CN1107521C - 降低呼吸道病理性粘液样内含物的粘滞度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改善气流不畅的患者的正常呼吸道气流和存在的病理性气管内容物，尤其是粘液内容物引起的阻塞的方法。肌动蛋白结合蛋白被给予病理呼吸状态的患者呼吸道，该状态包括存在内容物。该肌动蛋白结合蛋白与内容物中肌动蛋白聚合物结合并降低粘度。该肌动蛋白也可防止肌动蛋白与与内服或外服DNA酶结合，从而增叫了内容物中DNA聚合物降解。

Description

降低呼吸道病理性粘液样内含物的粘滞度的方法
本发明涉及呼吸道疾病的治疗，旨在治疗中对呼吸道粘液里的肌动蛋白起解聚作用和促进粘液中的DNA降解，尤其对阻塞呼吸道的粘液物溶解清除。本发明在方法上通过把肌动蛋白结合蛋白加入呼吸道而降低粘液的粘滞度，也通过阻断肌动蛋白与DNA酶I的结合或降低粘液中肌动蛋白的含量而强化呼吸道DNA酶I的溶解作用活性。该方法包括对有治疗必要的病人需给与足量的活性肌动蛋白结合物或其片段或其衍生物。气道阻塞
由炎症渗出引起的气道阻塞是发病和致死的主要原因，粘液的淤积阻塞是慢性支气管炎、支气管哮喘、大叶性肺炎及囊状纤维变性等疾病的一个特征，并且与肺实质的破坏有关。粘液还能促进急慢性鼻窦炎甚至感冒的发生。
呼吸系统的粘液阻塞原因很多，其中之一是在感染或刺激条件下产生的炎症介质引起粘液合成并释放增加。囊状纤维变性中粘液的粘滞度增加，可能由于异常的上皮离子转运影响了形成粘液的离子多聚物的电荷或水合作用。在囊状纤维变性中厚厚的粘液阻碍了纤毛摆动对细菌的排除，并且有利于细菌的生长，尤其是绿脓杆菌。这些细菌或诸如吸烟等其他刺激，产生化学趋化物使循环中白细胞进入气道。当白细胞吞噬细菌或其他刺激物后，细胞死亡裂解或碎片，影响器官内容物的粘滞度。
对病理状态下的器官内粘液样内容物的研究主要集中于DNA，因为DNA是由肺中原始分离出来的。也研究粘液中的粘液多糖成分及二硫化物键合的作用(Roberts，G.P.，Arch.Biochem，Biophys.173：528-537 1976；Robert，G.P.，Eur.J.Biochem.50：265-280 1974；Charman，J.，et al.，Brit.J.Dis.Chest 68：215，1974；Bhaskar，K.R.，et al.，Exp.Lung Res.10：401-422 1986；Lethem，M.I.，et al.，Eur.Respir.J.3：19-23 1990)。脓性粘液含有10-13mg/ml的DNA，一种离子聚合物被广泛认为可以影响气道流体的流动特性。牛胰DNA酶I，这种酶可溶解DNA，多年前就已被作为一种粘液溶解剂。但一直未应用于临床，这是由于它的抗原性或污染后的副作用所致。于是人DNA酶I的CDNA被克隆和表达，以溶剂为目的的重组人DNA酶I付诸了试验，在体外它表现出能降低囊性纤维变性中的粘液的粘滞度。(Shak，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9188-9192，1990)。最近在美国，人类DNA酶I已允许用于临床治疗囊性纤维变性的患者(年龄大于五岁)。胞外肌动蛋白
肌动蛋白是有核动物细胞内含量最为丰富的蛋白质，在很多有核细胞中它占蛋白质含量的10-20％，在肌细胞中占30％。每一个肌动蛋白结合一个ATP或ADP分子，并且在ATP水化为ADP时自身集合成长丝状。
动物组织损伤时可导致肌动蛋白释放到胞外区域，尽管接近一半的非肌细胞的肌动蛋白属于F-肌动蛋白(双螺旋—棒状—丝状肌动蛋白，它是由G-肌动蛋白的单体集合而成)。胞外液体的离子条件有利于肌动蛋白的聚合，因此事实上所有从死细胞释放的肌动蛋白只要在足够浓度(大于每毫升几个微克)的条件下都会聚合丝状(Lind，S.E.，et al，Am Rev Respir Dis.138：429-434，1990)。肌动蛋白集合成棒一样的长丝状物能相对地具有抵制蛋白水解酶的降解作用。在没有短丝状蛋白的纯化溶液中肌动蛋白丝很容易达到几个微米的长度。
由于细胞中有大量的肌动蛋白，从死细胞中释放的肌动蛋白是可以通过增强胞外流体粘滞度，象粘蛋白样捕捉细胞或其它方式对微环境产生重大影响。但它的毒性作用至今还没有确定。大量注入胞外游离肌动蛋白对动物组织是有毒性作用的(Harper，K.D.，et al，Clin Res 36：625 A 1988；Haddad，J.G.，et al.，ProcNatl Acad Sci USA 87：1381-1395，1990)。正如下文所述，从损伤细胞释放出来的肌动蛋白若与肌动蛋白结合蛋白结合，这种肌动蛋白将保留为单体或寡聚体。肌动蛋白结合蛋白
有很多与肌动蛋白相关的天然蛋白质，可参阅一篇关于肌动蛋白结合蛋白的综述，见Stossel，T.P.，et al.，Am Res Cell Biol.1：353-402(1985)；Pollar，T.D.et al.，Ann.Rev.Biochem，55：987-1035(1986)。然而，其中有两种蛋白质：凝胶溶素(gelsolin)和DBP(维生素D结合蛋白)，被认为是主要的胞外肌动蛋白结合蛋白(Janmey，P.A.，et al.，Blood 70：529-530，1987)。
