JPH0959176A - 経口慢性関節リウマチ治療剤及び機能性食品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 慢性関節リウマチ(ＲＡ)の予防・治療に有用
な経口ＲＡ治療剤及び機能性食品を提供することを目的
とする。 【解決手段】 本発明の経口ＲＡ治療剤及び機能性食品
は、特定の条件下に変性（断片化）されたII型コラーゲ
ンを含有することからなる。ＲＡはII型コラーゲンを抗
原とする自己免疫疾患であると考えられているが、本発
明で使用される変性II型コラーゲンは高い経口免疫寛容
原性を有するので、II型コラーゲンに対する免疫応答が
抑制され、ＲＡの予防・治療を行うことができ、特に投
与が簡便な経口投与によりＲＡの予防・治療を図ること
ができるという効果を奏する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は経口慢性関節リウマ
チ治療剤及び機能性食品に関する。より詳細には、変性
させたII型コラーゲンを含有し、慢性関節リウマチの治
療・予防に有用な薬剤及び機能性食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチ（Rheumatoid Arthrit
is, 以下、ＲＡという）は罹患患者の多い慢性疾患の一
つであり、結合組織に炎症をきたす全身的な疾患であ
る。当該疾患は、主に関節の滑膜に非特異的炎症を起
し、全身の多発性関節炎の病像を呈し、軟骨や骨の損傷
をきたす。ＲＡの発病メカニズムは充分に解析されてい
ないが、リンパ球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ４が関係し、活
性化Ｔ細胞が関与する自己免疫疾患であると考えられて
いる(Lancet 341, 283, 1993)。II型コラーゲンが軟骨
中の主要構造蛋白であることや実験動物にII型コラーゲ
ンを投与するとリウマチ関節炎と形態的に類似した症状
を起すことから、II型コラーゲンが本疾患の自己抗原の
一つであると考えられている(J. Exp. Med. 146, 857,
1977; Lab. Invest. 54, 26, 1986)。ＲＡに対する治療
剤としては、抗リウマチ剤(金塩製剤、D-ペニシラミン
等)、非ステロイド剤、免疫抑制剤などが汎用されてい
るが、これらの薬剤の投与により十分な効果が得られな
いようなときには、強い抗炎症作用と免疫抑制作用を有
しているステロイド剤が用いられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記の薬剤によるＲＡ
の治療は対症療法的であり、根治的な治療法とはいえな
い。また、ステロイド剤は重篤な副作用を引き起こすお
それがあるので、その使用に際しては十分な注意をはら
い、常に減量や使用中止を考慮する必要性のあることが
指摘されている。最も望ましいＲＡの治療法は、疾患特
異的なメカニズムに基づいて関節の炎症を軽減すること
であり、使用される薬剤は毒性のないことが望ましい。
このような観点から、免疫寛容に基づくＲＡの治療法が
注目されている。免疫寛容とは、ある条件下に抗原で動
物を処理しておくと、次にこの抗原で適切な免疫操作を
行っても、抗体産生などの免疫応答が起こらない現象で
あり、免疫寛容を導く物質は免疫寛容原と称される。免
疫寛容によるＲＡの治療法としては、II型コラーゲン又
はその部分配列を有するペプチドを免疫寛容原として用
い、このぺプチドを新生児ラットに静脈ないし腹腔内投
与すると、ＲＡの発症を抑制することができることが報
告されている(J. Exp. Med. 170, 1999, 1989; J. Immu
nology 151, 500, 1993)。

【０００４】上記の方法においては、免疫寛容原は静脈
ないし腹腔内投与されているが、静脈ないし腹腔内投与
による免疫寛容原の投与は煩雑であるのみならず、免疫
寛容原のペプチドをＲＡ患者に連続的に静脈ないし腹腔
内投与する場合には、ＲＡ患者に重篤なアレルギー反応
やショックなどを引き起こすことも想定される。そこ
で、より簡便で且つ安全な投与方法によるＲＡの治療法
が望まれている。また、医薬品としてのみならず、日常
的な食物の摂取を通してＲＡの治療・予防を図ることが
できればより好ましく、ＲＡの治療・予防を目的とする
機能性食品も求められている。このような観点から、安
全性が高く且つ簡便な投与方法によるＲＡの治療法が切
望されており、経口免疫寛容によるＲＡの予防・治療が
検討されている。経口免疫寛容、ひろくは粘膜免疫寛容
は、抗原が経口的に腸管等の粘膜を通って入った場合、
その抗原に対して全身の免疫応答が失われる現象であ
り、経口免疫寛容においては、抗原が経口的に腸管等の
粘膜を通じて吸収されるとき、パイエル板、腸管上皮細
胞及びこれと隣接するリンパ球、門脈、肝臓などのいろ
いろの器官と機能による作用を受けるので、アレルギー
反応やショックなどを引き起こすことが少なく、アレル
ギーや臓器移植における免疫抑制療法として試みられて
いる。 また、抗原が経鼻的に投与された場合にも、上
記のような消化管粘膜を通じた吸収とともに、気道また
は肺などの粘膜を通じて吸収がなされるので、その抗原
に対しての全身性免疫応答が失われる免疫寛容現象が生
じる。

