DE69725897T2

DE69725897T2 - Behandlung von störungen mittels interleukin-9

Info

Publication number: DE69725897T2
Application number: DE69725897T
Authority: DE
Inventors: Jean-Christophe Renauld; Mary-Christine Many; François HUAUX; Dominique Lison
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Cancer Research
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2017-08-30
Also published as: CA2263935A1; AU721908B2; ATE252911T1; WO1998008545A1; ES2210569T3; US5830454A; AU4171297A; DE69725897D1; EP1007093A1; EP1007093B1; DK1007093T3; US5935929A; PT1007093E; JP2000517322A; EP1007093A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Interleukin-9 (IL-9) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung pathologischer Zustände, insbesondere fibrotischer Erkrankungen sowie Autoimmunerkrankungen, das alleine oder zusammen mit anderen Medikamenten verabreicht wird.
HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Interleukin-9 (hierin nachstehend „IL-9") ist ein Glykoprotein, das aus Mäuse- sowie menschlichen Zellen isoliert worden ist. Siehe z. B. US-A-5.208.218. Dieser Verweis lehrt auch isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für den Proteinabschnitt des Moleküls kodieren, und wie dieser exprimiert wird.
Verschiedene Verwendungsarten des Moleküls, zusätzlich zu seinem ersten Nutzen als T-Zellen-Wachstumsfaktor, sind z. B. in der US-A-5.164.317 (starke Vermehrung von Mastzellen), 5.246.701 und 5.132.109 (Förderung der Erzeugung von IgG und Hemmung der Erzeugung von IgE) ersichtlich. Beispiele für die umfassende wissenschaftliche Literatur über das Molekül sind Van Snick et al., J. Exp. Med. 169(1), 363–368 (1989) (cDNA für das Mäusemolekül, folglich als P40 bezeichnet); Houssiau et al., J. Immunol. 148(10), 3147–3151 (1992) (IL-2-Abhängigkeit der IL-9-Expression in T-Lymphozyten); Renauld et al., Oncogene 9(5), 1327–1332 (1994) (Wirkung auf Thymuslymphome); Renauld et al., Blood 85(5), 1300–1305 (1995) (anti-apoptotischer Faktor für Thymuslymphome). Übersichtsartikel sind z. B. in Renauld et al., Cancer Invest. 11(5), 635–640 (1993); Renauld et al., Adv. Immunol. 54, 79–97 (1993), zu finden.
Es gibt keine Literatur über den Einfluss von IL-9 auf Autoimmunerkrankungen.
Auf dem Fachgebiet ist eine große Anzahl an Autoimmunerkrankungen bekannt, die auf verschiedene Arten klassifiziert sind. Eine Art der Klassifikation erfolgt anhand des Aspekts des Immunsystems, der am engsten mit der Erkrankung verbunden ist. Beispielsweise sind bei der humoralen Reaktion in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen B-Zellen involviert. Antikörper gegen Selbstmoleküle, wie Acetylcholin-Rezeptor (Myasthenia gravis) oder TSH-Rezeptor (Basedow-Krankheit), werden gebildet. Bei Autoimmunerkrankungen, die eine Zellreaktion beinhalten, reagieren T-Zellen, Makrophagen und NK-Zellen mit Selbstmolekülen. Beispiele für solche Erkrankungen sind Insulinabhängiger Diabetes und Thyreoiditis. Diese Krankheitsfamilie resultiert u. a. aus einer Verschiebung des Th1/Th2-Gleichgewichts.
Ein Problem bei der Untersuchung von Autoimmunerkrankungen ist das Fehlen geeigneter Tiermodelle. Ohne ein geeignetes System, um eine bestimmte Erkrankung zu untersuchen, können keine Schlüsse auf die potentielle Wirksamkeit eines bestimmten Medikaments in einem therapeutischen Kontext gezogen werden.
