JP2023502986A - 増強された機能を有する免疫細胞を提供する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、増強された機能を有する免疫細胞を生成する方法に関する。さらに具体的には、免疫細胞の機能を増強する方法であって、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように免疫細胞を改変することを含む方法が本明細書に開示される。ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように、免疫細胞に分化することができる幹細胞または前駆細胞を改変することを含む方法も本明細書に開示される。本方法によって作製された免疫細胞または幹細胞、および治療的処置における免疫細胞の使用も本明細書に開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９３８，０２２号明細書の優先権の利益を主張し、その内容全体を本明細書に組み込む。
本開示の技術分野
本開示は、増強された機能を有する免疫細胞を生成する方法に関する。さらに具体的には、免疫細胞の機能を増強する方法であって、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように免疫細胞を改変することを含む方法が本明細書に開示される。ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように、免疫細胞に分化することができる幹細胞または前駆細胞を改変することを含む方法も本明細書に開示される。本方法によって作製された免疫細胞または幹細胞、および治療的処置における免疫細胞の使用も本明細書に開示される。
配列表の参照による組み込み
２０２０年１１月３日に作成された、１０ＫＢの３７８３０ＷＯ＿ＮＤ２０１９０３＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名されたＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの疾患では、腫瘍細胞を殺傷するのに非常に効果的であることが示されている。Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を標的とする承認された生成物は、ＣＡＲ遺伝子構築物を患者由来（「自家」）Ｔ細胞に導入することによって生成される（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１３，１３（８）：５２５－４１）。他の血液悪性腫瘍、例えば多発性骨髄腫のためのＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）などの他の血球マーカーを標的とする追加の自家生成物が開発中である（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４５（７６５５）：４２３－４３１）。
血液系の癌では、ＣＡＲ－Ｔ細胞による臨床結果は印象的であったが、固形腫瘍の治療では同様の結果はまだ得られていない。固形腫瘍に対する効果の相対的欠如については、腫瘍部位への到達の制限、腫瘍微小環境の免疫抑制性、および固形腫瘍特異的標的抗原の欠如を含む複数の理由がある。さらに、投与されたＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性の欠如、および「疲弊」が、一定して観察される限界である（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２０１７，６８：１３９－１５２）。
ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＬＡＧ－３などの阻害受容体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を減弱させ、Ｔ細胞の疲弊を加速させ得る。ＰＤ－１をゲノム編集によって破壊すると、Ｔ細胞の抗腫瘍活性が改善されることが予測された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１７，２７（１）：１５４－１５７）。しかし、Ｔ細胞上のＰＤ－１の消失は、疲弊に対する感受性を増加させ、寿命を短縮し、抗腫瘍効果の改善をなくす可能性がある（Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＤ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０１５，２１２（７）：１１２５－３７）。これらの理由から、Ｔ細胞に対する遺伝子編集が抗腫瘍活性を増強するかどうかは、個別に評価される必要がある。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、細菌がバクテリオファージを記憶し破壊することを可能にする、細菌免疫系の重要な要素である。哺乳動物細胞では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮなどの他の遺伝子編集技術と同様に遺伝子編集に適用され得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、２つの主要な要素、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。具体的には、設計されたガイドＲＮＡは、ヒトゲノム内のユーザによって定義された切断部位に対して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼガイドＣａｓ９－ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体との複合体を形成する。ＲＮＰ切断は、ゲノム内で二本鎖ＤＮＡ切断をもたらし、二本鎖ＤＮＡ切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれるエラープローンプロセスによって修復される。ＮＨＥＪ経路では、ヌクレオチドの欠失または挿入（「インデル」）は、遺伝子の破壊またはノックアウトをもたらす（Ａｄｄｇｅｎｅ，ＣＲＩＳＰＲ １０１：Ａ Ｄｅｓｋｔｏｐ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１７）。ガイドＲＮＡのオンターゲット効率およびオフターゲット効果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ターゲティング用途の特異性および安全性を決定する。結果として、特別に設計されたガイドＲＮＡは、遺伝子破壊の成功に重要な役割を果たす。
近年の試験では、ＣＲＩＳＰＲを使用して免疫調節因子のゲノム規模の機能喪失スクリーニングが行われ、ＴＣＥ２、ＳＯＣＳ１、ＲＡＳＡおよびＣＢＬＢなどの負の調節因子を除去すると、インビトロでＴ細胞細胞傷害性が顕著に増加することが発見された（Ｓｈｉｆｒｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２０１８，１７５（７）：１９５８－１９７１，ｅ１５）。しかし、短期間のインビトロ細胞傷害性は、インビボでの機能または寿命に対する遺伝子阻害または遺伝子欠失の効果に対する誘導を制限する。遺伝子の阻害が、その活性または寿命を含め、免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などを含む）の機能に及ぼし得る潜在的な効果は、インビトロおよびインビボでさらに広範囲に評価される必要がある。
増強された免疫細胞は癌に対する潜在的な武器であるが、免疫細胞産物を数値的に生成し、拡大培養し、特性評価するという課題が存在する。免疫細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成することができる。したがって、多能性幹細胞技術は、理論的には、多能性幹細胞が無制限の再生可能な細胞源を提供することから、極めて有望な技術である。幹細胞（例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から、複数の病原体および癌にも応答することができる広範囲の標的認識系（ＴＣＲ／ＣＡＲ／細胞傷害性受容体）も含め、増強された能力を有する免疫細胞の効果的に無制限の供給を直接もたらす能力は、大きな商業的機会である。したがって、これは、ｉＰＳＣの生存能、自己再生、増殖能、および免疫細胞に分化する能力に対する特定の目的の遺伝子の阻害の影響を理解することにも関連する。
Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１３，１３（８）：５２５－４１ Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４５（７６５５）：４２３－４３１ Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２０１７，６８：１３９－１５２ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１７，２７（１）：１５４－１５７ Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＤ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０１５，２１２（７）：１１２５－３７ Ａｄｄｇｅｎｅ，ＣＲＩＳＰＲ １０１：Ａ Ｄｅｓｋｔｏｐ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１７ Ｓｈｉｆｒｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２０１８，１７５（７）：１９５８－１９７１，ｅ１５
本明細書では、いくつかの遺伝子の阻害が、インビボで細胞傷害性細胞の持続性および抗腫瘍活性を増強したことが実証されている。
一態様では、免疫細胞の機能を増強する方法が本明細書で提供される。該方法は、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子（すなわち、１または複数の遺伝子）の機能を阻害するように免疫細胞を改変することを含む。
別の態様では、免疫細胞に分化することができる幹細胞を改変する方法が本明細書で提供される。該方法は、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように幹細胞を改変することを含む。いくつかの実施形態では、改変された幹細胞は、免疫細胞にさらに分化し、上記少なくとも１つの遺伝子の機能は、免疫細胞内で阻害される。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、場合により低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸を介して、ｍＲＮＡのレベルまたは機能を低下させることによって達成される。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、場合により抗体または小分子を使用することによって、該遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルまたは活性を低下させることによって達成される。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子編集系によって達成される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるガイドＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを利用する。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞などの細胞を含む）またはＮＫ細胞から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成された改変された細胞、例えば、改変された免疫細胞または改変された幹細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成された改変された免疫細胞は、１または複数の標的抗原を認識する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＴＡＧ－７２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される。
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって生成された免疫細胞が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に開示される方法によって生成された改変された幹細胞が本明細書で提供される。
一態様では、少なくとも１つの遺伝子の機能が、改変されていない免疫細胞と比較して改変された免疫細胞内で阻害され、少なくとも１つ（すなわち、１または複数）の遺伝子が、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される、改変された免疫細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ２遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、Ａ２ＡＲ遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＦＡＳ遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ１遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子は、改変された免疫細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２から選択される複数の遺伝子が阻害される。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞内の遺伝子の機能の阻害は、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルもしくは機能の低下、または該遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルもしくは活性の低下に起因する。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、該遺伝子の核酸配列における改変に起因する。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞などの細胞を含む）またはＮＫ細胞から選択される。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、１または複数の標的抗原を認識する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＴＡＧ－７２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子の核酸配列における改変を含む、免疫細胞に分化することができる改変された幹細胞が本明細書で提供され、改変は、少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害し、少なくとも１つの遺伝子は、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ２遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、Ａ２ＡＲ遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＦＡＳ遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ１遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子は、改変された幹細胞内で阻害される。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２から選択される複数の遺伝子が阻害される。
