente em cada produção, como quantificado por western blot. - Figura 15. Quantificação precisa da incorporação de SpCas9 em VEsiCas.
[0029] (a) Western blot de uma preparação representativa de VEsiCas. Duas curvas padrão diferentes (Padrão 1 e Padrão 2), obtidas com diferentes preparações de SpCas9 recombinantes, são carregadas junto com a amostra para permitir a quantificação por densitometria. (b-c) Curvas padrão obtidas a partir da análise densitométrica dos dados em (a) usados para a quantificação absoluta de SpCas9. As equações da linha de tendência e os valores de R quadrado correspondentes são relatados em cada gráfico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0030] Na descrição a seguir, vários detalhes específicos são dados para fornecer uma compreensão completa das modalidades. As modalidades podem ser praticadas sem um ou mais dos detalhes específicos, ou com outros métodos, componentes, materiais etc. em outros casos, estruturas, materiais ou operações bem conhecido(a)s não são mostrado(a)s ou descrito(a)s em detalhes para evitar obscurecer aspectos de as modalidades.
[0031] A referência ao longo deste relatório descritivo a “uma modalidade” ou “uma modalidade” significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrito(a) em conexão com a modalidade está incluído(a) em pelo menos uma modalidade. Assim, as aparências das expressões “em 1 modalidade” ou “em uma modalidade” em vários lugares ao longo desse relatório descritivo não se referem necessariamente à mesma modalidade. Além disso, o(a)s recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinado(a)s de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.
[0032] Os títulos fornecidos nesse documento são apenas para conveniência e não interpretam o escopo ou o significado das modalidades.
[0033] Nucleases guiadas por RNA, e em particular a tecnologia CRISPR-Cas, são uma ferramenta poderosa para edição do genoma e para regulação do genoma. Sua tradução para uso clínico depende fortemente de melhorias adicionais em sua especificidade (revogação completa da atividade fora do alvo) e dispensação. Esses são aspectos fortemente interdependentes da edição do genoma, uma vez que a quantidade e o tempo de expressão de RNPs de nuclease (por exemplo, gRNA e SpCas9) em células receptoras se correlacionam fortemente com as frequências de clivagens fora do alvo (Tsai & Joung 2016; Petris et al. 2017; Fu et al. 2013). Além disso, a persistência da expressão de SpCas9 pode gerar respostas imunológicas adversas para as células modificadas in vivo, reforçando ainda mais a demanda por um método de dispensação altamente controlável (Chew et al. 2016). A expressão transitória de SpCas9 foi obtida através de métodos de dispensação físicos e químicos (reagentes baseados em lipídios e polímeros) (Zuris et al. 2015; Mout, Ray, Yesilbag Tonga, et al. 2017), que não são ideais para aplicações in vivo (Mout, Ray, Lee, et al. 2017). As primeiras ferramentas para dispensação de genes in vivo são vetores virais que, no entanto, têm sérias limitações decorrentes de seu risco potencial de mutagênese por inserção (Chick et al. 2012; Petris et al. 2017) e expressão de transgene permanente que pode aumentar o número de clivagens fora do alvo de SpCas9 (Petris et al. 2017). A genotoxicidade associada à integração viral pode ser parcialmente contornada pelo uso de vetores virais não integrados, tais como aqueles derivados de vírus adenoassociados (AAV) (Zacchigna et al. 2014; Nakai et al. 2001; Ruozi et al. 2015). Devido às limitações de tamanho, ortólogos de SpCas9, como o de Staphylococcus aureus (Ran et al. 2015; Friedland et al. 2015), ou estratégias de proteínas divididas (split- Cas9) geralmente têm sido empregados com vetores AAV (Truong et al. 2015). No entanto, a separação dos elementos CRISPR introduz alta complexidade no sistema e integrações ocasionais de AAV foram relatadas (Deyle & Russell 2009). De forma similar, a mutagênese por inserção imprevisível relatada com outros vetores não integrantes, como os vetores lentivirais defeituosos para integrase (IDLV), pode ser aumentada pela atividade de nuclease além do nível de referência (Gabriel et al. 2011; Wang et al. 2015). As tentativas de combinar as vantagens oferecidas pela dispensação viral junto com a expressão transitória de SpCas9 foram recentemente abordadas usando um vetor lentiviral de CRISPR-Cas autolimitado (Petris et al. 2017) e por manipulação genética de partículas lentivirais contendo SpCas9 pré-empacotado juntamente com um vetor lentiviral não integrante que expressa os gRNAs (Choi et al. 2016). Uma outra etapa para a exploração das propriedades de dispensação viral em um contexto livre de DNA é o desenvolvimento de partículas semelhantes a vírus (VLPs) (Mangeot et al. 2011;
Voelkel et al. 2010). As VLPs foram usadas principalmente na última década para abordagens de vacinação (Ramqvist et al. 2007) e para a dispensação de proteínas exógenas (Mangeot et al. 2011; Voelkel et al. 2010).
[0034] A fim de resolver as desvantagens identificadas acima da tecnologia conhecida, os presentes inventores foram inesperadamente capazes de produzir vesículas capazes de dispensar - de uma forma transitória - gRNAs e/ou RNPs, como aquele formado por uma nuclease guiada por uma molécula de gRNA (RNA nuclease guiada), cujo componente gRNA foi abundantemente empacotado em vesículas explorando um sistema de expressão citoplasmática. As novas vantagens surpreendentes incluem uma produção e dispensação muito mais eficiente de gRNAs ou RNPs de gRNA nuclease, onde as nucleases empacotadas em vesículas são quase completamente e corretamente acopladas com seu gRNA devido à transcrição citoplasmática obtida nas células permissivas apropriadas. Em comparação com a expressão nuclear de gRNAs, o sistema de expressão citosólica descrito nesse documento para gRNAs e RNPs empacotando em vesículas liberadas por células foi várias vezes mais eficiente. Essas vesículas são projetadas para ter elementos mínimos (por exemplo, elementos virais, tal como a glicoproteína VSV-g) necessários para desencadear a formação de vesículas, a liberação de vesículas de células produtoras, o direcionamento eficiente e a fusão de vesículas para ter como alvo células onde a dispensação de gRNAs e/ou RNPs transportado(a)s devem ocorrer.
[0035] As vesículas objeto do presente pedido são projetadas para dispensar gRNAs e/ou RNPs de nuclease guiada por gRNA de uma forma transitória. Isso se opõe à dispensação por meio de transfecção de DNA ou dispensação de vetor viral, em que o DNA codificador produz gRNAs e/ou nuclease guiada por gRNA continuamente ou pelo menos até que o DNA codificador seja liberado pela célula (plasmídeo perdido após a divisão celular) que, por sua vez, não ocorrem após a integração do plasmídeo/vetor viral na cromatina celular. Por outro lado, a dispensação de RPN resulta em um aumento da especificidade, tolerabilidade e segurança de suas aplicações em vários campos (por exemplo, edição e terapia de genes e genomas, regulação da expressão gênica, modificações epigenéticas). A dispensação transitória minimiza os riscos devido a: resposta imunológica contra elementos não próprios presentes nas vesículas; clivagem ou modificação do local fora do alvo para RNPs de gRNA e/ou gRNA-nuclease e/ou outro de seus elementos associados presentes em vesículas; efeitos tóxicos devido à presença de componentes de vesículas em particular RNPs de gRNA e/ou gRNA-nuclease, que podem alterar a homeostase celular se expressados por um longo tempo.
[0036] A presente invenção se refere a uma vesícula que compreende: i) um envelope lipídico associado a pelo menos uma proteína associada à membrana; ii) pelo menos uma molécula de RNA guia; e iii) opcionalmente pelo menos uma nuclease guiada por RNA; em que a vesícula tem pelo menos um dos seguintes recursos: - a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma quantidade de pelo menos 0,2% em p/p da massa total da proteína da vesícula; e - se a vesícula contém também a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, a pelo menos uma molécula de RNA guia é complexada com a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, em que a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma razão molar em relação à pelo menos uma nuclease guiada por RNA igual ou maior que 0,85:1.
[0037] Em uma modalidade, o envelope lipídico é selecionado de uma estrutura lipídica mono ou bicamada, um exossomo, um vírus envelopado, uma partícula semelhante a um vírus envelopada, um microssoma, um endossomo, um nanossomo, um vacúolo. De preferência, o envelope lipídico é selecionado de um exossoma, um vírus envelopado ou uma partícula semelhante a um vírus com envelope; mais preferencialmente, o envelope lipídico é uma partícula semelhante a um vírus com envelope.
[0038] Em uma modalidade, a pelo menos uma proteína associada à membrana estimula a formação de vesículas e/ou medeia a fusão de vesículas com células alvo. A pelo menos uma proteína associada à membrana é selecionada de: complexo adaptador-clatrina AP1, proteína de proteolipídeo PLP1, TSAP6, CHMP4C, proteína do envelope de VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína do envelope BRL, glicoproteína do envelope do vírus da raiva, proteína do envelope NA/HA/M2 da influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, gp160 de HIV, proteínas de capsídeo, proteínas de nucleocapsídeo, proteína de matriz de vírus com envelope tendo uma interação com a membrana celular, ebola VP40, glicoproteína de ebola, proteína retroviral Gag e/ou Gag- pol, proteína lentiviral Gag e/ou Gag-Pol, proteínas Arc,
proteínas de envelope de retrotransposons TY3/cigano, Vpu de HIV-1, Gag mínimo, fusão de SADB19-VSV-G, uma porção do domínio transmembranar de VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou ou seu domínio extracelular fundido com uma das proteínas do envelope listadas acima, fragmentos de anticorpos variáveis de cadeia simples (scFv) derivados de domínios variáveis de imunoglobulina capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo, receptores de proteínas capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo, ligantes proteicos capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo e análogos dos mesmos.
[0039] De acordo com uma modalidade, a pelo menos uma molécula de RNA guia é selecionada de miRNA, shRNA, siRNA, sgRNA, crRNA, tracrRNA.
[0040] De acordo com uma modalidade, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: CRISPR nucleases classe 2 tipo II, tipo V, tipo VI e nucleases guiadas por RNA Argonaute e variantes das mesmas. De preferência, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: uma nuclease Cas9, Cpf1, Cas13 e Ago2 e variantes das mesmas; um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 e Cas13 com ou sem atividade de nuclease; um mutante de nuclease Cas9 e Cpf1 com atividade de nickase; uma nuclease Cas9 e Cpf1 fundida com um domínio de proteína selecionado de: etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, peptídeos de penetração celular e peptídeos que permitem o escape endossomal, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, proteínas ou domínios de proteína modulando reparo de DNA, proteínas ou domínios de proteína que permitem a modificação pós-tradução de outras proteínas, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula, domínios de ligação de proteína. Mais de preferência, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: uma nuclease Cas9, Cpf1 e Cas13 e variantes das mesmas; ainda mais preferencialmente, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de uma nuclease Cas9 e Cpf1 e variantes das mesmas.
[0041] De acordo com uma modalidade, a pelo menos uma molécula de RNA guia, formando um complexo com uma nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13, ou um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13 com ou sem atividade de nuclease, é manipulada geneticamente para incluir um aptâmero, de preferência um aptâmero MS2, tendo propriedades de interação com um domínio de proteína de interação de aptâmero, de preferência uma proteína MS2, que é fundida a outros domínios de proteína que codificam um editor de base, um regulador de transcrição ou um regulador de cromatina. De preferência, o aptâmero está incluído em pelo menos uma molécula de RNA guia em posições adequadas (por exemplo, em grampo de cabelo, nexus, tetra-enovelamento, haste) ou na extremidade 3’ de pelo menos uma molécula de RNA guia.
[0042] Em uma modalidade, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é fundida a pelo menos um de: sinal de farnesilação, sinal de miristoilação, domínio transmembranar.
[0043] A vesícula, uma vez dispensada a uma célula alvo, proporciona a expressão transitória da nuclease guiada por RNA e/ou RNA guia dentro da célula alvo, a fim de minimizar a toxicidade celular.
[0044] Os métodos padrão para a expressão de gRNA não são adequados para produzir as vesículas objeto da presente invenção em vista de sua baixa eficiência de incorporação de RNPs de gRNAs e/ou nucleases guiadas por RNA em vesículas. A dispensação eficiente de nucleases guiadas por RNA e/ou gRNA é de importância crítica para a edição do genoma usando nucleases guiadas por RNA.
[0045] Os presentes inventores desenvolveram, portanto, um novo método para produzir as vesículas objeto da presente invenção capaz de atingir altas concentrações de RNPs de gRNAs e/ou nucleases guiadas por RNA no citoplasma para seu empacotamento em vesículas.
[0046] Verificou-se de fato surpreendentemente que o empacotamento eficiente de RNPs de gRNAs e de nuclease guiada por RNA em vesículas liberadas nas células requer uma grande quantidade de gRNA localizado no citoplasma das células de empacotamento e que soluções biotecnológicas dedicadas são necessárias para atingir esse objetivo. Este requisito é de extrema importância quando os gRNAs não devem conter uma capa 5’, uma sequência poli-A, não devem ser processados pela maquinaria celular e/ou processados por enzimas celulares nucleares (por exemplo, desaminação, metilação etc.). O requisito de uma presença não natural de altas concentrações de gRNAs no citoplasma para empacotamento eficiente em vesículas liberadas por células pode envolver qualquer tipo de moléculas de gRNA, incluindo gRNAs derivados do processamento de RNAs codificantes ou não codificantes, independentemente da origem do gRNA de um vírus, uma célula arqueaeal, bacteriana ou eucariótica (em particular se derivada de bacteriófagos ou RNA de vírus de células eucarióticas que se replicam na ausência ou fora do núcleo da célula). Esse aspecto tem importância crítica para a incorporação de vesículas de gRNAs, que são usualmente transcritos por polimerases diferentes da RNA polimerase-II (por exemplo, RNA polimerase-III) para fins biotecnológicos, como revelado por exemplo em WO2015/191911. Observou-se inesperadamente que a expressão de gRNAs mediada por Pol-III nuclear padrão não permite a sua liberação eficiente do núcleo para o citoplasma da célula para permitir a sua incorporação eficaz nas vesículas liberadas pelas células.
[0047] A solução revelada nesse documento pelos inventores explora a transcrição citoplasmática direta e/ou localização de gRNAs para superar essas limitações. Os gRNAs de acordo com a invenção são expressados por um sistema natural ou artificial no citoplasma da célula.
[0048] Surpreendentemente, essa solução requer células permissivas adequadas para expressar e localizar grandes quantidades de gRNA (s) e/ou RNP(s) no citoplasma para seu empacotamento em vesículas derivadas de células.
[0049] De acordo com a presente invenção, as vesículas são produzidas por um método que compreende as seguintes etapas: i) fornecer uma célula de empacotamento, em que a célula de empacotamento tem as seguintes características: a) a célula é tolerante a altos níveis de transcrição citosólica direta de pelo menos uma molécula de gRNA e/ou um complexo formado por pelo menos uma molécula de gRNA e pelo menos uma nuclease guiada por RNA, em que a tolerância celular é determinada por: uma falta de expressão na célula de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, MDA-5, IPS-1, RIPI, FADD, TRAF6, TRAF3, TANK, NAP, NEMO, IKKα, IKKβ, IKKε, IKKγ, TBK1, DDX3, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, p65, p50, RIP1, TLR3, TLR7, TLR8, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3, Caspase-1; e/ou a capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou a capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’; e b) a célula expressa de forma estável ou transiente uma RNA polimerase no citoplasma; ii) transfectar a célula de empacotamento com pelo menos um primeiro cassete de expressão e pelo menos um segundo cassete de expressão e opcionalmente pelo menos um terceiro cassete de expressão, em que: a) o primeiro cassete de expressão compreende uma primeira sequência de nucleotídeos para transcrever a pelo menos uma molécula de RNA guia; b) a segunda cassete de expressão compreende uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica a pelo menos uma proteína associada à membrana; e c) o terceiro cassete de expressão compreende uma terceira sequência de nucleotídeos que codifica a pelo menos uma nuclease guiada por RNA; iii) produzir a vesícula a partir das células de empacotamento.
[0050] De acordo com uma modalidade, a RNA polimerase é uma RNA polimerase de bacteriófago selecionada de: RNA polimerase de fago T7, RNA polimerase de Bacteriófago SP6, RNA polimerase de bacteriófago de Yersinia pestis phiA1122, RNA polimerase de bacteriófago de Pseudomonas gh-1, RNA polimerase de bacteriófago de Pseudomonas putida, RNA polimerase de Bacteriófago T3, RNA polimerase de Bacteriófago T4, RNA polimerase de Roseógago SIOl, RNA polimerase de Bacteriófago phiYe03-12, RNA polimerase de bacteriófago phiKMV, RNA polimerase de bacteriófago de Enterobacteria Kl-5, RNA polimerase de Vibriófago VpV262, RNA polimerase de BA14, RNA polimerase de BA127 e RNA polimerase de BA156 e variantes das mesmas. Mais preferencialmente, a RNA polimerase é selecionada de RNA polimerase T7, RNA polimerase SP6, RNA polimerase T3 e RNA polimerase T4. Ainda mais de preferência, a RNA polimerase é uma RNA polimerase T7.
[0051] Em uma outra modalidade, a célula de empacotamento é selecionada de células BHK21, BSR-T7/5, BHK-T7 e Vero.