Es gibt jedoch ein geeignetes Tiermodell für zellvermittelte Erkrankungen, das in der folgenden Offenbarung verwendet wurde. Anhand des spezifischen Falls induzierter Thyreoiditis in einem Mausmodell wurde gezeigt, dass IL-9 in Th1-assoziierten Autoimmunerkrankungen therapeutisch wirksam ist. Dies wird in der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen dargestellt.
Das in der Offenbarung verwendete Mausmodell kann auch zur Untersuchung von Erkrankungen wie Sialadenitis, autoimmuner hämolytischer Anämie und anderen Erkrankungen verwendet werden. Weiters ist ein Mausmodell verfügbar, das für die Untersuchung von Pathologien, die Fibrose einschließen, wie z. B. interstitielle Lungenerkrankung, eingesetzt werden kann. Charakteristisch für diese mit Fibrose in Zusammenhang stehenden Erkrankungen ist eine Entzündung im betroffenen Gewebe oder Organ, die zu Narbenbildung und Entstellung des Gewebes führt. Beispielhaft für diese Gruppe von Pathologien sind interstitielle Lungenerkrankungen, wie Silikose, Asbestose, durch Siliziumdioxidstaub hervorgerufene Lungenerkrankung („white lung disease"), Staublungenerkrankung, Shaver-Krankheit etc. Diese Erkrankungen sind als Pneumokoniosen (oder anthrakotische Tuberkulose) bekannt und schließen eine Entzündung und Lungenfibrose ein, die z. B. durch Inhalation feiner Mineralteilchen verursacht werden. Andere fibrotische Leiden umfassen sämtliche Formen von Sklerose, mit Fibrose in Zusammenhang stehendem Rheumatismus, wie z. B. primärchronische Polyarthritis, und Kollagenverbundene Fibrose, wie z. B. Leiden, die Keloide einschließen, Narbenbildung, Nierenerkrankungen, die verwandte Zustände umfassen, usw.
Die Mausmodelle für diese Leiden wurden, wie unten ersichtlich wird, dazu verwendet, die Wirksamkeit von IL-9 in deren Behandlung aufzuzeigen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die Wirkung hoher Dosen an Iodid nach der Kropfinduktion bei NOD-Mäusen.
1B zeigt die Wirkung von IL-9 auf mit Iodid behandelte NOD-Mäuse.
1C veranschaulicht die Färbung für CD4⁺-T-Zellen in den Schilddrüsen von NOD-Mäusen mit Kropf nach der Behandlung mit einer hohen Iodid-Dosis, jedoch ohne IL-9.
1D kann mit 1C verglichen werden, zeigt jedoch die Ergebnisse mit IL-9.
1E und 1F zeigen das Ergebnis von Versuchen, die eine langfristige IL-9-Therapie untersuchten.
1G zeigt parallel dazu die Ergebnisse bei der Verwendung von IL-4.
1H zeigt die Thyreoiditis-Induktion bei Tieren, die vorher durch die Verabreichung von IL-9 vor Thyreoiditis bewahrt wurden.
Die 2A und 2B veranschaulichen die Ergebnisse einer Lymphknotenbiospie, die zur Messung der B-Zellen-Avtivierung durch die Immunfärbung von B-Zellen dient.
3 zeigt die Ergebnisse von ELISA-Analysen zur Bestimmung von Anti-Thyreoglobulin-Antikörpern in den Versuchstieren. Von links nach rechts gelesen werden in dieser Figur die Ergebnisse von NOD-Mäusen ohne Thyreoiditis, NOD-Mäusen, die lediglich mit Iodid behandelt wurden, und Mäusen, die Iodid und IL-9 erhielten, gezeigt. Die zwei optischen Dichten stammen von zwei Verdünnungen des getesteten Serums.
Die 4A und 4B veranschaulichen die Immunfärbungsdaten für B-Zellen in der Schilddrüse von FVB-Mäusen. 4A zeigt die Immunfärbung ohne IL-9 und 4B jene mit IL-9.
5 veranschaulicht die Ergebnisse einer Untersuchung von Langerhans-Inseln nach der Verabreichung von IL-9.