いくつかの実施形態では、改変された幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
いくつかの実施形態では、改変された幹細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む。
さらなる態様では、標的遺伝子の配列を編集することができるガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含む、免疫細胞の機能を増強するための組成物が本明細書で提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号２～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。
別の態様では、本明細書に開示される改変された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象の病態を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、病態は、癌、感染症、自己免疫障害、臓器の線維症、または子宮内膜症である。
この特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許または特許出願公開の写しは、請求、および必要とされる手数料の支払いに応じて特許庁によって提供される。
図１Ａから図１Ｂは、改変された免疫細胞の抗腫瘍活性を評価する例示的な戦略を示す。（Ａ）免疫調節遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の評価のために実施される戦略の概略図であって、実施例で使用される初代Ｔ細胞に対するレンチウイルスＣＡＲ形質導入、遺伝子ターゲティングおよび機能分析の代表的なタイムラインを示す概略図。（Ｂ）ＮＫ－９２細胞に対して、免疫調節遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトに続いて、レンチウイルスＣＡＲ形質導入および機能分析を行った、改変されたＮＫ－９２細胞の生成の代表的なタイムライン。 図２Ａから図２Ｂは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するためのヒト初代Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入を示す。（Ａ）この試験で使用したＴＡＧ－７２特異的ＣＡＲ構築物の概略図。（Ｂ）初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲの形質導入効率。レンチウイルスベクターによる形質導入の１０日後に発現を調査した。各ドットプロット内に埋め込まれた値は、ＣＡＲ＋事象の頻度を生存可能な単一細胞の割合として表す。（ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す）。 図３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰトランスフェクション後のＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖曲線（ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す）を示す。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＰＤ－１ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＰＤ－１を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／Ａ２ＡＲ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、Ａ２ＡＲを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＦＡＳ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＦＡＳを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＲＣ３Ｈ２を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＴＧＦＢＲ１ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＴＧＦＢＲ１にドミナントネガティブ変異を導入するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＴＧＦＢＲ２ ＫＯ Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと、ＴＧＦＢＲ２にドミナントネガティブ変異を導入するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとを形質導入されたＴ細胞。 図４Ａから図４Ｄは、ガイドＲＮＡ形成ＲＮＰのトランスフェクションが、ＣＡＲ－Ｔ細胞内の特定の遺伝子のオープンリーディングフレームに挿入および欠失（インデル）を導入することを示す。Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）アッセイによって、インデルの頻度を評価した。（Ａ）ＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞（「編集済み試料」）からのＳａｎｇｅｒ配列決定トレースは、非トランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞（「対照試料」）とは対照的に、切断部位の下流の塩基の異種混合を示す（配列番号１７は、編集済み試料からの２８１～３４６ｂｐを示す；配列番号１８は、対照試料からの２８１～３４６ｂｐを示す）。対照試料の黒い下線領域はガイド配列を表し、水平の赤い点線の下線領域は関連するＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）部位である。両トレース上の垂直の黒い点線は、切断部位を表す。（Ｂ）ＲＣ３Ｈ２ ＲＮＰトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞由来のゲノムＤＮＡにおける各編集済み配列（正規化された）の寄与の相対的パーセンテージ。それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６に、上から下への配列を示す。（Ｃ）ＲＣ３Ｈ２ ＲＮＰトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞の編集済み集団全体におけるインデルサイズの分布。フレーム外インデルパーセンテージとは、フレームシフトを示すかまたは２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。（Ｄ）ＲＮＰトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＣＥアッセイ結果の要約。この試験で使用した代表的なガイドＲＮＡによって、ＲＮＰ複合体を形成した（ＰＤ－１、配列番号１；ＲＣ３Ｈ１、配列番号２；ＲＣ３Ｈ２、配列番号４；Ａ２ＡＲ、配列番号７；ＦＡＳ、配列番号９；ＴＧＢＦＢＲ１、配列番号１１；ＴＧＦＢＲ２、配列番号１４；ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す）。 図５Ａから図５Ｈは、遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＴＡＧ－７２ｈｉ発現標的細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の強力な細胞殺傷を媒介するが（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅおよび図５Ｇ）、ＴＡＧ－７２－ｎｅｇ／低癌標的細胞（ＭＥＳ－ＯＶ細胞株）の強力な細胞殺傷を媒介しない（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆおよび図５Ｈ）ことを示す。標的細胞をプレートに一晩接着させた後、ＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター対標的比１：１で加えた。非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）を対照として殺傷アッセイに含めた。細胞インピーダンス（平均±ＳＤ、正規化された細胞指数（ＮＣＩ）として表される）を２０時間にわたってモニタリングした。通常の増殖条件下での標的細胞増殖（「標的細胞のみ」）も全体を通してモニタリングした。（技術的３連で行った、ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す）。ＣＡＲ－Ｔ（図５Ａ～図５Ｈ）：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＰＤ－１（図５Ａ～図５Ｂ）：ＰＤ－１ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＲＣ３Ｈ１（図５Ｃおよび図５Ｄ）：ＲＣ３Ｈ１ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＲＣ３Ｈ２（図５Ｃおよび図５Ｄ）：ＲＣ３Ｈ２ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；Ａ２ＡＲ（図５Ｅおよび図５Ｆ）：Ａ２ＡＲノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＦＡＳ（図５Ｅおよび図５Ｆ）：ＦＡＳノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＴＧＦＢＲ１（図５Ｇおよび図５Ｈ）：ＴＧＦＢＲ１ドミナントネガティブＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＴＧＦＢＲ２（図５Ｇおよび図５Ｈ）：ＴＧＦＢＲ２ドミナントネガティブＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞。 図６は、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス異種移植モデルにおけるＯＶＣＡＲ－３卵巣腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。ＮＳＧマウス４匹／群に、１×１０７個のＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞（ＴＡＧ－７２陽性）を皮下投与した。腫瘍が約１５０～２００ｍｍ３に増殖した際に、５日間隔で静脈内注射によって２用量の５×１０６個のＴ細胞を養子移入した。値およびエラーバーは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３±ＳＥＭ）を表す。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＰＤ－１ ＫＯ Ｔ：ＰＤ－１遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；平均±ＳＥＭ；ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す。 図７は、ＯＶＣＡＲ－３卵巣腫瘍ＮＳＧマウス異種移植モデルにおけるＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＮＳＧマウス４匹／群に、１×１０７個のＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞（ＴＡＧ－７２陽性）を皮下投与した。腫瘍が約１５０～２００ｍｍ３に増殖した際に、５日間隔で静脈内注射によって２用量の５×１０６個のＴ細胞を養子移入した。値およびエラーバーは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３±ＳＥＭ）を表す。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ Ｔ：ＲＣ３Ｈ１遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ：ＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ Ｔ：ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブル遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞。＊＊ｐ＜０．０１、全群の平均をＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ対照群と比較するＧｒｅｉｓｓｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正およびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較一元配置ＡＮＯＶＡ検定による混合効果分析。ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す。 図８は、ＯＶＣＡＲ－３卵巣腫瘍ＮＳＧマウス異種移植モデルにおけるＡ２ＡＲおよびＦＡＳ遺伝子ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＮＳＧマウス４匹／群に、１×１０７個のＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞（ＴＡＧ－７２陽性）を皮下投与した。腫瘍が約１５０～２００ｍｍ３に増殖した際に、５日間隔で静脈内注射によって２用量の５×１０６個のＴ細胞を養子移入した。値およびエラーバーは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３±ＳＥＭ）を表す。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／Ａ２ＡＲ ＫＯ Ｔ：Ａ２ＡＲ遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＦＡＳ ＫＯ Ｔ：ＦＡＳ遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．００１、全群の平均をＣＡＲ－Ｔ対照群と比較する二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較試験。ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す。 図９は、ＯＶＣＡＲ－３卵巣腫瘍ＮＳＧマウス異種移植モデルにおけるＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２ドミナントネガティブ遺伝子変異ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＮＳＧマウス４匹／群に、１×１０７個のＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞（ＴＡＧ－７２陽性）を皮下投与した。腫瘍が約１５０～２００ｍｍ３に増殖した際に、５日間隔で静脈内注射によって２用量の５×１０６個のＴ細胞を養子移入した。値およびエラーバーは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３±ＳＥＭ）を表す。