PT1365788E - Análogos da trombomodulina para utilização na recuperação de lesão da medula espinal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANÁLOGOS DA TROMBOMODULINA PARA UTILIZAÇÃO NA RECUPERAÇÃO DE LESÃO DA MEDULA ESPINAL"

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido U.S. Provisório N° 60/229714, apresentado a 31 de Agosto de 2000.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de utilização de análogos da trombomodulina para a produção de um medicamento para o tratamento de traumatismos neurológicos associados com lesão da medula espinal em mamíferos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A trombomodulina (TM) é uma glicoproteína da membrana celular. Em humanos, encontra-se amplamente distribuída no endotélio dos vasos sanguíneos e dos vasos linfáticos. A sua importância fisiológica foi amplamente estudada. (Ver, por exemplo, Esmon et al., J. Biol. Chem. (1982), 257:859-864; Salem et al., J. Biol. Chem. (1983), 259:12246-12251). A trombomodulina funciona como um receptor para a trombina, uma enzima central na cascata de coagulação. Sob a forma livre, a trombina promove a coagulação, tanto directamente, pela 1 conversão do fibrinogénio em fibrina, como indirectamente, pela activação de outras proteínas da cascata de coagulação (por exemplo, os Factores V, viu e XIII) e através da activação das plaquetas. No entanto, quando ligado à trombomodulina, o complexo trombina-trombomodulina está envolvido na activação da proteína C em proteína C activada, a qual, então, exerce uma regulação negativa sobre a cascata de coagulação, pela inactivação proteolítica dos cofactores essenciais, Factor Va e Factor VlIIa (Esmon et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. (1991), 614:30-43), resultando em actividade anticoagulante aumentada. O complexo trombina-trombomodulina está, também, envolvido na activação do inibidor da fibrinólise activável pela trombina (TAFI), o qual, quando activado, origina a inibição da fibrinólise. Embora os estudos iniciais tenham sido negativos, os estudos mais recentes indicaram que a trombomodulina não se encontra apenas presente em células endoteliais cerebrais (Boffa, et al., Nouv. Rev. Fr. Hematol. (1991), 33:423-9; Wong, et al., Brain Res. (1991), 556:1-5; Wang, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1997), 17:3139-46; Tran, et al., Stroke (1996) , 27 :2304-10,- discussão 2310-1), sendo, também, expresso na superfície de astrócitos, onde esta actua de um modo idêntico à sua função nos vasos sanguíneos activando a proteína C, pela formação de um complexo com a trombina (Pindon, et al., Glia (1997) , 19:259-68). A trombomodulina é, também, regulada positivamente em astrócitos reactivos no SNC, em resposta a lesões mecânicas (Pindon, et al., J. Neurosci. (2000), 20: 2543-50) . Um relatório recente sugere que a trombomodulina recombinante bloqueia a activação pela trombina de outro receptor, o receptor 1 activado pela protease (PAR 1) em células neuronais em cultura (Sarker, et al. Thromb. Haemost. (1999), 82:1071-77) . 2 A proteína C activada tem sido, também, significativamente, associada à regulação de respostas inflamatórias envolvendo várias citocinas ou leucócitos activados (Esmon et al., Thromb. Haemost. (1991), 66:160-165). De um modo consistente com esta hipótese, os estudos demonstraram que a proteína C activada previne lesões vasculares pulmonares em ratos inoculados com endotoxina, inibindo a produção do factor da necrose tumoral (TNF-α), o qual activa os neutrófilos de um modo potente (Murakami et al., Blood (1996), 87:642-647; Murakami et al., Am. J. Physiol. (1996), 272:L197-2). A trombomodulina humana recombinante solúvel previne também as lesões vasculares pulmonares induzidas por endotoxinas, pela inibição da activação de neutrófilos através da activação da proteína C (Uchiba et al., Am. J. Physio. (1996), 271:L470-5; Uchiba et al., Am. J. Physio. (1997), 273:L889-94). A lesão da medula espinal (SCI) é uma patologia grave, a qual produz deficiências para toda a vida (Stover et al., Paraplegia (1987), 24:225-228). Presentemente, encontram-se apenas disponíveis medidas terapêuticas limitadas para o seu tratamento (Bracken et al., New Engl. J. Med. (1990), 322: 1405-1411). De facto, a intervenção aguda mais frequentemente aceite após SCI, para além da cirurgia, consiste na administração do esteróide metilprednisolona (MP) (Hall, E. D., Adv. Neurol. (1993), 59:241-8; Bracken, Μ. B., J. Neurosurg. (2000), 93:1759; Bracken, Μ. B., Cochrane Database Syst. Rev. 2 (2000); Koszdin, et al., Anesthesiology (2000), 92:156-63). No entanto, após 10 anos de experiência este tratamento é ainda bastante controverso e uma meta-análise recente sugeriu que o tratamento com MP possa ser, na realidade, contra-indicado (Hurlbert, R. J., J. Neurosurg. (2000), 93:1-7; Pointillart, et al., Spinal 3

Cord (2000), 38:71-6; Lankhorst, et al., Brain Res. (2000), 859:334-40) . A patofisiologia da SCI inclui uma lesão mecânica primária e uma lesão neurológica secundária retardada (Tator et al., J. Neurosurg. (1991), 75:15-26). Enquanto que a lesão primária é determinada pelas circunstâncias do traumatismo, os resultados da lesão secundária podem ser receptivos à modulação terapêutica. Embora os mecanismos envolvidos no processo da lesão secundária não se encontrem completamente compreendidos, podem estar envolvidas respostas inflamatórias que originam lesões endoteliais (Demopoulos, et al., Scan. Electron Microsc. (1978), 2:677-680) e isto constitui uma área que pode servir

como alvo para intervenção terapêutica. Foi, recentemente, demonstrado que o factor da necrose tumoral (TNF-α) desempenha um papel importante na SCI induzida por traumatismo por compressão em ratos, pela activação dos neutrófilos (Taoka, et al., Neuroscience (1997), 79:1177-182; Taoka et al., J

Neurotrauma (2000), 17:219-29). Foi também descrito que a proteína C activada reduz a gravidade da SCI induzida por traumatismo por compressão, pela inibição da produção de TNF-a (Taoka et al., J. Neurosci. (1998), 18:1392-1398). Os estudos

demonstraram que a trombomodulina recombinante solúvel preveniu a SCI induzida por traumatismo por compressão num modelo da SCI de rato, pela inibição da acumulação de leucócitos, através da redução da expressão do ARNm do TNF-α no local da lesão (Taoka et al., Thromb. Haemost. (2000), 83:462-468). Estas observações sugerem que a trombomodulina possa, também, prevenir a SCI induzida por traumatismo por contusão, através da activação da proteína C, com a inibição resultante da produção de TNF-a.

