JP2004521076A - シグナルコード障害の回復に使用するためのトロンボモジュリン類似体 - Google Patents

Abstract

本発明は、外傷によって誘発された脊髄障害を治療するための、トロンボモジュリン類似体の使用に関する。

Description

【０００１】
本出願は、２０００年８月３１日に提出された米国の仮出願Ｎｏ．６０／２２９，７１４の恩典を請求するものであるが、ここで、この出願は全く参考のためにのみ記載されているものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、哺乳類における脊髄損傷に付随する神経障害の治療におけるトロンボモジュリン類似体の使用方法に関する。
【０００３】
背景技術
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、細胞膜糖タンパク質である。ヒトにおいては、血管およびリンパ管の内皮上に広範囲に分布している。その生理学的重要性については、数多く研究されている（たとえば、Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）、２５７：８５９−８６４；Ｓａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９８３）、２５９：１２２４６−１２２５１参照）。
【０００４】
トロンボモジュリンは、トロンビンのための受容体として、凝固カスケードにおける中心的酵素として機能する。遊離している場合には、トロンビンは、フィビリノゲンをフィブリンに変換することによって直接的にか、あるいは凝固カスケード（たとえば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子）中で他のタンパク質の活性化を介し、さらには血小板の活性化することによって間接的に凝固作用を促進させる。しかしながら、トロンボモジュリンと結合した場合には、このトロンビン−トロンボモジュリン複合体が、プロテインＣを活性化させ活性化プロテインＣにし、その後に本質的な補因子である第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子（Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９１）， ６１４： ３０−４３）をタンパク分解的に不活化させることによって、凝固カスケードをダウンレギュレーションさせ、結果として増加した抗凝固活性を生じる。さらに、トロンビン−トロンボモジュリン複合体は、トロンビンによって活性化されうる繊維素溶解抑制因子（ＴＡＦＩ）を活性化させ、これが活性化される場合には、繊維素溶解が抑制される。しかしながら、以前の研究においては否定的であり、より最近の研究においては、トロンボモジュリンが、脳内皮細胞中ばかりでなく（Ｂｏｆｆａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｕｖ． Ｒｅｖ． Ｆｒ． Ｈｍａｔｏｌ． （１９９１）， ３３：４２３−９； Ｗｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． （１９９１）， ５５６：１−５； Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９７）， １７： ３１３９−４６； Ｔｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｒｅｏｋｅ （１９９６）， ２７： ２３０４−１０； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２３１０−１）、アストロサイト表面上で発現し、ここで、トロンビンとの複合体を形成することによって、血管中でのその役割と同様に、プロテインＣを活性化する機能を有することが示された（Ｐｉｎｄｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉｓ （１９９７）， １９： ２５９−６８）。また、トロンボモジュリンは、ＣＮＳ中の反応性アストロサイト中で、機械的損傷と呼応してアップレギュレーションする（Ｐｒｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０００）， ２０： ２５４３−５０）。最近の報告においては、組換えトロンボモジュリンが他の受容体、培養された神経細胞中でのプロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ−１）（Ｓａｒｋｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． （１９９９）， ８２： １０７１−７７）のトロンビン活性化をブロックすることが示唆されている。
【０００５】
また、活性化プロテインＣは、種々のサイトカインまたは活性化白血球を含む炎症性応答の調節に強く関与している（Ｅｓｍｏｎ ｓｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． （１９９１）， ６６：１６０−１６５）。この仮説と一致して、研究において、活性化プロテインＣが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の生成を抑制することによって、エンドトキシンを投与されたラットにおける肺血管障害を予防することが示されており、この場合、これは、潜在的に好中球を活性化するものである（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ（１９９６）， ８７：６４２−６４７； Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９６）， ２７２： Ｌ１９７−２）。組換えヒト可溶性トロンボモジュリンはさらに、エンドトキシンによって誘発された肺血管障害を、プロテインＣの活性化による好中球の活性化抑制によって予防する（Ｕｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９６）， ２７１： Ｌ４７０−５； Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９７）， ２７３：Ｌ８８９−９４）。
【０００６】
