DE69419907T2

DE69419907T2 - Verwendung von aktin-bindenden verbindungen zur herstellung eines medikaments zur verminderung der viskosität von pathalogischen schleimartigen bestandteilen der atemwege

Info

Publication number: DE69419907T2
Application number: DE69419907T
Authority: DE
Inventors: Paul Janmey; Stuart Lind; Thomas Stossel
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1993-04-02
Filing date: 1994-04-04
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: AU6625094A; GB9520020D0; DE69419907D1; GB2293102A; CA2159205A1; DK0692970T3; CN1122108A; NO953862L; EP0692970B1; BR9405856A; ATE182790T1; US5464817A; NO953862D0; JP2001302537A; KR100308679B1; EP0692970A1; US5656589A; ES2135576T3; SG49574A1; GR3031753T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Krankheiten der Atmungsorgane, bei denen es wünschenswert ist, Aktinfilamente aufzulösen, zu depolymerisieren oder zu solubilisieren oder den Abbau von DNA in Schleim der Atemwege zu fördern. Die Erfindung betrifft insbesondere die Solubilisierung und die vermehrte Clearance von Schleim, der die Atemwege bei Erkrankungen der Luftwege blockiert. Die Erfindung betrifft die Verwendung von Aktin-bindenden Proteinen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung der Viskosität von Schleim zur Instillation der Aktin-bindenden Proteine in die Atemwege. Die Erfindung betrifft auch die Förderung der Wirkung von DNase I bei Behandlungen der Atemwege durch die Blockierung der Aktinbindung an DNase I oder die Verringerung der Aktin-Spiegel in Schleim der Atemwege. Dies schließt die Verwendung von wirksamen Mengen von Aktin-bindenden Verbindungen oder Fragmenten oder funktionellen Derivaten davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an einen Patienten ein, der eine solche Behandlung benötigt, so daß die Verbindungen oder Fragmente oder Derivate in den Atemwegen aktiv sind.

Blockierung der Luftwege

Die durch eine Entzündung mit Exsudatsbildung verursachte Blockierung der Atemwege ist eine Hauptursache von Morbidität und Mortalität. Die Schleimpfropfenbildung und -stauung ist ein Merkmal von chronischer Bronchitis, asthmatischer Bronchitis, bakterieller Bronchopneumonie und insbesondere der Mukoviszidose und mit der Zerstörung von Lungensubstanz assoziiert. Schleim trägt auch zur Morbidität der akuten und chronischen Sinusitis und auch von Erkältungskrankheiten bei.
Die schleimartige Blockierung des Atmungssystems ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen. Ein Faktor ist die vermehrte Schleimsynthese und -freisetzung, die durch Entzündungsvermittler verursacht wird, welche durch eine Infektion oder Reizung ausgelöst wer den. Bei der Mukoviszidose ist die Viskosität des Schleims erhöht, vermutlich aufgrund eines abnormen epithelialen Ionentransports, der die Hydratisierung oder die Ladung der ionischen Polymere beeinflußt, aus denen sich die Schleimsubstanz zusammensetzt. Der zähe Schleim der Mukoviszidose verhindert die Clearance von Bakterien mittels Transport durch Zilienschlag und begünstigt das Wachstum von Bakterien, insbesondere von Pseudomonas aeruginosa. Diese Bakterien oder andere Reizmittel, wie Tabakrauch, erzeugen chemische Lockstoffe, die Leukocyten in den Luftwegen rekrutieren. Da die Leukocyten Bakterien oder Reizmittel binden, degenerieren sie und ihre Komponenten steuern Trümmer bei, die die Viskoelastizität der Bestandteile der Luftwege beeinflussen.
Ein großer Teil der Forschung auf dem Gebiet der pathologischen schleimartigen Bestandteile der Luftwege wurde auf DNA gerichtet, da DNA zuerst aus Eiter isoliert wurde. Es wurde jedoch auch über die Mucopolysaccharidzusammensetzung von Schleim und die Rolle von Disulfidbrücken geforscht (Roberts G.P., Arch. Biochem. Biophys. 173 (1976), 528-537; Roberts G.P. Eur. J. Biochem. 50 (1974), 265-280; Charman J. et al., Brit. J. Dis. Chest 68 (1974), 215; Bhaskar K.R. et al., Exp. Lung Res. 10 (1986), 401-422; Lethem M.I. et al., Eur. Respir. J. 3 (1990), 19-23). Eitriger Schleim enthält etwa 10-13 mg/ml DNA, ein ionisches Polymer, von dem allgemein angenommen wird, daß es die Fließeigenschaften von Flüssigkeiten der Luftwege beeinflußt. DNase I aus Rinderpankreas, ein Enzym, das DNA abbaut, wurde vor vielen Jahren als Schleimlösemittel getestet. Jedoch fand es wegen der durch die Antigenität und/oder kontaminierende Proteasen induzierten Nebenwirkungen keine klinische Anwendung. Deshalb wurde cDNA für menschliche DNase I cloniert und exprimiert. Rekombinante menschliche DNase I wurde als ein Therapeutikum getestet. Es wurde gezeigt, daß sie die Viskosität von Mukoviszidose-Schleim in vitro vermindert (Shak S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9188-9192). Menschliche DNase I wurde vor kurzem in den Vereinigten Staaten zur Behandlung von Patienten (über 5 Jahre) mit Mukoviszidose zugelassen.

Extrazelluläres Aktin

Aktin ist das in kernhaltigen tierischen Zellen am häufigsten vorkommende Protein und es macht 10-20% des Proteins vieler kernhaltiger Zellen und 30% des Proteins von Muskelzellen aus. Aktinmoleküle binden sowohl an das ATP- als auch an das ADP-Molekül und lagern sich selbst zu langen Filamenten zusammen, während dieses Vorgangs wird das ATP zu ADP hydrolysiert.
Eine Verletzung tierischer Gewebe führt zur Freisetzung von Aktin in den Extrazellularraum. Obwohl etwa die Hälfte des nicht-muskulären, zellulären Aktins F-Aktin ist (die doppel-helikale, stäbchenförmige Filamentform von Aktin, die aus G-Aktin-Monomeren zusammengesetzt ist), begünstigen die ionischen Bedingungen der extrazellulären Flüssigkeiten die Aktin-Polymerisierung, so daß zu erwarten ist, daß praktisch das gesamte aus sterbenden Zellen freigesetzte Aktin zu Filamenten polymerisiert, falls es ausreichend konzentriert ist (mehr als wenige Mikrogramm pro Milliliter) (Lind S.E. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138 (1988), 429-434). Aktin polymerisiert zu langen, stäbchenförmigen Filamenten, die gegen einen Abbau durch proteolytische Enzyme relativ beständig sind. In geklärten Lösungen können Aktinfilamente in Abwesenheit von Filament-verkürzenden Proteinen leicht eine Länge von mehreren Mikrons erreichen.
Infolge der großen Mengen von Aktin in Zellen stellt die Freisetzung von Aktin aus sterbenden Zellen genügend Aktin bereit, so daß es eine signifikante Wirkung auf die Mikroumgebung hat, entweder durch die Erhöhung der Viskosität der extrazellulären Flüssigkeiten, wie Mucin, und/oder durch das Einschließen von Zellen oder durch andere, bis jetzt noch nicht identifizierte toxische Wirkungen. Die Infusion von extrazellulärem freiem Aktin ist für tierische Gewebe toxisch (Harper K.D. et al., Clin. Res. 36 (1988), 625A; Haddad J.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1381-1385). Wenn aus beschädigten Zellen freigesetztes Aktin an ein Aktin-bindendes Protein gebunden werden könnte, wie zum Beispiel die nachstehend besprochenen, würde dieses Aktin monomer oder oligomer bleiben.
Die Vorbeugung vor oder die Verringerung einer Gewebeschädigung in einem Individuum aufgrund einer Aktin-Anreicherung unter Verwendung von Aktin-bindenden Verbindungen wurde bereits beschrieben (WO-91/15770). Aktin-bindende Verbindungen wurden zur Behandlung von mit Aktin in Beziehung stehenden Krankheiten verwendet, bei denen es wünschenswert ist, die Aktin-Spiegel im Plasma oder abgelagert im Extrazellularraum von Geweben zu verringern. Die Bindung der Aktin-bindenden Verbindungen an Aktin hat auf diese Weise die Modifizierung einer beliebigen der vielen Funktionen von Aktin zur Folge.