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ：ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＴＧＦＢＲ１ ＫＯ Ｔ：ＴＧＦＢＲ１ドミナントネガティブ遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＴＧＦＢＲ２ ＫＯ Ｔ：ＴＧＦＢＲ２ドミナントネガティブ遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、全群の平均をＣＡＲ－Ｔ対照群と比較する二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較試験。ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す。 図１０は、Ｒａｊｉリンパ腫腫瘍ＮＳＧマウス異種移植モデルにおけるＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトによるＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＮＳＧマウス４匹／群に、Ｒａｊｉ腫瘍細胞（ＣＤ１９陽性）を皮下投与した。腫瘍接種の３日後、静脈内注射によって、５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞の単回用量を用いてマウスを処置した。（Ａ）腫瘍サイズを２３日間モニタリングした。値およびエラーバーは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３±ＳＥＭ）を表す。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ補正による複数のｔ検定を行って、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞群を非トランスフェクトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。（＊ｐ＜０．００５；＊＊ｐ＜０．００１）（Ｂ）Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して、カプラン・マイヤー生存曲線を分析した。ＮＴ：非形質導入Ｔ細胞；ＣＤ１９ ＣＡＲ：ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ：ＲＣ３Ｈ１遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ：ＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ：ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブル遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞。ドナー１例から得られたＴ細胞の代表的なデータを示す。 図１１は、継続的な活性化曝露後の、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ＫＯを有するまたは有しないＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞上の活性化マーカーの発現を示す。グラフは、７日間の抗原曝露後のＣＡＲ＋細胞上の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を示す。単一の健常ドナーからＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。結果は、技術的２連の平均±ＳＤを表す。 図１２は、シングルおよびダブルノックアウトＴ細胞におけるＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウト分析を示す。ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ガイドＲＮＡ形成ＲＮＰをヒト活性化Ｔ細胞にトランスフェクトして、ＲＣ３Ｈ１またはＲＣ３Ｈ２シングルＫＯ（ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ Ｔ細胞またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞）、またはＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯ Ｔ細胞（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ Ｔ細胞）を生成した。ＩＣＥ分析を使用して、ノックアウト効率を分析した。フレーム外インデルパーセンテージとは、フレームシフトを示すかまたは２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。 図１３は、ＣＡＲを有しないＴ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋）の機能に対するＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯの効果を示す。Ｔ細胞±ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）（ＤＢ）の存在下、１：１のビーズ対細胞比でＴ細胞拡大培養培地中で少なくとも９２時間維持した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）アッセイでエフェクター細胞を使用する前に、ビーズを磁気的に除去した。１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、標的癌細胞（この場合、ＯＶＣＡＲ－３）にエフェクター細胞を加えた。ＮＣＩを２０時間にわたってモニタリングした。いずれの条件でも、標的細胞の排除（ＮＣＩの減少として観察された）が見られた。重要なことに、継続的なＣＤ３／ＣＤ２８媒介活性化の後、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子が遺伝的に欠失した細胞は、インビトロで標的細胞をさらに効果的に排除することができた。結果は、生物学的およびアッセイ内の３連の平均±ＳＥＭを表す。 図１４は、シングルおよびダブルノックアウトＮＫ－９２細胞におけるＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウト分析を示す。ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ガイドＲＮＡ形成ＲＮＰをＮＫ－９２細胞にトランスフェクトして、ＲＣ３Ｈ１またはＲＣ３Ｈ２シングルＫＯ（ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ ＮＫ－９２細胞またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２）、またはＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯ ＮＫ－９２細胞（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ＮＫ－９２）を生成した。ＩＣＥ分析を使用して、ノックアウト効率を分析した。フレーム外インデルパーセンテージとは、フレームシフトを示すかまたは２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 図１５は、ＮＫ－９２細胞の機能に対するＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯの効果（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ有りおよび無し）を示す。リアルタイム細胞モニタリングシステム、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）を使用して、ＮＫ細胞株、ＮＫ－９２±ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ（緑色）またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ（紫色）またはＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ（橙色）±ＴＡＧ－７２ ＣＡＲがインビトロで癌細胞を排除する能力を評価した。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＮＫ－９２細胞株においてＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子を欠失させた。標的癌細胞（ＭＥＳ－ＯＶ（左パネル）またはＯＶＣＡＲ－３（右パネル）に、Ｅ：Ｔ比１：１で、得られたＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２エフェクター細胞を加えた。ＮＣＩを４０時間にわたってモニタリングした。いずれの条件でも、標的細胞の排除（標的細胞のみ（青色）と比較したＮＣＩの減少として観察された）が観察された。結果は、技術的３連の平均±ＳＥＭを表す。（Ｂ）ＮＫ－９２細胞の追加の遺伝子操作を行って、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを導入した。レンチウイルス形質導入をトランスフェクション後に行った。培養中約７２時間後のフローサイトメトリーによって形質導入効率を評価し、ここで、各ドットプロット内に埋め込まれた値は、生存可能な単一細胞の頻度としてのＣＡＲ＋細胞の割合を表す。蛍光活性化細胞選別を使用して、得られたＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞を単離し、それらのインビトロ機能を以前に記載されたように評価した。（Ｃ）ＮＣＩを４０時間にわたってモニタリングした。結果は平均±ＳＥＭを表し、ｎ＝１～３である。 図１６は、養子細胞療法のための細胞源としてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成を示す。ｉＰＳＣから遺伝子ノックアウト免疫細胞を誘導するワークフロー。ｉＰＳＣをトランスフェクトして、目的の遺伝子をノックアウトする。次いで、これらの細胞を配列決定してノックアウトを特性評価および検証してから、ＣＤ３４＋細胞および免疫細胞に分化させる。 図１７Ａから図１７Ｂは、ｉＰＳＣにおけるＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯ（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣ）が、多能性に影響を及ぼさないことを示す。これを、（Ａ）分化細胞が存在しない形態（スケールバー＝２００μｍ）、および（Ｂ）ｉＰＳＣマーカーＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＳＳＥＡ－４に関するフローサイトメトリー分析によって特性評価した。ヒストグラムプロットが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣ試料のいずれかからの培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。全生細胞の９９％超が、あらゆるｉＰＳＣマーカーを発現する。 図１８Ａから図１８Ｃは、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ガイドＲＮＡ形成ＲＮＰのトランスフェクションが、ｉＰＳＣ内の特定の遺伝子のオープンリーディングフレームに挿入および欠失（インデル）を導入することを示す。ＲＣ３Ｈ１ ｇＲＮＡおよびＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡを同時トランスフェクトしたｉＰＳＣ（「編集済み試料」）からのＳａｎｇｅｒ配列決定トレースは、非トランスフェクトｉＰＳＣ（「対照試料」）とは対照的に、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（Ａ）およびＲＣ３Ｈ２遺伝子（Ｂ）の切断部位の下流の塩基の異種混合を示す（Ａでは、配列番号２７は、編集済み試料からの１８４～２４９ｂｐを示し、配列番号２８は、対照試料からの１８３～２４８ｂｐを示す；Ｂでは、配列番号２９は、編集済み試料からの２７０～３３６ｂｐを示し、配列番号３０は、対照試料からの２７２～３３７ｂｐを示す）。対照試料の黒い下線領域はガイド配列を表し、水平の赤い点線の下線領域は関連するＰＡＭ部位である。両トレース上の垂直の黒い点線は、切断部位を表す。（Ｃ）ＲＣ３Ｈ１ ｇＲＮＡおよびＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡを同時トランスフェクトしたｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲノックアウト分析。ＩＣＥ分析を使用して、ＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子のノックアウト効率を評価した。フレーム外インデルパーセンテージとは、フレームシフトを示すかまたは２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 図１９は、ｉＰＳＣでは、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯは、ｉＣＤ３４＋細胞への分化を阻止しないことを示す。未染色細胞と、ＣＤ３４＋に対する抗体によって染色した細胞とをフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムプロットが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣ試料のいずれかからの培養物中の全生ＣＤ３４＋細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣＨ３２遺伝子の両方の欠失は、ｉＣＤ３４細胞のサブセットへのｉＰＳＣ発達を妨げなかった。 図２０は、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯを含むｉＰＳＣが、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６のＮＫ細胞傷害性受容体発現を有するＣＤ５６＋細胞に分化することができることを示す。ＣＤ５６＋ヒストグラムが、生成された培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＮＫｐ４６プロットおよびＮＫＧ２Ｄプロットは、ＣＤ５６＋細胞をゲートオフした。各それぞれの受容体に対する各抗体の陽性染色を示すために、未染色対照およびアイソタイプ対照を示す。ＮＫ機能性受容体（ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄ）とＣＤ５６との共発現は、ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣに由来するＣＤ５６＋細胞が、ＮＫ媒介性細胞傷害機能を果たす可能性を有することを示す。 図２１Ａから図２１Ｂは、ｉＰＳＣでは、Ａ２ＡＲ ＫＯが、多能性に影響を及ぼさないことを示す。これを、（Ａ）分化細胞が存在しない形態（スケールバー＝２００μｍ）、および（Ｂ）ｉＰＳＣマーカーＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＳＳＥＡ－４に関するフローサイトメトリー分析によって特性評価した。ヒストグラムプロットが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ試料のいずれかからの培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。全生細胞の９５％超が、あらゆるｉＰＳＣマーカーを発現する。 図２２Ａから図２２Ｃは、Ａ２ＡＲガイドＲＮＡ形成ＲＮＰのトランスフェクションが、ｉＰＳＣ内のＡ２ＡＲ遺伝子のオープンリーディングフレームに挿入および欠失（インデル）を導入することを示す。インデルの頻度をＩＣＥ分析によって評価した。