KR100308679B1 - 호흡기내병리학적뮤코이드기도내용물의점도를감소시키는방법 - Google Patents

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토마스 피. 스토셀
스튜어트 이. 린드
폴 에이 잔메이
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쉘비 칼베르그 모르스
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Abstract

본 발명은 일반적으로 병리학적 기도 내용물, 및 특히 뮤코이드 내용물의 존재로 야기된 기류 및 섬모 클리어런스가 제한된 환자에 있어서 정상적인 호흡기도 기류를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이러한 내용물의 존재를 함유하는 병리학적 호흡상태의 환자의 호흡기도내로 액틴-결합 단백질을 투여한다. 액틴-결합 단백질은 내용물내 액틴 중합체에 결합하여 점도를 감소시킨다. 또한 액틴-결합 단백질은 액틴이 외인성 또는 내인성 DNase I에 결합하는 것을 저해하여, 내용물내 DNA 중합체의 분해를 증가시킨다.

Description

[발명의 명칭]
호흡기내 병리학적 뮤코이드 기도 내용물의 점도를 감소시키는 방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 호흡기도 점액내 DNA의 분해를 촉진시키거나 액틴 필라멘트를 분해, 해중합 또는 용해시키는 것이 바람직한 호흡기 질병의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기도 질병에서 호흡기를 폐쇄하는 점액의 클리어런스 증가 및 용해화에 관한 것이다. 본 발명은 액틴-결합 단백질을 호흡기에 적하하여 점액의 점도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 호흡기 점액내 액틴의 수치를 감소시키거나 액틴이 DNase I에 결합하는 것을 차단함으로써 호흡기 치료시 DNase I의 작용을 용이하게 하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유효량의 액틴-결합 화합물, 또는 그 단편 또는 그 작용성 유도체를 투여하여, 상기 치료가 필요한 환자의 호흡기내에서 그 화합물, 그 단편 또는 그 유도체가 활성이 되게 하는 것을 포함한다.
[발명의 배경]
[기도 폐쇄]
염증성 삼출에 의해 야기되는 기도 폐쇄가, 이환 상태(morbidity) 및 치사성의 주요 원인이다. 점액 전색 및 저류는 만성 기관지염, 천식성 기관지염, 박테리아성 기관지 폐렴, 및 특히 낭종성(cystic) 섬유증의 특징이며, 폐물질의 파괴와 관련되어 있다. 또한 점액은 급성 및 만성 정맥동염, 및 보통 감기의 이환상태에도 기여한다.
호흡기의 뮤코이드 폐쇄의 요인은 다양하다. 한가지 요인은, 감염 또는 자극에 의해 유도된 염증 매개자에 의해 야기된 점액 합성 및 방출의 증가이다. 낭종성 섬유증에서 점액의 점도가 증가하는데, 이는 아마도 점액 물질을 구성하는 이온성 중합체의 전하 또는 수화에 영향을 미치는 비정상적 상피성 이온 이동 때문일 것이다. 낭종성 섬유증의 두꺼운 점액 때문에 섬모 이동에 의한 박테리아 클리어런스가 저해되고 박테리아, 특히 슈도모나스 에루기노사의 성장이 좋게 된다. 이들 박테리아 또는 다른 자극물(예, 담배 연기)로 인해 화학주성 인자가 발생하여, 기도내로 백혈구가 보충된다. 백혈구가 박테리아 또는 자극물과 만날 때, 백혈구는 변성되고 그 성분이 조직파편(debris)이 되어 기도 내용물의 점탄성에 영향을 미친다.
병리학적 뮤코이드 기도 내용물의 영역에 대한 많은 연구들이 DNA에 촛점을 맞추어왔는데, DNA가 원래 농(pus)으로부터 분리되었기 때문이다. 그러나, 또한 점액의 뮤코다당류 조성 및 이황화물 결합의 역할에 대한 연구들[로버츠, 지. 피., Arch. Biochem. Biophys, 173:528-537(1976): 로버츠. 지.피. Eur. J. Biochem. 50:265-280(1974): 차르만, 제이. 외 다수, Brit. J. Dis. Chest 68:215(1974); 바스카르, 케이. 알. 외 다수, Exp. Lung Res. 10:401-422(1986); 레템, 엠. 아이. 외 다수, Eur. Respir. J. 3:19-23(1990)]이 있어왔다. 화농 점액은 약 10~13 mg/ml의 DNA를 함유하는데, 이온성 중합체는 기도 유체의 유동학적 성질에 영향을 미친다고 여겨져 왔다. 수년전에 DNA를 분해하는 효소인 소 췌장 DNase I을 점액 용해제로서 테스트했다. 그러나, 항원성(antigenicity) 및/또는 프로테아제를 오염시켜서 부반응을 야기하기 때문에 임상적으로 사용되지 않았다. 따라서, 사람 DNase I에 대한 cDNA를 클론한 후 발현시켰다. 재조합 사람 DNase I을 치료제로서 테스트했다. 이것은 시험관내에서 낭종성 섬유증 점액의 점도를 감소시켰다[샤크, 에스.외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 87: 9188~9192(1990)]. 최근에 미합중국에서는 사람 DNase I을 이용해 낭종성 섬유증을 가진 환자(5살 초과)를 치료하는 것을 승인했다.
[새포외 액틴]
액틴은 유핵 동물 세포내에서 가장 풍부한 단핵질이고, 많은 유핵 세포의 단백질의 10~20%를 구성하고 있으며 근육 세포의 단백질의 30%를 구성한다. 액틴 분자는 각각 하나의 ATP 또는 ADP 분자에 결합하여, ATP가 ADP로 가수분해되는 동안 긴 필라멘트로 자가-회합된다.
동물 조직에 손상이 가면 액틴이 세포외 공간으로 방출된다. 비록 비(非)근육 세포 액틴의 약 절반이 F-액틴(G-액틴 단량체로부터 회합된 이중-나선형, 막대형, 필라멘트 형태의 액틴)이지만, 세포외 유체의 이온 상태가 액틴 중합화에 유리하기 때문에, 충분히 농축된 경우(1 ml당 수 ㎍초과)에는 괴사 세포로부터 방출되는 거의 모든 액틴은 필라멘트로 중합되리라 여겨진다[린드, 에스, 이. 외 다수, Am. Rev. Respir. Dis. 138: 429-434(1988)]. 단백 분해 효소에 의한 분해에 비교적 저항성인, 긴 막대형 필라멘트로 액틴이 중합된다. 정제된 용액에서, 필라멘트-단축 단백질의 부재하에 액틴 필라멘트는 용이하게 수 마이크론의 길이가 될 수 있다.
세포내 액틴의 양이 많기 때문에, 괴사 세포로부터의 액틴의 방출은, 세포외 유체(예, 뮤신)의 점도를 증가시키거나 및/또는 세포를 포획하거나, 또는 다른 원인에 의해 비록 아직 미확인된 독성 영향이지만 미소환경에 중요한 영향을 가지는 충분량의 액틴을 제공한다. 세포외 유리 액틴의 주입은 동물 조직에 유독하다[하퍼, 케이. 디 외 다수, Clin. Res. 36:625A(1988); 하다드, 제이.지. 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 87:1381-1385(1990)]. 만일 하기와 같이 손상받은 세포로부터 방출된 액틴이 액틴-결합 단백질에 결합된다면, 이 액틴은 단량체성 또는 올리고머성으로 잔류할 것이다.
[액틴-결합 단백질]
자연적으로 액틴과 회합하는 단백질이 다수 있다. 이러한 액틴-결합 단백질을 보기 위해서는, 하기 문헌을 보면 된다[스토셀, 티.피. 외 다수, Ann.Rev. Cell Biol. 1:353-402(1985); 폴라드, 티. 디. 외 다수, Ann. Rev. Biochem. 55:987-1035(1986)]. 그러나 2개의 단백질, 즉 겔솔린 및 DBP(비타민 D 결합 단백질)이 주로 세포외 액틴에 결합하는 것으로 여겨진다[잔메이, 피. 에이. 외 다수, Blood 70:529-530(1987)].
혈장 겔솔린(종종 브레빈으로 호칭됨) 및 DBP(소위 Gc 글로블린)은 혈장내 존재하는 2개의 고친화성 액틴-결합 단백질이다. 고친화성 액틴-결합 단백질은 10-8미만의 Kd로 액틴과 결합한다. 겔솔린 및 DBP 양쪽 다 혈청내 액틴과 결합하고, 액틴 해중합 활성을 가진다. DBP는 우선적으로 단량체성 액틴에 결합하고, 겔솔린은 우선적으로 액틴 필라멘트에 결합한다.
겔솔린은 포유류 세포질 및 세포외 유체에서 수득되는 다가작용성 액틴-결합 단백질이다. 혈장 겔솔린은 분자의 아미노 말단에 25 아미노산이 추가로 있어 세포 겔솔린과 다르다. 혈장 및 세포 겔솔린 둘다 단일의 유전자의 산물이다. 혈장 겔솔린은 3개의 액틴-결합 부위를 지니며, G-액틴 또는 F-액틴에 고친화성으로 결합한다.
