CN115947861B - 一种高效杂交瘤融合方法 - Google Patents
一种高效杂交瘤融合方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115947861B CN115947861B CN202210878628.6A CN202210878628A CN115947861B CN 115947861 B CN115947861 B CN 115947861B CN 202210878628 A CN202210878628 A CN 202210878628A CN 115947861 B CN115947861 B CN 115947861B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- mgcp
- fusion
- cells
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 27
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 3
- -1 acridinium esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108010082093 Placenta Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 101150104214 HGPRT gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150062285 PGF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效杂交瘤融合方法，具体方法为构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合表达质粒载体；上述载体在骨髓瘤细胞SP2/0中转录翻译形成融合蛋白（命名为MGCP）并被转运至细胞表面；骨髓瘤细胞表面的MGCP蛋白可识别结合小鼠脾细胞表面的CD19蛋白，通过上述两种蛋白的结合可实现骨髓瘤细胞和脾细胞在物理空间上的定向紧密贴合；在PEG和电击诱导融合时，两种细胞的融合效率可提升10‑20倍。
Description
技术领域
本发明属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及一种高效杂交瘤融合方法。
背景技术
杂交瘤技术是在正常体细胞融合的基础上发展而来的，Kohler和Milstein在1975年首次实现免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成了B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体，此杂合体既具有骨髓瘤细胞能在体外培养中快速无限增殖的特点，又具有B淋巴细胞可分泌单克隆抗体的优点。传统经典的杂交瘤技术是利用PEG将HGPRT基因缺陷型骨髓瘤细胞SP2/0与免疫动物的脾细胞进行融合，利用HAT选择性培养基可将正确融合的杂交瘤细胞筛选和培养出来。再通过常规的检测技术如ELISA、FACS等，将能分泌针对特定蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤克隆筛选出来，利用有限稀释的方法对阳性克隆进行亚克隆，亚克隆后得到的细胞即是能分泌均一性单克隆抗体的细胞。
传统的杂交瘤技术虽然实现了单克隆抗体分泌细胞的永生化，但存在着细胞融合效率较低的问题，在融合体系中可能存在大量未融合的骨髓瘤细胞、脾细胞以及错误融合的骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞、脾细胞-脾细胞等，骨髓瘤细胞和脾细胞融合率约为几万分之一；同时使用高浓度的PEG对细胞具有毒害作用，不利于后续融合细胞的培养和筛选。
发明内容
传统的杂交瘤融合技术的融合效率较低，不能有效提供庞大的抗体库进行筛选高质量抗体，为解决融合效率低的问题，本发明提供一种高效杂交瘤融合方法。
在融合反应发生前脾细胞和骨髓瘤细胞通过细胞表面的配体-受体蛋白特异性性识别结合，上述两种细胞的紧密结合提高融合时脾细胞和骨髓瘤细胞发生细胞膜融合的概率，具体方法为：
S1、构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合序列，融合蛋白命名为MGCP，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
S2、对上述融合蛋白MGCP氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，得到优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S3、将上述核苷酸序列委托合成后构建至PLVX-puro慢病毒表达载体，上述载体转染骨髓瘤细胞SP2/0后转录翻译形成融合蛋白MGCP并被转运至细胞表面，MGCP识别结合小鼠脾细胞表面的CD19蛋白，通过上述两种蛋白的结合可实现骨髓瘤细胞和脾细胞在物理空间上的定向紧密贴合。在PEG和电击诱导融合时，两种细胞的融合效率可提升10-20倍。
融合蛋白MGCP经优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
