KR20050072743A - 점액 또는 타액의 액화를 위한 생성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 과도하게 또는 비정상적으로 점착력 있는 점액 또는 타액의 점도 및/또는 점착력을 감소 및/또는 액화를 증가시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드 및 임의로 추가의 환원 시스템을 함유한다.

Description

점액 또는 타액의 액화를 위한 생성물 및 방법{Product and Process for Liquefaction of Mucus or Sputum}

본 발명은 일반적으로 점액 또는 타액의 액화를 유도, 증대 및/또는 증가시키기 위한 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위(active-site)를 함유한 단백질 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF)은 통상적이고 치명적인 유전병으로서 염소 채널 단백질(chloride channel protein)을 암호화하는 유전자인 CF 트랜스맴브레인 컨덕탄스 레귤레이터(CF transmembrane conductance regulator)의 변이로부터 발생한다. 상기 결함의 결과로 인해 신체의 상피는 염소 수송에 대해 비투과성이 된다 (Boucher et al. Lung 161:1-17, 1983; Welsh, Physiol. Rev. 67:11443-11884, 1987). 췌장, 장 및 남성 생식기 계통을 포함한 여러 기관이 영향을 받지만 폐 내의 합병증이 사망률의 95%를 차지한다 (Means, M. Cystic Fibrosis: the first 50 years. In: Cystic Fibrosis - Current Topics Volume 1, Dodge J.A., Brock D.J.H. and Widdicombe J.H. 편저: Wiley and Sons, 1992, p.217-250). 상기 질병으로 손상된 폐에서 기도로의 염소 수송은 Na⁺ 및 유체의 과도한 흡수로 이어지고 기도 표면 액체의 용량을 감소시킨다 (Jiang et al. Science 262:424-427, 1993). 기도 표면 액체의 건조 현상은 점액의 겔 형성 성분인 뮤신(mucin) 거대분자의 농축으로 이어진다 (Matsui et al. Cell 95:1005-1015, 1998). 정상적인 점액의 점탄력(viscoelastic) 특성은 뮤신 중합체의 농도, 분자량 및 결집도에 의존한다 (Verdugo et al. Biorheology 20: 223-230, 1983). 뮤신과 DNA 간의 추가의 상호작용(Potter et al. Am. J. Dis. Child 100: 493-495, 1960; Lethem et al. Am. Rev. Respir. Dis. 100: 493-495, 1990; Lethem et al. Eur. Respir. J. 3:19-23, 1990) 및 사멸하는 염증 세포로부터 방출된 f-액틴(actin) 중합체 (Sheils et al. Am. J. Path. 148: 919-927, 1996; Tomkiewicz et al. DNA and actin filament ultrastructure in cystic fibrosis sputum. In: Cilia, mucus, and mucociliary interactions, Baum G.L, Priel Z., Roth Y., Liron N. and Ostfeld E.J. 편저, New York, NY: Marcel Dekker, 1988)는 밀도있고 점성의 성질을 갖는 CF 타액의 원인이다. 이러한 점액을 기침에 의해 또는 기타 점액의 제거를 할 수 없기 때문에 기회주의적인 질병인자의 집락화를 촉진시킨다.

CF 폐 질환의 병인학이 타액의 변형된 유동 성질에 기인하지만 손상된 폐 기능은 태어났을 때 거의 명백하지 않다. 그 대신 기관지 확장증 및 기도 장애는 환자의 연령이 증가함에 따라 진전된다. 만성 폐 손상은 세균 감염 및 염증 반응의 집요한 순환에 의해 발생한다. 기도 손상은 폐 속에 모인 뉴트로필(neutrophil)이 엘라스타제와 같은 매트릭스 분해 효소 및 해로운 반응성 산소성분을 방출함으로써 일어난다(Konstan and Berger, Pediatr. Pulmonal. 24: 137-142,1997).

몇몇 기대되는 성과에도 불구하고 유전자 치료법에 의한 CF의 교정은 현재까지 가능하지 않다. 근래에는 화농성의 기도 분비물의 제거를 촉진하는 의약과 이와 연계되는 항생제 식이요법이 진전된 기도 질환을 처치하는 주요 방법이다. CF 기도에 존재하는 세포 외 DNA를 소화하는 정제된 rhDNase의 흡입 (Pulmozyme; Genentech, USA)이 보편적으로 사용되는 울혈 제거제이다. 이러한 처치법은 타액 점도를 감소시키고 강제 호기의 체적(forced expiratory volume, FEV)을 안정시키는데 의료적으로 효과적이다 (Fuchs et al. N. Engl. J. Med. 331: 637-642, 1994). N-아세틸시스테인, 나시스텔린(N-acetyl-L-cysteine 유도체) 및 겔솔린을 포함한 뮤신 또는 악틴 중합체 분해를 위한 기타 치료법은 실험적으로 타액 점도를 감소시킬 수도 있으나 미국에서 특별히 CF의 처치를 위해 의약 승인을 받아야 한다.

그러므로 본 기술분야에서 낭포성 섬유증의 처치를 위해 개선된 치료 방법에 대한 수요가 있을 뿐만 아니라 비정상적이거나 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액과 관련된 기타 질병 및 조건에 대한 치료 방법이 요구되고 있는 실정이다.

도 1a는 Trx 환원 시스템에 대해 노출시켰을 때 CF 타액의 액화는 복용량 의존적인 것을 나타내는 선형 그래프이다.

도 1b는 Trx에 의한 CF 타액의 액화는 NADPH 의존적인 것을 나타내는 선형 그래프이다.

도 2는 컴팩션 에세이(compaction assay) 재현성에 대한 평가를 나타내는 선형 그래프이다.

도 3a는 Trx 환원 시스템(Trx + 0.1 μM TR + 2 mM NADPH)이 글루타티온 환원 시스템(GSH + 0.1 μM Gr + 2 mM NADPH) 보다 타액을 액화시키는데 강력하다는 것을 나타내는 선형 그래프이다.

도 3b는 Trx 환원 시스템(Trx + 0.1 μM TR + 2 mM NADPH)이 N-아세틸시스테인 (NAC) 보다 타액을 액화시키는데 강력하다는 것을 나타내는 선형 그래프이다.

도 4a는 시험관내 CF 타액의 점탄성(logG^*)에 대한 Trx 용량의 영향을 나타낸다.

도 4b는 시험관내 CF 타액의 점탄성(logG^*)에 대한 NADPH 용량의 영향을 나타낸다.

도 5는 희석 또는 Trx 노출 후 CF 타액의 당단백질의 질량 프로파일을 나타내는 디지털 이미지이다.

도 6은 Trx 노출이 CF 타액에 존재하는 DNA의 용해도를 증가시키는 것을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 한 양태는 과도하게 점성 및 점착력 있는 점액 또는 타액을 가진 환자에게 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자의 점액 또는 타액을 접촉하기 전 보다 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는데 효과적인 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위(active-site)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 양태의 한 가지 관점에서 환자는 비정상적인 또는 과도한 점도 또는 점착력의 점액 또는 타액이 질병의 증상 또는 원인으로서, 이에 제한되지는 않지만 낭포성 섬유증을 포함한 폐 질환을 앓는다.

한 가지 관점에서 환자의 점액 또는 타액과 상기 조성물을 접촉하는 단계는 코, 기관내, 기관지, 폐에 직접 설치 및 호흡으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경로에 의해 환자에게 상기 조성물을 도입함으로써 수행된다. 한 가지 관점에서 접촉시키고자 하는 점액 또는 타액이 환자의 호흡기 계통, 소화기 계통 또는 생식기 계통에 위치한다. 또 다른 관점에서 상기 조성물은 환자에게 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 바람직하게는 환자로부터의 점액 또는 타액 시료의 전체 부피의 액상이 상기 조성물의 투여 후 통계적으로 상당히 증가함을 나타낸다.

본 발명의 한 양테의 한 가지 관점에서 상기 단백질 또는 펩타이드는 환자의 kg 중량 당 약 1.5 mmole 내지 150 mmole의 양으로 환자에게 투여한다. 또 다른 관점에서 상기 단백질이 환자 체내에서 약 5분 내지 약 24시간의 반감기를 갖는다. 한 가지 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 C-X-X-C를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 2)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호 3)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이다. 또 다른 관점에서 상기 단백질은 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 및 포유류의 티오레독신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 티오레독신을 포함한다. 보다 바람직한 관점에서 상기 단백질은 인간의 티오레독신을 포함한다.

본 발명의 한 관점에서 상기 조성물은 단백질의 티오레독신의 활성 부위를 환원시키기 위해 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원 형태)(NADPH)를 추가로 포함한다. 추가의 관점에서 상기 조성물은 티오레독신 환원효소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 처치하기 위한 적어도 하나의 추가 성분(agent)을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 한 가지 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위는 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위는 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 2)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 관점에서 상기 티오레독신 활성 부위는 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호 3)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이다. 또 다른 관점에서 상기 단백질은 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 및 포유류의 티오레독신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 티오레독신을 포함한다. 한 가지 관점에서 상기 단백질은 인간의 티오레독신을 포함한다.

상기 조성물은 추가의 관점에서 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원 형태)(NADPH)를 포함할 수 있다. 추가의 관점에서 상기 조성물은 티오레독신 환원효소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 가진 환자에게 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자의 호흡 계통에서의 점액 또는 타액을 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X, 이때 C는 환원된 상태의 잔기, 를 포함하는 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키고, 이때 조성물의 접촉은 상기 조성물과의 접촉 전보다 환자로부터의 점액 또는 타액 시료에서 액상의 부피를 증가시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 점액 또는 타액의 액화를 유도, 향상 및/또는 증가시키기 위한 환원 상태의 티오레독신 활성 부위(thioredoxin active-site)를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 보다 자세하게 본 발명자들은 티오레독신이 점액 또는 타액의 점도 및/또는 점착력을 감소시켜서 타액 또는 점액을 액화시키는 효과적인 에이전트(agent)임을 발견하였다. 따라서 천연 티오레독신, 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드 또는 그러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 바람직하지 않은 점액 또는 진득한 점성의 타액과 관련된 다양한 질환 또는 질병을 치료하는데 있어서 단독으로 또는 조성물로서 이용될 수 있다. 예를 들어 낭포성 섬유증과 같은 호흡기 질환은 본 발명에 따른 물질과 방법을 사용한 치료에 맞게 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 점액 또는 타액 특히, 비정상적으로 또는 과도하게 점성과 점착력을 갖는 점액 또는 타액의 증가된 액화를 위하여 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질의 용도에 관한 것이다. 상기 단백질은 그러한 비정상적인 또는 과도한 점액 또는 타액에 의해 영향 또는 고통을 받고 있는 환자에게 점액 또는 타액의 액화를 증가시키기에 효과적인 방식과 양으로, 바람직하게는 환자에게 치료학적 효과를 제공할 수 있도록 투여한다.

티오레독신과 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질은 낭포성 섬유증과 같은 질환의 치료에 이용되는 다른 환원제보다 우수한 장점을 갖고 있다. 예를 들어 다른 환원제(예, N-아세틸시스테인(NAC), 나시스텔린(NAL), 디티오트레이톨(DTT))와 달리 티오레독신은 효과적인 (환원) 형태로 순환적으로 재환원될 수 있다. 또한, 티오레독신의 자동-산화(예, 초과산화물, 과산화물, 수산기 라디칼 및 다른 독성 산화 대사물질을 생산)는 NAC, NAL 및 DTT와 같은 다른 환원제와 비교했을 때 낮은 정도로 일어난다. 또한, 티오레독신은 일반적으로 세포외의 공간에 존재하는 천연적으로 발생하는 화합물이므로 티오레독신의 기도(airway)로의 도입은 면역반응을 유도하지 않으며 자극을 유발하지 않는다. 티오레독신은 또한 당화되지 않기 때문에 천연 또는 재조합 형태의 단백질 투여가 선천적 면역반응을 유도하지 않는다. 더욱 중요하게는 티오레독신은 다른 환원제와는 대조되게 처리된 점액 또는 타액을 액상으로 유지할 수 있다는 것이다. 예를 들어 NAC 및 DTT는 일정 시간 후에 "소모(spent)" 또는 산화되어져 이 단계에서 액화된 점액 또는 타액은 보다 점성의 겔(gel) 상태로 되돌아갈 수 있다. 이와 반대로 티오레독신에 의해 생성된 액화는 그것의 환원 시스템에 의한 순환적 재환원 덕분으로 수 시간 동안 지속될 수 있다. 마지막으로 티오레독신은 다른 환원제에 비하여 보다 강력하여 이로운 효과를 달성하기 위해서 다른 에이전트에 비하여 훨씬 적은 용량으로 이용될 수 있다.

상술한 장점 이외에도 티오레독신은 질환 상태에서 그것의 이용성을 감소시키는 다른 이점을 갖고 있다. 예를 들어 티오레독신은 질병 타액(예, 낭포성 섬유증 타액)에 있는 (이에 제한되는 것은 아니지만, 그램 음성 박테리아의 박테리아 세포벽으로부터 유래된 내독소, 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 피오시아닌 및 다른 것들을 포함하는) 특정 박테리아의 독소의 독성을 감소시키는 것으로 예상되는 MnSOD를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(예, White 등에 의한 미국특허 제 5,985,261의 참조, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 또한, 티오레독신은 호흡기 질환의 전반적 치료를 향상시킬 수 있는 항염증 특성을 갖고 있다.

티오레독신(Trx)은 다양한 티올 의존적(thiol-dependent) 세포 환원 반응을 촉매하는 단백질 디설파이드 환원효소이다. 티오레독신(Trx)은 종(species)간에 상당히 보존된 두 개의 레독스-활성 시스테인(redox-active cysteine)을 포함하고 있다. 산화 상태에서 이들 시스테인은 단백질의 삼차원 구조로부터 돌출된 디설파이드 다리 결합을 형성하고 있다(Holmgren Annu Rev Biochem 54:237-271, 1985). NADPH-의존적 티오레독신 환원효소(TR)는 Trx가 디티올/디설파이드 교환 능력을 구비한 전자 캐리어로서의 기능을 하도록 한다(Oblong et al., Biochemistry 32:7271-7277, 1993). 단백질 디설파이드는 Trx에 의해 매개되는 환원 작용의 바람직한 기질이다. 낭포성 섬유증 질병에서 기도 분비물의 지속적인 점성의 성질은 기도의 폐색, 기회 감염균에 의한 감염 및 폐 기능의 약화로 이어진다. 호흡기의 뮤신이 중합화에서 중요한 역할을 담당할 것으로 예상되는 몇 개의 시스테인 도메인을 포함한다는 것이 알려지면서(Bell et al. Biochem. J .357:203-209;2001; Asker et al. Biochem. J. 333;381-387,1998) 본 발명자들은 Trx가 뮤신 디설파이드의 환원에 의해 효과적인 점액질의 용해제(mucolytic)로서 작용할 수 있는지 여부를 확인하고자 노력하였다.

본 발명에 기재된 조사에서 본 발명자들은 시험관 내에서(in vitro) CF 타액의 물리적 및 유동학적 특성에 대한 Trx 환원 시스템(티오레독신, 티오레독신 환원효소 및 NADPH)의 영향을 조사하였다. CF 환자로부터 수득한 타액을 TRX와 이의 환원 시스템[0.1μM 티오레독신 환원효소(TR)+ 2mM NADPH]으로 처리하고 액상 : 겔상의 비율(백분율 액상)을 컴팩션 에세이(compaction assay)에 의해 평가하였다. 낮은 Trx 농도(1μM)에 대한 노출은 타액의 액상의 백분율에서의 상당한 증가를 유발하였다. 백분율 액상에서의 최대의 증가는 30μM Trx에서 일어났다. 추가의 측정은 Trx 환원 시스템에 의한 타액의 액화는 NADPH 농도에 의존적이라는 것을 규명하였다. Trx 환원 시스템의 상대적인 강도는 또한 다른 디설파이드 환원제와도 비교되었다. Trx와는 대조적으로 글루타티온 및 N-아세틸시스테인은 1mM 이하의 농도로 사용되었을 때 타액을 효과적으로 액화시키지 못하였다. 자성의 유동분석계(magnetic microrheometry)에 의해 측정된 타액의 점탄성(viscoelasticity)은 3, 10 또는 30μM의 Trx로 처리한 후 20분에 크게 감소하였다. 유사하게 점탄성에서의 이와 같은 감소는 또한 NADPH 농도에 의존적이었다. 추가의 조사는 Trx 처리는 고분자량 당단백질의 용해도를 증가시키고 세포외 DNA를 타액의 액상으로 재분포시키는 것을 암시하였다. 본 발명에 기술된 조사는 시험관내에서 Trx와 이의 환원 시스템의 촉매 활성 양의 처리는 화농성 CF 타액을 액화시키고 점탄성을 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다. Trx로 처리된 타액에 존재하는 고분자량 당단백질의 증가된 용해도는 뮤신 고분자가 점액질의 용해 과정에서 Trx에 의해 환원되는 기질일 수도 있음을 암시한다.