（Ａ）Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ（「編集済み試料」）からのＳａｎｇｅｒ配列決定トレースは、非トランスフェクトｉＰＳＣ（「対照試料」）とは対照的に、切断部位の下流の塩基の異種混合を示す。配列番号３１は、編集済み試料からの１３４～１９９ｂｐを示す；配列番号３２は、対照試料からの１３７～２０２ｂｐを示す。対照試料の黒い下線領域はガイド配列を表し、水平の赤い点線の下線領域は関連するＰＡＭ部位である。両トレース上の垂直の黒い点線は、切断部位を表す。（Ｂ）Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ由来のゲノムＤＮＡにおける各編集済み配列（正規化された）の寄与の相対的パーセンテージ。それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７および３８に、上から下への配列を示す。（Ｃ）ＲＮＰトランスフェクトｉＰＳＣの編集済み集団全体におけるインデルサイズの分布。フレーム外インデルパーセンテージとは、フレームシフトを示すかまたは２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 図２３は、ｉＰＳＣにＡ２ＡＲ ＫＯを含めても、ｉＣＤ３４＋細胞へのその分化は阻止されないことを示す。ＣＤ３４に対する抗体によって染色した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。未染色細胞と、アイソタイプ対照によって染色した細胞とを対照として含めた。ヒストグラムプロットが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ試料のいずれかから生成された培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＫＯを含めても、ｉＣＤ３４＋細胞のサブタイプの発達は阻止されない。 図２４は、Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣが、ｉＮＫ細胞に分化することができることを示す。未染色細胞と、ＮＫ細胞マーカーに対する抗体によって染色した細胞とをフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ５６＋ヒストグラムが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ試料のいずれかから生成された培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。各それぞれの受容体に対する各抗体の明確な陽性染色を示すために、未染色試料を示す。適切なアイソタイプ対照も実行し、陰性であった。ＮＫ機能性受容体（ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄ）の発現は、Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣに由来するＣＤ５６＋細胞がｉＮＫ細胞であり、細胞傷害機能を潜在的に有することを実証する。 図２５は、Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣが、インビトロ殺傷活性が増強された機能的ｉＮＫ細胞に分化することができることを示す。ｉＮＫ細胞は、非トランスフェクトｉＰＳＣおよびＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣに由来した。得られたｉＮＫ細胞の機能を、ＯＶＣＡＲ－３細胞を標的として使用したリアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して、インビトロで評価した。１：２のエフェクター対標的比を使用した。（Ａ）共培養の少なくとも１０時間にわたって１５分間隔でＮＣＩの変化を記録し、ここで、ＮＣＩの減少は標的細胞死を示す。（Ｂ）５時間（左パネル）および１０時間（右パネル）の両方の共培養での標的細胞のみの対照と比較したｉＮＫ細胞の細胞傷害率として示される、（Ａ）から得られた結果。細胞は、単一のｉＮＫ分化に由来した。各データポイントは、技術的複製を表す。
本明細書を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記載された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解される。
明細書および特許請求の範囲を通して、用語「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味すると解釈されるべきであり、文脈上他に明確に指示されない限り、「２つ以上」を除外すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「核酸構築物」は、一般に、人工的または組換え的に構築または作製された核酸分子を指し、核酸ベクターとも区別なく呼ばれる。例えば、核酸構築物は、細胞内で転写されることが望まれる目的のヌクレオチド配列を含み、いくつかの例では、所望の機能のＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｇＲＮＡ）を生成し、他の例では、目的のタンパク質（例えばＣａｓタンパク質）に翻訳されるｍＲＮＡを生成するように作製され得る。核酸構築物内の目的のヌクレオチド配列は、５’調節領域（例えば、異種プロモーターなどのプロモーター）および／または３’調節領域（例えば、異種３’ＵＴＲなどの３’非翻訳領域（ＵＴＲ））に作動可能に連結され得る。核酸構築物は、環状形態（例えばプラスミド）もしくは線状形態であり得るか、組込み核酸（すなわち、宿主細胞の染色体に組み込まれ得る、例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）であり得るか、またはエピソームのままであり得る（例えばプラスミド）。
一般的な説明
本明細書では、１または複数の選択された遺伝子の機能を阻害することによって、増強された機能を有する免疫細胞を提供する方法が開示される。例えば、本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用した１または複数の選択された遺伝子の除去が、インビボで細胞傷害性リンパ球の持続性および抗腫瘍活性を増強することが実証されている。したがって、方法は、免疫細胞、または免疫細胞に分化することができる幹細胞において、１または複数の選択された遺伝子の機能を阻害することによって提供される。本方法によって作製された免疫細胞または幹細胞、および治療的処置における免疫細胞の使用も本明細書に開示される。
免疫細胞
本明細書で使用される「免疫細胞」は、哺乳動物免疫系の細胞、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞）、好中球および単球（マクロファージおよび樹状細胞を含む）、ならびに哺乳動物免疫系の細胞に由来する細胞株を含むと理解されるべきである。免疫細胞は、哺乳動物対象から単離され得るか、哺乳動物対象の免疫細胞に由来する細胞株の培養物から回収され得るか、または幹細胞からの分化によって生成され得る。
本開示は、増強された機能を有する免疫細胞を提供することに関する。「増強された機能」とは、本明細書に開示される改変または操作の結果として提供される免疫細胞が、対照免疫細胞（すなわち、改変または操作を伴わない免疫細胞）と比較して、活性（例えば細胞傷害性）、増殖、生存、持続性および／または浸潤の増強を示すことを意味する。免疫細胞の細胞傷害性とは、一般に受容体に基づく機構を介して、免疫細胞が標的細胞を殺傷する能力を指す。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性免疫細胞、例えば細胞傷害性リンパ球である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。
「Ｔ細胞」への言及は、Ｔ細胞受容体を含む任意の細胞への言及として理解されるべきである。これに関して、Ｔ細胞受容体は、α鎖、β鎖、γ鎖またはδ鎖のうちのいずれか１または複数を含み得る。当業者によって理解されるように、ＮＫＴ細胞はＴ細胞受容体も発現し、したがって、標的抗原特異的ＮＫＴ細胞も本発明に従って生成することができる。本発明は、Ｔ細胞の任意の特定のサブクラスに限定されることを意図するものではないが、一実施形態では、対象Ｔ細胞は、α／β ＴＣＲ二量体を発現する。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋キラーＴ細胞またはＮＫＴ細胞である。本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性細胞としても知られている。適応免疫系の主要部分として、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、主に感染細胞を標的とし破壊するために細胞内環境を走査する。細胞内内容物に由来する小さなペプチド断片は、プロセシングされ、細胞表面に輸送され、そこでＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される。ただし、ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、単にウイルス感染に応答するだけでなく、癌を含む損傷細胞または異常細胞を監視および除去することによって、追加のレベルの免疫監視を提供する。ＭＨＣ Ｉ提示ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞認識は、通常、細胞傷害性顆粒もしくはリンホカインの放出、または対象細胞を破壊するためのＦＡＳ／ＦＡＳＬ相互作用を介したアポトーシス経路の活性化のいずれかをもたらす。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩに関連して抗原提示細胞によって提示されるペプチドを認識し、Ｂ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を調節するように設計されたサイトカインの放出をもたらす。細胞傷害活性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、様々な免疫応答に観察されている。さらに、ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビトロでＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の細胞傷害性を示し、さらに長い抗腫瘍活性のためにインビボでＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも性能が優れていた（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１８；３（１０）：ｅ９９０４８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ｎｏｖ ２２；９（４１７），ｅａａｇ１２０９を参照）。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴまたはＴ／ＮＫ細胞とも呼ばれる）は、セミインバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲα－β）と、典型的にはナチュラルキラー細胞に関連する表面抗原とを発現するＴ細胞の特殊な集団である。ＮＫＴ細胞上のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を共通に認識するという点で独特である。ほとんどのＮＫＴ細胞は、インバリアントＴＣＲアルファ鎖と、少数のＴＣＲベータ鎖のうちの１つとを発現する。Ｉ型ＮＫＴ細胞上に存在するＴＣＲは、一般に、抗原アルファ－ガラクトシルセラミド（アルファ－ＧａｌＣｅｒ）を認識する。この群の中で、ＣＤ４＋ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４－ＣＤ８－細胞を含む識別可能な亜集団が同定されている。ＩＩ型ＮＫＴ細胞（または非インバリアントＮＫＴ細胞）は、さらに広範囲のＴＣＲ α鎖を発現し、アルファ－ＧａｌＣｅｒ抗原を認識しない。ＮＫＴ細胞は、複数の、多くの場合反対の効果、例えば、炎症の促進、または寛容を含む免疫抑制の誘導のいずれかを有するサイトカインを産生する。結果として、それらは、抗菌性免疫応答および抗ウイルス性免疫応答に寄与し、腫瘍関連免疫監視を促進し、自己免疫疾患の発症を阻害または促進することができる。ナチュラルキラー細胞と同様に、ＮＫＴ細胞もまた、パーフォリン関連細胞傷害性、ＦＡＳ関連細胞傷害性およびＴＮＦ関連細胞傷害性を誘導することができる。したがって、Ｔ細胞への言及は、ＮＫＴ細胞への言及を含むと理解されるべきである。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の一部を形成する細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に対する迅速な応答を提供し、感染後約３日の時点で作用し、腫瘍形成にも応答する。典型的には、Ｔ細胞などの免疫細胞は、感染細胞表面または形質転換された細胞表面上に提示された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を検出し、サイトカイン放出を誘発し、標的細胞の溶解またはアポトーシスをもたらす。ただし、ＮＫ細胞は、抗体またはＭＨＣの非存在下でストレスを受けた細胞を認識する能力を有し、はるかに速い免疫反応を可能にする。ＭＨＣ Ｉマーカーを欠く有害細胞は、Ｔ細胞などの他の免疫細胞によって検出および破壊され得ないため、この役割は特に重要である。ＮＫＴ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、ＴＣＲまたはＣＤ３を発現しないが、通常、表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６を発現する。
いくつかの実施形態では、本方法に従って改変または操作される免疫細胞は、例えば、血液（全血、血清または血漿）、骨髄、胸腺、リンパ節を含む哺乳動物対象から単離することができる。
いくつかの実施形態では、本方法に従って改変または操作される免疫細胞は、哺乳動物対象の免疫細胞に由来する細胞株、例えばＴ細胞株の培養物から収集することができる。
いくつかの実施形態では、本方法に従って改変または操作される免疫細胞は、幹細胞または他の前駆細胞（幹細胞から培養および分化された細胞など）から分化することができる。幹細胞を免疫細胞、特にＴ細胞またはＮＫ細胞に分化させる方法は、当技術分野で公知である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８，２３（２）：１８１－１９２ ｅ５；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，３１（１０）：９２８－３３；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ａｌｐｈａｂｅｔａ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｔ－ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣ Ｉｍｐａｒｔｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６，７６（２３）：６８３９－６８５０）。
幹細胞
本明細書で使用される「供給源細胞」は、再プログラミングまたは分化によって「誘導細胞」に変換される細胞を指す。本明細書に開示される方法に使用するのに適した供給源細胞の例には、幹細胞が挙げられる。「誘導細胞」の例には、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞が挙げられる。
