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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf die Verwendung von Interleukin-9 (IL-9) bei der Herstellung eines
Medikaments zur Behandlung pathologischer Zustände, insbesondere fibrotischer
Erkrankungen sowie Autoimmunerkrankungen, das alleine oder zusammen
mit anderen Medikamenten verabreicht wird.
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HINTERGRUND
UND STAND DER TECHNIK
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Interleukin-9 (hierin nachstehend „IL-9") ist ein Glykoprotein,
das aus Mäuse-
sowie menschlichen Zellen isoliert worden ist. Siehe z. B. US-A-5.208.218.
Dieser Verweis lehrt auch isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für den Proteinabschnitt des
Moleküls
kodieren, und wie dieser exprimiert wird.
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Verschiedene Verwendungsarten des
Moleküls,
zusätzlich
zu seinem ersten Nutzen als T-Zellen-Wachstumsfaktor, sind z. B.
in der US-A-5.164.317 (starke Vermehrung von Mastzellen), 5.246.701
und 5.132.109 (Förderung
der Erzeugung von IgG und Hemmung der Erzeugung von IgE) ersichtlich.
Beispiele für die
umfassende wissenschaftliche Literatur über das Molekül sind Van
Snick et al., J. Exp. Med. 169(1), 363–368 (1989) (cDNA für das Mäusemolekül, folglich
als P40 bezeichnet); Houssiau et al., J. Immunol. 148(10), 3147–3151 (1992)
(IL-2-Abhängigkeit
der IL-9-Expression in T-Lymphozyten); Renauld et al., Oncogene
9(5), 1327–1332
(1994) (Wirkung auf Thymuslymphome); Renauld et al., Blood 85(5),
1300–1305
(1995) (anti-apoptotischer Faktor für Thymuslymphome). Übersichtsartikel
sind z. B. in Renauld et al., Cancer Invest. 11(5), 635–640 (1993);
Renauld et al., Adv. Immunol. 54, 79–97 (1993), zu finden.
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Es gibt keine Literatur über den
Einfluss von IL-9 auf Autoimmunerkrankungen.
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Auf dem Fachgebiet ist eine große Anzahl
an Autoimmunerkrankungen bekannt, die auf verschiedene Arten klassifiziert
sind. Eine Art der Klassifikation erfolgt anhand des Aspekts des
Immunsystems, der am engsten mit der Erkrankung verbunden ist. Beispielsweise
sind bei der humoralen Reaktion in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen
B-Zellen involviert. Antikörper
gegen Selbstmoleküle,
wie Acetylcholin-Rezeptor (Myasthenia gravis) oder TSH-Rezeptor
(Basedow-Krankheit), werden gebildet. Bei Autoimmunerkrankungen, die
eine Zellreaktion beinhalten, reagieren T-Zellen, Makrophagen und
NK-Zellen mit Selbstmolekülen.
Beispiele für
solche Erkrankungen sind Insulinabhängiger Diabetes und Thyreoiditis.
Diese Krankheitsfamilie resultiert u. a. aus einer Verschiebung
des Th1/Th2-Gleichgewichts.
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Ein Problem bei der Untersuchung
von Autoimmunerkrankungen ist das Fehlen geeigneter Tiermodelle.
Ohne ein geeignetes System, um eine bestimmte Erkrankung zu untersuchen,
können
keine Schlüsse
auf die potentielle Wirksamkeit eines bestimmten Medikaments in
einem therapeutischen Kontext gezogen werden.
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Es gibt jedoch ein geeignetes Tiermodell
für zellvermittelte
Erkrankungen, das in der folgenden Offenbarung verwendet wurde.
Anhand des spezifischen Falls induzierter Thyreoiditis in einem
Mausmodell wurde gezeigt, dass IL-9 in Th1-assoziierten Autoimmunerkrankungen
therapeutisch wirksam ist. Dies wird in der folgenden detaillierten
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
dargestellt.