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、生活における長期の身体障害を生じる深刻な状態である（Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒａｐｌｅｇｉａ （１９８７）， ２４：２２５−２２８）。これに関しては、現在では制限された治療方法のみが使用可能とされている（Ｂｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． （１９９０）， ３２２： １４０５−１４１１）。実際に、手術以外において、最も一般的に認められているＳＣＩ後の介入方法は、ステロイド、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）の投与である（Ｈａｌｌ， Ｅ．Ｄ．， Ａｄｖ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９３）， ５９： ２４１−８； Ｂｒａｃｋｅｎ， Ｍ．Ｂ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． （２０００）， ９３：１７５−９； Ｂｒａｃｋｅｎ， Ｍ． Ｂ．， Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ． Ｒｅｖ．２ （２０００）； Ｋｏｓｚｄｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ （２０００）， ９２： １５６−６３）。しかしながら、試験後１０年にたっても、この治療はなおもかなりの物議をかもしており、かつ現在における後（ｍｅｔａ）分析では、ＭＰでの治療が実際には禁忌でありうると指摘している（Ｈｕｒｂｅｒｔ， Ｒ． Ｊ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． （２０００）， ９３： １−７；Ｐｏｉｎｔｉｌｌａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ （２０００）， ３８：７１−６； Ｌａｎｋｈｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． （２０００）， ８５９： ３３４−４０）。
【０００７】
ＳＣＩの病態生理学は、機械的な一次障害および遅延して生じる二次的神経障害を含む（Ｔａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． （１９９１）， ７５： １５−２６）。一次障害が外傷の状況によって決定されるのに対して、二次障害の克服は、治療的調整に左右される。二次障害プロセスに含まれるメカニズムは完全には知られていないが、内皮損傷を導く炎症反応が影響していると考えられ（Ｄｅｍｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃ． （１９７８），２： ６７７−６８０）、この場合、これは治療的介入の標的として役立つ領域である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は現在において、好中球を活性化させることによって、ラットで圧迫性外傷によって誘発されたＳＣＩで、重要な役割を有することが示された（Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７）， ７９： １１７７−１８２； Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｒｏｔｒａｕｍａ （２０００）， １７：２１９−２９）。さらに、活性化プロテインＣが、圧迫性外傷によって誘発されたＳＣＩの重症度を、ＴＮＦ−α生成を抑制することによって軽減させることが報告された（Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （１９９８）， １８： １３９２−１３９８）。研究によって、組換え可溶性トモンボモジュリンが、圧迫性外傷によって誘発されたＳＣＩを、ラットＳＣＩモデルにおいて、障害の部位でＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の減少によって、白血球蓄積を抑制することによって予防することが示された（Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ （２０００）， ８３： ４６２−４６８）。これらの観察によって、さらにトモンボモジュリンが、プロテインＣの活性化によって打撲性外傷により誘発されたＳＣＩを予防することが示唆され、その際、ＴＮＦ−α生成抑制が生じる。現在では、ヒトＳＣＩのために、打撲傷または鋼球落下（ｗｅｉｇｈｔ−ｄｒｏｐ）によるラットモデルによって立証されている（Ｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （２０００）， １７： １−１７）。
【０００８】
特定の可溶性トロンボモジュリン組成物が、ラットモデルにおいてＳＣＩに引き続いて生じる神経障害の減少において効果的であり、したがって、哺乳類におけるこのような神経障害の治療において有用であることが開示されている。天然タンパク質の活性のすべてでないにしてもほとんどを保持するトロンボモジュリンの可溶性類似体が製造された。さらに、抗酸化性、タンパク分解耐性を有するか、または循環の範囲内でより長い半減期を有するように改変されたトロンボモジュリンの可溶性類似体が開発され、かつ、ＵＳ特許第５２５６７７０号、第５８６３７６０号および第５４６６６６８号明細書中で記載されている。これらの文献は、ここで参考のためにのみ記載する。前記組成物は以前から抗血栓薬として有用であると記載されている。しかしながら、ＳＣＩに引き続いて生じる神経障害の改善のための治療薬としての、これらの組成物の有用性についてはいずれにも開示されていない。
【０００９】
発明の形態
本発明による一つの態様は、ＳＣＩによって引き起こされる神経障害を治療するための方法に関するものであり、この場合、この方法は、抗酸化性であり、３８８位でメチオニンがロイシンに置き換えられている、可溶性の組み換えトロンボモジュリン類似体の治療的効果量を、これを必要とする哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含み、この場合、この類似体は、天然トロンボモジュリンによって番号付けされているものである（配列番号２）。
【００１０】
本発明の他の態様は、プロテアーゼによる分解に耐性を示すか、および／またはグリコシル化の修飾されたパターンを示す付加的な修飾を含むトロンボモジュリン類似体を使用するものである。
【００１１】
本発明の他の態様は、Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭとして公知のトロンボモジュリン類似体を使用し、この場合、この類似体は、天然トロンボモジュリンの配列（配列番号２）に対して、以下の位置での修飾を有するものである：アミノ酸１〜３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結。
【００１２】
本発明の他の態様は、哺乳類において脊髄損傷によって引き起こされる神経障害を治療するのに有用な医薬品組成物に関し、この場合、この医薬品組成物は、製薬学的助剤、および抗酸化作用を有し、かつ３８８位でメチオニンがロイシンに置換されている、可溶性組み換えトロンボモジュリン類似体の治療的効果量を含有し、この場合、この類似体は天然トロンボモジュリン（配列番号２）によって番号付けされているものである。
【００１３】
本発明の他の態様は、前記に示されたように修飾されている他のトロンボモジュリン類似体を含有する医薬品組成物に関する。
【００１４】
図の簡単な説明
図１は、天然トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号２）を、Ｓｕｚｕｋｉら（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ６：１８９１−１８９７の番号付け方法を用いて示す。