血浆凝胶溶素(有时称为短杆菌素)和DBP(也称为Gc球蛋白)是血浆中两种亲和力的肌动蛋白结合蛋白。高亲和力的肌动蛋白结合蛋白以小于10-8Kd的分子与肌动蛋白结合。血清中凝胶溶素和DBP与肌动蛋白结合并有使之解聚合的活性。DBP易于结合单体肌动蛋白，而凝胶溶素易于结合肌动蛋白丝。
凝胶溶素是一种从哺乳动物细胞浆和胞外液体中得到的多功能的肌动蛋白结合蛋白。血浆凝胶溶素不同于胞内凝胶溶素，因其分子的氨基末端多了25个氨基酸，而这两种凝胶溶素是一个基因的产物。血浆凝胶溶素有三个肌动蛋白结合位点，并与G-肌动蛋白、F-肌动蛋白都有高亲和力。
血浆凝胶溶素在结合第二个肌动蛋白分子时具有比结合第一个肌动蛋白分子更高的亲和性。因此，它易于形成2∶1而不是1∶1的混合物，而且易与多聚体而不是单聚体结合。当加入F-肌动蛋白时，血浆凝胶溶素以非蛋白水解方式解离多聚体，并且保持与新形成的丝状物一个末端结合。假如有有利的凝胶溶素分子存在，它们可以连续地分离肌动蛋白直至形成2∶1的肌动蛋白与凝胶溶素结合物。从而迅速地解聚肌动蛋白丝。
游离的和结合状态(与肌动蛋白)的凝胶溶素分子功能特性不同，尽管有利凝胶溶素可以解离肌动蛋白丝，但肌动蛋白—凝胶溶素无此作用。
凝胶溶素在血浆和其它胞外液体中的功能是解离肌动蛋白丝。假如凝胶溶素多于肌动蛋白，则只有凝胶溶素—肌动蛋白结合物形成。而肌动蛋白过剩时就会有游离的肌动蛋白寡聚体和凝胶溶素—肌动蛋白结合物存在。肌动蛋多聚体的分离是通过非蛋白水解方式断裂两个相邻肌动蛋白分子间非共价键。凝胶溶素的解离活性的激活需要微克分子以上浓度的Ca+和PH大于6的环境，其活性可被PIP2(磷脂酰肌醇-4-5-双磷酸盐)和PIP(磷脂酰肌醇-4-单磷酸盐)抑制。胞外液体中Ca+浓度正常情况下为毫克分子水平，且不含PIP2及PIP，故血浆凝胶溶素是胞外液体中的活性成分。
人的胞外(血浆)凝胶溶素的cDNA已被克隆和测序(Kwiatkowski，D.J.，et al.，Nature 323：455-488 1986；Kwiatkowski，D.J.，et al，J Cell Biol.106：375-384 1988)。有与肌动蛋白结合能力的天然片段已被确定(Bryan，J.，J Cell Biol106：465a 1988 abst.No.2616；Kwiatkowski，D.J.，et al，J CellBiol.108：1717-1726 1989；Way M.，et al，J cell Biol 109：593-605 1989)。没有证据表明存在遗传多态性(不常见的Finnish-型淀粉样变性遗传病中血浆凝胶溶素单个氨基酸的突变除外)。这一特点表明使用人重组蛋白不会导致免疫反应或其它毒性作用。血浆凝胶溶素已在很多体液中发现，提示凝胶溶素可能是气道液体里的正常组分，至少在炎症状态如此。
DBP也已克隆(Cooke，N.E.，et al.，J clin Invest.76：2420-2424 1985；Yang，F.，et al，Proc Natl.Acad Sci USA 82：7994-7998 1985)。DBP有一个肌动蛋白结合点，主要与肌动蛋白单体而不是F-肌动蛋白结合。肌动蛋白和DNA酶I
肌动蛋白和DNA酶I的紧密结合抑制了DNA酶I的催化活性(Lindberg，u.，Biochem.Biophys.Acta.82：237-248 1964；Lazarides and Lindberg，Proc Natl.Acad.Sci USA 71：4742-4746 1974)。在白细胞中肌动蛋白占蛋白总量的10％，因此，同DNA多聚体一样在气道脓液里存在大量肌动蛋白。只要肌动蛋白在气道内含物出现，DNA酶I对DNA的降解效率将因为被肌动蛋白的结合而降低。
肌动蛋白只要产生高弹性的网状结构并当渗入粘液形成DNA多聚体时，就会形成象其纤维样的很硬的胶(Janmey，P.A.，Blood 80：928-936 1992)。介绍应用肌动蛋白结合物解离肌动蛋白，尤其是解离肌动蛋白丝(Janmey.P.A.，Curr，Opinion CellBiology 3：4-11 1991)是一个十分有吸引力的方法，以此降低气道粘液尤其是脓性粘液的稠度。
由于肌动蛋白抑制了DNA酶I的水解活性，所以肌动蛋白结合分子通过溶解肌动蛋白并使它在含有DNA的气道粘液中易于排除而提高了DNA酶I的功效。
本发明基于申请人这样的看法，由于白细胞是脓性粘液的主要成分且肌动蛋白占白细胞内蛋白总量的10％，故大量肌动蛋白可能存在于气道脓性粘液里。本发明也考虑到由于DNA酶I在脓液中与肌动蛋白结合使之降解脓性粘液中DNA多聚体的效率下降，包括内源性DNA酶I和以治疗为目的而加入的DNA酶I的作用都会下降。
因此，本发明申请人考虑以肌动蛋白结合物，片段或衍生物用于含有病理性粘液样气道分泌物的患者，给他们提供治疗并保护他们的呼吸道免遭损害。故本发明是一项旨在提供降低粘液粘滞度或溶解粘液样气道内容物的方法，保证了患者的气道通畅，呼吸正常，尤其是患有气道炎症性疾病的患者。本发明在方法上通过加入肌动蛋白结合物，特别是肌动蛋白结合蛋白，实现：1)解聚合，多聚体、片段成分解离，或阻止从细胞中释放的肌动蛋白丝聚合或固化，和/或2)，阻止肌动蛋白抑制DNA酶I降解那些增强粘液粘性的DNA多聚体活性。DNA酶I可以是内源性的，也可以是因治疗而雾化吸入或其它方式给入的。
因此，这项发明的再一个目的就是通过在呼吸道使用结合肌动蛋白的化合物，尤其是肌动蛋白结合蛋白，降低了肌动蛋白与DNA酶I的结合力，促进了呼吸道病理性粘液样物质中DNA的降解。