【０００５】経口免疫寛容によるＲＡの予防に関して、
ウシ関節由来未変性II型コラーゲンを経口投与（胃内投
与）されたマウスにおいて、コラーゲン誘導性関節炎
（ＣＩＡ）の発症が抑制されたことが報告されている(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7443, 1986)。しか
し、この報文では、加熱変性されたII型コラーゲンで
は、ＣＩＡ発症の抑制効果は認められなかったことが記
載されている。また、II型コラーゲンの経口免疫寛容原
性に関し、加熱処理することにより、免疫原性（抗原性
又はアレルギー発症能）を低下させることができるが、
免疫寛容原性は未変性のものと同程度か又はそれより低
下することが報告されている(J. Clin. Invest., 69, 6
73-683, 1982; J. Immun., 140, 1477-1484, 1988)。

【０００６】本発明者等はこの経口免疫寛容に注目し、
鋭意研究を重ね、II型コラーゲンの加熱変性条件を検討
してきた。その結果、上記の報文の記載に反し、熱変性
II型コラーゲンは経口免疫寛容原として有用であり、Ｒ
Ａの発症を抑制できることを見出した。即ち、上記文献
に記載の熱変性条件ではコラーゲンの熱変性が不十分で
あり、更に過酷な条件で熱変性して調製したII型コラー
ゲンは未変性II型コラーゲンより高い経口免疫寛容原性
を有することが判明した。また、アミノ酸配列を特異的
に認識する薬剤でII型コラーゲンを処理し、得られたII
型コラーゲンの変性物（断片化物）が未変性II型コラー
ゲンより高い経口免疫寛容原性を有することが判明し
た。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、Ｒ
Ａの予防・治療に有用な経口薬剤及び機能性食品を提供
することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コ
ラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変
性させたII型コラーゲンを有効成分として含有する経口
慢性関節リウマチ治療剤； 熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６
０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たもの
である上記に記載の経口慢性関節リウマチ治療剤； アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させたII
型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１
０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３
本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体
構造を解き、その後に、アミノ酸配列を特異的に認識
し、切断する薬剤を作用させて得たものである上記に
記載の経口慢性関節リウマチ治療剤； II型コラーゲンが、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウ
マ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類、
ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、
ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サケ、サメ、エイ等
の魚類由来である上記〜の何れかに記載の経口慢性
関節リウマチ治療剤； 製剤形態が、経口投与製剤、経鼻投与製剤、経腸投与
製剤又は経粘膜投与製剤である上記〜の何れかに記
載の経口慢性関節リウマチ治療剤； 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コ
ラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変
性させたII型コラーゲンを含有する機能性食品； 熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６
０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たもの
であり；またアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変
性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以
上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプ
チド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺
旋状の立体構造を解き、その後に、アミノ酸配列を特異
的に認識し、切断する薬剤を作用させて得たものである
上記に記載の機能性食品；である。なお、本発明にお
いては、便宜上、「経口」には、通常の経口の他、経
鼻、経腸及び経粘膜も含まれるものとする。

【０００８】本発明の経口慢性関節リウマチ治療剤及び
機能性食品は、熱変性させたII型コラーゲン又はアミノ
酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させたII型コラー
ゲンを含有することからなる。一般に、コラーゲン分子
は、−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｘ及びＹはアミノ酸残基）の
繰り返しからなるアミノ酸約１０００残基（分子量約１
０万）のポリペプチド鎖（α鎖）が３本撚り合わされて
できている。現在までに発見されているコラーゲン分子
の種類は１９種（Ｉ型〜ＸＩＸ型）あり、その内、II型
コラーゲンは３本のα１（II）型ポリペプチド鎖で構成
され、関節軟骨、椎間板髄核、眼ガラス体などに多く含
まれている。

【０００９】本発明において、原料となるII型コラーゲ
ンの精製・単離は慣用の方法に準じて行うことができ、
例えば、II型コラーゲンを含有する生体組織を、ペプシ
ン、プロナーゼなどの蛋白分解酵素を用いて限定分解
し、塩分別沈殿法などで精製することにより調製するこ
とができる(J. Exp. Med. 146, 857-868, 1977; Arthri
lis Rheum. 22, 1344, 1979; J. Immunol. 124, 2912,
1980など参照)。また、既に市販されているII型コラー
ゲンを用いることもできる。II型コラーゲンの由来は特
に限定されず、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウ
マ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類、
ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、
ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サケ、サメ、エイ等
の魚類など由来のコラーゲンが例示される。更には、上
記の各種動物のII型コラーゲンのアミノ酸配列に関する
知見に基づいて化学合成されたII型コラーゲン、又は遺
伝子組換技術により作製されたII型コラーゲンを用いる
こともできる。