Aktin-bindende Proteine

Es gibt viele Proteine, die natürlicherweise mit Aktin assoziiert sind. Für eine Übersicht von Aktin-bindenden Proteinen vgl. Stossel T.P. et al., Ann. Rev. Cell Biol. 1 (1985), 353-402; Pollard T.D. et al., Ann. Rev. Biochem. 55 (1986), 987-1035). Jedoch wird von den zwei Proteinen Gelsolin und DBP (Vitamin D-bindendes Protein) angenommen, daß sie hauptsächlich für die Bindung von extrazellulärem Aktin verantwortlich sind (Janmey P.A. et al., Blood 70 (1987), 529-530).
Plasma-Gelsolin (zuweilen bezeichnet als Brevin) und DBP (zuweilen bezeichnet als Gc-Globulin) sind zwei im Plasma vorliegende Proteine, die Aktin mit hoher Affinität binden. Proteine, die Aktin mit hoher Affinität binden, binden Aktin mit einem Kd-Wert von weniger als 10&supmin;&sup8;. Sowohl Gelsolin als auch DBP binden an Aktin im Blutserum und weisen eine Aktin-depolymerisierende Aktivität auf. DBP bindet vorzugsweise monomeres Aktin, während Gelsolin vorzugsweise Aktinfilamente bindet.
Gelsolin ist ein multifunktionelles, Aktin-bindendes Protein, das aus Cytoplasma und extrazellulären Flüssigkeiten von Säugern erhalten wird. Plasma-Gelsolin unterscheidet sich von zellulärem Gelsolin durch zusätzliche 25 Aminosäuren am Aminoterminus des Moleküls. Beide Gelsoline sind das Produkt eines einzigen Gens. Plasma-Gelsolin weist drei Aktin-bindende Stellen auf und bindet mit hoher Affinität an entweder G-Aktin oder F-Aktin.
Plasma-Gelsolin bindet ein zweites Aktinmolekül mit einer höheren Affinität als es ein erstes Aktinmolekül bindet. Folglich bildet es vorzugsweise mehr 2 : 1-Komplexe als 1 : 1- Komplexe und bindet eher Filamente als Monomere. Bei der Zugabe zu F-Aktin trennt Plasma-Gelsolin das Filament in einer nicht-proteolytischen Weise auf und bleibt an einem Ende des neu gebildeten Filaments gebunden. Falls freie Gelsolinmoleküle vorhanden sind, trennen sie das Aktinfilament schrittweise auf, bis nur noch 2 : 1-Aktin-Gelsolin-Komplexe vorliegen, auf diese Weise wird das Filament schnell depolymerisiert.
Freie und komplexierte (an Aktin) Gelsolinmoleküle unterscheiden sich in bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften. Während freies Gelsolin Aktinfilamente spalten kann, können Aktin-Gelsolin-Komplexe dies nicht.
Die Hauptfunktion von Gelsolin im Plasma und anderen extrazellulären Flüssigkeiten ist die Trennung von Aktinfilamenten. Falls Gelsolin in einer im Verhältnis zu Aktin überschüssigen Menge vorliegt, werden nur Gelsolin-Aktin-Komplexe gebildet; falls Aktin im Überschuß vorliegt, liegen freie Aktinoligomere und Gelsolin-Aktin-Komplexe vor. Die Aktin-Trennung erfolgt durch eine nicht-proteolytische Spaltung der nichtkovalenten Bindung zwischen benachbarten Aktinmolekülen. Die Trennwirkung von Gelsolin wird durch mikromolare Mengen an Ca&spplus;&spplus; und durch einen pH-Wert über 6 aktiviert, und es wurde gezeigt, daß sie durch Phosphatidylinositol-4-5-bisphosphat (PIP2) und Phosphatidylinositol-4- monophosphat (PIP) inhibiert wird. Da extrazelluläre Ca&spplus;&spplus;-Konzentrationen im millimolaren Bereich liegen und extrazelluläre Flüssigkeiten normalerweise kein PIP oder PIP&sub2; in einer Form enthalten, die Gelsolin inhibiert, ist Plasma-Gelsolin in extrazellulären Flüssigkeiten konstitutiv aktiv.
cDNA von menschlichem extrazellulärem (Plasma-) Gelsolin wurde cloniert und sequenziert (Kwiatkowski D.J. et al., Nature 323 (1986), 455-458; Kwiatkowski D.J. et al., J. Cell Biol. 106 (1988), 375-384). Fragmente des nativen Proteins, die die Fähigkeit zur Bindung von Aktin beibehalten, wurden identifiziert (Bryan J., J. Cell Biol. 106 (1988), 1553- 1562; Yin H.L. et al., J. Cell Biol. 107 (1988), 465a, Abstract Nr. 2616; Kwiatkowski D.J. et al., J. Cell Biol. 108 (1989), 1717-1726; Way M. et al., J. Cell Biol. 109 (1989) 593-605). Es gibt keinen Hinweis, der nahelegt, daß es genetisch polymorph ist (ausgenommen bei der ungewöhnlichen genetischen Störung, die als Finnische Amyloidose bezeichnet wird, bei der einzelne Aminosäuremutationen bei den Plasma-Gelsolinen nachgewiesen wurden), was darauf hinweist, daß die Verwendung eines rekombinanten menschlichen Proteins keine immunogenen oder andere toxische Wirkungen zur Folge haben sollte. Plasma-Gelsolin wurde in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen, was nahelegt, daß Gelsolin auch eine normale Komponente von Flüssigkeit der Luftwege sein kann, zumindest bei Entzündungszuständen.
DBP wurde ebenfalls cloniert (Cooke N.E. et al., J. Clin. Invest. 76 (1985), 2420- 2424; Yang F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7994-7998). DBP weist eine einzige Aktin-bindende Stelle auf und bindet konstitutiv an monomeres Aktin, aber nicht an F-Aktin.

Aktin und DNase I

Die katalytische Aktivität von DNase I wird durch Aktin inhibiert, an welches das Enzym fest bindet (Lindberg U., Biochem. Biophys. Acta 82 (1964), 237-248; Lazarides und Lindberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (1974), 4742-4746). Aktin macht etwa 10% der Proteinmasse der Leukocyten aus. Daraus folgt, daß überschüssiges Aktin sowie DNA-Poly mere in eitrigen Bestandteilen der Luftwege vorliegen könnten. Falls Aktin in diesen Bestandteilen vorliegt, würde die Wirksamkeit der DNase I beim DNA-Abbau voraussichtlich durch die Bindung an in den gleichen Sekreten, für die DNase I gedacht war, vorliegendes Aktin vermindert werden.
Aktinfilamente allein bilden Netzwerke von hoher Elastizität und bei der Durchdringung von Schleim und/oder DNA-Polymeren würden sie voraussichtlich zu sehr festen Gelen beitragen, so wie sie es bei Fibrin tun (Janmey P.A., Blood 80 (1992), 928-936). Die Einführung Aktin-bindender Moleküle, die Aktinfilamente auflösen, insbesondere durch Auftrennung der Aktinfilamente (Janmey P.A., Curr. Opinion Cell Biology 3 (1991), 4-11), ist deshalb ein attraktiver Ansatz zur Verminderung der Konsistenz von Schleim der Luftwege und insbesondere von eitrigem Schleim der Luftwege.
Da Aktin die katalytische Aktivität von DNase I inhibiert, sollten Aktin-bindende Moleküle auch die Wirksamkeit von DNase I beim Abbau von DNA durch die Solubilisierung von Aktin und die Erleichterung seiner Entfernung aus DNA-enthaltendem Schleim der Luftwege steigern, in denen DNase I wirksam sein soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einer Aktinbindenden Verbindung oder von Fragmenten oder funktionellen Derivaten davon, die von DNase I verschieden sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Solubilisierung von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim der Atemwege eines Patienten zur Verminderung der Viskosität von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim der Atemwege eines Patienten oder zur Behandlung einer Blockierung der Atemwege eines Patienten, wobei die Blockierung durch das Vorhandensein von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim der Atemwege verursacht wird. Die Aktinbindende Verbindung, die Fragmente oder funktionellen Derivate davon sind zur Verabreichung an ein Individuum in wirksamen Mengen gedacht.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Überlegung der Anmelder zugrunde, daß, da Leukocyten eine wesentliche Komponente von eitrigem Schleim sind und Aktin etwa 10% der Proteinmasse der Leukocyten ausmacht, überschüssiges Aktin in eitrigen schleimartigen Bestandteilen der Luftwege vorliegen könnte. Der Erfindung liegt auch die Überlegung zugrunde, daß die Wirksamkeit von DNase I beim Abbau der DNA-Polymere in eitrigem Schleim voraussichtlich durch die Bindung an Aktin verringert wird, das in dem Schleim vorliegt. Deshalb wird die Wirkung von sowohl endogener DNase I als auch von aus thera peutischen Zwecken verabreichter DNase I durch die Bindung an Aktin verringert, das in den gleichen Sekreten vorliegt, für die die Enzyme gedacht waren.
Demgemäß liegt der vorliegenden Erfindung die Überlegung der Anmelder zugrunde, daß die Verabreichung von Aktin-bindenden Verbindungen oder Fragmenten oder funktionellen Derivaten davon an Patienten mit pathologischen schleimartigen Bestandteilen der Luftwege für eine Behandlung von und einen Schutz vor einer Blockierung der Atemwege sorgt. Ein Ziel der Erfindung ist deshalb die Bereitstellung einer Verbindung zur Depolymerisierung von Aktinfilamenten, um einer Aktin-Polymerisierung vorzubeugen, und zur Verringerung der Aktin-Spiegel der Atemwege von Individuen mit einer Erkrankung der Luftwege.
Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer Verbindung zur Verminderung der Viskosität von oder zur Solubilisierung von schleimartigen Bestandteilen der Luftwege, die die normale Durchgängigkeit und den normalen Luftstrom der Atemwege bei Individuen mit einer Erkrankung der Atemwege und insbesondere einer entzündlichen Krankheit der Luftwege blockieren.
Demgemäß stellt die Erfindung eine Verbindung zur Verminderung der Viskosität oder Konsistenz von pathologischen Bestandteilen der Luftwege bereit. Daher werden Aktinbindende Verbindungen und insbesondere Aktin-bindende Proteine, die: 1) die aus aufgebrochenen Leukocyten und anderen Zellen freigesetzten Aktinfilamente, die die Bestandteile der Luftwege und insbesondere die schleimartigen Bestandteile der Luftwege verfestigen, auflösen (depolymerisieren, fragmentieren und dissoziieren) oder deren Aggregation verhindern, und/oder 2) verhindern, daß Aktin die Wirkung des Enzyms DNase I inhibiert, das DNA- Polymere abbaut, die die Viskoelastizität von Schleim erhöhen, als Arzneimittel zur Instillation in die Atemwege formuliert. Die DNase I kann endogen sein oder zur Bereitstellung für therapeutische Zwecke; durch Aerosolisierung oder ein anderes geeignetes und wirksames Verfahren verwendet werden.
Demgemäß ist ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel die Verringerung der Menge an Aktin, die an DNase 1 in den Atemwegen bindet. Deshalb werden Aktin-bindende Verbindungen und insbesondere Aktin-bindende Proteine als Arzneimittel zur Verabreichung in die Atemwege formuliert. Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel ist die Beschleunigung des DNA-Abbaus in pathologischen schleimartigen Bestandteilen der Luftwege. Aktin-bindende Verbindungen und insbesondere Aktin-bindende Proteine werden deshalb als Arzneimittel zur Verabreichung in die Atemwege formuliert.
Diese und andere Ziele der Erfindung, die nachstehend deutlicher werden, können erreicht werden durch die Verwendung von einem oder mehreren Aktin-bindenden Proteinen oder Fragmenten oder funktionellen Derivaten davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an Patienten mit schleimartigen Bestandteilen der Atemwege, die eine Blockierung der Atemwege verursachen, in Dosierungen und gemäß Therapieschemata, welche die Blockierung behandeln, die nach einer Aktin- und/oder DNA-Freisetzung in diese Bestandteile auftritt.