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Das in der Offenbarung verwendete
Mausmodell kann auch zur Untersuchung von Erkrankungen wie Sialadenitis,
autoimmuner hämolytischer
Anämie
und anderen Erkrankungen verwendet werden. Weiters ist ein Mausmodell
verfügbar,
das für
die Untersuchung von Pathologien, die Fibrose einschließen, wie
z. B. interstitielle Lungenerkrankung, eingesetzt werden kann. Charakteristisch
für diese
mit Fibrose in Zusammenhang stehenden Erkrankungen ist eine Entzündung im
betroffenen Gewebe oder Organ, die zu Narbenbildung und Entstellung
des Gewebes führt.
Beispielhaft für
diese Gruppe von Pathologien sind interstitielle Lungenerkrankungen,
wie Silikose, Asbestose, durch Siliziumdioxidstaub hervorgerufene
Lungenerkrankung („white lung
disease"), Staublungenerkrankung,
Shaver-Krankheit etc. Diese Erkrankungen sind als Pneumokoniosen (oder
anthrakotische Tuberkulose) bekannt und schließen eine Entzündung und
Lungenfibrose ein, die z. B. durch Inhalation feiner Mineralteilchen
verursacht werden. Andere fibrotische Leiden umfassen sämtliche
Formen von Sklerose, mit Fibrose in Zusammenhang stehendem Rheumatismus,
wie z. B. primärchronische
Polyarthritis, und Kollagenverbundene Fibrose, wie z. B. Leiden,
die Keloide einschließen,
Narbenbildung, Nierenerkrankungen, die verwandte Zustände umfassen,
usw.
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Die Mausmodelle für diese Leiden wurden, wie
unten ersichtlich wird, dazu verwendet, die Wirksamkeit von IL-9
in deren Behandlung aufzuzeigen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1A zeigt
die Wirkung hoher Dosen an Iodid nach der Kropfinduktion bei NOD-Mäusen.
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1B zeigt
die Wirkung von IL-9 auf mit Iodid behandelte NOD-Mäuse.
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1C veranschaulicht
die Färbung
für CD4+-T-Zellen in den Schilddrüsen von
NOD-Mäusen mit Kropf
nach der Behandlung mit einer hohen Iodid-Dosis, jedoch ohne IL-9.
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1D kann
mit 1C verglichen werden,
zeigt jedoch die Ergebnisse mit IL-9.
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1E und 1F zeigen das Ergebnis von
Versuchen, die eine langfristige IL-9-Therapie untersuchten.
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1G zeigt
parallel dazu die Ergebnisse bei der Verwendung von IL-4.
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1H zeigt
die Thyreoiditis-Induktion bei Tieren, die vorher durch die Verabreichung
von IL-9 vor Thyreoiditis bewahrt wurden.
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Die 2A und 2B veranschaulichen die Ergebnisse
einer Lymphknotenbiospie, die zur Messung der B-Zellen-Avtivierung
durch die Immunfärbung
von B-Zellen dient.
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3 zeigt
die Ergebnisse von ELISA-Analysen zur Bestimmung von Anti-Thyreoglobulin-Antikörpern in
den Versuchstieren. Von links nach rechts gelesen werden in dieser
Figur die Ergebnisse von NOD-Mäusen ohne
Thyreoiditis, NOD-Mäusen,
die lediglich mit Iodid behandelt wurden, und Mäusen, die Iodid und IL-9 erhielten,
gezeigt. Die zwei optischen Dichten stammen von zwei Verdünnungen
des getesteten Serums.
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Die 4A und 4B veranschaulichen die Immunfärbungsdaten
für B-Zellen
in der Schilddrüse
von FVB-Mäusen. 4A zeigt die Immunfärbung ohne
IL-9 und 4B jene mit
IL-9.
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5 veranschaulicht
die Ergebnisse einer Untersuchung von Langerhans-Inseln nach der
Verabreichung von IL-9.
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Die 6A und 6B zeigen die Wirkung von
IL-9 auf Pankreas-Insulitis bei NOD-Mäusen, wobei 6A die Inseln einer 10 Wochen alten NOD-Maus
zeigt, die eine stark Iodid-hältige
Ernährung
und kein IL-9 erhielt, und 6B die
Inseln einer 10 Wochen alten NOD-Maus zeigt, die eine stark Iodid-hältige Ernährung sowie IL-9
erhielt.