用語「幹細胞」は、自己再生が可能であり、その特定の表現型を考慮すると、複数の系統の方向に発達し、したがって、新しい生物を形成するか、または生物の組織もしくは細胞集団を再生する可能性を示す任意の細胞への言及として理解されるべきである。本発明に従って利用される幹細胞は、多能および多分化能であり、２つ以上の系統に沿って分化することができ、限定するものではないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、臍帯幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、前駆体細胞、多能性細胞、多分化能細胞または脱分化体細胞（人工多能性幹細胞など）を含む。「多能」とは、対象幹細胞が、とりわけ、外胚葉、内胚葉および中胚葉である３つの胚葉のいずれか１つの細胞を形成するように分化することができることを意味する。
いくつかの実施形態では、供給源細胞はまた、少なくとも１つのホモ接合性主要ＨＬＡ遺伝子型（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍａｊｏｒ ＨＬＡ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を発現する。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、主要移植抗原であり、かつ集団の顕著な割合、例えば、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％またはそれ以上によって好ましくは発現される少なくとも１つのホモ接合性ＨＬＡ遺伝子型を発現する。ホモ接合性ＨＬＡ遺伝子型が優性ＭＨＣ Ｉ ＨＬＡ型またはＭＨＣ ＩＩ ＨＬＡ型に対応する場合（組織拒絶に関して）、そのような細胞の使用は、治療レジメンの状況で本発明の細胞を投与される比較的広い集団内の組織拒絶の問題を顕著に減少させるであろう。他の実施形態では、供給源細胞は、複数のＨＬＡ抗原、例えば、２つ、３つまたはそれ以上のＨＬＡ抗原に関してホモ接合性であり得る。目的のＨＬＡ抗原は、例えば、ＨＬＡ Ａ１、Ｂ８、Ｃ７、ＤＲ１７、ＤＱ２、またはＨＬＡ Ａ２、Ｂ４４、Ｃ５、ＤＲ４、ＤＱ８、またはＨＬＡ Ａ３、Ｂ７、Ｃ７、ＤＲ１５、ＤＱ６から選択され得る。
いくつかの実施形態では、供給源細胞は、阻害された遺伝子に関してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、供給源細胞は、遺伝子改変された供給源細胞から分化した誘導細胞内の改変された遺伝子の機能が阻害されるように、本明細書で同定される１または複数の遺伝子において遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、供給源細胞はまた、ＣＡＲ（すなわち、キメラ抗原受容体）をコードする核酸を含むように遺伝子改変されている。ＣＡＲをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法によって供給源細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、供給源細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、供給源細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞に分化することができる前駆細胞、例えば、多能性幹細胞（ｉＰＳＣなど）から培養された細胞であって、免疫細胞への培養ではいくらかの分化を受けているが、免疫細胞に完全には分化していない細胞が、改変されるために使用される。
ｉＰＳＣ
ｉＰＳＣは、通常、体細胞から直接生成される。ｉＰＳＣは、原則として、例えば、血液および皮膚細胞由来の単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）を含む任意の有核細胞から誘導することができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、完全に分化したＴ細胞から、または前駆Ｔ細胞、例えば胸腺細胞から生成され得、この前駆Ｔ細胞は、それらのＴＣＲの再編成を開始したか、または完了さえしており、目的の抗原特異性を示す。別の実施形態では、ｉＰＳＣに、目的の抗原決定基（例えば腫瘍抗原決定基）に向けられたＴＣＲ（再編成されたＴＣＲ遺伝子など）をコードする１または複数の核酸分子をトランスフェクトする。一実施形態では、ｉＰＳＣは、再編成されたＴＣＲ、好ましくは再編成されたαβ ＴＣＲを発現する細胞に由来する。別の実施形態では、前記細胞は、再編成されたγδ ＴＣＲを発現する。本発明のｉＰＳＣの生成に使用するのに適した細胞の例には、限定するものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、胸腺細胞または他の形態の前駆Ｔ細胞が挙げられる。
別の実施形態では、ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞などの別の種類の免疫細胞に由来する。
成熟細胞または分化細胞（例えば、Ｔ細胞または前駆Ｔ細胞）からｉＰＳＣを生成する方法は、当業者に公知である（Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｌｉ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）。
いくつかの実施形態では、供給源細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
いくつかの実施形態では、供給源細胞は、臍帯血ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から生成される。
いくつかの実施形態では、対象供給源細胞は、多能性幹細胞よりも免疫細胞に向かってさらに分化した細胞である。
本明細書に開示される方法によって生成される誘導免疫細胞には、免疫細胞に分化することができる造血系細胞、および特定の種類の免疫細胞が含まれる。誘導免疫細胞の例には、ＨＥ、ｐｒｅ－ＨＳＣ、ＨＳＣ、多分化能前駆細胞、共通リンパ前駆細胞、初期胸腺前駆細胞、ｐｒｅ－Ｔ細胞前駆細胞、ｐｒｅ－ＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、マクロファージ、ならびにＴ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの他の免疫細胞がある。
本開示は、増強された機能を有する、分化によって生成された免疫細胞または誘導免疫細胞を提供することに関する。「増強された機能」とは、本明細書に開示される改変または操作の結果として提供される免疫細胞が、対照免疫細胞（すなわち、改変または操作を伴わない免疫細胞）と比較して、活性（例えば細胞傷害性）、増殖、生存、持続性および／または浸潤の増強を示すことを意味する。免疫細胞の細胞傷害性とは、一般に受容体に基づく機構を介して、免疫細胞が標的細胞を殺傷する能力を指す。
阻害される遺伝子
本開示によれば、本明細書で同定される１または複数の遺伝子の機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強し得る。
本明細書で使用される「遺伝子の機能の阻害」とは、該遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルおよび／または活性が最終的に低下または排除されることを意味する。したがって、遺伝子の機能は、遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に対する操作もしくは改変の結果として（例えば、遺伝子の破壊をもたらす）、ｍＲＮＡの阻害の結果として（例えば、転写または翻訳を阻害することによって、例えば、ｍＲＮＡのレベルまたは機能を低下させる）、またはタンパク質の阻害の結果として（例えば、タンパク質のレベルまたは活性を低下させることによって）阻害され得る。いくつかの実施形態では、改変された細胞内の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルおよび／または活性と、改変されていない細胞内のタンパク質のレベルおよび／または活性とを比較した場合、阻害の程度は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、その機能が阻害される遺伝子は、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、阻害は、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される単一の遺伝子、例えば、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１またはＴＧＦＢＲ２である単一の遺伝子を対象とする。いくつかの実施形態では、阻害は、少なくとも別の遺伝子の阻害と組み合わせて、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される単一の遺伝子を対象とする。いくつかの実施形態では、阻害は、場合により、少なくとも別の遺伝子の阻害と組み合わせて、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される遺伝子のうちの２つ以上、例えば、ＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ１遺伝子およびＴＧＦＢＲ２遺伝子、ＴＧＦＢＲ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子を対象とする。
以下に記載されるように、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる遺伝子群のメンバーは、免疫細胞機能に関与するとして当技術分野で公知である。しかし、これらの遺伝子の機能の阻害が、個々にまたは組み合わせて、有害な結果を有し得るかどうかは当技術分野では知られていない。特に、これらの遺伝子の機能を完全に除去することは（例えば、遺伝子編集によって）、重要な細胞機能に悪影響を及ぼし、それによって、生存能または複製能力が低下した細胞をもたらすと予測され得る。さらに、幹細胞（例えばｉＰＳＣ）内のこれらの遺伝子の機能を除去することは、細胞機能、例えば、生存能、自己再生、多能性、特定の細胞型（例えば免疫細胞）に分化する能力、およびそれらの細胞型が機能的であることに悪影響を及ぼすと予測され得る。これらの重要な細胞機能の維持が本発明の重要な特徴であることが当業者によって認識されるであろう。
ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２
ＲＣ３Ｈ１は、ＲＣ３Ｈ１、Ｒｏｑｕｉｎ－１、Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １、ＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃ３Ｈ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｏｍａｉｎｓ １、ＲＯＱ１、ＲＮＦ１９８またはＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ １９８としても知られている。
ＲＣ３Ｈ２は、Ｒｏｑｕｉｎ－２、Ｒｏｑｕｉｎ２、Ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－ｔｙｐｅ ｄｏｍａｉｎｓ ２、Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２、Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ Ａｎｄ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｏｍａｉｎｓ ２、ＭＮＡＢ、ＲＯＱ２、ＲＮＦ１６４またはＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ １６４としても知られている。
タンパク質のＲＯＱＵＩＮファミリーには、自然免疫系および適応免疫系の両方に重要な役割を果たすＲＮＡ結合タンパク質であるＲＯＱＵＩＮ１（ＲＣ３Ｈ１によってコードされる）およびＲＯＱＵＩＮ２（ＲＣ３Ｈ２によってコードされる）が含まれる（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．，Ｒ．Ｒ．Ｒａｍｉｓｃａｌ，ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｖｉｎｕｅｓａ，ＲＯＱＵＩＮ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６，４６（５）：ｐ．１０８２－９０）。マウス（サンロケマウス（ｓａｎｒｏｑｕｅ ｍｉｃｅ））では、Ｒｃ３ｈ１変異は、Ｔ細胞内のＩＣＯＳ発現を増加させ、これにより、マウスにループス様自己免疫症候群が引き起こされる（Ｙｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｑｕｉｎ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１６７）：ｐ．２９９－３０３）。マウスでは、ＲＣ３Ｈ１ノックアウトまたはＲＣ３Ｈ２ノックアウト単独は自己抗体を発達させず、自己免疫を欠いていたが、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルノックアウトマウスは、サンロケマウスの同様の免疫生理学的表現型を示した。今日まで、ＲＣ３Ｈ１またはＲＣ３Ｈ２に、疾患を引き起こす変異を有するヒトは見出されていない（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．，Ｒ．Ｒ．Ｒａｍｉｓｃａｌ，ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｖｉｎｕｅｓａ，ＲＯＱＵＩＮ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６，４６（５）：ｐ．１０８２－９０）。ヒトＴ細胞内のＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子の役割、特に、細胞傷害性細胞におけるその機能は、本開示以前には分かっていなかった。
本開示によれば、ＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方の機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強する。
Ａ２ＡＲ
Ａ２ＡＲは、ＡＤＯＲＡ２Ａ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２ａ、ＡＤＯＲＡ２、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｅ Ａ２ａまたはＲＤＣ８としても知られている。
腫瘍細胞によって生成される細胞外アデノシンは、細胞傷害性リンパ球の活性化を制限し、アデノシン２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）を介して抗腫瘍免疫応答を阻害する重要な免疫抑制代謝産物である。
本開示によれば、例えば、遺伝子編集による（例えば、特異的に設計されたガイドＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される）Ａ２ＡＲ遺伝子の機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強する。
ＦＡＳ
ＦＡＳは、Ｆａｓ細胞表面死受容体、ＡＰＴ１、ＣＤ９５、ＦＡＳ１、ＡＰＯ－１、ＦＡＳＴＭ、ＡＬＰＳ１ＡまたはＴＮＦＲＳＦ６としても知られている。
ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５およびＡＰＯ－１としても知られている）は、細胞傷害性Ｔ細胞のアポトーシスおよび最終分化を誘導する。ＦＡＳとそのリガンドＦＡＳＬとの結合は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を場合により弱める可能性がある。
本開示によれば、例えば、遺伝子編集による（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される）ＦＡＳ遺伝子の機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強する。
ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２
ＴＧＦＢＲ１は、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＴＧＦＢ受容体１、ＴＧＦ－β受容体１、ＡＡＴ５、ＡＬＫ５、ＥＳＳ１、ＬＤＳ１、ＭＳＳＥ、ＳＫＲ４、ＴＢＲＩ、ＡＬＫ－５、ＬＤＳ１Ａ、ＬＤＳ２Ａ、ＴＢＲ－Ｉ、ＴＧＦＲ－１、ＡＣＶＲＬＫ４、ｔｂｅｔａＲ－Ｉ、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １またはＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉとしても知られている。
ＴＧＦＢＲ２は、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＡＡＴ３、ＦＡＡ３、ＬＤＳ２、ＭＦＳ２、ＲＩＩＣ、ＬＤＳ１Ｂ、ＬＤＳ２Ｂ、ＴＡＡＤ２、ＴＢＲＩＩ、ＴＢＲ－ｉｉ、ＴＧＦＲ－２、ＴＧＦベータ－ＲＩＩ、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２またはＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩとしても知られている。
ＴＧＦ－βは、全身の免疫抑制を発揮し、宿主の免疫監視を阻害し、腫瘍内の免疫抑制性微小環境の主要な要因の１つと考えられている。
本開示によれば、例えば、遺伝子編集による（例えば、特異的に設計されたガイドＲＮＡに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される）ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２遺伝子の機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強する。
本開示によれば、少なくとも別の遺伝子の阻害と組み合わせた、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つの機能の阻害が、免疫細胞の機能を増強する。
遺伝子の機能の阻害
遺伝子の機能の阻害は、例えば、遺伝子編集、例えば、ＲＮＡ干渉もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを介した翻訳の阻害による、またはタンパク質産物に直接拮抗する小分子もしくは抗体などの化合物の使用による様々な手法によって達成することができる。
遺伝子編集による阻害
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子のゲノム配列を改変する遺伝子編集系の使用によって達成される。
遺伝子編集系は、典型的には、ヌクレアーゼと結合したＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を含む。ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸は、遺伝子の標的領域に特異的に結合またはハイブリダイズし、ヌクレアーゼは、遺伝子の標的領域内で１または複数の二本鎖切断および／または１または複数の一本鎖切断をもたらす。標的領域は、コード領域のＮ末端部分の近くの、例えばエクソン内（例えば、第１のエクソンまたは第２のエクソン内）の遺伝子のコード領域であり得る。二本鎖切断または一本鎖切断は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）による細胞修復プロセスを介して修復を受け得る。いくつかの例では、修復プロセスは、挿入、欠失、ミスセンス変異またはフレームシフト変異（例えば、二対立遺伝子フレームシフト変異を含む）を導入し、遺伝子の破壊と、遺伝子の機能の阻害とをもたらす。
遺伝子編集系の例には、ＤＮＡ結合タンパク質とヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡガイドヌクレアーゼとを含む融合物、例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ系が挙げられる。
ＺＦＰおよびＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、エンドヌクレアーゼに融合された１または複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）を含む遺伝子編集系を利用することによって達成される。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮが挙げられる。
ＺＦＰおよびＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインは、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するように「操作され」得る。例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の１または複数のアミノ酸は、所定のＤＮＡ配列への結合を導くように改変され得る。合理的な設計の基準は、例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書、米国特許第６，４５３，２４２号明細書、米国特許第６，５３４，２６１号明細書、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット、国際公開第９８／５３０５９号パンフレット、国際公開第９８／５３０６０号パンフレット、国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット、国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットおよび米国特許公開第２０１１０３０１０７３号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、またはＺＦＰの１または複数のジンクフィンガードメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、１または複数の「ジンクフィンガー」（その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸の領域）を介して配列特異的にＤＮＡに結合する。天然に存在するＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の特定の位置でアミノ酸置換を行うことによって変化させることができる。さらに、多くの操作された遺伝子特異的ジンクフィンガーが市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）と共同でＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）によって開発された、ジンクフィンガー構築のためのＣｏｍｐｏＺｒプラットフォームを参照）。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、阻害されるように本明細書で同定される遺伝子内の標的配列に結合するように操作される。典型的な標的配列には、エクソン、コード配列のＮ末端領域付近の領域（例えば、第１のエクソン、第２のエクソン）、および５’調節領域（プロモーター領域またはエンハンサー領域）が含まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するために、ＺＦＰがエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡ切断ドメインに融合される。ＤＮＡ切断ドメインの例には、ＩＩＳ型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、ＺＦＮをコードする核酸配列を含む核酸構築物（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスベクター）のトランスフェクションによって、細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）に導入される。次いで、ＺＦＮは、構築物から細胞内で発現され、標的遺伝子の編集および破壊をもたらす。いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、そのタンパク質形態で細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在するまたは操作された転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１または複数のＴＡＬＥ反復を含むポリペプチドであり、各反復は、３３～３５アミノ酸長であり、１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。ＴＡＬ反復の１２位および１３位のＨＤ（ヒスチジン（Ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）－アスパルテート（Ａｓｐａｔａｔｅ））配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧ（アスパラギン－グリシン）がＴに結合し、ＮＩ（アスパラギン－イソロイシン）がＡに結合し、ＮＮ（アスパラギン－アスパラギン）がＧまたはＡに結合することが明らかにされている。例えば、米国特許第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、阻害されるように本明細書で同定される遺伝子内の目的の標的ＤＮＡ配列に特異性を有するＴＡＬ反復のアレイを有するように設計され得る。特別設計されたＴＡＬＥアレイはまた、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｙ．，ＵＳＡ）およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を通じて市販されている。いくつかの実施形態では、ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼに融合されてＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を形成し、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、阻害されるように本明細書で同定される遺伝子内の標的部位でヌクレオチド配列を切断する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含む核酸構築物（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスベクター）のトランスフェクションによって、細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）に導入される。次いで、ＴＡＬＥＮは、構築物から細胞内で発現され、標的遺伝子の編集および破壊をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、そのタンパク質形態で細胞に導入される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲ（「クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復」に関して）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」に関して）系を利用することによって達成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、容易に入手可能な試薬およびプロトコルを用いて当技術分野で周知である（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１），８２３－８２６；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１５７．６：１２６２－１２７８；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，２３３－２３９；Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３：４２０－４２４，２０１６；Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１：４６４－４７１（２０１７））。例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集プロトコルは、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｄｏｕｄｎａ，ａｎｄ Ｐｒａｓｈａｎｔ Ｍａｌｉ，２０１６，’’ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’’（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：９７８－１－６２１８２１－３０－４）およびＲａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８（１１）：２２８１－２３０８に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、一般に、２つの要素を含む：（１）本明細書でＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたはＣａｓタンパク質とも呼ばれるＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２または他の代替的なヌクレアーゼ；ならびに（２）ｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」）を含む二重ＲＮＡ、または一本鎖完全長ガイドＲＮＡのいずれかを含み、ヌクレアーゼをゲノム内の標的部位に導く標的化配列を含む非コード短鎖「ガイドＲＮＡ」。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的部位にヌクレアーゼを導き、ここでヌクレアーゼは、該標的部位でＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。次いで、得られたＤＳＢは、２つの一般的な修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路および相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つによって修復される。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢを迅速に修復することができる最も活性な修復機構であるが、ＤＳＢ部位に小さなヌクレオチドの挿入または欠失（インデル）をもたらし、機能性遺伝子をノックアウトするフレームシフト変異をもたらすことが多い。ＨＤＲ経路は効率的ではないが、忠実度が高い。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに切断領域に相同なＤＮＡ鋳型が提供されると、ＨＤＲを介して相同ＤＮＡ鋳型を使用して二本鎖切断が修復される。ＨＤＲ経路は、ＲＮＰとともに、大きな遺伝子挿入を細胞に挿入することを可能にする。
当技術分野では、目的の遺伝子内の標的部位を標的とする配列を含むｇＲＮＡ配列の設計または選択が記載されている。標的部位は、調節領域の配列（プロモーターおよびエンハンサーなど）またはコード領域内の配列（エクソン、例えば、５’末端付近のエクソン、またはタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするエクソンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、標的部位は、典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧなどのＰＡＭ配列のすぐ５’側のその位置に基づいて選択される。