Die 6A und 6B zeigen die Wirkung von IL-9 auf Pankreas-Insulitis bei NOD-Mäusen, wobei 6A die Inseln einer 10 Wochen alten NOD-Maus zeigt, die eine stark Iodid-hältige Ernährung und kein IL-9 erhielt, und 6B die Inseln einer 10 Wochen alten NOD-Maus zeigt, die eine stark Iodid-hältige Ernährung sowie IL-9 erhielt.
Die 7A und 7B zeigen die Histologie der Lungen normaler sowie IL-9-transgener Mäuse, denen intratracheal Siliciumdioxid-Teilchen verabreicht wurden.
8 zeigt die Hydroxyprolin-Spiegel in den Lungen normaler Mäuse und transgener Mäuse, die vermehrt IL-9 bilden und den Teilchen ausgesetzt worden sind.
9 zeigt die FACS-Analyse von Zellen, die in der bronchoalveolären Spülung normaler Mäuse oder IL-9-Mäuse vorhanden sind, die mit Siliciumdioxid behandelt worden sind oder nicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1
Zwei Stämme von Mäusen, d. h. der FVB-Stamm und der NOD-Stamm, wurden zu den folgenden Versuchen herangezogen. Der NOD-Mäusestamm wird als geeignetes Modell für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen erachtet. Der Grund dafür liegt darin, dass der Stamm eine nicht fettleibige, diabetische Maus (non-obese diabetic, daher „NOD") verkörpert, die als Ergebnis von Autoimmunerkrankungen wie Diabetes spontan Pankreas- sowie Schilddrüsenläsionen entwickelt. Der Mäusestamm ist ebenfalls als Modell für die Pathogenese und Immuntherapie von Autoimmunerkrankungen wie zellvermittelte Autoimmunerkrankungen nützlich. Siehe z. B. Many et al., J. Endroncrinol. 147, 311–320 (1995); Male et al., Advanced Immunology Third Edition, 12–15 (1996); Kikutani et al., Adv. Immunol. 51, 285–322 (1992). Im Speziellen wird, mit Verweis auf Autoimmundiabetes, die mononukleare Zellinfiltration der Pankreas-Inseln schon im Alter von 4–6 Wochen detektiert, gefolgt von der Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Pankreasinsel.
Th1-Zellen stehen mit diesem Entzündungsprozess der Langerhans-Inseln in Zusammenhang. Dies führt wiederum nach 30 Wochen bei 70–80% der Weibchen sowie 20 der Männchen zu Diabetes. Dies wird von Studien unterstützt, die eine Beschleunigung des Beginns nach der Verabreichung von IL-12 und einen Schutz mit IL-4 oder IL- 10 zeigen. Siehe z. B. Trembleau et al., J. Exp. Med. 181, 817–821 (1995); Rapaport et al., J. Exp. Med. 178, 87–89 (1993); Rabinovitch et al., Transplantation 60, 368–374 (1995). Many et al., siehe oben, legt nahe, dass bei Thyreoiditis derselbe Mechanismus eine Rolle spielt. Daher eignet sich der NOD-Stamm als Modell für die folgenden Untersuchungen.
Zwei Monate alte weibliche NOD-Mäuse (Haplotyp H-2g) sowie zwei Monate alte weibliche FVB-Mäuse (Haplotyp H-2q) als Kontrolle wurden verwendet. Die FVB-Mäuse können mit Iod behandelt werden, um transiente Thyreoiditis zu entwickeln, während die NOD-Mäuse eine persistente Form der Erkrankung ausbilden. Auch die Intensität der CD4⁺-T-Zellen-Infiltration in den betroffenen Organen ist unterschiedlich (siehe unten).