Fig. 1: Dynamische Schermodule von Mukoviszidose-Sputum

Sputumproben mit oder ohne Gelsolin oder einem Gelsolinfragment wurden zwischen den parallelen, kreisförmigen Platten eines Torsionspendels plaziert (Ferry J.D., Viscoelastic Properties of Polymers, 3. Auflage, Wiley & Sons, New York (1980)) und auf den an der oberen Probenplatte befestigten Arm wurde eine vorübergehende mechanische Verschiebung ausgeübt. Das dynamische Schermodul G wurde aus der Frequenz und der Dämpfung der resultierenden freien Schwingungen berechnet. Der Wert G von Aktinpolymer-enthaltenden Lösungen hängt stark von der durchschnittlichen Aktinfilamentlänge ab (Janmey et al., Biochemistry 27 (1988), 8218-8226). 1A: Mukoviszidose-Sputum allein; 1B: Mukoviszidose-Sputum plus Gelsolin; 1C: Mukoviszidose-Sputum plus Gelsolin- Aminosäurefragment 1-260.

Fig. 2: Scherkriechdehnung und -erholung von Mukoviszidose-Sputum

Sputumproben mit oder ohne Gelsolin oder einem Gelsolin-Fragment, die zwischen den Platten des Torsionspendels plaziert wurden, wurden einer konstanten Scherbeanspruchung ausgesetzt. Die folgende Deformation wird als Scherverformung, das Verhältnis von Scherdeformation zur festgelegten mechanischen Beanspruchung, quantitativ bestimmt. Frühere Studien haben gezeigt, daß sich die Verformung von F-Aktin stark erhöht, wenn die durchschnittliche Filamentlänge abnimmt (Janmey et al., Biochemistry 27 (1988), 8218- 8226). Die plötzlichen Verringerungen der Deformation stellt die Freisetzung der angelegten mechanischen Beanspruchung dar.

Fig. 3: Dosis-Antwort-Kurve für Gelsolin und DNase I

Die Änderung der Viskosität von Sputumproben mit Gelsolin oder DNase I wurde mit einem Torsionspendel nach einer 60-minütigen Inkubation bestimmt. Die Änderung der Viskosität mit zunehmender Konzentration ist als Prozentsatz der anfänglichen Viskosität angegeben.

Fig. 4: Wirkung von Gelsolin in Kombination mit DNase I auf die Viskosität von Sputum

Die Änderung der Viskosität von Sputumproben mit Gelsolin, DNase I oder Gelsolin und DNase I wurde mit einem Torsionspendel über einen Zeitraum von 60 Minuten nach Zugabe der Verbindung bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der anfänglichen Viskosität gegen die Zeit angegeben.

Fig. 5: Wirkung einer Kombination von Aktin-bindenden Verbindungen auf die Viskosität von Sputum