[0052] Em uma modalidade, a pelo menos uma proteína associada à membrana, útil para estimular a formação de vesículas e/ou para mediar a fusão de vesículas em células alvo, é selecionada de: Complexo adaptador-clatrina AP1, proteína de proteolipídeo PLP1, TSAP6, CHMP4C, proteína de envelope de VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope de vírus da raiva, proteína de envelope de NA/HA/M2 de influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, gp160 de HIV, proteínas de capsídeo, proteínas de nucleocapsídeo, proteína de matriz de vírus envelopado tendo uma interação com uma célula membrana, VP40 de ebola, glicoproteína de ebola, proteína retroviral Gag e/ou Gag-pol, proteína lentiviral Gag e/ou Gag-Pol, proteínas Arc, proteínas de envelope de retrotransposons TY3/ciganos, Vpu de HIV-1, Gag mínimo, fusão de SADB19-VSV- G, uma porção do domínio transmembranar de VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou seu domínio extracelular fundido com uma das proteínas do envelope listadas acima, fragmentos de anticorpos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de domínios variáveis de imunoglobulina capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo, receptores de proteínas capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo, ligantes proteicos capazes de reconhecer moléculas de superfície em células alvo e análogos das mesmas.
[0053] De acordo com uma modalidade, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: nucleases guiadas por CRISPR classe 2 tipo II, tipo V, tipo VI e RNA Argonaute e variantes das mesmas. De preferência, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: uma nuclease Cas9, Cpf1, Cas13 e Ago2 e variantes das mesmas; um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 e Cas13 com ou sem atividade de nuclease; um mutante de nuclease Cas9 e Cpf1 com atividade de nickase; uma nuclease Cas9 e Cpf1 fundida com um domínio de proteína selecionado de: sequências de aminoácidos que codificam etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, peptídeos de penetração celular e peptídeos que permitem o escape endossomal, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, proteínas ou domínios de proteína de modulação do reparo de DNA, proteínas ou domínios de proteína permitindo a modificação pós-tradução de outras proteínas, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula, domínios de ligação de proteína. Mais de preferência, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de uma nuclease Cas9, Cpf1 e
Cas13 e variantes das mesmas; ainda mais de preferência, a pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de uma nuclease Cas9 e Cpf1 e variantes das mesmas.
[0054] De acordo com uma outra modalidade, a pelo menos uma molécula de RNA guia, formando um complexo com uma nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13, ou um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13 com ou sem atividade de nuclease, é manipuladas geneticamente para incluir um aptâmero, de preferência um aptâmero MS2, tendo propriedades de interação com um domínio de proteína de interação de aptâmero, de preferência uma proteína MS2, que é fundida a outros domínios de proteína que codificam um editor de base, um regulador de transcrição ou um regulador de cromatina. O aptâmero pode ser incluído na estrutura de sgRNA em posições adequadas (por exemplo, grampo de cabelo, nexo, tetraenovelamento, haste) ou na extremidade 3’ do sgRNA.
[0055] De acordo com uma modalidade preferida, a tolerância celular para dirigir a transcrição citosólica do gRNA é determinada por: (i) uma falta de expressão na célula de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, MDA-5, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3; e/ou (ii) a capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou (iii) uma capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’. Mais de preferência, as células de empacotamento são caracterizadas por: (i) uma falta de expressão de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, INF-α, INF- β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3; e/ou (ii) uma capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou (iii) uma capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’.
[0056] De acordo com a presente invenção, o método para produzir as vesículas fornece adicionalmente na etapa ii) para a transfecção da célula de empacotamento com pelo menos um outro cassete de expressão, em que pelo menos um outro cassete de expressão compreende uma outra sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana, útil para alterar o tropismo de vesículas para células alvo, selecionadas de: gp160 de HIV, gp120 de HIV, VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína de ebola, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, NA/HA/M2 de influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus TCR-alfa, CD4, MHC-I, MHC-II, domínios variáveis de anticorpos e/ou anticorpos de comprimento total que reconhecem moléculas de superfície em células alvo, com a condição de que a sequência de nucleotídeos adicional codifique pelo menos uma proteína associada à membrana diferente de pelo menos uma proteína associada à membrana codificada pela segunda sequência de nucleotídeos compreendida na segunda cassete de expressão. De preferência, pelo menos um outro cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana selecionada de: glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope de vírus da raiva, proteína de fusão de SADB19- VSV-G, uma proteína de VSV-G de comprimento total ou os domínios citosólicos e transmembranares da proteína de VSV-
G fundidos a um domínio receptor capaz de se ligar a uma molécula de superfície nas células alvo. Mais de preferência, pelo menos uma outra cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana selecionada de: glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, proteína de fusão de SADB19-VSV-G.
[0057] A seguir, definições e outras características dos recursos reivindicados são fornecidas. Moléculas de RNA guia
[0058] De acordo com a presente invenção, a pelo menos uma molécula de RNA guia (gRNA) incorporada nas vesículas, que é usada por nuclease(s) guiada(s) por RNA para ligar o alvo de ácido nucleico, é selecionada de: sgRNA, crRNA, tracrRNA, miRNA, shRNA, siRNA.
[0059] A molécula de gRNA pode ser um RNA guia único natural ou artificial (sgRNA) ou um RNA guia feito por dois ou mais transcritos.
[0060] De preferência, os gRNAs podem ser ligados por uma ou mais de proteínas e/ou outras moléculas de gRNAs como descrito abaixo.
[0061] O gRNA, usado sozinho ou em combinação com outros gRNAs, é capaz de se ligar e ter como alvo a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, e em algumas modalidades também outras moléculas associadas, a um alvo de ácido nucleico de interesse (presente na célula alvo) pelo menos em parte complementar à parte “guia” da molécula de gRNA.
[0062] Algumas não correspondências nas sequências de nucleotídeos (por exemplo, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%) entre a porção guia da molécula de gRNA e os ácidos nucleicos alvo podem estar presentes. A presença de não correspondências pode ter um efeito na atividade da nuclease guiada por RNA (por exemplo, a presença de não correspondências pode regular a atividade da nuclease, desencadeando a ligação de RNP da sequência alvo, mas não sua clivagem, ou influenciando a taxa de clivagem e afinidade, tal como em (Dahlman et al. 2015)).
[0063] De forma similar, as moléculas associadas a RNPs podem ter sua função enzimática rigidamente regulada pela presença de não correspondências entre o gRNA e o ácido nucleico alvo devido às diferentes afinidades e alterações conformacionais envolvendo os componentes de RNP, sequência alvo e/ou regiões próximas.
[0064] A molécula de gRNA pode ser modificada para modular a afinidade de nuclease para o alvo de interesse. O gRNA pode ser modificado conforme descrito abaixo (i) para ser mais ou menos estável em comparação com o gRNA precursor natural ou artificial, (ii) para abolir, reduzir ou aumentar sua interação com uma sequência de ácido nucleico alvo e/ou com um ou mais de nuclease guiada por RNA e/ou moléculas associadas, (iii) para ser rastreável, (iv) para ser posteriormente modificado por uma forma madura ou inativada por clivagem de gRNA, (v) para ser modificado com modificações pós-transcricionais para adicionar novas funções para o transcrito original ou regular sua maturação.
[0065] O gRNA pode ser modificado para se associar especificamente a outras moléculas e proteínas para introduzir nova atividade ao gRNA e/ou ao complexo de nuclease guiada por gRNA/RNA. Em particular, a ativação transcricional ou edição de base pode ser obtida através da inclusão de um aptâmero similar à sequência de ligação de MS2 no gRNA que gera ligação com uma proteína MS2 fundida a domínios de ativação transcricional ou domínios de edição de base. Exemplos não limitativos de domínios de ativação transcricional são: VPR, VP64, VP16. Exemplos não limitativos de domínios de edição de base são: domínios de nucleotídeo desaminase (por exemplo, citidina desaminases (AID, APOBEC etc.) ou adenina desaminases). A ancoragem dos domínios de ativação transcricional ou domínios de edição de base para ou próximo ao local alvo de nuclease guiada por RNA gera ativação transcricional ou edição de base do gene alvo.
[0066] O gRNA pode ser modificado quimicamente por desaminação de RNA, incorporação de nucleotídeos naturais e artificiais.
[0067] O gRNA pode ser fundido a: domínios de RNA adicionais internamente ou em suas extremidades 5’ e 3’ (por exemplo, capa 5’, repetições de MS2, RNA tipo grampo de cabelo, aptâmeros de RNA fluorescentes (por exemplo, brócolis, espinafre)), ribozimas, terminadores, sequências poli-A.
[0068] O gRNA ativo pode ser constituído pela associação de diferentes moléculas de RNA, que interagem por pareamento de bases ou outra ligação química (por exemplo, ligação covalente, ligação de hidrogênio, ligação de sal), como por exemplo o dímero crRNA-tracrRNA formando uma molécula de gRNA funcional para algumas CRISPR nucleases.
[0069] Porções constantes de gRNA, definidas também como andaime, são porções de gRNAs não necessárias para a seleção do alvo, mas necessárias para a ligação por uma nuclease guiada por RNA ou uma molécula associada a ela (por exemplo, uma proteína, um segundo RNA).
[0070] Os andaimes de gRNA podem ser otimizados para melhorar a transcrição, estabilidade, dobramento e interação com moléculas associadas, como uma proteína de ligação de RNA (por exemplo, (Thyme et al. 2016) e (Dang et al. 2015)). Se a proteína de ligação de RNA é uma molécula SpCas9, o gRNA pode ser composto por um único gRNA e seu andaime (tendo uma sequência de nucleotídeos como estabelecido, por exemplo, na SEQ ID No.: 44) pode ser otimizado por mutações e alterações de nucleotídeos, como definido adiante, por exemplo em SEQ ID No.: 45 e 46 como descrito em (Dang et al. 2015).
[0071] Para nucleases guiadas por RNA diferentes modificações correspondentes de SpCas9 (por exemplo, outros ortólogos de Cas9, famílias de nucleases Cpf1 ou Cas13) do andaime de gRNA cognato (por exemplo, por remoção ou mutação de nucleotídeos T para interromper trechos poli-T e/ou modificação da estrutura de RNA tipo grampo de cabelo e/ou modificação dos enovelamentos de RNA) podem ser realizadas por uma pessoa habilitada na técnica tendo em vista o conhecimento geral comum.
[0072] A RNA polimerase T7 e SP6, que de acordo com a invenção pode ser usada para a transcrição de gRNA citoplasmático, requer uma sequência inicial G, GG, GGG ou GA após seu promotor para iniciar a transcrição. Assim, em plasmídeos que codificam o cassete de expressão de gRNA, tais nucleotídeos podem ser adicionados à extremidade 5’ do transcrito correspondente ao gRNA de acordo com a invenção, modificando o cassete de expressão relativa para favorecer a transcrição citosólica por tais enzimas. Polimerases alternativas podem ser usadas na substituição da RNA polimerase T7 ou SP6 para obter a transcrição citoplasmática, por essa razão os requisitos de sequência da extremidade 5’ para iniciar a transcrição são alterados em conformidade.
[0073] Exemplos de modificações de gRNA de acordo com a invenção também são descritos em US2015/0376586.
[0074] As moléculas de gRNA úteis na presente invenção podem ser retrotranscritas para orientar os DNAs (gDNAs) antes ou depois do empacotamento em vesículas ou antes ou após a fusão da vesícula com as células alvo. Esses gDNAs podem ser pareados com nucleases guiadas por DNA para o seu direcionamento ou usados como DNAs doadores.
[0075] O(s) gRNA(s) de acordo com a invenção pode(m) se ligar a outras moléculas, influenciando mutuamente a sua atividade e/ou interações. Essas moléculas incluem, mas não estão limitadas a: proteínas (por exemplo, proteína MS2), DNA (por exemplo, moléculas de DNA doadoras para HDR) e moléculas pequenas (por exemplo, moléculas pequenas para a regulação de uma ribozima, GTP, moléculas que se ligam a aptâmeros de RNA (por exemplo, 3,5-difluoro-4- hidroxibenzilideno imidazolinona (DFHBI))). Nuclease(s) guiada(s) por RNA
[0076] O gRNA se liga a uma nuclease guiada por RNA, que é uma molécula biologicamente relevante guiada para um ácido nucleico alvo (por exemplo, RNA e/ou DNA) pelo gRNA. A nuclease guiada por RNA pode adicionar uma função ou ganhar uma função a partir da interação com a molécula de gRNA.
[0077] Em uma modalidade, a nuclease guiada por RNA é pelo menos uma proteína que em combinação com seu gRNA poderia simplesmente se ligar a uma sequência alvo ou trazer uma atividade para a, contígua ou proximalmente à, sequência alvo de acordo com sua atividade de nuclease e/ou à presença de uma ou mais moléculas adicionais associadas à RNP(s) de nuclease (exemplos de atividades são descritos em detalhes abaixo).
[0078] De acordo com a presente invenção, tais nucleases guiadas por RNA são selecionadas de nucleases associadas a CRISPR e nucleases guiadas por RNA Argonaute, ou seja, CRISPR nucleases de bacteriófago, nucleases guiadas por RNA Argonaute de origem bacteriana ou nucleases guiadas por RNA Argonaute de origem eucariótica.
[0079] De preferência, a nuclease guiada por RNA é selecionada de: CRISPR nucleases classe 2 tipo II, tipo V, tipo VI e Argonaute e variantes das mesmas. Mais de preferência, a nuclease guiada por RNA é selecionada de: nucleases Cas9, Cpf1, Cas13 e Ago2 e variantes das mesmas (como descrito abaixo).
[0080] As atividades da(s) RNP(s) de nuclease podem ser no DNA, RNA ou moléculas de proteína encontradas em proximidade espacial (não mais que 200nm, 100nm, 50nm, 30nm, 20nm, 10nm, 5nm, 3mn, 2nm, 1nm) para a sequência de ácidos nucleicos alvo, como determinado pelo gRNA, de acordo com a estrutura primária, secundária, terciária e quaternária das moléculas alvo envolvidas.
[0081] Exemplos de atividades da(s) nuclease(s) guiada(s) por RNA para a, contiguamente ou proximalmente à, sequência de ácido nucleico alvo incluem, mas não estão limitados a: clivagem, descontinuação, ligação, metilação, desmetilação, acetilação, desacetilação, fosforilação,
desfosforilação, ativação da transcrição, repressão da transcrição, interferência da transcrição, biotinilação, desaminação, desaminação de nucleotídeo, desaminação de citosina, desaminação de guanosina, interferência translacional, ubiquitinilação, modificação semelhante à ubiquitina, oxidação, redução. De preferência, esses alvos são alvos de DNA ou RNA terapêutica e/ou diagnosticamente relevantes.
[0082] Uma nuclease Cas9 e/ou uma Cpf1, como esse termo é usado nesse documento, refere-se a uma nuclease que pode interagir com uma molécula de gRNA e, em conjunto com a molécula de gRNA, localizar (por exemplo, alvo ou de origem) em um sítio que compreende um domínio alvo e sequência PAM.
[0083] De acordo com a presente invenção, uma nuclease Cas9 de uma variedade de espécies pode ser usada nos métodos descritos nesse documento. Embora dentro da seção experimental da presente invenção a nuclease Cas9 de S. pyogenes tenha sido usada (tendo suas sequências de aminoácidos reveladas em UniProtKB ID Q99ZW2), as nucleases Cas9 de outras espécies podem exercer a mesma atividade.
[0084] Exemplos de espécies, a partir das quais as nucleases Cas9 utilizáveis dentro da presente invenção podem ser obtidas, incluem: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, proteobactéria gama, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aures, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus thermophilus, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., ou Verminephrobacter eiseniae. De preferência, a nuclease Cas9 é derivada de Staphylococcus aureus (Chylinski et al. 2013), S. thermophilus e Neisseria meningitidis (Hou et al. 2013). Mais preferencialmente, a nuclease Cas9 é derivada de Staphylococcus pyrogenes.
[0085] Nucleases Cas9 de ocorrência natural que podem ser usadas na presente invenção incluem nucleases Cas9 de uma família bacteriana do grupamento 1 derivada de: S. pyogenes (por exemplo, cepa SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 e SSI-1), S.
thermophilus (e.g., cepa LMD-9), S. pseudoporcinus (por exemplo, cepa SPIN 20026), S. mutans (por exemplo, cepa UA159, NN2025), S. macacae (por exemplo, cepa NCTC11558), S. gallolyticus (por exemplo, cepa UCN34, ATCC BAA-2069), S. equines (por exemplo, cepa ATCC 9812, MGCS 124), S. dysdalactiae (por exemplo, cepa GGS 124), S. bovis (por exemplo, cepa ATCC 700338), S. anginosus (por exemplo, cepa F0211), S. agalactiae (por exemplo, cepa NEM316, A909), Listeria monocytogenes (por exemplo, cepa F6854), Listeria innocua (L. innocua, por exemplo, cepa Clipl l262), Enterococcus italicus (por exemplo, cepa DSM 15952), ou Enterococcus faecium (por exemplo, cepa 1,231,408).
[0086] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA Argonaute de origem eucariótica é o componente catalítico RISC Ago2, de preferência Ago2 humano ou de mamífero.
[0087] Variantes de nuclease guiadas por RNA, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção, são reveladas a seguir.
[0088] Em uma modalidade, uma variante de nuclease Cas9, por exemplo, uma variante de nuclease SpCas9 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 90%, preferencialmente 95%, mais de preferência 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer sequência de nuclease Cas9 aqui lembrada (e tendo suas sequências de aminoácidos conforme reveladas em UniProtKB ID Q99ZW2) ou uma sequência de nuclease Cas9 de ocorrência natural derivada das espécies listadas acima.
[0089] Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 também pode ser uma nuclease Cas9 manipuladas geneticamente (isto é, uma variante da nuclease Cas9), como revelado i.a. em
Nuñez et al. 2016; Wright et al. 2015; Zetsche et al. 2015; Nihongaki et al. 2015; Kleinstiver et al. 2016; Slaymaker et al. 2016; Pedido de patente italiana Nº 102017000016321; WO2016/205613 e WO2017/040348.