Durch das Verabreichen von Iod-armer Nahrung (0,1 μg Iod pro Tag), ergänzt durch 0,25% Propylthiouracil für 10 Tage sowie anschließendem alleinigen Verabreichen der Iod-armen Nahrung für weitere 2 Tage, wurde bei den Mäusen ein Kropf hervorgerufen. Sie erhielten dann durch intraperitoneale Injektion für 4 Tage hohe Dosen an Iod (10 μg/Tag). Fünf Mäuse von jedem Stamm erhielten zudem für 6 Tage 1 μg/Tag an rekombinantem Mäuse-Interleukin-9. Mit der Verabreichung von Interleukin-9 wurde durch intraperitoneale Injektion in 0,2 ml/Vol. PBS wurde zwei Tage vor der Verabreichung der stark Iod-hältigen Nahrung begonnen. Die Kontrollmäuse erhielten lediglich PBS. Interleukin-4 („IL-4") wurde als Kontrolle bei den NOD-Mäusen verwendet.
Nach der Behandlung wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 7,5 mg Nembutal, das mit Kochsalzlösung 1/3 verdünnt war, betäubt. Blut wurde abgenommen, um durch Radioimmuntest die Thyroxin-Spiegel zu bestimmen, und anschließend wurden die Schilddrüsen entfernt. Ein Lappen jeder Drüse wurde für die morphologische und stereologische Analyse herangezogen und der andere Lappen für die immunohistochemische Analyse.
Zur Durchführung ersterer wurden die Lappen für 2 h in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 Kakodylatpuffer eingetaucht, dann für 1 h in 1% Osmiumtetroxid fixiert und in ein Harz eingebettet. 0,5 μm dicke Schnitte wurden angefertigt und mit Toluidinblau gefärbt. Die relativen Volumina der verschiedenen Drüsenkomponenten wurden mit einem Projektionsmikroskop gemessen.
Die immunohistochemische Analyse wurde durch Schnellgefrierung der Lappen in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan durchgeführt. Kyrostat-Schnitte wurden angefertigt und für die Immunperoxidase-Färbung nach Toussaint-Demylle et al., Autoimmunity 7, 51–62 (1990), mittels eines für CD4⁺-T-Zellen und eines für B-Zellen spezifischen monoklonalen Antikörpers verwendet.
Die Anzahl der Zelltypen (CD4⁺, B⁺) wurde durch Vergrößerung (250fach) in zehn zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern der Schilddrüsenschnitte ermittelt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den 1–5 und in den Tabellen 1 und 2, die unten erläutert werden, angeführt.
Diese zeigen, dass die Verabreichung einer hohen Dosis an Iodid nach kropferzeugender Behandlung eine starke nekrotische Wirkung auf die Schilddrüsenzellen hatte. Zelltrümmer sammelten sich in follikulären Lumina. Nach 4 Behandlungstagen kam es im Zuge der interstitiellen Infiltration entzündlicher Zellen zu Zellnekrose.
Nach 6 Tagen IL-9-Verabreichung, mit der zwei Tage vor der Iod-reichen Behandlung begonnen worden war, war die Histologie der Schilddrüse der FVB-Mäuse sehr ähnlich wie die durch Iod-reiche Nahrung alleine erhaltene. Es lagen Anzeichen von Zell-Nekrose und Thyreoiditis vor, und die Analyse legte nahe, dass IL-9 die interstitielle Infiltration von entzündlichen Zellen verstärkte. Das relative Volumen des Interstitiums war größer als bei den Kontrollmäusen (FVB-Mäuse), die nicht mit IL-9 behandelt worden waren. Siehe Tabelle 2.
In 1A ist ersichtlich, dass bei NOD-Mäusen mit Kropf sämtliche follikulären Lumina mit nekrotischen Trümmern gefüllt waren, und das Interstitium war umfassend von entzündlichen Zellen durchdrungen. Im Gegensatz zu den FVB-Mäusen verhinderte die Verabreichung von IL-9 bei NOD-Mäusen mit Kropf Schilddrüsen-vermittelte Thyreoiditis. 1B zeigt, dass große follikuläre Lumina wenige nekrotische Trümmer enthielten, und nur wenige entzündliche Zellen wurden im Interstitium gefunden. Tabelle 1 zeigt, dass dessen relatives Volumen nach der Behandlung mit IL-9 deutlich geringer war. Die relativen Volumina von Epithel und Kolloid nahmen im Vergleich zu Mäusen, die kein IL-9 erhielten, zu. Nach der Verabreichung von IL-9 konnte zudem eine deutliche Abnahme des Schilddrüsengewichts beobachtet werden.