Foram recentemente validados modelos de rato de contusão ou de 4 queda de um peso para SCI humana (Metz et al., J Neurotrauma (2000), 17:1-17).

Os requerentes verificaram que determinadas composições da trombomodulina solúvel são eficazes na redução das lesões neurológicas após SCI, num modelo de rato e, consequentemente, são úteis no tratamento dessas lesões neurológicas em mamíferos. Têm sido produzidos análogos solúveis da trombomodulina que conservam a maioria, se não a totalidade, das actividades da proteína nativa. Para além disso, foram desenvolvidos análogos solúveis da trombomodulina, os quais são resistentes a oxidação, resistentes a proteólise ou que foram, de outra forma, modificados para possuir uma meia-vida mais longa em circulação e são descritos nas Patentes U.S. N° 5256770, 5863760 e 5466668. Estas composições foram anteriormente descritas como sendo úteis como agentes anti-trombóticos. No entanto, não se verificou qualquer divulgação em relação à utilidade destas composições como agentes terapêuticos para a melhoria de lesões neurológicas após SCI.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, um aspecto desta invenção é dirigido a um método para a produção de um medicamento para o tratamento de lesões neurológicas resultantes de SCI, o qual compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo da trombomodulina recombinante, solúvel, o qual é resistente à oxidação e em que a metionina na posição 388 foi substituída por uma leucina, em que o análogo é numerado de acordo com a trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2) 5

Um aspecto adicional desta invenção utiliza análogos da trombomodulina, os quais contêm modificações adicionais para proporcionar resistência à quebra por proteases e/ou apresentar um padrão de glicosilação alterado.

Um aspecto adicional desta invenção utiliza um análogo da trombomodulina, conhecido com Solulin™, o qual contém modificações à sequência nativa da trombomodulina (SEQ ID N°: 2) nas seguintes posições: remoção dos aminoácidos 1-3, M388L, R456G, H457Q, S474A e terminação em P490.

Breve Descrição dos Desenhos A FIG 1 mostra a sequência de aminoácidos da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), utilizando o sistema de numeração de Suzuki et al. (1987) Embo J 6:1891-1897. A FIG 2 mostra resultados da avaliação da função neuronal pela escala de avaliação da locomoção de campo aberto (LRS) de Basso, Beatty e Bresnahan, designada como escala de "BBB", em ratos, após lesão controlada da medula espinal por contusão. Os ratos feridos são tratados com veiculo (soro fisiológico) ou com Solulin™ administrados intraperitonealmente (i. p.), após lesão, como descrito no Exemplo 2. A FIG 3 (A e B) , ilustra espécimes histológicos representativos de ratos com lesões da medula espinal após tratamento com soro fisiológico (Controlo) ou com Solulin™, administrado i. p., 1 h após SCI moderada por contusão (força de 25 g.cm). São mostrados espécimes de 6 acima, sobre e abaixo da lesão. Na Figura 3A, os espécimes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E); na Figura 3B, os espécimes foram corados com tionina. A FIG 4 mostra análises da extensão do volume da lesão, como determinada por exame histológico de ratos tratados com soro fisiológico (controlo) versus Solulin™, sobre, acima e abaixo do epicentro da lesão. Foi determinada uma redução estatisticamente significativa de cerca de 40% (p <0,05) no volume da lesão, com o tratamento com Solulin™, em comparação com controlos tratados com soro fisiológico, com um teste t não emparelhado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Como utilizado na descrição e nas reivindicações, a menos que especificado de outra forma, os termos seguintes têm os significados indicados: O termo "resíduo" refere-se a um aminoácido que é incorporado num péptido. O aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e, a menos que limitado de outra forma, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de uma forma semelhante à dos aminoácidos de ocorrência natural. Para os objectivos desta divulgação, os resíduos de aminoácido são aqui designados pela sua abreviatura de três letras ou de uma letra aceites ou pela notação "AA", a qual significa a presença de um resíduo de aminoácido. Os 7 aminoácidos aqui referidos são descritos por designações abreviadas, como se segue:

Tabela 1: Nomenclatura do Aminoácidos

Nome 3 letras 1 letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido Aspártico Asp D Cisteina Cys C Ácido Glutâmico Glu E Glutamina Gin Q Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Vai V

Na descrição de uma substituição de um aminoácido, para os objectivos desta divulgação, a substituição é descrita fornecendo o aminoácido presente na trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2) (TM), a posição do aminoácido dentro da sequência da trombomodulina (utilizando o sistema de numeração de Suzuki et al., Embo Journal (1987), 6:1891-1897), seguida pelo aminoácido que foi substituído pelo original: i. e., M388L refere-se à substituição da metionina na posição 388 por leucina). "Trombomodulina nativa" refere-se à proteína completa, como esta ocorre na natureza (FIG 5: SEQ ID N°: 2). É conhecido que a trombomodulina nativa contém polimorfismos de ocorrência natural em determinados resíduos. Por exemplo, na posição 455, verifica-se uma variação de ocorrência natural no aminoácido que se encontra nesta posição, com alanina presente em 82% das ocorrências e valina presente em 18% das ocorrências (Van der Velden et al. (1991) Throm. Haemeostasis 65:511-513.) Para os objectivos desta invenção, a sequência da trombomodulina nativa apresentada (FIG 5; SEQ ID N°: 2) é a que contém valina na posição 455, como descrito por Suzuki et al. (1987) EMBO J 6:1891-1897. No entanto, todos os polimorfismos de ocorrência natural são incluídos no âmbito dos análogos reivindicados. Quando são descritas actividades biológicas referentes à TM nativa, o termo abrange uma forma aquosa solubilizada com detergente. Frequentemente, no contexto da comparação com uma actividade, um polipéptido solúvel transfectado pode apresentar propriedades substancialmente idênticas.

Os "análogos da trombomodulina" são péptidos que conservam, substancialmente, a actividade biológica da TM nativa, como discutido acima e os quais têm uma estrutura molecular diferente da de uma versão nativa da TM. Por exemplo, o termo refere-se a proteínas tendo uma sequência de aminoácidos idêntica ou homóloga à da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), a péptidos ou fragmentos da trombomodulina insolúveis e solúveis e a espécies de TM resistentes à oxidação, tendo todas actividade 9 semelhante à da trombomodulina. Estes compostos incluem, também, derivados e moléculas compreendendo modificações de aminoácidos que não reduzem, significativamente, as propriedades de cofactor de activação da proteína C da proteína, em comparação com a TM nativa. 0 termo "TM mutante" refere-se a um análogo da TM contendo a substituição designada (como descrito acima) ou outra modificação indicada.