혈장 겔솔린은 첫번째 액틴 분자와 결합하는 것보다 높은 친화성으로 두번째 액틴 분자와 결합한다. 그러므로 혈장 겔솔린은 1:1 복합체를 넘어 우선적으로 2:1 복합체를 형성하고, 단량체보다는 필라멘트에 결합한다. F-액틴에 첨가되었을 때, 혈장 겔솔린은 비단백분해적인 방법으로 필라멘트를 절단하고 새로 형성된 필라멘트의 한쪽 말단에 결합된 채로 잔류한다. 유리 겔솔린 분자가 존재하는 경우에, 이는 액틴 필라멘트를 연속적으로 절단하고, 필라멘트를 신속히 해중합함으로써 2:1 액틴-겔솔린 복합체만이 존재하게 된다.
유리 및 (액틴에) 복합된 겔솔린 분자는 그 작용적 성질이 다르다. 유리 겔솔린은 액틴 필라멘트를 절단할 수 있으나, 액틴-겔솔린 복합체는 액틴 필라멘트를 절단할 수 없다.
혈장 및 다른 세포외 유체의 겔솔린의 주된 작용은, 액틴 필라멘트를 절단하는 것이다. 겔솔린이 과량으로 액틴과 존재하는 경우에는, 겔솔린-액틴 복합체만 형성된다. 액틴이 과량 있는 경우에는, 유리 액틴 올리고머 및 겔솔린-액틴 복합체가 존재한다. 액틴의 절단은, 인접하는 액틴 분자사이의 비공유 결합의 비단백분해적 분해에 의해 일어난다. 겔솔린의 절단 작용은 마이크로몰의 Ca++및 6 보다 높은 pH에 의해 활성화되고, 포스파티딜 이노시톨 4-5-비스포스페이트(PIP2) 및 포스파티딜 이노시톨-4-모노포스페이트(PIP)에 의해 억제되는 것으로 나타난다. 세포외 Ca++농도는 밀리몰 수치이고 세포외 유체는 통상 겔솔린을 억제하는 형태의 PIP 또는 PIP2를 함유하지 않으므로, 혈장 겔솔린은 세포외 유체내에서 구조적으로 활성이다.
사람 세포외(혈장) 겔솔린 cDNA는 클론되고 서열되어 있다[키아트코우스키, 디. 제이. 외 다수, Nature 323:455-458(1986); 키아트코우스키, 디. 제이. 외 다수, J. Cell Biol. 106:375-384(1988)]. 액틴에 결합하는 능력을 보유한 본래의 단백질의 단편은 동정되어 왔다[브리앙, 제이., J. Cell Biol. 106:1553-1562(1988); 인, 에이치. 엘. 외 다수, J. Cell Biol. 107:465a(1988), 초록, 번호 2616; 키아트코우스키, 디. 제이. 외 다수, J. Cell Biol. 108: 1717-1726(1989); 웨이, 엠 외 다수, J. Cell Biol. 109:593-605(1989)]. 이것이 유전적으로 다형성이라는 것을 암시하는 증거는 없는데(단일의 아미노산 돌연변이가 혈장 겔솔린내에서 발견되는 소위 피니시-유형의 아밀로이드증의 흔하지 않은 유전 질병을 제외함), 이는 재조합 사람 단백질의 사용으로 면역원성 또는 다른 독성 영향이 야기되지 않아야 한다는 것을 나타낸다. 혈장 겔솔린은 많은 체액에서 검출되어 왔는데, 이는 겔솔린이 기도 유체의 정상 성분일 수 있으며, 적어도 염증 상태에서는 기도 유체의 정상 성분이라는 것을 암시한다.
DBP 역시 클론되었다[쿠크, 엔. 이. 외 다수, J. Clin. Invest. 76:2420-2424(1985); 양, 에프. 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 82:7994-7998(1985)]. DBP는 단일의 액틴-결합 부위를 지녔고 구조적으로 단량체성 액틴에 결합하나, F-액틴에는 결합하지 않는다.
[액틴 및 DNase I]
DNase I의 촉매 작용은, 그 효소가 밀접하게 결합하는 액틴에 의해 저해된다[린드버그, 유., Biochem. Biophys. Acta 82:237-248(1964); 라자리드 및 린드버그, Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 71:4742-4746(1974)]. 액틴은 백혈구의 단백질 질량의 약 10%를 차지한다. 그러므로 DNA 중합체 뿐만 아니라 풍부한 액틴이 화농성 기도 내용물내에 존재할 수 있다. 액틴이 이 내용물내에 존재하는 경우에는, DNase I이 첨가되는 분비물내 존재하는 액틴에 DNase I이 결합함으로써 DNA 분해에 있어 DNase I의 효능이 감소되는 것을 예상할 수 있다.
액틴 필라멘트 단독으로는 고 탄성의 네트워크를 생산하며, 점액 및/또는 DNA 중합체내로 투과되었을 때에, 피브린과 함께 형성하는 것처럼 매우 강성의 겔을 형성하는 것을 예상할 수 있다[잔메이, 피. 에이., Blood 80:928-936(1992)]. 그러므로, 특히 액틴 필라멘트를 절단함으로써[잔메이. 피. 에이., Curr. Opinion Cell Biology 3:4-11(1991)] 액틴 필라멘트를 분해시키는 액틴-결합 분자의 혼입은, 기도 점액, 특히 화농성 기도 점액의 점조도(consistency)를 감소시키는 수단으로 유리하다.
액틴이 DNase I의 촉매 작용을 억제하므로, 액틴-결합 분자는 또한, DNase I이 유효하리라고 예견되는 DNA-함유 기도 점액으로부터 액틴을 용해시키고 용이하게 제거시킴으로써 DNA를 분해하는 DNase I의 효능을 높인다.
[발명의 요약]
본 발명은, 백혈구가 화농성 점액의 주요 성분이고 액틴이 백혈구의 단백질 질량의 약 10%를 차지하므로, 액틴이 화농성 뮤코이드 기도 내용물내에 풍부하게 존재하리라는 출원인의 고려를 기초로 한다. 또한 본 발명은 화농성 점액내 DNA 중합체를 분해하는 DNase I의 효능이 점액내 존재하는 액틴에 결합함으로써 감소되는 것을 예견할 수 있다는 고려에 근거를 두고 있다. 그러므로 내인성 DNase I 및 치료 목적으로 부가된 DNase I 양쪽의 영향 모두, 효소가 첨가되는 분비물내 존재하는 액틴에 결합함으로써 감소될 것이다.
따라서 본 발명은, 병리학적 뮤코이드 기도 내용물을 가진 환자에게 액틴-결합 화합물, 또는 그 단편 또는 그 작용성 유도체를 투여하여 호흡기의 폐쇄를 치료 및 방지한다는 출원인의 고려에 기초하고 있다. 그러므로 본 발명의 목적은, 액틴 필라멘트를 해중합하는 방법, 액틴 중합화를 방지하는 방법 및 기도 질병이 있는 개체의 호흡기내 액틴 수치를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기도 질병, 특히 염증성 기도 질병이 있는 개체의 호흡기내 기류 및 정상적 개구를 폐쇄하는 뮤코이드 기도 내용물의 점도를 감소시키거나 기도 내용물을 용해시키는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 액틴-결합 화합물, 특히 액틴-결합 단백질을 호흡기내로 적하하여,
1) 기도 내용물, 특히 뮤코이드 기도 내용물을 고형화하는 분쇄된 백혈구 및 기타 세포들로부터 방출된 액틴 필라멘트를 분해(해중합, 단편화 및 해리)하거나 또는 회합을 방지하고/하거나,
2) 점액의 점탄성을 증가시키는 DNA 중합체를 분해하는 DNase I 효소의 작용을 액틴이 억제하지 못하도록 방지하여서, 병리학적 기도 내용물의 점도 또는 점조도를 감소시키는 방법을 제공한다. DNase I은 내인성일 수도 있고, 치료 목적으로 에어로졸화 또는 다른 적절하고 유효한 방법에 의해 제공될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 목적은 액틴-결합 화합물, 특히 액틴-결합 단백질을 호흡기에 투여함으로써 호흡기내 DNase I에 결합하는 액틴의 수치를 감소시키는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 액틴-결합 화합물, 특히 액틴-결합 단백질을 투여하여 병리학적 뮤코이드 기도 내용물내 DNA 분해를 증가시키는 것이다.
이하에서 한층 명백하게 되는 본 발명의 목적들은, 기도 내용물내로 액틴 및 /또는 DNA가 방출된 후에 일어나는 폐쇄증을 치료하는 섭생법 및 용량으로 하나 이상의 액틴-결합 단백질 또는 그 단편 또는 그 작용성 유도체를, 기도 폐쇄증을 야기하는 뮤코이드 기도 내용물을 지닌 환자에게 투여함으로써 달성될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
[제1도]
낭종성 섬유증 담(sputum)의 역학 전단 모듈러스.
겔솔린 또는 겔솔린 단편이 존재 또는 부재하는 담 시료를 토오션 추(pendulum)의 평행 원형판사이에 놓고[페리, 제이. 디. 중합체의 점탄성 성질, 제 3판, 존 와일리 & 선즈, 뉴욕(1980)], 상부의 시료판에 부착된 아암에 순간 변위를 적용했다. 생성되는 자유 오실레이션의 진동수 및 감폭으로부터 역학 전단 모듈러스 G'를 계산했다. 액틴 중합체를 함유하는 용액의 G'는 액틴 필라멘트 평균 길이에 강하게 좌우된다[잔메이 외 다수, 생화학 27:8218-8226(1988)].