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Die 7A und 7B zeigen die Histologie
der Lungen normaler sowie IL-9-transgener Mäuse, denen intratracheal Siliciumdioxid-Teilchen
verabreicht wurden.
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8 zeigt
die Hydroxyprolin-Spiegel in den Lungen normaler Mäuse und
transgener Mäuse,
die vermehrt IL-9 bilden und den Teilchen ausgesetzt worden sind.
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9 zeigt
die FACS-Analyse von Zellen, die in der bronchoalveolären Spülung normaler
Mäuse oder IL-9-Mäuse vorhanden
sind, die mit Siliciumdioxid behandelt worden sind oder nicht.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Beispiel 1
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Zwei Stämme von Mäusen, d. h. der FVB-Stamm und
der NOD-Stamm, wurden zu den folgenden Versuchen herangezogen. Der
NOD-Mäusestamm
wird als geeignetes Modell für
die Untersuchung menschlicher Erkrankungen erachtet. Der Grund dafür liegt
darin, dass der Stamm eine nicht fettleibige, diabetische Maus (non-obese
diabetic, daher „NOD") verkörpert, die
als Ergebnis von Autoimmunerkrankungen wie Diabetes spontan Pankreas-
sowie Schilddrüsenläsionen entwickelt.
Der Mäusestamm
ist ebenfalls als Modell für
die Pathogenese und Immuntherapie von Autoimmunerkrankungen wie
zellvermittelte Autoimmunerkrankungen nützlich. Siehe z. B. Many et
al., J. Endroncrinol. 147, 311–320
(1995); Male et al., Advanced Immunology Third Edition, 12–15 (1996);
Kikutani et al., Adv. Immunol. 51, 285–322 (1992). Im Speziellen
wird, mit Verweis auf Autoimmundiabetes, die mononukleare Zellinfiltration
der Pankreas-Inseln schon im Alter von 4–6 Wochen detektiert, gefolgt
von der Zerstörung
der Insulin-produzierenden β-Zellen
der Pankreasinsel.
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Th1-Zellen stehen mit diesem Entzündungsprozess
der Langerhans-Inseln in Zusammenhang. Dies führt wiederum nach 30 Wochen
bei 70–80%
der Weibchen sowie 20 der Männchen
zu Diabetes. Dies wird von Studien unterstützt, die eine Beschleunigung
des Beginns nach der Verabreichung von IL-12 und einen Schutz mit
IL-4 oder IL- 10
zeigen. Siehe z. B. Trembleau et al., J. Exp. Med. 181, 817–821 (1995);
Rapaport et al., J. Exp. Med. 178, 87–89 (1993); Rabinovitch et
al., Transplantation 60, 368–374
(1995). Many et al., siehe oben, legt nahe, dass bei Thyreoiditis
derselbe Mechanismus eine Rolle spielt. Daher eignet sich der NOD-Stamm
als Modell für
die folgenden Untersuchungen.
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Zwei Monate alte weibliche NOD-Mäuse (Haplotyp
H-2g) sowie zwei Monate alte weibliche FVB-Mäuse (Haplotyp H-2q) als Kontrolle
wurden verwendet. Die FVB-Mäuse
können
mit Iod behandelt werden, um transiente Thyreoiditis zu entwickeln,
während
die NOD-Mäuse
eine persistente Form der Erkrankung ausbilden. Auch die Intensität der CD4+-T-Zellen-Infiltration in den betroffenen
Organen ist unterschiedlich (siehe unten).
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Durch das Verabreichen von Iod-armer
Nahrung (0,1 μg
Iod pro Tag), ergänzt
durch 0,25% Propylthiouracil für
10 Tage sowie anschließendem
alleinigen Verabreichen der Iod-armen Nahrung für weitere 2 Tage, wurde bei
den Mäusen
ein Kropf hervorgerufen. Sie erhielten dann durch intraperitoneale
Injektion für
4 Tage hohe Dosen an Iod (10 μg/Tag).
Fünf Mäuse von
jedem Stamm erhielten zudem für
6 Tage 1 μg/Tag
an rekombinantem Mäuse-Interleukin-9.