本发明的所有目的于下文中很容易看出，这些目的是在一定剂量无规则条件下使用一种多多种肌动蛋白结合蛋白、片段或功能性衍生物，治疗因肌动蛋白和/或DNA释放所致的气道阻塞。
附图说明
图1，囊性纤维变性病人痰液的动力切变系数。将含有凝胶溶素或不含凝胶溶素的痰液样品放在两个平行的摇摆圆盘之间(ferry J.D.Viscoelastic Properties of Polymers 3rd Ed.，JohnWiley & sons，New York 1980)，并对附着在样品下的臂作一短暂的移位，动力切变系数G从频率和自由摆动的衰减中求出。含有肌动蛋白多聚体的溶液的切变系数G直接取决于该肌动蛋白丝的平均长度(Janmey，et al.，Biochemistry 27：8218-8226 1988)。图1A：囊性纤维变性患者痰液切变系数；图1B：囊性纤维变性痰液加凝胶溶素的切变系数；图C：囊性纤维变性痰液加凝胶溶素氨基酸片段1-260的切变系数。
图2，囊性纤维变性痰液的切变力的攀升和回落。把含有凝胶溶素和不含凝胶溶素的痰液样品放在摇摆圆盘之间，给予持续的切变压力。随后的变形看成是切变顺应性，即切变强度与外加压力之比。以前的研究表明，F-肌动蛋白的顺应性随着肌动蛋白丝平均长度的下降而迅速提高(Janmey et al.，Biochemistry 27：8218-8226 1988)。切变强度的突然下降表示外加压力的解除。
图3，凝胶溶素和DNA酶I的剂量效应曲线。含有凝胶溶素或DNA酶I的痰液样品放置摇摆圆盘中培养60分钟后测粘滞度变化，粘滞度的变化是随浓度增加而改变，粘滞度的变化用占初始粘滞度的百分数表示。
图4，DNA酶I和凝胶溶素联合使用对痰液粘滞度的影响。含有凝胶溶素、DNA酶I的样品放置摇摆盘中培养60分钟。结果以所占初始粘滞度的百分数表示。
图5.联合使用肌动蛋白结合物对痰液粘滞度的影响。加入凝胶溶素和Gc球蛋白(维生素D结合蛋白)的痰液样品放在摇摆圆盘中培养60分钟测粘滞度的变化。结果始终用所占初始粘滞的百分数表示。
本发明考虑到呼吸道内容物中存在肌动蛋白丝和DNA多聚体，它们可以增加这些内含物的粘稠度，并以此作用方式阻碍呼吸道的正常清洁作用而导致病理变化。因此，本发明的目的在于通过解离肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白多聚体的形成，降低肌动蛋白的含量和降解DNA多聚体，从而降低病理状态下气道内含物的粘滞度。本发明的一个具体应用是一种结合了肌动蛋白的化合物或几种化合物应用于患有呼吸道疾病的人。而这些疾病是由于气道内存在肌动蛋白丝及DNA多聚体所致。肌动蛋白结合物则可解聚肌动蛋白，阻止或降低游离肌动蛋白单体的聚合，阻止肌动蛋白丝或单体与DNA酶I的结合。本发明通常的实施方案是一种溶解或降低病理性呼吸道内含物粘滞度的方法，而这些气道内含物是各种患者饱经痛苦的原因。
本发明还考虑到气道粘液存在肌动蛋白丝和DNA多聚体，它们可以增加粘液的稠度或粘滞度并阻碍气道空气的正常流通和气道内含物的清除，故本发明的目的是要通过在含粘液的呼吸道中使用肌动蛋白结合化合物来降低这些粘液的粘滞度。该化合物可解离肌动蛋白丝为肌动蛋白单体，或与肌动蛋白结合而阻止肌动蛋白与DNA酶I的结合。该化合物也可以阻止肌动蛋白单体聚合成肌动蛋白丝。通过提高粘液的清除率，该化合物可最佳减少肌动蛋白在内容物中含量。因此，本发明的一个实施方案是一提供了一种方法，即通过将肌动蛋白结合物或几种结合物引入到含所述粘液的单体呼吸道中来降低气道粘液的粘滞度或对粘液的溶解，考虑到呼吸道脓性分泌液中白细胞所致的DNA多聚体会增加粘液的稠度，脓性粘液中还可能大量存在肌动蛋白丝致使粘液阻塞气道，减少痰液的咳出，并诱发其它类型的呼吸道疾病。因此，本发明的另一个目的是解离肌动蛋白丝的同时对DNA多聚体的解聚以降低脓性粘液的粘滞度。本发明的最佳应用是给呼吸道内存在这种粘液的患者使用肌动蛋白结合物或几种结合物的混合物，降低脓性粘液的粘滞度。肌动蛋白结合物而已通过解聚肌动蛋白丝为肌动蛋白单体或与肌动蛋白丝、单体结合从而阻止它们与DNA酶I结合，这些化合物还可阻止肌动蛋白单体聚合成肌动蛋白丝。最终，由于增强了对粘液的清除而减少了呼吸道内肌动蛋白的含量。
在本发明付诸于治疗时，DNA酶I的应用可以是单独也可以与肌动蛋白结合物联合使用。
本发明的进一步应用是给存在病理性粘液或脓性粘液的呼吸道使用肌动蛋白结合物的功能性衍生物或片段以防止呼吸道阻塞和减少痰液。
本发明的优点在于它可以直接降低需要这方面治疗的病人气道内特殊内容物的稠度。肌动蛋白结合物可以：(1)解聚、分离来自坏死细胞或其它细胞能增加粘稠度的肌动蛋白丝，或阻止肌动蛋白单体、寡聚体聚合为多聚体，(2)通过阻止肌动蛋白与DNA酶I结合从而解除肌动蛋白对DNA酶I的抑制作用。DNA酶I可以对DNA多聚体起解聚作用，(3)最终通过对气道内容物的清除来减低气道粘液中肌动蛋白的含量。基于本发明的目的可以理解为气道内存在的肌动蛋白是游离单体或丝状物形成的胞外肌动蛋白。
本发明的突出之处是使用凝胶溶素蛋白活性片段或功能衍生物。凝胶溶素可以象以往呼吸道疾病患者使用DNA酶I一样常规地使用。凝胶溶素还可与其它肌动蛋白结合物(尤其是维生素D结合蛋白)或DNA酶I联合使用。另一方面，应用肌动蛋白结合物(特别是凝胶溶素)可以通过静脉给药而到达气管、支气管和肺泡，有效地解决呼吸道给药会因为气道阻塞而受限制的问题。静脉给药在呼吸道有炎症和伴随血气通透性增加的情况下效果更好。