【００１０】本発明における熱変性II型コラーゲンは、
酸性条件下又はアルカリ性条件下にII型コラーゲンを熱
変性することにより調製される。後記実験例に示される
ように、かかる熱変性によりII型コラーゲンは断片化さ
れる。熱変性条件は、加熱温度及び加熱時間により適宜
調整し得るが、通常、６０℃以上で且つ１０分間以上の
条件が適用され、好ましくは６５℃以上で１５分間以
上、より好ましくはオートクレーブ処理（例えば、１２
１℃、１５分間程度）が利用される。

【００１１】酸性条件としては、例えば、クエン酸、酢
酸、塩酸などの有機又は無機酸類を用いた溶液が例示さ
れ、好ましいｐＨ範囲としては５．５以下、より好まし
くは２．０〜４．５が例示される。アルカリ性条件とし
ては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ト
リエタノールアミンなどの無機又は有機塩基を用いた溶
液が例示され、好ましいｐＨ範囲としては９．５以上、
より好ましくは１０．０〜１２．０が例示される。

【００１２】好ましい熱変性条件としては、II型コラー
ゲンの無機酸又は有機酸水溶液を、６５℃以上、好まし
くは１００℃程度で、１５分間以上、好ましくは２０分
間程度加熱するか；オートクレーブを用いて、１１０℃
程度で３０分間以上、好ましくは２〜１０時間程度加熱
するか、１２０℃程度で１５分間以上、好ましくは２０
分間加熱する方法が挙げられる。なお、後記実験例に示
されるように、かかる熱変性II型コラーゲンは、II型コ
ラーゲンα１鎖より低分子量の限定分解物を含有してい
る。

【００１３】本発明における他の変性II型コラーゲン
は、アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性（断片
化）させたII型コラーゲンである。アミノ酸配列を特異
的に認識する薬剤で変性（断片化）する手段としては、
種々の物質及びその切断部位が知られており、それら変
性薬剤の市販品を利用することができる。その一例を示
せば、次のとおりである（なお、切断部位は↓で示
す）。化学薬剤としては、ヒドロキシルアミン：Asn↓G
ly、蟻酸：Asp↓Pro、酢酸：Asp↓Pro、ＢＮＰＳ−スカ
トール：Trp↓、ｏ−ヨードソベンゾ酢酸：Trp↓などが
例示できる。酵素としては、キモトリプシン：Trp↓及
びTyr↓及びPhe↓、コラゲナーゼ：Pro−Ｘ↓Gly−Pr
o、エンドプロテナーゼLys-C：Lys↓、トロンビン：Arg
−Gly−Pro−Arg↓、トリプシン：Arg↓及びLys↓など
が例示できる。なお、これらの薬剤は単独または２種以
上を組み合わせて使用することもできる。また、上記の
薬剤の使用は常法に準じて行うことができ、また使用
量、反応温度等の条件も常法に準じて適宜設定すること
ができるが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分
間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３本が
撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造
を解き、その後に上記の薬剤を作用させるのが好まし
い。更に、変性（断片化）後に使用した薬剤を除去又は
失活させる場合、当該方法は当業者に周知の方法で行う
ことができ、例えば、加熱、透析、限外濾過、イオン交
換体処理、ｐＨ調整などが例示される。

【００１４】かくして熱変性されたII型コラーゲン又は
アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させたII型
コラーゲン（以下、便宜上、これらを合わせて、変性II
型コラーゲンという）は、そのまま本発明の治療剤又は
機能性食品に利用することができ、また慣用のペプチド
精製法(例えば、塩析、透析、ゲル濾過、限外濾過、イ
オン交換クロマトグラフィ等)を用いて精製した後に使
用してもよい。また、凍結乾燥などの手段により粉末化
して使用してもよい。

【００１５】上記の変性II型コラーゲンは、免疫原性が
低減されていると共に、未変性のII型コラーゲンに比べ
て免疫寛容原性が向上しているという特長を有する。更
に、生体成分であるII型コラーゲンの変性物であること
から、安全性が高いと推定される。これらの点について
は、後記の実験例に示されるように、変性II型コラーゲ
ンを経鼻投与したマウスを未変性II型コラーゲンで免疫
しても、ＣＩＡの発症率、発症指数及び発症足の割合の
上昇が著しく抑制・遅延された。

【００１６】また、２００μｇのような高投与量で熱変
性II型コラーゲンを経鼻投与した場合、抗原特異的抗体
（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）の産生は抑制
されていると共に、炎症性のサイトカインであるＩＦＮ
−γの産生も抑制されていた。このような現象は、アナ
ジー(anergy)又はクローン麻痺として知られている。ま
た、熱変性II型コラーゲンの０．２（又は２もしくは２
０）μｇという少量を吸入させた場合、ＩｇＧ１の産生
は維持されているが、炎症反応と関係があるとされてい
るＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生が抑制されていた。
更に、抗炎症性のサイトカインであるＩＬ−１０の産生
が増強されていた。このような状態は、アクティブ・又
はバイスタンダー・サプレッションとして知られてい
る。更に、本発明者等は、本発明の変性II型コラーゲン
は、加熱処理や薬剤処理により低分子量化すると共にII
型コラーゲン分子の螺旋型立体構造が崩壊した構造を有
すると考えている。Ｂリンパ球によって造られる抗体
は、II型コラーゲンの螺旋状の立体構造を認識して結合
するので、本発明者等は、螺旋構造を破壊した変性II型
コラーゲンは、未変性II型コラーゲンに比べて副作用な
どが少なく、安全であると考えている。