Mit der Verabreichung von Interleukin-9 wurde durch intraperitoneale
Injektion in 0,2 ml/Vol. PBS wurde zwei Tage vor der Verabreichung
der stark Iod-hältigen
Nahrung begonnen. Die Kontrollmäuse
erhielten lediglich PBS. Interleukin-4 („IL-4") wurde als Kontrolle bei den NOD-Mäusen verwendet.
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Nach der Behandlung wurden die Mäuse mit
einer intraperitonealen Injektion von 7,5 mg Nembutal, das mit Kochsalzlösung 1/3
verdünnt
war, betäubt.
Blut wurde abgenommen, um durch Radioimmuntest die Thyroxin-Spiegel
zu bestimmen, und anschließend
wurden die Schilddrüsen
entfernt. Ein Lappen jeder Drüse wurde
für die
morphologische und stereologische Analyse herangezogen und der andere
Lappen für
die immunohistochemische Analyse.
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Zur Durchführung ersterer wurden die Lappen
für 2 h
in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 Kakodylatpuffer eingetaucht, dann für 1 h in
1% Osmiumtetroxid fixiert und in ein Harz eingebettet. 0,5 μm dicke Schnitte
wurden angefertigt und mit Toluidinblau gefärbt. Die relativen Volumina
der verschiedenen Drüsenkomponenten
wurden mit einem Projektionsmikroskop gemessen.
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Die immunohistochemische Analyse
wurde durch Schnellgefrierung der Lappen in mit flüssigem Stickstoff
gekühltem
Isopentan durchgeführt.
Kyrostat-Schnitte wurden angefertigt und für die Immunperoxidase-Färbung nach
Toussaint-Demylle et al., Autoimmunity 7, 51–62 (1990), mittels eines für CD4+-T-Zellen und eines für B-Zellen spezifischen monoklonalen
Antikörpers
verwendet.
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Die Anzahl der Zelltypen (CD4+, B+) wurde durch
Vergrößerung (250fach)
in zehn zufällig
ausgewählten
mikroskopischen Feldern der Schilddrüsenschnitte ermittelt.
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Die Ergebnisse dieser Untersuchungen
sind in den 1–5 und in den Tabellen 1 und
2, die unten erläutert
werden, angeführt.
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Diese zeigen, dass die Verabreichung
einer hohen Dosis an Iodid nach kropferzeugender Behandlung eine
starke nekrotische Wirkung auf die Schilddrüsenzellen hatte. Zelltrümmer sammelten
sich in follikulären Lumina.
Nach 4 Behandlungstagen kam es im Zuge der interstitiellen Infiltration
entzündlicher
Zellen zu Zellnekrose.
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Nach 6 Tagen IL-9-Verabreichung,
mit der zwei Tage vor der Iod-reichen Behandlung begonnen worden
war, war die Histologie der Schilddrüse der FVB-Mäuse sehr ähnlich wie
die durch Iod-reiche Nahrung alleine erhaltene. Es lagen Anzeichen
von Zell-Nekrose und Thyreoiditis vor, und die Analyse legte nahe,
dass IL-9 die interstitielle Infiltration von entzündlichen
Zellen verstärkte.
Das relative Volumen des Interstitiums war größer als bei den Kontrollmäusen (FVB-Mäuse), die
nicht mit IL-9 behandelt worden waren. Siehe Tabelle 2.