기도의 점액에 의한 폐색은 CF를 앓고 있는 환자에게서 심각한 이환율과 사망률을 유발할 수 있다. 본 발명자들은 기도내에 이들 분비물의 지속성을 촉진시키는 점탄성은 Trx에 의해 현저하게 감소되는 것을 증명하였다. 이러한 결론은 두 라인(line)의 실험 증거에 의해 지지된다. 먼저, 컴팩션 에세이는 Trx와의 정치(incubation) 중에 다량의 액체가 CF 타액의 겔 매트릭스로부터 방출되는 것을 암시하였다. 이러한 방출이 일어남과 동시에 고체 물질의 부피가 감소하여 타액의 겔 형성 성분이 용해되는 것을 암시하였다. CF 타액의 액화는 정치 기간 중에 CF 샘플에서 주로 관측될 수 있어 원심 분리에 의한 분리를 할 필요가 없다. 기도 표면의 수분 부피의 회복은 CF 상피의 점막과 털에 관련된(mucociliary) 운반 능력을 보존할 수 있기 때문에 Trx에 의한 액체의 방출은 중요한 치료 가능성을 갖는 것으로 예상된다(Jiang et al., Science 262:424-427, 1993). 두 번째, 자성의 유동 분석계 측정은 타액 점탄성은 Trx에 의한 타액 성분의 감소의 결과로서 감소된다는 직접적인 증거를 제공한다.

CF 타액은 액체와 고체의 특성을 모두 보이는 비뉴톤 유체(non-newtonian fluid)이다. 낮은 농도로 용액에 존재할 때 중합체는 자유롭게 회전할 수 있다. 중합체가 농축되거나 그들의 회전이 저해되는 정도까지 교차 연결되면 용액은 퍼콜레이션 역치(percolation threshold)라고 불리는 전이 상태에 도달하게 된다(Forgacs, J. Cell Sci. 108; 213-2143, 1995). 퍼콜레이션 역치에서 용액은 고체의 특징을 수득하기 시작하고 더 많은 교차-고분자 상호작용이 첨가됨에 따라 샘플 중에 각 필라멘트가 매트릭스로 통합될 때까지 탄성 계수(elastic moduli)가 계속적으로 증가한다. 생화학적 분석은 호흡기의 관(tract)을 둘러싼 세포에 의해 분비되는 뮤신 MUC5AC 와 MUC5B가 기도 점액의 주요 겔 형성 중합체 성분이라는 것을 규명하였다(Hovenberg et al. Glycoconj J. 13:839-847, 1996; Thornton et al. Biochem. J. 316:967-975, 1996; Thornton et al. Biochem. J. 272:9561-9566, 1997). 이러한 뮤신에 존재하는 시스테인 도메인이 중합체 형성 및 디설파이드 결합 형성에 의해 근접한 뮤신쇄와 상호작용을 하는데 관여한다(Bell et al. Biochem. J. 357:203-209, 2001; Asker et al. Biochem. J. 333:381-387, 1998). 단백질의 디설파이드 결합은 Trx 효소 활성의 바람직한 기질이기 때문에 본 발명자들은 Trx에 의한 타액의 액화 중에 환원의 표적이 뮤신 중합체라는 가설을 제기하였다. 이러한 가설은 Trx로 처리된 타액에서 고분자량의 글리코형태(glycoform)의 용해도에서의 변화를 규명한 PAS 염색에 의해 지지되었다. Trx에 노출된 타액의 액상에서 더 높은 농도의 당단백질의 검출은 더욱 짙은 황색에 의해 인지되고 희석액으로 처리된 샘플로부터 유래된 액상보다 더 높은 불투명도를 가지고 있다. Trx로 처리된 타액의 PAS로 검출할 수 있는 당단백질의 향상된 전기영동 이동성은 또한 이러한 고분자들이 효소에 의한 환원 중에 크기가 감소되었다는 것을 제시하는 것이다. 이러한 전기영동 분석으로부터 발견한 것은 당단백질의 액상으로의 방출은 Trx에 노출된 중에 겔 매트릭스의 질량이 감소하는 것과 부합된다는 것이 증명됨에 의해서 컴팩션 에세이 측정결과와 일치하는 것이다.

질병에 걸린 CF 폐의 기도 내에서 중성구의 용균은 기도 분비물로 세포외의 DNA 축적을 유발한다(Lethem et al. Eur. Respir. J. 3:19-23, 1990). 비공유 상호작용에 의해 상기 DNA은 뮤신 당단백질 내에서 뒤얽히게 되어 점액 겔 점탄성을 증가시킨다(Sachdev et al. Chest 81:41S-43S, 1982). 본 발명에서 기술된 조사에서 본 발명자들은 타액내에 존재하는 DNA가 Trx 처리 후에 점진적으로 용해되는 것을 확인하였다. 이에 대한 논리적인 해석은 Trx 활성이 DNA와 관련된 고분자간의 뒤얽히는 상호작용을 감소시키기에 충분하도록 겔 매트릭스 내에 구조적 변화를 유발한다는 것이다. 이와 같이 증가된 DNA 용해도가 Trx에 CF 타액이 노출되는 중에 관측되는 점탄성의 변화에 기여하는 것인지 불분명하다. 그럼에도 불구하고 임상적 견해에 의하면 타액의 불용성 겔상으로부터 DNA의 제거는 DNA를 CF의 치료 중에 DNase 활성에 보다 민감하게 만들 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 CF 치료를 위하여 존재하는 "공지의" 치료법과 시너지 효과적으로 작용할 수 있는 강한 잠재력을 갖고 있다.

다른 티올 환원제의 타액 액화 능력과 비교하는 연구에서 Trx는 글루타티온(GSH: 환원된 글루타티온) 환원 시스템 보다 높은 효능이 있음이 증명되었다. Trx는 두 개의 레독스 활성의 시스테인 잔기(디티올)를 갖고 있는 반면에 GSH는 한 개(모노티올)를 갖고 있기 때문에 Trx는 CF 타액의 겔 형성 성분에서의 디설파이드 결합의 환원에 보다 효과적이다. 비순환적 점액질의 용해 약제와 관련하여 DTT는 동일 몰(equimolar)을 기준으로 NAC 용액(또는 Mucomystⓒ) 보다 효과적이다(도 2 및 3 참조; 데이터는 나타내지 않음). 이들 화합물의 효능은 레독스 활성의 시스테인 잔기의 수에 따라 달라질 수 있는데 DTT는 두 개를, NAC는 한 개만을 가지고 있다. 이러한 컴팩션 에세이를 기반으로 하여 이중의 레독스 활성 시스테인을 갖고 있는 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물을 사용하는 효소에 의한 디설파이드 결합 환원은 강력한 점액질 용해 전략이 있을 것으로 기대된다.

요약하면 Trx는 액상 분획은 증가시키고 CF 타액의 점탄성을 감소시킨다. 당단백질 용해도의 증가는 타액을 Trx로 처리하는 중에 일어나고 이것이 이들의 유동학적 변화에 대한 메커니즘일 것이다. 액체의 분비를 촉진시키고 기도 분비물의 점도를 감소시키는 점액 환원 시스템의 개발은 CF 뿐만 아니라 호흡기 계통 질환(예를 들면 만성 또는 급성 기관지염; 기관지 확장증; 급성 기관염; 급성 또는 만성 부비강염; 기도의 급성 또는 만성적 점액에 의한 폐색으로부터 유발되는 무기폐; 세기관지염)과 관련된 과도하거나 비정상적인 점액의 점도 및/또는 점착력의 치료 뿐만 아니라 과도하거나 비정상적인 점액의 점도 및/또는 점착력과 관련되거나 악화된 다양한 소화기 계통 또는 생식기 계통 질병(예를 들면, 점액의 농화에 의한 급성, 아급성 또는 만성의 장 폐색; 생식 기관의 폐색에 의한 불임)의 치료에 치료학적 잠재력을 갖는 것으로 기대된다. Trx는 당화 및 해독후 번역이 결여된 천연 단백질이고 일반적으로 세포외의 공간에서 적은 양으로 존재하기 때문에 이들의 장기 투여는 면역 시스템에 의해 용인될 수 있다.

따라서 본 발명의 한 양태는 과도하게 점성 또는 점착성인 점액 또는 타액을 갖는 환자에게서 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물로 환자의 점액 또는 타액을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 단백질은 접촉 단계 이전과 비교했을 때 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는데 효과적이다.

본 발명에 있어서, 용어 "점액"은 호흡기, 소화기 및 생식기를 포함한 신체의 다양한 조직에 있는 점막(mucous membrane)에 의해 분비되는 투명한 점질의(viscid) 유체를 의미한다. 점액은 그것이 분비되는 조직을 습하게 하고, 매끄럽게 하며 보호한다. 이는 점액의 겔 형성 성분인, 뮤신 고분자를 포함한다. 정상적인 점액의 점탄성 특성은 농도, 분자량 및 뮤신 중합체간의 뒤얽힘에 따라 달라진다. 용어 "타액"은 침(saliva)과 점액을 포함하여 호흡기의 통로(passage)로부터 나온 방출물(discharge)의 혼합물을 의미하는 것이다. 타액은 일반적으로 배출된 침과 점액 (및 호흡기의 조직으로부터 나온 다른 방출물)의 혼합물이다. 따라서 점액은 타액의 일차 성분이고 그에 의하여 타액 중에 과도하게 점성인 점액이 존재하는 것은 그 자체로 과도하게 점성인 타액을 생성한다. 용어 "액화"는 액체가 되는 과정을 의미한다. 따라서 점액 또는 타액의 액화의 증가는 보다 고상 또는 점성인 상태와 비교했을 때 점액 또는 타액의 액상에서의 증가를 의미한다.

신체에서 점액 및 타액의 일반적인 기능은 점액(및 타액의 점액 성분)은 점탄성의 성질을 갖는 것을 요구한다. 정상 점액 및 타액(즉, 건강한 개인 또는 보다 자세하게는 점액 또는 타액의 점도 또는 점착성에 의해 유발되거나 악화된 증상 또는 질환을 앓고 있지 않는 개인)을 가진 개인에게서 점탄성은 농도, 고분자량 및 뮤신 중합체간의 뒤얽힘에 따라 달라진다(Verdugo et al. Biorheology 20:223-230, 1983). 점액 중에 뮤신은 죽은 염증 세포에서 방출된 DNA(Potter et al. Am. J. Dis. Child 100:493-495, 1960; Lethem et al. Am. Rev. Respir. Dis. 100;493-495, 1990; Lethem et al. Eur. Respir. J. 3:19-23, 1990) 및 f-액틴 중합체와 상호작용하게 되면(Sheils et al. Am. J. Path. 148:919-927, 1996; Tomkiewicz et al. DNA and actin filament unltrastructure in cystic fibrosis sputum,. In: Cilia, mucus, and mucociliary interactions, edited by Baum G.L. Priel Z. Roth Y. Liron N. and Ostfeld E.J. NEW YORK: Marcel Dekker, 1998) 점액(및 타액)은 CF 타액처럼 보다 더 밀도 있고 점성을 갖게 된다. 기침 또는 점막과 털의 청결에 의해 그러한 점액을 제거할 수 없게 되면 폐에 기회 감염균 병소의 군집화가 촉진된다. 따라서 비정상적이거나 과도한 점성 및/또는 점착력이 있는 점액은 정상 또는 건강한 사람의 점액 보다 측정 또는 검출할 수 있을 정도로 더욱 점성 또는 점착력이 있는 점액 및/또는 그것의 점도 및/또는 점착력에 의하여 환자에게 불편함 또는 고통을 유발하거나 질환 또는 질병을 유발하거나 악화시켜서 환자에게 적어도 하나 이상의 증상을 유발하거나 일으키는 점액으로 특징지어진다. 다시 말해서 비정상적으로 또는 과도하게 점성 및/또는 점착력이 있는 타액은 정상적인 점액 또는 타액으로부터의 이탈이며 이 때 질환을 다소 완화시키거나 다른 치료학적 이익을 제공하여 환자를 치료하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법과 조성물은 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 것이 바람직한 임의의 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 특히, 특정 폐, 동(sinus), 비(nasal), 소화기 또는 생식기 계통의 질병 또는 질환을 가진 환자는 본 발명의 방법을 사용한 치료로부터 효과를 볼 수 있다. 본 발명은 폐 관련 질병인 낭포성 섬유증을 포함하여 점액 또는 타액의 비정상적인 또는 과도한 점성 및/또는 점착력으로 인하여 유발되거나 악화되는 질환 또는 질병의 적어도 하나의 증상을 개선 또는 감소시키는데 가장 유용하다. 다른 질병들이 일시적으로 점액 또는 타액의 비정상적인 또는 과도한 점도 및/또는 점착력과 관련있을 수 있으며 그러한 증상이 발생하였을 때 본 발명의 방법은 점액 또는 타액의 액화를 증가시키고 환자에게 적어도 약간의 완화와 치료학적 효과를 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 그러한 질병의 예에는 이에 제한되는 것은 아니지만 낭포성 섬유증; 만성 또는 급성 기관지염; 기관지 확장증(비-CF 및 CF 기관지 확장증); (박테리아성, 바이러스성, 미오플라즈마성 또는 다른 유기체에 의해 유발된) 급성 기관염; 급성 또는 만성 부비강염; (때때로 천식과 같은 다양한 질병에서 보여지는) 점액에 의한 기도의 급성 또는 만성적 폐색으로부터 유발되는 무기폐(폐 또는 대엽의 붕괴); (바이러스성 또는 다른 것에 의한) 세기관지염; 이에 제한되는 것은 아니지만 CF 또는 유사한 질병에서 용변 또는 이의 등가물을 포함한 점액의 농화에 의한 급성, 아급성 또는 만성 장 폐색; 및 (이에 제한되는 것은 아니지만) 자궁 경부, 정관 또는 다른 생식 구조물의 폐색으로 인한 불임을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물과 방법은 바이러스 및 박테리아 모두에 의한 감염을 포함한 다양한 호흡기의 감염을 가진 환자에게서 점액 또는 타액의 과도한 점성 및/또는 점착력과 관련된 증상들을 감소시키는데 유용할 수 있다.

이에 따라 치료학적 효과는 특정 질병 또는 질환을 필수적으로 치료하기 보다는 일반적으로 질병 또는 질환의 완화, 질병 또는 질환의 제거, 질병 또는 질환과 관련된 증상의 감소 또는 제거, 일차 질병 또는 질환의 발병으로부터 유발된 이차 질병 또는 질환의 예방 및 완화(예, 호흡기의 관에 있는 과도하게 점성인 점액으로 인하여 기회 감염균 미생물에 의해 유발되는 감염 질병) 및/또는 질병 또는 질환 또는 상기 질병 또는 질환과 관련된 증상의 예방을 포함한 결과를 내포한다. 본 발명에서 용어 "질병으로부터 보호된"이란 질병의 증상을 감소; (치료 효과 없이 질병이 증상을 경감시키거나 가볍게 하는) 완화 치료; 질병의 발병률을 감소, 및/또는 질병의 심도를 감소시키는 것을 의미한다. 환자를 보호한다는 것은 환자에게 투여되었을 때 질병이 발병하는 것을 예방하고/거나 질병 또는 질환의 증상, 신호 또는 원인 중 어느 하나를 완화시키는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 의미한다. 그에 의하여 질병으로부터 환자를 보호한다는 것은 질병의 발병을 예방하고(예방학적 치료) 및 질병을 가진 환자를 치료하는(치료학적 치료)것 모두를 포함한다. 특히 환자를 질병으로부터 보호하는 것은 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드로 점액 또는 타액을 접촉시켜 이로운 효과를 달성함에 의하여 환자의 점액 또는 액화를 증가시켜서 달성된다. 이로운 효과는 당업자 또는 환자를 치료하는 숙련된 의료진에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 용어 "질병"은 정상적인 건강한 상태로부터의 이탈을 의미하며 질병의 증상이 존재하는 상태를 포함할 뿐만 아니라 이탈(예, 감염, 유전자 돌연변이, 유전자 결함 등)이 일어난 상태지만 증상이 드러나지 않은 질환(condition)을 포함한다.