众所周知，血浆蛋白是可以进入呼吸道的，α-1抗胰蛋白酶治疗遗传性肺气肿就是一个显著的例子。估计血液向组织输送血浆蛋白是一个直接的功能。因此，可以通过测定血中凝胶溶素含量来确定气道是否对肌动蛋白结合物利用了。
已知(Am J.Path.130：261-267 1988 and Am.Rev.Resp.Dis.138：429-434 1988)血浆凝胶素含量在实验性肺损伤及临床ARDS(成人肺呼吸综合症)疾病中会减少.另外一些实验表明在肌肉和血浆凝胶溶素浓度之间存在某种联系(Yamamoto，H.，Osaka Gas Group Foundation Publication Volume 5：145-1471992)。因为肌肉是血浆凝胶溶素的主要来源，患者随着慢性炎症和缺氧对其的消耗，血浆凝胶溶素也将随之下降。
本发明的所有实施方案中，DNA酶I的有效性被增强，最终使病理状态下呼吸道内容物尤其是粘液或脓性粘液中DNA被解聚合。
经验证明，本发明可用语治疗疾病不只限于囊性纤维变性，它包括慢性支气管炎，脓性粘液或单纯粘液脓性变坏的支气管炎，支气管粘液溢，支气管肺炎，广泛的细支气管炎，脓性肺炎，肺炎样肺泡硬化，哮喘，伴有或不伴哮喘的支气管扩张粘液阻塞，急性或慢性脓性窦炎，脓胸，支气管扩张，支气管囊肿，成人呼吸道综合症(ARDS)，移植后的管腔闭合，细支气管炎及过敏性细支气管炎(肺泡纤维化)。
为了对这份说明书、权利要求书和所给专业术语的范围有一个清晰、连贯的理解，下面给出一些定义。
术语“呼吸道”或“气道”专业上认为是管状、多孔的器官和结构，通过肺换气体交换发生在外界空气与血液之间。这就使理解上包括，特别是鼻腔和鼻甲，咽，喉，器官，支气管和肺。本发明是直接用于治疗气道任何部位，尤其是气管以下部位的粘液、脓性粘液等内容物的溶解与清除。一般专业上认为“呼吸道内容物”或“气道内容物”在正常情况下是由气道内细胞产生的物质(例如，通过分泌)，或者细胞自身的残留物构成。因此，在理解病理状态(粘液样)气道内容物时，是指可以导致结构和功能改变的那种成分，存在与气道内容物中(比如，过量的肌动蛋白)可引起呼吸道功能异常或疾病。这些成分不只是粘液、脓性粘液，比如在囊性纤维变形的厚粘液中还有细菌等。故这些成分也可能是粘液中的生物成分，它能改变粘液中的特性并引起疾病或紊乱。这些成分也可能是疾病本身引起的。在疾病状态下可以使正常呼吸道内容物的量增加，或使正常成分的类型发生改变。例如，正常状态下的一些气道内容物失去平衡或某种成分比例失调(如过量的肌动蛋白)。术语“呼吸道疾病”是指出现了病理性气道内容物之后所引起的一系列变化，包括气流减少，气道阻塞、呼吸道纤毛的清除功能下降、呼吸道肌肉运动能力减弱，如咳嗽、打喷嚏。呼吸道长时间与这些滞留的细胞，溶解酶，炎性介质、真菌、支原体、细菌或其它微生物接触而受刺激。术语“粘液”一般理解为在粘液膜层游离存在的粘性物质，由腺体分泌而成，还包括各种无机盐、脱落细胞及白细胞。“脓性粘液”是本发明主要的应用对象，一般认为它具有高粘滞性，来源于白细胞或脱落细胞及破碎的内源性气道细胞的DNA多聚体使其粘滞度相对增加。
术语“溶解的气道内容物”(粘液样)，“溶解的粘液”，或“溶解的脓性粘液”是指这些内容物的力学特性发生了变化，使得粘液或脓性粘液更象液体，或者说固状性能减弱，顺应性加强(对应变压力有更好的流动反映性)。多聚体的解离对这些内容物粘滞度的改变起了作用，使内容物/粘液/脓性粘液的结构间隙中的蛋白或分子析出，降低这些物质的粘滞度或稠度。术语“降低粘滞度”或降低“稠度”，可以理解为改变其力学特征。正如前面所述。粘滞度是表示物质的一个物理特征，它依据物质组成分子在相互运动时的摩擦情况而定。粘性高的溶液表明其组成分子间的摩擦力大，而降低粘滞度就是降低组成分子之间的摩擦力。
术语″外源性DNA酶″是指病人由于呼吸道内DNA多聚体所致呼吸道疾病需要使用DNA酶时，临床给予的DNA酶。
术语“内源性DNA酶”是指患者呼吸道内存在的DNA酶，尤其是这类病人呼吸道粘液中存在DNA酶。
术语″增强DNA降解″是本发明的一个目的。引入一定量的肌动蛋白结合物，它们则与病理状态下气道内容物中的肌动蛋白结合。如果粘液或脓性粘液中的肌动蛋白未与肌动蛋白结合物结合，肌动蛋白就会和这些液体中的DNA酶结合，降低了DNA多聚体的降解，肌动蛋白与肌动蛋白结合物结合之后可以降低粘滞度，增强呼吸的气流量，痰液易咳出并使其它一些由于气道内容物所致的呼吸道疾病得以缓解。
术语“结合肌动蛋白的化合物”指能与肌动蛋白结合的任何物质，尤其是蛋白质(或多肽)类，通过与肌动蛋白的结合，调节肌动蛋白的许多功能，包括抑制肌动蛋白单体变成多聚体直至丝状，对以前存在的丝状物解离成碎片和结合DNA酶I。本发明介绍的肌动蛋白结合物实际上不含体内外的污染物，如体内的原核或真核细胞，体外的化学合成物质。这些结合物有来源于细胞外的凝胶溶素，DBP和来源于细胞内的肌浆球蛋白，肌球蛋白，抑聚合蛋白(profilin)和胞质磷蛋白(cofilin)，非肌细胞内含量丰富。本发明介绍的肌幼蛋白结合物不只限于：a)，肌动蛋白结合物主要是分离肌动蛋白单体，也就是说，与单体结合为复合物阻止它形成多聚体(如，DBP，凝胶溶素，β4-肌球蛋白和cofilin)；b)，肌动蛋白结合物解离单体和有解离多聚体的强烈活性(如凝胶溶素，裂解蛋白(villin)，片段和裂解蛋白(severin)；c)，肌动蛋白结合物主要阻断肌动蛋白多聚体末端，阻止在此末端进行单体交换(如阻断蛋白(tropomodulin)，capz，cap 100，ASP-56)；d)，结合肌动蛋白的非蛋白质分子对肌动蛋白有同样作用(如细胞松弛可有生物活性的衍生物产生，从而阻断肌动蛋白丝末端，调节胞外的残留物)。专家认为有效的化合物将存留在胞外，为了阻止任何与胞内功能肌动蛋白相互作用引起的毒性，肌动蛋白结合蛋白片段具有将存留的肌动蛋白或其单体分离的活性。这一点也是本发明的目的范围。如果需要的话，这种化合物以易接受的给药形式给动物。