【００１７】なお、II型コラーゲンの変性方法は上記の
例に限定されるものではなく、適宜変更して実施するこ
とができる。例えば、製造工程上で加熱殺菌を必要とす
る製品（例えば、食肉加工食品、水産加工食品等の食
品、牛乳等の乳製品、果汁、茶等の飲料、液状医薬品、
経腸輸液等の医薬品など）において、原料に未変性II型
コラーゲンを添加し、加熱処理により熱変性II型コラー
ゲンを生成させることにより、製品中に熱変性II型コラ
ーゲンを含有させてもよい。また、II型コラーゲンを含
有する原材料（例えば、家畜などの関節軟骨等）から、
熱水抽出法により熱変性II型コラーゲン含有物（例え
ば、スープ等）を調製することもできる。

【００１８】本発明のＲＡ治療剤は、上記の変性II型コ
ラーゲンを有効成分とするものであり、ＲＡの治療・予
防を目的として経口投与（経鼻投与、経腸投与及び経粘
膜投与をも含む）される。投与に際しては、有効成分を
経口投与に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混
合して、慣用の医薬製剤の形態で投与され、このような
製剤としては、例えば、経口剤（例えば、錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳
剤等の液剤、凍結乾燥製剤など）、吸入剤、坐薬、経腸
輸液等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段に
より調製することができる。上記の医薬用無毒性担体と
しては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マ
ンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエ
チレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレ
ングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水等が挙
げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤
剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加するこ
とができる。本発明のＲＡ治療剤において、有効成分の
投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与
スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定され
るが、例えば、１日当り0.05μｇ〜5ｇ／ｋｇ体重程度
とされ、１日数回に分けて投与してもよい。

【００１９】また、本発明の機能性食品は、前記の変性
II型コラーゲンを含有することからなり、そのまま、又
は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せし
めて、ＲＡの治療及び予防に有用な機能性食品（又は食
品素材）として食される。例えば、上述した適当な助剤
を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形
態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト
等に成形して食用に供してもよく、また種々の食品（例
えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、
ちくわ等の水産加工食品、パン、バター、粉乳など）に
添加して使用されたり、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の
飲物に添加して使用してもよい。かかる機能性食品の形
態における変性II型コラーゲンの摂取量は、年齢、体
重、症状、疾患の程度、食品の形態等により、適宜選択
・決定され、例えば、１日当り0.05μｇ〜5ｇ／ｋｇ体
重程度とされるが、変性II型コラーゲンは多量に摂取し
ても生体に悪影響を与えない利点を有することから、そ
れ以上の量を摂取してもよい。

【００２０】

【発明の効果】前述のように、ＲＡの発病メカニズムは
II型コラーゲンを抗原とする自己免疫疾患であると考え
られいる。本発明で用いられる変性II型コラーゲンは、
高い経口免疫寛容原性を有するので、本発明の治療剤を
投与又は本発明の機能性食品を摂取することにより、免
疫応答が抑制され、ＲＡの治療及び予防を行うことがで
きる。従って、本発明によれば、ＲＡの予防を図ること
ができると共に既に発病しているＲＡの治療に利用する
ことができる。更に、経口投与（経鼻投与、経腸投与及
び経粘膜投与をも含む）や経口摂取によりＲＡの治療・
予防を図ることができ、簡便性且つ安全性に優れる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例及び実験例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。 実験例１熱変性コラーゲンの調製 ウシ由来II型コラーゲンのクエン酸溶液（ｐＨ３．０）
を、６５℃で１５分間の加熱又はオートクレーブ中で加
熱（１２１℃、１５分間）して変性させ、変性コラーゲ
ンを得た。以下、便宜上、６５℃で１５分間変性させた
II型コラーゲンを「変性コラーゲンＡ」と、オートクレ
ーブ（１２１℃、１５分間）で変性させたII型コラーゲ
ンを「変性コラーゲンＢ」と称する。

【００２２】実験例２アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で処理することに
よる変性（断片化）II型コラーゲンの調製 ウシ由来II型コラーゲンを０．１Ｍ炭酸アンモニウム溶
液に分散させ（濃度；１ｍｇ／ｍｌ）、５０℃で３０分
間加熱した。これにトリプシン(TPCK-Trypsin、Sigma社
製）を加え(II型コラーゲンに対して２％)、３７℃１時
間作用させた。そして、１２Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨ
３．０に調整し、４℃にて１晩放置して酵素反応を停止
させた。その後に、限外濾過（Centriprep3、アミコン
社製）を行い、II型コラーゲンの未切断物及びトリプシ
ンを取り除いて、酵素で変性（断片化）したII型コラー
ゲンを調製した。以下、便宜上、上記に準じてトリプシ
ンで変性したII型コラーゲンを「変性コラーゲンＣ」と
称する。