Os termos "péptidos" e "polipéptidos" referem-se a cadeias de aminoácidos cujos carbonos α se encontram ligados através de ligações peptídicas formadas por uma reacção de condensação entre o carbono α do grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amino de outro aminoácido. 0 aminoácido terminal numa extremidade da cadeia (terminal amino) tem, consequentemente, um grupo amino livre, enquanto que o aminoácido terminal na outra extremidade da cadeia (terminal carboxilo) tem um grupo carboxilo livre. 0 termo "domínio" refere-se a uma sequência de aminoácido discreta que se pode associar com uma função ou característica particular. Tipicamente, um domínio apresenta uma unidade estrutural terciária característica. 0 gene da trombomodulina completo codifica um péptido precursor, contendo os domínios seguintes: 10

Tabela 2: Domínios da TM

Posição Aproximada Domínio do Aminoácido (-18)-(-1) 1-226 227-462 463-497 498-521 522-557

Sequência sinal Domínio do terminal N (domínio da lectina; L) Domínios semelhantes a 6 EGF (E) Glicosilação ligada a 0 (D) Transmembranar Domínio citoplasmático

Ver Yost et al., Cell, (1983), 34:759-766 e Wen et al., Biochemistry (1987), 26:4350-4357.

Um "local de protease" refere-se a um aminoácido ou a uma série de aminoácidos num polipéptido da TM, os quais definem um local de reconhecimento, ligação, quebra ou outro, susceptível à actividade de uma protease, quando, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido abrangidos por este local são substituídos por outros resíduos de aminoácidos ou são eliminados, deixando a protease de ter capacidade para quebrar a TM naquele local. Este termo abrange, também, regiões da molécula da TM que são inerentemente susceptíveis a proteases, e. g., por se encontrarem conformacionalmente expostas e disponíveis para uma actividade de protease.

Um "local de quebra por protease" refere-se à posição precisa na qual uma protease quebra o análogo do polipéptido da TM. 11

Um "terminal N único" e um "terminal C único" têm os seus significados literais, os quais, funcionalmente, se referem à propriedade da composição, e. g., em que após análise da sequência de aminoácidos sequencial convencional, cada ciclo de degradação resulta na remoção de um resíduo de aminoácido, o qual é, essencialmente, destituído de um resíduo de aminoácido diferente. Deste modo, após vários ciclos, e. g., 10 ciclos de remoção gradual dos aminoácidos do terminal N, apenas um aminoácido é, essencialmente, recuperado em cada ciclo. Em particular, não é detectada mais heterogeneidade na sequência do que a que seria estatisticamente prevista a partir de um polipéptido de cadeia única completamente puro de acordo com o processo analítico utilizado. "Conserva, substancialmente, a actividade biológica da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2)" e termos semelhantes, como aqui utilizados, significam que a trombomodulina partilha actividades biológicas com uma molécula da TM nativa ligada à membrana. Geralmente, a actividade em unidades por miligrama de proteína é, pelo menos, de cerca de 50%, normalmente, 75%, tipicamente, 85%, mais tipicamente, 95%, de um modo preferido, 100% e, de um modo mais preferido, mais de 100% da actividade da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2). Esta actividade biológica pode ser a da activação da proteína C mediada pela trombina (APC), do tempo de coagulação da tromboplastina parcial activada (APTT), do tempo de coagulação da trombina (TCT) ou de qualquer das actividades biológicas da TM, de um modo preferido, terapêuticas. O padrão nativo para comparação é a versão da TM ligada a uma membrana, completa, mas, em muitos casos, pode ser utilizada uma TM solúvel, compreendendo o domínio lectina/EGF/ligado a O (TM.sub.LEO) como um padrão mais conveniente. 12 refere-se a "Locais de glicosilação" refere-se a resíduos de aminoácido, os quais são reconhecidos por uma célula eucariota como posições para a ligação de resíduos de açúcar. Os aminoácidos onde os açúcares se ligam são, tipicamente, resíduos de Asn (para açúcares ligados a N), treonina ou serina (para açúcares ligados a 0) . 0 local específico de ligação é, tipicamente, assinalado por uma sequência de aminoácidos, e. g., Asn-X-(Thr ou Ser), para a maioria das ligações ligadas a N e (Thr ou Ser)-X-X-Pro, para a maioria das ligações ligadas 0, em que X é qualquer aminoácido. A sequência de reconhecimento para os glicosaminoglicanos (um tipo específico de açúcar sulfatado) é geralmente Ser-Gly-X-Gly mas pode também, ser X-Ser-Gly-X-Val. Os termos ligados a N e ligado a 0, referem-se ao grupo químico que funciona como o local de ligação entre a parte açúcar e o resíduo do ácido amido. Os açúcares ligados a N encontram-se ligados através de um grupo amino; os açúcares ligados a 0 encontram-se ligados através de um grupo hidroxilo. "Tempo de meia-vida de circulação in vivo" refere-se ao tempo médio que uma actividade plasmática administrada num mamífero leva para se reduzir para metade.