환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 환자의 점액 또는 타액의 접촉은 조성물과의 접촉 전과 비교했을 때 점액 또는 타액의 증가된 액화를 유발하도록 의도된다. 본 발명에서 점액 또는 타액의 액화에서의 증가는 액화 전과 비교했을 때 점액 또는 타액의 액화 정도에서의 측정 또는 검출할 수 있는 증가일 수 있으며 바람직하게는 통계학적으로 현저한 증가이다(즉, 환자의 샘플과 기준 대조군간의 측정된 액화의 차이는 p<0.05의 신뢰도로 통계학적으로 현저하다). 일반적으로 정상적인 건강한 개인은 일반적으로 대조군으로 작용하기에 충분한 양의 타액을 생산하지 못하기 때문에 정상의 건강한 개인으로부터 나온 타액이 기준 대조군으로서 배제되지 않지만 "기준 대조군"은 치료제의 투여전 환자의 샘플이다. 점액 또는 타액의 액화는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있는데 이에 제한되는 것은 아니지만 실시예에서 기술될 컴팩션 에세이를 포함한다. 그러한 에세이에서 고상(겔) 대 수용상(액체)에서의 점액 또는 타액의 양이 측정된다. 본 발명의 한 측면에서 점액 또는 타액의 상대적인 점도 또는 점착력은 이에 제한되는 것은 아니지만 (예를 들면 자성의 유동측정계에 의해 측정되는) 점탄성, 당단백질 함량 또는 DNA 함량을 포함한 다른 변수 또는 지시자(indicator)를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서 액화 정도는 점액 또는 타액 샘플의 총 부피의 백분율로서 수용(액체)상에 존재하는 주어진 점액 또는 타액 샘플의 양으로서 기술된다. 낭포성 섬유증을 갖고 있는 환자에게서 예를 들면 점액 또는 타액의 액화 정도는 전체 부피의 10% 이하 또는 심지어 5% 이하일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 단백질 또는 조성물과 점액 또는 타액의 접촉은 전체 부피의 적어도 약 15% 이상이 액상, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 20% 이상이 액상, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 25% 이상이 액상, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 30% 이상이 액상, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 35% 이상이 액상, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 40% 이상이 액상이고, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 45% 이상이 액상이고, 보다 바람직하게는 전체 부피의 적어도 약 50% 이상이 액상이 되도록 점액 또는 타액의 변화를 유발하거나 점액에 의해 유발된 기능의 차단 또는 저해가 제거될 때까지이다(예, 환자의 기도가 유체를 뱉어낼 수 있을 때까지). 일반적으로 점액 또는 타액의 액화는 기도 또는 다른 차단된 통로(예, 소화기 또는 생식기)가 청결해질 때까지 과도하게 타액을 액화시키지 않은 채 조금씩 점진적인 증가분으로 증가하는 것이 바람직하다. 점액 또는 타액의 과도한 액화는 그것이 환자에게 해로운 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하지 않다(예, 타액이 환자에 의해 제거되기 전에 액화된 타액은 뒤로 흐르거나 감염된 얇은 액체로 작은 기도로 흐를 수 있다). 바람직하게는 본 발명의 단백질, 펩타이드 또는 조성물과 점액 또는 타액을 접촉시키는 것은 치료 전과 비교했을 때 점액 또는 타액의 액화로 부피에서 적어도 약 1%의 증가 보다 바람직하게는 적어도 약 2%의 증가 그리고 환자의 기도 또는 다른 막힌 통로가 청결하게 될 때까지 1%의 증가분으로 생산한다.

한 측면에서 치료는 환자의 영향을 받은 조직(호흡기의 관, 소화기의 관, 생식기의 관)으로부터 유래된 얇은 물질을 제거하는 방법과 병행하여 수행하는 것이다. 예를 들어 폐 시스템의 경우에 본 발명의 방법은 자세에 의한 배출, 거친 재재기 및 다른 호흡기의 운동 또는 액화된 점액 또는 타액을 배출하기에 적합한 다른 방법과 병행하여 이용될 수 있다.

본 발명에서 치료될 환자의 점액 또는 타액은 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 (또는 단백질을 포함하는 조성물)과 접촉시킨다. 단백질은 접촉 단계 이전과 비교했을 때 타액 또는 점액의 점도 및 점착력을 감소시키고/거나 타액 또는 점액의 액화를 증가시키기에 충분하다. 앞서 기술된 바와 같이 티오레독신은 많은 티올-의존적 세포 환원 반응을 수행하는 많은 유기체에서 발견되는 단백질 디설파이드 환원효소이다. 인간에서 티오레독신은 성인의 T 세포 백혈병 유래 인자(leukemia-derived factor; ADF)를 의미하기도 한다. 세포간에서 이러한 유비쿼터스 저분자량의 단백질(11,700)은 환원된 상태이다. 환원 또는 산화 티오레독신은 손상되지 않은 세포에 유입 또는 세포 맴브레인에 흡수될 수 있으며 여기서 일정 시간 후 적은 양이 점진적으로 습득된다. 이는 활성 부위에 산화된 단백질에서는 단백질의 삼차원 구조로부터 돌출된 부분에 위치한 디설파이드 다리 결합을 형성하는 두 개의 이웃한 시스테인 잔기를 갖고 있다. 플라보단백질 티오레독신 환원 효소는 이러한 디설파이드의 NADPH-의존적 환원을 촉매한다. 티오레독신의 약간의 증가는 단백질에서 설피드릴-디설파이드 레독스 상태에서의 충분한 변화를 유발할 수 있다.

세포 단백질의 환원에 영향을 미치는 이들의 능력 외에도 티오레독신은 다른 티올과는 달리 자발적 산화(예, 자동 산화를 통하여 초산화물의 라디칼을 생성하는 것)에 의해 세포에서의 산화 스트레스를 유발하지 않음에도 불구하고 항산화제(예, 반응성 산소 종을 제거함에 의해 산화할 수 있는 기질의 산화를 방지함에 의해)로서 직접적으로 작용하다는 것이 인식되었다. 상기된 White 등에 의한 미국특허 제 5,985,261호는 티오레독신이 MnSOD의 생산을 직접적으로 유도하며 그러한 유도는 환원 상태의 티오레독신에 의해 영향을 받는다는 것을 보여주었다.

본 발명의 "티오레독신 활성 부위"는 아미노산 서열 C-X-X-C를 포함한다. 본 발명에서 "C"로 표기된 아미노산 잔기는 시스테인 잔기이고"X"로 표기된 아미노산 잔기는 임의의 아미노산 잔기, 특히 20개의 표준 아미노산 잔기 중 어느 하나이다. 본 발명의 티오레독신 활성 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 C-G-P-C(서열번호 :1)를 포함한다. 티옥레독신 활성 부위는 추가로 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 티오레독신 활성 부위는 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 :2)를 포함하며, 여기서 "G"로 표기된 아미노산 잔기는 글리신 잔기이고 "P"로 표기된 아미노산 잔기는 프롤린 잔기이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 티오레독신 활성 부위는 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호: 3)을 포함하며 여기서 "W"로 표기된 아미노산 잔기는 트립토판 잔기이고 "K"로 표기된 아미노산 잔기는 리신 잔기이다.

본 발명의 한 측면에서 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질은 전장의(full-length) 티오레독신 단백질 또는 구조적 및 기능적으로 상기된 바와 같은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 이들의 단편이다. 바람직한 티오레독신 단백질은 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 및 포유동물의 티오레독신이며 사람의 티오레독신이 특히 바람직하다. 다양한 유기체로부터 유래된 티오레독신의 핵산과 아미노산 서열이 공지되어 있으며 본 발명에 통합된다. 예를 들어, 서열번호: 4 내지 15는 슈도모나스 시린재 (서열번호: 4), 포르피로모나스 진지발라스 (서열번호: 5), 리스테리아 모노시토제네스 (서열번호: 6), 사카로미세스 세레비시아애 (서열번호: 7), 갈러스 갈러스 (서열번호: 8), 무스 무스걸러스 (서열번호: 9), 라투스 노르베기쿠스 (서열번호: 10), 보스 타우루스 (서열번호: 11), 호모 사피언스 (서열번호: 12), 아라비도프시스 탈리아나 (서열번호: 13), 제아 마이스 (서열번호: 14), 오리자 사티바 (서열번호: 15)로부터 유래된 티오레독신의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 서열의 각각에 대하여 X-C-G-P-C-X(서열번호: 2) 모티브(이는 서열번호: 1의 CPGC 모티브를 포함한다)는 다음과 같이 확인된다: 서열번호:4(33-38번째), 서열번호:5(28-33번째), 서열번호:6(27-32번째), 서열번호:7(29-34번째), 서열번호:8(31-36번째), 서열번호:9(31-36번째), 서열번호:10(31-36번째), 서열번호:11(31-36번째), 서열번호:12(31-36번째), 서열번호:13(59-64번째), 서열번호:14(89-93번째) 및 서열번호: 15(94-99). 추가로, 사람과 박테리아의 티오레독신을 포함한 몇 개의 티오레독신 단백질의 삼차원 구조가 밝혀져 있다. 따라서 다수의 유기체로부터 유래된 티오레독신의 구조와 활성 부위는 당업계에 알려져 있고 당업자는 본 발명에서 사용될 수 있는 전장의 티오레독신의 단편 또는 상동체를 용이하게 동정하고 생산할 수 있을 것이다.

용어 "환원 상태"는 특히 본 발명의 단백질 또는 펩타이드이 활성 부위에서의 시스테인 잔기를 상태를 기술한다. 환원 상태에서 상기 시스테인 잔기는 디티올을 형성한다(즉, 두개의 유리 설프히드릴기 -SH). 이와는 반대로 산화 상태에서 상기 시스테인 잔기는 분자내의 디설파이드 다리 결합을 형성하고 있다; 그러한 분자는 시스틴이라고 기재된다. 환원 상태에서 티오레독신 활성 부위는 그의 활성 부위의 디티올을 디설파이드로 가역적인 산화 반응을 통하여 레독스 반응에 관여할 수 있으며 티올-디설파이드 교환 반응을 촉매한다.

티오레독신 활성 부위를 함유하는 본 발명의 단백질은 상기된 티오레독신 활성 부위이거나 글리코시드 결합에 의해 다른 아미노산과 결합한 티오레독신 활성 부위일 수도 있다. 따라서 본 발명에 따른 단백질 또는 펩타이드의 최소한의 크기는 약 4 내지 약 6개의 아미노산이며, 바람직한 크기는 그러한 단백질의 전장, 융합, 다가화 또는 최소한의 기능적 부위가 바람직한지에 따라 달라진다. 바람직하게는 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 길이는 약 4 내지 100개의 아미노산 잔기 또는 그 이상으로 연장되어 전체 정수내(즉, 4, 5, 6, 7,...99, 100, 101,...) 임의의 길이의 펩타이드가 특히 구상될 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서 본 발명의 단백질은 전장의 단백질 또는 그러한 단백질의 상동체일 수 있다. 본 발명에서 용어 "상동체"는 천연적으로 발생하는 단백질 또는 펩타이드에 대한 변형에 의해 천연적으로 발생하는 단백질 또는 펩타이드(즉, "프로토타입" 또는 "야생형" 단백질)와는 상이하지만 천연적으로 발생하는 형태의 기본 단백질과 측쇄(side chain) 구조를 유지하고/거나 천연 단백질의 적어도 생물학적으로 활성인 부분(예, 티오레독신 활성 부위)의 기본 삼차원 구조를 유지하는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 그러한 변화는 이에 제한되는 것은 아니지만 하나 또는 몇몇 아미노산 측쇄에서의 변화; 결실(예, 단백질 또는 펩타이드의 절단형(단편)), 삽입 및/또는 치환을 포함한 하나 또는 몇몇 아미노산의 변화; 하나 또는 몇몇 원자의 입체화학에서의 변화; 및/또는 이에 제한되는 것은 아니지만 메틸화, 당화, 인산화, 아세틸화, 미리스톨화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜이노시톨의 첨가를 포함한 약간의 유도체화를 포함한다. 본 발명에서 천연의 티오레독신 단백질의 상동체를 포함한 본 발명에서 유용한 임의의 단백질 또는 펩타이드는 환원 상태로서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 활성 부위 디티올의 디설파이드로의 가역적인 산화 반응을 통한 레독스 반응, 디티올-디설파이드 교환 반응을 촉매 및/또는 점액 또는 타액의 점도 또는 점착력을 감소시키거나 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는데 관여할 수 있는 티오레독신 활성 부위를 갖는다. 본 발명에서 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 티오레독신과 유사한 특징을 가질 수 있으며 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 또는 포유동물의 티오레독신의 그룹으로부터 선택된 티오레독신인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서 단백질은 사람의 티오레독신이다.

상동체는 천연의 대립형질 변이 또는 천연의 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산의 천연적으로 발생하는 대립형질 변이체는 상기 단백질을 암호화하는 유전자와 게놈상에서 실질적으로 동일한 위치에서 존재하는 유전자이지만 예를 들면 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발된 천연의 변이에 의해 유사하지만 동일하지 않은 서열을 갖게 된다. 대립형질 변이체는 비교 대상이 되는 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성과 동일한 활성을 갖는다. 한 부류의 대립형질 변이체는 유전자의 코드의 축퇴성으로 인하여 상이한 핵산 서열을 갖지만 동일한 단백질을 암호화할 수도 있다. 대립형질 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3'비해독 영역(예, 조절 영역)에서의 변이를 포함할 수도 있다. 대립형질 변이체는 또한 당업계에 공지되어 있다.

상동체는 이에 제한되는 것은 아니지만 분리된, 천연적으로 발생한 단백질에 대한 직접적인 변형, 직접 단백질 합성 또는 무작위적 또는 표적화 돌연변이를 일으킬 수 있는 예를 들면 전통적인 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 변형을 가하는 방법을 포함한 단백질의 제조 방법과 관련하여 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

야생형 단백질과 비교했을 때 상동체에서의 변형은 천연적으로 발생한 단백질과 비교했을 때 상동체의 기본적인 생물학적 활성을 항진, 길항 또는 실질적으로 변화를 일으키지 않을 수 있다. 일반적으로 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체내(즉, 단백질의 천연의 생리학적 환경) 또는 시험관내(즉, 실험실 조건 하에서)에서 측정되거나 관측된 천연적으로 발생하는 형태의 단백질에 의해 보여지고 수행되는 임의의 기능을 의미한다. 상동체 또는 (후술하는) 모방체와 같은 단백질의 변형은 천연적으로 발생하는 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 천연적으로 발생하는 단백질과 비교했을 때 감소된 또는 증가된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성시킬 수 있다. 단백질의 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 감소시키는 변형은 단백질의 (완전한 또는 부분적인) 불활성화, 하향 조정 또는 단백질의 감소된 활성을 의미한다. 유사하게 단백질 발현을 증가시키거나 단백질의 활성을 증가시키는 변형은 증폭, 과잉생산, 활성화, 향상, 상향 조정 또는 단백질의 증가된 작용을 의미한다.

한 양태에서 티오레독신의 펩타이드 또는 비펩타이드 상동체를 포함한 티오레독신 단백질의 상동체는 약제의 설계 또는 선별의 생산물일 수 있으며 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 상동체는 모방체로 기술할 수 있다. 모방체는 생물학적으로 발생하는 펩타이드의 기본 구조를 모방한 기본 구조를 가지고/거나 천연적으로 발생하는 펩타이드의 현저한 생물학적 특성을 갖고 있기 때문에 천연적으로 발생하는 펩타이드의 생물학적 작용을 모방할 수 있는 임의의 펩타이드 또는 비펩타이드 화합물을 의미한다. 모방체는 이에 제한되는 것은 아니지만 천연적으로 발생한 펩타이드와 측쇄 유사도가 없도록 프로토타입에 실질적으로 변형이 가해진 펩타이드(그러한 변형은 예를 들면 분해에 대한 민감성을 감소시킬 수 있다); 항-이디오타이프 및/또는 촉매성 항체 또는 이들의 단편; 분리된 단백질의 비단백질 부분(예, 탄수화물 구조물); 예를 들면 조합 화학(combinatorial chemistry)을 통하여 동정된 핵산 및 약제를 포함한 합성 또는 천연의 유기 물질을 포함할 수 있다. 그러한 모방체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 설계, 선별 및/또는 동정될 수 있다. 본 발명에서 유용한 모방체 또는 다른 치료학적 화합물을 설계 또는 선별하는데 유용한 다양한 약제 설계의 방법이 Maulik et al. 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Application and Strategies, Wiley-Liss, Inc.,에 개시되어 있으며, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다.

모방체는 예를 들면 분자의 다양화 전략(거대하고 화학적으로 다양한 분자의 라이브러리의 신속한 구축을 가능하게 하는 관련된 전략들의 조합), 천연 또는 합성 화합물의 라이브러리, 특히 화학물질 또는 조합물질의 라이브러리(즉, 유사한 빌딩 블록(building block)을 갖고 있지만 서열 또는 크기에서 상이한 화합물의 라이브러리)로부터 또는 근본적, 직접적 또는 무작위적 약제 설계에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, Maulik 등을 참조한다.