[0090] A nuclease Cas9 também pode ser mutada para ser uma nickase (por exemplo, mutantes SpCas9 D10A ou H840A em relação à sequência de referência conforme revelado em UniProtKB ID Q99ZW2), ou ser incapaz de clivar o DNA (por exemplo, mutação das posições de aminoácidos D10A/D839A/H840A ou D10A/D839A/H840A/N863A em relação à sequência de referência conforme revelado em UniProtKB ID Q99ZW2).
[0091] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é fundida com as sequências de aminoácidos, que podem fornecer novas funções, localizações, detectabilidades, atividades regulatórias e outros efeitos conhecidos por um habilitado na técnica. As sequências de aminoácidos que podem ser fundidas à nuclease guiada por RNA são selecionadas de: etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, peptídeos de penetração celular e peptídeos que permitem o escape endossomal, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, proteínas ou domínios de proteína de modulação do reparo de DNA, proteínas ou domínios de proteína permitindo a modificação pós-tradução de outras proteínas, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula, domínios de ligação de proteína. De preferência, as sequências de aminoácidos que podem ser fundidas com a nuclease guiada por RNA são selecionadas de: etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula.
[0092] Essas modificações são detalhadas nos parágrafos a seguir.
[0093] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é fundida a etiquetas de proteína (por exemplo, etiqueta-V5, etiqueta-FLAG, etiqueta-myc, etiqueta-HA, etiqueta-GST, etiqueta-polyHis, etiqueta-MBP, etiqueta-SUN, comprimento total ou parte da proteína EGFP ou proteínas fluorescentes similares) úteis para facilitar a detectabilidade da nuclease guiada por RNA.
[0094] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é fundida a domínios de nuclease adicionais (por exemplo, Fok-I ou outra nuclease guiada por RNA) para aumentar a especificidade ou atividade.
[0095] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é fundida com um domínio de edição de ácido nucleico que atua no DNA ou RNA, tal como, por exemplo, adenosina desaminase ou citidina desaminase (por exemplo, AID, APOBEC).
[0096] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser fundida a peptídeos de penetração celular (por exemplo, peptídeos de poliarginina) ou outras moléculas que favorecem o escape endossomal (por exemplo, ppTG21, como descrito em (Rittner et al. 2002)).
[0097] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser fundida a pelo menos uma proteína que poderia influenciar a expressão do gene ou alterar o reparo do DNA,
tais como: ativadores transcricionais (por exemplo, VP16, VP64, VPR), repressores transcricionais (por exemplo, KRAB), inibidores de reparo de DNA (GAM, UGI)); guanosil transferase, DNA metiltransferase (por exemplo, DNMT1; DNMT3), RNA metiltransferases, DNA desmetilases, RNA desmetilases acetiltransferases, desacetilase, ubiquitina- ligases, desubiquitinases, cinases, fosfatases, NEDD8- ligases, des- NEDDylases, SUMO-ligases, deSUMOylases, histona deacetilases (por exemplo, HDAC), histona acetiltransferases (por exemplo, p300), histona metiltransferases, histona desmetilases), domínios de ligação de DNA de proteína (por exemplo, domínio dedo de zinco ou TALE), proteínas de ligação de RNA (por exemplo, proteína MS2).
[0098] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é fundida a domínios de proteína adicionais e/ou sequências de peptídeos que regulam a localização ou estabilidade da nuclease guiada por RNA, tais como: comprimento total ou porções de proteína Gag, proteína Vpr retroviral ou lentiviral, proteína Ciclofilina A, sinais de localização nuclear (por exemplo, sinal de localização nuclear SV40, c- Myc NLS, PY-NLSs, sinais de localização nuclear bipartidos como descrito em (Suzuki et al. 2016)), sinais de exportação nuclear (por exemplo, sinal de exportação nuclear Ver de HIV-1), sinais de localização mitocondrial, sinais de localização de plastídio, sinais de localização subcelular, sinais de direcionamento de membrana (por exemplo, peptídeos líderes), sinais de lipidação (por exemplo, sinais de miristoilação (sequência de consenso: MGXXXS), sinal de palmitoilação, sinal de prenilação, sinal de isoprenilação,
sinais de degradação de desestabilização (por exemplo, motivos de caixa de destruição de Geminina).
[0099] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser fundida a sinais de ligação de proteína, tais como: domínios de dimerização ou multimerização, intracorpos (por exemplo, intracorpo anti-SUN-etiqueta), uma metade de uma proteína dividida ou domínios biológicos de amarração (por exemplo, MS2, Csy4 e proteína lambda N).
[00100] De acordo com a invenção, uma nuclease guiada por RNA pode ser reconstituída a partir de um ou mais fragmentos da mesma; de preferência em que uma inteína ou um íntron de proteína ou um domínio de dimerização é incluído na nuclease guiada por RNA (por exemplo (Truong et al. 2015)). De preferência, tais fragmentos podem ser induzidos para reconstituir uma proteína nuclease guiada por RNA cataliticamente ativa por dimerização de inteína de um Cas9 dividido como revelado, por exemplo, em (Truong et al. 2015).
[00101] Em algumas modalidades, a etapa de reconstituição pode ser realizada in vitro, em alguma outra modalidade, pode ser realizada in vivo (ver referências abaixo). De preferência, tais fragmentos podem ser induzidos a reconstituir a nuclease guiada por RNA de forma similares à nuclease Cas9 por dimerização de um Cas9 dividido como revelado, por exemplo, em (Wright et al. 2015) e (Liu et al. 2016).
[00102] De acordo com a invenção, uma nuclease Cas9 pode ser manipulada geneticamente para reconhecer uma sequência PAM diferente daquela direcionada pela nuclease Cas9 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 pode ser manipulada geneticamente para reconhecer sequências PAM relaxadas ou novas. Variantes de Cas9 podem compreender uma ou mais mutações adicionais nos resíduos D1135V/R1335Q/T1337R (variante QVR), D1135E/R1335Q/T1337R (variante EVR), D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R (variante VRQR), D1135V/G1218R/R1335E/T1337R (variante VRER) da sequência de aminoácidos revelada em UniprotKB ID Q99ZW2, como revelado no pedido de patente US2016/0319260. Em algumas modalidades, uma nuclease Cas9 pode ser modificada para reconhecer uma sequência PAM nova ou relaxada (mutações A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I/E1219V em relação à sequência de aminoácidos revelada em UniprotKB ID Q99ZW2), embora tenha também mutação melhorando sua especificidade (por exemplo, xCas9-3.6 ou xCas9-3.7 como revelado em (Hu et al. 2018)).
[00103] De acordo com a invenção, qualquer outro Cas9 ou variante de nuclease guiada por RNA conhecida na técnica visando diferentes PAMs acoplados a um gRNA transcrito no citoplasma de células permissivas pode ser usado.
[00104] Uma nuclease Cas9 pode ser adicionalmente modificada de acordo com a invenção para ser direcionada para membranas ou endossoma, como revelado i.a. em WO2015/191911.
[00105] Uma nuclease Cas9 pode ser substituída por um subtipo e classe diferente de nucleases guiadas por RNA direcionadas ao DNA, incluindo, mas não se limitando a, nucleases guiadas por RNA associado a CRISPR tipo V. De preferência, essas nucleases associadas a CRISPR tipo V são nucleases Cpf1 (por exemplo, Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1), Lachnospiraceae Bacterium Cpf1 (LbCpf1), Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1), como revelado em 2015. (Shmakov et al.)).
[00106] As nucleases guiadas por RNA Cpf1 podem ser modificadas para funcionar além da clivagem de DNA (como revelado em (Tak et al. 2017)). Alguns exemplos não limitativos de variantes de nuclease Cpf1 são: AsCpf1 contendo a mutação R1226A (referida à sequência de aminoácidos revelada em UniprotKB ID U2UMQ6) para obter uma DNA nickase; o mutante LbCpf1 D832A/E925A (referido à sequência de aminoácidos revelada em PDB ID 5ID6_A) incapaz de clivar o DNA; a fusão com outros polipeptídeos tendo ou não tendo uma atividade catalítica similar às fusões de Cas9 (por exemplo, VPR, reguladores transcricionais de KRAS, núcleo de acetilase p300, APOBEC, AID etc), como revelado por exemplo em (Tak et al. 2017).
[00107] Em algumas modalidades, as nucleases Cpf1 podem ser modificadas para atingir diferentes PAMs (como revelado em (L. Gao et al. 2017)) e funcionar além da clivagem de DNA (por exemplo, usado em combinação com outros domínios de proteína, tal como adenina ou citidina desaminase) de forma similar a variantes manipuladas geneticamente mortas com nuclease Cas9.
[00108] Nucleases guiadas por RNA úteis na presente invenção também são representadas por nucleases guiadas por RNA que têm como alvo RNA incluindo, mas não se limitando a, RNase guiada por RNA associada a CRISPR tipo VI Cas13 (por exemplo, Cas13a (anteriormente conhecido como C2c2), Cas13b, Cas13c e Cas13d (Yan et al. 2018)) e nucleases Argonaute guiadas por RNA (por exemplo, gRNA Argonaute de Marinitoga piezophila associado a CRISPR (Lapinaite et al. 2018), componente catalítico RISC Ago2).
[00109] Como mencionado acima para Cas9, as nucleases guiadas por RNA Cas13 ou Ago2 que têm como alvo RNA podem ser modificadas de forma similar para funcionar além da clivagem de RNA (como revelado em (Cox et al. 2017)). Veículos para dispensar gRNA(s) e RNP(s) de acordo com a invenção
[00110] Os veículos adequados para a dispensação dos referidos gRNAs e RNPs são vesículas que, de acordo com a invenção, são estruturas derivadas do citoplasma liberadas por uma célula espontaneamente e/ou após estimulação interna e/ou externa.
[00111] As vesículas liberadas de uma célula podem ser, mas não estão limitadas a: qualquer vesícula formada por membrana envolvida por um envelope lipídico natural e/ou artificialmente liberada de uma célula tendo diâmetro entre 1000 e 5 nm. Exemplos de vesículas formadas por membrana liberadas de uma célula são exossomos, vírus envelopados (por exemplo, vírus de Herpesviridae, Coronaviridae, Hepadnaviridae, Poxviridae, Retroviridae, Paramyxoviridae, Arenaviridae, Filoviridae, Bunyaviridae, Orthomyxoviridae, Togaviridae, Flaviviridae, da Hepatite D), partículas semelhantes a vírus, partículas semelhantes a vírus endógenos ou ancestrais, microssomas, endossomos, nanossomas, vacúolos, corpos multivesiculares.
[00112] De preferência, as vesículas são partículas semelhantes a exossomos ou partículas semelhantes a vírus, com um tamanho de 10-1000nm, 20-500nm, 40-400nm ou 70-300, mais de preferência um tamanho de 80-200 nm.
[00113] As vesículas de acordo com a invenção são manipuladas geneticamente para incluir o referido gRNA e nucleases associadas a gRNA.
[00114] As vesículas de acordo com a invenção contêm pelo menos uma molécula de RNA guia presente dentro das vesículas em uma quantidade de pelo menos 0,2% p/p da massa total da proteína da vesícula.
[00115] Se a vesícula de acordo com a invenção contém também a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, a pelo menos uma molécula de RNA guia é complexada com a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, em que a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma razão molar em relação à pelo menos uma nuclease guiada por RNA em uma faixa de 0,85:1 a 10:1. Sistemas de transcrição citoplasmática para acumular RNAs no citosol
[00116] De preferência, os sistemas de transcrição para a expressão direta de RNA no citoplasma são exógenos ao citoplasma da célula produtora.
[00117] Esses sistemas incluem RNA polimerases de mitocôndrias, outros organismos eucarióticos, mas também RNA polimerases virais e bacterianas, que podem ser derivadas de patógenos da célula produtora ou de microrganismos completamente não relacionados.
[00118] A RNA polimerase de escolha de acordo com a presente invenção é selecionada de: RNA polimerase de fago T7, RNA polimerase de bacteriófago SP6, RNA polimerase de bacteriófago Yersinia pestis phiA1122, RNA polimerase de bacteriófago de Pseudomonas gh-1, RNA polimerase de bacteriófago Pseudomonas putida; RNA polimerase de Bacteriófago T3, RNA polimerase de Bacteriófago T4, RNA polimerase de Roseógago SIOl, RNA polimerase de Bacteriófago phiYe03-12, RNA polimerase de bacteriófago phiKMV, RNA polimerase de bacteriófago de Enterobacteria Kl-5, RNA polimerase de Vibriófago VpV262, RNA polimerase BA14, RNA polimerase de BA127 e RNA polimerase de BA156 e variantes das mesmas.
[00119] Variantes de RNA polimerases que podem ser usadas na presente invenção podem ser identificadas usando o programa Ferramenta de Recuperação de Arquitetura de Domínios Conservados (CDART) do National Center for Biotechnology Information (Geer et al. 2002) ou por programas similares ou outros programas preditivos, que usam RNA polimerase T7 ou SP6 como sequência modelo. Exemplos de enzimas identificadas dessa maneira incluem: Bacteriófagos T ímpares ou vírus relacionados, incluindo Enterobactérias. De preferência, a RNA polimerase é selecionada de RNA polimerase de fago T7, RNA polimerase de Bacteriófago SP6, RNA polimerase de Bacteriófago T3, RNA polimerase de Bacteriófago T4 e variantes das mesmas. Mais de preferência, a RNA polimerase é selecionada de RNA polimerase de fago T7, RNA polimerase de Bacteriófago SP6 e variantes das mesmas.
[00120] Em várias aplicações, a RNA polimerase de T7 pode ser substituída por outra RNA polimerase derivada de fago (por exemplo, RNA polimerase de SP6) com algumas modificações óbvias no sistema de expressão (por exemplo, mudança de promotor e/ou sequências terminadoras).
[00121] As variantes da RNA polimerase T7 ou SP6 têm sequências de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%, de preferência 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%, de identidade com a RNA polimerase T7 ou SP6 de tipo selvagem com SEQ ID N: 40 e 42, respectivamente. A RNA polimerase T7 ou SP6 tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e 43, respectivamente.
[00122] Mutantes de fago polimerase podem ser usados de acordo com a invenção. Tais mutantes têm a capacidade de transcrever a partir de promotores modificados e de transcrever começando com diferentes nucleotídeos (por exemplo, RNA polimerase T7 iniciando a transcrição de um GA ou AA, em vez de GG ou GGG canônico como revelado em (Esvelt et al. 2011)).
[00123] De preferência, a transcrição citoplasmática artificial da invenção para a incorporação de gRNAs transcritos e RNPs de gRNA-nuclease em vesículas é realizada em uma célula eucariótica (de humano, mamífero, inseto, planta ou célula de levedura) a partir da qual tais vesículas podem ser derivadas. No entanto, a transcrição citoplasmática de acordo com a invenção pode ser alcançada também em células procarióticas e arquea. Mais de preferência, a célula eucariótica é uma célula de mamífero. Mais de preferência é uma célula de camundongo, hamster, humano ou uma célula de primata não humano.
[00124] Pode-se notar, a produção de células de vesículas de acordo com a invenção tem que tolerar a expressão do transcrito produzido pelo sistema de transcrição citosólico (por exemplo, RNA polimerase T7 ou SP6). Essa produção ectópica de transcritos pode ser tóxica e desencadear uma resposta celular antiviral (por exemplo, resposta de interferon) nas células produtoras, o que é prejudicial para a transcrição ectópica e também para transcrição e tradução endógenas nas células produtoras. De fato, a RNA polimerase
T7 ou SP6 produz transcritos de trifosfato 5’ não capeados com características não próprias (por exemplo, difosfato 5’ RNA, ssRNA, dsRNA). Tais transcritos são detectados na maioria dos tipos de células por imunidade celular inata, que induz como consequência um estado antiviral não permissivo, amortecendo adicionalmente a transcrição citoplasmática, bloqueando a tradução de várias proteínas e alterando fortemente o estado fisiológico da célula. Apenas as células deficientes em uma ou mais de suas vias antivirais podem ser usadas em combinação com a RNA polimerase de T7 ou enzimas relacionadas para acumular grandes quantidades dos transcritos de interesse no citoplasma de células de mamíferos ou eucarióticas.
[00125] Tendo em vista o acima, as células de empacotamento úteis de acordo com a presente invenção são caracterizadas por: (i) uma falta de expressão de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, MDA-5, IPS-1, RIPI, FADD, TRAF6, TRAF3, TANK, NAP, NEMO, IKKα, IKKβ, IKKε, IKKγ TBK1, DDX3, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, p65, p50, RIP1, TLR3, TLR7, TLR8, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3, Caspase-1; e/ou (ii) uma capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou (iii) uma capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’. De preferência, as células de empacotamento são caracterizadas por: (i) uma falta de expressão de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, MDA-5, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3; e/ou (ii) uma capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou (iii) uma capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’. Mais de preferência, as células de empacotamento são caracterizadas por: (i) uma falta de expressão de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3; e/ou (ii) uma capacidade celular de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou (iii) uma capacidade celular de expressar uma fosfatase 5’ para desfosforilar os transcritos de trifosfato 5’.
[00126] Este é um requisito essencial para células adequadas para serem usadas como células produtoras eficientes de vesículas contendo RNAs e RNPs produzidos por transcrição citoplasmática. É conhecida na técnica a existência de células que são defeituosas nas vias que envolvem essas proteínas e, portanto, não são, ou menos, afetadas pelo acúmulo de produtos de transcrição não autocitosólicos.