【００２３】実験例３ＣＩＡ（コラーゲン誘導性関節炎）発症抑制試験（１） 方法 ＤＢＡ／１系マウスに免疫７日前にウシ由来変性コラー
ゲンＡ、Ｂ及びＣの１０ｍＭクエン酸溶液（コラーゲン
含量：２００μｇ）を鼻腔より麻酔下にて吸入させた。
０日目に未変性II型コラーゲンとフロインド完全アジュ
バントで免疫し、更に２１日目に未変性II型コラーゲン
とフロインド不完全アジュバントで追加免疫して、ＣＩ
Ａを発症させた。なお、比較例及び対照として、上記の
変性コラーゲンに代えて、未変性II型コラーゲン２００
μｇ（比較例）、１０ｍＭクエン酸（対照）を吸入させ
た。 結果 各群のＣＩＡ発症日数を比較し、Mann-Whitney u検定を
行った。その結果を表１に示す。表１に示されるよう
に、未変性II型コラーゲンでは免疫寛容現象は認められ
ないが、変性コラーゲンＡ、Ｂ及びＣにおいてはＣＩＡ
の発症が遅延し、明確な免疫寛容が認められた。また、
オートクレーブを用いて過酷な条件下に変性を施された
変性コラーゲンＢの方が、また５０℃で３０分間加温
し、α１(II)型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさって
なるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解きほぐした
後に、アミノ酸配列のうちアルギニン及びリジンのＣ末
端を特異的に認識し、切断するトリプシンを作用させて
得られた変性コラーゲンＣの方が、変性コラーゲンＡよ
りも免疫寛容原性は強いことが判明した。

【００２４】

【表１】 ａ：ｐ＜０．０２， ｂ：ｐ＜０．００５

【００２５】実験例４ＣＩＡ発症抑制試験（２） 方法 ＤＢＡ／１系マウスに免疫３１日前から１日前までトリ
由来変性コラーゲンＡ及びＢの凍結乾燥粉末を餌と混合
（４％）して給餌した。ＣＩＡの発症は実験例２と同様
な方法で行った。なお、比較例及び対照として、上記コ
ラーゲンに代えて、未変性II型コラーゲン（比較例）及
びカゼイン（対照）を同量餌に混合して給餌した。 結果 各群のＣＩＡ発症率（％）を観察日ごとに比較し、Mann
-Whitney u検定を行った。その結果を図１に示す。な
お、ＣＩＡ発症率（％）は、各マウスの四肢において、
少なくとも関節炎評価１以上の肢を一つでも認めると
き、これを関節炎マウスとみなし、この関節炎マウス匹
数を各群マウス匹数で割ったものをＣＩＡ発症率（％）
とした。図１に示されるように、未変性II型コラーゲ
ン、変性コラーゲンＡ及びＢにおいて有意（ｐ＜０．０
１）にＣＩＡの発症が抑制され、明確な免疫寛容が認め
られた。また、未変性II型コラーゲンよりも変性コラー
ゲンＡの方が免疫寛容原性は強く、更にオートクレーブ
を用いて過酷な条件下に変性を施された変性コラーゲン
Ｂの方が変性コラーゲンＡよりも免疫寛容原性が強いこ
とが判明した。

【００２６】実験例５変性II型コラーゲン経鼻投与によるＣＩＡ発症抑制試験
（投与量の影響） 方法 ＤＢＡ／１系マウスに免疫７日前にウシ由来変性コラー
ゲンＢの０．２、２、２０及び２００μｇ（何れも１０
ｍＭクエン酸溶液）を鼻腔より麻酔下にて吸入投与し
た。０日目に未変性II型コラーゲン（２００μｇ）とフ
ロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）で免疫し、
更に２１日目に未変性II型コラーゲン（２００μｇ）と
フロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）で追加
免疫して、その日以降のＣＩＡ発症の様子を観察した。
なお、対照として、上記の変性コラーゲンＢに代えて、
１０ｍＭクエン酸のみを吸入させた。

【００２７】結果 試験結果を図２及び図３に示す。図２は発症指数の変化
を示し、ここで発症指数とは、関節炎の症状（足の腫
れ）を常法に従って各足ごとに０〜３までの評点で評価
し、各マウスについて４足の評点を合計して合計点を求
め、各マウスの合計点の平均値をとったものである。ま
た、図３は発症足の割合（％）であり、関節炎を発症し
た足を合計し、全体の足の数で除して得た割合である。
図２及び図３に示されるように、対照（即ち、変性コラ
ーゲンＢを事前に経鼻投与せずに、０日目及び２１日目
に未変性II型コラーゲンで免疫した試験群）では、追加
免疫直後から経時的にＣＩＡの発症指数及び発症足の割
合が上昇した。それに対して、変性コラーゲンＢを２０
０μｇ吸入させた場合には、対照に比べて明らかに、Ｃ
ＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇は著しく抑制、
遅延された。この抑制傾向は、２０及び２μｇの変性コ
ラーゲンＢを吸入させた場合にも、用量依存的に認めら
れた。また、０．２μｇの変性コラーゲンＢを吸入させ
た場合には、２００μｇを吸入させた場合と同程度に、
ＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇が著しく抑
制、遅延された。