Bezugnehmend auf die immunohistochemische Analyse waren die Zellen, die die Schilddrüsen der FVB-Mäuse mit Kropf, die für 4 Tage mit Iodid behandelt wurden, infiltrierten, hauptsächlich MHC-Klasse-II-positive ACPs sowie T-Zellen. Die CD4⁺-T-Helferzellen dominierten in dieser Gruppe. Die Verabreichung von IL-9 erhöhte die Anzahl der CD4⁺-Zellen und noch mehr die Anzahl der B-Zellen. Die Daten für NOD-Mäuse sind in der Tabelle 1 angeführt und die für FVB-Mäuse in Tabelle 2, die untenstehend folgt.
Im Gegensatz dazu führte die Verabreichung von Iodid an NOD-Mäuse zum Eindringen zahlreicher CD4⁺-T-Zellen und nur weniger B-Zellen. Wenn IL-9 verabreicht wurde, nahm die Anzahl der eingedrungenen CD4+-Zellen drastisch ab. Siehe 1C und 1D.
Tabelle 1
Tabelle 2
Diese Ergebnisse legten nahe, zusätzliche Experimente durchzuführen, um die minimale Behandlungslänge zu ermitteln, die zur erwünschten Wirkung führt. Im Speziellen wurden Parallelversuche durchgeführt, bei denen die ursprünglich sechs Behandlungen pro Tag auf vier oder eine einzelne Injektion reduziert wurden. Es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt, was darauf hindeutet, dass nur eine sehr kurze Behandlung notwendig ist. Siehe Tabelle 1 oben.
Die Langzeitwirkung der IL-9-Therapie wurde anhand der Analyse der Schilddrüsen der NOD-Mäuse 64 Tage nach der oben beschriebenen Behandlung mit Iod-reicher Nahrung untersucht. Die Untersuchung der Schilddrüsen zeigte ähnliche Ergebnisse wie die oben dargestellten, wobei repräsentative Daten in den 1E und 1F dargestellt sind, die mit Iod-reicher Nahrung behandelte Mäuse sowie Mäuse, die zusätzlich mit IL-9 behandelt wurden, zeigen. 1E zeigt markierte Thyreoiditis, während die in 1F veranschaulichte Biospsie eine normale Morphologie aufzeigt und beweist, dass IL-9 den Beginn von Autoimmunprozessen mehr als hinauszögerte und diese eigentlich blockierte.
Die Schlussfolgerung, dass IL-9 die zelluläre Autoimmunreaktion unterdrückt hatte, wurde durch Daten, die sich nach der Verabreichung von IL-4, das als ein wichtiger TH2-fördernder Faktor bekannt ist, ergaben, unterstützt. Wie in Tabelle 1 und in der 1G ersichtlich ist, hemmte IL-4, wenn es anhand desselben Protokolls wie IL-9 verabreicht wurde, die Iodid-vermittelte Entzündung nicht, obwohl es zu einer Erhöhung des Spiegels Schilddrüsen-infiltrierender B-Zellen, d. h. B220⁺-Zellen, kam.
Ein weiterer Beweis kam von einer Studie, in der Mäuse, die durch die Verabreichung von IL-9 während einer ersten Iod-reichen Therapie geschützt worden waren, zwei Monate später ähnlich behandelt wurden. 1H zeigt, dass kein Widerstand gegen Iodid-vermittelte Thyreoiditis detektiert wurde, was darauf hinweist, dass IL-9 keine schützende Gedächtnisreaktion unterstützt. Eine weitere Analyse der Daten legt nahe, dass es zu einer gewissen B-Zellen-Reaktion kommt. Die 2A und 2B zeigen z. B. eine B-Zellen- Aktivierung. Im Speziellen veranschaulichen diese Figuren eine Analyse von entwässernden Lymphknoten von NOD-Mäusen nach einer Therapie mit Iod-reicher Nahrung allein (untersucht am vierten Tag der Behandlung) sowie mit Iod-reicher Nahrung plus IL-9 (wiederum nach vier Tagen). Die Keimzentren sind in den 2A und 2B vergrößert.