Um "análogo da TM solúvel" é um análogo da TM que é solúvel numa solução aquosa e, tipicamente, pode ser segregado por uma célula. Para a administração farmacológica, o análogo da TM solúvel ou um análogo insolúvel podem ser, opcionalmente, combinados com vesículas de fosfolípidos, detergentes ou outros compostos semelhantes, bem conhecidos dos especialistas na técnica da formulação farmacológica. Os análogos da TM preferidos da presente invenção são solúveis na corrente sanguínea, tornando os análogos úteis em várias terapias, anticoagulantes e outras. As modificações que fazem a TM 13 solúvel, tipicamente, não afectam, significativamente, muitas actividades, em relação à trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), e. g., afinidade para a trombina ou actividade na activação da proteina C. "Domínio de glicosilação ligada a 0" refere-se à sequência de aminoácidos numerados de 463 a 497 da sequência da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), como representado na Tabela 2 (ver a página 5). "Análogos resistentes à oxidação" refere-se a análogos da trombomodulina que são capazes de manter uma quantidade substancial de actividade biológica após exposição a um agente oxidante, tais como, radicais de oxigénio, Cloramina T, peróxido de hidrogénio ou neutrófilos activados. "Solulin™" refere-se a um análogo da trombomodulina descrito na Patente U.S. N° 5256770, no qual foram realizadas as seguintes modificações da sequência da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2): remoção dos aminoácidos 1-3, M388L, R456G, H457Q, S474A e terminação em P490. "Excipientes farmacêuticos" refere-se a materiais não-tóxicos, aceitáveis medicamente, os quais são utilizados para realizar uma terapia médica. Estes materiais podem ser inertes, tais como água e sal ou biologicamente activos, tais como um antibiótico ou analgésico. "Capacidade reduzida" refere-se a uma diminuição estatisticamente significativa de uma propriedade biológica. A propriedade é ilimitada e a medição ou a quantificação da propriedade são realizadas através de meios padrão. 14 "Resíduos de açúcar" referem-se aos hidratos de carbono hexose e pentose, incluindo glucosaminas e a outros derivados de hidrato de carbono e partes, os quais se encontram covalentemente ligados a uma proteína. "Substituintes de sulfato" são substituintes contendo enxofre, nos açúcares pentose ou hexose. "Conversão do fibrinogénio em fibrina mediada pela trombina" refere-se à actividade enzimática pela qual a trombina quebra a proteína precursora fibrinogénio para produzir um monómero de fibrina, o qual, subsequentemente, polimeriza para formar um coágulo sanguíneo. "Doença trombótica" refere-se a uma patologia patogénica num mamífero, caracterizada pela formação de um ou mais trombos que são ou podem ser prejudiciais à saúde do mamífero. "SCI", como aqui utilizado, refere-se a lesões traumáticas sofridas pela medula espinal e pela área em redor desta. Esta inclui lesões de contusão e/ou compressão, assim como lesões de transecção. 0 modelo utilizado nos estudos que suportam a utilidade desta invenção é o da contusão, o qual se aproxima mais dos tipos de SCI sofridos por humanos em acidentes com veículos motorizados e/ou lesões relacionadas com desportos. Todas as SCI são caracterizadas pela perda súbita da função motora completa ou parcial e a extensão desta perda depende da localização das lesões no interior da medula. As lesões superiores (cervicais) podem resultar na perda total da função motora ou tetraplegia e perda do controlo respiratório e, por vezes, colapso cardiovascular. As lesões inferiores podem 15 resultar em paraplegia, mas sem envolvimento dos braços ou disfunção respiratória. "Mamífero", inclui humanos e animais domesticados, tais como gatos, cães, porco, gado, ovelhas, cabras, cavalos, coelhos e semelhantes. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade do análogo da trombomodulina, o qual, quando administrado a um mamífero que deste necessite, de um modo preferido, um humano, é suficiente para efectuar o tratamento, como definido abaixo, para lesões neurológicas resultantes da SCI. A quantidade do análogo da trombomodulina que constitui uma "quantidade terapeuticamente eficaz" irá variar, dependendo do análogo da trombomodulina, da gravidade da SCI e da idade do mamífero a ser tratado, mas pode ser determinada, rotineiramente, por um comum especialista na técnica, tendo em consideração o seu próprio conhecimento e a presente divulgação. "Tratar" ou "tratamento", como aqui utilizado, abrange a melhoria das lesões neurológicas associadas com a SCI num mamífero, de um modo preferido, num humano, em que as lesões se encontram associadas com a perda da função motora e/ou respiratória e inclui o tratamento, o qual resulta na recuperação melhorada da função neurológica.

Utilidade da Invenção

Esta invenção é dirigida a um método para a produção de um medicamento para o tratamento em mamíferos, de traumatismos neurológicos associados com lesões da medula espinal (SCI) . Como 16 discutido acima, a proteína C activada inibe a produção de TNF-α, uma molécula que demonstrou desempenhar um papel importante na SCI induzida por traumatismo por compressão e é conhecido o facto da trombomodulina, num complexo com trombina, produzir a proteína C activada. A presente invenção proporciona um medicamento para o tratamento de mamíferos tendo SCI, compreendendo análogos da trombomodulina, os quais possuem a mesma actividade que a trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), mas os quais apresentam propriedades que fazem dos análogos, melhores agentes terapêuticos.

Para demonstrar a utilidade dos análogos da trombomodulina da invenção como agentes terapêuticos para o tratamento de traumatismos neurológicos associados com SCI, foram avaliados análogos da trombomodulina para a sua capacidade (1) para melhorar a pontuação na escala de avaliação da locomoção (LRS), a qual constitui um método para avaliar a função da medula espinal e (2) para melhorar a histologia da medula espinal, a qual proporciona uma perspectiva da regeneração da medula espinal, em ratos após SCI (ver Figuras 2-4).

Como uma indicação adicional da utilidade da administração parentérica do análogo da trombomodulina (Solulin™) neste contexto, foi determinado que a administração intraperitoneal (i. p.) de Solulin™ tem efeitos significativos sobre as funções de coagulação do plasma.

Os estudos indicam que é preferida a intervenção terapêutica precoce (1-3 horas após as lesões). 17

Modelos Animais para a SCI

Foram utilizados vários sistemas experimentais para investigar a patofisiologia da SCI e testar os efeitos dos agentes neuroprotectores, em laboratório (Amar e Levy, Neurosurgery (1999), 44:1027-1040). Os paradigmas experimentais actuais envolvem a submissão de culturas de células neuronais ou de segmentos anatomicamente intactos da medula espinal, a várias agressões mecânicas ou de isquémicas, tais como a queda de um peso, focal ou compressão extradural circunferencial com um balão, pressão com um grampo, lesões fotoquimicas ou térmicas, forças distraccionais ou traumatismo por pistão.

Um método mais preferido, o qual se aproxima mais significativamente da SCI humana (Metz, et al., J. Neurotrauma (2000), 17:1-17) consiste em infligir uma contusão da medula espinal, de acordo com o protocolo do Multi-Center Animal Spinal Cord Injury Study (MASCIS), utilizando a contusão controlada pelo método da queda de um peso (Gruner, J. A, J. Neurotrauma (1992), 9:123-6; Basso, et al., J. Neurotrauma (1996), 13:343- 59) . As lesões resultantes podem ser avaliadas por exame histológico (e. g., microscopia óptica ou electrónica e, em especial, métodos de coloração e sinalização) (Gruner, J. A., Ibid.) , medidas dos resultados eletrofisiológicos (e. g., potenciais evocados) (Metz, et al., J. Neurotrauma (2000), 17: 1-17) ou avaliações comportamentais (e. g., locomoção de campo aberto ou estabilidade postural sobre um plano inclinado) (Basso, et al., J. Neurotrauma (1996), 13:343-59). 18

Ensaios Laboratoriais para a Medição da Actividade da TM

Encontram-se disponíveis vários ensaios laboratoriais para a medição da actividade da TM. A actividade de cofactor da proteína C pode ser medida no ensaio descrito por Salem, et al., J. Biol. Chem. (1984), 259(19):12246-12251 e Galvin, et al., J. Biol. Chem. (1987), 262(5):2199-2205. Resumidamente, este ensaio consiste em dois passos. O primeiro consiste na incubação do análogo da TM do teste, com trombina e proteína C, sob condições definidas. No segundo passo, a trombina é inactivada com hirudina ou antitrombina III e heparina e a actividade da proteína C recém-activada é determinada pela utilização de um substrato cromogénico, através do qual o cromóforo é libertado pela actividade proteolítica da proteína C activada. Este ensaio é realizado com reagentes purificados.