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In 1A ist
ersichtlich, dass bei NOD-Mäusen
mit Kropf sämtliche
follikulären
Lumina mit nekrotischen Trümmern
gefüllt
waren, und das Interstitium war umfassend von entzündlichen
Zellen durchdrungen. Im Gegensatz zu den FVB-Mäusen verhinderte die Verabreichung
von IL-9 bei NOD-Mäusen
mit Kropf Schilddrüsen-vermittelte
Thyreoiditis. 1B zeigt,
dass große
follikuläre
Lumina wenige nekrotische Trümmer
enthielten, und nur wenige entzündliche
Zellen wurden im Interstitium gefunden. Tabelle 1 zeigt, dass dessen
relatives Volumen nach der Behandlung mit IL-9 deutlich geringer
war. Die relativen Volumina von Epithel und Kolloid nahmen im Vergleich
zu Mäusen,
die kein IL-9 erhielten, zu. Nach der Verabreichung von IL-9 konnte zudem
eine deutliche Abnahme des Schilddrüsengewichts beobachtet werden.
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Bezugnehmend auf die immunohistochemische
Analyse waren die Zellen, die die Schilddrüsen der FVB-Mäuse mit
Kropf, die für
4 Tage mit Iodid behandelt wurden, infiltrierten, hauptsächlich MHC-Klasse-II-positive
ACPs sowie T-Zellen. Die CD4+-T-Helferzellen
dominierten in dieser Gruppe. Die Verabreichung von IL-9 erhöhte die
Anzahl der CD4+-Zellen und noch mehr die
Anzahl der B-Zellen. Die Daten für
NOD-Mäuse
sind in der Tabelle 1 angeführt
und die für
FVB-Mäuse
in Tabelle 2, die untenstehend folgt.
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Im Gegensatz dazu führte die
Verabreichung von Iodid an NOD-Mäuse
zum Eindringen zahlreicher CD4+-T-Zellen
und nur weniger B-Zellen. Wenn IL-9 verabreicht wurde, nahm die
Anzahl der eingedrungenen CD4+-Zellen drastisch ab. Siehe 1C und 1D.
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Diese Ergebnisse legten nahe, zusätzliche
Experimente durchzuführen,
um die minimale Behandlungslänge
zu ermitteln, die zur erwünschten
Wirkung führt.
Im Speziellen wurden Parallelversuche durchgeführt, bei denen die ursprünglich sechs
Behandlungen pro Tag auf vier oder eine einzelne Injektion reduziert wurden.
Es wurden ähnliche
Ergebnisse erzielt, was darauf hindeutet, dass nur eine sehr kurze
Behandlung notwendig ist. Siehe Tabelle 1 oben.
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Die Langzeitwirkung der IL-9-Therapie
wurde anhand der Analyse der Schilddrüsen der NOD-Mäuse 64 Tage
nach der oben beschriebenen Behandlung mit Iod-reicher Nahrung untersucht.
Die Untersuchung der Schilddrüsen
zeigte ähnliche
Ergebnisse wie die oben dargestellten, wobei repräsentative
Daten in den 1E und 1F dargestellt sind, die
mit Iod-reicher Nahrung behandelte Mäuse sowie Mäuse, die zusätzlich mit
IL-9 behandelt wurden, zeigen. 1E zeigt
markierte Thyreoiditis, während
die in 1F veranschaulichte
Biospsie eine normale Morphologie aufzeigt und beweist, dass IL-9
den Beginn von Autoimmunprozessen mehr als hinauszögerte und
diese eigentlich blockierte.
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Die Schlussfolgerung, dass IL-9 die
zelluläre
Autoimmunreaktion unterdrückt
hatte, wurde durch Daten, die sich nach der Verabreichung von IL-4,
das als ein wichtiger TH2-fördernder
Faktor bekannt ist, ergaben, unterstützt. Wie in Tabelle 1 und in
der 1G ersichtlich ist,
hemmte IL-4, wenn es anhand desselben Protokolls wie IL-9 verabreicht
wurde, die Iodid-vermittelte Entzündung nicht, obwohl es zu einer
Erhöhung
des Spiegels Schilddrüsen-infiltrierender
B-Zellen, d. h. B220+-Zellen, kam.
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Ein weiterer Beweis kam von einer
Studie, in der Mäuse,
die durch die Verabreichung von IL-9 während einer ersten Iod-reichen
Therapie geschützt
worden waren, zwei Monate später ähnlich behandelt
wurden. 1H zeigt, dass
kein Widerstand gegen Iodid-vermittelte
Thyreoiditis detektiert wurde, was darauf hinweist, dass IL-9 keine
schützende
Gedächtnisreaktion
unterstützt.