1A : 낭종성 섬유증 담만 존재;
1B : 낭종성 섬유증 담 및 겔솔린 존재;
1C : 낭종성 섬유증 담 및 겔솔린 아미노산 단편 1-260.
[제2도]
낭종성 섬유증 담의 전단 크리프 및 회복성.
겔솔린 또는 겔솔린 단편이 존재 또는 부재하는 담 시료를 토오션 추의 판사이에 놓고 일정 전단 응력을 적용시켰다. 차후의 변형을 전단 컴플라이언스(전단 스트레인/가한 응력의 비율)로 정량했다. 필라멘트 평균 길이가 감소함에 따라 F-액틴의 컴플라이언스는 급격하게 증가한다는 것을 기존의 연구들이 보여준다[잔메이 외 다수, 생화학 27:8218-8226(1988)]. 스트레인에 있어 급격한 감소는 적용된 응력의 방출을 나타낸다.
[제3도]
겔솔린 및 DNase I의 용량 반응 곡선.
60분동안 항온처리한 후에 겔솔린 또는 DNase I 존재하의 담 시료의 점도에 있어서의 변화를 토션 추내에서 측정했다. 농도 증가와 함께 점도에 있어서의 변화를 초기 점도의 백분율로서 나타냈다.
[제4도]
DNase I과 혼합된 겔솔린의 담 점도에 대한 영향.
화합물을 첨가하고 60분의 주기에 걸쳐 겔솔린, DNase I, 또는 겔솔린과 DNase I 존재하의 담 시료 점도에 있어서의 변화를 토션 추내에서 측정했다. 시간 경과에 따른 결과를 초기 점도의 백분율로서 나타냈다.
[제5도]
액틴-결합 화합물들의 배합물의 담 점도에 대한 영향.
Gc 글로블린(비타민 D 결합 단백질)과 혼합된 겔솔린을 첨가하고 60분의 주기에 걸쳐 담 시료 점도의 변화를 토션 추 내에서 측정했다. 시간 경과에 따른 결과를 초기 점도의 백분율로서 나타냈다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 기도(호흡기) 내용물이, 기도 내용물의 점조도 또는 점도를 증가시켜서 정상적인 클리어런스를 방해하여 병리학적 결과를 야기하는 액틴 필라멘트 및 DNA 중합체를 함유할 수 있다는 고려에 기초를 둔 것이다. 따라서 본 발명의 목적은, 액틴 필라멘트의 해중합 또는 분해, 액틴 중합화의 억제, 액틴 수치의 감소 및 DNA 중합체의 분해를 야기시킴으로써 병리학적 기도 내용물의 점도 또는 점조도를 감소시키는 것이다. 따라서 본 발명의 한 구체예에서, 기도 내용물이, 호흡 곤란을 야기하는 액틴 필라멘트 및 DNA 중합체를 함유하는 환자의 호흡기내에 액틴-결합 화합물(들)을 주입시킨다. 액틴-결합 화합물은 액틴을 분해할 수 있으며, 유리 단량체성 액틴의 중합화를 방지 또는 감소시킬 수 있고/있거나, 액틴 필라멘트 또는 단량체가 DNase I에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 본 발명의 일반적인 구체예는, 이러한 기도 내용물이 존재하는 결과로서 호흡 곤란을 겪는 개체의 호홉기 내 병리학적 호흡기도 내용물의 점조도 또는 점도를 감소시키거나 또는 용해화시키는 것이다.
본 발명은 또한, 기도 점액의 점조도 또는 점도를 증가시키는 액틴 필라멘트 및 DNA 중합체를 기도 점액이 함유하여 정상적 기류 및 클리어런스를 저해할 수 있다는 고려에 기초를 둔 것이다. 따라서 본 발명의 목적은, 그러한 점액을 함유하는 호흡기내로 액틴-결합 화합물(들)을 투여함으로써 그러한 점액의 점조도 또는 점도를 감소시키는 것이다. 액틴 필라멘트를 액틴 단량체로 분해(해중합)시킴으로써, 또는 액틴이 DNase I에 결합하는 것을 방지하기 위해 액틴에 결합함으로써, 또는 양쪽 기전으로 액틴-결합 화합물은 작용할 수 있다. 또한 액틴 단량체가 필라멘트로 중합화되는 것을 방지함으로써 액틴-결합 화합물이 작용할 수도 있다. 점액 클리어런스를 증진시킴으로써, 이 화합물은 궁극적으로 기도 내용물내 액틴의 수치를 감소시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 한 구체예에서는 호흡기가 상기 점액을 함유하는 개체의 호흡기에 액틴-결합 화합물(들)을 투여함으로써, 상기 점액을 용해시키거나 기도 점액의 점도 또는 점조도를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 호흡기내 화농성 점액이 상당한 백혈구 오염물을 함유하여 상기 점액이 점액의 점조도 또는 점도를 증가시키는 DNA 중합체를 함유하고, 또 점액이 기도 폐쇄, 객출 감소, 다른 형태의 호흡 곤란에 기여할 정도의 양의 액틴 필라멘트를 함유할 수 있다는 고려를 기초로 한 것이다. 따라서 본 발명의 목적은, 상기 점액내 존재할 수 있는 액틴 필라멘트의 분해(해중합)를 야기시키고 상기 점액내 존재하는 DNA 중합체의 분해를 증가시킴으로써, 화농성 점액의 점도 또는 점조도를 감소시키는 것이다. 그러므로 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이러한 점액을 가지는 개체의 호흡기에 액틴-결합 화합물(들)을 투여함으로써 화농성 점액의 점조도 또는 점도가 감소된다. 액틴을 액틴 단량체로 해중합시키거나, 액틴 필라멘트 및 단량체에 결합하여 액틴 필라멘트 및 단량체가 DNase I에 결합하는 것을 방지함으로써, 또는 양쪽에 의해 액틴-결합 화합물들은 그 영향을 나타낼 수 있다. 또한 액틴-결합 화합물은, 액틴 단량체가 필라멘트로 중합화되는 것을 방지함으로써 작용할 수도 있다. 점액 클리어런스를 증진시킴으로써, 궁극적으로 액틴-결합 화합물은 기도 내용물내 액틴의 수치를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 모든 구체예에서, DNase I이 존재한다면, 이것은 내인성이거나 또는 치료 목적으로 외래적으로 첨가된 것일 수 있다. DNase I을 치료 목적으로 첨가하는 경우에는, DNase I은 액틴-결합 화합물(들)과 함께 공투여되거나, 별도로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 호흡기내에 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액을 가지는 환자에게 액틴-결합 화합물의 단편 또는 작용성 유도체를 투여하여, 호흡기의 폐쇄 또는 객출의 감소를 방지한다.
본 발명의 바람직한 구체예에는, 하기 (1),(2) 및 (3) 작용중 하나 이상을 할 수 있는 액틴-결합 화합물들을 이러한 치료가 필요한 환자의 호흡기에 투여함으로써, 특정한 기도 내용물의 점조도를 감소시키는 방법들이 지시되어 있다; (1) 분쇄된 백혈구 및 다른 세포들로부터 방출되어 기도 내용물을 고형화시키는 액틴 필라멘트를 분해, 해중합, 단편화 및 해리한다(또는 액틴 단량체 및 올리고머의 회합 또는 중합화를 방지한다); (2) 액틴이 DNase I에 결합하는 것을 차단함으로써 DNA 중합체를 분해하는 DNase I의 작용을, 액틴이 저해하는 것을 방지한다; (3) 내용물의 클리어런스를 증진시킴으로써 기도 내용물의 액틴의 수치를 궁극적으로 감소시킨다. 본 발명의 목적에 비추어 호흡 기도 내용물내 존재하는 액틴은, 유리 단량체 또는 필라멘트 형태로 상기 내용물내에 존재하는 세포외 액틴으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서는, 단백질 겔솔린 또는 그 활성 단편 또는 그 작용성 유도체를 사용한다. DNase I을 호흡 곤란 환자에게 투여하는데 사용되는 방법과 같은 통상적인 방법에 의해 겔솔린을 호흡기내로 투여할 수 있다. 그러나, 이 치료는 겔솔린만으로 한정되지는 않는다. 겔솔린은 다른 액틴-결합 화합물(바람직하게는 비타민 D 결합 단백질)과 함께 또는 DNase I과 함께 공-투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 액틴-결합 화합물(들)(바람직하게는 겔솔린)은 또한 정맥 내 투여 경로에 의해 기도로 투여될 수 있다. 이 구체예는, 흡입에 의한 약물 송달은, 폐쇄증 때문에 울혈된 기도내로 원천적으로 한정될 수도 있다는 것을 고려한 것이다. 효율적인 용해화로 흡입에 의한 약물 송달을 증가시킬 수 있다고 기대된다. 한편, 혈액으로 송달하여도 약물을 기관지 및 세기관지 뿐 아니라 폐포내까지 송달할 수 있고, 만성 염증 및 수반되는 혈액-조직 투과성 증가에 의해 그러한 송달이 증가될 수 있다.
유전성 기종의 α-1-항트립신 치료에 의해 증명된 바와 같이, 혈장 단백질이 기도로 들어갈 수 있다는 것은 공지되어 있다. 혈장 단백질이 혈액에서 조직으로 송달되는 효율성은 아마도 이 단백질의 혈액 농도의 직접적인 함수일 것이다. 따라서, 혈장 겔솔린 수치를 측정하여 액틴에 대한 기도의 결합이 고갈 효과를 가졌는지를 결정할 수 있다.