【００１５】
図２は、コントロールされた打撲性脊髄障害を有するラットにおける、Ｂａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｙおよびＢｒｅｓｎａｈａｎのオープンフィールド運動評価スケール（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅ）、いわゆる“ＢＢＢスケール”による神経機能評価の結果を示す。障害を有するラットは、例２に示したように障害の後に、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）によって助剤（塩溶液）またはＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭで処置した。
【００１６】
図３（ＡおよびＢ）は、軽い打撲性ＳＣＩ（２５ｇｍ．ｃｍ 外力）の１時間後に、塩溶液（コントロール）またはＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭを、腹腔内投与することによって処置された、脊髄損傷を有するラットからの組織標本の典型的なものを示す。この標本は、損傷を上部、その位置および下部から示す。図３Ａは、標本をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したものであり；図３Ｂは、標本をチオニンで染色したものである。
【００１７】
図４は、塩溶液（コントロール）で処置されたラットとＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭ中で処置されたラットとを比較した組織学的試験によって測定された損傷範囲の分析を示す。塩溶液処理コントロール群と比較して、Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭでの処理の場合に、損傷体積の約４０％の統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）が、アンペアード ｔ−検定で見出された。
【００１８】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書および請求の範囲において使用されている以下の用語は、特別に記載しないかぎり、次の意味を有する：
用語“残基”は、ペプチド中に組み込まれたアミノ酸を意味する。アミノ酸は天然由来のアミノ酸であってもよく、限定しない限りは、天然アミノ酸と同様に機能しうる天然アミノ酸の公知の類似体を包含する。開示の目的のために、アミノ酸残基は、本明細書中において許容される３字または１字の略記によって示されるか、あるいは、アミノ酸残基の存在を示す記号“ＡＡ”によって示される。アミノ酸は、以下の略記によって記載される。
【００１９】
第１表：アミノ酸命名法

開示の目的のために、アミノ酸置換が記載される場合には、置換は、天然のトロンボモジュリン（配列番号２）（ＴＭ）中で存在するアミノ酸、トロンボモジュリン配列の範囲内のアミノ酸の位置（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９８７）， ６：１８９１−１８９７の番号付け方法を用いて）に引き続いて、置換されるアミノ酸を明記することによって示され；すなわちＭ３８８Ｌは、３８８位でメチオニンをロイシンに置換したもであると理解される。
【００２０】
“天然のトロンボモジュリン”は、天然の全長タンパク質を意味する（配列番号２）。天然のトロンボモジュリンは、天然由来の多型を特定の残基で含有することが知られている。たとえば、４５５位において、天然アミノ酸の多様性が見出され、この場合、アラニンは８２％の回数（ｔｉｍｅ）およびバリンは１８％の回数で存在するものである（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｈｒｏｍ． Ｈａｅｍｅｏｓｔａｓｉｓ ６５：５１１−５１３）。本発明の目的のために、示された天然のトロンボモジュリン配列（図５；配列番号２）は、Ｓｕｚｕｋｉら、（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ ６：１８９１−１８９７によって記載されたように、４５５位でバリンを含有するものである。しかしながら、すべての天然由来の多型は、請求された類似体の範囲内に含まれる。生物学的活性が、天然のＴＭに関して記載される場合には、この用語は、デタージェント（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）可溶化水性形を包含する。しばしば、組成物の活性に関連して、トランスフェクトされた可溶性のポリペプチドは本質的に同一の性質を示していてもよい。
【００２１】
“トロンボモジュリン類似体”は、前記に示したように、本質的に天然ＴＭの生物学的活性を保持するペプチドであり、かつ天然ＴＭとは異なる分子構造を有する。たとえば、この用語は、天然トロンボモジュリン（配列番号２）と同一であるかまたはホモログのアミノ酸配列を有するタンパク質、不溶性および可溶性のトロンボモジュリンペプチドまたはフラグメント、および抗酸化性ＴＭの種に関し、この場合、これらすべてはトロンボモジュリン様の活性を有する。さらに、これらの化合物は、天然ＴＭと比較した場合に、タンパク質のプロテインＣ活性補因子特性をあまり減少させることのないアミノ酸変異を有する誘導体および分子を含む。
【００２２】
用語“ＴＭ変異体”は、示された置換（前記）かまたは示された修飾を含むＴＭ類似体に関する。
【００２３】
用語“ペプチド”および“ポリペプチド”は、α炭素が、一つのアミノ酸のα炭素カルボニル基と他のアミノ酸のアミノ基との間の縮合反応によって形成されたペプチド結合を介して結合されている、アミノ酸鎖に関する。したがって、鎖の一つの末端での末端アミノ酸（アミノ末端）は、遊離アミノ基を有し、その一方で、末端アミノ酸鎖の他の末端（カルボキシ末端）は、遊離カルボキシル基を有する。
【００２４】
用語“領域（ドメイン）”は、特定の機能または特性に付随しうる独立したアミノ酸配列に関する。典型的に、ドメインは、特徴的な第３の構造単位を示す。完全長のトロンボモジュリン遺伝子は、以下のドメインを含有する前駆体ペプチドをコードする：
第２表：ＴＭドメイン

Ｙｏｓｔら、Ｃｅｌｌ，（１９８３），３４：７５９−７６６およびＷｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｅｒｙ（１９８７），２６：４３５０−４３５７を参照のこと、この場合、これらの文献は参考のためにのみ記載しているものである。
【００２５】
“プロテアーゼ部位”は、認識部位、結合部位、切断部位またはプロテアーゼに対する活性感受性の部位を示す、ＴＭポリペプチド中の一つのアミノ酸または一連のアミノ酸に関し、この部位によって包含される一つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、他の一個または複数個のアミノ酸残基によって置換されるかまたは欠失する場合には、プロテアーゼによってもはやこの部位でＴＭを切断することができない。さらに、この用語は、プロテアーゼに対して特異的に感受性のＴＭ分子ドメインを包含し、この場合、これは、たとえば、構造的に暴露されることによってプロテアーゼに対して特異的に感受性であり、かつプロテアーゼ活性が可能なＴＭ分子の領域を包含する。