[00127] Exemplos de células deficientes em pelo menos uma das vias de detecção de RNA de vírus, como listado acima, são células BHK21, BSR-T7/5, BHK-T7 (Eaton et al. 2017) e VERO.
[00128] Essas células podem ser modificadas para expressar de forma estável ou transitória o sistema de transcrição citoplasmático (Eaton et al. 2017).
[00129] Um método reproduzível para obter células produtoras de vesículas de acordo com a invenção é transfectar células BHK21 ou VERO com plasmídeos, ou transduzir com vetores virais que codificam a RNA polimerase
T7 e opcionalmente um marcador selecionável (por exemplo, resistência à puromicina ou EGFP), de acordo com procedimentos óbvios de biologia molecular é conhecido por uma pessoa habilitada média na técnica.
[00130] Outras células comuns de mamífero, frango e inseto (por exemplo, HEK-293, HEK-293T, Hela, U2OS, iPSC, DT40, High5, Sf9) podem ser tratadas ou modificadas para serem permissivas para a transcrição citoplasmática eficiente por (i) inativação genética (por exemplo, usando nucleases direcionadas), (ii) interferência transcricional (por exemplo, siRNA e shRNA), ou (iii) inibição farmacológica (por exemplo, inibidores de interferon, inibidores de NF-κB, inibidores de IκB/IKK) das vias e proteínas mencionadas acima, conhecidas por estar envolvidas na resposta a transcritos não próprios e virais. As células de insetos apresentam várias vantagens. Em particular, eles são desprovidos de proteínas humanas indesejáveis e sua cultura não requer soro animal.
[00131] Também é possível contornar o requisito de uma célula permissiva deficiente nas vias de detecção de RNA de vírus mencionadas acima, manipulando geneticamente a célula produtora para expressar uma ou mais de enzimas de capeamento no citosol. Essas enzimas de capeamento podem ser fundidas direta ou indiretamente à RNA polimerase usada para a transcrição citosólica. Um exemplo não limitante é a fusão da RNA polimerase T7 com a Enzima de Capeamento do Vírus da Peste Suína Africana NP868R (Eaton et al. 2017). Outro exemplo não limitativo é a atividade da enzima de capeamento das enzimas do vírus vaccinia (D1 e D12 para formar a estrutura cap-0 e VP39 para formar a estrutura capa-1), que permite a transcrição do RNA citosólico pela RNA polimerase T7 em células mal permissivas na ausência de infecção por vaccinia para expressar proteínas de capeamento (Elroy-Stein & Moss 2001; Fuchs et al. 2016). Em células não permissivas (por exemplo, HEK-293), no entanto, a obtenção de níveis muito elevados de transcritos expressados de RNA polimerase T7 citosólica capeada 5’ eficientemente requer a infecção com o vírus vaccinia vivo que tem enzimas capazes de formar estruturas capa-1 no RNA expressado diretamente no citoplasma (Wei & Moss 1975).
[00132] Uma célula tolerante à transcrição citosólica também pode ser obtida através da expressão de uma fosfatase 5’ que realiza a desfosforilação dos transcritos citosólicos de trifosfato 5’. Métodos para Estimular a Formação de Vesículas
[00133] As vesículas são liberadas espontaneamente pelas células; no entanto, esse processo natural produz títulos de vesículas geralmente muito baixos para uma exploração industrial confiável.
[00134] A produção de vesículas de acordo com a invenção pode ser artificialmente intensificada para obter partículas muito mais eficientes incorporando nucleases associadas a gRNAs e RNA de acordo com a invenção.
[00135] O estímulo da célula para liberar vesículas pode ser realizado empregando indutores de vesícula selecionados de: incorporação na vesícula de pelo menos uma proteína associada à membrana, métodos físicos e/ou compostos químicos.
[00136] De acordo com uma modalidade, um aumento na formação de vesículas liberadas por células existentes ou a indução da produção de novas vesículas liberadas por células pode ser alcançado através da expressão de pelo menos uma proteína associada à membrana, em que pelo menos uma proteína associada à membrana a proteína é codificada pela segunda sequência de nucleotídeos contida no segundo cassete de expressão usado na etapa de transfecção ii) do método de produção de vesículas revelado nesse documento.
[00137] Uma lista não limitativa de pelo menos uma proteína associada à membrana codificada pelo segundo cassete de expressão inclui: proteínas celulares envolvidas na formação de vesículas (por exemplo, complexo adaptador- clatrina AP1, proteína de proteolipídeo PLP1, TSAP6, CHMP4C); proteínas estruturais virais de vírus envelopado (por exemplo, proteína do envelope de VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína do envelope BRL, glicoproteína do envelope do vírus da raiva, NA/HA/M2 de influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, gp160 de HIV; proteínas do capsídeo, proteínas do nucleocapsídeo, proteína de matriz de vírus envelopado tendo uma interação com a membrana celular; VP40 de ebola, glicoproteína de ebola, proteína retroviral Gag e/ou Gag-pol, proteína lentiviral Gag e/ou Gag-Pol); proteínas semelhantes a retrovirais endógenas ou ancestrais (proteínas Arc, proteínas env de retrotransposons TY3/ciganos); proteínas não estruturais virais (Vpu de HIV-1); proteínas artificiais (Gag mínimo (Accola et al. 2000), fusão de SADB19-VSV-G (Schoderboeck et al. 2015)); parte do domínio transmembranar de VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou seu domínio extracelular fundido com uma das proteínas do envelope listadas acima ou fragmentos de anticorpo variável de cadeia única (scFv)
derivados de domínios variáveis de imunoglobulina ou receptores de proteína ou ligantes proteicos capazes para reconhecer moléculas de superfície nas células alvo. De preferência, a pelo menos uma proteína associada à membrana é selecionada de: complexo adaptador-clatrina AP1, proteína de proteolipídeo PLP1, TSAP6, CHMP4C, proteína de envelope de VSV-G, proteína de envelope de ebola VP40, glicoproteína de ebola, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope de vírus da raiva, proteína de envelope NA/HA/M2 de influenza, proteína de envelope anfotrópico de MuLV, proteína de envelope de gp64 de baculovírus, parte do domínio transmembranar de VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou seu domínio extracelular fundido com uma das proteínas de envelope listadas acima. Mais de preferência, a pelo menos uma proteína associada à membrana é selecionada de: proteína de envelope de VSV-G, proteína de envelope de ebola VP40, glicoproteína de ebola, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, proteína de envelope NA/HA/M2 de influenza, proteína de envelope anfotrópico de MuLV, proteína do envelope de gp64 de baculovírus; ainda mais de preferência a pelo menos uma proteína associada à membrana é a proteína do envelope de VSV-G.
[00138] Adicionalmente, vários tipos de tratamentos químicos ou físicos que danificam as células podem ser usados para desencadear a liberação de vesículas extracelulares de células que podem ser usadas para empacotar nucleases guiadas por gRNAs e RNA de acordo com a invenção. Uma lista não limitativa de tais métodos físicos e/ou químicos inclui estimulação fotodinâmica (isto é, Foscan® m-THPC
(5,10,15,20-tetra(3-hidroxifenil)clorina) e estimulação luminosa similar à descrita em (Aubertin et al. 2016)), radiação ionizante, estresse térmico (Bewicke-Copley et al. 2017), alteração nas condições de cultura, concentrações de cálcio e/ou sais, doxorrubicina (Aubertin et al. 2016), cisplatina (Samuel et al. 2018). Métodos para enriquecer o carregamento de complexos de nuclease guiada por gRNA e/ou gRNA/RNA em vesículas de acordo com a invenção.
[00139] Um gRNA de acordo com a invenção pode ser mais eficientemente empacotado em vesículas liberadas por células se puder ser enriquecido localmente no citosol na proximidade da membrana plasmática ou na proximidade do(a)(s) Golgi, ER, núcleo, mitocôndria, peroxissoma, membranas de endossoma, onde vesículas liberadas pelas células são frequentemente formadas.
[00140] Uma nuclease guiada por RNA pode ser manipulada geneticamente para capturar moléculas de gRNA de acordo com a invenção e para enriquecer sua abundância relativa em um compartimento ou área subcelular citosólico(a). Na técnica, são descritos métodos para enriquecer a localização de proteínas perto de membranas celulares (ver, por exemplo, WO2015/191911). Tais métodos incluem o uso de sinais de direcionamento de membrana ou afinidade de membrana (isto é, fusão direta com um ou mais de sinais de farnesilação e/ou miristoilação, um ou mais de domínios transmembranares ou endossomo). Por exemplo, a proteína Cas9 pode ser modificada para ser direcionada a domínios transmembranares ou ao endossoma como revelado i.a. em WO2015/191911.
[00141] Se a proteína se liga a gRNAs, ela pode ser usada para aumentar o carregamento de gRNA nas vesículas. A interação entre as proteínas que têm como alvo gRNA e membrana pode ser direta ou mediada por um carreador ou fator de proteína (isto é, métodos descritos nas patentes WO2014200659A1 e PCT/EP2010/067200). Purificação e enriquecimento de vesículas
[00142] As vesículas de acordo com a invenção podem ser administradas após purificação ou através de cocultura de células produtoras com células alvo (em contato ou separadas por um tamanho seletivo excluindo membrana para permitir a passagem das vesículas). Além disso, as células produtoras de vesículas podem ser enxertadas em um organismo humano, primata não humano, camundongo, rato, peixe para liberar vesículas diretamente in vivo.
[00143] As etapas de purificação são descritas de forma não limitativa na seção de resultados. Vários protocolos publicados para o enriquecimento de vesículas e vírus liberados por células podem ser aplicados para purificação de vesículas: isto é, filtração através de filtro de poro de 0,45 ou 0,22 um, uso de etiquetas de afinidade ou proteínas presentes na superfície das vesículas (biotina- estreptavidina, Ag-mAb), centrifugação na ausência ou presença de uma almofada de sacarose (isto é, 20% de sacarose, 10% de sacarose, 5% de sacarose), um gradiente de sacarose (5-60%, 10-60%, 20-60%), uso de polímeros de polietileno glicol (PEG-4000, PEG6000). Direcionamento de célula e Propriedades de fusão
[00144] O direcionamento de células e/ou a fusão de vesículas de acordo com a invenção pode ser obtido(a) incorporando dentro das vesículas, pelo menos, uma proteína associada à membrana, como discutido acima na seção “Métodos para estimular a formação de vesículas”.
[00145] Para aumentar o direcionamento celular e/ou as propriedades de fusão das vesículas (isto é, tropismo de vesículas e propriedades de fusão celular), as vesículas podem conter pelo menos uma outra proteína associada à membrana. Tal pelo menos uma outra proteína associada à membrana é expressada através de um outro cassete de expressão usado na etapa de transfecção ii) do método de produção de vesículas revelado nesse documento. O cassete de expressão adicional contém uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica a pelo menos uma proteína associada à membrana adicional, desde que tal pelo menos uma proteína associada à membrana seja diferente de pelo menos uma proteína associada à membrana codificada pela segunda sequência de nucleotídeos contida no segundo cassete de expressão.
[00146] A pelo menos uma outra proteína associada à membrana é selecionada de: Gp160 de HIV, Gp120 de HIV, VSV- G, envelope de ALV, glicoproteína de ebola, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, NA/HA/M2 de influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus. Proteínas associadas à membrana adicionais adequadas para direcionar a vesícula às células alvo pretendidas são receptores e/ou ligantes de membrana (por exemplo, TCR-alfa, CD4, MHC-I, MHC-II), domínios variáveis de anticorpos e/ou anticorpos de comprimento total que reconhecem moléculas de superfície em células alvo direta ou indiretamente ligadas à membrana celular (isto é, anticorpos monoespecíficos e biespecíficos, SIP, minicorpos,
nanocorpos, anticorpos de cadeia pesada, anticorpos de domínio único). De preferência, a pelo menos uma outra proteína associada à membrana é selecionada de: Gp160 de HIV, Gp120 de HIV, VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína de ebola, glicoproteína de envelope BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, NA/HA/M2 de influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, TCR-alfa, CD4, MHC-I, MHC-II.
[00147] A atividade de brotamento, direcionamento e fusão das vesículas de acordo com a invenção pode resultar da atividade de uma proteína única (isto é, VSV-G) ou de múltiplas proteínas diferentes (isto é, simulando vírus e vetores pseudotipados naturais ou artificiais).
[00148] As vesículas de acordo com a invenção podem ter como alvo virtualmente qualquer célula onde RNPs de nuclease guiada por RNA e/ou gRNA dispensada pode ter um efeito biológico. De preferência, esse efeito envolve a ligação e/ou clivagem de um ácido nucleico presente na célula alvo. Modalidade preferida
[00149] A seguir, é fornecida uma discussão sobre uma modalidade preferida da presente descrição, em que as vesículas (denominadas VEsiCas) são capazes de dispensar componentes CRISPR-Cas empregando como proteína associada à membrana que constitui o envelope da vesícula, a proteína VSV-G. Esses dados não são limitativos no que se refere ao escopo real da presente invenção, como reivindicado no conjunto pendente de reivindicações.
[00150] Verificou-se que as vesículas incorporando a proteína de VSV-G, em combinação com SpCas9, estavam suficientemente carregadas com a proteína SpCas9. No entanto, vesículas produzidas sob condições experimentais padrão usando transcrição baseada em U6 nuclear para a síntese de sgRNA mostraram atividade de edição de genoma pobre, sugerindo quantidades não suficientes de sgRNA incorporado. Essa limitação foi contornada favorecendo a montagem da proteína SpCas9 com o sgRNA na produção de células por meio da síntese citoplasmática de sgRNA conduzida pela RNA polimerase T7. Para essa finalidade, os presentes inventores empregaram células resistentes à citotoxicidade induzida por altos níveis de RNA citoplasmático de trifosfato 5’ não capeado, BSR-T7/5 (Habjan et al. 2008). Essa linha de célula é deficiente para a via RIG-I de detecção de RNA, levando à ativação do interferon, e é transfectada de forma estável para expressar a RNA polimerase T7.
[00151] Uma vantagem notável oferecida pela abordagem VEsiCas é a natureza transitória da SpCas9 dispensada. Como demonstrado nesse estudo, a depuração rápida de SpCas9, que diminuiu logo 12 horas após o tratamento com VEsiCas, reduziu fortemente a atividade fora do alvo associada à edição do genoma, em oposição a altos níveis de clivagens não específicas geradas por SpCas9 transfectada com plasmídeo. Os dados presentes também provam que VEsiCas são mais eficientes na dispensação de complexos Cas9 RNP do que eletroporação. Na verdade, o presente sistema requer menos proteína SpCas9, oferecendo assim uma vantagem clara na prevenção de potenciais efeitos adversos de respostas imunes contra as células editadas (Chew et al. 2016). Finalmente, VEsiCas pode ser prontamente adaptada a abordagens de edição de genoma mais complexas, como o uso de cas9 nickase, exigindo a incorporação de pares de sgRNAs (Komor et al.
2017).
[00152] No geral, a dispensação eficiente e sem traço de CRISPR-Cas9 por meio da abordagem de VEsiCas representa um avanço adicional em direção à edição do genoma in vivo mais segura.
RESULTADOS Projeto e desenvolvimento de Vesículas de SpCas9-sgRNA com envelope de VSV-G, VEsiCas
[00153] Foi relatado que vesículas induzidas por VSV-G mediam a transferência de proteínas na ausência de componentes virais adicionais (Mangeot et al. 2011). Testamos se as vesículas VSV-G poderiam ser adaptadas para dispensação livre de DNA de SpCas9 e sgRNA. SpCas9 e sgRNA para a sequência de codificação de EGFP (sgEGFP5) foram expressados juntamente com VSV-G em células HEK293T e o meio clarificado condicionado derivado foi aplicado em uma linha de célula repórter fluorescente, HEK293-EGFP. A expressão de EGFP foi mal alterada nessas condições, indicando edição do genoma ineficiente, enquanto a edição eficiente foi observada pela transfecção de SpCas9 juntamente com o sgRNA (Fig. 1a). A atividade de edição limitada não foi explicada pela falta de proteína dispensada, uma vez que ambas as vesículas e células alvo foram positivas para SpCas9 (Fig. 2a). Esses resultados nos levaram a avaliar se o fator limitante para a atividade das vesículas poderia ser a quantidade insuficiente de sgRNA incorporado. Para esse objetivo, as células alvo HEK293-EGFP foram transfectadas com plasmídeos que expressam sgEGFP5 antes do tratamento com vesículas VSV-G contendo SpCas9. Nessas condições experimentais, obtivemos níveis de edição mais próximos dos observados nas células transfectadas com SpCas9 e sgRNA (Fig. 1a, comparar a sexta e a segunda coluna do gráfico). Esses resultados sugerem claramente que a edição limitada observada com as preparações de SpCas9/VSV-G foi devido à dispensação ineficiente do sgRNA.
Especulamos que a dispensação pobre de sgRNA poderia ser devido à formação ineficiente de complexos de RNP de SpCas9-sgRNA durante a produção de vesículas.
Em particular, os sgRNAs sintetizados com Pol III nos núcleos podem ter se acoplado fracamente com SpCas9 citoplasmático para formar RNPs na periferia da célula, perto das vesículas VSV-G nascentes.