실험적 폐 손상 및 임상적 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)에서 혈장 겔솔린 수치가 저하되었다는 것이 문헌[Am. J. Path. 130:261-267(1988) 및 Am. Rev. Resp. Dis. 138:429-434(1988)]에 나타나 있고, 근육 질량과 혈장 겔솔린 농도 사이에 상당한 관계가 있다고 일부 사람들은 주장한다[야마모토, 에이치. 오사카 가스 그룹 설립 공보 제5권: 145-147(1992)]. 혈장 겔솔린의 주된 원천이 근육이므로, 환자가 만성 감염 및 저산소증에 대한 반응으로 점점 더 악액질로 됨에 따라 혈장 겔솔린 수치가 떨어질 수 있다.
DNase I의 효율이 증가된 본 발명의 모든 구체예에서, 이 구체예의 궁극적인 목적은 병리학적 기도 내용물, 특히 점액 및 화농성 점액내의 DNA 분해를 증가시키는 것이다.
본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있는 질병의 예로서는 낭종성 섬유증, 만성 기관지염, 단순 뮤코이드 기관지염의 점액농성 또는 화농성 악화, 기관지루, 기관지 폐렴, 만연된 세기관지염, 화농성 폐렴, 폐렴-폐포-경화, 점액 전색과 함께 천식성 기관지염의 존재 또는 부재하의 천식, 급성 및/또는 만성 화농성 정맥동염, 축농증, 기관지 확장증, 기관지류, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 후-이식 폐색성세기관지염, 및 알레르기성 세기관지염(섬유화 폐포염)이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 용어에 주어진 범위를 포함하여, 명세서 및 특허 청구범위의 이해를 명확히 하기 위해 하기 정의를 제공했다.
"호홉기(respiratory tract)" 또는 "기도"라는 용어는, 당업자라면 폐 환기 및 주위 대기와 혈액 사이의 기체 교환이 일어나는 방법에 의한, 관상 및 공동성 기판 및 구조를 언급하는 것으로 이해할 것이다. 이것은 그 중에서도 비강 및 갑개(conchae), 청각 튜브의 인두 개구, 인두, 후두, 기관, 기관지, 및 폐를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 도관(tract) 부분, 특히 기관-하부의 부분중에 기도 내용물, 점액, 화농성 점액 등의 치료를 위한 것이다.
당업자라면 "기도 내용물" 또는 "호흡기 내용물"은 기도를 구성하는 세포에 의해 정상적으로 생산되는 물질의 혼합물(예를 들어, 분비액을 통함) 또는 세포 자체의 파편을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서 당업자는, "병리학적 (뮤코이드) 기도 내용물" 또는 "호흡기의 병리학적 (뮤코이드) 내용물"이라는 용어가 비정상적인 호흡기 기능 및/또는 질병을 야기하는 기도 내용물내의 구조적 및 기능적 변화를 만드는 성분(예, 과량의 액틴)을 함유하는 내용물을 말한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 것으로는 낭종성 섬유증, 박테리아 등에서와 같이 점액, 화농성 점액, 두꺼운 점액이 있으며, 이에 한정되지 않는다. 이 성분들은 또한, 점액의 성질을 변화시키고, 질병 또는 곤란을 야기하는 점액의 생물학적 성분일 수 있다. 상기 성분 자체는, 정상적인 기도 내용물의 양에 있어서의 증가, 또는 기도 내용물내에 정상적으로 발견되는 성분들과 성분 유형이 다른 변화에 기여하는 잠복성 질병 상태에 의해 야기될 수도 있다. 예를 들어, 기도 내용물내에서 정상적으로 발견되는 특정 성분이 불균형 또는 비적합한 양으로 존재할 수 있다(예, 과량의 액틴). "호홉 곤란"이란 병리학적 기도 내용물의 결과를 의미하는데, 기류 감소, 기도의 폐쇄, 섬모에 의한 호흡 클리어런스의 감소, 근육 기전에 의한 호흡 클리어런스의 감소(예, 기침, 목구멍 청소 및 재채기), 내용물과의 지속 접촉으로 인한 호흡 자극, 백혈구-유도된 용해 효소의 저류, 염증 매개자, 진균류, 마이코플라스마, 박테리아 또는 다른 미생물들을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
당업자라면 "점액(mucus)"이란 용어를 각종 무기염, 표피탈락된 세포 및 백혈구와 함께, 선(gland) 분비물로 이루어진 점액 막의 유리 점액물(slime)로 이해 할 것이다.
"화농성 점액"이란 용어를 본 발명의 목적에 비추어 볼 때 당업자는, 백혈구 및/또는 표피탈락된 및/또는 파열된 내인성 기도 세포로부터 유도된 DNA 중합체에 의해 비교적 고형화된, 점도가 높은 점액으로 이해할 것이다.
"(뮤코이드) 기도 내용물의 용해화", "점액의 용해화", 또는 "화농성 점액의 용해화"라는 구는 상기 내용물, 점액 또는 화농성 점액의 기계적 성질을 변화시켜, 상기 내용물을 고체상보다는 액체상이 되게 하고 더 순응성이며, 전단 응력에 반응하여 더 유동하기 쉽게 만드는 것을 의미한다. 이러한 성분들의 점도에 기여하는 중합체가 분해되어 또한 내용물/점액/화농성 점액 겔의 틈 사이에 포획된 단백질과 다른 분자를 방출시킬 수 있다. "점도 감소" 또는 "점조도 감소"라는 용어는 직전에 전술한 바와 같이, 기계적 성질을 변화시키는 것으로 이해될 수 있다. 당업자라면 "점도"라는 용어는, 물질의 성분 분자들이 서로 미끄러질 때 그 성분 분자들의 마찰에 좌우되는 물질의 물성을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 점도가 높은 용액은 성분 분자 사이의 마찰도가 높은 것으로 특징지워지며, 반면에 점도의 감소는 성분 분자가 서로 미끄러질 때 성분 분자 사이의 마찰도가 감소된 것으로 특징지워질 것이다.
"외인성 DNase"라는 것은 환자의 호흡기내에서 DNA 중합체에 의해 야기된 호흡 곤란 때문에 DNase 가 필요한 환자에게 임상적인 방법에 의해 첨가되는 DNase를 의미한다.
"내인성 DNase"라는 것은 환자의 호흡기내에, 특히 환자의 호흡기의 점액내에서 정상적으로 발견되는 DNase를 의미한다.
본 발명의 목적상 "DNA 분해를 증가시킨다"라는 용어는 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액내 존재하는 액틴에 결합하는 액틴-결합 화합물의 양을 첨가하는 것을 의미하는데, 만일 상기 액틴-결합 화합물에 노출되지 않는다면 액틴은 체액내 존재하는 DNase에 결합하여, 이 DNase 가 DNA 중합체의 양을 감소시켜서, 점도를 감소시키고 호흡기류와 객출을 증가시키며 기도 내용물에 의해 야기된 다른 형태의 호흡 곤란을 제거하는 것을 저해한다.
"액틴-결합 화합물"이라는 용어는 액틴에 결합하여 액틴의 많은 작용중 하나를 개질할 수 있는 임의의 화합물, 특히 임의의 단백질(또는 펩타이드)을 포함하는 것을 의미하는데, 액틴의 작용의 예로는 필라멘트로 중합되는 액틴 단량체의 능력을 억제하고, 이미 존재하는 필라멘트를 단편화(분해, 해중합)시키며, DNase I에 결합한다. 치료가 필요한 환자에게 투여된 경우에, 본 발명의 액틴-결합 화합물들에는 천연 오염물질이 거의 존재하지 않는데 이 천연 오염물질들은 생체내 (원핵 또는 진핵) 숙주내 또는 시험관내(화학 합성의 결과로서)에서 이러한 화합물과 회합한다. 이러한 화합물들로서는 세포외 액틴-결합 단백질(예, 겔솔린 및 DBP), 및 세포내 가장 풍부한 단백질(예, 마이오신, 트로포마이오신, 프로필린 및 코필린)과 비근육 세포내 가장 풍부한 단백질과 같은 세포내 액틴-결합 단백질이 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법의 범위내에 있는 액틴-결합 화합물로서는 (a) 주로 액틴 단량체를 단편 분리시키는, 즉 중합화에 저항하는 복합체내로 단량체를 결합시키는 액틴-결합 화합물(예, DBP, 프로필린, β4-티모신 1, 및 코필린); (b) 단량체를 단편 분리시키고 필라멘트 절단 작용을 지니는 액틴-결합 화합물(예, 겔솔린, 빌린, 프라그민 및 시버린); (c) 주로 액틴 필라멘트의 말단을 차단하고 그 말단과 단량체의 교환을 방지하는 액틴-결합 화합물(예, 트로포모듈린, cap Z, cap 100, ASP-56): 및 (d) 액틴에 상기 효과를 가지는 액틴-결합 비단백성 분자(예, 액틴 필라멘트의 말단을 차단하고, 개질되어 세포외에 잔류하는 시토샬라신 또는 그 생물학적 활성 유도체)가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 작용성 세포내 액틴과의 상호 작용에 의한 독성을 방지하기 위해서, 유용한 화합물들은 세포외에 잔류한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 액틴 필라멘트 절단 및/또는 단량체-단편분리 작용을 지니는 액틴-결합 단백질의 단편 또한 본 발명의 범위에 들어간다.