【００２６】
“プロテアーゼ切断部位”は、プロテアーゼがＴＭポリペプチド類似体を切断する正確な位置を意味する。
【００２７】
“一本鎖Ｎ−末端”および“一本鎖Ｃ−末端”は、機能的な組成物の性質示すそのままの意味を有し、たとえば、通常の配列化されたアミノ酸配列分析において、それぞれの変性サイクルによって、アミノ酸残基の除去を生じ、この場合、これは本質的に異なるアミノ酸残基が全くない。したがって、Ｎ−末端アミノ酸の数回、たとえば１０回に亘っての段階的な除去の後に、本質的に一つのみのアミノ酸がそれぞれの回において回収される。特に、配列における不均一性は全く検出されないのは、使用された分析工程による完全に純粋な一本鎖ポリぺプチドが統計的に予想されるのと同じである。
【００２８】
本明細書中で使用された、“天然トロンボモジュリン（配列番号２）の生物学的活性の本質的な保持”およびそれに類似する用語は、トロンボモジュリンが、天然の膜結合ＴＭ分子と生物学的活性を共有していることを意味する。一般に、タンパク質１ｍｇに対する単位当たりの活性は少なくとも約５０％、通常は７５％、典型的には８５％、より典型的には９５％、好ましくは１００％であり、かつ最も好ましくは天然のトロンボモジュリン（配列番号２）の活性１００％を上廻る。この生物学的活性は、プロテインＣのトロンビン介在型活性（ＡＰＣ）、活性化部分トロンボプラスチン凝固時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）、または任意のＴＭの生物学的な、好ましくは治療的活性であってもよい。比較となる天然のスタンダードは、ＴＭの全長膜結合領域であるが、しかしながら多くの場合において、レクチン／ＥＧＦ／Ｏ−結合領域（ＴＭ．ｓｓｕｂ．ＬＥＯ）を含有する可溶性ＴＭが、有利にはスタンダードとして使用される。
【００２９】
“グリコシル化部位”は、糖残基の付着箇所としての真核細胞によって認識されているアミノ酸残基を意味する。糖が付着しているアミノ酸は、典型的にはＡｓｎ（Ｎ−結合の糖に対して）、スレオニン残基またはセリン残基（Ｏ−結合の糖に対して）である。付着の特異的な部位は、典型的には、アミノ酸配列、たとえば、ほとんどのＮ−結合付着部位に関してはＡｓｎ−Ｘ−（ＴｈｒまたはＳｅｒ）によって、かつほとんどのＯ−結合付着部位に関しては（ＴｈｒまたはＳｅｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏによってシグナル化され、その際、Ｘは任意のアミノ酸である。グリコースアミノグルカンのための認識配列（硫酸化された糖の特別な型）は、一般的にはＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙであるが、しかしながらＸ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｖａｌであってもよい。Ｎ−結合およびＯ−結合の用語は、糖部分およびアミノ酸残基の間の付着部位として役立つ化学基を意味する。Ｎ−結合された糖は、アミノ基を介して付着しており；Ｏ−結合された糖はヒドロキシシル基を介して付着している。
【００３０】
“インヴィヴォ（Ｉｎ ｖｉｖｏ）循環半減期”は、哺乳類において投与された血漿活性をその半分に減少する平均的な時間を意味する。
【００３１】
“可溶性ＴＭ類似体”は、水性溶液中において可溶であり、かつ典型的には細胞によって分泌されうる。製薬学的投与のために、可溶性ＴＭ類似体または不溶性の類似体は、場合によってはリン脂質小胞体、デタージェント（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、または医薬品処方の当業者に公知の他の同様の化合物と組み合わせてもよい。本発明の好ましいＴＭ類似体は血流中において可溶であり、これによって、種々の抗凝固剤および他の治療薬中でのこの類似体を有用なものとする。ＴＭの可溶性を生じさせる修飾は、典型的には、天然のトロンボモジュリン（配列番号２）に関する多くの活性、たとえば、トロンビン結合性またはプロテインＣ活性化における活性にあまり影響しない。
【００３２】
“Ｏ−結合グリコシル化領域”は、第２表に示したように、天然トロンボモジュリン配列の４６３〜４９７として番号付けされたアミノ酸配列を示す。
【００３３】
“抗酸化性類似体”は、酸化剤、たとえば酸素ラジカル、クロロアミンＴ、過酸化水素または活性化好中球に暴露した後に本質的な生物学的活性の相当量を維持することが可能なトロンボモジュリンの類似体を示す。
【００３４】
“Ｓｏｌｕｌｉｎ ^ＴＭ”は、米国特許第５２５６７７０号明細書中で記載されたトロンボモジュリン類似体に関し、この場合、これは、天然のトロンボモジュリン配列（配列番号２）に対して以下の修飾を有しているものである：アミノ酸１〜３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０での終結。
【００３５】
“製薬学的助剤”は、無毒の医学的に許容可能な材料であり、この場合、これは、医学的治療法を補うために使用されている。これらの材料は、水および塩のように不活性であってもよいか、あるいは抗菌性および鎮痛性のように生物学的に活性であってもよい。
【００３６】
“減少させる能力”は、生物学的特性を統計学的に有意に減少させることを意味する。この特性については制限されることなく、かつ特性の測定および計量は標準的方法による。
【００３７】
“糖残基”は、グルコースアミンおよび他の炭水化物誘導体、ならびにタンパク質と共有結合する部分を含有するヘキソースおよびペントース炭水化物を意味する。
【００３８】
“スルフェート置換基”は、ペントースまたはヘキソース糖上の硫酸含有置換基である。
【００３９】
“フィブリノーゲンのフィブリンへのトロンビン介在型変換”は、トロンビンが、タンパク質のフィブリノゲンを分解することによってフィブリンモノマーにすることを意味し、この場合、これは、その後に重合することによって血餅を形成する。
【００４０】
“血栓性障害”は、一つまたはそれ以上のトロンビンの形成によって特徴付けされる哺乳類における病理学的状態を意味し、この場合、これらは、哺乳類の健康を害しうる。
【００４１】
“ＳＣＩ”は、脊髄およびその周囲が受ける外傷的障害を意味する。これは、打撲および／または圧迫による損傷、さらには切断による損傷をも含む。本発明の利用を想定した試験で使用されたモデルは、打撲性のものであり、この場合、これは、自動車事故および／またはスポーツ関連の損傷においてヒトが受けるＳＣＩの型としては最も多いものである。すべてのＳＣＩは、完全にかまたは部分的に運動機能を急激に失うことによって特徴付けされ、かつこの損失の範囲は、損傷脊椎のその位置による。高い部分（頸部）の損傷は、運動機能の完全な喪失を生じるか、または四肢の麻痺（ｑｕａｄｒａｐｌｅｇｉａ）および呼吸調節の喪失を生じ、かつ場合によっては循環虚脱を生じる。より低い部分の損傷は対麻痺を生じるが、しかしながら、腕に関する障害および呼吸不全を生じることはない。