【００２８】実験例６変性II型コラーゲン経鼻投与が血清中の抗II型コラーゲ
ン抗体価（サブクラス）に及ぼす影響 本試験では、変性II型コラーゲン経鼻投与が抗体（サブ
クラス）プロファイルに及ぼす影響を調べた。即ち、Ｉ
ｇＧのサブクラスＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂはそれぞれ炎
症反応に不可欠な補体との結合能があるので、関節炎の
症状と関係があるとされている。また、ＩｇＧ２ａの産
生は、関節炎発症中の関節滑膜中に多く存在するＴ細胞
（Ｔｈ１タイプ）の産生するＩＦＮ−γとも密接な関係
がある。すなわち、特定の抗原に対する血清中のＩｇＧ
２ａ産生量の低下は、当該抗原に対するＴｈ１タイプの
反応が全身性に低下していることを示唆するものと考え
られている。

【００２９】方法供試血清の採取 上記実施例５の実験に平行して、免疫後２８日目（即
ち、追加免疫後７日目）に試験マウス及び対照マウスか
ら採血し、血清を採取した後、下記の方法で抗II型コラ
ーゲン抗体価（サブクラス）を測定した。ＥＬＩＳＡによるＩｇＧサブクラスの測定 プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ製）に未変性II
型コラーゲン（５μｇ／ウエル）を吸着させ、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで洗浄した後に、適宜希釈したマウスの血清
を加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後にアル
カリフォスファターゼ標識したウサギ抗マウス抗体（抗
マウスＩｇＧ１、抗マウスＩｇＧ２ａ、又は抗マウスＩ
ｇＧ２ｂ、何れもＺＹＭＥＤ製）を加えた。ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで洗浄し、その後に基質溶液（パラニトロフェ
ノール２リン酸、東京化成製）を加えた。３０分間放置
後、５Ｎ ＮａＯＨを加えて、反応を停止させ、４０５
ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４に示
す。

【００３０】結果 対照（即ち、変性コラーゲンＢを事前に経鼻投与せず
に、０日目及び２１日目にII型コラーゲンで免疫した試
験群）では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが産
生されていた。その結果は、図２及び３に示すＣＩＡの
発症指数及び発症足の割合の上昇と対応していた。それ
に対して、変性コラーゲンＢ ２００μｇを吸入させた
場合には、対照に比べて明らかに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２
ａ及びＩｇＧ２ｂの産生が抑制されていた。その結果
は、図２及び３に示すＣＩＡの発症指数及び発症足の割
合の上昇の抑制と対応していた。また、変性コラーゲン
Ｂ ２０、２又は０．２μｇを吸入させた場合には、対
照に比べて、ＩｇＧ１の産生は抑制されていなかった。
一方、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生は、対照に比べ
て抑制されていた。特に、０．２μｇを吸入させた場合
のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生の抑制の程度は、２
００μｇを吸入させた場合と同程度であり、図２及び３
に示すＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇の抑制
と対応していた。これらのことから、変性コラーゲンＢ
の２０、２又は０．２μｇ（特に、０．２μｇ）の投与
は、補体との結合能から、関節炎の症状に関与するとさ
れるＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生を抑制するという
効果を奏する。さらには、変性コラーゲンＢの２０、２
又は０．２μｇの投与は、ＩｇＧ１の産生能自体は抑制
しないので、外来異物を認識し排除する機能を有する抗
体産生能自体を抑制することはないという効果を奏す
る。

【００３１】実験例７変性II型コラーゲンを経鼻投与したマウスより分離した
リンパ球の産生するサイトカイン（変性II型コラーゲン
刺激の影響） 本試験では、炎症と関連するとして知られているサイト
カイン（ＩＦＮ−γとＩＬ−１０）を測定し、変性II型
コラーゲン刺激の影響を調べた。なお、ＴＧＦ−βやＩ
Ｌ−１０は抗炎症性（抑制性）のサイトカインとして知
られており、実際のＲＡにおいても重要な免疫学的調節
機能を果たすとも報告されている(J. Exp. Med. 179, 1
5617-15627, 1994)。

【００３２】方法リンパ球の分離と培養 前記実験例５の実験と同様に、ＤＢＡ／１系マウスに免
疫７日前にウシ由来変性コラーゲンＢの０、０．００
２、０．０２、０．２、２、２０及び２００μｇを鼻腔
より麻酔下にて吸入させた。そして、０日目に未変性II
型コラーゲン（１００μｇ）とフロインド完全アジュバ
ント（ＤＩＦＣＯ製）をマウス足蹠部に免疫した。そし
て、１０日目に、膝下リンパ節を摘出し単一細胞懸濁液
を調製し、９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ製）に播腫し
た（１×１０⁶／ウエル）。各ウエルに無血清培地（X-v
ivo20、BIOWHITTAKER製）を加え、さらにII型コラーゲ
ン（最終濃度；５００μｇ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ₂
条件下で３日間培養し、培養上清を得た。同様に、II型
コラーゲンを添加せずに培養し、又はII型コラーゲンを
添加せずにコンカナバリンＡ（最終濃度；５μｇ／ｍ
ｌ）を添加して培養し、それぞれの培養上清を得た。な
お、コンカナバリンＡはＴ細胞のマイトージェンであ
り、全てのＴ細胞に抗原非特異的に刺激を与えるため、
陽性対照として用いた。