Alternativamente, o efeito de um análogo da TM pode ser medido utilizando plasma em ensaios do tempo de coagulação, tais como do tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT) , tempo de coagulação da trombina (TCT) e/ou tempo da protrombina (PT) . O ensaio do aPTT está dependente, tanto da activação da proteína C, assim como da inibição directa da trombina, enquanto que os ensaios do TCT e do PT dependem, apenas, da inibição da trombina. O prolongamento do tempo de coagulação em qualquer um destes ensaios demonstra que a molécula pode inibir a coagulação no plasma. Os ensaios podem ser realizados num medidor automático do tempo de coagulação de acordo com as especificações do fabricante; Medicai Laboratory Automation Inc distribuído por American Scientific Products, McGaw Park, III) . (ver, também, Salem et al., J. Biol. Chem. (1984), 259: 12246-12251). 19 A activação do TAFI pode ser medida como descrito por Wang et al. {J. Biol. Chem. (2000), 275:22942-22947), utilizando o facto do TAFI activado ser uma carboxipeptidase. Neste ensaio, são incubados extractos, contendo o análogo da trombomodulina em questão, com trombina e a mistura é, então, incubada com TAFI purificado. A quantidade do TAFI activado produzido é determinada pela utilização de um substrato cromogénico, através do qual o cromóforo é libertado pela actividade proteolitica do TAFI activado. Alternativamente, a activação do TAFI pode ser ensaiada através de um ensaio de lise do coágulo do plasma num sistema definido, utilizando proteínas purificadas ou num meio de plasma (Nagashima, et al., Throm. Research (2000), 98: 333-342) .

Os ensaios descritos acima são utilizados para identificar análogos da TM solúveis que têm capacidade de ligação à trombina e avaliar a capacidade do complexo trombina-trombomodulina, formado com estes análogos, para activar a proteína C, tanto em sistemas purificados, como num meio de plasma. Podem ser utilizados ensaios adicionais, para avaliar outras actividades da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), tais como a inibição da formação de fibrina a partir do fibrinogénio, catalisada pela trombina (Jakubowski, et al., J. Biol. Chem. (1986), 261(8):3876-3882), inibição da activação do Factor V pela trombina (Esmon, et al., J. Biol. Chem. (1982), 257:7944-7947), inibição acelerada da trombina pela antitrombina III e cofactor II da heparina (Esmon et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 12238— 12242), inibição da activação do Factor XII pela trombina. (Polgar, et al., Thromb. Haemostas. (1987), 58:140), a inibição da inactivação da proteína S mediada pela trombina (Thompson e Salem, J. Clin. Inv. (1986), 78 (1):13-17) e inibição da 20 activação e agregação das plaquetas mediada pela trombina (Esmon, et al., J. Biol. Chem. (1983), 258:12238-12242).

Modificações da trombomodulina

As modificações da molécula da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2) são úteis para aumentar a eficácia terapêutica dos análogos da trombomodulina da presente invenção.

As composições de análogo da TM, particularmente, preferidas, são as que apresentam uma ou mais das caracteristicas seguintes: (i) estas são resistentes à oxidação, (ii) estas apresentam resistência a protease, (iii) estas têm terminais N ou C homogéneos, (iv) estas foram modificadas após tradução, e. g., por glicosilação de, pelo menos, alguns dos locais de glicosilação da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2), (v) estas têm propriedades de ligação dupla reciproca linear da trombina, (vi) estas são solúveis em solução aquosa, em quantidades relativamente baixas de detergentes e, tipicamente, não apresentam uma sequência transmembranar.

Estas modificações foram descritas nas Patentes U.S. N° 5256770, 5863760 e 5466668. 21

Em particular, as modificações preferidas da molécula da TM, as quais se referem a estas características, incluem a remoção dos aminoácidos 1-13, terminação em P490 e as substituições seguintes: M388L (para a resistência à oxidação), R456G e H457Q (ambas para a resistência à proteólise) e S474A (bloqueia a adição de glicosaminoglicano e reduz a velocidade de eliminação). É mais preferida uma molécula compreendendo todas estas modificações, a qual é designada como Solulin™.

Preparação dos análogos da TM desta Invenção A preparação dos análogos da TM utilizados nesta invenção é divulgada nas patentes U.S. N°. 5256770, 5863760 e 5466668.

Administração Geral do medicamento de acordo com a invenção, compreendendo O medicamento análogos da trombomodulina, uma forma de introdução da Administração do medicamento, compreendendo análogos da trombomodulina da invenção, sob a forma pura ou numa composição farmacêutica apropriada, pode ser realizado através de qualquer das formas de administração ou agentes utilizados em utilizações semelhantes. Deste modo, a administração pode ser, por exemplo, oralmente, nasalmente, parentericamente, topicamente, transdermicamente ou rectalmente, sob a forma de formas de dosagem sólidas, semi-sólidas, de pó liofilizado ou liquidas, tais, como por exemplo, comprimidos, supositórios, pílulas, cápsulas de gelatina elásticas moles e rígidas, pós, soluções, suspensões ou aerossóis ou semelhantes, de um modo 22 preferido, sob formas de dosagem unitária adequadas para a administração simples de dosagens precisas. As composições irão incluir um veiculo ou excipiente farmacêutico convencional e um composto da invenção como o/um agente activo, e, para além disso, podem incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, veiculos, adjuvantes, etc.

De um modo geral, dependendo do modo de administração pretendido, as composições farmaceuticamente aceitáveis irão conter, cerca de, 1% a, cerca de, 99%, em peso, de (um) composto (s) da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável e 99% a 1%, em peso, de um excipiente farmaceuticamente adequado. De um modo preferido, a composição irá ter, cerca de, 5% a 75%, em peso, de (um) composto (s) da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, sendo o remanescente constituído por excipientes farmacêuticos adequados.

Os compostos da invenção ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem, também, ser formulados num supositório utilizando, por exemplo, cerca de, 0,5% a, cerca de, 50% do ingrediente activo, introduzido num veículo que se dissolve lentamente dentro do organismo, e. g., polioxietilenoglicóis e polietilenoglicóis (PEG), e. g., PEG 1000 (96%) e PEG 4000 (4%). A via preferida de administração é parentericamente, por exemplo, por injecção. A injecção pode ser subcutânea, intravenosa ou intramuscular. Estes análogos são administrados em quantidades farmaceuticamente eficazes e, frequentemente, sob a forma de sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de adição ácida. Esse sais podem incluir, e. g., cloridrato, bromidrato, fosfato, sulfato, acetato, benzoato, malato, citrato, glicina, glutamato e aspartato, entre outros. Ver 23

Goodman e Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8 a ed., Pergamon Press, 1985, o qual é aqui incorporado por referência. As composições liquidas farmaceuticamente administráveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc., de (um) composto(s) da invenção (cerca de 0,5% a, cerca de, 20%) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável e adjuvantes farmacêuticos opcionais, num veiculo, tais como, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose aquosa, glicerol, etanol e semelhantes, para, deste modo, formar uma solução ou uma suspensão.