ガイド配列は、標的配列（標的部位のヌクレオチド配列）との相補性を有する標的化配列を含むように設計される。ガイド配列と標的配列との特異的なハイブリダイゼーションを引き起こし、標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列と標的配列との間の相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上（例えば、１００％または完全に相補的）である。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０ヌクレオチド長以下である。いくつかの実施形態では、ガイド配列の標的化配列部分は、約２０ヌクレオチド長である。標的相補性の領域がさらに短い（＜２０ヌクレオチド）切断型ｇＲＮＡは、標的特異性が改善され、効果的であると記載されている（例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２（３）：２７９－２８４，２０１４を参照）。したがって、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列は、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列は、標的部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である。ガイドＲＮＡの標的化配列が標的部位のヌクレオチド配列に完全に相補的でないいくつかの実施形態では、ゲノム内のＰＡＭ配列に近い標的化配列の部分（シード領域とも呼ばれる）は、標的部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である。換言すれば、ガイド配列（すなわち、非シード領域）のヌクレオチド５’のいくらかの変動が許容される。例えば、ガイド配列は、標的配列内の少なくとも１７ヌクレオチドに完全に相補的な少なくとも１７ヌクレオチドのシード領域を有する、少なくとも１７ヌクレオチド長（例えば、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長）の標的化部分を含むように設計することができる。
特定の遺伝子内の標的配列の例を表１に示す。いくつかの実施形態では、ガイド配列は１７～２０ヌクレオチドの標的化配列を含み、シード領域内の少なくとも１７ヌクレオチド（標的化配列の３’部分）は、標的配列内の少なくとも１７ヌクレオチドに対して、例えば、標的配列の３’末端からの１７ヌクレオチドに対して完全に相補的である。
Figure 2023502986000001
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のためのｇＲＮＡデータベースが公的に利用可能であり、ｇＲＮＡデータベースは、ヒトゲノムまたはマウスゲノム内の遺伝子の構成的エクソン内の例示的なｓｇＲＮＡ標的配列を提供する（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔおよびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるｇＲＮＡデータベースを参照；Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４も参照）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子へのオフターゲット結合が最小限である配列であるか、またはそれを含む。
本明細書での使用に適したＣａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの例には、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（３）：７５９－７７１）、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３もしくはＣｓｆ４またはその機能性誘導体（すなわち、天然に存在する形態のＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ活性を実質的に保持する、天然に存在するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの変異形態または誘導体、例えばその断片）が挙げられる。例えば、米国特許第２０１８０２４５０９１号明細書および米国特許第２０１９０２４７５１７号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２の下にＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに提供されているアミノ酸配列を有する、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質である。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第１の核酸と、阻害されるように本明細書で同定される遺伝子内の標的配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第２の核酸とを細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）に導入することを含むＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集によって達成される。２つの核酸は、細胞内でＣａｓタンパク質およびｇＲＮＡの発現を達成するために、１つの核酸構築物（またはベクター）に含まれ得るか、または異なる構築物（またはベクター）上に提供され得る。細胞内のＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの発現は、標的配列でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導き、これにより、ＤＮＡ切断がもたらされる。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとの間の組合せまたは複合体を細胞に導入することを含むＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集によって達成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡの組合せまたは複合体は、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮もしくは圧搾、リポソーム、ナノ粒子、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡプラスミド移入、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入またはウイルス媒介性（統合ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルス、ならびに非統合ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、ワクシニアを含む）によって細胞に送達され得る。
使用される特定の遺伝子編集方法にかかわらず、遺伝子配列が改変されており、遺伝子機能が阻害されていることを確認するために、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲを含むＰＣＲ、もしくは核酸配列決定を介してＤＮＡもしくはｍＲＮＡを検査することによって、または例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）を介して特定のタンパク質もしくはペプチドの存在もしくは活性を検出することによってなど、様々なアッセイを行ってもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１遺伝子、ＲＣ３Ｈ２遺伝子、Ａ２ＡＲ遺伝子およびＦＡＳ遺伝子のうちの少なくとも１つの機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を介してこれらの遺伝子のうちの少なくとも１つの初期エクソンにインデルを導入することによって阻害され、これにより、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つにフレームシフト変異がもたらされ、機能性タンパク質が編集済み遺伝子から翻訳されないようになる。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１遺伝子、ＲＣ３Ｈ２遺伝子、Ａ２ＡＲ遺伝子およびＦＡＳ遺伝子のうちの２つ以上の機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してこれらの遺伝子のうちの２つ以上の初期エクソンにインデルを導入することによって阻害され、これらの遺伝子のうちの２つ以上にフレームシフト変異がもたらされ、機能性タンパク質が編集済み遺伝子から翻訳されないようになる。いくつかの実施形態では、ＲＣ３Ｈ１遺伝子、ＲＣ３Ｈ２遺伝子、Ａ２ＡＲ遺伝子およびＦＡＳ遺伝子のうちの２つ以上は、別の遺伝子、例えば、ＲＣ３Ｈ２およびＲＣ３Ｈ１と組み合わせてＲＣ３Ｈ２を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ１遺伝子およびＴＧＦＢＲ２遺伝子のうちの少なくとも１つの機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を介してこれらの遺伝子のうちの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインの出発アミノ酸残基に関するエクソンとコドンの上流とにインデルを導入することによって阻害され、ドミナントネガティブ変異である、細胞内シグナル伝達ドメインを除去するフレームシフト変異がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＲ１遺伝子およびＴＧＦＢＲ２遺伝子の両方の機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してこれらの遺伝子の各々の細胞内シグナル伝達ドメインの開始アミノ酸残基に関するエクソンとコドンの上流とにインデルを導入することによって阻害され、ドミナントネガティブ変異である、細胞内シグナル伝達ドメインを除去するフレームシフト変異がもたらされる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅを使用することによって、二本鎖切断またはドナーＤＮＡを用いず使用することもできる。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３：４２０－４２４，２０１６；Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１：４６４－４７１（２０１７）を参照されたい。
ｍＲＮＡのレベルまたは機能の低下または排除による阻害
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルまたは機能を低下させるかまたは排除すること、すなわち、ｍＲＮＡの阻害によって達成される。遺伝子編集系による阻害とは異なり、ｍＲＮＡの阻害は一過性である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの阻害は、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）もしくはその前駆体、または細胞内で転写されてアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはその前駆体を生成することができる核酸構築物の使用によって達成することができる。
アンチセンス－アンチセンス技術は周知の方法である。アンチセンスＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡの全長または一部に相補的であり、かつ内因性ｍＲＮＡと二重鎖を形成することによって内因性ｍＲＮＡからの翻訳を遮断するＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡは、目的の遺伝子の発現の阻害を達成するために、合成的に作製され、目的の細胞（例えば免疫細胞）に導入され得るか、または外因的に導入された核酸構築物からの転写を介して目的の細胞内で作製され得る。アンチセンスＲＮＡは、目的の遺伝子由来の全長ｍＲＮＡに相補的である必要はない。しかし、アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成し、標的ｍＲＮＡに基づく翻訳を遮断するのに十分な長さであるべきである。典型的には、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、５００、４００、３００、２００、１００、７５または５０ヌクレオチド長以下である。アンチセンス分子はまた、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体およびＲＮＡ類似体であり得る。
リボザイム－リボザイム（すなわち、触媒ＲＮＡ）は、標的ＲＮＡと特異的に対合し、特定の位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって、標的ＲＮＡを機能的に不活性化するように設計することができる。例えば、米国特許第６，４２３，８８５号明細書、米国特許第５，２５４，６７８号明細書およびＰｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２（１３）：６１７５－６１７９（１９９５）を参照されたい。リボザイムは、合成的に作製され、目的の細胞（例えば免疫細胞）に導入され得るか、または外因的に導入された核酸構築物からの転写を介して目的の細胞内で作製され得る。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）－ＲＮＡｉによる遺伝子発現または翻訳の阻害は、当技術分野で公知であり、ｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ」に関して）、ｓｈＲＮＡ（「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」に関して）およびｍｉＲＮＡ（「マイクロＲＮＡ」に関して）などのＲＮＡ分子を利用して達成され得る。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路に関与し、特定の遺伝子の発現を妨害することが知られている。ｓｉＲＮＡは、小さな（典型的には２０～２５ヌクレオチド長）二本鎖ＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡ（すなわち、目的の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）または標的ｍＲＮＡの一部と相同または相補的な配列を含むように設計され得る。ｓｈＲＮＡは、リボヌクレアーゼＤＩＣＥＲによって切断されて、ｓｉＲＮＡを生成する。標的遺伝子の配列を考慮すると、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、いずれかが合成的に設計および作製され、目的の細胞（例えば免疫細胞）に導入され得るか、またはそのようなＲＮＡをコードする外因的に導入された核酸構築物から、目的の細胞（例えば免疫細胞）内で作製され得る。また、ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写された長い前駆体からプロセシングされ、かつ標的ｍＲＮＡとの不正確な塩基対形成を介して翻訳を妨害する小さなＲＮＡ分子（一般に約２１～２２ヌクレオチド）である。ｍｉＲＮＡまたはその前駆体（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）は、合成的に作製され、目的の細胞（例えば免疫細胞）に導入され得るか、またはｍｉＲＮＡもしくはその前駆体のいずれかをコードする外因的に導入された核酸構築物から、目的の細胞（例えば免疫細胞）内で作製され得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの阻害は、酵素的に不活性なヌクレアーゼであるＣａｓ分子が、目的の遺伝子を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて使用される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の改変バージョンを使用して達成することができる。標的部位は、遺伝子の５’調節領域（例えば、プロモーター領域またはエンハンサー領域）内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、ＤＮＡ切断活性を排除するかまたは実質的に低下させる変異、例えば点変異を含む酵素的に不活性なＣａｓ９分子である（例えば、国際公開第２０１５／１６１２７６号パンフレットを参照）。いくつかの実施形態では、酵素的に不活性なＣａｓ９分子は、転写リプレッサータンパク質に直接的または間接的に融合される。