분자 다양화 전략에서 거대한 화합물 라이브러리는 예를 들면 생물학적, 효소학적 및/또는 화학적 방식을 이용하여 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 탄수화물 및/또는 합성된 유기 분자로부터 합성될 수 있다. 분자의 다양화 전략을 개발하는데 있어서 중요한 변수는 서브유니트(subunit)의 다양화, 분자 크기 및 라이브러리 다양화를 포함한다. 그러한 라이브러리를 스크리닝하는 일반적인 목표는 조합적 선별의 연속적 적용을 이용하여 원하는 표적에 대한 높은 친화성의 리간드를 수득하고 그 다음 그 리드(lead) 분자를 무작위적 또는 지정된 설계 전략에 의해 최적화하는 것이다. 분자의 다양화 전략은 상기된 Maulik et al.에 자세히 설명되어 있다.

Maulik et a.l은 예를 들면 사용자가 적합하게 선별된 단편의 단편 라이브러리로부터 신규한 분자를 창조하는 과정을 지시하는 직접적인 설계 방법; 사용자가 후보 리간드의 적합성을 평가하기 위하여 선별 기준을 적용함과 동시에 무작위적으로 돌연변이된 단편과 이들의 조합에 유전적 또는 다른 알고리즘을 사용하는 무작위적 설계 및 사용자가 삼차원 수용체 구조와 작은 단편 프로브간의 상호작용 에너지를 계산하고 이어서 선호되는 프로브 부위들 간의 결합시키는 그리드 기반 접근법(grid-based approach)을 개시하고 있다.

본 발명의 한 양태에서 본 발명에 이용하기에 적합한 단백질은 티오레독신 단백질의 전장 서열 또는 본 발명에서 기술된 바와 같은 티오레독신 활성 부위를 갖는 이의 임의의 단편을 포함하는, 필수적으로 구성하는 또는 구성하는 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어 본 발명에서 기술된 티오레독신 활성 부위를 함유하는 서열번호 : 4 내지 12 중 어느 하나 또는 이들의 단편 또는 이들의 다른 상동체가 본 발명에 의해 포함된다. 그러한 상동체는 전장 티오레독신 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 10% 이상 동일한, 적어도 20%이상 동일한, 적어도 30%이상 동일한, 적어도 40%이상 동일한, 적어도 50%이상 동일한, 적어도 60%이상 동일한, 적어도 70%이상 동일한, 적어도 80%이상 동일한, 적어도 90%이상 동일한, 적어도 95%이상 동일하거나, 10% 내지 100%내 전체 정수 중 임의의 백분율(10%, 11%, 12%,....98%, 99%, 100%)로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한 동일성%에 대한 언급은 (1) 아미노산 조사용 blastp 및 핵산 조사용 blastn과 표준 디폴트 변수를 사용한 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 조사; 여기서, 질문(query) 서열은 디폴트에 의해 복잡성이 낮은 영역에 대해 필터링된다 (참조: Altschul, S. F. , Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다); (2) BLAST 2 정렬(하기 기재한 변수를 사용함); (3) 및/또는 표준 디폴트 파라미터를 사용한 PSI-BLAST(Position Specific Iterated BLAST)를 사용하여 수행하는 상동성 평가를 의미한다. BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 간에 표준 파라미터의 몇 가지 차이가 있기 때문에, BLAST 2 프로그램을 사용하는 경우에 2개의 특이적 서열이 유의적 상동성을 갖는 것으로 인정될 수 있는 반면에, 질문 서열로서 서열들 중 하나를 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST으로 수행한 조사는 제 2 서열을 최상의 매치로서 식별하지 않을 수 있음이 주지된다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체를 고찰하기 위한 민감한 방법으로서, 사용이 용이한 자동화 형태의 "프로필" 조사를 제공한다. 상기 프로그램은 먼저, 갭이 있는(gapped) BLAST 데이터베이스 조사를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 다음 라운드의 데이터베이스 조사를 위해 질문 서열을 대신하게 되는 위치-특이적 스코어 행렬을 구축하기 위해 복귀된 임의의 유의적 정렬로부터의 정보를 사용한다. 따라서, 동일성%는 이들 프로그램 중 어느 하나를 사용함으로써 측정할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

2개의 특이적 서열을 문헌[참조: Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다]에 기재된 바와 같이 BLAST2 서열을 사용하여 서로 정렬할 수 있다. 생성된 정렬에 갭(결실 및 삽입)의 도입을 허용하면서 상기 두 서열 간에 갭이 있는 BLAST 조사(BLAST 2.0)를 수행하기 위해 BLAST 2 서열 정렬은 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 blastp 또는 blastn으로 수행한다. 본 발명에서 명료성의 목적상, BLAST 2 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 변수를 사용하여 수행한다.

blastn의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:

매치에 대한 보상값=1

미스매치에 대한 패널티= -2

오픈 갭(5) 및 신장 갭(2) 페널티

갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(11) 필터(적용)

blastp의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:

오픈 갭(11) 및 신장 갭(1) 페널티

갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(3) 필터(적용).

본 발명에서 유용한 단백질은 전장 티오레독신 단백질(예, 서열번호: 4 내지 12)의 적어도 약 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 또한 포함할 수 있다(즉, 대조 서열의 10개의 인접한 아미노산 서열과 100% 동일성을 갖는 10개의 인접한 아미노산 잔기). 바람직한 양태에서, 티오레독신 단백질의 상동체는 천연적으로 발생하는 티오레독신 단백질의 아미노산 서열의 적어도 약 15개 이상, 적어도 약 20개 이상, 적어도 약 25개 이상, 적어도 약 30개 이상, 적어도 약 35개 이상, 적어도 약 40개 이상, 적어도 약 45개 이상, 적어도 약 50개 이상, 적어도 약 55개 이상, 적어도 약 60개 이상, 적어도 약 65개 이상, 적어도 약 70개 이상, 적어도 약 75개 이상 및 적어도 약 80개 이상 단백질의 전장 서열까지 전체 정수(10, 11, 12)내 임의의 길이의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 이용된 용어 "인접한"또는 "연속적인"은 중단되지 않은 서열에서 연결된 것을 의미한다. 예를 들어 제 1 서열이 제 2서열의 30개의 인접한(또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은 상기 제 1 서열이 제 2서열의 중단되지 않는 30개 아미노산 잔기의 서열과 100% 동일한 중단되지 않은 30개 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 의미한다. 유사하게 제 1 서열이 제 2 서열과 "100% 동일성"은 갖는다는 것은 상기 제 1 서열과 제 2서열이 뉴클레오타이드 또는 아미노산 간의 갭(gap)없이 정확하게 일치한다는 것을 의미한다.

다른 양태에서 본 발명에서 이용 가능한 단백질은 천연의 티오레독신 아미노산 서열과 충분히 유사하여 상동체를 암호화하는 핵산 서열은 (후술하는) 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건 하에서 천연의 티오레독신 단백질을 암호화하는 핵산 분자(즉, 천연의 티오레독신 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 가닥의 상보체)에 혼성화할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 그러한 혼성화 조건은 이하에서 상세히 설명한다.

본 발명의 티오레독신 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 핵산 서열의 상보체는 티오레독신을 암호화하는 가닥에 상보적인 핵산 가닥의 핵산 서열을 의미한다. 주어진 아미노산 서열을 암호화하는 이중 가닥의 DNA는 단일 가닥의 DNA와 상기 단일 가닥의 DNA에 상보적인 서열을 갖는 상보적 서열이다. 이에 의하여 본 발명의 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 티오레독신 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 상보체와 엄격한 혼성화 조건하에서 안정적인 혼성체를 형성하는 그러한 핵산 분자를 포함한다. 상보적인 서열을 추정하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 발명에서 혼성화 조건은 임의의 핵산 분자가 동일한 핵산 분자를 동정하기 위하여 이용될 수 있는 표준 혼성화 조건을 의미한다. 그러한 표준 조건은 예를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labs Press, 1989에 개시되어 있다. 상기 문헌 Sambrook et al.은 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다(특히 페이지 9.31-9.62 참조). 또한, 뉴클레오타이드의 부정합(mismatch) 정도를 다양화하는 혼성화를 달성하기에 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는 공식은 예를 들어 Meinkoth et al. 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284에 개시되어 있다. 상기 문헌 Meinkoth et al.은 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.

보다 자세하게는 본 발명에서 기술된 온화한 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 70% 이상의 핵산 서열 동일성 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 의미한다(즉, 약 30% 이하의 뉴클레오타이드의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 20% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 매우 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 10% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 앞서 기재된 바와 같이 당업자는 이러한 특정한 뉴클레오타이드 부정합 정도를 달성할 수 있는 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는데 Meinkoth et al.에 기술된 공식을 사용할 수 있다. 그러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 혼성체가 형성되는지에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 혼성체에 대하여 계산된 용융 온도는 DNA:RNA 혼성체 보다 10℃이하이다. 특정한 양태에서, DNA:DNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 적합한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na⁺)의 이온 강도로 약 20℃ 내지 약 35℃(낮은 엄격성), 보다 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃(높은 엄격성), 보다 더 바람직하게는 약 35℃ 내지 45℃의 온도(보다 높은 엄격성)에서의 혼성화를 포함한다. 특정 양태에서, DNA:RNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 유사하게 엄격한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na⁺)의 이온 강도로 약 30℃ 내지 약 45℃, 보다 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃, 보다 더 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 이러한 수치는 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 0% 포름아미드 및 약 40%의 G+C 함량의 분자에 대한 용융 온도의 계산에 기반을 둔다. 선택적으로 T_m은 위에서 인용된 Sambrook et al. 페이지 9.31 내지 9.62에 기술된 바에 따라 실험적으로 계산될 수도 있다. 일반적으로 세정 조건은 가능한 엄격해야 하고 선택된 혼성화 조건에 적합해야 할 것이다. 예를 들어, 혼성화 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 T_m 보다 약 20-25℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함할 수 있으며, 세정 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 T_m 보다 약 12-20℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함한다. DNA:DNA 혼성체에 이용하기에 적합한 혼성화 조건의 한 예는 약 42℃에서의 6X SSC(50% 포름아미드)에서 2-24시간 혼성화하고 실온에서 약 2X SSC로 한 차례 이상 세정하고 이어서 더 높은 온도와 더 낮은 이온 강도에서 추가로 세정(예, 약 37℃에서 약 0.1X-0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정한 후 68℃에서 약 0.1X 내지 0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정)하는 세정 단계를 포함한다.

본 발명의 단백질은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 절편과 다양한 기능을 갖고 있는 융합 절편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어 그러한 융합 절편은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 결과적으로 형성된 융합 단백질을 정제할 수 있는 것과 같이, 본 발명에 따른 단백질의 정제를 간단히 하는 도구로서 작용할 수 있다. 적합한 융합 절편은 목적한 기능(예, 단백질에 증가된 안정성 부여, 단백질에 증가된 면역성 부여 및/또는 단백질 정제의 간편화)을 갖는 임의의 크기의 도메인일 수 있다. 본 발명의 범위내에서 하나 이상의 융합 절편을 사용할 수 있다. 융합 절편은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 절편의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 결합될 수 있다. 융합 단백질의 융합 절편과 티오레독신 활성 부위를 함유하는 도메인 간의 연결은 상기 단백질의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 도메인의 즉각적인 회수를 가능하게 하기 위해서 절단에 민감할 수 있다. 융합 단백질은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 도메인의 카르복시 및/또는 아미노 말단에 부착된 융합 절편을 포함하는 단백질을 암호화하는 융합 핵산 분자로 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 제조할 수 있다.

한 양태에서 본 발명에 따른 방법으로 이용하기에 적합한 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 상기 단백질이 투여될 동물과 실질적으로 유사한 종의 동물로부터 유래된 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 다른 양태에서, 미생물과 식물과 같은 다양한 기원으로부터 유래된 티오레독신 활성 부위를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 주어진 환자에게 이용될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명에서 기술된 천연적으로 존재하는 티오레독신 단백질의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나는 특정된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각의 측면에 적어도 하나에서 약 20개까지의 추가 이종 아미노산 서열을 갖도록 제조될 수 있다. 이렇게 제조된 단백질 또는 폴리펩타이드는 특정된 아미노산 서열을 "실질적으로 구성하는"이라고 기술될 수 있다. 본 발명에서 상기 이종 아미노산 서열은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 존재하지 않거나(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열에서 그러한 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화되지 않는 아미노산 서열이다. 유사하게 "실질적으로 구성하는"이라는 용어가 핵산 서열과 관련하여 사용된 경우에는 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 적어도 하나 내지 약 60개까지 추가 이종 뉴클레오타이드가 측면에 위치할 수 있는 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 이종 뉴클레오타이드는 천연 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는) 단백질에 어떠한 추가 기능을 부여하거나 특정한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 암호화하지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명의 방법으로 사용되기에 적합한 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드는 그것의 천연 환경으로부터 제거되어진, 분리된 또는 생물학적으로 순수한 단백질을 포함한다. 그에 따라 "분리된"과 "생물학적으로 순수한"은 단백질이 정제된 정도를 반영하지는 않는다. 본 발명의 분리된 단백질은 예를 들면 천연 기원으로부터 수득하거나 재조합 DNA 기술(예, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 클로닝)을 이용하여 제조하거나 화학적으로 합성할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 방법에서 이용되는 티오레독신 활성 부위를 함유한 단백질은 환자에게서 점액 또는 타액의 액화에서 측정 또는 검출할 수 있는 증가(또는 점도 또는 점착력에서의 감소)를 유발하거나 점액 및 타액과 관련된 환자에게서 측정 또는 검출 또는 인지할 수 있는 치료학적 효과를 유발할 수 있는 충분한 생체내 반감기를 갖고 있다. 그러한 반감기는 상기 단백질의 전달 방법에 의해 영향을 받는다. 본 발명의 단백질은 동물에서 약 5분 이상, 바람직하게는 동물에서 약 4시간 이상, 보다 더 바람직하게는 동물에서 약 16시간 이상의 반감기를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서 본 발명의 단백질은 동물에서 약 5분 내지 약 24시간, 바람직하게는 동물에서 2시간 내지 약 16시간, 보다 바람직하게는 동물에서 4시간 내지 12시간의 반감기를 갖는다.

본 발명의 추가의 양태는 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 그러한 핵산 분자는 시험관내 또는 생체내에서 본 발명에 따른 방법에서 유용한 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 앞서 기술된 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 실질적으로 구성하거나, 구성하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에 있어서, 분리된 핵산 분자는 그것의 천연 환경으로부터 제거되어진(즉, 사람의 조작이 가해진) 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드)이며, DNA, RNA, 또는 cDNA를 포함한 DNA 또는 RNA의 유도체를 포함할 수 있다. 그에 따라 "분리된"이란 핵산 분자가 정제된 정도를 반영하지 않는다. 용어"핵산 분자"는 일차적으로 물리적인 핵산 분자를 의미하고 용어 "핵산 서열"은 일차적으로 핵산 분자상의 뉴클레오타이드의 서열을 의미하는 것이지만 상기 두 용어는 특히 핵산 분자 또는 핵산 서열이 단백질을 암호화할 수 있다는 측면에서 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 천연 기원으로부터 분리하거나 재조합 DNA 기술(예, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 예를 들면, 유전자, 유전자의 천연 대립형질 변이체, 이들의 코딩 영역 또는 일부분, 그리고 본 발명의 목적한 단백질을 암호화하거나 천연 유전자 분리체와 엄격한 조건하에서 안정적인 혼성체를 형성할 수 있는 핵산 분자의 능력을 실질적으로 저해하지 않는 방식으로 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위에 의해 변형된 코딩 및/또는 조절 영역을 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 축퇴성을 포함할 수 있다. 본 발명에서 뉴클레오타이드의 축퇴성은 하나의 아미노산이 상이한 뉴클레오타이드 코돈에 의해 암호화될 수 있는 현상을 의미한다. 따라서 본 발명에서 유용한 주어진 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 핵산 서열은 축퇴성으로 인하여 다양해질 수 있다.

본 발명에 있어서 유전자는 코딩 영역 자체 뿐만 아니라 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산을 제어하는 조절 영역(이에 제한되는 것은 아니지만, 전사, 해독 또는 해독 후 제어 영역)과 같은 천연(즉, 야생형) 유전자와 관련된 모든 핵산 서열을 포함한다. 다른 양태에서 유전자는 주어진 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 동일하지 않지만 유사한 서열을 포함하는 천연적으로 존재하는 대립형질 변이체일 수 있다. 대립형질 변이체는 앞서 설명하였다. 용어 "핵산 분자"와 "유전자"는 상기된 바와 같이 핵산 분자가 유전자를 포함할 때 상호교환적으로 이용될 수 있다.

바람직하게는 분리된 본 발명의 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 클로닝)또는 화학적 합성방법을 이용하여 제조할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 천연의 핵산 분자 그리고 이에 제한되는 것은 아니지만 천연의 대립형질 변이체와 단백질의 생물학적 활성에 목적한 효과를 제공할 수 있는 방식으로 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위된 변형된 핵산 분자를 포함한 이들의 상동체를 포함한다. 대립형질 변이체와 단백질 상동체(예, 핵산 상동체에 의해 암호화된 단백질)는 앞서 상세히 설명하였다.