【００４２】
“哺乳類”は、ヒトおよび家畜、たとえば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ等を含む。
【００４３】
“治療的効果量”とは、これを必要とする哺乳類、好ましくはヒトに投与した場合に、以下に示すようなＳＣＩによって引き起こされる神経障害の治療に十分作用するトロンボモジュリン類似体の量を意味する。“治療的効果量”から成るトロンボモジュリン類似体の量は、トロンボジュリン類似体、ＳＣＩの重症度および治療されるべき哺乳類の年齢に依存するが、しかしながら、当業者の知識およびこの開示に関連しての通常の技術の一つによって、日常的に決定されてもよい。
【００４４】
本明細書中で使用される“治療”または“処置”は、哺乳類、好ましくはヒトにおけるＳＣＩに付随して生じる神経障害の改善を取り扱うものであり、この場合、この障害は、運動機能および／または呼吸機能の喪失に関連し、かつ、結果として、神経機能の改善された回復を得る。
【００４５】
本発明の利用可能性
本発明は、脊髄損傷（ＳＣＩ）に付随して生じる神経障害の、哺乳類における治療のための方法に関する。前記に示したように、活性化プロテインＣは、圧迫性外傷によって誘発されたＳＣＩにおいて重要な役割を示す分子である、ＴＮＦ−αの生成を抑制し、かつ、トロンビンとトロンボモジュリンとの複合体を形成することで、活性化プロテインＣを生成することが知られている。本発明は、天然のトロンボモジュリン（配列番号２）と同様の活性を有するトロンボモジュリンを投与することによって、ＳＣＩを有する哺乳類を治療するための方法を提供するが、しかしながら、これは、類似体が治療薬としてより良好な性質を有することを示す。
【００４６】
ＳＣＩに付随して生じる神経障害の治療のための治療薬としての、本発明によるトロンボモジュリン類似体の利用可能性について試験するために、トロンボモジュリン類似体を、（１）運動評価スケール（ＬＣＲ）スコアを改善するためのその能力について評価し、この場合、この方法は、脊髄機能について評価するものであり、かつ（２）脊髄を組織学的に改善させるためのその能力について評価し、この場合、これは、ＳＣＩ後のラットにおける脊髄癒合の像を提供するものである。
【００４７】
これに関連してのトロンボモジュリン類似体（Ｓｏｌｕｌｉｎ ^ＴＭ）の非経口的投与での利用可能性の付加的な示唆として、Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭの腹腔内投与（ｉ．ｐ．）が、血漿凝固作用において著しい効果を有することが確認された。
【００４８】
試験は、早期の治療的干渉（障害後１〜３時間）が好ましいことを示した。
【００４９】
ＳＣＩのための動物モデル
幾つかの試験系は、ＳＣＩの病理学を研究し、かつ実験室における神経保護剤の効果について試験するために使用されているものである（Ａｍａｒ ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ （１９９９）， ４４： １０２７−１０４０）。通常の試験的パラダイムは、種々の機械的障害または虚血性発作、たとえば、鋼球落下（ｗｅｉｇｈｔ−ｄｒｏｐ）、病巣または周囲の硬膜外バルーン圧迫（ｅｘｔｒａｄｕａｌ ｂａｌｌｏｎ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、クリップ加圧（ｃｌｉｐ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、光化学的または熱的外傷、伸延応力、またはピストン外傷を受けた脊髄の神経細胞培養物または解剖学的に無傷の部分を含む。
【００５０】
よりヒトＳＣＩに適応させた好ましい方法（Ｍｅｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （２０００）， １７：１−１７）は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｅｎｔｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｙ（ＭＡＳＣＩＳ）プロトコールにしたがって、コントロールされた打撲のための鋼球落下法（Ｇｒｕｎｅｒ， Ｊ．Ａ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９２）， ９： １２３−６； Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｒｏｔｒａｕｍａ （１９９６）， １３： ３４３−５９）を用いての脊髄打撲を加える。生じる障害は、組織学的試験（たとえば、光学または電子顕微鏡および特別な染色およびトレーシング法）（Ｇｒｕｎｅｒ， Ｊ． Ａ．， Ｉｂｉｄ）、電気生理学的予後測定法（たとえば、誘発電位）（Ｍｅｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （２０００）， １７：１−１７）、または挙動分析法（たとえば、オープンフィールドロコモーションまたは傾斜面上での起立安定性）（Ｂａｓｓｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９６）， １３： ３４３−５９）によって分析することができる。
【００５１】
ＴＭ活性を測定するためのラボラトリーアッセイ
ＴＭ活性を測定するためのいくつかのラボラトリーアッセイが可能である。プロテインＣ補因子活性は、Ｓａｌｅｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４），２５９（１９）：１２２４６−１２２５１およびＧａｌｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７），２６２（５）：２１９９−２２０５によって記載されたアッセイにおいて測定することができる。要約すれば、このアッセイは２工程から成る。最初に、トロンビンとプロテインＣを用いて試験すべきＴＭ類似体を、定められた条件下でインキュベートする。第２工程において、トロンビンを、ヒルジンまたは抗トロンビンＩＩＩおよびヘパリンを用いて失活させ、かつ新たに活性化プロテインＣの活性を色素物質を用いて測定し、その際、発色団は活性化プロテインＣのタンパク質分解活性によって放出された。このアッセイは精製された試薬を用いておこなった。
【００５２】
二者択一的に、ＴＭ類似体の効果は、凝固時間アッセイ、たとえば活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）、および／またはプロトロンビン時間（ＰＴ）中で、血漿を用いて測定することができる。ａＰＴＴアッセイは、プロテインＣの活性化ならびにトロンビンの直接的な抑制の双方に依存するが、その一方でＴＣＴおよびＰＴアッセイはトロンビンの抑制のみに依存している。これらのアッセイのいずれか一つにおける凝固時間の延長は、分子が、血漿中で凝固を抑制することができることを証明するものである。アッセイは製造者による指示書；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｉｎｃ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｃＧａｗ Ｐａｒｋ，ＩＩＩにより分与（Ｓａｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４），２５９：１２２４６−１２２５１を参照のこと、この場合、この文献は参考のためにのみ引用）にしたがって、自動凝固測定器でおこなってもよい。