这里“动物”一词是包括所有痰液中有游离肌动蛋白或肌动蛋白丝的动物，这样的痰液对动物的正常生理是有害的。这些动物中最重要的是人。但是，这项发明并不只希望于人类，在考虑到这项发明对所有动物治疗作用时，可以看到所有动物受惠于本发明。
肌动蛋白结合物的″有效量″是指以降低或排除肌动蛋白在呼吸道的毒性作用的剂量。本发明中，化合物使用量能有效溶解或降低病理状态气道内容物粘滞度或稠度，阻止这些液体中的肌动蛋白与DNA酶I结合，从而增强DNA降解，或降低液体粘滞度以治疗不同类型的呼吸道疾病。有效治疗量也是这个剂量，即它可以减少临床细菌感染的发病率，降低炎性介质或细胞毒性酶，细胞毒性酶可由呼吸道病变本身产生或前者是后者的诱因。
肌动蛋白结合分子的用量及治疗时间是根据病变程度及其检测指标来决定，如痰液量、粘滞度、肺功能FEV、血O2、PH、PCO2肺通量、气流残余量、感染部位等。有经验的医生是熟悉这些常规检测技术。
雾化肌动蛋白结合蛋白的用量可以根据以往用DNA酶I治疗病人的有效吸入量决定。比如参看Atiken，M.L.，et al.，J AmMed.Assoc.267：1947-1951(1992)，特别在1948页，“研究方案”。体内有效剂量与体外已明确的有效量相关，如在体外剂量据说明上注明能够溶解痰液的剂量为2-10μg/ml，则用于体内时应增加到是体外的一千倍的剂量(2-10mg/ml)。当然，准确使用肌动蛋白结合物的剂量和规则也要根据治疗呼吸道疾病的常规方案而定。一般而言，使用肌动蛋白结合蛋白的剂量将不同程度依赖于化合物的类型，病人年龄，疾病严重程度，目前的治疗措施，组织损伤程度，病人性别，症状持续时间等。正确有效的剂量可以根据检测气道内容物而定。
如果一种物质是从一些物质中纯化得来的，而这种物质在纯化前就已被发现，那么这种物质被认为是事实上的未被自然污染的，如肌动蛋白结合物的自然污染物或许是非肌动蛋白结合肽，碳氢化合物，糖基化多肽，脂类，膜等。如果那些污染物从本来自然存在体内外某种物质样品中未被发现，那么，这种物质样品实际被认为是未被发现，那么，这种物质样品实际被认为是未被自然污染。“实际上不存在”是指这类污染物完全没有或仅有微量。故(1)不会干扰活性试剂的理想疗效(如以上述方法制备的肌动蛋白结合物)，(2)也不会伤害被给予的动物。
“给予”是指通过各种途径经将肌动蛋白结合蛋白引入动物呼吸道的方法，包括除雾化吸入，支气管镜导入和静脉注射以外的方法途径。
本发明介绍的肌动蛋白结合物可以和DNA酶或其它肌动蛋白结合物联合使用。“联合使用”指每次用药给予两种以上成分，它们的生物活性有重叠，这个词的意思包括连续，广泛使用这类结合物或与DNA酶I共同应用。
“可接受的药剂媒介物”包括溶剂、载体、稀释剂等，它们可以作为制备肌动蛋白化合物的添加剂，是为了给这类化合物提供载体或剂。
“碎片”是指分子的任何部分，这一部分能结合肌动蛋白和单体，或解聚多聚体。该词的意思还包括任何来源的肌动蛋白结合片段，如天然多肽序列、合成多肽序列和基因工程多肽序列。进一步说，如果这种片段是一个肽，一个肌动蛋白结合蛋白的肽的片段，那么这种“碎片”还包括了各种肌动蛋白。
肌动蛋白结合物的″功能衍生物″是指这种衍生物具有大量与肌动蛋白相似的生物活性.″事实上相似″的意思是说活性程度不同但活性作用相同。比如，本发明的肌动蛋白结合物的一个功能衍生物，它有与肌动蛋白结合物相同的氨基酸链，包括依据诊断、治疗需要所要的修饰，如翻译后的修饰，结合磷酸酯或共价结合碳氢化合物(糖)。这个词也包括肌动蛋白结合物的化学衍生物，这类衍生物可提高化合物的渗透性、吸收性、生物半衰期等。这类衍生物也可降低分子毒性，排除或减弱不必要的付作用等。衍生物和特殊化学部分是有这方面作用，可在Remington′s Pharmaceutical Science(1980)中见到。把这些部分和分子结合是众所周知过程。“功能衍生物”一词包括化学衍生物变异体，相似物或肌动蛋白结合物的药剂溶液。
“变异体”是指结构和生物活性事实上与天然结合物或片段相似的物质。
“同功物”只室功能上与天然肌动蛋白结合相似的化合物，如肌动蛋白结合蛋白的同功物的氨基酸序列不同于肌动蛋白，但它与肌动蛋白有同源性，表现为只具有肌动蛋白结合蛋白的生物活性。
“可接受的药用性盐”是指这项发明中肌动蛋白结合物的盐。这类盐可以从药用性酸或碱中得到，酸：硫酸盐、盐酸盐、含氮盐、磷酸盐等；碱：强碱、碱金属氧化物，铵氢氧化物、烷基胺氢氧化物等。
“生物活性”是它们与肌动蛋白结合及修饰它变为另一种形式的能力，而这种形式相对于未经修饰的肌动蛋白而言，对动物的毒性较弱。这种修饰可能只是与化合物结合或者有这种结合导致化学及酶反映所致。
本发明中主要的成分是肌动蛋白结合分子，来源于经纯化的天然和重组肌动蛋白结合蛋白质。此外，还有其它非蛋白类肌动蛋白结合分子和生物活性片段，有独特的肌动蛋白结合区，这部分具有生物活性，它能将肌动蛋白分裂为单体形式或迅速解离肌动蛋白或覆盖对宿主细胞有毒的游离肌动蛋白位点，肌动蛋白结合区所具有的这些生物活性也可通过合成、酶催化、蛋白分解，化学或重组DNA方法得以实现。