핵산 분자 상동체는 당업자에게 알려진 다수의 방법을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들면 Sambrook et al.을 참조). 예를 들어 핵산 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만 전통적 돌연변이 유발방법 및 재조합 DNA 기술(예, 위치 지정 돌연변이 유발방법, 화학물질의 처리, 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션 및/또는 PCR 증폭) 또는 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성과 혼합군을 라이게이션하여 핵산 분자의 혼합과 이의 조합의 "구축"을 포함한 다양한 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 주어진 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 변형시키는 다른 방법은 유전자 셔플링(shuffling)(즉, 분자 번식)(예를 들어 Stemmer에 의한 미국특허 5,605,793호;, Minshull 및 Stemmer에 의한 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91:10747-10751 참조, 이들 모두의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 이러한 기술은 단백질에 동시에 다수의 변화를 효과적으로 도입할 수 있다. 핵산 분자 상동체는 주어진 유전자와의 혼성화 또는 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질의 기능(즉, 생물학적 활성)을 스크리닝함으로써 선별될 수 있다

본 발명의 한 양태는 전술한 분리된 핵산 분자가 적어도 하나 이상의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 보다 자세하게 본 발명에서 재조합 핵산 분자는 일반적으로 재조합 벡터와 본 발명에서 기술된 분리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하고 그러한 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하는 도구로서 이용되는 설계된(즉, 인공적으로 제조된) 핵산 분자이다. 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 발현 및/또는 숙주 세포에 전달하여 재조합 세포를 형성하는 것과 같이 선택된 핵산 서열의 클로닝, 서열분석 및/또는 조작에 이용하기 적합해야 한다. 그러한 벡터는 일반적으로 이종의 핵산 서열 즉, 클로닝되고 전달될 핵산 서열에 근접하여 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 함유하지만, 본 발명의 핵산 서열에 근접하여 천연적으로 존재하거나, (후술하는) 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예, 프로모터, 비해독 영역)을 함유할 수도 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA이거나 원핵 또는 진핵 생물 유래일 수 있으며 일반적으로는 플라스미드이다. 벡터는 염색체외 성분(예, 플라스미드)로 유지되거나 재조합 숙주 세포의 염색체내로 통합될 수 있지만, 벡터는 본 발명의 대부분의 적용에서 게놈과 분리된 채로 유지되는 것이 바람직하다. 전체 벡터는 숙주 세포내 위치에서 또는 특정 조건 하에서 잔류하거나, 본 발명의 핵산 분자를 남겨두고 플라스미드 DNA는 결실될 수도 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체의 프로모터 조절하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절하에 또는 조합된 몇 개의 프로모터 제어하에 있을 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다수의 카피(copy)가 염색체 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 하나 이상의 선택 마커를 포함할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 이용된 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 암호화된 생산물(예, 목적 단백질)의 제조에 적합한 벡터를 의미한다. 이러한 양태에서, 생산될 생산물(예, 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질)을 암호화화는 핵산 서열이 재조합 벡터에 삽입되어 재조합 핵산 분자를 형성한다. 생산될 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 재조합 숙주 세포 내에서 상기 핵산 서열을 전사하고 해독할 수 있도록 벡터내 조절 서열에 작동가능하게 연결시키는 방식으로 벡터에 삽입한다.

본 발명의 다른 양태에서 재조합 핵산 분자는 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 바이러스의 게놈 또는 이의 일부분에 통합된 분리된 본 발명의 핵산 분자를 포함하는데, 여기서 상기 핵산 분자는 DNA의 세포내 도입을 가능하게 하는 바이러스의 코트로 패키지(package)된다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 알파바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 레트로바이러스를 기반으로 한 바이러스를 포함한 다수의 바이러스 벡터가 이용될 수 있다.

일반적으로 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 적어도 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 용어 "재조합 분자" 또는 "재조합 핵산 분자"는 일차적으로 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 의미하지만, 본 발명에서 기술된 바와 같이 핵산 분자가 재조합 분자일 때에는 용어 "핵산 분자"와 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 분자가 숙주 세포로 형질감염(즉, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 전도)되었을 때 발현될 수 있는 방식으로 발현 조절 서열에 연결되는 것을 의미한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 조절하는 발현 조절 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열과 같은 전사를 조절하는 것이다. 적합한 전사 조절 서열은 재조합 핵산 분자가 도입되는 숙주 세포 또는 유기체에서 기능을 발휘할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 핵산 분자는 전사 조절 서열, 복제 기원 및 재조합 세포와 양립할(compatible) 수 있는 다른 조절 서열과 같은 추가의 조절 서열을 포함할 수도 있다. 한 양태에서 숙주 세포 염색체에 통합된 재조합 서열을 포함한 본 발명에 따른 재조합 분자는 발현된 단백질을 단백질을 생산한 세포로부터 분비되도록 하는 신호 서열(즉, 신호 절편 핵산 서열)을 포함한다. 적합한 신호 절편은 발현될 단백질과 천연적으로 관련된 신호 절편 또는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종의 신호 절편을 포함한다. 다른 양태에서 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질을 숙주 세포의 막으로 전달하고 삽입할 수 있는 리더 서열을 포함한다. 적합한 리더 서열은 단백질과 천연적으로 연관된 리더 서열 또는 단백질의 세포막으로의 전달 및 삽입을 지시할 수 있는 임의의 이종의 리더 서열을 포함한다.

본 발명에서 용어 "형질감염"은 외래의 핵산 분자(즉, 재조합 핵산 분자)를 세포내로 삽입시킬 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 이 용어가 핵산 분자의 미생물 세포 또는 식물로의 도입을 의미하는데 사용될 때에는 용어 "형질감염"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 미생물 시스템에서 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외래 핵산의 습득으로 인한 유전적인 변화를 기술하는데 사용되며 용어 "형질감염"과 실질적으로 동일한 의미이다. 그러나 동물 세포에서 형질전환은 (전술한) 배양 중 세포의 생장 특성에서의 변화로 이들이 예를 들어 종양화된(cancerous) 후를 말하는 제 2의 의미를 갖고 있다. 따라서 혼동을 피하기 위하여 동물 세포로의 외래 핵산의 도입에 관련해서는 용어 "형질감염"을 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명에서는 상기 용어들이 외래 핵산 분자를 세포내로 도입하는 것과 연관된 한은 동물 세포의 형질감염과 식물 세포와 미생물 세포의 형질전환을 포함한다. 따라서 형질감염 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 형질전환, 세포의 화학적 처리, 입자 사격(particle bombardment), 전기천공, 미세주입, 리포펙션(lipofection), 흡수, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 재조합 분자가 본 발명의 암호화된 생성물(예, 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질)을 제조하는데 이용될 수 있다. 한 양태에서 암호화된 생성물은 단백질을 제조하기에 효과적인 조건하에서 본 발명에서 기술된 핵산 분자를 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 암호화된 단백질을 제조하는 바람직한 방법은 하나 이상의 재조합 분자로 숙주 세포를 형질감염시켜 재조합 세포를 형성하는 것이다.

바람직한 양태에서 환원 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 조성물로 처리될 점액 또는 타액과 접촉시킨다. 상기 조성물은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질을 포함하고 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 감소시키거나 상기 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 다른 화합물과 같은 하나 이상의 추가 화합물을 포함할 수 있다. 한 양태에서 조성물은 치료될 환자의 세포(예, 폐 또는 기도의 상피 세포)에 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있으며, 세포는 형질감염되어서 단백질을 발현할 수 있으며 이에 의해 상기 단백질은 세포의 미세 환경에서 점액 또는 타액과 접촉할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 단백질 또는 핵산 분자 또는 다른 조절 화합물을 환자에게 전달하기 위한 전달 비히클을 포함한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명에서 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 방법에서 유용한 치료학적 단백질, 핵산 또는 다른 화합물을 적합한 생체내 또는 생체외 부위에 전달하기에 적합한 임의의 물질을 의미한다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 담체는 단백질, 핵산 분자 또는 화합물이 목적한 부위(예, 치료될 점액 또는 타액이 분비되거나 배출된 부위)에 도달하자마자 (화합물 또는 단백질의 경우에) 점액 또는 타액과 접촉하거나 (핵산 분자의 경우에) 세포에 유입되어 상기 세포에 의해 발현되어서 이렇게 발현된 단백질이 점액 또는 타액과 접촉할 수 있는 형태로 단백질, 핵산 분자 또는 화합물을 유지할 수 있다. 본 발명의 적합한 부형제는 치료학적 에이전트(단백질, 핵산 또는 화합물)를 세포, 조직 또는 유체(점액 또는 타액)에 특이적으로 표적화시키는 것 뿐만 아니라 운반 또는 운반을 용이하게 하는 부형제 또는 제형제를 포함한다(또는 비표적화 담체로서 기술된다). 약제학적으로 허용되는 부형제의 예에는 이에 제한되는 것은 아니지만 물, 인산으로 완충된 살린, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한크 용액, 다른 수용성의 생리학적 평형 용액, 기름, 에스테르 및 글리콜이다. 수용성 담체는 예를 들면 화합물의 안정성과 등장성을 개선시켜서 수용자의 생리학적 조건에 근접하도록 해주는 적합한 보조 성분을 함유할 수 있다.

적합한 보조 성분은 예를 들면, 소듐 아세테이트, 염화나트륨, 소듐 락테이트, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산완충용액, 트리스 완충용액 및 비카르보네이트 완충용액을 제조하는데 이용되는 다른 성분을 포함한다. 보조 성분은 또한 티메로살, m 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤졸 알콜과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 의해 살균 및/또는 동결건조시킬 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체의 한 유형은 본 발명의 조성물을 환자에게 서서히 방출할 수 있는 서방 제형을 포함한다. 본 발명에서 서방 제형은 본 발명에 따른 하나 이상의 치료학적 에이전트 서방 비히클내에 포함시키는 것이다. 적합한 서방 시스템은 이에 제한되는 것은 아니지만 생적합성(biocompatible) 중합체, 다른 중합체 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 거환 제조물, 삼투압 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스페어 및 경피내 전달 시스템을 포함한다. 핵산의 적합한 전달 비히클은 이에 제한되는 것은 아니지만 리포좀, 바이러스 벡터 또는 리보자임을 포함한 다른 전달 비히클이다.

리포좀 전달 비히클은 환자의 적합한 세포 및/또는 조직에 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 전달할 수 있는 리피드 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 세포의 세포막에 융합되어 조성물을 세포내로 전달할 수 있는 리피드 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 환자의 해당 부위에 조성물을 전달하는 충분한 시간 동안에 환자 내에서 안정된 상태로 잔류할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용하기에 적합한 리포좀으로는 임의의 리포좀이 포함된다.

환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유한 단백질 또는 펩타이드의 적합하거나 효과적인 양은 활성 부위 디티올의 디설파이드로의 가역적인 산화반응을 통한 레독스 반응에 관여, 디티올-디설파이드 교환 반응의 촉매 및 특히 점액 또는 타액의 점도 또는 점착력의 감소 및/또는 환자의 점액 또는 타액의 액화를 증가 그리고 보다 자세하게는 환자에게 치료학적 효과를 제공하기에 충분하도록 환자의 점액 또는 타액의 액화를 증가시킬 수 있는 양이다. 점도 또는 점착력의 감소 또는 점액 또는 타액의 액화의 증가는 앞서 기술된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 방법에 의해 측정, 검출 또는 확인될 수 있다.

한 양태에서 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 바람직한 양은 환자의 몸무게 1kg 당 0.1μmol 내지 150μmol을 포함한다. 다른 양태에서 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 바람직한 양은 환자의 몸무게 1kg 당 1.5μmol 내지 150μmol을 포함한다. 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 보다 바람직한 양은 환자의 몸무게 1kg 당 2μmol 내지 25μmol을 포함한다. 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 보다 더 바람직한 양은 환자의 몸무게 1kg 당 3μmol 내지 10μmol을 포함한다.

다른 양태에서 전달 경로가 에어로졸 또는 이와 유사한 경로라면 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 양은 용량 단위당 적어도 약 0.25mg (예, 사람의 용량 단위는 2-3ml이다) 내지 용량 단위 당 약 25mg을 포함한다. 바람직하게는 환자에게 투여될 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 양은 용량 단위 당 약 적어도 0.25mg 이상을, 보다 바람직하게는 용량 단위당 적어도 약 0.3mg 이상을, 보다 바람직하게는 용량 단위당 적어도 약 0.35mg 이상을, 그리고 용량 단위 당 25mg 이상까지 0.05mg씩의 증가분을 포함한다. 에어로졸 전달의 경우에 일반적으로 에어로졸의 부피 중 약 10%만이 실질적으로 기도에 전달된다. 따라서 부위에 전달될 조성물의 부피가 더 증가된 다른 전달 경로의 경우에 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 더 적은 용량이 사용될 수 있는 것으로 보일 것이다.

동물에게 투여될 본 발명에 따른 단백질의 최적의 양은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어 단백질이 흡입 (에어로졸) 경로에 의해 투여된다면, 투여될 최적의 양은 기관내 주입에 의해 투여되는 최적의 양과는 상이할 수 있다. 당업계에 알려진 범위 내에서 투여 경로에 따라 양은 다양할 것이다. 본 발명의 단백질의 적합한 양은 동물에게 독성 없이 목적한 기능을 발휘하는 양이다.

본 발명의 바람직한 양태에서 티오레독신 반응 부위를 포함하는 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물은 단백질에서 티오레독신 활성 부위를 환원 상태로 유지 또는 환원시키는 환원 시스템을 포함하는 하나 이상의 에이전트와 함께 제형화된다. 바람직하게는 그러한 에이전트는 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(환원 형태)(NADPH) 및/또는 티오레독신 환원효소를 포함하며, 바람직하게는 NADPH와 함께 제형화되는 것이다. 본 발명자들은 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 환원 시스템의 존재는 본 발명의 방법에서 기능을 발휘하는 티오레독신 활성 부위를 함유한 단백질의 능력을 상당히 증가시키는 것을 확인하였다(예, 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 것). 또한, 본 발명자들은 환원 시스템으로서 NADPH를 포함하면 충분하고 티오레독신 환원효소는 상기 환원 시스템의 필수 성분은 아니지만, 바람직하게는 포함할 수도 있다는 것을 확인하였다. 다른 환원 시스템이 본 발명에서 이용될 수 있는데 이에 제한되는 것은 아니지만 NADPH-의존성 티오레독신 환원효소, 리포익산 및 다른 생물학적 환원제이다. 일반적으로 본 발명자들은 NADPH 또는 NADH와 같은 환원 등가물(reducing equivalent)의 본래 기원이 본 발명에 따른 조성물의 최적의 치료학적 효과를 달성하는데 중요한 성분일 것이라고 추정하였다. 그러나 환원 등가물(NADPH 또는 NADH로부터 유래된 H⁺)을 티오레독신 또는 티오레독신 활성 부위를 포함하는 분자에 운반할 수 있는 매개적 기능을 수행하는 추가의 성분이 또한 이용될 수 있다.

NADPH가 본 발명에 따른 조성물에 포함될 때 상기 조성물은 바람직하게는 약 0.5μM 내지 약 20mM의 NADPH 달성된 표면 농도, 보다 바람직하게는 약 5μM 내지 약 2mM의 NADPH 달성된 표면 농도, 보다 더 바람직하게는 약 50μM 내지 약 200μM의 NADPH 달성된 표면 농도를 포함하도록 제형화하는 것이다. 다른 양태에서 상기 조성물은 NADPH의 임의의 적합한 양, 바람직하게는 약 0.5μM 내지 약 20mM내의 0.1μM 증가분(즉, 0.5μM, 0.6μM,......19.9μM, 20μM)에 해당하는 NADPH 표면 달성 농도를 갖도록 제형화할 수 있다. "달성된 표면 농도"는 세포 또는 조직의 표면 예를 들면 폐 상피 세포의 표면에 달성된 또는 존재하는 NADPH와 같은 특정 화합물의 농도이다. 따라서 특정 표면 농도를 달성하기 위하여 특정 화합물을 더 많은 농도로 실질적으로 투여할 필요가 있을 것이다. 당업계에 공지된 범위 내에서 그러한 농도가 결정될 것이다. 본 발명의 조성물에 티오레독신 환원효소가 포함될 경우에는 바람직하게는 0.001μM 내지 1μM의 티오레독신 환원효소 달성된 표면 농도, 보다 바람직하게는 0.001μM 내지 0.1μM의 티오레독신 환원효소 달성된 표면 농도, 0.001μM의 증가분으로 0.001μM 내지 0.1μM 내의 임의의 양을 포함하도록 제형화하는 것이 바람직하다. 한 양태에서 본 발명의 조성물에 임의의 티오레독신 환원효소를 포함하는 것이 필수적이지는 않다. 본 발명의 범위내에서 티오레독신 환원효소 및/또는 NADPH의 양은 티오레독신 활성 부위의 환원 상태를 유지 또는 개선하기 위하여 그러한 활성 부위 또는 전달 지시자의 모드를 함유하는 단백질 또는 펩타이드의 양으로서 당업자에 의해 변형될 수 있다.