Se pretendido, uma composição farmacêutica da invenção pode conter, também, quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, antioxidantes e semelhantes, tais como, por exemplo, ácido cítrico, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, hidroxitolueno butilado, etc.

Os métodos efectivos de preparação dessas formas de dosagem, são conhecidos ou serão evidentes, para os especialistas nesta técnica; ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1990), o qual é aqui incorporado por referência. A composição a ser administrada irá conter, em qualquer situação, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou seu sal farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de um estado de doença, aliviado pela redução dos níveis plasmáticos de Lp(a) ou pela inibição da produção de apo(a,) de acordo com os ensinamentos desta invenção. O medicamento produzido de acordo com a invenção, compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da trombomodulina, a qual irá variar dependendo de vários factores 24 incluindo a actividade do composto especifico utilizado, a estabilidade metabólica e o periodo de tempo de acção do composto, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo da administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, gravidade dos estados de doença particulares e o hospedeiro sob terapia. Geralmente, estes medicamentos podem ser administrados a mamíferos, para utilização veterinária, tais como a animais domésticos e para utilização clínica em humanos de uma forma semelhante a outros agentes terapêuticos, ou seja, num veículo fisiologicamente aceitável. Em geral, a dosagem de administração do análogo da TM irá variar entre, cerca de, pelo menos, 0,0002, mais frequentemente, 0,02 e menos de 5000, frequentemente, menos de 2000, mais frequentemente, menos de 500 pg/kg, frequentemente, 0,02 a 2000 pg/kg e, mais frequentemente, 0,02 a 500 pg/kg do peso corporal do hospedeiro. Estas dosagens podem ser administradas por infusão constante ao longo de um período de tempo prolongado, até ser alcançado um nível circulante pretendido ou, de um modo preferido, sob a forma de uma injecção de uma pílula. As dosagens óptimas para um doente em particular podem ser rotineiramente determinadas por um comum especialista na técnica. É considerado que um especialista na técnica, utilizando a descrição anterior, sem elaboração adicional, pode utilizar a presente invenção no seu âmbito total. Consequentemente, as formas de realização específicas preferidas seguintes, devem ser interpretadas como apenas ilustrativas e não limitatantes do remanescente da divulgação de qualquer forma, em absoluto.

Nos exemplos anteriores e nos seguintes, todas as temperaturas são fornecidas não corrigidas em graus Celsius; e, a menos que indicado de outra forma, todas as proporções e percentagens são em peso. 25

Embora a presente invenção tenha sido descrita em referência às suas formas de realização especificas, deve ser entendido pelos especialista na técnica que podem ser realizadas várias modificações e os equivalentes podem ser substituídos, sem divergir do verdadeiro espírito e âmbito da invenção. Para além disso, podem ser realizadas muitas modificações e podem ser substituídos equivalentes sem divergir do verdadeiro espírito e âmbito da invenção. Para além disso, podem ser realizadas muitas modificações para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, passo ou passos de processo particulares, ao objectivo, espírito e âmbito da presente invenção. Todas essas modificações pretendem situar-se dentro do âmbito das reivindicações incluídas em anexo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Modelo de Rato para SCI

Animais: São alojados ratos Sprague-Dawley adultos do sexo feminino (Charles River, NY) , pesando 270-325 g, em ciclos de luz-escuridão de 12 horas e alimentação com ração para roedores ad libitum e foi fornecida água da torneira para beber. Todas as experiências dos animais são realizadas nas Instalações de Bem-estar Animal, sob as Orientações do NIH para estudos com animais. São utilizados, apenas, animais em bom estado de saúde. Uma semana antes dos processos cirúrgicos, os animais são tratados, diariamente, para os adaptar para medições da escala de avaliação da locomoção de campo aberto.

Processos Neurocirúrgicos: Os animais são anestesiados com uma injecção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). O local da ferida é preparado para a contusão SCI 26 utilizando o impactador NYU, por remoção dos pelos e esterilização da área da incisão ao longo da área inferior torácica dorsal, de acordo com o protocolo MASCIS, como descrito (Gruner, J. A. J. Neurotrauma (1992), 9:123-6; Basso, et al., J. Neurotrauma (1996), 13:343-59).

Antes da lesão, a pressão sanguinea é monitorizada, é recolhido o sangue arterial para medições de gás e é registada a temperatura rectal.

Exemplo 2: Processos na Contusão e Após contusão

Contusão: a contusão da medula espinal é realizada utilizando o método de contusão controlada por queda de um peso com um impactador NYU, utilizando o protocolo descrito acima (Gruner, J. A. J. Neurotrauma (1992), 9:123-126; Yong, et al., J. Neurotrauma (1998) 15:459-472)

Processos após lesão: Durante as 48 horas após a lesão, o tratamento é efectuado, são recolhidos dados e são recolhidas amostras de sangue e urina. Cerca de um terço dos ratos é eutanizado, 48 horas após a lesão, para a determinação do volume da lesão aguda. Os restantes são mantidos durante 14 a 28 dias, após a lesão, para permitir que fossem realizadas determinações da função motora (LRS/BBB).

Tratamento com Solulin™ Uma hora após a lesão, é administrada uma injecção única i. p. de 70 pg de Solulin™, dissolvido em 200 pL de soro fisiológico normal, a um grupo de três ratos. Os animais do controlo com veiculo, que tinham sofrido uma lesão completa, tal como o grupo de tratamento, receberam, apenas, soro fisiológico. Em algumas experiências, é 27 administrada uma segunda dose i. p. de 70 pg de Solulin™ dissolvido em 200 pL de soro fisiológico normal, 24 h após o impacto. Os animais de controlo (lesão simulada) foram sujeitos a todas as manipulações cirúrgicas, incluindo laminectomia, com excepção da lesão por queda de um peso.

Medição do aPTT É recolhido sangue para determinar os niveis plasmáticos do tempo da tromboplastina parcial activada (aPTT) , 3, 6, 12, 24 e 72 horas após SCI. É recolhido sangue da veia caudal, utilizando uma seringa para a tuberculina de 1 mL, retirando, aproximadamente, 1 mL de sangue para o interior de tubos pré-medidos, com ácido citrico. O sangue é imediatamente centrifugado, o plasma é removido e é congelado a -70 0 até os niveis do aPTT poderem ser medidos (Salem et al., J. Biol Chem. (1984), 259L12246-12251). As medições do nivel do aPTT demonstram que a actividade da trombomodulina é detectável durante, pelo menos, 24 horas após a injecção.

Foram utilizadas, pelo menos, três experiências distintas com três ratos por grupo de animais tratados com Solulin™ e controlo com veiculo.