바람직한 경우에 이러한 화합물들은 약학적 허용 염의 형태로 동물에게 투여될 수 있다.
"동물"이란 용어는, 담중의 유리 액틴 또는 액틴 필라멘트가 동물의 생리에 유해한 모든 동물을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 동물중 주요한 동물이 사람이다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 이로운 영향을 받을 수 있는 모든 동물들을 치료하는 것이 본 발명의 계획이다.
액틴-결합 화합물의 "유효한 양"이란 동물의 호흡기 내용물내 액틴의 독성 영향을 감소시키거나 제거하는 데 충분한 양이다. 본 발명과 관련하여, 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액의 점도 또는 점조도를 감소 또는 용해시키거나, 이들 액체 또는 겔내에서 DNase I에의 액틴-결합을 저해하거나, 이들 액체 또는 겔내 DNA 분해를 증가시키거나, 이들 액체 또는 겔의 점조도를 감소시켜 각종 형태의 호흡 곤란을 치료하는 데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 액틴-결합 화합물의 유효량은 또한 임상 감염의 발생 및 박테리아 함량을 감소시키거나, 염증 매개자의 함량을 감소시키거나, 이들 액체 또는 겔에 의해 야기되는 호흡 곤란 증후군내 분해적이고 세포 독성적인 효소의 함량을 감소시킬 수 있는 양이다.
투여되는 액틴-결합 분자의 양 및 치료 기간은, 징후의 재연 빈도 또는 징후의 악화, 담 부피 및 점조도, 폐 기능(예, FEV, 혈액 p02, pH, pCO2, 총폐활량, 기류의 잔류 부피 시험, 감염율 등)을 모니터하여 결정될 수 있다. 숙련된 임상의 는 호흡 치료에 대해 통상적으로 모니터하는 기법에 익숙할 것이다.
DNase I으로 환자를 치료하는 데 유효한 DNase 흡입 용량을 결정하는 데 사용되는 방법에 따라서 에어로졸화된 액틴-결합 단백질양을 결정할 수 있다. 예를 들면, 참고 문헌[에트켄, 엠. 엘. 외 다수, J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951(1992), 특히 1948 페이지, "Study Design"]이 있다. 생체 내에서 송달되는 용량은, 시험관내에서 결정된 유효량과 관련된다. 예를 들면, 본원에 예시된 용량(즉, 2~10 ㎍/ml)에 의해 시험관내에서 담이 잘 용해된 경우 시험관 내 용량의 1000 배 증가량(즉, 2~10 mg/ml)이 투여될 것이다. 물론, 액틴-결합 화합물의 투여 용량 및 섭생 계획은 호흡 질병 치료 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 사용된 액틴-결합 화합물의 유형, 환자의 연령 및 건강, 질병의 정도, 수반되는 치료의 종류, 조직 손상의 정도, 환자의 성(gender), 징후의 지속 정도, 반대 징후(있는 경우), 및 의사 개개인에 의한 필요되는 조절로 이해할 수 있는 다른 변수들을 고려하여 액틴-결합 화합물 치료 용량은 다양한 것이 일반적이다. 흡인(aspiration)에 의해 또는 담으로서 기도 내용물을 모니터함으로써, 정확한 유효 용량을 통상적으로 결정할 수 있다.
정제 전에 물질 내에 정상적으로 및 천연적으로 발견되는 물질을 실질적으로 정제하였다면, 이 물질은 "천연 오염물이 실질적으로 존재하지 않는" 것을 의미한다. 액틴-결합 화합물과 관련될 수 있는 천연 오염물의 예는, 비-액틴- 결합 펩타이드, 탄수화물, 글리코실화 펩타이드, 지질, 막 등이다. 생체내 또는 시험관내에서 물질내에 정상적 및 천연적으로 발견되는 오염물이 그 물질의 시료 내에 실질적으로 없다면, 이 물질에는 천연 오염물이 실질적으로 존재하지 않는 것이라고 말해진다. "실질적으로 없다"라는 것은 이러한 오염물들이 완전히 없거나, 매우 낮은 농도로 존재하여 이들의 존재가 (1) 동물에 제제가 투여될 때, 제제 내의 활성 성분(본원에서는 액틴-결합 화합물)의 소정의 치료 효과를 방해하지 않고 (2) 이러한 제제의 투여 결과로서 동물에게 유해하지 않다는 것을 의미한다.
"투여"라는 용어는, 의약 분야에 공지된 적절한 수단에 의해 동물의 호흡기에 액틴-결합 화합물을 주입하는 것으로서, 에어로졸화된 화합물의 흡입, 기관지 내시경에 의한 점적 및 정맥내 주입을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 액틴-결합 화합물들은 DNase와 공투여될 수 있거나, 하나의 액틴-결합 화합물이 하나 이상의 별개의 액틴-결합 화합물들과 공투여될 수 있다. "공-투여"라는 용어는 각각의 생물학적 활성 기간이 중복되는 시간대 동안 적어도 2개의 화합물들 각각이 투여되는 것을 의미한다. 그러므로 이 용어는 DNase I와 본 발명의 화합물, 또는 각각의 본 발명의 화합물이 순차적으로 투여되는 것 및 공 확장적(coextensive)으로 투여되는 것을 포함한다.
"약학적 허용 비이클"이라는 용어는 본 발명의 액틴-결합 화합물의 제제에 첨가제로서 사용되어 이러한 화합물의 투여를 위한 담체 또는 보조제를 제공하는 용매, 담체, 희석제 등을 포함한다.
"치료" 또는 "치료하는" 이란 용어는, 질병의 예방, 개선, 방지 및 치료를 포함할 수 있는 목적으로 환자에게 액틴-결합 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
"단편"이란 용어는, 액틴 단량체에 결합하고/하거나 필라멘트를 절단할 수 있는 액틴-결합 화합물의 분절을 제공하는 분자의 부분을 포함한다. 이 용어는, 예를 들어 천연 발생하는 펩타이드 서열, 합성 또는 화학적으로 합성된 펩타이드 서열, 및 유전적으로 엔지니어된 펩타이드 서열과 같은 모든 발생원으로부터 제조되는 액틴-결합 단편을 포함하는 것이다. 또한 이러한 단편이 펩타이드인 경우에, 이러한 액틴-결합 단백질의 펩타이드의 단편은 액틴-결합 단백질의 변종을 모두 포함한다.
액틴-결합 화합물의 "작용성 유도체"라는 것은, 액틴-결합 화합물의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 지니는 유도체이다. "실질적으로 유사한"이란, 정량적으로는 다르나 정성적으로는 동일한 활성을 의미한다. 예를 들면 본 발명의 액틴-결합 단백질의 작용성 유도체는, 액틴-결합 단백질과 동일한 아미노산 백본을 함유하나, 해독 후의 변형과 같은 다른 변형도 함유하는데, 예를 들면 결합된 인지질 또는 공유 결합된 탄수화물 등으로, 상기 변형은 진단학적 분석 또는 치료를 수행하기 위한 이러한 변형의 필요성에 따라 좌우된다. 본원에 사용된 이 용어는, 또한 액틴-결합 화합물의 화학적 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 화합물의 용해도, 흡수도, 생물학적 반감기 등을 개선할 수 있다. 또 상기 유도체는 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 바람직하지 않은 부작용을 제거 또는 약화시킬 수도 있다. 이러한 영향을 조정할 수 있는 유도체 및 특히 화학 잔기(moiety)는, 레밍턴의 약학 과학(1980)에 개시되어 있다. 이러한 잔기를 분자에 커플링시키는 공정은 당해 분야에 공지되어 있다. "작용성 유도체"라는 용어는 액틴-결합 화합물의 화학적 유도체, 변종, 유사체 또는 약학적 허용염을 포함한다.
"변종(variant)"이란 천연 화합물 또는 그 단편과, 구조 및 생물학적 활성에 있어서 실질적으로 유사한 화합물을 의미한다.
본 발명의 액틴-결합 화합물의 "유사체"는 천연 액틴-결합 화합물 또는 그 단편과, 작용에 있어서 실질적으로 유사한 화합물을 의미한다. 예를 들면 액틴- 결합 단백질의 유사체는 액틴-결합 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 단백질이나, 액틴-결합 단백질과 충분히 상동이어서 이러한 액틴-결합 단백질의 생물학적 활성을 지니는 단백질이다.
"약학적 허용염"이라는 용어는 본 발명의 액틴-결합 화합물의 염을 포함하는 것이다. 약학적 허용 산 또는 염기, 예를 들어 황산, 염산, 질산, 인산 등과 같은 산, 또는 수산화 알칼리 금속, 수산화 알칼리 토금속, 수산화 암모늄, 수산화 알킬 암모늄 등과 같은 염기로부터 이러한 염이 형성될 수 있다.
본 발명의 화합물의 "생물학적 활성"이란, 액틴에 결합하여 비개질된 액틴보다 동물에게 덜 유독한 형태로 액틴을 개질하는 화합물의 능력이다. 이러한 개질은, 상기 결합의 결과인 화학 반응 또는 효소 반응의 결과이거나 또는 화합물의 결합 자체의 결과일 수 있다.