Beispiel 2
Ein weiterer Beweis für das oben erläuterte Phänomen wurde anhand eines Standardimmuntests (ELISA) für Anti-Thyreoglobulin-Antikörper erbracht. Sämtliche Messungen wurden an Tag vier der Therapie mit Iod-reicher Nahrung allein als auch der Therapie mit Iod-reicher Nahrung und IL-9 durchgeführt. Wie in 3 ersichtlich wurden die Messungen an einem Modell durchgeführt, das sechs Tage lang ein Mal pro Tag IL-9 erhalten hatte. Zwei optische Dichten sind für zwei unterschiedliche Lösungen desselben Serums für NOD-Mäuse ohne Thyreoiditis, für NOD-Mäuse, die Iodid erhielten und kein IL-9, sowie für NOD-Mäuse, denen sowohl Iodid als auch IL-9 verabreicht wurde, dargestellt (von links nach rechts in 3).
Beispiel 3
Die oben angeführten Beobachtungen legten das Miteinbeziehen von Mäusen, die für Nicht-Autoimmunerkrankungen anfällig sind, nahe. In diesen Experimenten wurden Mäuse des FVB-Stamms mit Iod-reicher Nahrung behandelt, nachdem ihnen, wie bei den NOD-Mäusen, kropferzeugende Nahrung gefüttert worden war.
Es stellte sich heraus, dass die Verabreichung von IL-9 bei diesem Stamm die histologischen Aspekte der Schilddrüse nicht veränderte und sich auch das relative Interstitium-Volumen wesentlich erhöhte sowie eine moderate Zunahme der CD4⁺-Zellen und eine starke Zunahme der B220⁺-infiltrierenden B220⁺-Zellen hervorrief. Dies ist in Tabelle II oben sowie in den 4A und 4B ersichtlich.
In Übereinstimmung damit war auch die Keimzentrenbildung in den entwässernden Lymphknoten der FVB-Mäuse, die mit IL-9 behandelt worden waren, erhöht, und die Mäuse zeigten nach vier Tagen Anti-Thyreoglobulin-Antikörper.
Diese Daten deuten an, dass IL-9 die B-Zellen-Reaktion bei allen untersuchten Tieren stimuliert.
Eine Analyse des Thyroxingehalts im Plasma zeigte, dass die Spiegel beinahe gleich waren. Mäuse, denen kein IL-9 injiziert worden war, wiesen 2,4 ± 0,8 ng/ml auf, während Mäuse, die IL-9 Injektionen erhielten, 2,2 ± 0,6 ng/ml aufwiesen.
Beispiel 4
An einem Mäusemodell für Pankreas-Insulitis wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt. Im Speziellen wurde anhand des obigen Modells das Pankreas 10 Wochen alter Mäuse nach einer 6-tägigen Verabreichung von IL-9 untersucht. Siehe nachfolgende Tabelle 3:
Eine Gruppe der NOD-Mäuse, d. h. die IL-9-Gruppe, erhielt alle drei Tage für 66 Tage IL-9 (1 μg/Injektion), jedoch kein Iodid. Die zweite Gruppe erhielt entweder nur Iodid-reiche Nahrung oder Iodid-reiche Nahrung plus IL-9. Diese NOD-Mäuse wurden an Tag 6 oder Tag 66 des Experiments getötet. Dies war zwei Monate nach dem Ende der Behandlung. Wie in 5 ersichtlich ist, lag immer noch ein wesentlich niedriger Prozentsatz an entzündeten Inseln vor. Abschließend erhielten NOD-Mäuse im Alter von 10– 18 Wochen alle drei Wochen IL-9-Injektionen. Bei diesen Mäusen war der IL-9-vermittelte Schutz höher, wobei nur 20,9% der Inseln eine Entzündung aufwiesen, was die Schutzwirkung des Medikaments aufzeigte. Ein zusätzlicher Beweis davon ist in den 6A und 6B ersichtlich, in denen die Pankreasinseln unbehandelter und behandelter NOD-Mäuse verglichen werden.