Avaliação das lesões neurológicas: Foram realizadas medições da escala de avaliação da locomoção de campo aberto (LRS/BBB) (Basso, et al., J. Neurotrauma (1996) 13:343-59; Basso et al., Exp. Neurol. (1996) 139:244-256) por 3 observadores anónimos distintos, ao longo de um período de 24 dias após a SCI. Os resultados são registados e introduzidos num programa informático desenvolvido para a LRS e são analisados. 28

Exemplo 3: Exame Histológico de Tecido da Medula Espinal

As amostras fixadas de medula espinal são embebidas e seccionadas, tanto longitudinalmente, como horizontalmente, para avaliar e medir a área do local da lesão, na lesão e em segmentos adjacentes, com hematoxilina e eosina (H&E), tionina e outros corantes. Ver a Figura 3. (Bethea, et al., J. Neurotrauma (1999), 16:851-63). A Figura 4 mostra uma análise do volume da lesão e indica que foi verificada uma redução estatisticamente significativa do volume da lesão para o tratamento com Solulin™.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Festoff, Barry W.

Morser, Michael J. <120> Análogos da Trombomodulina para Utilização na Recuperação de Lesão da Medula Espinal <130> 51960AUSM1 <150> 60/229714 <151> 2000-08-31 <160> 2 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 3466 29

<212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (151)..(1875) <223> <220> <221> mat_peptide <222> (205) . . () <223> < 4 0 0 > 1 caggggctgc gcgcagcggc aagaagtgtc tgggctggga cggacaggag aggctgtcgc 60 catcggcgtc ctgtgcccct ctgctccggc acggccctgt cgcagtgccc gcgctttccc 120 cggcgcctgc acgcggcgcg cctgggtaac atg ctt ggg gtc ctg gtc ctt ggc 174

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly -15 gcg ctg gcc ctg gcc ggc ctg ggg ttc ccc gea ccc gea gag ccg cag 222 Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gin -10 -5 -1 1 5 ccg ggt ggc age cag tgc gtc gag cac gac tgc ttc gcg ctc tac ccg 270 Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro 10 15 20 ggc ccc gcg acc ttc ctc aat gcc agt cag ate tgc gac gga ctg cgg 318 Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gin lie Cys Asp Gly Leu Arg 25 30 35 ggc cac cta atg aca gtg ege tcc teg gtg gct gcc gat gtc att tcc 366 Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser Ser Vai Ala Ala Asp Vai Ile Ser 40 45 50 30 ttg cta ctg aac ggc gac ggc ggc gtt ggc cgc cgg cgc ctc tgg ate 414 Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile 55 60 65 70 ggc ctg cag ctg cca ccc ggc tgc ggc gac ccc aag cgc ctc ggg ccc 462 Gly Leu Gin Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro 75 80 85 ctg cgc ggc ttc cag tgg gtt acg gga gac aac aac acc age tat age 510 Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser 90 95 100 agg tgg gca cgg ctc gac ctc aat ggg gct ccc ctc tgc ggc ccg ttg 558 Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu 105 110 115 tgc gtc gct gtc tcc gct gct gag gcc act gtg ccc age gag ccg ate 606 Cys Vai Ala Vai Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile 120 125 130 tgg gag gag cag cag tgc gaa gtg aag gcc gat ggc ttc ctc tgc gag 654 Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu 135 140 145 150 ttc cac ttc cca gcc acc tgc agg cca ctg gct gtg gag ccc ggc gcc 702 Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala 155 160 165 gcg gct gcc gcc gtc tcg ate acc tac ggc acc ccg ttc gcg gcc cgc 750 Ala Ala Ala Ala Vai Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg 170 175 180 gga gcg gac ttc cag gcg ctg ccg gtg ggc age tcc gcc gcg gtg gct 798 Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Vai Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala 185 190 195 ccc ctc ggc tta cag cta atg tgc acc gcg ccg ccc gga gcg gtc cag 8.46 Pró Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gin 200 205 210 ggg cac tgg gcc agg gag gcg ccg ggc gct tgg gac tgc age gtg gag 894 Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu 215 220 225 230 aac ggc ggc tgc gag cac gcg tgc aat gcg ate cct ggg gct ccc cgc 942 Asn Gly Gly Cys Glu . His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg 235 240 245 tgc cag tgc cca gcc ggc gcc gcc ctg cag gca gac ggg cgc tcc tgc 990 Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys 250 255 260 acc gca tcc gcg acg cag tcc tgc aac gac ctc tgc gag cac ttc tgc 1038 Thr Ala Ser Ala Thr Gin Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys 265 270 275 gtt ccc aac ccc gac cag ccg ggc tcc tac tcg tgc atg tgc gag acc 1086 Val Pro Asn 280 Pro Asp Gin 285 Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 290 Met Cys Glu Thr 31 ggc tac cgg ctg gcg gee gac caa cac cgg tgc gag gac gtg gat gac 1134 Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp 295 300 305 310 tgc ata ctg gag ccc agt ccg tgt ccg cag ege tgt gtc aac aca cag 1182 Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gin Arg Cys Val Asn Thr Gin 315 320 325 ggt ggc ttc gag tgc cac tgc tac cct aac tac gac ctg gtg gac ggc 1230 Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly 330 335 340 gag tgt gtg gag ccc gtg gac ccg tgc ttc aga gee aac tgc gag tac 1278 Glu Cys Vai Glu Pro Vai Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr 345 350 355 cag tgc cag ccc ctg aac caa act age tac ctc tgc gtc tgc gee gag 1326 Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu 360 365 370 ggc ttc gcg ccc att ccc cac gag ccg cac agg tgc cag atg ttt tgc 1374 Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys 375 380 385 390 aac cag act gee tgt cca gee gac tgc gac ccc aac acc cag gct age 1422 Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp P.ro Asn Thr Gin Ala Ser 395 400 405 tgt gag tgc cct gaa ggc tac ate ctg gac gac ggt ttc ate tgc acg 1470 Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr 410 415 420 gac ate gac gag tgc gaa aac ggc ggc ttc tgc tcc ggg gtg tgc cac 1518 Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His 425 430 435 aac ctc ccc ggt acc ttc gag tgc ate tgc ggg ccc gac teg gee ctt 1566 Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu 440 445 450 gtc ege cac att ggc acc gac tgt gac tcc ggc aag gtg gac ggt ggc 1614 Vai Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly 455 460 465 470 gac age ggc tet ggc gag ccc ccg ccc age ccg acg ccc ggc tcc acc 1662 Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr 475 480 485 ttg act cct ccg gee gtg ggg ctc gtg cat teg ggc ttg ctc ata ggc 1710 Leu Thr Pro Pro Ala Vai Gly Leu Vai His Ser Gly Leu Leu Ile Gly 4 90 495 500 ate tcc ate gcg age ctg tgc ctg gtg gtg gcg ctt ttg gcg ctc ctc 1758 Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Vai Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu 505 510 515 32 tgc cac ctg cgc aag aag cag ggc gcc gcc agg gcc aag atg gag tac Cys His Leu Arg Lys Lys Gin Gly Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr 520 525 530 aag tgc gcg gcc cct tcc aag gag gta gtg ctg cag cac gtg cgg acc Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Vai Vai Leu Gin His Vai Arg Thr 535 540 545 550 gag cgg acg ccg cag aga ctc tgagcggcct ccgtccagga gcctggctcc Glu Arg' Thr Pro Gin Arg Leu 555 1806 gtccaggagc acagctggag tggcgagggg accactgggc ctcactaccg acctcgtggg gtttcctttg ctctctctac tcctagccct tcctcccagg tttgctctta aaataaaaat tcccagagca ctggactgtc ctgaattttg tgcaatttcc ttgctctaga actgcatgat aaataaaacc tgcccaatta ccttttggaa agaaatgcag tctgcagggg ttctggaata ctgtgcctcc aagaccctcc gtgattagag aatgatggca ggcgcaggag ctagggatga ttcttacctg aaactcccac ctcacattta aactgggcca gctgtctgct ggccatttgc aaataatttt. atagaaatta ttgctgtttt ttttttgtta· ttgcgagaag tcatgccaat gactctactg gggcctagcc tgtggcccct aatcctaggc gtgtgtctgc catgaaatat tcacccccag ccgcaccccc ggaggagaat attttgtaac ggtgagcgtt ctaaaatatt tatgtctcca ttgtcatgtg tgaagcaagc actcacctga cagacagaac tttttcacca aaacaaaggt cacccaaaga gatttgtact ttattactta agacaaacac tagcaattga gtcttgtgga ttaatcaggt gaacaagaat tccaccccat tcagtaattt agatçagtta ctttgctacc caagctgttt gagcctcggc gaagacacag attggtcggc tatttttttt gtatccactt acaggtaaac cccacttatt gtcaccctac ccctacatga gatttgctaa tgagatgtaa ggtatttatc gaaaaatggt tttttgacag ctcccaggag ctgtcactgt attgggagct cctcagagaa tggaagctgc ccagttcatg gaggacaacc taagtagcag aaagcacctt tcttctattc ctcttccgtg actgcgattt agccttctgg aagtatttag tgcacagctc tatcttggtg ccccattctt ctgtgcctga aacagaaaca tttatcctga aaggtattaa tttactttta aattgttgct tgttgaaaat acagttcaag tccttgtcac tgggaatgga tttctaccat cctgcccatg agaatctata attccagact gccaagtcag agctggcatt catggctaac acgtcactgg gtcccaggtc gcagaccttg gtttttgttt tccggtctct aatttttttt cctagttttc ccctacttct aaaacactaa aatttcagat attgatgttg aacagtgagc aatcttctta gttcagaagg aaagcttcaa tggtagacca tcctggagga ttcagagagg ggagctggtt tttaacaaga gcttccaatt gcccttattt 1854 1905 1965 2025 2085 2145 2205 2265 2325 2385 2445 2505 2565 2625 2685 2745 2805 2865 2925 2985 3045 3105 3165 3225 3285 3345 33 tcaagaaact gaggaatttt ctttgtgtag ctttgctctt tggtagaaaa ggctaggtac 3405 acagctctag acactgccac acagggtctg caaggtcttt ggttcagcta agccggaatt 3465 c 3466