본 발명의 방법의 주제인 구체적인 액틴-결합 분자는 정제된 천연 및 재조합 액틴-결합 단백질, 및 다른 비-단백성 액틴-결합 분자, 및 그 생물학적-활성 단편으로서, 액틴을 단량체 형태로 단편 분리시키거나 또는 액틴 필라멘트를 신속하게 분리 또는 해중합시키거나 숙주 세포에 유독한 유리 액틴 부위를 덮을 수 있는 생물학적 활성을 지니는 고유의 액틴-결합 영역의 존재를 특징으로 한다. 이러한 생물학적 활성을 지니는 개개의 액틴-결합 영역은 합성적, 효소적, 단백분해적, 화학적 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 겔솔린 또는 그 액틴-결합 단편, 또는 DBP, 또는 겔솔린 또는 그 액틴-결합 단편과 DBP의 배합물을 치료가 필요한 환자에게 제공한다. 본 발명에 사용되는 다른 바람직한 액틴-결합 화합물로는 β4티모신 및 ASP-56 이 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 겔솔린 또는 그 액틴-결합 단편, 또는 겔솔린 또는 그 액틴-결합 단편과 비타민 D 결합 단백질의 배합물은 치료가 필요한 환자에게 DNase I과 함께 공투여된다.
본 발명의 액틴-결합 단백질의 비경구 투여용 제제의 예로는 멸균 수성 또는 비수성 용매, 현탁액 및 에멀젼이 있다. 비수성 용매의 예로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 생선 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체로는 물, 물-알콜 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하는데 이들은 염화나트륨 용액, 링거스 덱스트로스 용액, 덱스트로스 및 염화나트륨 용액, 락토스를 함유한 링거스 용액, 또는 불휘발성유를 비롯하여 생리식염수 및 완충된 의약 비경구 비이클을 포함한다. 정맥내 비이클의 예로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예, 링거스 덱스트로스에 기초함) 등이 있다.
본 발명의 액틴-결합 단백질은 또한 펌프에 의해, 또는 특히 주된 손상이 급성이기 보다는 지속되거나 지연되는 경우에는 서방성 형태로 투여될 수 있다.
지속되는 시간 주기 동안 반복 주사하는 겻이 지시되어 있는 환자에게는, 서방성 형태의 투여가 더 편리하다. 예를 들어, 환자의 편의를 최대화하기 위해 액틴과 관련된 질환에 기초한 유전적 또는 만성 질병을 치료하는데 본 발명의 방법을 사용하는 경우에는, 본 발명의 액틴-결합 단백질을 서방성 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
만일 단백질의 생물학적 활성이 소화 과정에 의해 파괴되지 않고, 화합물의 특성상 장관 조직을 통해서 흡수될 수 있는 경우에는, 본 발명의 액틴-결합 단백질을 경구용 정제, 캡슐, 분말 패킷, 또는 액상 용액과 같은 제제 형태로 적용할 수 있다.
당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 통상적인 혼합, 과립화, 당의-제조, 용해, 동결 건조 또는 유사한 방법에 의해 본 발명의 약학 조성물을 제조했다. 본 발명의 조성물은 그 자체가 만성 또는 급성의 액틴-유도된 생리학적 손상을 조절하는 데 유용하다. 본 발명의 조성물은 혈류 또는 세포외 조직에서 과량의 액틴을 처리하는 체내의 기전을 최대 퍼텐셜까지 올린다. 정맥 제제 형태로서 본 발명의 조성물은 작용 발현이 충분히 신속하여, 가능한 조직 손상의 급성 치료에 유용하다.
천연 오염물이 실질적으로 없는 액틴-결합 단백질은 그 천연 또는 재조합 원천으로부터, 이러한 단백질을 분리하는데 종래에 사용된 당해 분야의 통상적인 기법(예, 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등) 및 조건에 따라서 분리 및 정제될 수 있다.
당업자는 부당한 실험이 없이도, 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 액틴-결합 화합물의 액틴-결합 영역(들)을 동정할 수 있고, 이러한 영역은 본 발명의 방법에 바람직하다. 예를 들어, 흔한 프로테아제(예, 트립신, 키모트립신 및 서브틸리신)로 전-길이의 액틴-결합 단백질을 단백 분해 절단함으로써 천연 액틴-결합 단백질의 유도체 또는 재조합으로 형성된 액틴-결합 단백질의 유도체를 제조할 수 있다. 액틴-유도체화된 수지의 친화성 크로마토그래피를 사용하여 액틴-결합 능력에 대해 이러한 단편을 분석할 수 있다.
액틴-절단 활성을 지닌 화합물 또는 그 단편의 동정이 필요한 경우에는, 당해 분야에 공지된 기법들을 사용하여, 예를 들어 파이렌-표지된 F-액틴의 해중합율을 따라서 이러한 화합물 또는 단편을 동정할 수 있다.
또한, 작용이 상동성을 가지는 것이 예견될 수 있는 다른 공지된 액틴-결합 또는 액틴-절단 영역과의 상동성에 의해, 이러한 단편을 동정할 수 있다. 예를 들어, 시버린, 겔솔린 및 빌린, 특히 시버린내 아미노산 잔기 40-351 및 겔솔린내 아미노산 잔기 63-383는 F-액틴 절단 활성을 가지는 영역에 있어 큰 상동성을 나타낸다는 것은 공지되어 있다.
겔솔린의 N-말단 절반, 예를 들어 CT4S로 공지된 N-말단 트립신소화성 단편은 F-액틴을 절단할 수 있고 2 개의 액틴 결합 부위를 함유한다. 천연 오염물이 실질적으로 존재하지 않는 CT45의 유효량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 부위중 하나는 키모트립신소화성 단편, CT15N(사람 겔솔린 잔기 24-150) 내에 존재하는데, CT15N은 액틴 단량체 및 필라멘트의 말단에 고친화성으로 결합한다. 이러한 부위중 다른 부위는 인접하는 단편 CT28N(잔기 151-406) 내에 함유되는데, CT28N은 폴리포스포이노시타이드-조절된 방법으로 F-액틴의 측면에 결합한다. 이 단편들 둘다 그 자체로는 액틴 필라멘트를 절단하지는 않는다. F-액틴을 절단할 수 있는 가장 작은 겔솔린 폴리펩타이드는 혈장 겔솔린의 잔기 25-165를 포함한다.
또한 액틴-결합 단백질과 같은 화합물들은 동물 종중에 잘 보존되어 있고 비 사람(소, 돼지) 혈장 및/또는 근육 조직으로부터 대량으로 용이하게 분리될 수 있으며, 이러한 단백질의 단편은 당해 분야에 공지된 기법에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 제조될 수 있다. 그러므로 이러한 액틴-결합 화합물들은, 심한 면역 반응을 야기하지 않으면서 본 발명의 치료 방법이 필요한 환자에게 투여될 수 있다.
본 출원에 인용된 모든 문헌들은 참고로서 본원에 포함된다. 지금까지 본 발명을 일반적으로 설명했고, 하기의 실시예는 또한 발명을 실시하는데 사용된 재료 및 방법들을 설명한다. 이 실시예들은 어떤 식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
낭종성 섬유증의 환자(그중 일부 환자는 에어로졸화된 DNase I으로 처리되었음)로부터 객출된 담의 표본들을 해동시킨 후 단면으로 분리시켰다. 담 점조도에 대한 DNase I의 영향을 측정하기 위해서는 샤크외 다수의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 87:9188-9192 (1990)]에 기재된 방법을 따랐는데, 다만 DNase I을 첨가하는 대신에 정제된 혈장 겔솔린을 첨가했다. 이 단백질은 비공유적으로 액틴 중합체를 절단한다. 액틴 필라멘트를 단편화할 수 있고 겔솔린의 아미노산 잔기 1-260("겔솔린 260")을 포함하며 대장균(E. Coli) 내에서 제조되는 재조합 겔솔린 단편 또한 사용되었다. 이러한 단백질들은 DNA에 대한 영향이 공지되지 않았는데, 낭종성 섬유증 담에 대한 유동성(pourability) 시험에서 샤크외 다수의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 87:9188-9192(1990)]에 기재된 것과 동일한 결과를 본질적으로 나타내었다. 이 겔솔린 단편은 비록 겔솔린의 3 배 이상의 농도로 첨가되기는 했지만, 겔솔린 단편이 겔솔린보다 더 효과적이었다(표 1).
추가의 담 시료를 가지고 실험을 반복했고, 동일한 결과를 수득했다. 끓인 겔솔린 단편은 불활성이었다.
[실시예 2]
토션 추와 관련된 더 형식적인 유동학적 분석법으로 담 시료를 연구했다. 제1a도에서, 순간 응력에 의해 유도된 고진동수 오실레이션에 의해 나타나는 바와 같이 낭종성 섬유증 담은 매우 단단하고 탄성적이었는데, 이로부터 탄성 모듈러스(G')를 계산할 수 있었다. 겔솔린(1B) 및 겔솔린 단편(1C)의 첨가는 오실레이션의 진동수를 감소시켰는데, 각각 모듈러스를 3 배 및 10 배로 낮추었다. 여기서도, 더 높은 농도로 존재하는 단편이 겔솔린보다 더 효율적이었다. 일정한 응력에 대한 담의 스트레인 반응("크리이프"로 알려짐)은 낭종성 섬유증 담의 본래의 딱딱함 또는 불량한 컴플라이언스를 나타내는 반면, 겔솔린 및 겔솔린 단편은 용량-반응적 방법으로 크리이프 컴플라이언스를 증가시켰다. 그러나, 모든 시료는 응력의 제거에 따라 원래의 상태를 회복했는데, 이는 응집성 중합체, 가능하게는 뮤코다당류 및 DNA 가 겔내에 남아 있다는 것을 나타낸다.