【００５３】
ＴＡＦＩ活性は、Ｗａｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００），２７５：２２９４２−２２９４７）によって示されたように測定されてもよく、この場合、この測定は、活性ＴＡＦＩがカルボキシペプチダーゼであるという事実を使用する。このアッセイにおいて、本発明によるトロンボモジュリン類似体を含有する抽出物は、トロンビンによってインキュベートされ、その後に混合物を精製したＴＡＦＩによってインキュベートする。生成された活性ＴＡＦＩの量は、色素物質の使用によって測定され、その際、発色団が活性ＴＡＦＩのタンパク質分解活性によって放出される。二者択一的に、ＴＡＦＩ活性は、血漿凝固溶解アッセイによって、精製されたタンパク質を用いる定義された系によってかまたは血漿環境中でアッセイすることができる（Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｏｍ． Ｒｅｓｅａｃｈ （２０００）， ９８： ３３３−３４２）。
【００５４】
前記に開示されたアッセイは、精製系および血漿環境中の双方において、トロンビンと結合することが可能な可溶性ＴＭ類似体を同定し、かつこれらの類似体を用いて形成されたトロンビン−トロンボモジュリン複合体の能力を評価する。他のアッセイは、天然のトロンボモジュリン（配列番号２）の他の活性、たとえば、フィブリノゲンからのフィブリンへのトロンビン接触形成の抑制（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８６）， ２６１ （８）： ３８７６−３８８２）、第Ｖ因子のトロンビン活性の抑制（Ｅｓｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８２）， ２５７：７９４４−７９４７）、抗トロンビンＩＩＩおよびヘパリン補因子ＩＩによるトロンビンの促進された活性（Ｅｓｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８３） ２５８： １２２３８−１２２４２）、第ＸＩＩＩ因子のトロンビン活性の抑制（Ｐｏｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈｅａｍｏｓｔａｓ． （１９８７）， ５８：１４０）、タンパク質Ｓのトロンビン介在型失活の抑制（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｌｅｍ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ． （１９８６）， ７８（１）： １３−１７）およびトロンビン介在型血小板活性および凝集の抑制（Ｅｓｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８３）， ２５８： １２２３８−１２２４２）を評価するために使用することができる。
【００５５】
トロンボモジュリンの修飾
天然トロンボモジュリン（配列番号２）分子に対する修飾は、本発明によるトロンボモジュリン類似体の治療的効率を増加させるのに有用である。
【００５６】
特に好ましいＴＭ類似体組成物は、以下の特徴点の一つまたはそれ以上を有する組成物である：
（ｉ）抗酸化性であり、
（ｉｉ）プロテアーゼ耐性を示し、
（ｉｉｉ）同種のＮ−またはＣ−末端基を有し、
（ｉｖ）天然トロンボモジュリン（配列番号２）の少なくともいくつかのグリコシル化部位でのグリコシル化によって、翻訳後修飾されており、
（Ｖ）直鎖二重逆トロンビン結合（ｌｉｎｅａｒ ｄｏｕｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）特性を有し、
（Ｖｉ）極めて少量のデタージェント（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）中の水性溶液中で可溶であり、かつ典型的に膜貫通配列を有しない。
【００５７】
これらの修飾は、米国特許第５２５６７７０号明細書、第５８６３７６０号明細書および第５４６６６６８号明細書中に記載されており、この場合、これらは参考のためにのみ引用されているものである。
【００５８】
特に、これらの特性に関する好ましいＴＭ類似体の修飾は、アミノ酸１〜１３の除去、Ｐ４９０での終結、及び以下の置換を含む：Ｍ３８８Ｌ（抗酸化性に関する）、Ｒ４５６ＧおよびＨ４５７Ｑ（双方ともにタンパク質分解耐性に関する）およびＳ４７４Ａ（グルコースアミノグルカン付加のブロックおよびクリアランスの遅延）。
【００５９】
最も好ましくは、すべてのこれらの修飾を含む分子であり、この場合、この分子はＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭと呼称されている。
【００６０】
本発明のＴＭ類似体の製造
本発明で使用されたＴＭ類似体の製造は、米国特許第５２５６７７０号明細書、第５８６３７６０号明細書および第５４６６６６８号明細書中で開示されており、この場合、これらはそれぞれ参考ためにのみ引用されているものである。
【００６１】
トロンボモジュリン類似体の一般的投与法
純粋な形でかまたは適切な製薬学的組成物の形での、本発明による組成物の投与は、任意の許容可能な投与方法または同様の利用可能性に役立つ薬剤によって実施される。これによって、投与は、たとえば経口的、経鼻的、非経口的、局所的、経皮的、または直腸的に、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の投与形で、たとえば、ペレット剤、坐剤、錠剤、ソフトタイプの弾性ゲルカプセルまたはハードゲルカプセル、粉末、溶液、懸濁液またはエーロゾル等であってもよく、好ましくは正確な投与量で簡単な投与に適した単一の投与形である。組成物は、通常の製薬学的キャリアまたは助剤、および活性物質としての本発明の化合物、さらには、他の医学的助剤、製薬学的薬剤、キャリア、アジュバント等を含有していてもよい。
【００６２】
一般に、投与の使用様式によって、製薬学的に認容性の組成物は、本発明の一つまたはそれ以上の化合物またはこれらの製薬学的に認容性の塩を約１％〜約９９％、および適した製薬学的助剤９９％〜１％含有していてもよい。好ましくは、組成物は、本発明の一つまたはそれ以上の化合物またはこれらの製薬学的に認容性の塩を約５％〜７５％を含有していてもよく、その際、残りは製薬学的助剤である。
【００６３】
本発明による化合物、またはその製薬学的に認容性の塩は、たとえば、生体内でゆっくりと溶解するするキャリア中に配分された活性成分約０．５〜約５０％を用いて、坐剤中に配合されてもよく、この場合、このようなキャリアは、たとえば、ポリオキシエチレングリコールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、たとえばＰＥＧ１０００（９６％）およびＰＥＧ４０００（４％）である。
【００６４】