atgtaccggatgcagctgctgagctgtatcgccctgtctctggccctggtcaccaacagcgaagtgaaagtgatcgagagcggcggaggactggttcagcctggcggatctctgaagctgtcttgtgccgccagcggcttcgacttcaacagatactggatgacctgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcgagatcaaccccgacagcagcagcatcaactacagccctagcctgaaggccaagttcatcatcagcagagacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagccaagtgcggagcgaggacacagccctgtactactgtgccagaagaggctacggcttcgattggctggtgtactggggacagggaaccctcgtgacagtttctgctggtggcggtggatctggcggaggtggaagcggaggcggaggatctgacatcctgatgatccagtctccaagcagcctgagcgctagcctgggagagagagtgtctctgacctgtagagccagccaggacatcggcagctccctgaattggctgcagcaagagcctgacggcaccatcaagagactgatctacgccacctccagcctggacagcggagtgcctaagagattcagcggcagcagaagcggcagcgactacagcctgacaatcagcagcctggaatccgaggacttcgtggactactactgcctgcagtacgccagctctccctacacatttggcggaggcaccaagctggaaatcaaaggtggcggaggaagtggcggcggaggttccggcggtggtggatctttttgggtgctcgtggttgtcggcggcgtgctggcttgttatagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgtag
融合蛋白MGCP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSEVKVIESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFNRYWMTWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSSINYSPSLKAKFIISRDNAKNTLYLQMSQVRSEDTALYYCARRGYGFDWLVYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILMIQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明将CD19scfv与IL2信号肽和CD28跨膜结构域融合串联表达成一个新的蛋白，对其相应的核苷酸序列进行密码子优化，最终得到对应的核苷酸序列，将核苷酸序列委托合成后构建至PLVX-puro慢病毒表达载体。
本发明在融合反应发生前脾细胞和骨髓瘤细胞通过细胞表面的配体-受体蛋白特异性性识别结合，两种细胞的紧密结合提高融合时脾细胞和骨髓瘤细胞发生细胞膜融合的概率。和传统杂交瘤细胞融合方法相比，本发明可提高杂交瘤融合效率10倍以上，为后续单克隆抗体筛选构建了相对比较庞大的群落，避免了传统方法需要多批次平行融合的问题。
附图说明
图1本发明单克隆抗体可用性评估中对照组和试验组试剂与国外知名品牌产品相关性分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 融合蛋白MGCP表达载体构建
在以往研究中，本公司发现了一个CD19scfv蛋白对CD19蛋白具有较高的亲和力和特异性；为了实现此CD19scfv在骨髓瘤细胞中表达后能被转运至细胞膜表面，本发明将CD19scfv与IL2信号肽和CD28跨膜结构域融合串联表达成一个新的蛋白（命名为MGCP蛋白）；MGCP蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,具有IL2信号肽(1-20AA)、CD19scfv片段(21-261AA)、CD28跨膜结构(277-303AA)以及接头序列，其中IL2信号肽负责引导MGCP蛋白翻译后转移至内质网进行修饰，CD28跨膜结构负责MGCP蛋白锚定至细胞表面，而CD19scfv负责识别结合脾细胞表面的CD19蛋白。
利用生物信息学方法，对上述氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子密码子优化，最终得到对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将上述核苷酸序列委托合成后构建至PLVX-puro慢病毒表达载体。
实施例2 慢病毒包装
转染前一天在10 cm细胞培养皿接种3.5*106个正常增殖的293T细胞，培养过夜后细胞汇合度达到70-80%；参照常规慢病毒包装方法将psPAX2、pMD2.G、pLVX-puro-CD19三种质粒按照3:1:4的比例混合，混合质粒与PEI使用比例为1:3。使用上述体系转染293T细胞，分别在转染后48h和72h收集细胞培养上清，并使用0.45μm滤膜过滤。
过滤后的上清，使用碧云天生物技术有限公司慢病毒浓缩试剂盒进行浓缩，具体过程如下：
1)取出4℃预冷的病毒沉淀试剂(4X)，按照1份病毒沉淀试剂(4X)和3份病毒上清液的比例混合。充分混匀后，在混匀仪低转速4℃混匀6h。
2)4℃，3500×g离心1h。小心吸除上清，切勿触及沉淀，不要剧烈晃动离心管。
3)4℃，3500×g离心1min，小心吸净少量的残留液体，切勿触及沉淀。
4)加入原病毒上清液体积的10%的病毒重悬液PBS，静置10min，然后使用移液器小心吹打20-30次，重悬病毒沉淀。吹打时避免产生气泡，剧烈吹打可能导致病毒失活。
5)4℃ 12,000×g离心3-5min，吸取上清即为浓缩的病毒。
实施例3 慢病毒瞬时转染骨髓瘤细胞SP2/0
将正常生长的SP2/0细胞按0.8*106个/孔传代接种至六孔细胞板，过夜培养后至细胞汇合度达到50%左右；感染前从冰箱取出病毒后37℃快速融化；将6孔细胞培养板中培养基弃掉，加入1mL新鲜培养基，将病毒原液按照1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000的稀释比例加入六孔板中，37℃培养4h，加入1mL新鲜培养基，感染24h后换液继续培养至48h；加入终浓度4ug/mL的puromycin进行抗性筛选，每2-3天换含有puromycin的培养基一次，直至未感染对照组细胞全部死亡为止，待感染组细胞状态良好时分别进行亚克隆，用FACS筛选出阳性克隆株。
实施例4 杂交瘤细胞制备