Die Änderung der Viskosität der Sputumproben nach Zugabe von mit Gc-Globulin (Vitamin D-bindendes Protein) kombiniertem Gelsolin wurde mit einem Torsionspendel über einen Zeitraum von 60 Minuten nach Zugabe der Verbindungen bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der anfänglichen Viskosität gegen die Zeit angegeben.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Überlegung zugrunde, daß Bestandteile der Luftwege (Atemwege) Aktinfilamente und DNA-Polymere enthalten können, die die Konsistenz oder Viskosität von Bestandteilen der Atemwege erhöhen und auf diese Weise die normale Clearance verhindern und zu pathologische Folgen führen. Demgemäß ist ein Ziel der Erfindung die Verminderung der Viskosität oder Konsistenz von pathologischen Bestandteilen der Atemwege durch Herbeiführung der Auflösung oder Depolymerisierung von Aktinfilamenten, die Inhibierung der Aktin-Polymerisierung, die Verringerung der Aktin-Spiegel und der Abbau von DNA-Polymeren. Entsprechend werden bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eine oder mehrere Aktin-bindende Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Einführung in die Atemwege eines Patienten verwendet, dessen Bestandteile der Luftwege Aktinfilamente und DNA-Polymere enthalten, die zur Atemnot beitragen. Die Aktin-bindende Verbindung kann. Aktin auflösen, die Polymerisierung von freiem monomeren Aktin verhindern oder verringern und/oder die Bindung von Aktinfilamenten oder -monomeren an DNase I verhindern. Eine allgemeine erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Bereitstellung eines Arzneimittels zur Solubilisierung oder zur Verminderung der Konsistenz oder Viskosität von pathologischen respiratorischen Bestandteilen in den Atemwegen von Individuen, die eine Atemnot als Folge des Vorhandenseins solcher Bestandteile durchmachen.
Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die Überlegung zugrunde, daß der Schleim der Luftwege Aktinfilamente und DNA-Polymere enthalten kann, die die Konsistenz oder Viskosität dieses Schleims erhöhen und auf diese Weise eine normale Expirationsstärke und Clearance verhindern. Entsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Viskosität oder Konsistenz eines solchen Schleims durch Formulierung von einer oder mehreren Aktin-bindenden Verbindungen als Arzneimittel zur Verabreichung in die Atemwege zu vermindern, die einen solchen Schleim enthalten. Die Verbindung kann durch die Auflösung (Depolymerisierung) von Aktinfilamenten zu Aktinmonomeren, durch die Bindung an Aktin, um die Bindung von Aktin an DNase I zu verhindern, oder beides wirksam sein. Die Verbindung kann auch wirksam sein, indem sie die Polymerisierung von Aktinmonomeren zu Filamenten verhindert. Durch Förderung der Clearance von Schleim kann die Verbindung letztendlich die Aktin-Spiegel von Bestandteilen der Atemwege verringern. Demgemäß werden bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eine oder mehrere Aktin-bindenden Verbindungen als Arzneimittel zur Verminderung der Konsistenz oder Viskosität von Schleim der Luftwege oder zur Solubilisierung des Schleims zur Einführung der Aktin-bindenden Verbindung oder Verbindungen in die Atemwege eines Individuums formuliert, dessen Atemwege einen solchen Schleim enthalten.
Der vorliegenden Erfindung liegt ferner die Überlegung zugrunde, daß eitriger Schleim in den Atemwegen signifikante Leukocyten-Verunreinigungen enthält, so daß der Schleim DNA-Polymere enthält, die die Konsistenz oder Viskosität des Schleims erhöhen, und daß er Mengen von Aktinfilamenten enthalten kann, so daß der Schleim zur Blockierung der Atemwege, einem verminderten Auswurf und anderen Formen von Atemnot beiträgt. Demgemäß ist ein erfindungsgemäßes Ziel die Verminderung der Konsistenz oder Viskosität von eitrigem Schleim durch Herbeiführung der Auflösung (Depolymerisierung) der Aktinfilamente, die in dem Schleim vorliegen können, und durch Beschleunigung des Abbaus von in dem Schleim vorliegenden DNA-Polymeren. Folglich werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine oder mehrere Aktin-bindende Verbindungen als Arznei mittel zur Verminderung der Konsistenz oder Viskosität von eitrigem Schleim zur Einführung der Aktin-bindenden Verbindung oder Verbindungen in die Atemwege eines Individuums mit dem Schleim formuliert. Die Aktin-bindenden Verbindungen können ihre Wirkung durch die Depolymerisierung von Aktin zu Aktinmonomeren, die Bindung an Aktinfilamente und -monomere, um ihre Bindung an DNase I zu verhindern, oder beides ausüben. Die Verbindung kann auch wirksam sein, indem sie die Polymerisierung von Aktinmonomeren zu Filamenten verhindert. Durch die Förderung der Clearance von Schleim kann die Verbindung letztendlich die Aktin-Spiegel von Bestandteilen der Luftwege verringern.
Bei allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann, falls DNase I vorliegt, diese entweder endogen sein oder muß für therapeutische Zwecke exogen verabreicht werden. Wenn sie für therapeutische Zwecke verwendet wird, kann sie zur gleichzeitigen Verabreichung mit der (den) Aktin-bindenden Verbindung oder Verbindungen oder getrennt verwendet werden.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Fragmente oder funktionelle Derivate der Aktin-bindenden Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an Patienten mit pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim in ihren Atemwegen verwendet, um einer Blockierung der Atemwege oder einer Verminderung des Auswurfs vorzubeugen.
Gemäß den bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden die Aktin-bindenden Verbindungen als Arzneimittel zur Verminderung der Konsistenz der spezifischen Bestandteile der Luftwege zur Einführung in die Atemwege eines Patienten formuliert, der eine solche Behandlung mit den Aktin-bindenden Verbindungen benötigt, die eine oder mehrere der folgenden Funktionen erfüllen können: (1) Auflösen, Depolymerisieren, Fragmentieren und Dissoziieren von Aktinfilamenten (oder Vorbeugung vor einer Aggregation oder Polymerisierung von Aktinmonomeren und -oligomeren), die aus aufgebrochenen Leukocyten und anderen Zellen freigesetzt wurden, die die Bestandteile der Atemwege verfestigen; (2) Verhinderung der Inhibierung der Wirkung von DNase I durch Aktin, die DNA- Polymere abbaut, durch Blockierung der Aktinbindung an DNase I; (3) schließlich Verringerung der Aktin-Spiegel von Bestandteilen der Luftwege durch Beschleunigung der Clearance der Bestandteile. Es ist selbstverständlich, daß das in den Bestandteilen der Atemwege vor liegende Aktin erfindungsgemäß extrazelluläres Aktin in diesen Bestandteilen in Form von freien Monomeren oder Filamenten ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Protein Gelsolin oder ein aktives Fragment oder funktionelles Derivat davon verwendet. Gelsolin kann zur Einführung in die Atemwege durch übliche Verfahren verwendet werden, wie zum Beispiel jene, die zur Verabreichung von DNase I an Patienten mit Atemnot angewendet werden. Die Verwendung ist jedoch nicht auf Gelsolin allein begrenzt. Gelsolin kann zur gleichzeitigen Verabreichung mit anderen Aktin-bindenden Verbindungen (vorzugsweise dem Vitamin D-bindenden Protein) oder mit DNase I verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können eine oder mehrere Aktin-bindende Verbindungen (vorzugsweise Gelsolin) auch zur Einführung in die Luftwege auf intravenöse Weise verwendet werden. Der Ausführungsform liegt die Überlegung zugrunde, daß die Wirkstoffverabreichung durch Inhalation in verstopften Luftwegen aufgrund der Blockierung von Natur aus begrenzt sein kann. Von einer wirksamen Solubilisierung könnte erwartet werden, daß sie die Wirkstoffverabreichung durch Inhalation verstärkt. Andererseits kann ein Angriff über das Blut den Wirkstoff in den Alveolen sowie Bronchiolen und Bronchien freisetzen, wobei eine solche Freisetzung durch eine chronische Entzündung und eine gleichzeitig erhöhte Blut-Gewebe-Permeabilität verstärkt wird.
Es ist bekannt, daß Plasmaproteine in die Luftwege eintreten können, wie durch die α-1-Antitrypsin-Therapie von angeborenen Emphysemen nachgewiesen wurde. Vermutlich ist die Wirksamkeit der Blut-Gewebe-Verteilung von Plasmaproteinen eine direkte Funktion der Blutspiegel solcher Proteine. Deshalb können die Gelsolin-Spiegel im Plasma gemessen werden, um zu bestimmen, ob die Bindung an Aktin in den Luftwegen eine verringernde Wirkung hatte.
Es wurde gezeigt (Am. J. Path. 130 (1988), 261-267, und Am. Rev. Resp. Dis. 138 (1988), 429-434), daß die Gelsolin-Spiegel im Plasma bei einer experimentell hervorgerufenen Lungenverletzung und bei klinischen ARDS-Erkrankungen erniedrigt sind, und andere behaupteten, daß es eine gewisse Beziehung zwischen der Muskelmasse und den Gelsolin-Konzentrationen im Plasma gibt (Yamamoto H., Osaka Gas Group Foundation Publication, Band 5 (1992), 145-147). Da die wichtigste Quelle für Plasma-Gelsolin der Muskel ist, kann es sein, daß die Spiegel sinken, wenn die Patienten als Antwort auf eine chronische Infektion und einen Sauerstoffmangel in den Geweben zunehmend kachektisch werden.
Bei allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen, bei denen die Wirksamkeit der DNase I verbessert wird, ist das Endziel der Ausführungsform die Beschleunigung des DNA- Abbaus in pathologischen Bestandteilen und insbesondere in Schleim und eitrigem Schleim der Luftwege.
Die Krankheiten, die für eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zugänglich sind, umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt: Mukoviszidose, chronische Bronchitis, die schleimig-eitrige oder eitrige Verschlimmerung einer einfachen schleimigen Bronchitis, Bronchialkatarrh mit einem starken Auswurf von Schleim, Bronchopneumonie, eine ausgedehnte Bronchiolitis, eine Lungenentzündung mit schleimig-eitrigem Auswurf, alveoläre Hepatisation, Asthma, mit oder ohne eine asthmatische Bronchitis mit Schleimpfropfenbildung, akute und/oder chronische eitrige Sinusitis, Emphyseme, Bronchiektasie, eine umschriebene Bronchusausweitung, respiratorische Insuffizienz beim Erwachsenen (ARDS), eine obliterative Bronchiolitis nach einer Transplantation und eine allergische Bronchiolitis (fibrosierende Alveolitis).
Um für ein klareres und folgerichtiges Verständnis der in der Beschreibung und den Patentansprüchen, einschließlich des Schutzumfangs, vorausgesetzten Begriffe zu sorgen, werden die folgenden Definitionen angegeben.
Der Fachmann versteht unter dem Begriff "Atemwege" oder "Luftwege" die tubulären und kavernösen Organe und Strukturen, durch die die Lungenventilation und der Gasaustausch zwischen der Umgebungsluft und dem Blut bewirkt wird. Diese umfassen selbstverständlich u. a. die Nasenhöhle und -muschel, die Rachenöffnung der Ohrtrompete, den Rachen, den Kehlkopf, die Luftröhre, die Bronchien und die Lungen. Die Erfindung betrifft die Behandlung von Bestandteilen der Luftwege, Schleim, eitrigem Schleim, etc. in einem beliebigen Teil des Trakts, insbesondere subtracheal.
Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß die "Bestandteile der Luftwege" oder die "Bestandteile der Atemwege" aus einem Gemisch von Stoffen, die normalerweise von den Zellen produziert werden, die den Luftweg auskleiden (zum Beispiel durch Sekretion), oder aus Resten der Zellen selbst bestehen. Demgemäß versteht der Fachmann unter dem Begriff "pathologische (schleimartige) Bestandteile der Luftwege" oder "pathologische (schleimartige) Bestandteile der Atemwege" diejenigen Bestandteile, die Komponenten enthalten, welche strukturelle und funktionelle Veränderungen der Bestandteile der Luftwege zur Folge haben (wie überschüssiges Aktin), die eine krankhafte Atemwegsfunktion und/oder -krankheit verursachen. Diese umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, Schleim, eitrigen Schleim, zähen Schleim, wie bei Mukoviszidose, Bakterien und ähnliche. Die Komponenten können auch biologische Komponenten von Schleim sein, die die Eigenschaften des Schleims verändern und eine Krankheit oder Funktionsstörung hervorrufen. Die Komponenten selbst können durch einen zugrundeliegenden Krankheitszustand hervorgerufen werden, der zu einer Zunahme der Menge an normalen Bestandteilen der Luftwege oder einer Veränderung der Art der Komponenten beiträgt, die normalerweise in den Bestandteilen der Luftwege vorkommen. Zum Beispiel kann ein gestörtes Gleichgewicht oder eine übermäßige Menge von bestimmten Komponenten vorliegen, die normalerweise in Bestandteilen der Luftwege vorkommen (z. B. überschüssiges Aktin). Der Begriff "Atemnot" bezieht sich auf die Wirkungen von pathologischen Bestandteilen der Luftwege, umfassend, aber nicht darauf begrenzt, eine verminderte Expirationsstärke, eine Blockierung der Luftwege, eine verminderte respiratorische Clearance durch Zilienschlag, eine verminderte respiratorische Clearance durch muskuläre Mechanismen, wie Husten, Räuspern und Niesen, eine respiratorische Reizung durch den anhaltenden Kontakt mit den Bestandteilen und die Retention von lytischen Enzymen, die von Leukocyten stammen, Entzündungsvermittlern, Pilzen, Mycoplasmen, Bakterien oder anderen Mikroorganismen.