投与の好ましい経路としては、非経口的におこなうことであり、たとえば注入によるものである。注入は、皮下、静脈内または筋内であってもよい。これらの類似体は、製薬学的効果量で、かつしばしば製薬学的認容性の塩、たとえば酸付加塩として投与される。このような塩は、たとえば、塩化水素塩、臭素水素塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ベンゾエート、マレート、クエン酸塩、グリシン、グルタメートおよびアスパレート等を含有していてもよい。Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８５年を参照のこと、この場合、これらは参考のためにのみ引用されている。液体の製薬学的に投与可能な組成物は、たとえば、本発明による一つまたはそれ以上の化合物またはこれらの製薬的認容性の塩（約０．５％〜約２０％）および場合によっては製薬学的アジュバントを、キャリア、たとえば水、塩溶液、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等中で溶解または分散等させることによって製造することができ、これによって溶液または懸濁液を形成する。
【００６５】
好ましい場合には、本発明による製薬学的組成物は、少量の補助物質、たとえば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、抗酸化剤等、たとえば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化ヒドロキシトルエン等を含有していてもよい。
【００６６】
このような投与形を製造するための実際の方法は公知であるか、あるいは当業者により知られていてもよく、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．， １９９０）， にも記載されているが、この場合、この文献は参考のためにのみ本明細書中に引用されているものである。投与されるべき組成物は、場合によっては、本発明による技術を用いて、Ｌｐ（ａ）の血漿レベルを減少させるかまたはａｐｏ（ａ）の生成を抑制することによって緩和される疾病状態の治療のために、本発明の化合物またはその製薬学的に認容性の塩の治療的効果量を含有していてもよい。
【００６７】
本発明の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩は、使用された特定の化合物の活性、代謝安定性および化合物作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与形式および投与時間、排出率、薬剤の組み合わせ、特定の疾病状態の重症度、およびホストが受けた治療を含む種々の要因に依存していてもよい。一般に、これらの類似体は、たとえば家畜を含む獣医学的使用に関して哺乳類に投与してもよく、かつヒトにおけるクリティカルな使用に関しては、他の治療薬と同様の方法で、すなわち、生理学的認容性のキャリア中で投与してもよい。一般に、ＴＭ類似体のための投与量は、ホストの体重１ｋｇに対して、少なくとも約０．０００２μｇ／ｋｇ、より一般的には０．０２μｇ／ｋｇ、および５０００μｇ／ｋｇ未満、通常は２０００μｇ／ｋｇ未満、より一般的には５００μｇ／ｋｇ未満、通常は０．０２〜２０００μｇ／ｋｇおよびより一般的には０．０２〜５００μｇ／ｋｇである。これらの投与量は、延長された時間において一定の注入によって、好ましい循環レベルが達成されるまで投与されてもよいか、または大量注入されてもよい。特定の患者のための最適化された投与量は、当業者によって経験的に定められてもよい。
【００６８】
以上の記載は、さらに詳細に説明することなく、当業者が本発明を利用するのに十分な程度のものであると確信している。したがって、以下の好ましい実施態様は、本発明を単に例証するためのものであってこれに制限されるものではない。
【００６９】
前記および以下の実施例において、すべての温度は別記しない限りは摂氏℃であり、すべての部および％は質量に基づくものである。
【００７０】
前記および以下に示したすべての出願、特許および刊行物の全開示は本明細書中において参考のためにのみ引用したものである。
【００７１】
本発明は、これらの特定の実施態様に関して記載するが、当業者によって種々の変更がおこなわれてもよく、かつ相当するものによって本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく置き換えられてもよいとみなすべきである。さらに、多くの修飾がおこなわれてもよく、かつ相当するものによって、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく置き換えられてもよい。また、多くの改変は、本発明の対象、趣旨および範囲に対して、特定の状態、材料、組成物、工程、一つまたは複数個の工程を付加するためにおこなわれてもよい。このようなすべての改変は、本発明の請求の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
実施例
例１：ＳＣＩのためのラットモデル
動物：体重２７０ｇ〜３２５ｇの成雌Ｓｐｒａｓｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， ＮＹ）を、１２時間の明暗サイクルで飼育し、かつ齧歯類用の食事を不断給餌し、かつ生水を与えた。すべての動物試験は、アニマルケア施設で、動物研究のためのＮＩＨガイドラインに基づいておこなった。健康状態が良好な動物のみを使用した。外科的処置の１週前に、これらの動物を、オープンフィールド運動評価スケール測定に適応させるために日常的に慣れされておいた。
【００７３】
神経外科的手段：動物をケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびジラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によって殺した。周囲の箇所を、ＮＹＵ衝撃装置を用いての圧迫性ＳＣＩを調製するために、シェービングし、ＭＡＳＣＩＳプロトコール（Ｇｒｕｎｅｒ， Ｊ． Ａ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９２）， ９： １２３−６； Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９６）， １３： ３４３−５９）に記載された背面のより下部の胸部領域に亘っての切開範囲した。
【００７４】
障害が生じる前に、血圧をモニタリングし、動脈血をガス測定のために回収し、かつ直腸温度を記録した。
【００７５】
例２：打撲および打撲後の処置
打撲：脊髄打撲を、ＮＹＵ衝撃装置を用いて、制御された打撲おもし落下法（ｃｕｎｔｕｓｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ−ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって、前記に示されたプロトコールに基づいておこなった（Ｇｒｕｎｅｒ， Ｊ．Ａ． Ｊ． Ｎｅｒｏｔｒａｕｍａ （１９９２）， ９： １２３−１２６； Ｙｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９８） １５： ４５９−４７２）。