Para testar essa hipótese, empregamos um sistema de transcrição conduzido por RNA polimerase T7 (Buchholz et al. 1999; Habjan et al. 2008) que catalisa a síntese de RNA no citoplasma (esquematizado na Fig. 1b). Os sgRNAs foram clonados a jusante do promotor T7 e a ribozima de HDV 5’ foi introduzida entre a sequência de codificação de sgRNA e o terminador da RNA polimerase T7 para induzir a formação de sgRNAs maduros com regiões constantes 3’ não modificadas (Nissim et al. 2014). As vesículas SpCas9 envelopadas com VSV-G foram produzidas em linhas de células que expressam de forma estável a RNA polimerase T7 e resistentes à toxicidade induzida por altos níveis de RNA citoplasmático de trifosfato 5’ não capeado, gerado por esse sistema de transcrição (Habjan et al. 2008; D.-H.
Kim et al. 2004; Pichlmair et al. 2006) (Fig. 2b). As Vesículas SpCas9 Envelopadas em VSV-G derivadas, VEsiCas, produzidas em células BSR-T7/5 que expressam sgEGFP5, foram verificadas quanto à incorporação de SpCas9 (Fig.2c). Essas VEsiCas induziram pelo menos 50% de perda de fluorescência de EGFP em células HEK293-EGFP,
portanto, muito similares às inativações observadas com tratamentos com vesículas VSV-G/SpCas9 de células pré- transfectadas com sgEGFP5 (Fig. 1c). VEsiCas foram então testadas em relação a dois loci genômicos, CXCR4 e o VEGFA, comumente usados como referência em experimentos de edição de genoma envolvendo Cas9, gerando indels em ambos os loci (Fig. 1d,e).
[00154] A pseudotransdução de SpCas9 também foi testada usando partículas semelhantes a vírus de base lentiviral (lenti-VLPs). Foi relatado que o domínio Gag do HIV-1 ou uma porção reduzida dele (MinimalGag) gera partículas semelhantes a vírus (VLP), descritas para transferir eficientemente cargas de proteína para células receptoras (Accola et al. 2000). SpCas9 fundido com Gag ou MinimalGag foi funcionalmente ativo na atividade de edição do genoma contra o locus EGFP (Fig. 3a-c). As duas quimeras de SpCas9 foram usadas para produzir VLPs baseadas em lentivírus (lenti-VLPs) em células BSR-T7/5, que produziram altas porcentagens de indels nos loci EGFP, CXCR4 e VEGFA (Fig. 3d-g). No entanto, uma vez que nenhuma melhoria dramática na edição do genoma foi obtida com lenti-VLPs, as VEsiCas transportando exclusivamente o elemento viral VSV-G foram usadas a seguir.
[00155] No geral, nossos dados mostraram claramente que as VEsiCas dispensam RNPs de SpCas9-sgRNA de maneira eficiente, livres de DNA codificador ou elementos adicionais de origem viral. Um fator chave para a obtenção de partículas de edição de genoma altamente eficientes foi a relocação da expressão de sgRNA do núcleo para o citoplasma das células produtoras, que foi obtida em células permissivas apropriadas por meio de uma RNA polimerase T7 citoplasmática. VEsiCas multiplexadas
[00156] Como as aplicações de edição de genoma, como exclusões genômicas direcionadas, podem exigir a dispensação simultânea de mais de um sgRNA, avaliamos a possibilidade de incorporar vários guias em VEsiCas (Multi-VEsiCas). Multi- VEsiCas foram produzidas em células BSR-T7/5 que expressam dois sgRNAs direcionados a EGFP dirigidos por T7 (sgEGFP5 e sgEGFPBi). A incubação de células repórteres HEK293-EGFP com Multi-VEsiCas portando ambos os sgRNAs direcionados gerou a eliminação esperada no locus de EGFP com eficiência de ~17%, que foi similar à obtida com a transfecção transitória de plasmídeos que codificam SpCas9 e os sgRNAs correspondentes (~14 %) (Fig. 4a). Por outro lado, VEsiCas portando cada sgRNA individual (sgEGFP5 ou sgEGFPBi) não foram capazes de produzir qualquer eliminação detectável no locus alvo (Fig. 4a). A flexibilidade da plataforma de dispensação de VEsiCas foi ainda demonstrada pela incorporação da SpCas9 nickase (SpCas9-n, mutante D10A) (Ran et al. 2013) para gerar VEsiCas-n portando dois guias posicionados de maneira próxima visando a sequência de codificação de EGFP. VEsiCas- n foram preparadas com sgRNAs individuais (sgEGFPBi ou sgEGFP3gW) ou com os sgRNAs em combinação (sgEGFPBi e sgEGFP3gW). O tratamento de células HEK293-EGFP com VEsiCas- n portando ambos os sgRNAs produziu uma redução robusta no número de células fluorescentes (50%), enquanto VEsiCas-n dispensando sgRNAs individuais não regulou negativamente a expressão de EGFP, como esperado (Fig. 4b). Esses dados indicam que mais de um sgRNA pode ser dispensado simultaneamente por VEsiCas, demonstrando assim sua aplicabilidade para gerar eliminações e para dispensar a SpCas9 nickase. Eficiência de edição de VEsiCas em células e in vivo
[00157] Quantidades crescentes de VEsiCas resultaram em um aumento proporcional na atividade de edição (Fig. 5). Além disso, a comparação lado a lado com protocolos de eletroporação, que muitas vezes são usados para dispensar Cas9 em células para edição de genoma, revelou que VEsiCas são mais eficientes. Na verdade, em comparação com a eletroporação, uma quantidade menor de SpCas9 dispensado via VEsiCas foi necessária para obter percentagens similares de células de inativação de EGFP (Fig. 5). A eficácia de VEsiCas foi testada em diferentes linhas de células, incluindo células aderentes (HeLa), células em suspensão (J-Lat-A1) e em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) expressando EGFP, mostrando uma redução robusta no número de células fluorescentes em todos os modelos testados (Fig. 6 e Fig. 7a). Finalmente, VEsiCas foram testadas no músculo cardíaco de camundongos transgênicos com EGFP. VEsiCas foram injetadas no coração de camundongos com 5 dias de idade, os quais foram analisados quanto aos níveis de fluorescência de EGFP 10 dias após o tratamento. O tecido cardíaco dos animais tratados foi corado com anticorpos contra α-actinina para avaliar especificamente a fluorescência de EGFP em cardiomiócitos. Como mostrado na Fig. 7b, grandes áreas de cardiomiócitos não fluorescentes podem ser observadas perto do sítio de injeção de VEsiCas (cerca de 30% das células EGFP-negativas).
[00158] Esses dados mostram que VEsiCas são ferramentas eficientes para dispensar RNPs de SpCas9 para edição de genoma em células de cultura, bem como in vivo. Atividade limitada fora do alvo por SpCas9 dispensado através de VEsiCas
[00159] A atividade fora do alvo produzida pelo Cas9 ainda é uma das principais limitações para seu uso terapêutico. A expressão transitória da nuclease em células alvo mostrou limitar clivagens não específicas (Petris et al. 2017; S. Kim et al. 2014). Para abordar esse ponto, a cinética dos níveis intracelulares de SpCas9, dispensado através de VEsiCas em comparação com as quantidades de nuclease expressadas pelo plasmídeo transfectado, foi examinada. SpCas9 de VEsiCas foi detectado em células alvo 6 horas após a transdução e desapareceu gradualmente nas 18 horas seguintes (Fig. 8a). Por outro lado, os níveis intracelulares de nuclease produzidos por um plasmídeo de expressão foram claramente detectados 12 horas após a transfecção e cada vez mais acumulados depois disso (Fig. 8a). Para avaliar a extensão da atividade fora do alvo gerada por SpCas9 dispensado através de VEsiCas ou por transfecção, a formação de indels foi medida em dois sítios fora do alvo previamente validados associados à edição do locus de VEGFA (VEGFA OT1 e OT3) (Petris et al. 2017). O Rastreamento de Indels por DEcomposição (TIDE) (Brinkman et al. 2014) revelou que SpCas9 dispensado através de VEsiCas produziu níveis mais elevados de atividade no alvo do que SpCas9 transfectado, enquanto causou níveis de referência de indels em ambos os sítios fora do alvo (Fig. 8b). Surpreendentemente, VEsiCas produziram pelo menos 17 e 22 vezes menos indels nos OT1 e OT3, respectivamente, em relação à clivagem no alvo, enquanto SpCas9 transfectado clivou OT1 de forma similar ao sítio no alvo, e OT3 foi editado apenas 5 vezes menos do que o alvo pretendido. Uma análise mais profunda fora do alvo no locus de VEGFA foi realizada por meio de GUIDE-seq (Tsai et al. 2014), uma abordagem ampla do genoma (Fig. 8c). A análise revelou que exclusivamente um sítio fora do alvo com centenas de leituras de GUIDE-seq a menos do que o no alvo pode ser encontrado em células transduzidas de VEsiCas (355 leituras no alvo e 11 leituras fora do alvo). Em contraste, SpCas9 expressado a partir de um plasmídeo transfectado clivado com eficiência similar a esse sítio no alvo e fora do alvo associado (253 leituras de GUIDE-seq no alvo e 291 fora do alvo). Além disso, SpCas9 expressado a partir de um plasmídeo transfectado gerou quatro sítios fora do alvo adicionais caracterizados por um maior número de leituras GUIDE-seq (de 417 a 1026) do que aqueles obtidos com o no alvo.
[00160] Em conclusão, a análise fora do alvo realizada no locus de VEGFA, um padrão-ouro para avaliação da especificidade de SpCas9, revelou que as VEsiCas produziram uma modificação genômica mais específica, que se correlaciona com a rápida depuração da nuclease das células alvo. Ativadores de VEsiCas de expressão gênica.
[00161] A regulação sem traço da expressão gênica pode ser desejável para vários objetivos, desde a pesquisa básica in vitro até o tratamento de doenças in vivo. Várias fusões diferentes de nucleases guiadas por RNA, em particular SpCas9 morto (dSpCas9), com ativadores, repressores ou modificadores de cromatina transcricionais (por exemplo, VP64, VPR, KRAB, p300) foram empregados para controlar artificialmente a expressão gênica (Vora et al. 2016; Y. Gao et al. 2016). Para demonstrar a viabilidade da inclusão de tais tecnologias em VEsiCas, as partículas foram purificadas a partir de sobrenadantes de células BSR-T7/5 transfectadas com plasmídeo que expressa o ativador transcricional dSpCas9-VP64 e sgRNAs. Antes da transdução com ativador de VEsiCas, as células alvo foram transfectadas com um plasmídeo modelo que codifica o gene de EGFP sob o controle de um promotor de CMV mínimo, que expressa EGFP apenas se fatores de transcrição adicionais ligarem o promotor de sequências próximas. Como mostrado na Fig. 9, ativador de VEsiCas contendo dSpCas9-VP64 e sgRNAs direcionados próximo à sequência do promotor (sgTetO) regulou positivamente a expressão de EGFP a partir do modelo repórter em 7% das células, enquanto nenhuma célula EGFP positiva foi observada após o tratamento com ativadores de VEsiCas não direcionados (sgCtr). Esses dados indicam claramente a possibilidade de dispensação por VEsiCas de RNPs formados por proteínas de fusão dSpCas9 e sgRNAs para fins de regulação gênica. Dispensação de RNA por VEsiCas.
[00162] O RNA altamente expressado no citoplasma pela RNA polimerase T7 deve ser capaz de empacotar em VEsiCas. Na verdade, a presença de uma molécula Cas9 não era necessária para a dispensação de sgRNA por VEsiCas. Na Fig. 10, as células alvo EGFP positivas foram pré-transfectadas com o plasmídeo SpCas9 e subsequentemente transduzidas com VEsiCas coletadas de células produtoras que expressam sgRNA, mas não SpCas9. Como esperado, as células transfectadas com SpCas9 se transduzidas com sgRNA de direcionamento (sgEGFPBi)
tiveram um aumento robusto no número de células EGFP negativas (18%) devido à edição do genoma, enquanto níveis próximos de referência de células não fluorescentes (4%) foram observados em amostras tratadas com controle (sgCtr). Esses dados indicam que RNAs, e em particular sgRNA, podem ser empacotados e dispensados por VEsiCas independentemente pela presença de SpCas9 e têm a atividade desejada nas células alvo. Atividade de Edição de VEsiCas Incorporando Spcas9 Miristilado
[00163] Para aumentar ainda mais a incorporação de nuclease por VEsiCas, avaliamos a possibilidade de induzir a ligação de SpCas9 à membrana plasmática por meio da miristilação da proteína. Para esse objetivo, fundimos o sinal de miristilação da matriz de HIV-1 (Lee e Linial, J. Virol. Outubro de 1994; 68 (10): 6644-6654; Uniprot KB ID P04591) com o terminal N de SpCas9 e utilizamos essa construção para produzir VEsiCas (myr-VEsiCas). Em seguida, medimos a eficiência de edição visando o locus de EGFP em HEK293-GFP, obtendo 27,6% de células EGFP negativas (Fig. 11). Esses dados demonstram que SpCas9 fundido com um sinal de miristilação N-terminal é cataliticamente ativo, está corretamente incorporado em VEsiCas e é capaz de induzir modificações genômicas na célula alvo.
MATERIAIS E MÉTODOS
[00164] Plasmídeos e oligonucleotídeos. Os plasmídeos de expressão de sgRNAs pUC19 que transcrevem sgRNA do promotor U6 e usados para os experimentos iniciais na produção de vesículas VSV-G foram publicados anteriormente (Petris et al. 2017). O Gag-SpCas9 (SEQ ID NO: 47) foi obtido através da fusão da sequência de codificação Gag com 3XFLAG-SpCas9 codificado pelo plasmídeo pX-SpCas9 publicado anteriormente (Petris et al. 2017). dSpCas9-VP64 foi expressado a partir do pcDNA-dSpCas9-VP64 publicado anteriormente (Perez-Pinera et al. 2013). pTRE-EGFP foi obtido por clonagem de um fragmento NotI e EcoRI de pEGFP-N1 (Clontech) em pTRE-tight (Clontech).
[00165] MinimalGag-SpCas9 (SEQ ID NO: 48) foi montado em pCDNA3 subclonando a sequência de codificação de SpCas9 de pX-SpCas9 e MinimalGag a partir do plasmídeo publicado anteriormente Δ-Zwt-p2b (Accola et al. 2000). Posteriormente, uma versão adicional de ambos os construtos foi obtida por remoção através de mutagênese direcionada de uma metionina (na posição 517 da SEQ ID NO.: 49 e na posição 164 da SEQ ID NO: 50) no peptídeo ligante derivado de pX-Cas9 que leva à produção de SpCas9 não fundido (Fig. 3).
[00166] Para a produção de VLPs e VEsiCas em células BSR- T7/5, os sgRNAs foram transcritos de um plasmídeo de expressão de pVAX-T7-sgRNA tendo um cassete acionado pelo promotor T7, clonado no plasmídeo pVAX (Thermo Fisher Scientific) usando os sítios NdeI e XbaI. SEQ ID NO: 51 descreve a unidade de transcrição inserida no plasmídeo pVAX usando os sítios NdeI e XbaI para obter o plasmídeo pVAX-T7- sgRNA. Os oligos de sgRNA foram clonados em pVAX-T7-sgRNA usando um sítio duplo BsmBI inserido antes da porção constante de sgRNA (a lista de oligonucleotídeos usados para clonar sgRNAs é fornecida na Tabela 1). Tabela 1. Sequências de oligonucleotídeos usados para construir plasmídeos de expressão de pVAX-T7-sgRNA e sequências de sítios alvo relativos sgRNA oligo 1 (*) Oligo 2 (*) sítio alvo (**) tataGGAAGTT aaacGGGTGTC CGAGGGCGACA GCCCTCGAACT ggtGAAGTTCGAGGGCG EGFP5 CCC TCCCC ACACCCTGGtga SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 13 1 2 tataGGGCACG aaacCCGGCAA GGCAGCTTGCC GCTGCCCGTGC ccaCCGGCAAGCTGCCC
EGFPB GG CCCC GTGCCCTGGccc i SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 14 3 4 tataGGGCTCG aaacTAGGTCA TGACCACCCTG GGGTGGTCACG accCTCGTGACCACCCT EGFP3 ACCTA AGCCCCC GACCTACGGcgt gW SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 15 5 6 tataGGTGGGC aaacCGGGGAA ACCGGCTTCCC GCCGGTGCCCA ggtGGTGGGCACCGGCT GFPI2 CG CCCC TCCCCGAGGaca SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 16 7 8 tataGGTGAGT aaacCACGCAC VEGFA GAGTGTGTGCG ACACTCACTCA gtgGGTGAGTGAGTGTG sítio TG CC TGCGTGTGGggt 3 SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 17 9 10 gtgAGTGAGTGAGTGTG
VEGFA -- -- TGTGTGGGGggg OT1 SEQ ID NO.: 18 atgTGTGGGTGAGTGTG
VEGFA -- -- TGCGTGAGGaca OT3 SEQ ID NO.: 19 sgRNA oligo 1 (*) Oligo 2 (*) sítio alvo (**) tataGGAAGCG aaacCCTCTTT TGATGACAAAG GTCATCACGCT aagGGAAGCGTGATGAC CXCR4 AGG TCCCC AAAGAGGagg SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 20 11 12 tataGGTACGT aaacTATCAGT TCTCTATCACT GATAGAGAACG acaTACGTTCTCTATCA TetO GATA TACC CTGATAGGGagt SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 37 35 36 tataGGAGACG aaacAGAGACG
GATTGACGTCT TCAATCCGTCT Ctr CT CC -- SEQ ID NO.: SEQ ID NO.: 38 39 (*) As letras minúsculas indicam extremidades coesivas usadas para clonagem no plasmídeo pVAX-T7-sgRNA. (**) Não correspondências e PAM estão em negrito. A sequência de contexto em torno dos sítios alvo está em letras minúsculas.