Der Fachmann versteht unter dem Begriff "Schleim" den freien Schleim der Schleimmembranen, der aus Sekreten der Drüsen zusammen mit verschiedenen anorganischen Salzen, abgeschilferten Zellen und Leukocyten besteht.
Der Fachmann versteht erfindungsgemäß unter dem Begriff "eitriger Schleim" einen Schleim, der durch aus Leukocyten und/oder abgeschilferten Zellen und/oder aufgebrochenen endogenen Zellen der Luftwege stammenden DNA-Polymeren sehr zähflüssig gemacht und erheblich verfestigt wird.
Die Ausdrücke "Solubilisierung von (schleimartigen) Bestandteilen der Luftwege" oder "Solubilisierung von Schleim" oder "Solubilisierung von eitrigem Schleim" sollen auf die Veränderung der mechanischen Eigenschaften der Bestandteile, des Schleims oder eitrigem Schleims verweisen, um solche Bestandteile mehr wie eine Flüssigkeit und weniger als einen Feststoff, elastischer und als Antwort auf eine Scherbeanspruchung besser fließfähig zu machen. Die Auflösung von Polymeren, die zur Viskosität dieser Komponenten beitragen, kann auch Proteine und andere Moleküle freisetzen, die in den Zwischenräumen des aus Bestandteilen/Schleim/eitrigem Schleim bestehenden Gel eingeschlossen sind. Die Begriffe "Verminderung der Viskosität" oder "Verminderung der Konsistenz" beziehen sich selbstverständlich auf die Veränderung der mechanischen Eigenschaften, wie unmittelbar zuvor beschrieben. Der Fachmann versteht, daß der Begriff "Viskosität" eine physikalische Eigenschaft eines Stoffes bezeichnet, die von der Reibung der Moleküle seiner Bestandteile abhängt, während sie aneinander vorbeigleiten. Eine sehr zähflüssige Lösung wird durch einen hohen Reibungsgrad zwischen den Molekülen der Bestandteile charakterisiert, während eine verminderte Viskosität durch eine Abnahme des Reibungsgrads zwischen den Molekülen der Bestandteile charakterisiert wird, wenn sie aneinander vorbeigleiten.
Der Begriff "exogene DNase" verweist auf DNase, die durch klinische Verfahren an einen Patienten verabreicht werden soll, der eine solche DNase auf Grund einer durch DNA-Polymere in den Atemwegen des Patienten verursachten Atemnot benötigt.
Der Begriff "endogene DNase" verweist auf DNase, die normalerweise in den Atemwegen eines Patienten und insbesondere im Schleim der Atemwege des Patienten vorkommt.
Der Begriff "beschleunigter DNA-Abbau" bezieht sich erfindungsgemäß auf die Verwendung einer bestimmten Menge einer Aktin-bindenden Verbindung, die an Aktin bindet, das in pathologischen Bestandteilen der Luftwege, Schleim oder eitrigem Schleim vorliegt, wobei das Aktin, falls es nicht der Aktin-bindenden Verbindung ausgesetzt wird, an die in diesen Flüssigkeiten vorliegende DNase binden und diese DNase daran hindern würde, die DNA-Polymermenge zu verringern, um eine verminderte Viskosität, einen verbesserten respiratorischen Luftstrom, ein Aushusten und eine Erleichterung von anderen Formen einer durch die Bestandteile der Luftwege verursachten Atemnot zu ermöglichen.
Der Begriff "Aktin-bindende Verbindung" schließt jede Verbindung und insbesondere jedes Protein (oder Peptid) ein, die bzw. das in der Lage ist, Aktin zu binden, um eine beliebige der vielen Funktionen von Aktin zu modifizieren, umfassend die Unterdrückung der Fähigkeit der Aktinmonomere, zu Filamenten zu polymerisieren, bereits existierende Filamente zu fragmentieren (auflösen, depolymerisieren) und an DNase I zu binden. Bei der Formulierung als Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten, der eine Behandlung benötigt, sind die erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Verbindungen im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen, die mit einer solchen Verbindung entweder in vivo (in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt) oder in vitro (als Ergebnis einer chemischen Synthese) assoziiert sind. Solche Verbindungen umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt, extrazelluläre Aktin-bindende Proteine, wie Gelsolin und DBP, und intrazelluläre Aktin-bindende Proteine, wie zum Beispiel jene, die in Zellen am häufigsten vorkommen (zum Beispiel Myosine, Tropomyosine, Profilin und Cofilin), und jene, die am häufigsten in Nicht-Muskelzellen vorkommen. Im Schutzumfang ihrer erfindungsgemäßen Verwendungen eingeschlossene Aktin-bindenden Verbindungen umfassen auch, aber sind nicht darauf begrenzt, a) Aktin-bindende Verbindungen, die überwiegend Aktinmonomere absondern, d. h., Monomere in einem Komplex binden, der gegen eine Polymerisierung beständig ist (zum Beispiel DBP, Profilin, ß&sub4;-Thymosin 1 und Cofilin); b) Aktin-bindende Verbindungen, die Monomere komplexieren und eine Filamente-trennende Wirkung besitzen (zum Beispiel Gelsolin, Villin, Fragmin und Severin); c) Aktin-bindende Verbindungen, die überwiegend die Enden von Aktinfilamenten blockieren und den Austausch von Monomeren mit diesem Ende verhindern (zum Beispiel Tropomodulin, capZ, cap 100, ASP-56); und d) Aktin-bindende, nicht-proteinähnliche Moleküle, die solche Wirkungen auf Aktin haben (zum Beispiel Cytochalasin oder biologisch aktive Derivate davon, die die Enden von Aktinfilamenten blockieren und modifiziert sind, so daß sie extrazellulär bleiben). Der Fachmann versteht, daß nützliche Verbindungen extrazellulär bleiben würden, um einer Toxizität durch eine Wechselwirkung mit funktionellem intrazellulärem Aktin vorzubeugen. Fragmente von Aktin-bindenden Proteinen, die eine Aktinfilament-spaltende und/oder Monomer-komplexierende Aktivität beibehalten, sind ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Gegebenenfalls können solche Verbindungen zur Formulierung eines Arzneimittels zur Verabreichung an ein Tier in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes formuliert werden.
Der Begriff "Tier"schließt alle Tiere ein, bei denen freies Aktin oder Aktinfilamente im Sputum für die Physiologie des Tieres schädlich wären. Unter solchen Tieren steht der Mensch an erster Stelle; die Erfindung soll nicht darauf begrenzt werden, erfindungsgemäß wird erwogen, daß die Arzneimittel zur Behandlung eines beliebigen Tiers und aller Tiere gedacht sind, die von der vorteilhaften Wirkung der Erfindung profitieren können.
Eine "wirksame Menge" einer Aktin-bindenden Verbindung ist eine Menge, die ausreichend ist, um die toxischen Wirkungen von Aktin in den Bestandteilen der Atemwege eines Tieres zu vermindern oder zu eliminieren. Erfindungsgemäß ist sie die Menge einer Verbindung, die bei der Solubilisierung oder Verminderung der Viskosität oder Konsistenz von pathologischen Bestandteilen der Luftwege, Schleim oder eitrigem Schleim, der Inhibierung der Aktin-Bindung an DNase I in diesen Flüssigkeiten oder Gelen, der Beschleunigung des DNA-Abbaus in diesen Flüssigkeiten oder Gelen oder der Verminderung der Konsistenz dieser Flüssigkeiten oder Gele wirksam ist, um verschiedene Formen der Atemnot zu behandeln. Eine wirksame Menge einer Aktin-bindenden Verbindung ist also die Menge, die den Gehalt an Bakterien, die Häufigkeit klinischer Infektionen, den Gehalt an Entzündungsvermittlern oder den Gehalt an abbauenden und cytotoxischen Enzymen bei Atemnotsyndromen verringern kann, die durch diese Flüssigkeiten oder Gele verursacht werden oder verursacht wurden.
Die zu verabreichende Menge des Aktin-bindenden Moleküls und die Dauer der Therapie kann durch die Überwachung der Häufigkeit der Verschlimmerung von Symptomen oder der Abnahme von Symptomen, des Sputumvolumens und der Sputumkonsistenz, der Lungenfunktionen, wie FEV, Blut-pO&sub2;, pH oder pCO&sub2;, der Lungengesamtkapazität, der Restvolumentests des Luftstroms, der Infektionsrate, etc. bestimmt werden. Der gut ausgebildete Kliniker ist mit Routineüberwachungsverfahren zur Atemwegsbehandlung vertraut.
Die Menge des aerosolisierten, Aktin-bindenden Proteins kann gemäß jenen Verfahren bestimmt werden, die zur Bestimmung der Dosen einer DNase-Inhalation angewendet werden, welche zur Behandlung von Patienten mit DNase I wirksam sind. Vgl. zum Beispiel Aitken, M.L. et al., J. Am. Med. Assoc. 267 (1992), 1947-1951, insbesondere Seite 1948, "Study Design". Die in vivo verabreichte Dosis steht mit der in vitro als wirksam bestimmten Menge in Beziehung. Zum Beispiel, falls das Sputum in vitro durch die hier exemplarisch angegebenen Mengen (d. h. 2-10 ug/ml) erfolgreich solubilisiert wird, würde eine 1000fach höhere Dosis als die in vitro-Dosis verabreicht werden (d. h. 2-10 mg/ml). Natürlich ist selbstverständlich, daß die Mengen und Therapieschemata zur Verabreichung der Aktin-bindenden Verbindungen von Fachleuten auf dem Gebiet der Behandlung von Atemwegserkrankungen leicht bestimmt werden können. Im allgemeinen variiert die Dosierung bei der Behandlung mit der Aktin-bindenden Verbindung in Abhängigkeit von Gesichtspunkten, wie der Art der verwendeten Aktin-bindenden Verbindung, dem Alter des Patienten, dem Gesundheitszustand des Patienten, der Schwere der Krankheit, der Art der begleitenden Behandlung, dem Ausmaß der Gewebeschädigung, dem Geschlecht des Patienten, der Dauer der Symptome, Gegenindikationen (wenn überhaupt) und anderen Variablen ab, die selbstverständlich von dem einzelnen behandelnden Arzt eingestellt werden müssen. Die geeignete wirksame Dosis kann routinemäßig durch die Überwachung der Bestandteile der Luftwege durch Absaugen oder als Sputum bestimmt werden.
Ein Material ist "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn es im wesentlichen von Stoffen gereinigt ist, mit denen es normalerweise und natürlicherweise vor einer solchen Reinigung vorkommt. Beispiele von natürlichen Verunreinigungen, mit denen Aktin-bindende Verbindungen assoziiert sein können, sind: Aktin-nichtbindende Peptide, Kohlenhydrate, glykosylierte Peptide, Lipide, Membrane, etc. Ein Material ist im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen, wenn solche Verunreinigungen, die normalerweise und natürlicherweise mit dem Stoff in vivo oder in vitro vorkommen, in einer Probe des Materials im wesentlichen fehlen. Der Begriff "im wesentlichen fehlen" bedeutet, daß solche Verunreinigungen entweder vollständig fehlen oder in solch geringen Konzentrationen vorliegen, daß ihr Vorhandensein (1) nicht die gewünschte therapeutische Wirkung des Wirkstoffs (hier die Aktin-bindende Verbindung) in dem Präparat beeinträchtigt, wenn ein solches Präparat an ein Tier verabreicht werden soll, und (2) dem Tier als Ergebnis der Verabreichung eines solchen Präparats keinen Schaden zufügt.
Der Begriff "Verabreichung" schließt die Einführung der Aktin-bindenden Verbindungen in die Atemwege eines Tieres durch ein geeignetes Verfahren ein, das auf dem Gebiet der Medizin bekannt ist, umfassend, aber nicht darauf begrenzt, die Inhalation einer aerosolisierten Verbindung, die Instillation mittels Bronchoskopie und die intravenöse Infusion.
Die erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Verbindungen können zur gleichzeitigen Verabreichung mit DNase verwendet werden, oder eine Aktin-bindende Verbindung kann zur gleichzeitigen Verabreichung mit einer oder mehreren verschiedenen Aktin-bindenden Verbindungen verwendet werden. Der Begriff "gleichzeitig verabreichen" bedeutet, daß jede von mindestens zwei Verbindungen zur Verabreichung innerhalb eines zeitlicher Rahmens verwendet wird, wobei sich die jeweiligen Perioden der biologischen Aktivität überlappen. Folg lich schließt der Begriff die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen miteinander oder mit DNase I zur aufeinanderfolgenden sowie gleichzeitigen Verabreichung ein.
Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Vehikel" umfaßt Lösungsmittel, Träger, Verdünnungsmittel und ähnliche Stoffe, die als Zusätze für Präparate der erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Verbindungen verwendet werden, um einen Träger oder ein Adjuvans für die Verabreichung solcher Verbindungen bereitzustellen.