【００７６】
損傷後の処置：損傷を受けた後４８時間内において、処置を開始し、データーを回収し、かつ、血液／尿を捕集した。約３分の１のラットを損傷後４８時間において、急性の損傷の容量を測定するために安楽死させた。残りのラットを損傷後１４〜２８日間に亘って保持し、運動機能測定（ＬＲＳ／ＢＢＢ）に使用した。
【００７７】
Ｓｏｌｕｌｉｎ ^ＴＭ 処理：損傷の１時間後において、２００μｌの通常生理食塩溶液中に溶解されたＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭ ７０μｇの単一の注入を、３つのラットに対して腹腔内的におこなった。処理群と同様に完全に損傷を受けた、助剤コントロール群の動物には食塩溶液のみを与えた。いくつかの試験において、２００μｌの通常生理食塩溶液中に溶解された７０μｇのＳｏｌｕｌｉｎ^ＴＭの第２回目の投与を衝撃の２４時間後に、腹腔内的におこなった。コントロール群の動物（偽性損傷群）については、鋼球落下による損傷を除いての椎弓切除を含むすべての外科的操作をおこなわれた。
【００７８】
ａＰＴＴ測定法：血漿活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）レベルのための血液は、ＳＣＩの後３、６、１２、２４および７２時間で捕集した。血液を、１ｍｌのツベルクリンシリンジを用いて、尾部静脈から引き抜き、約１ｍｌの血液を、予めクエン酸処理されたチューブ中に入れた。すぐに血液を遠心分離し、血液を除去し、ａＰＴＴレベルを測定することができるまで−７０℃で凍結させた（Ｓａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８４）， ２５９Ｌ１２２４６−１２２５１）。ａＰＴＴレベル測定は、トロンボモジュリン活性が注入後少なくとも２４時間に亘って検出可能であることを証明した。
【００７９】
少なくとも３つの別個の試験が、Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭ処理された動物および助剤で調製されたラットにつきそれぞれ３個のラットでおこなわれた。
【００８０】
神経障害の評価：オープンフィールド運動評価スケール（ＬＲＳ／ＢＢＢ）測定法（Ｂａｓｓｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９６） １３： ３４３−５９； Ｂａｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９６） １３９：２４４−２５６）を、３つの独立した無認識の観察者によって、ＳＣＩ後２４日間に亘っておこなった。結果を記録し、かつＬＲＳのために開発されたソフトウエアプログラム中に入力し、分析した。
【００８１】
例３：脊髄組織の組織学的試験
固定した脊髄試料を包埋し、縦軸および横軸の双方の方向で切断し、損傷による病変の箇所およびその近接領域について、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、チオニンおよび他の染色方法で、評価しかつ測定した。図３を参照のこと（Ｂｅｔｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ （１９９９）， １６： ８５１−６３）。
【００８２】
図４は、病変体積の分析を示し、病変体積の統計的に有意な減少が、Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭ処理において見出されることを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
天然トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図。
【図２】
コントロールされた打撲性脊髄障害を有するラットにおける、オープンフィールド運動評価スケールを示すグラフ図。
【図３】
脊髄損傷を有するラットからの組織標本を示す図。図３−Ａはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。図３−Ｂはチオニン染色。
【図４】
処置後のラットの組織学的試験によって測定された損傷範囲分析を示すグラフ図。

Claims (11)

1. 哺乳類において、脊髄損傷から生じる神経障害を治療するための方法において、抗酸化性であり、かつ３８８位でメチオニンがロイシンに置換されている可溶性組換えトロンボモジュリン類似体の治療的有効量を、これを必要とする哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳類において、脊髄損傷から生じる神経障害を治療するための方法、その際、類似体は天然トロンボモジュリン（配列番号２）に従って番号付けされている。
2. トロンボモジュリン類似体が、天然トロンボモジュリン（配列番号２）のＯ−結合グリコシル化領域の糖残基で修飾されている、請求項１に記載の方法。
3. トロンボモジュリン類似体が、Ｏ−結合グリコシル化領域がコンドロイチン硫酸を有しない程度に修飾されている、請求項２に記載の方法。
4. 類似体がプロテアーゼ分解に対する耐性を有している、請求項１に記載の方法。
5. トロンボモジュリン類似体（Ｓｏｌｕｌｉｎ ^ＴＭ）が、以下の位置：
   アミノ酸１〜３の除去、
   Ｍ３８８Ｌ
   Ｒ４５６Ｇ
   Ｈ４５７Ｑ
   Ｓ４７４Ａおよび
   Ｐ４９０での終結
   で修飾された天然のトロンボモジュリン（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
6. 哺乳類がヒトである、請求項５に記載の方法。
7. 哺乳類において、脊髄損傷から生じる神経障害の治療に有用な医薬品組成物において、この医薬品組成物が、製薬学的助剤、および抗酸化性であり、かつ、３８８位でメチオニンがロイシンに置換されている、可溶性の組換えトロンボモジュリン類似体の治療的有効量を含有する、哺乳類において、脊髄損傷から生じる神経障害の治療に有用な医薬品組成物、その際、類似体は天然トロンボモジュリン（配列番号２）にしたがって番号付けされている。
8. トロンボモジュリン類似体が、天然トロンボモジュリン（配列番号２）のＯ−結合グリコシル化領域の糖残基で修飾されている、請求項７に記載の医薬品組成物。
9. トロンボモジュリン類似体が、Ｏ−結合グリコシル化領域がコンドロイチン硫酸を有しない程度に修飾されている、請求項８に記載の医薬品組成物。
10. 類似体がプロテアーゼ分解に対して耐性である、請求項７に記載の医薬品組成物。
11. トロンボモジュリン類似体（Ｓｏｌｕｌｉｎ^ＴＭ）が、以下の位置：
    アミノ酸１〜３の除去
    Ｍ３８８Ｌ
    Ｒ４５６Ｇ
    Ｈ４５７Ｑ
    Ｓ４７４Ａおよび
    Ｐ４９０での終結
    で修飾されている天然トロンボモジュリン（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の医薬品組成物。

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