Eine weitere Analyse der Daten legt nahe, dass es zu einer gewissen
B-Zellen-Reaktion kommt. Die 2A und 2B zeigen z. B. eine B-Zellen- Aktivierung. Im Speziellen
veranschaulichen diese Figuren eine Analyse von entwässernden
Lymphknoten von NOD-Mäusen
nach einer Therapie mit Iod-reicher Nahrung allein (untersucht am
vierten Tag der Behandlung) sowie mit Iod-reicher Nahrung plus IL-9
(wiederum nach vier Tagen). Die Keimzentren sind in den 2A und 2B vergrößert.
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Beispiel 2
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Ein weiterer Beweis für das oben
erläuterte
Phänomen
wurde anhand eines Standardimmuntests (ELISA) für Anti-Thyreoglobulin-Antikörper erbracht.
Sämtliche
Messungen wurden an Tag vier der Therapie mit Iod-reicher Nahrung
allein als auch der Therapie mit Iod-reicher Nahrung und IL-9 durchgeführt. Wie
in 3 ersichtlich wurden
die Messungen an einem Modell durchgeführt, das sechs Tage lang ein
Mal pro Tag IL-9 erhalten hatte. Zwei optische Dichten sind für zwei unterschiedliche
Lösungen
desselben Serums für NOD-Mäuse ohne
Thyreoiditis, für
NOD-Mäuse,
die Iodid erhielten und kein IL-9, sowie für NOD-Mäuse, denen sowohl Iodid als
auch IL-9 verabreicht wurde, dargestellt (von links nach rechts
in 3).
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Beispiel 3
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Die oben angeführten Beobachtungen legten
das Miteinbeziehen von Mäusen,
die für
Nicht-Autoimmunerkrankungen anfällig
sind, nahe. In diesen Experimenten wurden Mäuse des FVB-Stamms mit Iod-reicher
Nahrung behandelt, nachdem ihnen, wie bei den NOD-Mäusen, kropferzeugende
Nahrung gefüttert
worden war.
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Es stellte sich heraus, dass die
Verabreichung von IL-9 bei diesem Stamm die histologischen Aspekte der
Schilddrüse
nicht veränderte
und sich auch das relative Interstitium-Volumen wesentlich erhöhte sowie eine
moderate Zunahme der CD4+-Zellen und eine starke
Zunahme der B220+-infiltrierenden B220+-Zellen hervorrief. Dies ist in Tabelle
II oben sowie in den 4A und 4B ersichtlich.
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In Übereinstimmung damit war auch
die Keimzentrenbildung in den entwässernden Lymphknoten der FVB-Mäuse, die
mit IL-9 behandelt worden waren, erhöht, und die Mäuse zeigten
nach vier Tagen Anti-Thyreoglobulin-Antikörper.
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Diese Daten deuten an, dass IL-9
die B-Zellen-Reaktion bei allen untersuchten Tieren stimuliert.
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Eine Analyse des Thyroxingehalts
im Plasma zeigte, dass die Spiegel beinahe gleich waren. Mäuse, denen
kein IL-9 injiziert worden war, wiesen 2,4 ± 0,8 ng/ml auf, während Mäuse, die
IL-9 Injektionen erhielten, 2,2 ± 0,6 ng/ml aufwiesen.
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Beispiel 4
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An einem Mäusemodell für Pankreas-Insulitis wurde
eine weitere Untersuchung durchgeführt. Im Speziellen wurde anhand
des obigen Modells das Pankreas 10 Wochen alter Mäuse nach
einer 6-tägigen
Verabreichung von IL-9 untersucht. Siehe nachfolgende Tabelle 3:
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Eine Gruppe der NOD-Mäuse, d.
h. die IL-9-Gruppe, erhielt alle drei Tage für 66 Tage IL-9 (1 μg/Injektion),
jedoch kein Iodid. Die zweite Gruppe erhielt entweder nur Iodid-reiche Nahrung oder
Iodid-reiche Nahrung plus IL-9. Diese NOD-Mäuse wurden an Tag 6 oder Tag
66 des Experiments getötet.