Beispiel 5
Die in obigen Experimenten verwendete FVB-Maus ist ein geeignetes Modell, um interstitielle Lungenerkrankungen wie Silikose zu untersuchen. Siehe z. B. Kumar, Am. J. Pathol. 135, 605–614 (1989); Suzuki et al., Thorax 51, 1036–1042 (1996).
Siliciumdioxid (DQ12, d50, 2,2 μm) oder Kochsalzlösung wurde direkt entweder in normale FVB-Mäuse oder einen transgenen Stamm von FVB-Mäusen, die IL-9 überexprimieren, injiziert. Die Injektion erfolgte über intratracheale Einträufelung (100 μl/Maus). Die Tiere wurden vor der Behandlung mittels 2 mg Phenobarital betäubt und ihr Nacken chirurgisch geöffnet. Siliciumdioxid wurde vor der Verwendung durch Erhitzen auf 200°C für 4 h sterilisiert. Dadurch wurde auch das Endotoxin inaktiviert.
Die Mäuse erhielten entweder 1 mg oder 5 mg Siliciumdioxid in den oben erwähnten 100 μl. Die Mäuse wurden entweder 60 Tage oder 120 Tage nach der Behandlung getötet, und eine bronchoalveoläre Spülung wurde durch Kanülieren der Trachea und Infundieren der Lungen mit 1,5 ml 0,9% NaCl sechs Mal durchgeführt. Die Kollagenablagerung wurde durch Ermitteln des Hydroxyprolin-Gehalts der rechten Lunge geschätzt. Dies wurde durch Exzision der Lunge und deren Homogenisierung und Hydrolysierung in 6 N HCl über Nacht bei 110°C gefolgt von einer HPLC-Analyse erreicht. Die linke Lunge wurde herausgeschnitten und in Bouin-Lösung für die Histopathologie fixiert. In Paraffin eingebettete Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin, Masson-Trichrom oder Toluidinblau für die Lichtmikroskopie gefärbt.
Die histologische Untersuchung zeigte, dass rasch nach der Verabreichung multiple zelluläre Knötchen auftraten, die dann mit mesenchymalen Zellen in Kollagen enthaltende Knötchen umgewandelt wurden. Siehe dazu 7A und 7B, die zudem zeigen, dass im Gegensatz dazu die TGIL-9-Mäuse („TGIL" ist eine Abkürzung für „transgenes IL-9") ausschließlich in der Nähe von Blutgefäßen Zellknötchen bildeten.
8 veranschaulicht als Beweis dafür die Hydroxyprolin-Spiegel, die zwei Monate sowie vier Monate nach der Verabreichung gemessen wurden. Wie aus den Figuren ersichtlich ist, ist die Menge an Hydroxyprolin bei den Mäusen, die IL-9 überexprimieren, bei Tag 120 deutlich geringer.
Tabelle 4 fasst diese Ergebnisse zusammen: Tabelle 4
Die bronchoalveoläre Spülung wurde untersucht, und es zeigten sich im Vergleich von mit Sliciumdioxid behandelten normalen Mäusen und TGIL-9-Mäusen keine wesentlichen Unterschiede in der Anzahl an Zellen. Die TGIL-9-Mäuse wiesen jedoch einen deutlichen Anstieg des Lymphozytenprozentsatzes, insbesondere der IgM⁺-B-Zellen, auf. Siehe die Analyse in 9. Die Spülung normaler Mäuse enthielt jedoch einen Großteil an Makrophagen und Neutrophilen. Es wurde kein Anstieg des Immunglobulinspiegels der TGIL-9-Mäuse beobachtet. Obwohl das Vorhandensein von B-Zellen nicht mit der anti-fibrotischen Wirkung von IL-9 in Zusammenhang stehen muss, steht es jedoch im Einklang mit der Erkenntnis, dass Lymphozyten in der bronchoalveolären Spülung von menschlichen Patienten ein Anzeichen für eine gute Prognose ist. Siehe Christman et al., Am. Rev. Respir. Dis. 132, 393–399 (1985).