Der Begriff "Behandlung" oder "Behandeln" umfaßt die Verabreichung von Aktinbindenden Verbindungen an einen Patienten für Zwecke, die die Prophylaxe, Linderung, Vorbeugung oder Heilung einschließen können.
Der Begriff "Fragment" schließt einen beliebigen Teil eines Moleküls ein, der ein Segment einer Aktin-bindenden Verbindung bereitstellt und zur Bindung von Aktinmonomeren und/oder Spaltung von Filamenten befähigt ist; der Begriff schließt Aktin-bindende Fragmente ein, die aus einer beliebigen Quelle hergestellt werden, wie zum Beispiel aus natürlich vorkommenden Peptidsequenzen, synthetischen oder chemisch synthetisierten Peptidsequenzen und gentechnisch hergestellte Peptidsequenzen. Falls ein solches Fragment ein Peptid ist, schließt ein Fragment eines Peptids eines solchen Aktin-bindenden Proteins außerdem jede Variante des Aktin-bindenden Proteins ein.
Ein "funktionelles Derivat" einer Aktin-bindenden Verbindung ist ein Derivat, das eine biologische Aktivität besitzt, die im wesentlichen mit der biologischen Aktivität der Aktin-bindenden Verbindung vergleichbar ist. Der Begriff "im wesentlichen vergleichbar" bezieht sich auf eine Aktivität, die quantitativ verschieden, aber qualitativ gleich ist. Zum Beispiel würde ein funktionelles Derivat eines erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Proteins das gleiche Aminosäuregerüst wie ein Aktin-bindendes Protein enthalten, aber auch andere Modifikationen, wie posttranslationale Modifikationen, wie zum Beispiel gebundene Phospholipide oder kovalent gebundene Kohlenhydrate, abhängig von der Notwendigkeit solcher Modifikationen für die Leistung des diagnostischen Tests oder der therapeutischen Behandlung. Der Begriff schließt auch, so wie er hier verwendet wird, ein chemisches Derivat einer Aktin-bindenden Verbindung ein. Solche Derivate können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit, etc. verbessern. Die Derivate können auch die Toxizität des Moleküls verringern oder irgendwelche unerwünschten Nebenwirkungen des Moleküls eliminieren oder abschwächen, etc. Derivate und insbesondere chemische Einheiten, die zur Vermittlung solche Wirkungen befähigt sind, werden offenbart in Remington's Pharmaceuticals Sciences (1980). Verfahren zur Kupplung solcher Einheiten an ein Molekül sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Der Begriff "funktionelles Derivat" schließt chemische Derivate, Varianten, Analoge oder pharmazeutisch verträgliche Salze einer Aktin-bindenden Verbindung ein.
Der Begriff "'Variante" bezieht sich auf eine Verbindung, die hinsichtlich der Struktur und biologischen Aktivität mit entweder der nativen Verbindung oder mit einem Fragment davon im wesentlichen vergleichbar ist.
Der Begriff ein "Analog" einer erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Verbindung verweist auf eine Verbindung, die hinsichtlich der Funktion entweder mit der nativen Aktinbindenden Verbindung oder mit einem Fragment davon im wesentlichen vergleichbar ist.
Zum Beispiel ist ein Analog eines Aktin-bindenden Proteins ein Protein, das nicht die gleiche Aminosäuresequenz wie ein Aktin-bindendes Protein aufweist, das aber zu einem Aktinbindenden Protein ausreichend homolog ist, um die biologische Aktivität eines solchen Aktin-bindenden Proteins beizubehalten.
Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Salz" schließt Salze der erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Verbindungen ein. Solche Salze können aus pharmazeutisch verträglichen Säuren oder Basen hergestellt werden, zum Beispiel aus Säuren wie Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, etc., oder Basen wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, Ammoniumhydroxide, Alkylammoniumhydroxide, etc.
Die "biologische Aktivität" der erfindungsgemäßen Verbindungen beruht auf ihrer Fähigkeit, Aktin zu binden und es in einer Form zu modifizieren, die weniger toxisch als nicht-modifiziertes Aktin für ein Tier ist. Eine solche Modifikation kann das Ergebnis der Bindung der Verbindungen per se oder das Ergebnis einer chemischen oder enzymatischen Reaktion sein, die aus einer solchen Bindung resultiert.
Die einzelnen Aktin-bindenden Moleküle, die Gegenstand der erfindungsgemäßen Verwendungen sind, sind gereinigte native und rekombinante Aktin-bindende Proteine und andere nicht-proteinähnliche Aktin-bindende Moleküle und biologisch aktive Fragmente davon, die durch das Vorhandensein von einzigartigen Aktin-bindenden Domänen gekennzeichnet sind, welche die biologische Aktivität besitzen, die sie befähigt, Aktin in einer monomeren Form zu komplexieren oder Aktinfilamente schnell aufzulösen oder zu depolymerisieren oder Stellen auf dem freien Aktin abzuschirmen, die für die Wirtszellen toxisch sind. Einzelne Aktin-bindenden Domänen, die diese biologische Aktivität besitzen, können auch durch synthetische, enzymatische, proteolytische, chemische oder DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Gelsolin oder Aktin-bindende Fragmente davon, DBP oder eine Kombination von Gelsolin oder Aktin-bindenden Fragmenten davon und DBP zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, das für einen Patienten bestimmt ist, der eine Behandlung benötigt. Andere bevorzugte Aktin-bindenden Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen ß&sub4;-Thymosin und ASP-56. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Gelsolin oder Aktin-bindende Fragmente davon oder eine Kombination von Gelsolin oder Aktin-bindenden Fragmenten davon und dem Vitamin D-bindenden Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen Verabreichung mit DNase I an einen Patienten verwendet, der eine Behandlung benötigt.
Präparate der erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Proteine zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungsmittel, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele nicht-wäßriger Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl, Fischöl und injizierbare organische Ester. Wäßrige Träger umfassen Wasser, Wasser-Alkohol-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich physiologischer Kochsalzlösung und gepufferter, medizinischer, parenteraler Vehikel, umfassend Natriumchloridlösung, Ringers Dextroselösung, Dextrose plus Natriumchloridlösung, Lactose enthaltende Ringer-Lösung; und nichtflüchtige Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstofflieferanten, Elektrolytlieferanten, wie jene, die auf der Ringer-Dextroselösung basieren, und ähnliche.
Die erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Proteine können auch zur Verabreichung mit Hilfe von Pumpen oder in Depotform verwendet werden, insbesondere wenn die zugrundeliegende Beeinträchtigung eher ausgedehnt oder anhaltend als akut ist.
Die Verabreichung in Depotform ist für den Patienten bequemer, wenn wiederholte Injektionen während anhaltenden Zeiträumen angezeigt sind. Zum Beispiel wird die Verabreichung der erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Proteine in Depotform bevorzugt, wenn die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen zur Behandlung einer genetischen oder chronischen Krankheit verwendet werden, der eine mit Aktin in Beziehung stehende Störung zugrundeliegt, um das Wohlbefinden des Patienten zu steigern.
Die erfindungsgemäßen Aktin-bindenden Proteine können in Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln, Pulverpäckchen oder flüssigen Lösungen zur oralen Verabreichung verwendet werden, wenn die biologische Aktivität des Proteins nicht durch den Verdauungsvorgang zerstört wird, und wenn die Eigenschaften der Verbindung es erlauben, daß sie über das Darmgewebe absorbiert wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen werden mit Hilfe von den Fachleuchten bekannten Verfahren als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen hergestellt, zum Beispiel durch herkömmliche Misch-, Granulierungs-, Dragee-Herstellungs-, Lösungs-, Gefriertrocknungs- oder ähnliche Verfahren. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen finden an und für sich selbst Anwendung bei der Regulierung einer Aktin-induzierten physiologischen Schädigung, sei sie chronisch oder akut. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen beeinflussen die körpereigenen Mechanismen zum Umgang mit überschüssigem Aktin im Blutstrom oder in extrazellulären Geweben, so daß sie ihre maximale Leistungsfähigkeit erreichen. Bei der intravenösen Dosierungsform weisen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen ausreichend schnellen Wirkungseintritt auf, so daß sie bei der akuten Behandlung einer potentiellen Gewebeschädigung nützlich sind.
Aktin-bindenden Proteine, die im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind, können aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen gemäß herkömmlicher Bedingungen und Verfahren isoliert und gereinigt werden, die bereits auf dem Fachgebiet zur Isolierung solcher Proteine angewendet werden, wie Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese oder ähnliche.
Der Fachmann kann die Aktin-bindende(n) Domäne(n) einer Aktin-bindenden Verbindung unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren ohne übermäßiges Experimentieren identifizieren, und solche Domänen werden für die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen bevorzugt. Zum Beispiel können Derivate der nativen Aktin-bindenden Proteine oder Derivate von rekombinant hergestellten, Aktin-bindenden Proteinen mittels proteolytischer Spaltung des ganzen Aktin-bindenden Proteins mit herkömmlichen Proteasen, wie zum Beispiel Trypsin, Chymotrypsin und Subtilisin, hergestellt werden. Die Affinitätschromatographie mit Aktin-derivatisierten Harzen kann angewendet werden, um solche Fragmente auf ihr Aktin-Bindevermögen zu testen.
Wenn die Identifizierung von Verbindungen oder Fragmenten davon, die eine Aktin-spaltende Aktivität besitzen, gewünscht wird, können solche Verbindungen oder Fragmente auch unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren identifiziert werden, zum Beispiel durch Verfolgen der Depolymerisierungsrate von Pyren-markiertem F-Aktin.
Solche Fragmente können außerdem durch ihre Homologie mit anderen bekannten Aktin-bindenden oder Aktin-spaltenden Domänen identifiziert werden, wobei vorhergesagt werden kann, daß die Funktion der Homologie folgt. Zum Beispiel ist bekannt, daß Severin, Gelsolin und Villin und insbesondere die Aminosäurereste 40-351 in Severin und die Aminosäurereste 63-383 in Gelsolin eine weitgehende Homologie hinsichtlich der für die F-Aktinspaltende Aktivität verantwortliche Domäne zeigt.
Der N-terminale Abschnitt von Gelsolin, zum Beispiel ein N-terminales, tryptisches Fragment, das als CT45 bekannt ist, ist zur Spaltung von F-Aktin befähigt und enthält zwei Aktin-Bindungsstellen. Wirksame Mengen von CT45, die im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind, können zur Verabreichung an einen Patienten verwendet werden. Eine dieser Stellen kommt in dem chymotryptischen Fragment CT15N vor (Reste 24-150 des menschlichen Gelsolins), das die Enden von Aktinmonomeren und -filamenten mit hoher Affinität bindet; die andere Stelle ist in dem benachbarten Fragment CT28N (Reste 151-406) enthalten, das an die Seitenkette von F-Aktin in einer Polyphosphoinositid-regulierten Weise bindet. Keines der Fragmente spaltet Aktinflamente selbst. Das kleinste Gelsolinpolypeptid, das zur Spaltung von F-Aktin befähigt ist, umfaßt die Reste 25-165 von Plasma-Gelsolin.
Außerdem sind Verbindungen wie Aktin-bindende Proteine unter den Arten stark konserviert und können leicht in großen Mengen aus nicht-menschlichem (Rind, Schwein) Plasma und/oder Muskelgeweben isoliert werden, und Fragmente dieser Proteine können chemisch oder enzymatisch durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Folglich können solche Aktin-bindenden Verbindungen zur Verabreichung an einen Patienten verwendet werden, der die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen benötigt, ohne eine schwere Immunantwort hervorzurufen.
Alle in dieser Anmeldung erwähnten Dokumente sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung veranschaulichen die folgenden Beispiele die bei der Durchführung der Erfindung verwendeten Materialien und Verwendungen weiter. Die Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise begrenzen.