[실시예 3]
중합체 액틴에 결합하는 로다민 팔로이딘을 낭종성 섬유증 담 표본에 첨가한 후 상 대조 및 형광 현미경으로 관찰했다. 시료는 세포 파편, DNA의 예상 원천, 및 액틴을 함유했고 밝은 형광성이었다. 겔솔린-단편-처리된 담 전색 및 처리되지 않은 담 전색을 2.5 ml의 0.15 M NaCl 용액으로 희석한 후 원심 분리했다. 담 겔로부터 방출된 단백질 양을 나타내는 지표로서 280 nm에서 흡수도를 측정했다. 그 결과를 표 2에 나타내었고, 겔솔린 및 260 kDa의 단편이 담 전색으로부터 단백질을 방출시켰다는 것을 알 수 있다.
겔솔린과 항온처리된 낭종성 섬유증 담 겔로부터 방출된 단백질의 분석.
광(optical) 밀도가 측정된 상층 용액으로부터 50㎕의 시료를 같은 부피의 황산나트륨도데실-함유 완충용액 및 β-머캅토에탄올-함유 완충 용액에 첨가하고, 이 혼합물내의 폴리펩타이드를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분석했다. 이 겔을 쿠마시 블루로 염색했다. 겔솔린-함유 용액 및 겔솔린 단편-함유 용액은 다수의 상이한 단백질들과 다량의 3개의 단백질을 함유하며, 그중 하나는 대조군 상층액보다는, 분자량 표준으로서 사용된 액틴과 공-이동한다는 것이 겔에 나타났다.
낭종성 섬유증 담의 항 - 액틴 항체 면역블롯 연구.
2명의 다른 환자로부터 낭종성 섬유증 담의 복제품을 같은 부피의 0.15 M 염화나트륨 및 pH 7.0인 20 mM 트리스 -HCl에 현탁시킨 후 균질화시켰다. 물질 50㎕를 같은 부피의 SDS 겔 완충액에 첨가한 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동법에 의해 분석했다. 겔 폴리펩타이드를 니트로셀룰로오스로 옮긴 후 항-액틴 항체로 액틴 밴드를 동정했다. 밴드는 담을 함유하는 선내에 나타났다. 액틴이 낭종성 섬유증 담내에 존재한다는 것을 이 결과로 확인했다.
[실시예 4]
액틴-결합 단백질에 의한 화농성 담의 용해화.
CF 환자로부터 신선한 담 시료를 수득하고 수집한 후 몇 시간내에 시험했다. 이 시험에서 시판되는 소의 DNase I을, 유동성(pourability) 분석법의 정제된 혈장 겔솔린과 직접 비교했다.
DNase I의 분자량이 31,000이고 겔솔린의 분자량이 84,000 이므로, 중량 기준으로 겔솔린이 상당히 더 효과적이다. 또한 겔솔린의 작용 발현이 빠른 것은 겔솔린에 대해 예견되는 화학양론적 작용과 일치하고, 반면에 DNase의 발현이 느린 것은, 액틴 중합체의 단편화나 DNA에 대한 효소적 작용보다는 단량체의 말단 소실에 의한 해중합작용과 일치한다.
CF 담의 점도에 대한 겔솔린 및 DNase I 농도의 영향.
CF 담의 점도에 대한 겔솔린과 DNase I의 농도의 영향을 비교하기 위해서, 다양한 농도의 이들 화합물을 첨가한 후에 담 시료의 점도에 있어서 변화를 측정했다.
객출에 의해 CF 환자로부터 담 시료를 수집한 후 즉시 시험하거나, 또는 액상 질소내에서 냉동시킨 후 -20℃에 저장했다. 저장된 시료는 신선한 표본과 별 차이 없는 유동학적 성질을 가졌다.
토션 추 내에서 점도를 측정하고 문헌 [잔메이,피.에이, J. Biochem. Biophys, Mehods, 22:41(1991)]에 기재한 바와 같이 125 mPa의 응력에서 시료의 크리이프율로부터 수치를 계산했다. 담 시료의 응집성 덩어리로부터 0.25 ml의 균일한 전색을 절단한 후 둥근 커버-슬립상에 전색을 적층했다. 첨가제가 없는 A 완충액 또는 50, 75, 150, 250 또는 500 nM의 정제된 사람 겔솔린이 존재하는 A 완충액 또는 100, 250, 500, 600 또는 750 nM의 소 췌장 DNase I(뉴저지주, 프리홀드의 워팅턴 바이오캐미칼사 제조)가 존재하는 A 완충액 10 ㎕를 담 시료에 첨가했다. 60분 항온처리한 후에, 각각의 농도의 첨가제가 있는 복제품에서 각각의 환자의 담 시료의 점도를 측정했다.
표 4 및 제3도에 나타나 있는 바와 같이, 겔솔린은 가장 낮은 농도에서조차 담의 점도를 크게 감소시켰다. 반대로, DNase I은 500 nM의 농도에서도, 담의 점도에 영향을 미치지 않았다.
[실시예 5]
DNase I과 겔솔린의 상승작용--단백질의 농도 의존적 방출.
단백질 방출 실험을 수행했을 때 세 명의 낭종성 섬유증 환자로부터의 담 시료는 농도-의존적 용해를 나타내었다. 대략 등가 부피의 담 시료를, 약 2.0 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 7 ㎍/ml 및 21 ㎍/ml 농도의 정제된 혈장 겔솔린을 함유하는 0.15 M NaCl 용액 0.5 ml에 현탁시켰다. 30분 동안 37℃에서 항온처리한 후에 시료를 원심 분리하고, 상층 용액의 광 밀도(λ = 280 nm)를 측정했다. 비교 스케일로서, A280눈금은 각각 하기와 같다 :2 ㎍/ml :0.25: 4 ㎍/ml : 1.30; 7 ㎍/ml : 1.86; 21 ㎍/ml : 180.
4 ㎍/ml의 DNase I를 함유한 용액에 대해서 A280은 약 0.5였다. 4 ㎍/ml의 DNase I과 2 ㎍/ml의 겔솔린을 함유한 용액에 대해서 A280은 약 1.3이었다. 기본적으로 효과가 없는 DNase I 농도의 존재하에서 저용량의 겔솔린은 예상된 것보다 더 많이 용해시켰다.
CF 담의 점도에 대한, DNase I과 조합된 겔솔린의 영향.
DNase I과 겔솔린이 조합된 경우에 CF 담의 점도를 감소시키는 데에 상승 작용을 나타내는가를 측정하기 위해서, 한쪽 또는 양쪽 화합물을 첨가한 후에 일정 시간 경과동안 담 시료의 점도를 측정했다.
객출에 의해 CF 환자로부터 담 시료를 수집한 후 즉시 시험하거나, 액상 질소에서 냉동시킨 후 -20℃에 저장했다. 저장된 시료는 신선한 표본과 별 차이 없는 유동학적 성질을 가졌다.
토션 추내에서 점도를 측정하고 문헌[잔메이, 피,에이., J. Biochem. Biophys, Methods, 22:41(1991)]에 기재한 바와 같이 125 mPa의 응력에서 시료의 크리이프율로부터 수치를 계산했다. 담 시료의 응집성 덩어리로부터 0.25 ml의 균일한 전색을 절단한 후 둥근 커버-슬립상에 전색을 적층했다. 그후에 첨가제가 없는 A 완충액, 또는 250 nM의 정제된 사람 겔솔린, 250 nM의 소 췌장 DNase I (뉴저지주, 프리홀드의 워팅턴 바이오캐미칼사 제조) 또는 250 nM의 겔솔린과 DNase I의 배합물이 존재하는 A 완충액ㆍ10 ㎕를 각각의 시료에 첨가했다. 그 후 토션 추의 현탁된 판에 대해 커버 슬립을 압연했다. 완충액을 첨가하고 15,30,45 및 60분 후에 각각의 환자로부터 담 시료의 점도를 복제 측정했다.
제4도에 나타낸 바와 같이, DNase I과 조합된 겔솔린은, 겔솔린만 존재하는 경우보다 담 점도를 더 많이 감소시켰다. 동일한 농도의 DNase I은 시료의 점도에 아무 영향을 미치지 않았다. A 완충액만으로 치료한 경우 동일한 환자의 담 시료의 점도는 실험 과정 동안에 변화하지 않았다.
[실시예 6]
CF 담에 대한 액틴-결합 화합물들의 조합의 영향.
CF 담의 점도에 대한 액틴-결합 화합물들의 조합의 영향을 시험하기 위해, Gc 글로블린(비타민 D 결합 단백질)과 혼합된 겔솔린을 첨가한 후에 담 시료 점도의 시간 경과에 따른 변화를 측정했다.