Dies war zwei Monate nach dem Ende der Behandlung. Wie in 5 ersichtlich ist, lag immer
noch ein wesentlich niedriger Prozentsatz an entzündeten Inseln
vor. Abschließend
erhielten NOD-Mäuse
im Alter von 10– 18
Wochen alle drei Wochen IL-9-Injektionen. Bei diesen Mäusen war
der IL-9-vermittelte Schutz höher,
wobei nur 20,9% der Inseln eine Entzündung aufwiesen, was die Schutzwirkung
des Medikaments aufzeigte. Ein zusätzlicher Beweis davon ist in
den 6A und 6B ersichtlich, in denen
die Pankreasinseln unbehandelter und behandelter NOD-Mäuse verglichen
werden.
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Beispiel 5
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Die in obigen Experimenten verwendete
FVB-Maus ist ein geeignetes Modell, um interstitielle Lungenerkrankungen
wie Silikose zu untersuchen. Siehe z. B. Kumar, Am. J. Pathol. 135,
605–614
(1989); Suzuki et al., Thorax 51, 1036–1042 (1996).
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Siliciumdioxid (DQ12, d50, 2,2 μm) oder Kochsalzlösung wurde
direkt entweder in normale FVB-Mäuse
oder einen transgenen Stamm von FVB-Mäusen, die IL-9 überexprimieren,
injiziert. Die Injektion erfolgte über intratracheale Einträufelung
(100 μl/Maus).
Die Tiere wurden vor der Behandlung mittels 2 mg Phenobarital betäubt und
ihr Nacken chirurgisch geöffnet.
Siliciumdioxid wurde vor der Verwendung durch Erhitzen auf 200°C für 4 h sterilisiert.
Dadurch wurde auch das Endotoxin inaktiviert.
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Die Mäuse erhielten entweder 1 mg
oder 5 mg Siliciumdioxid in den oben erwähnten 100 μl. Die Mäuse wurden entweder 60 Tage
oder 120 Tage nach der Behandlung getötet, und eine bronchoalveoläre Spülung wurde
durch Kanülieren
der Trachea und Infundieren der Lungen mit 1,5 ml 0,9% NaCl sechs
Mal durchgeführt.
Die Kollagenablagerung wurde durch Ermitteln des Hydroxyprolin-Gehalts
der rechten Lunge geschätzt. Dies
wurde durch Exzision der Lunge und deren Homogenisierung und Hydrolysierung
in 6 N HCl über
Nacht bei 110°C
gefolgt von einer HPLC-Analyse erreicht. Die linke Lunge wurde herausgeschnitten
und in Bouin-Lösung
für die
Histopathologie fixiert. In Paraffin eingebettete Schnitte wurden
mit Hämatoxylin
und Eosin, Masson-Trichrom oder Toluidinblau für die Lichtmikroskopie gefärbt.
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Die histologische Untersuchung zeigte,
dass rasch nach der Verabreichung multiple zelluläre Knötchen auftraten,
die dann mit mesenchymalen Zellen in Kollagen enthaltende Knötchen umgewandelt
wurden. Siehe dazu 7A und 7B, die zudem zeigen, dass
im Gegensatz dazu die TGIL-9-Mäuse
(„TGIL" ist eine Abkürzung für „transgenes
IL-9") ausschließlich in
der Nähe
von Blutgefäßen Zellknötchen bildeten.
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8 veranschaulicht
als Beweis dafür
die Hydroxyprolin-Spiegel, die zwei Monate sowie vier Monate nach
der Verabreichung gemessen wurden. Wie aus den Figuren ersichtlich
ist, ist die Menge an Hydroxyprolin bei den Mäusen, die IL-9 überexprimieren,
bei Tag 120 deutlich geringer.