【００３３】サンドイッチＥＬＩＳＡによるサイトカイ
ンの測定 プレート(Maxisorp、NUNC製)に抗マウスサイトカイン・
ラット単クローン抗体（抗マウスＩＬ−１０抗体：ＪＥ
Ｓ５−２Ａ５、抗マウスＩＦＮ−γ抗体：ＲＡ−６Ａ
２、いずれもPHARMINGEN製）をコーティング（５０μｌ
／ウエル）し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、３％Ｂ
ＳＡ加ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにてブロックした。そして、
適宜希釈した上記の培養上清を加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎにて洗浄した後に、ビオチン標識した抗マウスサイ
トカイン・ラット単クローン抗体（抗マウスＩＬ−１０
抗体：ＳＸＣ−１、抗マウスＩＦＮ−γ抗体：ＸＭＧ
１．２、いずれもPHARMINGEN製）を加えた。ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで洗浄した後に、アビジン化アルカリフォスフ
ァターゼ（ＺＹＭＥＤ製）を加えた。更にＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで洗浄し、その後に基質溶液（パラニトロフェノ
ール２リン酸、東京化成製）を加えた。６０分間放置
後、５Ｎ ＮａＯＨを加えて、反応を停止させ、４０５
ｎｍにおける吸光度を測定し、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１
０の産生量を測定した。対照（変性コラーゲンＢ投与量
０）に対するＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０の産生量の傾向
を表２に示す。

【００３４】

【表２】 ↑↑：対照に対して明らかに産生が促進される。 ↑：対照に対して産生が促進される傾向にある。 →：対照に対して差異が認められない。 ↓：対照に対して抑制される傾向にある。 ↓↓：対照に対して明らかに産生が抑制されている。

【００３５】結果 培地にコンカナバリンＡを添加した場合（陽性対照）に
は、マウスより採取したリンパ球の均一な増殖が観察さ
れた。一方、II型コラーゲンを培地に添加した場合に
は、コラーゲンに反応するリンパ球がコロニーを形成し
て増殖した。このコラーゲン反応性のリンパ球における
サイトカイン産生を測定したところ、次のような結果が
得られた。ＩＦＮ−γについては、変性コラーゲンＢの
２００μｇを吸入させたマウスより採取したリンパ球を
II型コラーゲンとともに培養した場合には、変性コラー
ゲンＢを吸入させなかったマウス（対照）より採取した
リンパ球を同様に培養した場合に比べて、炎症を増悪さ
せるＩＦＮ−γの産生が抑制されていた。ＩＬ−１０に
ついては、変性コラーゲンＢの０．００２、０．０２、
０．２又は２μｇを吸入させたマウスより採取したリン
パ球をII型コラーゲンとともに培養した場合には、変性
コラーゲンＢを吸入させなかったマウス（対照）より採
取したリンパ球を同様に培養した場合に比べ、抗炎症作
用を有するＩＬ−１０の産生が促進されていた。特に、
変性コラーゲンＢの０．２又は０．０２μｇを吸入させ
たマウスより採取したリンパ球をII型コラーゲンととも
に培養した場合には、ＩＬ−１０の産生が促進されてい
た。

【００３６】実験例８熱変性物の検討 熱変性物の性状を検討するために、１０ｍＭクエン酸水
溶液（ｐＨ３．０）に、トリ由来II型コラーゲンを０．
１、０．３及び１．０％となるように溶解し、６５℃２
０分間、１００℃２０分間及びオートクレーブ（１２０
℃２０分間）の加熱変性を行い、得られた変性液を電気
泳動に付した。その結果を図５に示す。図５において、
Ａはオートクレーブ（１２０℃２０分間）処理コラーゲ
ン、Ｂは１００℃２０分間処理コラーゲン、Ｃは６５℃
２０分間処理コラーゲン、Ｄは未変性のコラーゲンを示
し、各サンプルの３つのレーンは左側から０．１、０．
３及び１．０％のコラーゲン濃度である。また、左右両
端のレーンは分子量マーカーである。図５に示されるよ
うに、未変性II型コラーゲンはα１鎖（ＭＷ：100,000)
のみから構成されているが、加熱変性により低分子量成
分が増加し、１００℃２０分間及びオートクレーブ（１
２０℃２０分間）の加熱変性を行った場合には、α１鎖
は消失していた。このことから、限定分解された低分子
成分が免疫寛容原として作用していることが示唆され
た。ウシ由来II型コラーゲンについて、同様な実験を行
ったところ、図５と同様な電気泳動パターンが得られ
た。また、ウシ由来変性コラーゲンＣについて、同様な
電気泳動実験を行ったところ、αｌ鎖が消失するととも
に、オートクレーブ（１２０℃、２０分間）処理物より
も更に低分子化され、分子量10,000以下の成分として検
出された。このことから、限定分解された低分子成分が
免疫寛容原として作用していることが示唆された。