상기된 바와 같이 본 발명의 조성물은 과도하게 점성 또는 점착력이 있는 점액 또는 타액을 감소시키거나 상기 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는데 이용될 수 있는 다른 화합물과 같은 하나 이상의 추가 화합물을 포함할 수 있다. 그러한 화합물의 예는 당업계에 알려져 있으며 이에 제한되는 것은 아니지만 정제된 rhDNase, N-아세틸시스테인, 나시스텔린(N-N-아세틸-L-시스테인 유도체) 및 겔솔린을 포함한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 조성물은 조성물 특히, 조성물 중 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질, 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자 및/또는 다른 화합물을 표적 부위(예, 단백질과 화합물의 경우에는 치료될 점액 또는 타액, 재조합 핵산 분자의 경우에는 치료될 점액 또는 타액의 환경 내에 위치한 표적 숙주 세포)에 전달하기에 효과적인 방식으로 환자에게 투여한다. 적합한 투여 프로토콜은 임의의 생체내 또는 생체외 투여 프로토콜을 포함한다.

본 발명에서 효과적인 투여 프로토콜 (즉, 본 발명의 조성물을 효과적인 방식으로 투여하는 것)은 조성물 중 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 및/또는 다른 화합물을 치료될 점액 또는 타액과 접촉시키거나 티오레독신 활성 부위를 포함하는 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 환자의 목적한 숙주 세포로 형질감염시키고 발현하여 바람직하게는 환자가 그러한 투여로부터 약간의 측정, 관측 또는 인지할 수 있는 효과를 얻을 수 있는 적합한 용량 변수 및 투여 모드를 포함한다. 몇몇 상황에서 환자로부터 점액 또는 타액을 샘플링함으로써 효과적인 용량 변수가 본 발명에서 기술된 점액 또는 타액의 점도 또는 액화를 평가하는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 선택적으로 효과적인 용량 변수는 생체외 샘플, 생체내 동물 모델 및 환자가 사람이라면 임상 실험을 사용한 조사에 의해 확인될 수 있다. 효과적인 용량 변수는 특정 질병 또는 질환과 관련한 당업계의 표준 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 그러한 방법을 예를 들면 생존율, 부작용(즉, 독성) 및 질병의 진행 또는 회복을 포함한다.

본 발명에서 본 발명에 따른 조성물을 환자에게 투여하기에 적합한 방법은 환자에게 목적한 부위로 조성물을 전달하는 적합한 생체내 투여경로를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 당업자에게 명백할 것이지만 화합물이 단백질, 핵산 또는 다른 화합물(예, 약제)인지, 조성물이 신체의 어느 부위에 투여될 것인지 및 환자에 의해 경험된 질병 또는 질환에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 생체내 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 관상동맥내 투여, 동맥내 투여(예, 목동맥으로), 피하내 투여, 경피내 전달, 기관내 투여, 관절내 투여, 심실내 투여, 흡입(예, 에어로졸), 뇌내, 비강, 구강, 폐내 투여, 카테터의 주입, 조직으로의 직적접인 주입을 포함한다. 귀내 전달은 이어 드롭(ear drop)을 포함하거나, 비강내 전달은 노즈 드롭(nose drop) 또는 비강내 주입을 포함하거나, 안구내 전달은 아이 드롭(eye drop)을 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 전달은 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 Stribling et al. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 189:11277-11281, 1992 참조, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 구강 전달은 식품 또는 음료수내로 제형된 형태 뿐만 아니라 예를 들면 정제 또는 캡슐로서 입을 통하여 취해질 수 있는 고체와 액체를 포함할 수 있다. 점막 조직에 유용한 다른 투여 경로는 기관지, 피내, 근육내, 비강내, 다른 흡입, 직장내, 피하내, 국소 도포, 경피내, 질내, 자궁 경부 관통(trancervical), 자궁 경부 관상(pericervical) 및 요도 경로를 포함한다. 또한, 투여 프로토콜은 불임과 같은 분야에 이용되는 경우에 다이어프램(예, 경부로)을 이용한 단백질, 펩타이드 또는 조성물의 적용과 같은 전치료 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태로 본 발명의 단백질 또는 조성물이 호흡기의 관(기도)에 과도하게 또는 비정상적으로 점성인 또는 점착력이 있는 타액 또는 점액을 치료하기 위하여 투여될 때에, 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드(또는 조성물)와 다른 화합물은 이에 제한되는 것은 아니지만 흡입(즉, 예를 들면 계면활성제에 포함된 에어로졸을 흡입함에 의해); 기관지 내시경, 기관내 튜브 및/또는 임의의 인공적 통풍 장치를 통한 폐로의 직접적인 설치; 비강 투여(비강내 또는 비강관), 기관지 또는 기관내(즉, 기관 또는 로의 직접 주입에 의해)를 포함한 경로에 의해 직접적으로 또는 리피드로 캡슐화하거나 계면활성제를 통하여 투여한다. 본 발명의 조성물 또는 단백질을 기도내 점액 또는 타액과 접촉시킬 수 있는 가능한 모든 도입 방법이 본 발명에 포함된다.

본 발명에 기술된 다양한 투여 방법과 전달 비히클은 핵산 분자를 표적 세포에 전달하기에 충분한 것으로 보이며 이에 의해 상기 핵산 분자가 세포를 형질감염시키고 발현할 수 있다. 많은 연구에서 이종 유전자의 성공적인 전달과 발현은 본 발명에 따른 바람직한 세포 타입 및/또는 바람직한 전달 비히클 및 투여 경로를 사용하여 달성되었다.

예를 들어 Dow et al.에 의해 1998년 1월 6일자로 공개된 리포좀 전달을 이용하는 미국특허 제 5,705,151호는 양이온 리포좀 전달 비히클로 슈퍼항원을 암호화하는 핵산 분자와 사이토카인을 암호화하는 핵산 분자를 성공적으로 생체내 정맥내로 전달하고 그에 의하여 암호화된 단백질은 동물의 조직, 특히 폐의 조직에서 발현되는 것을 증명하였다. 또한, Liu et al. Nature Biotechnology 15:167, 1997은 유전자를 함유하는 콜레스테롤 함유 양이온 리포좀의 정맥내 전달이 바람직하게는 폐 조직을 표적화하고 생체내에서 효과적으로 유전자의 운반 및 발현을 매개하는 것을 증명하였다. Dzau와 그의 동료들에 의한 논문은 심장의 근세포, 섬유아세포 및 근육 세포를 포함한 심장 세포로 네이키드 DNA(naked DNA)와 일본 혈액응고 바이러스-리포좀 전달(Hemagglutinating virus of Japan-liposome delivery) 모두를 사용하여 위심낭 내 정치와 관상 동맥으로의 주입(관상 동맥내 전달) 모두에 의해 투여된 성공적인 생체내 유전자의 전달과 발현을 증명하였다(예를 들어 Aoki et al., 1997, J. Mol. Cell, Cardiol. 29:949-959; Kaneda et al. 1997, Ann N.Y. Acad. Sci. 881:299-308; 및 von der Leyen et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1137-1141).

많은 핵산 서열의 전달이 핵산 서열을 암호화하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 달성되어 왔다. 그러한 벡터를 사용한 성공적인 전달과 발현은 생체외 전달(예를 들면 레트로바이러스 벡터; Blaese et al. 1995, Science 270:475-480; Bordignon et al. 1995, Science 270:470-475), 비강 투여(CFTR-아데노바이러스-연관 벡터), 관상 동맥내 투여(아데노바이러스 벡터와 상기된 일본 혈액응고 바이러스), 정맥내 투여(아데노-연관 바이러스 벡터; Koeberl et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1426-1431)에 의해 달성되어져 왔다. Maurice et al.(1999, J. Clin. Invest. 104:21-29)에 의한 논문에는 관상 동맥내 전달에 의해 투여된 β2-아드레날린 수용체를 암호화하는 아데노바이러스 벡터가 생체내에서 확산된 다수 챔버의 심근에서 유전자의 발현과 이어진 혈류학적 기능에서의 상당한 증가와 다른 개선된 생리학적 변수를 유도할 수 있다는 것을 증명하였다. Levine et al은 지방조직으로 작제물의 직접 주입 및 아데노바이러스 벡터를 사용하여 사람의 지방세포와 래비트의 지방세포로 유전자의 생체내, 생체외 및 시험관내 전달과 발현을 기술한다(Levine et al. 1998, J. Nutr. Sci. Vitaminol. 44:569-572).

신경 세포로의 유전자 전달 분야에서 다수의 성공적인 생체내 유전자 전달이 보고되었다. Millecamps et al.은 이식 유전자의 프로모터(포스포글리세라이트 프로모터)의 업스트림에 위치한 신경세포에 제한적인 인핸서 요소를 사용하여 신경세포로의 아데노바이러스 벡터의 표적화를 보고하였다. 그러한 벡터는 마우스 및 래트에 근육내와 뇌내로 투여하여 성공적인 이식 유전자의 신경세포-특이적 형질감염과 발현을 달성하였다(Millecamps et al. 1999, Nat. Biotechnol. 17:865-869). 상술한 바와 같이 Bennett et al. 은 1년 이상 신경세포의 망막으로 망막내 주입에 의해 유전자를 전달하고 발현하는데 아데노-연관 바이러스 벡터를 이용한 것을 보고하였다(Bennett, 1999, 상동).

활악내 세포와 관절내 연결부로의 유전자 전달이 유사한 성공을 거두었다. Oligino 등은 생체내 활악내 세포에서 두 개의 상이한 수용체를 전달하고 발현시키기 위하여 중간 초기 유전자인 ICP4, 22 및 27이 결핍된 헤르페스 심플레스 바이러스 벡터의 이용을 보고하였다(Oligino et al., 1999, Gene Ther. 6:1713-1720). 헤르페스 벡터는 동맥내 주입에 의해 투여되었다. Kuboki et al.은 아데노바이러스 벡터에 의해 매개된 유전자 전달과 동맥내 주입을 사용하여 성공적이고 특이적으로 생체내 기니아 피그의 악관절에서 발현시켰다(Kuboki et al., 1999, Arch. Oral. Biol. 44:701-709). Apparailly 등은 IL-10을 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 마우스에 투여하고 유전자 산물의 성공적인 발현과 실험적으로 유발된 관절염에서의 상당한 치료 효과를 증명하였다(Apparailly et al., 1998, J.Immunol. 160:5213-5220). 다른 연구에서, 쥐과(murine)의 백혈병 바이러스계 레트로바이러스가 생체외 및 생체내 모두에서 사람 성장 호르몬 유전자를 (동맥내 주입에 의해) 전달하고 발현하는데 이용되었다(Ghivizzani et al. 1997, Gene Ther. 4:977-982). 이러한 연구는 생체내 유전자 전달에 의한 발현은 생체외 유전자 전달의 그것과 최소한 동등하다는 것을 보여주었다. 앞서 기술된 Sawchuk et al.은 동맥내 주입에 의해 성공적인 생체내 아데노바이러스 벡터에 의한 유전자의 전달과 안티 T 세포 수용체의 모노클로날 항체로 연결부(joint)가 전처리됨에 의한 상기 유전자의 장기간 발현을 보고하였다(Sawchuk et al. 1996, 상동). 마지막으로 레트로바이러스를 이용한 사람의 인터루킨-1 수용체 길항제의 생체외 유전자 전달은 높은 동맥내 발현과 관절염의 치료에서 치료학적 효능을 나타내었으며, 사람의 유전자 치료 임상에 적용되기 위해 FDA 승인을 받기 위한 절차가 진행중이다(Evans와 Robbins, 1996, Curr. Opin. Rheumatol. 8:203-234). 따라서 유전자 치료법과 관련된 최신 기술은 FDA가 적어도 관절염을 치료하는데 사람의 유전자 치료법이 적합한 전략이라고 여기게 해왔다. 이와 함께, 유전자 치료와 관련된 상기 모든 연구들은 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 전달과 발현이 실행가능하다는 것을 의미한다.

재조합 분자를 전달하는 또 다른 방법은 비표적화 담체에 의한 것이다(예, 네이키드 DNA 분자로, 예를 들면 Wolff et al., 1990, Science 247, 1465-1468에 나타낸 바와 같이). 그러한 재조합 핵산 분자는 일반적으로 직접 또는 근육내 투여에 의해 주입할 수 있다. 네이키드 DNA에 의해 투여될 재조합 핵산 분자는 분리된 본 발명의 핵산 분자를 포함하며 바람직하게는 본 발명의 재조합 분자를 포함하고 바람직하게는 복제 또는 증폭, 컴페턴트(competent)한다. 본 발명의 네이키드 핵산 시약은 딕이스트로닉(dicistronic) 재조합 분자를 포함하는 하나 이상의 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함할 수 있다. 네이키드 핵산 분자 전달은 가장 바람직한 표적 조직내로의 직접 투여를 이용한 근육내, 피하내, 피내, 경피내, 비강내 및 구강내 투여 경로일 수 있다. 네이키드 핵산 분자 백신의 바람직한 단일 용량은 1ng 내지 100μg이지만 투여 경로 및/또는 전달 방법에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 전달 방법은 예를 들면 주입에 의해, 드롭으로서, 에어로졸 분사 및/또는 국소 도포에 의한 것을 포함한다. 한 양태에서 순수한 DNA 작제물은 금 분자(1 내지 3μm 직경의)의 표면을 둘러싸고 "유전자 총"으로 피부 세포 또는 근육내로 발사될 수 있다.

본 발명의 방법으로 치료학적 조성물은 척추동물 부류, 이에 제한되는 것은 아니지만 영장류, 설치류, 가축류 및 애완동물을 포함한 포유동물의 임의의 구성원에 투여될 수 있다. 보호되어야 할 바람직한 환자는 사람이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.

다음의 재료 및 방법이 하기 실시예 1-6에서 사용되었다.

시약 및 재료. 동결건조된 재조합 E. coli Trx를 Promega사(Madison, WI)로부터 얻었다. E. coli TR은 American Diagnostica(Greenwich, CT)로부터 입수하였다. β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트, 환원 형태(NADPH), 환원된 GSH, 글루타티온 환원효소, 디티오트레이톨, 디이소프로필플루오로포스페이트, 아프로티닌, N-에틸 말레이미드, 쉬프 시약, 샐몬 테스테스(salmon testes) DNA, 훽스트 다이(dye)는 모두 시그마 케미컬(St. Louis, MO)로부터 입수하였다. N-아세틸시스테인은 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)로부터 입수하였다. 기타 화합물은 가능한 고순도이었다.

타액 수집. 타액은 National Jewish Medical and Research Center (Denver, CO) 및 Children's Hospital (Denver, CO)의 CF를 앓는 성인 및 소아 환자로부터 얻었다. 만일 땀의 염소치가 두개의 독립적인 필로카르핀 이온토포레시스 땀 시험에서 60 mM을 초과하는 경우 그리고 후속의 유전자 분석에서 두개의 대립유전자의 CF 생성 변이를 갖는 경우 환자가 CF를 지닌 것으로 진단하였다. 모든 시료는 즉각적인 객담 또는 고장성의 염분 유도에 의해 제공되었다. 시각적으로 탐지할 수 있는 침을 함유하는 타액 시료는 폐기하였다. 객담 후 시료는 이용될 때까지 -80℃에서 저장되었다. 타액 수집 프로토콜, 데이터 수집, 긍정/부정 서식은 Institutional Review Board of the University of Colorado Health Science Center(COMIRB) 및 관련 병원의 승인을 받았다.

컴팩션 에세이(compaction assay). -80℃에서 저장한 CF 타액은 실온에서 해동하여 포시티브 디스플레이스멘트 피페트 (Rainin, Emeryville, CA)를 이용하여 275 ㎕의 부피로 1.5 ml Eppendorf 원심분리 튜브에 등분(aliquot)하였다. 타액 시료는 희석액(H₂O), Trx + TR + NADPH, GSH + 글루타티온 환원효소 + NADPH, 디티오트레이톨(DTT) 또는 N-아세틸시스테인 처리하였으며 이를 위해 각 에이전트(agent)의 적절한 몰농도를 함유하는 25㎕의 H₂O를 첨가하였다. 간략한 보르텍싱(약 1초) 후 시료 튜브는 마이크로튜브 로티세리(Barnstead, Dubuque, IA)에 로딩하고 20분간 37℃에서 정치시켰다. 그후 시료는 Daugherty 등의 방법(Daugherty et al. Biomaterials 16: 553-558, 1995)에 따라 컴팩션 에세이를 진행하였다. 분석을 수행하기 위하여 각 시료의 내용물을 정확게 맞도록 200 ㎕ 피페트 팁으로 미리 만든 100 ㎕ 유리 미세 모세관 튜브(Fisher Scientific)에 로딩하였다. 세 개의 변형된 모세관 튜브를 각 타액 시료로부터 90% 이상을 끌어내기 위해 사용하였다. 그다음 모세관 튜브는 그들의 피페트 팁으로부터 제거하였고, 클레이(clay)로 밀봉하고 헤마토크리트 원심분리기(IEC, Needham Heights, MA)에서 10분 동안 원심분리시켰다. 그 다음 각 튜브의 겔(고체) 및 수용성(액체) 상을 밀리미터 단위로 길이를 측정하였다. 각 모세관 튜브의 액체 분획 백분율을 수용성 상 길이 나누기 전체 길이 (겔 + 수용성) X 100으로 계산하였다. 각 시료로부터 유도된 액체 분획의 세 측정치(%)의 평균을 구한 후 각 처리 조건에 대한 단일 값을 생성하였다.