Die vorhergehenden Daten zeigen, dass IL-9 bei geeigneten Tiermodellen bei der Behandlung und Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang mit der Schilddrüse, z. B. Thyreoiditis, und mit Diabetes wirksam war. In einem geeigneten Tiermodell wird zudem seine antifibrotische Wirkung veranschaulicht. Wie oben erwähnt worden ist, eignen sich die verwendeten Modelle (die NOD- und FVB-Mäuse) für die Untersuchung anderer Autoimmunerkrankungen, wie Thyreoiditis und Autoimmundiabetes und fibrotischer Erkrankungen wie Silikose. Ein Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Behandlung solcher Erkrankungen durch die Verabreichung wirksamer Mengen an IL-9. Der Dosierungsplan kann je nach Individuum und der Schwere des Leidens variieren. Im Allgemeinen ist jedoch eine täglich verabreichte Dosis von etwa 500 ng bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht des Individuums bevorzugt; insbesondere wird täglich eine Dosis von etwa 1 μg bis etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht. Das IL-9 kann natürlich vorkommen oder rekombinanter Herkunft sein und kann glykosyliert sein oder nicht. Das Zytokin kann über eine beliebige therapeutische Standardverabreichungsform verabreicht werden, wie z. B. intravenös, intraperitoneal, sublingual, intradermal, subkutan, oral, intratracheal, intranasal oder dergleichen. Das IL-9 kann alleine verabreicht werden oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Adjuvantien, Verdünnungsmittel, in Aerosolform etc. Zudem kann IL-9 mit einem oder mehreren therapeutisch wirksamen Materialien für die Behandlung von Leiden, für die es verwendet wird, kombiniert werden. Zahlreiche Medikamente werden für die Behandlung von Diabetes, Thyreoiditis und anderen zellvermittelten Autoimmunerkrankungen verwendet, wie z. B. IL-4. Siehe z. B. Rapoport et al., J. Exp. Med. 178, 87–99 (1993). Das IL-9 kann mit diesen in pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Sets kombiniert sein, worin das therapeutisch aktive IL-9 und das zweite Arzneimittel kombiniert sein können (wie z. B. eine Zusammensetzung) oder in Set-Form vorliegen können, wobei separate Mengen der Arzneimittel verfügbar sind, um nach Ermessen des Arztes, des Patienten etc. gemischt zu werden.
Weitere Aspekte der Erfindung sind für Fachleute offensichtlich und müssen nicht weiter erläutert werden.
Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke dienen der Beschreibung und nicht der Eingrenzung, und die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke beabsichtigt nicht, beliebige Äquivalente der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Abschnitte davon auszuschließen, wobei anzuerkennen ist, dass zahlreiche Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.

Claims

Verwendung von Interleukin-9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Konzentration an Interleukin-9 ausreicht, um die Anzahl an CD4+-Zellen in einem Individuum zu verringern, dem das Medikament verabreicht wurde.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Medikament zur Verabreichung in Verbindung mit einem spezifischen Arzneimittel zur Behandlung von zellvermittelter Autoimmunerkrankung dient.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zur Verabreichung zur Erhöhung der B-Zellen-Population in einem Individuum dient.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Immunerkrankung Thyreoiditis ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Immunerkrankung Autoimmun-Diabetes ist.
Verwendung von Interleukin-9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Bildung oder zur Beseitigung von Fibrose.
Verwendung von Interleukin-9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer interstitiellen Lungenerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die interstitielle Lungenerkrankung Silikose ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Interleukin-9 menschliches Interleukin-9 ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Interleukin-9 rekombinant erhältlich ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zur intravenösen, intraperitonealen, transdermalen, subkutanen, oral-intratrachealen, intranasalen oder sublingualen Verabreichung dient.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zu einer Verabreichung dient, die eine Interleukin-9-Konzentration von etwa 500 ng/kg bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht ergibt.