[00167] pVAX-T7-sgRNA incluiu uma ribozima de HDV 5’ (nucleotídeos 132 a 219 da SEQ ID NO: 51) (Nissim et al. 2014) projetado para clivar a extremidade 3’ do sgRNA contendo o terminador T7 (nucleotídeos 266 a 364 da SEQ ID NO: 51) e a própria ribozima. A construção de Cas9-Nickase foi obtida inserindo a mutação D10A na sequência de codificação de SpCas9 (UniProtKB ID Q99ZW2). A sequência de codificação da RNA polimerase T7 (SEQ ID NO: 40) foi amplificada usando os iniciadores diretos - HindIII T7 (SEQ ID NO: 21) e reversos - XbaI T7 (SEQ ID NO: 22), a partir do genoma de Células BSR-T7/5 e clonada no lugar de EGFP no plasmídeo pEGFP-N1 (Life technologies) usando os sítios HindIII/XbaI para obter o plasmídeo pKANA-T7-RNA-Pol. Os plasmídeos foram verificados por sequenciação de Sanger.
[00168] Culturas e transfecção de células. Células produtoras derivadas de BHK21 que expressam estavelmente a polimerase T7 (BSR-T7/5) como revelado em (Buchholz et al. 1999). Para selecionar células que retêm a construção de RNA polimerase T7, a cada duas passagens o meio foi suplementado com 1 µg/mL de G418 (tecnologias Gibco-Life). As células HEK293T foram obtidas na ATCC. As células HEK293-EGFP foram geradas por transfecção estável do plasmídeo pEGFP-IRES- Puromicina (Petris et al. 2017) e selecionadas com 1 µg/ml de puromicina. BHK-21 (ATCC CCL-10), Vero (ATCC-CCL-81), HeLa (ATCC-CCL-2) e todas as linhas de células descritas acima foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% termoinativado, L-glutamina 2 mM, 10 U/ml de penicilina e 10 μg/ml de estreptomicina. J-Lat-A1 são células Jurkat (Jordan et al. 2003) que foram transduzidas de forma latente por um vetor de HIV-1 que codifica EGFP. J-Lat-A1 foram cultivados em meio RPMI, suplementado com FBS a 10% e antibióticos Pen/estrep. A expressão de EGFP foi induzida com tratamento com TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) 10 nM por 24 horas. Para obter HeLa-EGFP, células HeLa foram transfectadas com o plasmídeo pEGFP-C1 (Clontech) usando o reagente de transfecção FuGENE HD (Promega). Após a seleção em meio de cultura com 400 μg/mL de G418 (Life Technologies) por aproximadamente 10 dias, as células que expressam altos níveis de EGFP foram enriquecidas por classificação FACS e propagadas como uma população de células policlonais. Culturas de carga de células HeLa-EGFP (~95% de células EGFP positivas) foram mantidas em meio de cultura suplementado com 200μg/mL de G418. As iPSCs humanas transgênicas que expressam constitutivamente GFP foram derivadas de uma linha comercial de iPSC Epissomal humana (Gibco, Thermo Fisher Scientific), originalmente derivada do sangue do cordão umbilical CD34+ usando um sistema epissomal baseado em EBNA. Os clones de iPSC humanos que expressam de forma estável copGFP sob controle do promotor de citomegalovírus ubíquo foram gerados por infecção com o vetor lentiviral pGZ-CMV- copGFP (System Biosciences). A seleção de clones à base de zeocina foi iniciada 72 horas após a infecção por 7 dias. Colônias resistentes foram colhidas manualmente, expandidas clonalmente e caracterizadas por sua competência de pluripotência. Linhas de iPSC humanas foram cultivadas em placas revestidas com Geltrex sem alimentador, cultivadas em meio StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotech). Todas as linhas de células foram verificadas como livres de Mycoplasma (PlasmoTest, Invivogen).
[00169] Os experimentos de transfecção foram realizados em placas de múltiplos poços de 12-24 com 250-1000 ng de cada plasmídeo usando o reagente TransIT-LT1 (Mirus), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram coletadas 2-4 dias após a transfecção ou conforme descrito. Produção de vesículas VSV-G/SpCas9, lenti-VLPs e VEsiCas.
[00170] Para a produção de vesículas VSV-G/Cas9, uma placa confluente de 100 mm de células HEK293T foi transfectada com 15 µg de pxCas9, Gag-SpCas9 ou pCDNA3- MinGag-SpCas9, 15 µg do pUC-U6-sgRNA desejado e 3 µg de plasmídeos de VSV-G usando o método de polietilenimina (PEI) (Casini et al. 2015). As produções subsequentes foram realizadas em células BSR-T7/5 usando as condições relatadas acima, exceto para o plasmídeo pVAX-T7-sgRNA que substituiu pUC-U6-sgRNA para a expressão guia de RNA.
Para Multi-VEsiCas durante os experimentos de eliminação, 7,5 µg de cada pVAX- T7-sgRNA (sgEGFP5 e sgEGFPBi) direcionando EGFP foram usados.
Para a produção de VEsiCas-n, 15 µg de plasmídeo Cas9-Nickase e 7,5 µg de cada pVAX-T7-sgEGFPBi e pVAX-T7- sgEGFP3gW foram usados.
Para reguladores de transcrição de VEsiCas, as células BSR-T7/5 foram transfectadas com 15 µg de pcDNA-dSpCas9-VP64 e 15 µg de plasmídeo pVAX-T7 direcionado a controle (sgCtr) ou a promotor (sgTetO) que expressa sgRNAs.
Para VEsiCas que dispensam moléculas de RNA sem células SpCas9, foram transfectadas apenas com 15 µg de plasmídeo pVAX que expressa o sgRNA indicado.
Após 12 horas de incubação, o meio foi substituído por DMEM completo fresco e 48 horas depois o sobrenadante foi coletado, centrifugado a 400xg por 5 minutos e filtrado através de um filtro PES de 0,22 μm.
VLPs e VEsiCas foram então concentradas e purificadas através de uma almofada de sacarose a 20% por ultracentrifugação por 2 horas a 150000xg (4 °C) e recolocados em suspensão em volumes adequados de meio completo (meio DMEM, RPMI ou StemMACS iPS-Brew XF, de acordo com as células alvo) ou 1x PBS para injeções em camundongos e armazenados a -80 °C.
A quantidade de quimeras SpCas9 ou Gag-SpCas9 e MinGag-SpCas9 produzida nas vesículas VSV-G foi avaliada por meio de análise de Western blot usando SpCas9 purificado como padrão.
A menos que indicado, para cada experiência de transdução única foram usadas vesículas contendo cerca de 1 µg de SpCas9. A proteína SpCas9 recombinante de referência foi produzida em bactérias (ver abaixo) de acordo com (Gagnon et al. 2014) e quantificada por meio de coloração com Coomassie. A eficiência de incorporação de SpCas9 em VEsiCas foi obtida pelo cálculo da quantidade de SpCas9 incorporada medida por Western blot usando uma proteína recombinante de concentração conhecida como padrão sobre a quantidade total de proteínas na preparação de VEsiCas quantificada por ensaio de Bradford (Bio-Rad). A eficiência da incorporação de gRNA foi avaliada por procedimentos qRT-PCR padrão usando o iniciador direto 5’-TAAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’ (SEQ ID No. 52) (gRNA para) e o iniciador reverso 5’- GACTCGGTGCCACTTTTTCA-3’ (SEQ ID No. 53) (gRNA rev) para o andaime de sgRNA otimizado e o iniciador direto 5’- AGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’ (SEQ ID No. 54) (gRNAopt para) e o iniciador reverso 5'- GACTCGGTGCCACTTTTTCA-3' (SEQ ID No. 55) (gRNAopt rev) para o andaime de sgRNA padrão (Zhang et al. 2016). Observe que o iniciador reverso é comum para ambas as configurações de sgRNA.
[00171] Dispensação em células alvo. No dia anterior à transdução, 1X105 de HEK293T, HEK293-EGFP, HeLa-EGFP ou J- LAT-A1 foram semeados em uma placa de 24 poços. VEsiCas e VLPs foram dispensadas em células alvo por espinoculação por 2 horas a 1600xg a 20 °C (30 min a 1000xg e 24 °C para iPSCs humanas), seguido por uma incubação durante a noite a 37 °C. As células J-Lat-A1 foram induzidas por TPA (Sigma-Aldrich) e analisadas para edição do genoma três dias após a última transdução ou para redução de EGFP pelo menos sete dias após o tratamento. Para os loci de VEGFA e CXCR4, foram realizados experimentos de tripla transdução. As células foram tripsinizadas 24 horas após cada transdução; 2/3 das células foram coletadas para análise genômica e 1/3 foi subcultivado para os tratamentos seguintes, um a cada 48 horas. As células foram coletadas para análise final três dias após o último tratamento.
[00172] Eletroporação de SpCas9-sgRNA. A proteína SpCas9 recombinante (UniProtKB ID Q99ZW2) foi produzida em bactérias de acordo com (Gagnon et al. 2014). Resumidamente, o plasmídeo pET-28b-Cas9-His (Addgene # 47327) foi usado para expressar SpCas9 em células de E. coli Rosetta (Novagen), que foram cultivadas por 12 horas a 37 °C, seguido por 24 horas de indução a 18 °C. A purificação foi realizada em resina etiqueta-his (G-Biosciences), a coluna foi lavada com Tris 20 mM pH 8, Imidazol 30 mM, NaCl 500 mM e eluída com Tris 20 mM pH 8, Imidazol 500 mM, NaCl 500 mM. Após diálise em Tris 20 mM, KCl 200 mM, alíquotas de uso único de MgCl2 10 mM foram armazenadas a -80 °C. Para produzir sgRNAs transcritos in vitro, primeiro amplificamos por PCR o pVAX- T7-sgEGFPBi e pVAX-T7-sgCtr com os iniciadores promotor T7 direto e final gRNA rev (Tabela 2). Tabela 2. Sequências dos oligonucleotídeos usados para amplificações de PCR. oligo sequência T7 direto - ACTAAGCTTGTCGACCATGAACACGATTAACATCG HindIII SEQ ID NO.: 21
TAATCTAGATTACGCGAACGCGAAGTC T7 reverso - XbaI SEQ ID NO.: 22 Promotor T7 GAAATTAATACGACTCACTATAGG direto SEQ ID NO.: 23 Final gRNA AAGCACCGACTCGGTGCCA reverso SEQ ID NO.: 24 oligo sequência
ACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA EGFP direto SEQ ID NO.: 25
AGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATC EGFP reverso SEQ ID NO.: 26 VEGFA sítio 3 ON GCATACGTGGGCTCCAACAGGT direto SEQ ID NO.: 27 VEGFA sítio 3 ON CCGCAATGAAGGGGAAGCTCGA reverso SEQ ID NO.: 28 VEGFA sítio 3 OT1 CAGGCGCCTTGGGCTCCGTCA direto SEQ ID NO.: 29 VEGFA sítio 3 OT1 CCCCAGGATCCGCGGGTCAC reverso SEQ ID NO.: 30 VEGFA sítio 3 OT3 AGTCAGCCCTCTGTATCCCTGGA direto SEQ ID NO.: 31 VEGFA sítio 3 OT3 GAGATATCTGCACCCTCATGTTCAC reverso SEQ ID NO.: 32
AGAGGAGTTAGCCAAGATGTGACTTTGAAACC CXCR4 direto SEQ ID NO.: 33
GGACAGGATGACAATACCAGGCAGGATAAGGCC CXCR4 reverso SEQ ID NO.: 34
[00173] Esse produto de PCR, contendo o promotor T7 e a sequência completa do sgRNA, foi usado para transcrição in vitro usando Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento HiScribe T7 (New England Biolabs) seguindo as instruções do fabricante. Os sgRNAs purificados por TRIzol (Invitrogen), precipitados com isopropanol e lavados com etanol a 75%, foram analisados por eletroforese em gel de acrilamida e quantificados usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).
[00174] Os sgRNAs purificados foram misturados com SpCas9 recombinante imediatamente antes da eletroporação, incubando
12,4 μg de SpCas9 com 3,1 μg de sgRNA (ou como indicado com uma razão em massa de 4:1 entre proteína e RNA) em Hepes 20 mM (pH 7,5), KCl 150 mM, MgCl2 1 mM, glicerol a 10% (vol/vol) e DTT a 1 mM a 37 °C por 10 min. Células 2,5 X 105 de HEK293- EGFP foram nucleofetadas usando o protocolo Q001 em K2HPO4/KH2PO4 120 mM pH 7,2, MgCl2 15 mM, glicose 10 mM, KCl 5 mM, usando Lonza Nucleofector II. As células foram analisadas quanto à perda de EGFP sete dias após a eletroporação.
[00175] Detecção de mutações induzidas por SpCas9. A expressão de EGFP foi analisada por Citômetro à base de Imagem Invitrogen Tali. Na análise comparativa com RNPs eletroporados, a análise das células que expressam EGFP foi realizada por FACS (FACSCanto, BD Biosciences). De modo a detectar indels nos loci de CXCR4 e VEGFA, o DNA genômico foi isolado usando o kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen). As PCRs em DNA genômico purificado foram realizadas usando a DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (Thermo Fisher Scientific). As amostras foram amplificadas usando os oligonucleotídeos listados na Tabela 2. Os produtos de PCR purificados foram analisados por sequenciamento e aplicação da ferramenta TIDE 36. A detecção da eliminação no locus de EGFP após tratamento com Multi-VEsiCas foi revelada por amplificação por PCR usando oligonucleotídeos EGFP direto e EGFP reverso.
[00176] GUIA-seq. 2x105 células de HEK293T foram transfectadas com 750 ng de plasmídeo que expressa Cas9, juntamente com 250 ng de plasmídeo codificador de sgRNA de VEGFA sítio 3 ou um plasmídeo pUC19 vazio (ambos descritos em (Petris et al. 2017)), 10 pmol da isca dsODN contendo ligações fosforotioato em ambas as extremidades (concebidas de forma idêntica ao protocolo GUIDE-seq) (Tsai et al. 2014) e 50 ng de um plasmídeo pEGFP-IRES-Puro (Petris et al. 2017), expressando EGFP e o gene de resistência à puromicina.
Os VEsiCas direcionadas ao VEGFA sítio 3 foram dispensadas por espinoculação 6 horas após a transfecção de plasmídeos que codificam dsODN e EGFP-IRES-Puro.
No dia seguinte, as células foram tripsinizadas e replantadas.
O procedimento foi repetido a cada 48h.
Após o último tratamento, as células foram destacadas e selecionadas com 2 µg/ml de puromicina por 48 horas.
As células foram então coletadas e o DNA genômico foi extraído usando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante e compartilhadas a um comprimento médio de 500 bp com o dispositivo de sonicação Bioruptor Pico (Diagenode). As preparações da biblioteca foram realizadas com os adaptadores e iniciadores de acordo com o trabalho anterior (Tsai et al. 2014). As bibliotecas foram quantificadas com o kit de Ensaio de Alta Sensibilidade de dsDNA Qubit (Invitrogen) e sequenciadas com o sistema de sequenciamento MiSeq (Illumina) usando um kit Illumina Miseq Reagent V2 - 300 ciclos (extremidade pareada de 2x150bp). Os dados de sequenciamento brutos (arquivos FASTQ) foram analisados usando o pipeline computacional GUIDE-seq (Tsai et al. 2016). Após a demultiplexação, as duplicatas de PCR putativas foram consolidadas em leituras únicas.
As leituras consolidadas foram mapeadas para o genoma de referência humano GrCh37 usando BWA-MEM37; leituras com qualidade de mapeamento menor que 50 foram filtradas.
Após a identificação das regiões genômicas que integram o oligodeoxinucleotídeo de fita dupla
(dsODNs) em dados alinhados, os sítios fora do alvo eram retidos se no máximo oito não correspondências contra o alvo estivessem presentes e se ausentes nos controles de referência. A visualização de sítios alinhados fora do alvo está disponível como uma grade de sequência codificada por cores.
[00177] Western blots. As células coletadas ou sobrenadantes contendo vesículas VSV-G foram lisados em tampão NEHN (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, NP40 a 0,5%, NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerol) suplementado com 1% de coquetel de inibidor de protease (Pierce). Os extratos de proteína foram separados por SDS-PAGE usando os padrões de proteína PageRuler Plus como marcadores de massa molecular padrão (Thermo Fisher Scientific). Após a eletroforese, as amostras foram transferidas para membranas de PVDF de 0,22 μm (GE Healthcare). As membranas foram incubadas com anti- FLAG de camundongo (Sigma) para detectar Gag-Cas9, MinGag- Cas9 e SpCas9, anti-α-tubulina de camundongo (Sigma) e com o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo (KPL) conjugado com HRP apropriado para detecção de ECL. O anticorpo monoclonal Cas9 Guide-it (Clone TG8C1 - Clontech) foi usado para quantificar SpCas9 por western blotting usando SpCas9 recombinante como referência. As imagens foram adquiridas e as bandas foram quantificadas usando o sistema de detecção UVItec Alliance.