给需要这方面治疗的病人提供凝胶溶素或肌动蛋白结合片段和DBP时，另外一些非常好的肌动蛋白结合物也可使用，包括β4胸腺素和ASP-56。另一个具体应用是给需要这方面治疗的病人用凝胶溶素或肌动蛋白结合片段，或以上两种与DBP及DNA酶I联合使用。
本发明中的肌动蛋白结合蛋白的非肠道给药制剂，包括无菌水或非水溶剂，悬浮液和乳剂。非水溶剂如丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射用的有机酯。水性载体包括：水、水-乙醇溶液；乳剂或悬浮液包括：盐和医用非肠道途径的载体缓冲液，有氯化钠溶液、格林葡萄糖溶液、葡萄糖加氧化钠溶液。格林溶液包括乳糖或混合油。静脉用载体包括流质和营养再生剂量、电解液，它们都以格林葡萄糖基础成分。发明中的肌动蛋白结合蛋白也可以用泵的方式使之持续释放，尤其适用于慢性损伤而非急性病。用持续释放的方法给药对需要长时期反复注射的病人更方便。比如，对患有遗传性或慢性与肌动蛋白相关疾病的患者用持续释放的方式给入肌动蛋白结合物是一个十分理想的用药方法。
肌动蛋白结合蛋白可以使用多种形式的剂型，如片剂、胶囊，粉剂或水溶液，口服。只要这种生物蛋白不会被消化过程破坏并且该化合物能通过肠道组织的吸收就行。
本发明提供的药剂组成是依据已知的那些技术，如传统的混合，制粒，糖锭，溶解，冻干或相类似的过程。发明中的组成成分对控制由肌动蛋白引起的急慢性损伤有用。发明中的成分直接针对机体自身处理血流或胞外组织的肌动蛋白。本发明的静脉用剂型赋予足够快的生效，对组织急性损伤潜在时期开始生效。
肌动蛋白可以从它们自然的或重组资源中通过分离纯化得到从而使之免于自然污染。这只是根据传统条件和以往分离蛋白的技术而定，比如提取法，沉淀法，色谱法及亲和层析法，电泳等。鉴别肌动蛋白化合物的结合区可使用无须繁重实验的技术，况且检测肌动蛋白结合物的结合区是本发明中务须实施的一项工作。例如，天然肌动蛋白结合物的衍生物或重组的肌动蛋白结合物的衍生物可以用蛋白酶水解肌动蛋白结合物而获得，如胰蛋白酶、糜蛋酶、枯草杆菌蛋白酶。用肌动蛋白衍生物树脂可以分析这些片段结合肌动蛋白的能力。
确定化合物或片段是否具有分离肌动蛋白活性是大家所关心的，这些化合物的功能可以通过普通的技术确定，如通过解离范标记的F-肌动蛋白的速率确定。
此外，这些碎片也可以根据它们与已知的肌动蛋白结合物或裂解肌动蛋白功能区是否有同源性而确定它们功能的同源性。如肌割蛋白、凝胶溶素和绒毛蛋白，尤其是肌割蛋白的40-351位氨基酸残基和凝胶溶素的63-383位氨基酸残基存在广泛的同源性，这些区域是裂解F-肌动蛋白的主要功能区。
例如，凝胶溶素的N-末端和tryptic(胰蛋白的)碎片N-末端知道为CT45，CT45有解离F-肌动蛋白的能力并且有两个肌动蛋白结合位点，因此有效量的纯化CT45可以给患者使用。这些残基位点之一是在胰凝乳蛋白片段(chymotryptic fragment)。CT15N(人类凝胶溶素残基24-150)它可与F-肌动蛋白单体、多聚体末端结合，且具有很高的亲和力；另一位点在邻近片段CT28N(残基151-406)，它与F-肌动蛋白侧链结合，以多磷酸肌醇位点调节方式(in a polyphosphoinositide-regulated manner)。任何片段自身都不可能解聚肌动蛋白丝。最小的具有解离F-肌动蛋白能力的凝胶多肽是在血浆凝胶溶素25-165个残基位点完成的。
另外，象肌动蛋白结合蛋白这类化合物存在于多种动物体内且很容易从非人类(牛、猪)血浆和肌肉组织中分离得到，而且这些蛋白片段也可通过化学或酶的方法得到。在这种情况下给需要这种治疗的患者使用肌动蛋白结合物不会引起严重的免疫反应。
在这部申请书中引用的所有参考书目都是查阅得来的。现已对这项成果进行了一段表述，下面将进一步讲述完成这项用到的材料、方法的实例。但例子不只是限于本发明。
例1
囊性纤维变性患者咳出的痰液标本，其中一些是接受了雾化DNA酶I治疗的。把它融解并分成几个部分。这个实验过程有shat等人描述过(proc.Natl Acad Sci USA 87：9188-9192 1990)，因为已经明确了DNA酶I对痰液粘滞度的影响，用纯化的血浆凝胶溶素代替DNA酶I，这种蛋白非共价键地裂解肌动蛋白多聚体。在E.colin内产生的重组凝胶溶素片段包括了凝胶溶素的1-260个氨基酸残基(凝胶溶素2601)，同样有与肌动蛋白丝结合的能力，可用于治疗。这些蛋白对DNA的作用还不知道。shak等在囊性纤维变性痰液的流动性实验中得到了相同的结果(Proc.Natl.Acad，Sci USA 87：9188-9192 1990)。尽管凝胶溶素片段仍比凝胶溶素更有效(表1)。
150mg的痰液样品用剃胡刀分割并放入试管中，这些为50ml容量的试管包含有已被标记的添加物，样品在使馆中的37℃环境中孵育，按下表隔一段时间把试管颠倒，把痰液沿带标签的试管壁倒流情况记录下来。0、无移动，Tr＝＜10％痰液沿倒置使馆侧壁流动；1+＝10-20％痰液流动；2+＝20-50％痰液移动；3+＝75％的痰液移动；4+＝所有痰液移动。
加入物   0分    15分   30分   60分
0.15M NaCl   0     Tr     Tr     Tr
+0.5mM凝胶溶素   0     2+     3+     4+