Beispiel 1

Proben von ausgehustetem Sputum von Patienten mit Mukoviszidose, von denen einige aerosolisierte DNase I erhalten hatten, wurden aufgetaut und in Teile aufgeteilt. Das von Shak et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9188-9192) beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von DNase I auf die Sputumkonsistenz wurde befolgt, außer daß anstelle von DNase I gereinigtes Plasma-Gelsolin zugegeben wurde. Dieses Protein trennt Aktinfilamente nicht-kovalent. Ein rekombinantes Gelsolinfragment, das in E. coli produziert wurde und die Aminosäurereste 1-260 von Gelsolin ("Gelsolin 260") umfaßt und auch Aktinfilamente fragmentieren kann, wurde ebenfalls verwendet. Diese Proteine, die bekannte Wirkungen auf DNA haben, ergaben im wesentlichen die gleichen von Shak et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9188-9192) beschriebenen Ergebnisse im Fließfähigkeitstest für Mukoviszidose-Sputum. Das Gelsolinfragment war wirksamer als Gelsolin, obwohl es in einer dreifach höheren Konzentration zugegeben wurde (Tabelle 1).

Tabelle 1

Sputumproben von etwa 150 mg wurden durch Schneiden mit einer Rasierklinge abgetrennt und in die angeführten Zusätze in 50 ml-Volumen enthaltende Teströhrchen überführt. Die Proben wurden bei 37ºC in den Teströhrchen inkubiert, die in den in der Tabelle gezeigten Zeitintervallen umgedreht wurden, und das Auftreten und das Ausmaß einer Bewegung des Sputums nach leichtem Klopfen an der Seite des Röhrchens wurde aufgezeichnet; 0 = keine Bewegung; Tr = < 10% des Sputums bewegten sich an der Seite des umgedrehten Röhrchens nach unten; 1+ = 10-20% des Sputums bewegten sich; 2+ = 20-50% des Sputums bewegten sich; 3+ = > 50% des Sputums bewegten sich; 4+ = das gesamte Sputum bewegte sich.
Die Experimente wurde mit weiteren Sputumproben wiederholt, die identische Ergebnisse ergaben. Das gekochte Gelsolinfragment war inaktiv.

Beispiel 2

Sputumproben wurden mit einem konventionelleren Fließtest unter Einbeziehung eines Torsionspendels untersucht. Wie in Fig. 1A gezeigt, war Mukoviszidose-Sputum sehr fest und elastisch, wie durch die hohe Schwingungsfrequenz gezeigt wurde, die durch eine vorübergehende mechanische Beanspruchung induziert wurde, aus der ein Elaszitätsspannungsmodul (G') berechnet werden konnte. Die Zugabe von Gelsolin (1B) und des Gelsolinfragments (1C) verringerte die Schwingungsfrequenz, wobei die Module um das Drei- bzw. Zehnfache kleiner waren. Wieder war das in einer höheren Konzentration vorliegende Fragment wirksamer als Gelsolin. Die Verformungsantwort (bekannt als "Kriechdehnung") des Sputums auf eine gleichmäßige mechanische Beanspruchung zeigte die dem Mukoviszidose- Sputum eigene Steifheit oder schlechte elastische Verformung, während Gelsolin und das Gelsolinfragment wieder in einer Dosis-Antwort-Weise die elastische Kriechverformung verringerten. Jedoch kehrten alle Proben wieder auf ihre ursprünglichen Positionen zurück, nachdem die mechanische Beanspruchung zurückgenommen wurde, was zeigt, daß kohärente Polymere, möglicherweise Mucopolysaccharide und DNA, in den Gelen zurückblieben.

Beispiel 3

Rhodaminphalloidin, das an polymeres Aktin bindet, wurde zu Mukoviszidose- Sputumproben zugegeben, die dann mit Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopen beobachtet wurden. Die Proben enthielten Zelltrümmer, die vermutliche Quelle von DNA und Aktin, und fluoreszierten hell. Unbehandelte und Gelsolinfragment-behandelte Sputumpfropfen wurden in 2,5 ml 0,15 M NaCl-Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die Absorption bei 280 nm wurde als Hinweis darauf bestimmt, wieviel Protein aus den Sputumgelen frei gesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben und zeigen, daß Gelsolin und das 260 kDa-Fragment Protein aus den Sputumpfropfen freisetzten.

Tabelle 2

Probe OD @ 1 = 280 nm (OD)
Sputum allein 0.015
Sputum + 1.5 mM Gelsolin 0.249
Sputum + 2.1 mM 260-Fragment 0.247

Analyse des aus Mukoviszidose-Sputumgelen freigesetzten Proteins, die mit Gelsolin inkubiert wurden

50 ul-Proben der Überstände, deren optischen Dichten bestimmt worden waren, wurden zu einem gleichen Volumen von Natriumdodecylsulfat- und β-Mercaptoethanolenthaltenden Pufferlösungen zugegeben, und die Polypeptide in diesem Gemisch wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Das Gel zeigte, daß die Gelsolin- und Gelsolinfragment-enthaltenden Lösungen viele verschiedene Proteine und große Mengen von drei Proteinen enthielten, umfassend eines, das mit dem als Molekulargewichtsstandard verwendeten Aktin eher wanderte als mit dem Kontrollüberstand.

Anti-Aktin-Antikörper-Immunblot-Untersuchung von Mukoviszidose-Sputum

Doppelte Proben von Mukoviszidose-Sputum von zwei verschiedenen Patienten wurden in einem gleichen Volumen von 0,15 M Natriumchlorid und 20 mM Tris-HCl, ph 7,0, suspendiert und homogenisiert. 50 ul des Materials wurden zu einem gleichen Volumen von SDS-Gelpuffer zugegeben und durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Polypeptide des Gels wurden auf Nitrocellulose übertragen und die Aktin-Bande wurde mit einem Anti-Aktin-Antikörper identifiziert. Die Banden wurden in den das Sputum enthaltenden Bahnen beobachtet. Dieses Ergebnis bestätigt, daß Aktin in Mukoviszidose- Sputum vorliegt.

Beispiel 4

Solubilisierung von eitrigem Sputum durch Aktin-bindende Proteine

Proben von frischem Sputum von CF-Patienten (CF = "Cystic Fibrosis") wurden gewonnen und innerhalb weniger Stunden nach dem Sammeln getestet. Bei diesem Test wurde im Handel erhältliche Rinder-DNase I direkt mit gereinigtem Plasma-Gelsolin in dem Fließfähigkeitstest verglichen (Tabelle 3). Tabelle 3
Da das Molekulargewicht von DNase I 31 000 und das von Gelsolin 84 000 beträgt, ist Gelsolin bezogen auf das Gewicht erheblich wirksamer. Auch das schnelle Einsetzen der Wirkung steht im Einklang mit der für Gelsolin erwarteten stöchiometrischen Wirkung, während das langsamere Einsetzen für DNase eher mehr mit der Depolymerisierung durch den Verlust von Monomeren an den Enden im Einklang steht als mit der Fragmentierung von Aktinpolymeren oder der enzymatischen Wirkung auf DNA.