[00178] Dispensação in vivo de VEsiCas. Os cuidados e tratamentos dos animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes institucionais em conformidade com as leis e políticas nacionais e internacionais (EEC Council Directive 86/609, OJL 358, 12 de dezembro de 1987 e D.lgs 116/92),
mediante aprovação do Comitê Ético ICGEB de Experimentação Animal e pelo Ministério da Saúde Italiano. Camundongos transgênicos (machos) expressando EGFP (C57BL/6-Tg (CAG- EGFP) 1Osb/J dos Laboratórios Jackson) no dia 5 pós-natal foram anestesiados por hipotermia em gelo por ~3-5 min, colocando uma gaze abaixo do filhote para evitar o contato direto com o gelo. Uma incisão cutânea transversal na metade inferior do tórax foi realizada com uma tesoura pequena, seguida por uma separação suave da pele do músculo subjacente por meio de uma dissecção romba. Uma toracotomia lateral foi feita fazendo uma pequena incisão no quarto espaço intercostal para visualizar o coração. VEsiCas (5 microlitros, correspondendo a 4 µg de SpCas9) portando um sgRNA de controle (sgCtr) ou um guia direcionado a EGFP (sgEGFPBi) foram injetadas na parede anterior do ventrículo esquerdo usando uma agulha 31G. As costelas e a pele foram suturadas juntas com sutura de Prolene não absorvível 8-0 para selar a incisão da parede torácica. Os neonatos foram aquecidos rapidamente sob uma lâmpada de calor por vários minutos até a recuperação e reintroduzidos à mãe. Após 10 dias, os corações foram coletados, fixados em paraformaldeído a 4% e rapidamente congelados em isopentano/nitrogênio líquido para análise por microscopia por fluorescência.
[00179] Imunofluorescência. As seções congeladas foram lavadas 3 vezes em PBS, permeabilizadas em Triton X-100 a 0,5% por 30 minutos e bloqueadas em soro de cabra a 10% por 1 hora. As seções foram coradas durante a noite a 4 °C com anticorpos anti-α-actinina sarcoméricos (Abcam), 1:100 em soro de cabra a 5%. Após 2 etapas de lavagem de 5 minutos em
Triton X-100 a 0,5% em temperatura ambiente, as seções foram incubadas 1 hora em 1:200 de anticorpo secundário anti- camundongo conjugado com Alexa Fluor-594 (Life Technologies) em 10% de soro de cabra por 45 minutos em temperatura ambiente. Os núcleos foram corados com solução de dicloridrato de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma). Exemplo comparativo Avaliação lado a lado de VEsiCas e outros sistemas do estado da técnica
[00180] Para demonstrar o desempenho superior de edição de VEsiCas, conduzimos uma comparação lado a lado com tecnologias do estado da técnica, ou seja, vesículas produzidas usando um sistema de transcrição nuclear baseado em U6 para o sgRNA (vesículas U6). As vesículas U6 podem ser consideradas uma boa representante para todas as tecnologias já presentes na técnica, uma vez que todas dependem da transcrição nuclear conduzida por U6 do sgRNA. Produzimos lotes de VEsiCas e vesículas U6 incorporando um sgRNA direcionado à sequência de codificação de EGFP (sgRNA de EGFPBi) e medimos a inativação de EGFP em uma linha de célula repórter expressando de forma estável EGFP (HEK293-EGFP). Os resultados brutos são relatados na Fig. 12a, enquanto um gráfico no qual os dados são normalizados na quantidade de SpCas9 usado para a transdução é mostrado na Fig. 12b. A quantificação do conteúdo de SpCas9 em cada amostra foi obtida por western blot, como descrito nos Métodos. VEsiCas demonstrou níveis mais elevados de inativação de EGFP, com um aumento geral no número total de células editadas de 1,6 vezes.
[00181] Para ampliar ainda mais nossa comparação, também avaliamos a eficácia de edição de VEsiCas em paralelo com Gesículas (revelado em WO2015/191911A2), um sistema de vesículas comercial distribuído pela Takara-Clontech capaz de dispensar complexos SpCas9-sgRNA e vesículas U6. Produzimos VEsiCas juntamente com Gesículas e vesículas U6, incorporando o sgRNA de EGFPBi em todas as três preparações. Tratamos células HEK293-EGFP usando frações das diferentes preparações de vesículas contendo a mesma quantidade de SpCas9 incorporada (40 ng) e medimos a diminuição na fluorescência. Como mostrado na Fig. 13, VEsiCas está superando as vesículas U6 (1,6 vezes mais edição), como esperado, e Gesículas (inativação aumentada 1,5 vezes), demonstrando os níveis mais altos de inativação de EGFP. Interessantemente, os níveis de edição obtidos com vesículas U6 e Gesículas são similares, apoiando ainda mais a noção de que a forma como o sgRNA é transcrito nas células produtoras é fundamental para determinar a eficácia da edição da preparação da vesícula, mais do que outras características técnicas do vesículas em si. No geral, uma vez que a quantidade de proteína SpCas9 usada é a mesma, a atividade aumentada de VEsiCas em comparação com os métodos padrão deve ser causado por uma quantidade aumentada de sgRNA incorporado nas vesículas. Avaliação de Incorporação de sgRNA por VEsiCas e sistemas do Estado da Técnica
[00182] A fim de melhor caracterizar a eficácia de nosso sistema de transcrição citoplasmática conduzido por T7, comparamos os níveis de sgRNA incorporados em vesículas U6 (sgRNA expressado por PolIII nuclear) com aqueles incorporados em VEsiCas (sgRNA derivado de RNA polimerase T7 citoplasmático). O guia de RNA usado é projetado para ter como alvo a sequência de codificação de EGFP (SgRNA para EGFPBi). Avaliamos o conteúdo de sgRNA em cada tipo de preparação de vesícula usando um ensaio baseado em RT-qPCR, como relatado na seção Métodos. O RNA total foi extraído da preparação da vesícula usando o kit Nucleospin miRNA (Macherey-Nagel) de acordo com o protocolo do fabricante. Uma curva padrão para quantificação absoluta foi preparada usando uma molécula de sgRNA transcrita in vitro idêntica àquela incorporada em ambas as preparações de vesículas (Fig. 14a). como mostrado na Fig. 14b, uma quantidade maior de gRNA foi medida em VEsicas em comparação com vesículas U6 (1,6 vezes mais). Esse valor pode ser corrigido adicionalmente levando-se em consideração a quantidade total de SpCas9 incorporada nas vesículas (medida como indicado na seção Métodos) para corrigir os vieses de produção. Esses cálculos confirmam a incorporação mais elevada para sgRNAs transcritos por T7, aumentando a razão sobre a expressão conduzida por U6 para 1,7 vezes (Fig. 14c). Avaliação da razão molar entre SpCas9 e sgRNA em VEsiCas
[00183] Uma vez que a quantidade de sgRNA incorporado se correlaciona com a maior eficiência de edição, concluímos que uma vantagem inesperada de VEsiCas é representada pelo aumento do nível de SpCas9 complexado com seu sgRNA e incorporado nas vesículas. Para medir a razão molar entre SpCas9 incorporado e sgRNA incorporado, quantificamos as duas moléculas presentes em uma preparação de VEsiCas. Para a quantificação de SpCas9, usamos western blot (Fig. 15a), como relatado na seção Métodos. Para aumentar a confiabilidade da medição, carregamos duas curvas padrão diferentes obtidas com duas preparações diferentes de SpCas9 recombinante (mostrado na Fig. 15b-c). Como mostrado na Tabela 3, as quantificações usando as duas curvas são consistentes. Tabela 3. Quantificação absoluta de SpCas9 incorporado em VEsiCas usando curvas padrão replicadas Cas9 Cas9 (ng) (pmol) VEsiCas (Padrão 1) 16,59 0,104 VEsiCas (Padrão 2) 22,73 0,142
[00184] Em seguida, extraímos o RNA total da preparação de VEsiCas e quantificamos a quantidade de sgRNA usando o ensaio RT-qPCR descrito nos Métodos e no parágrafo anterior. A partir dessas quantificações absolutas, obtivemos a razão molar entre as duas moléculas, que pode ser entendida como a quantidade de sgRNA incorporada pela nuclease. Como relatado na Tabela 4, a razão é igual a 1:0,85, indicando alta eficiência de complexação graças ao sistema de transcrição citoplasmática baseado em RNA polimerase T7. Tabela 4. Razão molar entre SpCas9 e sgRNA em VEsiCas Razão Cas9 Cas9 sgRNA sgRNA molar de (ng) (pmol) (ng) (pmol) Cas9:sgRNA 19,66 0,123 3,58 0,105 1:0,85 VEsiCas
REFERÊNCIAS
[00185] Accola, M.A., Strack, B. & Göttlinger, H.G.,
2000. “Efficient particle production by minimal Gag constructs which retain the carboxy-terminal domain of human immunodeficiency virus type 1 capsid-p2 and a late assembly domain”. Journal of Virology, 74(12), pp.5395–5402.
[00186] Aubertin, K. et al., 2016. “Massive release of extracellular vesicles from cancer cells after photodynamic treatment or chemotherapy”. Scientific Reports, 6(1), p.35376.
[00187] Bewicke-Copley, F. et al., 2017. “Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations”. Journal of extracellular vesicles, 6(1), p.1340746.
[00188] Brinkman, E.K. et al., 2014. “Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition”. Nucleic Acids Research, 42(22), pp.e168– e168.
[00189] Buchholz, U.J., Finke, S. & Conzelmann, K.K.,
1999. “Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter”. Journal of Virology, 73(1), pp.251–259.
[00190] Casini, A. et al., 2015. “Reduction of HIV-1 infectivity through endoplasmic reticulum-associated degradation-mediated Env depletion”. Journal of Virology, 89(5), pp.2966–2971.
[00191] Chew, W.L. et al., 2016. “A multifunctional AAV– CRISPR–Cas9 and its host response”. Nature methods, 13(10), pp.868–874.
[00192] Chick, H.E. et al., 2012. “Integrase-deficient lentiviral vectors mediate efficient gene transfer to human vascular smooth muscle cells with minimal genotoxic risk”. Human Gene Therapy, 23(12), pp.1247–1257.
[00193] Choi, J.G. et al., 2016. “Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing”. Gene Therapy, 23(7), pp.627–633.
[00194] Chylinski, K., Le Rhun, A. & Charpentier, E.,
2013. “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”. RNA Biology, 10(5), pp.726–737.
[00195] Cox, D.B.T. et al., 2017. “RNA editing with CRISPR-Cas13”. Science, 358(6366), pp.1019–1027.
[00196] Dahlman, J.E. et al., 2015. “Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease”. Nature Biotechnology, 33(11), pp.1159–1161.
[00197] Dang, Y. et al., 2015. “Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency”. Genome Biology, pp.1–10.
[00198] Deyle, D.R. & Russell, D.W., 2009. “Adeno- associated virus vector integration”. Current opinion in molecular therapeutics, 11(4), pp.442–447.
[00199] Diao, Y. et al., 2016. “A new class of temporarily phenotypic enhancers identified by CRISPR/Cas9- mediated genetic screening”. Genome Research, 26(3), pp.397–
405.
[00200] Eaton, H.E. et al., 2017. African Swine Fever “Virus NP868R Capping Enzyme Promotes Reovirus Rescue during Reverse Genetics by Promoting Reovirus Protein Expression, Virion Assembly, and RNA Incorporation into Infectious Virions”. S. López, ed. Journal of Virology, 91(11), pp.e02416–16.
[00201] Elroy-Stein, O. & Moss, B., 2001. “Gene expression using the vaccinia virus/ T7 RNA polymerase hybrid system”. Current protocols in protein science, Capítulo 5, pp.Unit5.15–5.15.11.
[00202] Esvelt, K.M., Carlson, J.C. & Liu, D.R., 2011. “A system for the continuous directed evolution of biomolecules”. Nature, 472(7344), pp.499–503.
[00203] Friedland, A.E. et al., 2015. “Characterization of Staphylococcus aureus Cas9: a smaller Cas9 for all-in-one adeno-associated virus delivery and paired nickase applications”. Genome Biology, 16(1), p.257.
[00204] Fu, Y. et al., 2013. “High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells”. Nature Biotechnology, pp.1–6.
[00205] Fuchs, A.-L., Neu, A. & Sprangers, R., 2016. “A general method for rapid and cost-efficient large-scale production of 5' capped RNA”. RNA, 22(9), pp.1454–1466.
[00206] Gabriel, R. et al., 2011. “An unbiased genome- wide analysis of zinc-finger nuclease specificity”. Nature Biotechnology, 29(9), pp.816–823.
[00207] Gagnon, J.A. et al., 2014. “Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs”. B. Riley, ed. PLoS ONE, 9(5), p.e98186.
[00208] Gao, L. et al., 2017. “Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities”. Nature Biotechnology, 35(8), pp.789–792.
[00209] Gao, Y. et al., 2016. “Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators”. Nature methods, 13(12), pp.1043–1049.
[00210] Geer, L.Y. et al., 2002. “CDART: protein homology by domain architecture”. Genome Research, 12(10), pp.1619–
1623.
[00211] Habjan, M. et al., 2008. “T7 RNA polymerase-
dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus”. The Journal of general virology, 89(Pt 9), pp.2157–2166.
[00212] Hou, Z. et al., 2013. “Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(39), pp.15644–15649.
[00213] Hu, J.H. et al., 2018. “Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity”. Nature, 556(7699), pp.57–63.
[00214] Jordan, A., Bisgrove, D. & Verdin, E., 2003. “HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro”. The EMBO Journal, 22(8), pp.1868–1877. Disponível em: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1 54479&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
[00215] Kim, D.-H. et al., 2004. “Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase”. Nature Biotechnology, 22(3), pp.321–325.
[00216] Kim, S. et al., 2014. “Highly efficient RNA- guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins”. Genome Research, 24(6), pp.1012–
1019.
[00217] Kleinstiver, B.P. et al., 2016. High-fidelity “CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off- target effects”. Nature, 529(7587), pp.490–495.
[00218] Komor, A.C., Badran, A.H. & Liu, D.R., 2017. “CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes”. Cell, 168(1-2), pp.20–36.
[00219] Lapinaite, A., Doudna, J.A. & Cate, J.H.D., 2018. “Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(13), pp.3368–3373.
[00220] Liu, K.I. et al., 2016. “A chemical-inducible CRISPR-Cas9 system for rapid control of genome editing”. Nature chemical biology, 12(11), pp.980–987.
[00221] Lombardo, A. et al., 2007. “Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase- defective lentiviral vector delivery”. Nature Biotechnology, 25(11), pp.1298–1306.
[00222] Long, C. et al., 2016. “Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy”. Science, 351(6271), pp.400–403.
[00223] Mangeot, P.-E. et al., 2011. “Protein transfer into human cells by VSV-G-induced nanovesicles”. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 19(9), pp.1656–1666.
[00224] Mout, R., Ray, M., Lee, Y.-W., et al., 2017. “In Vivo Delivery of CRISPR/Cas9 for Therapeutic Gene Editing: Progress and Challenges”. Bioconjugate chemistry, 28(4), pp.880–884.
[00225] Mout, R., Ray, M., Yesilbag Tonga, G., et al.,
2017. “Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9- Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing”. ACS nano, 11(3), pp.2452–2458.
[00226] Nakai, H. et al., 2001. “Extrachromosomal recombinant adeno-associated virus vector genomes are primarily responsible for stable liver transduction in vivo”. Journal of Virology, 75(15), pp.6969–6976.
[00227] Nihongaki, Y. et al., 2015. “Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing”. Nature Biotechnology, 33(7), pp.755–760.
[00228] Nissim, L. et al., 2014. “Multiplexed and programmable regulation of gene networks with an integrated RNA and CRISPR/Cas toolkit in human cells”. Molecular Cell, 54(4), pp.698–710.
[00229] Nuñez, J.K., Harrington, L.B. & Doudna, J.A.,
2016. “Chemical and Biophysical Modulation of Cas9 for Tunable Genome Engineering”. ACS Chemical Biology, 11(3), pp.681–688.
[00230] Perez-Pinera, P. et al., 2013. “RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors”. Nature methods, 10(10), pp.973–976.
[00231] Petris, G. et al., 2017. “Hit and go CAS9 delivered through a lentiviral based self-limiting circuit”. Nature Communications, 8, p.15334.
[00232] Pichlmair, A. et al., 2006. “RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'- phosphates”. Science, 314(5801), pp.997–1001.
[00233] Ramakrishna, S. et al., 2014. “Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA”. Genome Research, 24(6), pp.1020–
1027.
[00234] Ramqvist, T., Andreasson, K. & Dalianis, T.,
2007. “Vaccination, immune and gene therapy based on virus- like particles against viral infections and cancer”. Expert opinion on biological therapy, 7(7), pp.997–1007.
[00235] Ran, F.A. et al., 2013. “Double Nicking by RNA- Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity”.
Cell, 154(6), pp.1380–1389.
[00236] Ran, F.A. et al., 2015. “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9”. Nature, 520(7546), pp.186–191.
[00237] Rittner, K. et al., 2002. “New basic membrane- destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo”. Molecular Therapy, 5(2), pp.104–114.
[00238] Ruozi, G. et al., 2015. “AAV-mediated in vivo functional selection of tissue-protective factors against ischaemia”. Nature Communications, 6(1), p.7388.
[00239] Samuel, P. et al., 2018. “Cisplatin induces the release of extracellular vesicles from ovarian cancer cells that can induce invasiveness and drug resistance in bystander cells”. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences, 373(1737), p.20170065.
[00240] Schoderboeck, L. et al., 2015. “Chimeric rabies SADB19-VSVg-pseudotyped lentiviral vectors mediate long- range retrograde transduction from the mouse spinal cord”. Gene Therapy, 22(5), pp.357–364.
[00241] Shmakov, S. et al., 2015. “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”. Molecular Cell, 60(3), pp.385–397.
[00242] Slaymaker, I.M. et al., 2016. “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”. Science, 351(6268), pp.84–88.
[00243] Suzuki, K. et al., 2016. “In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration”. Nature, 540(7631), pp.144–149.
[00244] Tak, Y.E. et al., 2017. “Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors”. Nature methods, 14(12), pp.1163–1166.
[00245] Thyme, S.B. et al., 2016. “Internal guide RNA interactions interfere with Cas9-mediated cleavage”. Nature Communications, 7, p.11750.