+5mM凝胶溶素片段   0     3+     4+     4+
这个实验用另一批痰样品重复，有相同结果，煮沸的凝胶溶素片段无活性。
例2：
痰液研究采用较正式的流变分析方法，包括摇动摆.参看图1A囊性纤维变性的痰液硬度和粘弹性非常大，短时给予的压力可引起很高频率的振动，从中可计算出弹性系数(G1)，假如凝胶溶素(图1B)和凝胶溶素片段(1C)可减少振动频率，分别将系数降低3和10倍。此外，假如较高浓度的片段化凝胶溶素更有效。囊性纤维变性痰液对稳定的应力的强度反映可以显示出固有的韧性或很差的顺应性，然而假如凝胶溶素及其片段，依据剂量依赖方式，可见它能增加痰液的顺应性，然而，所有样品解除应力后又见它们都恢复到最初状态。表明粘合的多聚体可能是粘液多糖和DNA仍在凝胶中。
例3：
若丹明鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin)可以与肌动蛋白多聚体结合，加入囊性纤维变性痰液样品中，可在相对照和荧光显微镜下观察。样品包含的胞内碎片，被认为是肌动蛋白和DNA的来源，能显出很强的荧光，未经治疗的和经凝胶溶素片段治疗的痰液放在15M的NaCl溶液5ml内稀释、离心。在280nm处的吸收峰可以确定痰液中蛋白的释放量。结果见表2，表中出示了凝胶溶素和260KDa片段使蛋白从痰液塞中释放的情况。
              表2
    样品     OD1＝280(OD)
    只有痰液     0.015
    痰+1.5mM凝胶溶素     0.249
    痰+2.1mM260片段     0.247
分析与凝胶溶素一起孵育的囊性纤维变性痰液释放的蛋白质，从确定了光密度的溶液上清液中取50μl的样品，加入等量的含有十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇缓冲液。混合液中的多肽可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶用考马斯亮兰染色，在含有凝胶溶素和凝胶溶素片段溶液胶中有许多不同的蛋白质和大量的三种蛋白，包括一种与肌动蛋白一起移动的作为分子量参照的标准蛋白。
抗肌动蛋白免疫点杂交研究囊性纤维变性痰液，从两个不同病人身上获得的囊性纤维变性痰液悬浮在等量的0.15M NaCl和20mM Tris-HCl，中，PH＝7.0，并且摇匀。50μl的样品加入等量的SOS凝胶缓冲液并且用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。把凝胶多肽转移到硝化纤维素膜上，肌动蛋白带用抗肌动蛋白抗体鉴别。这条带可以在含有痰液的部位看见。结果证明在囊性纤维性痰液中会有肌动蛋白。
例4
用肌动蛋白结合蛋白溶解脓性粘液。从CF病人得到的新鲜痰液样品需要在几个小时内试验，在这个实验中，用流动分析法对商品中DNA酶I与纯化的血浆凝胶溶素直接比较(表3)。
                                  表3
                                浓度μg/ml
    培养时间(37℃) 2 5 10 2 5 10
    1分     0     0     3+     0     0     0
    3分     0     Tr     3+     0     0     Tr
    5分     Tr     2+     4+     Tr     Tr     Tr
    10分     Tr     2+     4+     Tr     Tr     Tr
    15分     Tr     2+     4+     Tr     1+     3+
因为DNA酶I分子量31,000，凝胶溶素分子量为84,000，凝胶溶素被认为更加有效。且迅速发挥与预期的化学计算量一致的作用。但DNA酶作用缓慢开始，因为DNA酶的作用方式更加趋向于失去单体末端的方式，而不是倾向于肌动蛋白多聚体解聚作用方式或酶对DNA的催化作用方式。
凝胶溶素和DNA酶I主要对CF痰液粘滞度产生影响，比较凝胶溶素和DNA酶I对CF痰粘滞度的影响程度，可以通过测定加入不同浓度的这些化合物对样品痰液粘滞度的影响来分析。
痰液样品是将CF病人咳出的痰液收集在一起得来的，要么立即用于实验，要么冻在液氮里和贮于-20℃中。经这种方法处理的样品与新鲜样品的特性无显著性差异。
粘滞度通过摇动摆测定，并且通过在125mPa应变压力条件下把样本的曲线上升段变化率计算出来。参见P.A.Janmey，JBiochem.Biophys.Methods，22：41.1991。0.25ml相同的粘液塞从整块痰样品粘团中切出并把它放在转动的有盖滑片上，10微升缓冲液A(加或不加添加剂)加入50，75，150，250或500nM纯化的人凝胶溶素或加100、250、500、600或750nM牛胰DNA酶I(worthingto Biochemical，Freahold，New Jersey)，将这些成分加入痰样品中。每个病人的痰液样品的粘滞度在培养60分钟后测出每一个添加浓度，重复两次实验。
见表4和图3，凝胶溶素既使在最低浓度条件下都可见它显著地降低了粘滞度，相反，DNA酶I浓度在500nM以下时对粘滞度无影响。
                   表4
    ％最初粘滞度
    加入物浓度(nM) 凝胶溶素 DNA酶I