本实施例以PLGF抗原和sflt抗原分别各独立免疫20只小鼠，对比分析本发明对杂交瘤细胞的融合效率提升程度。
1、抗原免疫
按照常规流程使用抗原免疫小鼠，增强免疫到三针时进行尾静脉采血，用间接ELISA法检测血清效价，效价已达到融合要求。
2、细胞融合
将血清效价检验合格的5只小鼠处死取淋巴细胞；将每只小鼠的脾细胞平均分成两份，分别与载有MGCP蛋白的骨髓瘤细胞（试验组）和正常骨髓瘤细胞（对照组）按照1:3比例进行融合，融合后按照5*104个细胞/孔进行铺板，用HAT培养基进行筛选，培养一周后统计融合细胞克隆形成数量。
每只小鼠对应的试验组和对照组分别取三块板进行克隆计数后计算单板克隆平均值，然后使用平均值乘以总板数即为每组融合总克隆数。
表一 PlGF抗原免疫组杂交瘤融合效率统计
表二 sflt抗原免疫组杂交瘤融合效率统计
通过上述试验可以看出，载有MGCP蛋白的骨髓瘤细胞与脾细胞的融合效率较对照组提升10-20倍，效果非常显著。
实施例5 单克隆抗体可用性评估
对实施例4中的试验组和对照组PlGF杂交瘤细胞进一步培养、筛选和亚克隆，挑选两组中亲和力最高的抗体组合（见表三）在化学发光平台验证抗体的性能差异。
表三 对照组和试验组试剂使用抗体编号
具体过程如下：
1) 包被抗体偶联磁珠
取2ml活化缓冲液MES于离心管中；用移液器取5mg羧基磁珠于上述溶液中，充分混合后加入50ul 10mg/ml EDC溶液（须现用现配）后在37℃震荡反应40min；使用磁分离架分离磁珠，吸取上清丢弃；清洗一次后加入50ug包被抗体，37℃震荡反应3h。反应结束后使用PBST缓冲液清洗2次。使用5ml磁珠储存液重悬抗体磁珠，水浴超声二分钟后备用。磁珠储存液：50mM PB、1%Nacl、0.5%Casein、0.1%Triton X-100、0.1%proclin300。
2) 标记抗体偶联吖啶酯
使用移液器准确吸取1mg抗体加入到1ml 偶联反应缓冲液（20mM PB，pH 7.5）；在上述体系中加入吖啶酯活性分子，吖啶酯分子和抗体分子的比例为10:1，在37℃条件下反应60min后加入终止液停止偶联反应；将标记物转移到透析袋中，透析换液5次后回收相应的抗体吖啶酯标记物。将吖啶酯-抗体使用标记物稀释液稀释至1ug/ml，稀释后的溶液即为吖啶脂抗体试剂，上述标记物稀释液配方为20mM Tris、100mM KCl、1%BSA、0.2%Tween20、1%glycerol、0.2%proclin300。
3) 试剂检测
在全自动化学发光仪上使用上述检测模式为样本量50ul、磁珠抗体量10ul、吖啶酯抗体试剂100ul，上述反应体系在37℃孵育10min后清洗三次后在检测室加入相应的预激发液和激发液，并记录发光值。
使用两组试剂分别检测质控品，对比两组试剂的相关发光值强度；
使用两组试剂分别检测临床样本，和国外知名品牌罗氏试剂对比相关性。
4) 结果分析
表四 对照组和试验组试剂检测质控品结果
从表四可以看出试验组抗体组合比对照组抗体表现出更低的背景信号，同时检测质控品时相对反应值更高。
从图1可以看出试验组和对照组抗体制备的试剂均与罗氏试剂表现出较好的临床相关性，但试验组表现更加优异，相关性系数R2达到0.9971。说明本发明中对骨髓瘤细胞的基因工程改进，可以提升骨髓瘤细胞与脾细胞的融合效率，扩大了候选杂交瘤细胞库，同时不影响杂交瘤分泌抗体。
Claims (1)
1.一种高效杂交瘤融合方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合序列，融合蛋白命名为MGCP，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
S2、对上述融合蛋白MGCP氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，得到优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S3、将上述核苷酸序列委托合成后构建至PLVX-puro慢病毒表达载体，上述载体转染骨髓瘤细胞SP2/0后转录翻译形成融合蛋白MGCP并被转运至细胞表面，MGCP识别结合小鼠脾细胞表面的CD19蛋白，通过上述两种蛋白的结合可实现骨髓瘤细胞和脾细胞在物理空间上的定向紧密贴合；
IL2信号肽用于引导MGCP蛋白翻译后转移至内质网进行修饰；
CD28跨膜结构用于MGCP蛋白锚定至细胞表面；
CD19scfv用于识别结合脾细胞表面的CD19蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210878628.6A CN115947861B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种高效杂交瘤融合方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210878628.6A CN115947861B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种高效杂交瘤融合方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115947861A CN115947861A (zh) | 2023-04-11 |
| CN115947861B true CN115947861B (zh) | 2023-11-17 |
Family
ID=87284653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210878628.6A Active CN115947861B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种高效杂交瘤融合方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115947861B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423700A (zh) * | 2000-03-24 | 2003-06-11 | 麦克美特股份公司 | 含有针对nkg2d受体复合物的表位的结合位点的多功能多肽 |