[00246] Truong, D.-J.J. et al., 2015. “Development of an intein-mediated split–Cas9 system for gene therapy”. Nucleic Acids Research, 43(13), pp.6450–6458.
[00247] Tsai, S.Q. & Joung, J.K., 2016. “Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases”. Nature Reviews Genetics, 17(5), pp.300–312.
[00248] Tsai, S.Q. et al., 2014. “GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases”. Nature Biotechnology, 33(2), pp.187–197.
[00249] Tsai, S.Q. et al., 2016. “Open-source guideseq software for analysis of GUIDE-seq data”. Nature Biotechnology, 34(5), pp.483–483.
[00250] Voelkel, C. et al., 2010. “Protein transduction from retroviral Gag precursors”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(17), pp.7805–7810.
[00251] Vora, S. et al., 2016. “Next stop for the CRISPR revolution: RNA-guided epigenetic regulators”. The FEBS Journal, 283(17), pp.3181–3193.
[00252] Wang, X. et al., 2015. “Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors”. Nature Biotechnology, 33(2), pp.175–178.
[00253] Wei, C.M. & Moss, B., 1975. “Methylated nucleotides block 5'-terminus of vaccinia virus messenger
RNA”. Proceedings of the National Academy of Sciences, 72(1), pp.318–322.
[00254] Wright, A.V. et al., 2015. “Rational design of a split-Cas9 enzyme complex”. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(10), pp.2984–2989.
[00255] Yan, W.X. et al., 2018. “Cas13d Is a Compact RNA- Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein”. Molecular Cell, 70(2), pp.327–339.e5.
[00256] Yang, Y. et al., 2016. “A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice”. Nature Biotechnology, 34(3), pp.334–338.
[00257] Zacchigna, S., Zentilin, L. & Giacca, M., 2014. “Adeno-associated virus vectors as therapeutic and investigational tools in the cardiovascular system”. Circulation research, 114(11), pp.1827–1846.
[00258] Zetsche, B., Volz, S.E. & Zhang, F., 2015. “A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation”. Nature Biotechnology, 33(2), pp.139–142.
[00259] Zhang, J.-P. et al., 2016. “Different Effects of sgRNA Length on CRISPR-mediated Gene Knockout Efficiency”. Scientific Reports, 6(1), p.28566.
[00260] Zuris, J.A. et al., 2015. “Cationic lipid- mediated delivery of proteins enables efficient protein- based genome editing in vitro and in vivo”. Nature Biotechnology, 33(1), pp.73–80.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Vesícula, caracterizada pelo fato de que compreende: i) um envelope lipídico associado a pelo menos uma proteína associada à membrana; ii) pelo menos uma molécula de RNA guia; e iii) opcionalmente pelo menos uma nuclease guiada por RNA; em que a vesícula tem pelo menos um dos seguintes recursos: - a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma quantidade de pelo menos 0,2% p/p da massa total da proteína da vesícula; e - se a vesícula contém também a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, a pelo menos uma molécula de RNA guia é complexada com a pelo menos uma nuclease guiada por RNA, em que a pelo menos uma molécula de RNA guia está presente dentro da vesícula em uma razão molar em relação à pelo menos uma nuclease guiada por RNA igual ou maior que 0,85:1.
2. Vesícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o envelope lipídico é selecionado de uma estrutura lipídica em mono ou bicamada, um exossomo, um vírus envelopado, uma partícula semelhante a vírus envelopada, um microssoma, um endossomo, um nanossomo, um vacúolo, de preferência, um exossomo ou uma partícula semelhante a vírus envelopada.
3. Vesícula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína associada à membrana estimula a formação de vesículas a partir de uma célula produtora de vesículas e/ou medeia a fusão de vesículas a uma célula alvo.
4. Vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína associada à membrana é selecionada de: Complexo adaptador-clatrina AP1, proteína proteolipídica PLP1, TSAP6, CHMP4C, proteína do envelope de VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína de envelope de BRL, glicoproteína do envelope do vírus da raiva, proteína do envelope NA/HA/M2 da influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, gp160 de HIV; proteínas do capsídeo, proteínas do nucleocapsídeo, proteína da matriz de vírus envelopado tendo uma interação com a membrana celular; VP40 de ebola, glicoproteína de ebola, proteína retroviral Gag e/ou Gag- pol, proteína lentiviral Gag e/ou Gag-Pol, proteínas Arc, proteínas de envelope de retrotransposons TY3/cigana, Vpu de HIV-1, Gag mínimo, fusão de SADB19-VSV-G, uma porção do domínio transmembranar de VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou seu domínio extracelular fundidos com uma das proteínas do envelope listadas acima, fragmentos de anticorpos variáveis da cadeia única (scFv) derivados de domínios variáveis de imunoglobulinas capazes de reconhecer as moléculas superficiais em células alvo, receptores de proteínas capazes de reconhecer moléculas superficiais em células alvo, ligantes proteicos capazes de reconhecer moléculas superficiais em células alvo e análogos das mesmas.
5. Vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma molécula de RNA guia é selecionada de sgRNA, crRNA, tracrRNA, miRNA, shRNA, siRNA.
6. Vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de nucleases CRISPR classe 2 tipo II, tipo V e/ou tipo VI ou nucleases guiadas por RNA de Argonaute e variantes das mesmas.
7. Vesícula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: uma nuclease Cas9, Cpf1, Cas13 e Ago2 e variantes das mesmas; um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 e Cas13 com ou sem atividade de nuclease; um mutante de nuclease Cas9 e Cpf1 com atividade de nickase; e uma nuclease Cas9 e Cpf1 fundida a um domínio de proteína selecionado de: etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, peptídeos de penetração celular, peptídeos que permitem o escape endossomal, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, proteínas ou domínios de proteína modulando reparo de DNA, proteínas ou domínios de proteína que permitem a modificação pós-tradução de outras proteínas, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula, domínios de ligação de proteína.
8. Vesícula, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de RNA guia, formando um complexo com uma nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13 e uma variante das mesmas, ou um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13 com ou sem atividade de nuclease, é manipulada(o) geneticamente para incluir um aptâmero, de preferência um aptâmero MS2, tendo propriedades de interação com um domínio de proteína de interação de aptâmero, de preferência uma proteína MS2, que é fundida a outros domínios de proteína que codificam um editor de base, um regulador de transcrição ou um regulador de cromatina.
9. Vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma nuclease guiada por RNA é fundida a pelo menos um de: um sinal de farnesilação, um sinal de miristoilação, um domínio transmembranar.
10. Vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a vesícula, uma vez dispensada a uma célula alvo, fornece a expressão transitória da(o) nuclease guiada por RNA e/ou RNA guia dentro da célula alvo, a fim de minimizar a toxicidade celular.
11. Método para produzir a vesícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o método compreende as seguintes etapas: i) fornecer uma célula de empacotamento, em que a célula de empacotamento tem as seguintes características: a) a célula é tolerante a altos níveis de transcrição citosólica direta, em que a tolerância da célula é determinada por: uma falta de expressão na célula de pelo menos uma via de detecção de RNA de vírus selecionada de: RIG-I, proteína semelhante a RIG-I, MDA-5, IPS-1, RIPI, FADD, TRAF6, TRAF3, TANK, NAP, NEMO, IKKα, IKKβ, IKKε, IKKγ, TBK1, DDX3, IκB, NF-κB, IRF3, IRF7, p65, p50, RIP1, TLR3, TLR7, TLR8, INF-α, INF-β, INF-γ1, INF-γ2, INF-γ3, Caspase-1, TLR8; e/ou a capacidade da célula de capear pelo menos uma molécula de RNA guia por expressão de enzimas de capeamento; e/ou uma capacidade da célula de expressar uma 5’-fosfatase para desfosforilar os transcritos de 5’-trifosfato; e b) a célula expressa de forma estável ou transiente uma RNA polimerase no citoplasma; ii) transfectar a célula de empacotamento com pelo menos um primeiro cassete de expressão, e pelo menos um segundo cassete de expressão e opcionalmente pelo menos um terceiro cassete de expressão, em que: a) o primeiro cassete de expressão compreende uma primeira sequência de nucleotídeos para transcrever pelo menos uma molécula de RNA guia; b) o segundo cassete de expressão compreende uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana; e c) o terceiro cassete de expressão compreende uma terceira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma nuclease guiada por RNA; iii) produzir a vesícula a partir das células de empacotamento.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a RNA polimerase é uma RNA polimerase de bacteriófago selecionada de: RNA polimerase de fago T7, RNA polimerase de Bacteriófago SP6, RNA polimerase de bacteriófago de Yersinia pestis phiA1122, RNA polimerase de bacteriófago de Pseudomonas gh-1, RNA polimerase de bacteriófago de Pseudomonas putida, RNA polimerase de bacteriófago T3, RNA polimerase de Bacteriófago T4, RNA polimerase de Roseófago SIOl, RNA polimerase de Bacteriófago phiYe03-12, RNA polimerase de bacteriófago phiKMV, RNA polimerase de bacteriófago de Enterobacteria Kl-5, RNA polimerase de Vibriófago VpV262, RNA polimerase de BA14, RNA polimerase de BA127 e RNA polimerase de BA156 e variantes dos mesmos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a célula de empacotamento é selecionada de células BHK21, BSR-T7/5, BHK-T7 e Vero.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma proteína associada à membrana é selecionada de: complexo adaptador-clatrina AP1, proteína proteolipídica PLP1, TSAP6, CHMP4C, proteína de envelope de VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína de envelope de BRL, glicoproteína do envelope do vírus da raiva, proteína do envelope NA/HA/M2 da influenza, proteína do envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, gp160 de HIV, proteínas do capsídeo, proteínas do nucleocapsídeo, proteína da matriz de vírus envelopado tendo uma interação com a membrana celular, VP40 de ebola, glicoproteína do ebola, proteína retroviral Gag e/ou Gag- pol, proteína lentiviral Gag e/ou Gag-Pol, proteínas Arc, proteínas de envelope de retrotransposons TY3/cigana, Vpu de HIV-1, Gag mínimo, fusão de SADB19-VSV-G, uma porção do domínio transmembranar VSV-G e/ou seu domínio intracelular e/ou seu domínio extracelular fundido(s) com uma das proteínas do envelope listadas acima, fragmentos de anticorpos variáveis da cadeia única (scFv) derivados de domínios variáveis de imunoglobulinas capazes de reconhecer moléculas superficiais em células alvo, receptores de proteínas capazes de reconhecer moléculas superficiais em células alvo, ligantes proteicos capazes de reconhecer moléculas superficiais em células alvo e análogos dos mesmos.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: nucleases CRISPR classe 2 tipo II, tipo V e tipo VI e nucleases guiadas por RNA de Argonaute.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma nuclease guiada por RNA é selecionada de: uma nuclease Cas9, Cpf1, Cas13 e Ago2 e variantes das mesmas; um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 e Cas13 com ou sem atividade de nuclease; um mutante de nuclease Cas9 e Cpf1 com atividade de nickase; uma nuclease Cas9 e Cpf1 fundida com um domínio de proteína selecionado de: sequências de aminoácidos que codificam etiquetas de proteína, domínios de nuclease adicionais, domínios de edição de ácido nucleico, peptídeos de penetração celular e peptídeos que permitem o escape endossomal, reguladores de transcrição, reguladores de cromatina, proteínas ou domínios de proteína de modulação do reparo de DNA, proteínas ou domínios de proteína que permitem a modificação pós-tradução de outras proteínas, domínios de proteína ou peptídeos que regulam a estabilidade da proteína e/ou localização dentro da célula, domínios de ligação de proteína.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula de RNA guia, formando um complexo com uma nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13, ou um mutante de nuclease Cas9, Cpf1 ou Cas13 com ou sem atividade de nuclease, é manipulada geneticamente para incluir um aptâmero, de preferência um aptâmero MS2, tendo propriedades de interação com um domínio de proteína selecionado de: um editor de base, um regulador de transcrição ou um regulador de cromatina.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) fornece a transfecção da célula de empacotamento com pelo menos um outro cassete de expressão, em que pelo menos um outro cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica pelo menos uma proteína associada à membrana, útil para alterar o tropismo de vesículas para células alvo, selecionadas de: gp160 de HIV, gp120 de HIV, VSV-G, envelope de ALV, glicoproteína do ebola, glicoproteína de envelope de BRL, glicoproteína de envelope do vírus da raiva, NA/HA/M2 da influenza, envelope anfotrópico de MuLV, gp64 de baculovírus, TCR-alfa, CD4, MHC-I, MHC-II, domínios variáveis de anticorpos e/ou anticorpos de comprimento total que reconhecem moléculas superficiais em células alvo, com a condição de que a pelo menos uma proteína associada à membrana codificada pela sequência de nucleotídeos adicional compreendida no cassete de expressão adicional é diferente de pelo menos uma proteína associada à membrana codificada pela segunda sequência de nucleotídeos compreendida no segundo cassete de expressão.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a terceira sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma nuclease guiada por RNA contém adicionalmente pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um de: um sinal de farnesilação, um sinal de miristoilação, um domínio transmembranar.
BR112021000408-4A 2018-07-10 2019-07-08 vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas BR112021000408A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102018000007055 2018-07-10
IT201800007055 2018-07-10
PCT/IB2019/055805 WO2020012335A1 (en) 2018-07-10 2019-07-08 Vesicles for traceless delivery of guide rna molecules and/or guide rna molecule/rna-guided nuclease complex(es) and a production method thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021000408A2 true BR112021000408A2 (pt) 2021-06-29

Family

ID=63684346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021000408-4A BR112021000408A2 (pt) 2018-07-10 2019-07-08 vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210261957A1 (pt)
EP (1) EP3820995A1 (pt)
JP (1) JP2021524272A (pt)
KR (1) KR20210044213A (pt)
BR (1) BR112021000408A2 (pt)
CA (1) CA3105925A1 (pt)
MX (1) MX2021000343A (pt)
WO (1) WO2020012335A1 (pt)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019051097A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The Regents Of The University Of California RNA-GUIDED ENDONUCLEASE FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING SAME
CN113164623A (zh) 2018-09-18 2021-07-23 维恩维纽克公司 基于arc的衣壳及其用途
CN113923983B (zh) * 2019-04-03 2024-02-27 乔治亚大学研究基金公司 通过细胞外囊泡来递送crispr/mcas9以用于基因组编辑
WO2020219713A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Case Western Reserve University Fusogenic particles and related methods for delivering therapeutic agents to cells
CN115667505A (zh) 2020-03-19 2023-01-31 因特利亚治疗公司 用于定向基因组编辑的方法和组合物
WO2021188996A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for enhanced lentiviral production
EP4247951A2 (en) * 2020-11-19 2023-09-27 Wake Forest University Health Sciences Vectors, systems and methods for eukaryotic gene editing
WO2022152746A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Alia Therapeutics Srl K526d cas9 variants and applications thereof
EP4351660A2 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Scribe Therapeutics Inc. Particle delivery systems
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023118349A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
WO2023194359A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
CN115261340A (zh) * 2022-05-20 2022-11-01 四川大学 一种gh-1噬菌体病毒样颗粒、制备方法及应用
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024056880A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Alia Therapeutics Srl Enqp type ii cas proteins and applications thereof
WO2024105162A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
CN116083488A (zh) * 2023-01-03 2023-05-09 北京镁伽机器人科技有限公司 基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014200659A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
WO2015191911A2 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
US20150376587A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
US9816080B2 (en) * 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
CN107532161A (zh) 2015-03-03 2018-01-02 通用医疗公司 具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶
WO2016205613A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
EP3341477B1 (en) 2015-08-28 2022-03-23 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
JP7059179B2 (ja) * 2015-10-20 2022-04-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 遺伝子操作のための方法及び製品

Also Published As

Publication number Publication date
EP3820995A1 (en) 2021-05-19
MX2021000343A (es) 2021-05-28
US20210261957A1 (en) 2021-08-26
WO2020012335A1 (en) 2020-01-16
CA3105925A1 (en) 2020-01-16
JP2021524272A (ja) 2021-09-13
KR20210044213A (ko) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112021000408A2 (pt) vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas
Montagna et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9
US20240035006A1 (en) Crystal structure of crispr cpf1
US11339410B2 (en) Methods and products for expressing proteins in cells
Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo
CN113348245A (zh) 新型crispr酶和系统
CA3077086A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
AU2017268842B2 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
BR112019016765A2 (pt) Molécula de cas9 modificada isolada, método para produzir uma cas9 modificada, complexos de proteína ou ribonucleoproteína ou complexos de proteína e ribonucleoproteína misturadas ou lipídeo, proteína de fusão, sequência de nucleotídeos, ácido nucleico, vetor, célula, animal ou planta, composição farmacêutica, uso in vitro de uma cas9 modificada recombinante, kit de partes, e, método in vitro para alterar o genoma de uma célula
CN116209756A (zh) 调控基因组的方法和组合物
CA3174553A1 (en) Host defense suppressing methods and compositions for modulating a genome
AU2020368539A1 (en) Engineered muscle targeting compositions
US20240084330A1 (en) Compositions and methods for delivering cargo to a target cell
US20240067940A1 (en) Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US20210147828A1 (en) Dna damage response signature guided rational design of crispr-based systems and therapies
WO2020041380A1 (en) Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
US20240141382A1 (en) Gene editing components, systems, and methods of use
US20240084274A1 (en) Gene editing components, systems, and methods of use
CA3220253A1 (en) Compositions and methods for increasing efficiency of precise editing repair
WO2024020346A2 (en) Gene editing components, systems, and methods of use
US20190211317A1 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
JP2024521793A (ja) 正確な編集修復の効率を向上させるための組成物及び方法