자성의 유동분석계. 처리에 대응한 점탄력성 변화를 King에 의해 개발한 자성의 유동분석계 (King M. Magnetic microrheometer. In: Methods in Bronchial Mucology, Braga P.C. and Allegra L. 편저, New York: Raven Press, 1988, p. 73-83)에 의해 측정하였다. 10-120 ㎛ 강철 구를 10mg 타액 시료에 위치시켰다. 전자자석을 이용하여 상기 구를 진동시켰고, 동 이미지를 현미경을 통하여 포토셀 한 쌍으로 투영시켰다. 점액은 구의 이동을 저해하였고 상기 효과는 구의 이동 대 오실로스코프에서 자석의 추진력을 플로트(plot)함으로써 나타낼 수 있었고 이로부터 G^*를 측정하였다. G^* 는 역학적 임피던스 또는 점도 및 탄성의 벡터 합이었다. Trx 및 NADPH 용량 응답시험을 위해 10rad/s에서 log G^*를 처리 전에 측정하였고(기준선), 그 후 처리하지 않는 경우, 희석액(H₂O) 또는 환원 시스템의 Trx의 경우 20분 정치시킨 후 측정하였다. 모든 처리는 전체 시료 부피의 10%에 해당하는 H₂O의 용량으로 시료에 투여하였다. 시료의 등분(aliquot) 당 1회의 측정을 수행하였다.

타액으로부터 당단백질 추출. 타액으로부터 용해성 당단백질의 추출은 Davies 등에 따른 방법(Davies and Carlstedt, Methods Mol. Biol. 125: 3-13, 2000)으로 수행하였다. CF 타액의 275 ㎕를 20분 동안 37℃에서 25 ㎕의 H₂O 단독 또는 Trx(10 또는 30 μM) + NADPH (2mM) 및 TR (0.1 μM)를 함유한 H₂O에 의해 처리하였다. 처리 후 1 mM의 디이소프로필플루오로포스페이트 및 10 ㎍의 아프로티닌을 함유한 100 ㎕의 H₂O가 첨가되었으며, 그 다음 22,000g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 각 시료의 얻은 상등액(수용상)은 새로운 미세원심분리 튜브로 옮겨졌고 -20℃에서 저장하였다. 각 시료의 잔여 고형 겔 부분은 피페트 팁을 이용하여 250㎕의 구아니디니움 추출 완충액 (6 M 구아니디니움 클로라이드; 5 mM EDTA; 10 mM 소듐포스페이트 완충액, pH 6.5; 1 mM N-에틸 말레이미드; 100 μM 디이소프로필플루오로포스페이트; 및 1 ㎍/ml 아프로티닌)의 존재하에 튜브 바닥으로부터 조심스럽게 탈리하였고 14시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 원심분리 후 상기 겔상 추출로부터 얻은 상등액은 깨끗한 튜브로 옮겨졌고 전기영동을 할 때까지 -20℃에서 냉동하였다.

당단백질 함량의 분석. 수용상 및 겔상 시료의 당단백질 함량은 Thornton 등에 따른 방법(Thornton et al. Methods Mol. Biol. 125: 77-85, 2000)으로 피리오딕 에시드 쉬프 시약(PAS)를 이용한 염색에 의해 평가하였다. 수용성 및 겔 시료는 해동시키고 각각의 80 ㎕의 등분을 Biomax 수평 영동 장치 (Kodak, Rochester, NY) 내에 내장된 1.0% 아가로오즈 겔 (150 mm X 125 mm)에 로딩하였다. 전기영동 시약은 다음과 같았다 : 전기영동 완충액 : 40 mM Tris 아세테이트, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.1% SDS; 시료 로딩 완충액 : 60% 전기영동 완충액, 40% 글리세롤 (v/v) 및 0.0005% (w/v) 브로모페놀 블루. 겔 내용물은 트랜스퍼 용액으로 0.6 M NaCl, 60 mM 소듐시트레이트를 이용하여 진공 블로터 (Boeckel Scientific, Feasterville, PA)에 의해 폴리비닐리덴 (PVDF) 막으로 이동시켰다. 이동 후 막은 3회 물로 세척하였고 실온에서 30분 동안 200 ml의 1% 피리오딕 애시드 (v/v), 3% 아세트산 (v/v) 용액으로 이동시켰다. 상기 막은 1mM HCl 중 0.1% 소듐 메타브설파이트로 세정하고 6분 동안 쉬프 시약에 위치시켰다.

전체 DNA 함량의 측정. CF 타액의 275 ㎕를 처리하지 않은 경우, 25 ㎕의 H₂O 처리한 경우, 또는 Trx (30 μM) + TR (0.1 μM) 및 NADPH (2mM)을 함유한 H₂O 25 ㎕로 처리한 경우 각각 정치시켰다. 37℃에서 정치 20분 후 100 ㎕의 H₂O를 각 시료에 첨가하였고, 그 다음 10분 동안 원심분리(22,000 X g) 하였다. 얻은 겔 및 액상은 분리하고 100 mM Tris Cl, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.5% Tween 20 및 1 mg/ml 프로테이나제 K로 이루어진 소화용액 동량과 함께 4시간 동안 50에서 정치하였다. 액상 및 겔상으로부터 페놀/클로로포름 추출에 의해 DNA를 정제하고 100 ㎕의 TE 완충액, pH 8.0에 재현탁화시켰다. DNA 농도는 여기 파장 575 nm 및 방사 파장 555 nm로 F-2000 플루오로미터 (Hitachi, Schaumburg, IL)를 이용하여 훽스트 분석 (Labarca and Paigen, Anal. Biochem. 102 : 344-352, 1980)에 의해 결정하였다. TE 완충액에 용해시킨 샐몬 테스티스 DNA를 이용하여 검량곡선을 수립하였다.

통계. 도면의 데이터는 표준 오차를 나타내는 도 4A 및 4B를 제외하고는 평균 ± 표준오차를 나타낸다. 선형 혼합효과 모델링 접근법을 이용하여 액화, 점탄성 및 타액 시료의 DNA 용해도에 대한 처리 영향을 분석하였다. Dunnet의 교정이 단일 대조군에 대해 여러 처리를 비교할 때 적용하였다. 컴팩션 에세이의 재현성은 선형 모델에서 계산한 인트라클래스 상관계수를 이용하여 평가하였다. 모든 분석은 SAS 버전 8.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC)를 이용하여 수행하였다. 검정은 p<0.05로 정의하였다.

실시예 1

다음의 실시예는 CF 타액으로부터 액체 방출에 대한 Trx 환원 시스템의 영향을 설명한다.

CFTR 유전자의 결함으로 인한 비정상적인 이온 수송 때문에 CF 환자의 기도 분비물은 종종 건조된다. 따라서 화농성 CF 타액은 주로 견고하고 비유동성 생고분자 매트릭스를 포함하고, 이를 종종 겔상이라 일컫고 용해성 액상의 양은 적다. 타액에서 이러한 두 상의 비율에 대한 Trx의 영향을 평가하기 위해 컴팩션 에세이 측정을 수행하였다. 첫 번째 실험에서 동량의 타액 시료를 0, 1, 10 또는 30 μM Trx; 0.1 μM TR; 및 2 mM NADPH (최종 농도)를 함유하는 25㎕ H₂O에 의해 처리하였다. 20분 동안 정치시킨 후 각 시료의 액체 분획은 컴팩션 에세이에 의해 결정하였다.

액상에 존재하는 CF 타액의 평균 (± SD) 백분율은 Trx 노출 전 3.5 ± 2.9% (도 1A; 값은 5개의 독립적 실험으로 얻은 값의 평균. ^* P<0.05 대 H₂O에 노출된 시료)이었다. 타액의 10%에 해당하는 희석액 (H₂O)으로 처리한 등분은 액상에 존재하는 타액 비율에서 작고 미미한 증가 (6.2 ± 6.6%)를 보였다. 반대로 CF 타액의 액상은 Trx 환원 시스템 (Trx + 0.1 μM TR, 및 2 mM NADPH)으로 처리한 후 상당히 증가하였다. Trx (1μM)로 처리한 타액의 경우 타액의 액체 분획은 37.8 ± 15.4% 까지 증가하였다. 액체 분획의 최대 증가는 보다 높은 Trx (30μM) 농도로 정치시킨 시료에서 나타났다 (74.5 ± 15.6%).

NADPH의 영향을 조사하기 위해 상이한 제공자로부터 추가의 시료를 30 μM Trx, 0.1 μM TR 및 0, 0.2, 0.6, 1.0 또는 2 mM NADPH로 20분 동안 처리하였다. NADPH 없이 Trx 및 TR로 처리한 시료는 타액에 존재하는 액상 백분율이 낮았다 (2.9% ± 1.3%). NADPH로 처리한 등분은 액체 분획에서 복용량 의존적 증가를 보여주었으며, 2 mM에서 최대 증가를 나타냈다 (70.55 ± 18.13%) (도 1B). Trx 없이 NADPH로 타액을 처리한 경우 타액에 존재하는 액체 분획의 비율을 전혀 증가시키지 않았다 (미도시).

실시예 2

다음 실시예는 실시예 1의 컴팩션 에세이 측정의 재현성을 보여준다.

컴팩션 에세이 측정의 재현성을 평가하기 위해 상이한 CF 제공자로부터 얻은 시료를 등분으로 분리하여 냉동시켰다. 특히, 상이한 제공자 (A, B, C)로부터 새로이 얻은 CF 타액을 275 ㎕ 등분으로 분리하여 냉동시켰다. 해동한 후 등분은 처리하지 않은 경우, 또는 H₂O, 10 μM Trx (+ 0.1 μM TR 및 2 mM NADPH) 또는 디티오트레이톨 (DTT, 1 또는 5 mM)로 처리한 경우 각각 20분 동안 정치시켰고 액체 백분율은 컴팩션 에세이로 측정하였다. 각 제공자 시료에 대해 수행한 3개의 독립적인 실험으로 얻은 결과는 분석 재현성을 평가하는데 사용하였다. 연속 3일에 걸쳐 등분을 해동시키고 물, Trx 및 이의 환원 시스템, 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하거나 전혀 처리하지 않았다.

도 2에 나타낸 바와 같이 첨가 없이 또는 희석액 (H₂O) 처리한 제공자 A로부터의 등분은 전체 부피의 10% 이하의 액상 분획을 가졌다. DTT (1 mM 또는 5 mM) 또는 환원 시스템을 지닌 Trx (30 μM)로 처리한 제공자 A로부터의 타액 등분은 전체 부피 대비 90% 이상 시료의 액체 분획을 증가시켰다. 상기 제공자 A로부터 타액시료의 액체 분획 백분율 값은 추후의 독립적 실험에서 2차 및 3차 결정시 동일한 처리를 한 경우와 비교할 때 거의 변동이 없었다. Trx 또는 DTT 노출에 대해 제공자 B 및 C 시료에서 일어난 변화의 정도는 제공자 A로부터 타액 시료에서 일어난 것 만큼 크지는 않았으나 대조군에 비해서는 여전히 상당히 차이가 있었다. 제공자 B로부터 얻은 시료에 대해 의약 처리 후 액체 상태에서 존재하는 타액의 3일간 변화 백분율은 다음과 같았다 : 1 mM DTT-24-31%; 5 mM DTT-42-57%, 30 μM Trx-46-51%. 제공자 C로부터 얻은 타액에 대해 액체 백분율 값은 다음의 범위이었다 : 1 mM DTT-57-61%; 5 mM DTT-77-79%, 30 μM Trx- 62-81%. 이러한 결과는 컴팩션 에세이가 타액 시료의 이질적 그룹에서 의약에 의해 유도된 액화를 측정하는 방법으로 사용하는데 유효할 만큼 충분한 시료 내 재현성을 지닌다는 것을 보여준다.

실시예 3

다음의 실시예는 Trx가 글루타티온이나 N-아세틸시스테인 보다 강력한 타액 액화제(liquefaction agent)임을 보여준다.

타액을 액화시키는 Trx의 효율성을 타 모노티올 및 디티올 환원제와 비교하였다. 타액 시료를 등분하여 20분 동안 Trx 또는 GSH로 처리하였으며 액체 백분율은 컴팩션 에세이에 의해 결정하였다. 초기 컴팩션 에세이 실험은 등몰 농도의 NADPH 존재하에 타액의 액화에서 Trx 및 GSH 환원 시스템의 강도를 비교하였다. 대조군(무 첨가)과 비교할 때 10, 30 또는 60μM Trx로 처리한 타액에서 액체 분획 백분율의 진전되고 상당한 증가를 관찰할 수 있었다 (도 3A). 반대로 대등한 또는 1 mM의 고농도의 GSH에 대해 노출한 후 타액의 액체 분획의 주요 증가는 관찰되지 않았다. 별도의 연구에서 농도 범위(도 3B)에 걸친 N-아세틸시스테인의 사용 또한 타액을 액화하는데 있어서 덜 효과적임을 알 수 있었다. 도 3A 및 3B에 따르면 실제 백분율은 다음과 같았다 : 무처리 = 2.7 ± 2.3%; H₂O = 4.5 ± 2.7%; 10μM Trx = 34.8 ± 6.6%; 30 μM Trx = 54.6 ± 10.4%; 60 μM Trx = 67.0 ± 8.0%; 30 μM GSH = 7.8 ± 5.7%; 100 μM GSH = 15.9 ± 9.3%; 1 mM GSH = 27.6 ± 3.9%. Trx 및 NAC 효력의 분석도 20분 동안 정치 후 결정하였으나 상이한 타액 시료 집단에 대하여 수행하였다. 값은 5 (GSH) 또는 4 (NAC) 실험으로부터의 평균이다(*P<0.05 대 무처리).

실시예 4

다음의 실시예는 타액 점탄성에 대한 Trx의 영향을 보여준다.

자성의 유동분석계를 Trx 및 이의 환원 시스템이 타액 점도에 주는 영향을 결정하기 위해 수행하였다. 타액 시료에 대한 측정은 정치 전 및 후에 Trx 환원 시스템으로 수행하여 변화를 logG^*(점탄성)로 결정하였다.

무처리, H₂O 또는 티오레독신 노출된 CF 타액의 점탄성 데이터 (log G^*)

처리	무	H2O	3 μM Trx	10μM Trx	30 μM Trx
전	3.31± 0.05	3.30± 0.06	3.37± 0.06	3.33± 0.06	3.28± 0.04
후	3.22± 0.04	3.20± 0.03	3.11± 0.04	2.94± 0.05	2.63± 0.04

CF 타액의 등분은 무처리, H₂O 처리 또는 Trx+ 환원 시스템 (0.1 μM TR 및 2 μM NADPH) 처리하여 37℃에서 20분 동안 정치 시켰다. 모든 데이터는 4 시료에 대해 log G^* (평균 ± 표준 오차)로 나타내었다.

도 4A에 나타낸 실험에서 타액 시료는 H₂O 또는 3, 10, 또는 30 μM Trx + 0.1 μM TR 및 2 mM NADPH로 20분 동안 정치 시켰고 log G^*는 자성의 유동분석계에 의해 결정하였다. 데이터는 노출 전과 후에 기록한 log G^* 측정값의 차이로 나타내었다 (Y 축에 표시). 각 컬럼은 4 시료에 대한 평균 ± 표준오차를 나타낸다(◆ H₂O 희석액 값으로부터 통계적으로 검정). 타액을 희석액(H₂O)에 20분 동안 정치시킨 경우 전처리한 값에 비해 log G^* (0.11 log 단위)가 어느 정도 감소하였다. Trx (3 μM), TR (0.1 μM) 및 NADPH (2 mM)에 대한 노출은 희석액 단독으로 처리한 경우에 비해 log G^*(0.26 log 단위)가 상당히 감소하였다(도 4A). 보다 상당한 감소가 더 높은 농도의 Trx에 노출시킨 시료의 경우 명백해졌다 (각각 10 μM Trx에서 0.39 log 단위 감소 및 30 μM Trx에서 0.65 log 단위 감소).