<210> 2 <211> 575 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2

Gly Leu Gly -5

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala -15 -10

Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu -11 5 10

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro 15 20

Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 25 30

Ser Gin Ile Cys Asp Gly Leu Arg 35

Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser 40 45

Ser Vai Ala Ala Asp Vai Ile Ser 50

Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 55 60

Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile 65 70

Gly Leu Gin Leu Pro Pro Gly Cys 75

Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro 80 85

Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr 90

Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser 95 100

Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 105 HO

Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu 115

Cys Vai Ala Vai Ser Ala Ala Glu 120 125

Ala Thr Vai Pro Ser Glu Pro Ile 130

Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai 135 140

Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu 145 150

Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 155 34

Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala 160 165

Ala .Ala Ala Ala Vai Ser Ile Thr 170

Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg 175 180

Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro 185 190

Vai Gly Ser Ser Ala Ala Vai Ala 195

Pro Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys 200 205

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin 210

Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 215 220

Gly Ala Trp Asp Cys. Ser Vai Glu 225 230

Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 235

Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg 240 245

Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala 250

Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys 255 260

Thr Ala Ser Ala Thr Gin Ser Cys 265 270

Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys 275

Vai Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly 280 285

Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr 290

Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin 295 300

His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp 305 310

Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 315

Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin 320 325

Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 330

Pro Asn Tyr Asp Leu Vai Asp Gly 335 340

Glu Cys Vai Glu Pro Vai Asp Pro 345 350

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr 355

Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr 360 365

Ser Tyr Leu Cys Vai Cys Ala Glu 370

Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 375 380

Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys 385 390

Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp 395 35

Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 400 405 410

Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 415 420 425 430

Gly Phe Cys Ser Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 435 440 445

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Vai Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460

Asp Ser Gly Lys Vai Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 465 470 475

Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Vai Gly Leu 480 485 490

Vai His Ser Gly Leu Leu ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 495 500 505 510

Vai Vai Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gin Gly 515 520 525

Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 530 535 540

Vai Vai Leu Gin His Vai Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gin Arg Leu 545 550 555

Lisboa, 31 de Julho de 2007 36

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo recombinante da trombomodulina solúvel, o qual é resistente à oxidação e em que a metionina na posição 388 foi substituída por uma leucina, em que o análogo é numerado de acordo com a SEQ ID N°: 2 da trombomodulina nativa, para a produção de um medicamento para o tratamento de Lesões da Medula Espinal.
2. 2. Utilização da reivindicação 1, em que o análogo da trombomodulina é modificado nos resíduos de açúcar do domínio de glicosilação ligado a 0, da SEQ ID N°: 2 da trombomodulina nativa.
3. 3. Utilização da reivindicação 1 ou 2, em que o análogo da trombomodulina é modificado de forma a que o domínio de glicosilação ligado a 0 não apresente qualquer sulfato de condroitina.
4. 4. Utilização de uma das reivindicações anteriores, em que o análogo foi tornado resistente à clivagem por proteases.
5. 5. Utilização de uma das reivindicações anteriores, em que o análogo da trombomodulina (Solulin™) tem a sequência de aminoácidos da trombomodulina nativa (SEQ ID N°: 2) modificada nas posições seguintes: remoção dos aminoácidos 1-3 M388L 1 R456G H457Q S474A, e terminação em P490.
6. 6. Utilização de uma das reivindicações anteriores, em que o mamifero é um humano. Lisboa, 31 de Julho de 2007 2