Wirkung der Gelsol in- und DNase I-Konzentration auf die Viskosität von CF-Sputum

Um die Wirkung der Konzentration von Gelsolin und DNase I auf die Viskosität von CF-Sputum zu vergleichen, bestimmten die hier genannten Anmelder die Änderung der Viskosität von Sputumproben nach der Zugabe von variierenden Konzentrationen dieser Verbindungen.
Die Sputumproben wurden von CF-Patienten durch Aushusten gewonnen und entweder unmittelbar getestet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20ºC gelagert. Die gelagerten Proben wiesen Fließeigenschaften auf, die von denjenigen von frischen Proben nicht zu unterscheiden waren.
Die Viskosität wurden mit einem Torsionspendel gemessen, und die Werte wurden aus der Kriechdehnungsrate der Probe bei einer mechanischen Beanspruchung von 125 mPa gemäß der Beschreibung von Janmey P.A., J. Biochem. Biophys. Methods 22 (1991), 41, berechnet. Gleichförmige Pfropfen von 0,25 ml wurden aus kohärenten Massen der Sputumproben geschnitten und die Pfropfen wurden auf runde Deckgläser aufgetragen. Zehn Mikroliter Puffer A ohne Zusätze oder Puffer A mit 50, 75, 150, 250 oder 500 nM gereinigtem menschlichem Gelsolin oder mit 100, 250, 500, 600 oder 750 nM DNase I aus Rinderpankreas (Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey) wurden zu den Sputumproben zugegeben. Nach einer 60-minütigen Inkubation wurde die Viskosität der Sputumprobe eines jeden Patienten in doppelter Ausfertigung bei jeder Konzentration des Zusatzes bestimmt.
Wie in Tabelle 4 und Fig. 3 gezeigt, bewirkt Gelsolin eine deutliche Verminderung der Viskosität, auch in der niedrigsten Konzentration. Im Gegensatz dazu hatte DNase I keine Wirkung auf die Viskosität des Sputums bei Konzentrationen von bis zu 500 nM. Tabelle 4

Beispiel 5

Zusammenwirken zwischen DNase I und Gelsolin: konzentrationsabhängige Freisetzung von Proteinen

Ein Proteinfreisetzungsexperiment wurde durchgeführt, das die konzentrationsabhängige Auflösung von Sputumproben von drei Mukoviszidose-Patienten zeigte. Sputumproben mit einem etwa gleichen Volumen wurden in 0,5 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung suspendiert, die Konzentrationen von gereinigtem menschlichem Plasma-Gelsolin von etwa 2,0 ug/ml, 4 ug/ml, 7 ug/ml und 21 ug/ml enthielt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden die Proben zentrifugiert und die optische Dichte (λ = 280 nm) der Überstände wurde bestimmt. Die A&sub2;&sub8;&sub0;-Ablesewerte waren bezogen auf einen relativen Maßstab wie folgt: 2 ug/ml: 0,25; 4 ug/ml: 1,30; 7 ug/ml: 1,86; und 21 ug/ml: 180. Der A&sub2;&sub8;&sub0;-Ablesewert nach der Behandlung mit 4 ug/ml DNase I war etwa 0,5. Der A&sub2;&sub8;&sub0;-Ablesewert nach einer Behandlung mit 4 ug/ml DNase I plus 2 ug/ml Gelsolin war etwa 1,3. Gelsolin erzielt wie erwartet eine stärkere Auflösung in einer geringen Dosis in Gegenwart einer im Grunde unwirksamen DNase I-Konzentration.

Wirkung von Gelsolin kombiniert mit DNase I auf die Viskosität von CF-Sputum

Um zu bestimmen, ob die Kombination von Gelsolin mit DNase I hinsichtlich der Verminderung der Viskosität von CF-Sputum ein Zusammenwirken zeigt, bestimmten die hier genannten Anmelder die Viskosität von Sputumproben über einen bestimmten Zeitraum nach Zugabe von einer oder beider Verbindungen.
Die Sputumproben wurden von CF-Patienten durch Aushusten gewonnen und entweder unmittelbar getestet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20ºC gelagert. Die gelagerten Proben wiesen Fließeigenschaften auf, die sich von denjenigen von frischen Proben nicht unterschieden.
Die Viskosität wurden mit einem Torsionspendel gemessen, und die Werte wurden aus der Kriechdehnungsrate der Probe bei einer mechanischen Beanspruchung von 125 mPa gemäß der Beschreibung von Janmey P.A., J. Biochem. Biophys. Methods 22 (1991), 41, berechnet. Gleichförmige Pfropfen von 0,25 ml wurden aus kohärenten Massen der Sputumproben geschnitten und die Pfropfen wurden auf runde Deckgläser aufgetragen. Zehn Mikroliter Puffer A ohne Zusätze, mit 250 nM gereinigtem menschlichem Gelsolin, mit 250 nM DNase I aus Rinderpankreas (Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey) oder mit 250 nM einer Kombination von Gelsolin und DNase I wurden dann zu einer jeden Probe zugegeben. Die Deckgläser wurden dann gegen die freihängende Platte des Torsionspendels gepreßt. Doppelte Messungen der Viskosität der Sputumprobe eines jeden Patienten wurden 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Zugabe des Puffers durchgeführt.
Wie in Fig. 4 gezeigt, ruft Gelsolin kombiniert mit DNase I eine größere Verminderung der Viskosität des Sputums als Gelsolin allein hervor. DNase I in der gleichen Konzentration hatte keine Wirkung auf die Viskosität der Proben. Die Viskosität von Sputumproben des gleichen Patienten, die mit Puffer A allein behandelt wurden, veränderte sich im Verlauf des Experiments nicht.

Beispiel 6

Wirkung einer Kombination von Aktin-bindenden Verbindungen auf CF-Sputum

Um die Wirkung einer Kombination von Aktin-bindenden Verbindungen auf die Viskosität von CF-Spurum zu testen, bestimmten die hier genannten Anmelder die Änderung der Viskosität von Sputumproben mit der Zeit nach der Zugabe von Gelsolin kombiniert mit Gc-Globulin (Vitamin D-bindendes Protein).
32 Sputumproben wurden von 5 CF-Patienten gewonnen. Die Proben wurden entweder sofort untersucht oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20ºC gelagert. Die gelagerten Proben wiesen Fließeigenschaften auf, die sich von denjenigen von frischen Proben nicht unterschieden.
Die Viskosität wurden mit einem Torsionspendel gemessen, und die Werte wurden aus der Kriechdehnungsrate der Probe bei einer mechanischen Beanspruchung von 125 mPa gemäß der Beschreibung von Janmey P.A., J. Biochem. Biophys. Methods 22 (1991); 41, berechnet. Gleichförmige Pfropfen von 0,25 ml wurden aus kohärenten Massen der Sputumproben geschnitten und die Pfropfen wurden auf runde Deckgläser aufgetragen. Zehn Mikroliter Puffer A ohne Zusätze oder mit 250 nM einer Kombination von gereinigtem menschlichem Gelsolin und Gc-Globulin (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) wurden dann zu einer jeden Probe zugegeben und die Deckgläser wurden gegen die freihängende Platte des Torsionspendels gepreßt. Doppelte Messungen der Viskosität der Sputumprobe eines jeden Patienten wurden 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Zugabe des Puffers durchgeführt.
Wie in Fig. 5 gezeigt, vermindert Gelsolin kombiniert mit Gc-Globulin die Viskosität der Sputumproben schnell. Die Viskosität von Sputumproben des gleichen Patienten, die mit Puffer A allein behandelt wurden, veränderte sich im Verlauf des Experiments nicht.

Claims

1. Verwendung von mindestens einer Aktin-bindenden Verbindung oder Fragmenten oder funktionellen Derivaten davon, die von DNase I verschieden sind, für die Herstellung eines Arzneimittels zur:

(a) Solubilisierung von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim in den Atemwegen eines Patienten;

(b) Verminderung der Viskosität von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim in den Atemwegen eines Patienten;

(c) Behandlung einer Blockierung der Atemwege in einem Patienten, wobei die Blockierung durch das Vorhandensein von pathologischen Bestandteilen, Schleim oder eitrigem Schleim in den Atemwegen verursacht wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Aktin-bindende Verbindung eine Aktinfilament-trennende Aktivität besitzt.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Aktin-bindende(n) Verbindung oder Verbindungen aus der Gelsolin, Villin, Fragmin und Severin umfassenden Gruppe ausgewählt sind.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Aktin-bindende Verbindung Gelsolin oder ein aktives Fragment oder ein funktionelles Derivat davon ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das aktive Fragment das chymotryptische Fragment CT45 ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das aktive Fragment die Aminosäurereste 25-165 von Gelsolin enthält.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei mindestens eine Aktin-bindende Verbindung Aktinmonomere in Komplexen absondert, die gegen eine Polymerisation beständig sind.

8. Verwendung nach. Anspruch 7, wobei die Aktin-bindende(n) Verbindung oder Verbindungen aus der das Vitamin D-bindende Protein, Cofilin, Profilin und Depactin umfassenden Gruppe ausgewählt sind.

9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine Aktin-bindende Verbindung Gelsolin oder ein aktives Fragment oder ein funktionelles Derivat davon ist und eine andere Aktinbindende Verbindung das Vitamin D-bindende Protein ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei DNase I gleichzeitig an den Patienten verabreicht werden soll.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die pathologischen Bestandteile, der Schleim oder der eitrige Schleim der Atemwege mit einem pathologischen respiratorischen Zustand assoziiert sind, der ausgewählt ist aus Mukoviszidose, chronischer Bronchitis, schleimig-eitriger oder eitriger Verschlimmerung einer einfachen mukösen Bronchitis, Bronchopneumonie, einer ausgedehnten Bronchiolitis, einer Lungenentzündung mit schleimig-eitrigem Auswurf, alveolärer Hepatisation, Asthma, mit oder ohne einer asthmatischen Bronchitis mit Schleimpfropfenbildung, akuter und/oder chronischer eitriger Sinusitis, Bronchiektasie, einer Bronchuserweiterung, respiratorischer Insuffizienz beim Erwachsenen (ARDS), einer obliterativen Bronchiolitis nach einer Transplantation und einer allergischen Bronchiolitis (fibrosierende Alveolitis).