    50     69      -
    75     30      -
    100     -     100
    150     28      -
    250     28     102
    500     30     105
    600     -     62
    700     -     30
例5
DNA酶I和凝胶溶素协同作用，蛋白质释放的浓度依赖关系，从蛋白质释放的实验中可以看出三个囊性纤维变性病人得到的痰液样品的蛋白释放浓度依赖粘液的溶解性。痰液样品等量悬浮于0.5ml的0.15M NaCl溶液中，该溶液包含纯化的血浆凝胶溶素，浓度分别为2.0mg/nl，4mg/ml，7mg/nl，21ng/ml，在37℃中培养30分钟后样品离心，在波长λ、280n.m处测定上清溶液的光密度。用相对值，A280读数如下：2μg/ml：0.25；4μg/ml：1.30；7μg/ml：1.86；21μg/ml：180。A280在4μg/ml DNA酶I时约0.5，在4μg/mlDNA酶I加2μg/ml凝胶溶素时1.3。凝胶溶素在低剂量时可以有较强的溶解性但是DNA酶I在该浓度基本无作用。
凝胶溶素和DNA酶I联合使用对CF痰液粘滞度影响。明确凝胶溶素与DNA酶I联合用是否在降低粘滞度上有协同作用，我们可以通过测定加入其一或两种化合物的痰液样品的粘滞度中看出来。
从CF病人咳出的痰中收集痰样品并且立即用于实验或冻在液氮里贮藏于-20℃条件下，贮存样品的流体特性与新鲜标本无差别。
用扭转摆测定粘滞度，并在125mpa应变压力条件下强度变化率来计算粘滞度.参见P.A.Janemy，J.Biochem BiophysMethods，22：41 1991。0.25ml相同的粘液塞从痰样品粘团中切出来，并且把这个粘液塞放在转动的有盖滑片上，10微升缓冲液A(不加添加剂)加250nM纯化的人凝胶溶素，250ml牛胰DNA酶I(Worthington Biochemical，Freehold，New Jersey)或加250nM凝胶溶素和DNA酶I混合液，将它们分别加入样品中，然后按压悬挂在晃动摆盘上的有盖的滑片。每一个病人的痰液样品粘滞度分别在加入缓冲液15、30、45、60分钟后测定两次。
如图4所示，凝胶溶素和DNA酶I联合使用比单独使凝胶溶素大大降低了痰液粘滞度.而在同样浓度的DNA酶I则对粘滞度无作用。相同病人来源的痰液样品只用缓冲液A处理，其粘滞度在整个实验过程中无变化。
例6
结合肌动蛋白的化合物的混合物对CF痰的作用，测定结合肌动蛋白化合物的联合使用对CF痰液粘滞度的影响和痰液样品加入凝胶溶素和GC球蛋白(维生素D结合蛋白)后粘滞度的变化。
从5个CF病人中得到32个痰液样本，样本立即实验或冻在液氮里保存于-20℃的中。贮后样品的流体特性与新鲜样本无差异。
用晃动摆测定粘滞度，并在125mpa应变压力条件下从样品曲线上升段的强度变化率中求出粘滞度，参见P.A.Janmey，J.Biochem Biophys Methods 22：41 1991.0.25ml相同的粘液塞从痰样品粘团中切出来，并把这个粘液塞放在转动的有盖滑片上。10μl缓冲液A不加或加250nM人纯化凝胶溶素和GC球蛋白(Calbiochem，La Jolla California)混合物加入每个样品中，按压与悬吊的晃动摆盘相对位置的带盖滑片，来源于每个病人的样本分别在加入缓冲液后15、30、45、60分钟测其粘滞度，测试两遍。
如图5所示，凝胶溶素与GC球蛋白联合使用能迅速降低痰样本的粘滞度.相同病人痰液经缓冲液A处理后的粘滞度无变化。
到现在为止，已全面地描述了这项发明，本领域人员应明白：在不影响本发明范围或其任何实施方案下，条件参数等也在本发明范围内。

Claims (8)

1.将至少一种肌动结合蛋白或其具有肌动蛋白结合能力的片段用于制备药物的用途，该药物用于：
(a)溶解患者呼吸道中的病理性气管内容物，粘液或脓性粘液；
(b)降低患者呼吸道中的病理性气管内容物，粘液或脓性粘液；
(c)治疗呼吸道障碍患者，其中该障碍是由呼吸道中存在病理性气管内容物，粘液或脓性粘液引起的。
2.权利要求1的用途，其中能结合肌动蛋白的肌动蛋白结合蛋白或其活性片段选自凝胶溶素，绒毛蛋白，片段化蛋白和肌割蛋白。
3.权利要求1的用途，其中能结合肌动蛋白的肌动蛋白结合蛋白或其活性片段选自凝胶溶素或其活性片段。
4.权利要求3的方法，其中活性片段为胰凝乳蛋白酶片段的CT45。
5.权利要求3的用途，其中活性片段含凝胶溶素的第25-165位氨基酸残基。
6.权利要求1的用途，其中能结合肌动蛋白的肌动蛋白结合蛋白或其活性片段选自：维生素D结合蛋白，胞质磷蛋白，抑制蛋白，和蚕食蛋白。
7.权利要求1的用途，其中一种肌动蛋白结合蛋白或其活性片段是凝胶溶素或其活性片段，另一个结合肌动蛋白的蛋白或其活性片段是维生素D结合蛋白。
8.权利要求1的用途，其中病理性气管内容物，粘液或脓性粘液是与一组疾病，包括囊性纤维变性，慢性支气管炎，粘液样支气管炎恶化为粘液脓性或脓性支气管炎，细支气管炎，广泛的细支气管炎，脓性肺炎，肺泡硬化，哮喘，伴或不伴哮喘的支气管扩张粘液阻塞，急性或慢性脓性窦炎，脓胸，支气管扩张，或人呼吸道综合症，移植后的管腔闭塞性细支气管炎和过敏性细支气管炎有关。
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