NADPH의 다양한 농도의 영향도 조사하였다 (도 4B; H₂O 또는 10 μM Trx, 0.1 μM TR, 및 0.2, 0.6 또는 2 mM NADPH로 정치시킨 후 log G^*의 변화). Trx (30 μM), TR (0.1 μM) 및 저농도의 NADPH (0.2 mM)에 노출시킨 타액은 점탄성의 어느 정도의 감소를 나타냈다 (0.16 log 단위). 점탄성의 추가 감소는 보다 높은 NADPH 농도인 0.6 mM (0.26 log 단위) 및 2 mM (0.39 log 단위)에서 발생하였고, 이는 타액 점탄성에서 Trx 매개된 환원을 허용하기 위해 감소된 당량이 전제된다는 중요성을 보여준다.

실시예 5

다음의 실시예는 타액 당단백질의 용해도에 대한 Trx의 영향을 설명한다.

뮤신 당단백질 중합체의 디설파이드 결합이 Trx에 의한 환원을 위한 잠재적 표적이 된다. 타액에 존재하는 당단백질에 대한 Trx의 영향을 조사하기 위해 타액의 등분을 H₂O, 10 또는 30 μM Trx 및 이의 환원 시스템에서 20분 동안 정치 시키고 원심분리에 의해 수용성 (Aq) 및 겔 분획으로 분리하였다. 각 불용성 겔 분획은 추가로 구아니디니움 (G)으로 14시간 동안 처리하였다. 처리 후 각 시료의 용해성 및 불용성 상은 분리되고 피리오딕 에시드/쉬프 시약 (PAS) 염색에 의해 당단백질의 함량을 분석하였다. 특히 분획을 1% 아가로오즈 겔 (w/v) 겔에 로딩하고 전기영동시킨 후 PVDF 막으로 이동시켰으며 재료 및 방법에서 설명한데로 피리오딕 에시드/쉬프 시약으로 염색하였다. 도 5를 참조하면, 분자량 표준은 맨 오른쪽 레인이다. 상기 결과는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.

도 5에 나타낸 바와 같이 고분자량의 당단백질의 구분된 밀집현상이 희석액으로 처리한 타액으로부터 유래된 용해성 및 겔 분획 모두에서 탐지되었다. 반대로 PAS 반응성 당단백질의 보다 많은 양이 10 또는 30 μM Trx로 처리한 타액으로부터 유도된 양 상에서 명백하였다. 상기 시료들을 처리하는 과정에서 희석액 처리한 시료의 겔상 매트릭스가 밤새 구아니디니움으로 처리하였음에도 불구하고 높은 불용성을 보유하였다. 상기 불용성은 희석액 및 Trx 처리된 타액으로부터의 겔상 레인에서 관찰된 당단백질 양의 정량적 차이를 설명할 수 있는 이유일 것이다. 더나아가 Trx 노출된 시료에서 글라이코 형태의 상당한 비율은 희석액 처리된 시료에 존재하는 부위보다 큰 전기영동 유동성을 나타내었다. 이러한 발견은 Trx가 용해도를 증가시키고 타액에서 당단백질 중합체의 크기를 감소시킨다는 것을 의미한다.

실시예 6

다음의 실시예는 타액에서 DNA의 용해도에 대한 Trx의 영향을 보여준다.

CF 기도 분비물 중 세포외 DNA의 다량 존재는 CF 타액의 과도한 점탄성에 기인한다. 타액에서 DNA의 용해도에 대한 Trx의 영향을 평가하기 위해 타액 시료 (275 ㎕)를 무첨가, 희석액 (H₂O) 또는 Trx (30 μM) + 환원 시스템으로 20분 동안 정치시켰고 그 후 겔 (불용성) 및 액(용해성) 상으로 분리하였다. 훽스트 분석에 의한 DNA 함량의 측정은 처리하지 않은 시료에 존재하는 대부분의 DNA가 겔 상에 남아 있음을 알 수 있었다 (겔= 0.94 ± 0.26 mg; 액체= 0.05 ± 0.03 mg) (도6). 희석액 처리된 시료는 액상에서 평균 DNA 함량이 어느 정도 증가된다는 것을 보여주었다 (겔= 0.80 ± 0.24 mg; 액체= 0.21 ± 0.23 mg). Trx 처리한 경우 겔에서 액상으로 추가의 DNA 이동이 관찰되었다 (겔= 0.55 ± 0.31 mg; 액체= 0.57 ± 0.37 mg). 도 6을 참조하면 각 분획으로부터 평균 DNA 함량 ± 표준오차를 나타낸다 (n=5 실험) (^*P,0.05 대 무처리 용해성 상).

실시예 7

다음 실시예는 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 가진 환자를 본 발명의 치료조성물로 처치한 예를 설명한다.

4 개월된 여성 소아 환자는 저 체중이며, 자주 덩어리지고 악취나며 기름진 배변을 보이며, 복부가 돌출되어 있으며 자주 기침을 하고 숨을 헐떡거린다. 환자에게 정량적 필로카르핀 이오토포레시스 땀 시험을 한 결과 낭포성 섬유증으로 진단되었다. 폐기능 시험과 흉부 X-레이가 상기 진단을 확인시켰다. 환자는 주기적 평가 및 발생한 경우 폐 이상 처치 및 예방, 양호한 영양섭취 및 물리적 활동을 포함한 치료를 거친다. 13세때 환자는 더딘 성장, 지연된 사춘기, 쇠퇴하는 물리적 인내력, 흔한 폐 감염, 호흡 곤란 및 위장의 불편함을 보인다. 상기 환자는 내과 병원에서 심한 기침, 숨 헐떡임 및 손상된 폐 기능을 보인다.

상기 환자의 기도로부터 수집한 타액의 시료에 대해 컴팩션 에세이를 수행하여 상기 분석 및 종래의 낭포성 섬유증 진단을 기초로 하며 상기 환자는 기도에서 과도하게 점성 및 점착력 있는 점액으로 인해 호흡기능장애가 있다고 결정된다. 폐의 상기 증세를 처치하기 위해 환자에게 인간 티오레독신 복용 단위 당 2.5 mg 및 에어로졸 공급에 의해 계면활성제에서 5 μM의 표면 농도를 달성하기 위한 NADPH 복용량을 포함한 조성물을 투여한다. 상기 환자는 그후 추가의 컴팩션 에세이에 의해 타액의 증가된 액화 및 기도 클리어링에 대한 폐 기능 시험을 통해 모니터링된다. 위에서 설명된 추후의 조성물 복용량은 에어로졸에 의해 매일 투여되며, 이는 환자의 기도가 상당히 깨끗해지고 환자의 증상 및 전체적 건강이 호전될 때까지 계속되었다.

각각의 간행물 및 기타 논의 또는 인용된 참고문헌은 그 전체로서 본 발명에 포함된다.

본 출원은 2002년 9월 10일 출원된 미국 특허출원 60/409,960호 및 2003년 4월 11일 출원한 미국 특허출원 60/462,082호에 대해 우선권을 주장한다. 각 미국특허출원 60/409,960호 및 60/462,082호의 전체 개시된 내용이 본 발명에 인용되어 포함되었다.

본 발명의 다양한 실시예가 상세히 기술되어 있지만 당업계에서 본 실시예의 변형 및 응용이 가능함은 명백하다. 그러나 상기 그러한 변형 및 응용은 이하의 청구항에 기재된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 이해되어야 한다.

<110> National Jewish Medical and Research Center <120> Product and Process for Liquefaction of Mucus or Sputum <150> US 60/409,960 <151> 2002-09-10 <150> US 60/462,082 <151> 2003-04-11 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Cys Gly Pro Cys 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide misc_feature (1)..(6) Xaa = any amino acid <400> 2 Xaa Cys Gly Pro Cys Xaa 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Trp Cys Gly Pro Cys Lys 1 5 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 4 Met Ser Asn Asp Leu Ile Lys His Val Thr Asp Ala Ser Phe Glu Ala 1 5 10 15 Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Val Leu Val Asp Tyr Trp Ala Glu 20 25 30 Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Val Leu Asp Glu Ile Ala 35 40 45 Thr Thr Tyr Ala Gly Lys Leu Thr Ile Ala Lys Leu Asn Ile Asp Glu 50 55 60 Asn Gln Glu Thr Pro Ala Lys His Gly Val Arg Gly Ile Pro Thr Leu 65 70 75 80 Met Leu Phe Lys Asn Gly Asn Val Glu Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu 85 90 95 Ser Lys Ser Gln Leu Ala Ala Phe Leu Asp Ala Asn Ile 100 105 <210> 5 <211> 104 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 5 Met Ala Leu Gln Ile Thr Asp Ala Thr Phe Asp Gly Leu Val Ala Glu 1 5 10 15 Gly Lys Pro Met Val Val Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys 20 25 30 Arg Met Val Gly Pro Ile Ile Asp Glu Leu Ala Ala Glu Tyr Glu Gly 35 40 45 Arg Ala Ile Ile Gly Lys Val Asp Val Asp Ala Asn Thr Glu Leu Pro 50 55 60 Met Lys Tyr Gly Val Arg Asn Ile Pro Thr Ile Leu Phe Ile Lys Asn 65 70 75 80 Gly Glu Val Val Lys Lys Leu Val Gly Ala Gln Ser Lys Asp Val Phe 85 90 95 Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Phe 100 <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 6 Met Val Lys Glu Ile Thr Asp Ala Thr Phe Glu Gln Glu Thr Ser Glu 1 5 10 15 Gly Leu Val Leu Thr Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Arg 20 25 30 Met Val Ala Pro Val Leu Glu Glu Ile Gln Glu Glu Arg Gly Glu Ala 35 40 45 Leu Lys Ile Val Lys Met Asp Val Asp Glu Asn Pro Glu Thr Pro Gly 50 55 60 Ser Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Ile Lys Lys Asp Gly 65 70 75 80 Glu Val Val Glu Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Pro Lys Glu Glu Leu Asp 85 90 95 Glu Val Ile Asn Lys Tyr Val 100 <210> 7 <211> 103 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Val Thr Gln Phe Lys Thr Ala Ser Glu Phe Asp Ser Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gln Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Thr Trp Cys Gly Pro 20 25 30 Cys Lys Met Ile Ala Pro Met Ile Glu Lys Phe Ser Glu Gln Tyr Pro 35 40 45 Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Gly Asp Val Ala 50 55 60 Gln Lys Asn Glu Val Ser Ala Met Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn 65 70 75 80 Gly Lys Glu Val Ala Lys Val Val Gly Ala Asn Pro Ala Ala Ile Lys 85 90 95 Gln Ala Ile Ala Ala Asn Ala 100 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 8 Met Val Lys Ser Val Gly Asn Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Leu Lys 1 5 10 15 Ala Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Phe Gly Asp Val Val Phe Ile Glu Ile Asp Val Asp Asp Ala Gln Asp 50 55 60 Val Ala Thr His Cys Asp Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Asn Gly Lys Lys Val Gln Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Glu Thr Ile Lys Ser Leu Val 100 105 <210> 9 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Ser Ile Thr Glu Tyr Ala 100 105 <210> 10 <211> 105 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Thr Glu Phe Ala 100 105 <210> 11 <211> 105 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 11 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Tyr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ala Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Ile 100 105 <210> 12 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp 50 55 60 Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val 100 105 <210> 13 <211> 134 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 13 Met Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val Phe Gly Ser Gly Glu Asp Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Thr Glu Ser Ser Glu Pro Ser Arg Val Leu Lys Phe Ser 20 25 30 Ser Ser Ala Arg Trp Gln Leu His Phe Asn Glu Ile Lys Glu Ser Asn 35 40 45 Lys Leu Leu Val Val Asp Phe Ser Ala Ser Trp Cys Gly Pro Cys Arg 50 55 60 Met Ile Glu Pro Ala Ile His Ala Met Ala Asp Lys Phe Asn Asp Val 65 70 75 80 Asp Phe Val Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Pro Asp Val Ala Lys Glu 85 90 95 Phe Asn Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Val Leu Val Lys Arg Gly Lys 100 105 110 Glu Ile Glu Arg Ile Ile Gly Ala Lys Lys Asp Glu Leu Glu Lys Lys 115 120 125 Val Ser Lys Leu Arg Ala 130 <210> 14 <211> 167 <212> PRT <213> Zea mays <400> 14 Met Ala Met Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Leu His Ala Pro Ala 1 5 10 15 Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Val Gly Asn Leu Val Leu Pro Ser Lys 20 25 30 Arg Ala Leu Ala Pro Leu Ser Val Gly Arg Val Ala Thr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg His Val Cys Gln Ser Lys Asn Ala Val Asp Glu Val Val Val Ala 50 55 60 Asp Glu Lys Asn Trp Asp Gly Leu Val Met Ala Cys Glu Thr Pro Val 65 70 75 80 Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Arg Met Ile Ala 85 90 95 Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Thr Cys 100 105 110 Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn Val Ala Ser Thr Tyr Gly 115 120 125 Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Ile Phe Lys Gly Gly Glu Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Ser Thr Leu Thr Thr Leu Ile 145 150 155 160 Asp Lys Tyr Ile Gly Ser Ser 165 <210> 15 <211> 172 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 15 Met Ala Leu Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Thr Leu His Ala Pro 1 5 10 15 Gln Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Gly 20 25 30 Ala Gly Ser Ser Gln Ser Lys Pro Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro Ser 35 40 45 Pro Leu Arg Pro Ala Ser Arg Phe Ala Cys Gln Cys Ser Asn Val Val 50 55 60 Asp Glu Val Val Val Ala Asp Glu Lys Asn Trp Asp Ser Met Val Leu 65 70 75 80 Gly Ser Glu Ala Pro Val Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly 85 90 95 Pro Cys Arg Met Ile Ala Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Glu Tyr 100 105 110 Val Gly Lys Ile Lys Cys Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn 115 120 125 Ile Ala Thr Asn Tyr Gly Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Met Phe 130 135 140 Lys Asn Gly Glu Lys Lys Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Thr 145 150 155 160 Thr Leu Ala Thr Ile Ile Asp Lys Tyr Val Ser Ser 165 170

Claims (26)

1. 접촉하는 단계 전보다 점액 또는 타액의 액화를 증대시키는데 효과적인 환원된 상태의 티오레독신의 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물과 환자의 점액 또는 타액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 가진 환자의 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 환자가 점액 또는 타액의 비정상적인 또는 과도한 점도 또는 점착력이 질병의 증상 또는 원인인 폐질환을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 환자가 낭포성 섬유증을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서,

   환자의 타액 또는 점액을 상기 조성물과 접촉시키는 단계가 비강, 기관내, 기관지, 폐에 직접 설치 및 호흡으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경로에 의해 환자에게 상기 조성물을 도입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서,

   접촉시키고자 하는 점액 또는 타액이 환자의 호흡기 계통, 소화기 계통 또는 생식기 계통에 위치한 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 조성물이 환자에게 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서,

   상기 단백질 또는 펩타이드가 환자의 1 kg 중량 당 약 1.5 mmole 내지 150 mmole의 양으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서,

   상기 단백질이 환자 체내에서 약 5분 내지 약 24시간의 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서,

   환자로부터의 점액 또는 타액 시료의 전체 부피의 액상이 상기 조성물의 투여 후 통계적으로 상당히 증가함을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 C-X-X-C를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 2)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호 3)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항에 있어서,

    상기 단백질이 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 및 포유류의 티오레독신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 티오레독신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서,

    상기 단백질이 인간의 티오레독신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서,

    상기 조성물이 단백질의 티오레독신의 활성 부위를 환원시키기 위해 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원 형태)(NADPH)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서,

    상기 조성물이 추가로 티오레독신 환원효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 환원된 상태의 티오레독신 활성 부위를 함유하는 단백질 또는 펩타이드와 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 처치하기 위한 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 점액 또는 타액의 액화에 이용하기 위한 조성물.
19. 제 18항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 18항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 X-C-G-P-C-X(서열번호 2)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태이고 X 잔기는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제 18항에 있어서,

    상기 티오레독신 활성 부위가 아미노산 서열 W-C-G-P-C-K(서열번호 3)를 포함하고, 이때 상기 C 잔기는 환원된 상태인 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 18항에 있어서,

    상기 단백질이 원핵생물의 티오레독신, 효모의 티오레독신, 식물의 티오레독신 및 포유류의 티오레독신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 티오레독신을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 18항에 있어서,

    상기 단백질은 인간의 티오레독신을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 18항에 있어서,

    상기 조성물이 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원 형태)(NADPH)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 제 24항에 있어서,

    상기 조성물이 추가로 티오레독신 환원효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 환자의 호흡 계통에서의 점액 또는 타액을 아미노산 서열 X-C-X-X-C-X, 이때 C는 환원된 상태의 잔기, 를 포함하는 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키고, 이때 조성물의 접촉은 상기 조성물과의 접촉 전보다 환자로부터의 점액 또는 타액 시료에서 액상의 부피를 증가시키는 것을 특징으로 하는 과도하게 점성 또는 점착력 있는 점액 또는 타액을 가진 환자의 점액 또는 타액의 액화를 증가시키는 방법.