| WO2018043996A1 (ko) * | 2016-08-29 | 2018-03-08 | 앱클론(주) | 하이브리도마 개발을 위한 신규 골수종 세포 |
| CN109843915A (zh) * | 2016-05-06 | 2019-06-04 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 基因工程化细胞及其制备方法 |
| CN110093370A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-08-06 | 安徽环球基因科技有限公司 | 一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法 |
-
2022
- 2022-07-25 CN CN202210878628.6A patent/CN115947861B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423700A (zh) * | 2000-03-24 | 2003-06-11 | 麦克美特股份公司 | 含有针对nkg2d受体复合物的表位的结合位点的多功能多肽 |
| CN109843915A (zh) * | 2016-05-06 | 2019-06-04 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 基因工程化细胞及其制备方法 |
| WO2018043996A1 (ko) * | 2016-08-29 | 2018-03-08 | 앱클론(주) | 하이브리도마 개발을 위한 신규 골수종 세포 |
| CN110093370A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-08-06 | 安徽环球基因科技有限公司 | 一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115947861A (zh) | 2023-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108490174B (zh) | 检测car-t细胞的方法及其应用 | |
| JP5663834B2 (ja) | 遺伝子組換え抗体の製造方法 | |
| US6340571B1 (en) | Antibodies specific for Staphylococcus aureus, and use thereof | |
| CN114807054B (zh) | 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒 | |
| CN114133452B (zh) | 一种肝素结合蛋白抗体及其试剂盒、应用 | |
| CN115073613A (zh) | 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用 | |
| CN115947861B (zh) | 一种高效杂交瘤融合方法 | |
| US10634676B2 (en) | Method and kit for simultaneously detecting human parvovirus B19 antigen and antibody | |
| CN116449002A (zh) | 一种筛查疫苗免疫和新型冠状病毒感染的胶体金层析试纸条及其应用 | |
| CN103388001B (zh) | 一种含凝血酶切割位点gst膜型表达载体及转染阳性细胞的方法 | |
| CN101985634B (zh) | 一种gfp膜型表达的载体及转染该载体的阳性细胞的分选方法 | |
| CN111548412A (zh) | 乙肝表面抗原单克隆抗体及制备方法、应用、氨基酸序列 | |
| CN115894675B (zh) | 新冠病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| WO2024145974A1 (zh) | 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| CN116003606B (zh) | 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| CN115894674B (zh) | 一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用 | |
| CN115166241B (zh) | 一种同时筛选记忆b细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用 | |
| Sádio et al. | Yeast surface display and cell sorting of antigen-binding Fc fragments | |
| WO2022244860A1 (ja) | 抗ノロウイルス抗体 | |
| US8349569B2 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
| CN117741162A (zh) | 一种检测供者特异性抗体的细胞学方法 | |
| CN114686443A (zh) | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2022244861A1 (ja) | 抗ノロウイルス抗体 | |
| CN114686444A (zh) | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114044819A (zh) | 全羊源单克隆抗体的高通量制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Rui Bing Inventor before: Deng Jiawu Inventor before: Wang Mingqiang Inventor before: Lv Yi Inventor before: Rui Bing |