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Tabelle
4 fasst diese Ergebnisse zusammen:
Tabelle 4
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Die bronchoalveoläre Spülung wurde untersucht, und
es zeigten sich im Vergleich von mit Sliciumdioxid behandelten normalen
Mäusen
und TGIL-9-Mäusen
keine wesentlichen Unterschiede in der Anzahl an Zellen. Die TGIL-9-Mäuse wiesen
jedoch einen deutlichen Anstieg des Lymphozytenprozentsatzes, insbesondere der
IgM+-B-Zellen, auf. Siehe die Analyse in 9. Die Spülung normaler
Mäuse enthielt
jedoch einen Großteil an
Makrophagen und Neutrophilen. Es wurde kein Anstieg des Immunglobulinspiegels
der TGIL-9-Mäuse
beobachtet. Obwohl das Vorhandensein von B-Zellen nicht mit der
anti-fibrotischen Wirkung von IL-9 in Zusammenhang stehen muss,
steht es jedoch im Einklang mit der Erkenntnis, dass Lymphozyten
in der bronchoalveolären
Spülung
von menschlichen Patienten ein Anzeichen für eine gute Prognose ist. Siehe
Christman et al., Am. Rev. Respir. Dis. 132, 393–399 (1985).
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Die vorhergehenden Daten zeigen,
dass IL-9 bei geeigneten Tiermodellen bei der Behandlung und Prophylaxe
von Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang mit der Schilddrüse, z. B.
Thyreoiditis, und mit Diabetes wirksam war. In einem geeigneten
Tiermodell wird zudem seine antifibrotische Wirkung veranschaulicht.
Wie oben erwähnt
worden ist, eignen sich die verwendeten Modelle (die NOD- und FVB-Mäuse) für die Untersuchung
anderer Autoimmunerkrankungen, wie Thyreoiditis und Autoimmundiabetes
und fibrotischer Erkrankungen wie Silikose. Ein Aspekt der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Behandlung solcher Erkrankungen durch
die Verabreichung wirksamer Mengen an IL-9. Der Dosierungsplan kann
je nach Individuum und der Schwere des Leidens variieren. Im Allgemeinen
ist jedoch eine täglich
verabreichte Dosis von etwa 500 ng bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht des Individuums
bevorzugt; insbesondere wird täglich
eine Dosis von etwa 1 μg bis
etwa 10 μg/kg
Körpergewicht
verabreicht. Das IL-9 kann natürlich
vorkommen oder rekombinanter Herkunft sein und kann glykosyliert
sein oder nicht. Das Zytokin kann über eine beliebige therapeutische
Standardverabreichungsform verabreicht werden, wie z. B. intravenös, intraperitoneal,
sublingual, intradermal, subkutan, oral, intratracheal, intranasal
oder dergleichen. Das IL-9 kann alleine verabreicht werden oder
in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Adjuvantien, Verdünnungsmittel,
in Aerosolform etc. Zudem kann IL-9 mit einem oder mehreren therapeutisch
wirksamen Materialien für
die Behandlung von Leiden, für
die es verwendet wird, kombiniert werden. Zahlreiche Medikamente
werden für
die Behandlung von Diabetes, Thyreoiditis und anderen zellvermittelten
Autoimmunerkrankungen verwendet, wie z. B. IL-4. Siehe z. B. Rapoport et
al., J. Exp. Med. 178, 87–99
(1993). Das IL-9 kann mit diesen in pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder
Sets kombiniert sein, worin das therapeutisch aktive IL-9 und das
zweite Arzneimittel kombiniert sein können (wie z. B. eine Zusammensetzung)
oder in Set-Form vorliegen können,
wobei separate Mengen der Arzneimittel verfügbar sind, um nach Ermessen
des Arztes, des Patienten etc. gemischt zu werden.
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Weitere Aspekte der Erfindung sind
für Fachleute
offensichtlich und müssen
nicht weiter erläutert
werden.
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Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke dienen
der Beschreibung und nicht der Eingrenzung, und die Verwendung solcher
Begriffe und Ausdrücke
beabsichtigt nicht, beliebige Äquivalente
der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Abschnitte davon
auszuschließen,
wobei anzuerkennen ist, dass zahlreiche Modifikationen innerhalb
des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.