5명의 CF 환자로부터 32개의 담 시료를 수득했다. 시료를 즉시 시험하거나, 액상 질소내에서 냉동시킨 후 -20℃에 저장했다. 저장된 시료는 신선한 표본과 별 차이 없는 유동학적 성질을 가졌다.
토션 추내에서 점도를 측정하고, 문헌[잔메이, 피.에이, J. Biochem. Biophys. Methods, 22:41(1991)]에 기재한 바와 같이 125 mPa의 응력에서 시료의 크리이프율로부터 수치를 계산했다. 담 시료의 응집성 덩어리로부터 0.25 ml의 균일한 전색을 절단한 후 둥근 커버-슬립상에 전색을 적층했다. 그후에 첨가제가 없는 A 완충액, 또는 250 nM의 정제된 사람 겔솔린 및 Gc 글로블린(캘리포니아주 라 졸라, 칼바이오캠사 제조)의 배합물이 존재하는 A 완충액 10 ㎕를 각각의 시료에 첨가하고, 토션 추의 현탁된 판에 대해 커버-슬립을 압연했다. 완충액을 첨가하고, 15,30,45 및 60분후에 각각의 환자로부터 담 시료의 점도를 복제 측정했다.
제5도에 나타낸 바와 같이, Gc 글로블린과 혼합된 겔솔린은 담 시료의 점도를 급속히 감소시켰다. A 완충액만으로 치료한 경우 동일한 환자의 담 시료의 점도는 실험 과정 동안에 변화하지 않았다. 지금까지 본 발명을 완전히 설명하였으므로, 당업자라면 본 발명 또는 그 구체예의 범위 또는 범주에 영향을 미치지 않으면서 조건, 매개변수 등의 넓은 등가 범위내에서 본 발명을 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 (a), (b) 또는 (c) 작용을 위해, DNase I 을 제외한 하나 이상의 액틴-결합 화합물 또는 그 단편 또는 그 작용성 유도체를 활성성분으로서 포함하고, 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물:
    (a) 환자의 호흡기내 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액을 용해시키는 작용;
    (b) 환자의 호흡기내 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액의 점도를 감소시키는 작용;
    (c) 호흡기내 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액의 존재로 인해 폐쇄가 야기된 경우에 환자의 호흡기 폐쇄를 치료하는 작용.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 액틴-결합 화합물이 액틴 필라멘트 절단 활성을 지니는 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 액틴-결합 화합물(들)이 겔솔린, 빌린, 프라그민 및 시버린으로 이루어진 군에서 선택되는 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 액틴-결합 화합물이 겔솔린 또는 그 활성 단편 또는 그 작용성 유도체인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 활성 단편이 키모트립신소화성(chymotryptic) 단편 CT45인 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 활성 단편이 겔솔린의 아미노산 잔기 25-165를 함유하는 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 액틴-결합 화합물이 중합화에 저항하는 복합체 내로 액틴 단량체를 단편 분리시키는 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 액틴-결합 화합물(들)이 비타민 D 결합 단백질, 코필린, 프로필린 및 데팍틴으로 이루어진 군에서 선택되는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 하나의 액틴-결합 화합물은 겔솔린 또는 그 활성 단편 또는 그 작용성 유도체이고, 다른 액틴-결합 화합물은 비타민 D 결합 단백질인 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, DNase I이 환자에게 함께 투여되는 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 병리학적 기도 내용물, 점액 또는 화농성 점액이, 낭종성 섬유증, 만성 기관지염, 단순 뮤코이드 기관지염의 점액농성 또는 화농성 악화, 기관지폐렴, 만연된 세기관지염, 화농성 폐렴, 폐렴-폐포-경화(consolidation), 점액 전색과 함께 천식성 기관지염의 존재 또는 부재하의 천식, 급성 및/또는 만성 화농성 정맥동염, 기관지 확장증, 기관지류(bronchocoele), 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 후-이식 폐색성(obliterative) 세기관지염, 및 알레르기성 세기관지염(섬유화 폐포염)으로 이루어진 군에서 선택되는 병리학적 호흡 상태와 관련되어 있는 약학 조성물.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464817A (en) * 1990-04-11 1995-11-07 Brigham And Women's Hospital Method for reducing the viscosity of pathological mucoid airway contents in the respiratory tract comprising administering actin-binding compounds with or without DNASE I
US5691160A (en) * 1992-08-14 1997-11-25 Biogen, Inc. Effects of actin filaments of fibrin clot structure and lysis
US5593964A (en) * 1993-10-07 1997-01-14 The George Washington University Medical Center Method of treating septic shock by preventing actin polymerization
US5578570A (en) * 1993-10-07 1996-11-26 The George Washington University Medical Center Method of treating septic shock using thymosin β4
DK0811068T3 (da) * 1995-02-24 2003-03-10 Genentech Inc Humane DNase I varianter
SK284191B6 (sk) 1995-02-24 2004-10-05 Genentech, Inc. Aktín-rezistentný variant humánnej DNázy I
CZ297463B6 (cs) * 1995-02-24 2006-12-13 Genentech, Inc. Varianta lidské DNázy I, mající DNA hydrolytickouaktivitu a aminokyselinovou sekvenci mající nejméne 90 % identity s aminokyselinovou sekvencí prírodní lidské DNázy I
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
PT941108E (pt) * 1996-12-04 2003-01-31 Renovo Ltd Cicatrizacao de feridas e tratamento da fibrose
EP1249244A1 (en) * 2001-04-13 2002-10-16 Universiteit Gent Therapeutic compositions for the treatment of a disease modulated by the G-actin / F-actin equilibrium, especially a respiratory tract disease
CA2439471A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-17 Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd. Promoters of the growth and/or differentiation of hematopoietic stem cells and/or hematopoietic progenitors
US8388951B2 (en) 2003-07-14 2013-03-05 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic DNA mutation disease
WO2005004904A1 (fr) * 2003-07-14 2005-01-20 Dmitry Dmitrievich Genkin Methode de traitement de maladies s'accompagnant d'alterations de la composition qualitative et/ou quantitative de l'adn extracellulaire du sang (variantes)
US8431123B2 (en) 2003-07-14 2013-04-30 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection
US8710012B2 (en) 2003-07-14 2014-04-29 Cls Therapeutics Limited Method for treating oncological diseases
GB0327723D0 (en) * 2003-09-15 2003-12-31 Vectura Ltd Pharmaceutical compositions
WO2005046454A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Trustrees Of The University Of Pennsylvania Methods of using gelsolin to treat or prevent bacterial sepsis
US9408891B2 (en) * 2003-11-12 2016-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of using gelsolin to treat or prevent bacterial sepsis
US8518457B2 (en) * 2004-05-11 2013-08-27 Pulmonox Technologies Corporation Use of inhaled gaseous nitric oxide as a mucolytic agent or expectorant
KR101314461B1 (ko) * 2004-05-12 2013-10-07 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 감염 치료를 위한 겔솔린의 용도
CA2578478A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 National Jewish Medical And Research Center Product and process for inhibition of biofilm development
EP1880733A4 (en) * 2005-04-25 2009-08-12 Genkin Dmitry Dmitrievich METHOD FOR EXTENDING THE LIFE OF A HUMAN AND ANIMALS
HUE056086T2 (hu) 2006-03-15 2022-01-28 Brigham & Womens Hospital Inc Gelszolin alkalmazása gyulladásos betegségek diagnosztizálására és kezelésére
US8440622B2 (en) * 2006-03-15 2013-05-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Use of gelsolin to treat multiple sclerosis and to diagnose neurologic disease (stossel)
EP2095825B8 (en) * 2006-11-28 2012-03-28 CLS Therapeutics Limited Method for treating human diseases associated with an increased deoxyribonucleic acid content in extracellular spaces of tissues and a medicinal preparation for carrying out said method
CA2713977A1 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 National Jewish Medical And Research Center Methods and compositions for the disruption of biofilms
HUE032875T2 (en) 2008-01-25 2017-11-28 Massachusetts Gen Hospital Diagnostic and therapeutic applications of gelsolin in renal failure
US9603906B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Inhalable liquid formulations of DNase I
US10617743B2 (en) 2014-06-19 2020-04-14 Cls Therapeutics Limited Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy
JP6745873B2 (ja) 2015-05-22 2020-08-26 ドミトリエヴィッチ ゲンキン，ドミトリー 神経変性における治療標的としての細胞外ｄｎａ
EP3740581A4 (en) 2018-01-16 2021-10-27 CLS Therapeutics Limited TREATMENT OF DISEASES BY LIVER EXPRESSION OF AN ENZYME WITH DESOXYRIBONUCLEASE (DNASE) ACTIVITY

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464817A (en) * 1990-04-11 1995-11-07 Brigham And Women's Hospital Method for reducing the viscosity of pathological mucoid airway contents in the respiratory tract comprising administering actin-binding compounds with or without DNASE I
WO1991015770A1 (en) * 1990-04-11 1991-10-17 The General Hospital Corporation Therapeutic uses of actin-binding compounds
US5691160A (en) * 1992-08-14 1997-11-25 Biogen, Inc. Effects of actin filaments of fibrin clot structure and lysis

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Publication number Publication date
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WO1994022465A1 (en) 1994-10-13
EP0692970B1 (en) 1999-08-04
GB2293102B (en) 1996-10-09
ATE182790T1 (de) 1999-08-15
DK0692970T3 (da) 1999-12-06
NO953862D0 (no) 1995-09-29

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