【００３７】実験例９ 実験例１におけるクエン酸溶液に代えて水酸化ナトリウ
ム溶液（ｐＨ１１．０）を用いる以外は実験例１と同様
にして熱変性を行い、熱変性II型コラーゲンを調製し
た。

【００３８】実施例１ ウシ由来変性コラーゲンＡ ０．５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ５ ｍｇ コーンスターチ ２０ ｍｇ 乳糖 １７４．５ｍｇ 常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型
し、錠剤を得た。

【００３９】実施例２ ニワトリ由来変性コラーゲンＢ ０．５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ５ ｍｇ 乳糖 １９４．５ｍｇ 常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬
カプセルに充填し、カプセル剤を得た。

【００４０】実施例３ ウシ由来変性コラーゲンＣ ０．５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ５ ｍｇ 乳糖 １９４．５ｍｇ 常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬
カプセルに充填し、カプセル剤を得た。

【００４１】実施例４ 天然果汁（濃縮果汁還元）に、ウシ由来変性コラーゲン
Ｂを天然果汁２００ｍｌ当り０．５ｍｇの割合で混合し
た後、常法に準じて殺菌し、アセプティック包装して、
果汁製品を得た。

【００４２】実施例５ ウインナソーセージ用練り肉に、ウシ由来変性コラーゲ
ンＢを当該練り肉１５ｇ当り３０μｇの割合で混合した
後、常法に準じてソーセージケーシングに充填し、燻煙
し、殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得
た。

【００４３】実施例６ ウシ由来変性コラーゲンＢに代えて、ウシ由来変性コラ
ーゲンＣを用いる以外は実施例４と同様にしてウインナ
ソーセージを得た。

【００４４】実施例７ ニワトリ胸骨軟骨（通称、ヤゲン軟骨）１５０ｇに水１
０００ｍｌを加え、タマネギ、ニンジン、パセリ、セロ
リ、ショウガなどの香味野菜、及び粒コショウを加え
て、煮立て、弱火にて３時間加熱した。冷却後、ストレ
ーナーで濾過し、塩、コショウで調味し、トリスープを
得た。なお、同スープについて、電気泳動実験を行った
ところ、図５のＢと同様の泳動像が観察された。また、
抗トリII型コラーゲン・ウサギ抗体を用いて、ウエスタ
ン ブロッティング実験を行ったところ、染色像が観察
された。これらのことから、当該トリスープ中には、変
性II型コラーゲンが含有されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例４におけるＣＩＡの発症率を示す図であ
る。

【図２】実験例５におけるＣＩＡの発症指数を示す図で
ある。

【図３】実験例５におけるＣＩＡの発症足の割合を示す
図である。

【図４】実験例６における、II型コラーゲンに対する抗
体のサブクラス別の抗体産生量を示す図である。

【図５】実験例８におけるII型コラーゲン熱変性物の電
気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中上 辰芳 茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番 日本ハ ム株式会社中央研究所内 (72)発明者 飴谷 章夫 東京都文京区西片１−１−５パークハイム 文京西片501 (72)発明者 上野川 修一 埼玉県春日部市増田新田400−８

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変
   性させたII型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認
   識する薬剤で変性させたII型コラーゲンを有効成分とし
   て含有する経口慢性関節リウマチ治療剤。
2. 【請求項２】 熱変性させたII型コラーゲンが、II型
   コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を
   行って得たものである請求項１記載の経口慢性関節リウ
   マチ治療剤。
3. 【請求項３】 アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤
   で変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０
   ℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリ
   ペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲン
   の螺旋状の立体構造を解き、その後に、アミノ酸配列を
   特異的に認識し、切断する薬剤を作用させて得たもので
   ある請求項１記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
4. 【請求項４】 II型コラーゲンが、ウシ、ブタ、ヤ
   ギ、ヒツジ、ウマ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラッ
   ト等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等
   の鳥類、カメ、ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サ
   ケ、サメ、エイ等の魚類由来である請求項１〜３の何れ
   かに記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
5. 【請求項５】 製剤形態が、経口投与製剤、経鼻投与
   製剤、経腸投与製剤又は経粘膜投与製剤である請求項１
   〜４の何れかに記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
6. 【請求項６】 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変
   性させたII型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認
   識する薬剤で変性させたII型コラーゲンを含有する機能
   性食品。
7. 【請求項７】 熱変性させたII型コラーゲンが、II型
   コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を
   行って得たものであり；またアミノ酸配列を特異的に認
   識する薬剤で変性させたII型コラーゲンが、II型コラー
   ゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１
   （II）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII
   型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、ア
   ミノ酸配列を特異的に認識し、切断する薬剤を作用させ
   て得たものである請求項６記載の機能性食品。