他の手段による阻害
本発明は、例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を直接阻害する化合物（例えば、とりわけ、小分子、抗体）を細胞（例えば免疫細胞）に導入することによって、遺伝子の機能を阻害するため、例えば遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルまたは活性を低下させるための、当技術分野で公知の他の方法を含む。
ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、１または複数の選択された遺伝子の阻害を有するように改変されている細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）はまた、キメラ抗原受容体（または「ＣＡＲ」）をコードする核酸を含むように改変されている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、選択された遺伝子の機能を阻害するように細胞が改変される前に、それと同時に、またはそれに続いて細胞に導入され得る。阻害が一過性（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉを介して）である実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、好ましくは、阻害を達成するように細胞が改変される前に細胞に導入される。阻害が恒久的（例えば、遺伝子編集を介して）である実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、阻害を達成するように細胞が改変される前に、それと同時に、またはそれに続いて細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、ＤＳＢの導入後に遺伝子編集の標的部位でＨＤＲによる挿入を可能にするように設計され、すなわち、遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸のノックインまたは挿入によって破壊される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子は、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、トランスポゾン系、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを介した遺伝子ノックインを含む複数の技術を介して細胞に導入され得る。
用語「キメラ抗原受容体」（「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」および「キメラ免疫受容体」としても知られている「ＣＡＲ」）は、抗原認識部分を免疫細胞にグラフトする操作された受容体への言及として理解されるべきである。一般的に言えば、ＣＡＲは、互いに作動可能に連結された、標的抗原に特異的な抗原認識部分と、膜貫通ドメインと、免疫細胞上に天然に発現される受容体の細胞内／細胞質シグナル伝達ドメインとから構成される。「作動可能に連結される」とは、抗原認識部分が標的抗原に結合すると、細胞内シグナル伝達ドメインを介してシグナルが誘導されて、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が活性化され、そのエフェクター機能が活性化されることを可能にするように、個々のドメインが互いに連結されていることを意味する。
ＣＡＲの抗原認識部分は、標的抗原のエピトープを認識し、エピトープに結合する、受容体の細胞外部分である。抗原認識部分は、限定するものではないが、通常、ｓｃＦｖである。
ＣＡＲの細胞内ドメインは、免疫細胞の天然に存在する受容体の一次細胞質シグナル伝達配列、および／または免疫細胞の天然に存在する受容体の二次配列もしくは共刺激配列を含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列の例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の共刺激シグナル伝達配列と組み合わせてＣＤ３－ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含み得る。好適な共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３などが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、一般に、膜にまたがる典型的な疎水性アルファヘリックスであり、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。
用語「標的抗原」は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの受容体発現免疫細胞によって標的とされることが求められる細胞によって発現される任意のタンパク質性分子または非タンパク質性分子への言及として理解されるべきである。標的抗原は、「自己」分子（患者の体内で発現される分子）または非自己分子（例えば、感染性微生物由来）であり得る。本明細書で言及される標的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞の免疫応答を自然に誘発することができる分子に限定されない。むしろ、「標的抗原」は、標的とされることが求められる任意のタンパク質性分子または非タンパク質性分子への言及である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞表面に発現される。標的抗原は、標的細胞によって排他的に発現され得るか、または非標的細胞によっても発現され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、標的抗原は、非自己分子、または正常細胞よりも顕著に高いレベルで標的とされることが求められる細胞によって排他的に発現されるか、もしくは標的とされることが求められる細胞によって発現される分子である。標的抗原の非限定的な例には、以下が挙げられる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐｌＯＯ（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異的多系統抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５；過剰発現糖タンパク質、例えば、ＭＵＣ１およびＭＵＣ１６；過剰発現胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる固有の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の腫瘍関連抗原には、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＥＧＦＲ、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃＭｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＣＡ１９－９、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ－７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＰＳＭＡ、メソテリンまたはＢＣＭＡが含まれる。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原、特に、タンパク質腫瘍関連抗原、糖タンパク質腫瘍関連抗原または非タンパク質腫瘍関連抗原である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原、例えば腫瘍関連抗原ＴＡＧ－７２である。
他の実施形態では、標的抗原は、表面タンパク質、例えばＣＤ２４であり、別の実施形態では、腫瘍標的化に使用することができる表面タンパク質、例えば、ＣＤ１９またはＣＤ２０である。
改変された細胞の医薬組成物および治療的使用
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって生成された細胞、すなわち、選択された遺伝子のうちの１または複数の機能が阻害されている改変された細胞を含有する組成物が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で生成される細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物が本明細書で提供される。薬学的に許容される担体には、溶媒、分散媒、等張剤などが含まれる。担体の例には、油、水、生理食塩水、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔質マトリックス、防腐剤など、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者への投与のために、例えば、養子細胞療法のために、典型的には単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で調製され、製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、時間放出送達系、遅延放出送達系および持続放出送達系を使用することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患または病態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量の細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１００万～約１０００億個の細胞、例えば、少なくとも１００万、５００万、１０００万、２５００万、５０００万、１億、２億、３億、４億または５億個の細胞、最大約１０億、５０億、１００億、２００億、３００億、４００億、５００億、６００億、７００億、８００億、９００億または１０００億個の細胞という量で、本明細書に開示される改変された細胞を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、化学療法剤などの別の活性剤または薬物をさらに含む。
別の態様では、本明細書に開示される改変された細胞の方法および使用、例えば、治療方法、および養子細胞療法における使用が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、疾患もしくは病態を有するか、または疾患もしくは病態を発症するリスクがある対象に、本明細書に開示される改変された細胞、または本明細書に開示される改変された細胞を含む組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、疾患または病態は、新生物病態（すなわち、癌）、微生物感染もしくは寄生虫感染（ＨＩＶ、ＳＴＤ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、ＣＯＶＩＤ－１９または抗生物質耐性細菌など）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息）、臓器の線維症（例えば、心臓、肺、肝臓など）または子宮内膜症である。
いくつかの実施形態では、新生物病態には、中枢神経系腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、頭頸部癌（例えば扁平上皮癌）、乳癌および前立腺癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌の両方）、腎癌（例えば腎細胞腺癌）、食道胃癌、肝細胞癌、膵胆管新生物（例えば、腺癌および膵島細胞腫瘍）、結腸直腸癌、子宮頸癌および肛門癌、子宮癌および他の生殖器系癌、尿路癌（例えば、尿管および膀胱の）、胚細胞腫瘍（例えば、精巣胚細胞腫瘍または卵巣胚細胞腫瘍）、卵巣癌（例えば卵巣上皮癌）、未知の原発性ヒト免疫不全関連悪性腫瘍の癌腫（例えばカポジ肉腫）、リンパ腫、白血病、悪性黒色腫、肉腫、内分泌腫瘍（例えば甲状腺の）、中皮腫および他の胸膜腫瘍または腹膜腫瘍、神経内分泌腫瘍ならびにカルチノイド腫瘍が含まれる。
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、癌を治療するという状況で腫瘍の増殖および／もしくは転移を阻害することによって、またはウイルス感染を治療するという状況でウイルスの量および／もしくは拡散を減少させることによって、病態の治療、すなわち、病態の低減もしくは改善、または病態の任意の１または複数の症状の低減もしくは改善をもたらす。用語「治療」は、完全な回復を必ずしも意味するものではない。いくつかの実施形態では、本方法は、病態の予防、すなわち、病態を予防すること、病態を発症するリスクを低下させること、または病態の発症を遅延させることをもたらす。同様に、「予防」は、対象が最終的にその病態に至らないことを必ずしも意味しない。
いくつかの実施形態では、細胞または組成物が投与される対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的には霊長類、例えばヒトである。
いくつかの実施形態では、細胞、または細胞を含む組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される用語「非経口」は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与を含む。
改変された細胞、または改変された細胞を含む組成物の所望の投与量は、組成物の単回投与、複数回投与または持続注入投与によって送達され得る。治療効果または予防効果は、治療された対象の定期的な評価によってモニタリングすることができる。
いくつかの実施形態では、養子細胞療法は、自家移入によって行われる。免疫細胞（Ｔ細胞など）は、細胞療法を受ける対象から、またはそのような対象に由来する試料から単離および／または調製される。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が対象から単離され、（１または複数の遺伝子の機能を阻害するために）本明細書に開示される方法に従って改変され、次いで、同じ対象に投与される。
いくつかの実施形態では、養子細胞療法は、同種移入によって行われ、この場合、細胞は、細胞療法を受けることになる対象（レシピエント対象）とは異なるドナー対象から単離され、および／または調製される。いくつかの実施形態では、ドナー対象およびレシピエント対象は、同じＨＬＡクラスまたはＨＬＡスーパータイプを発現する。
以下の実施例では、限定するものではないが、腫瘍治療のためのＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および誘導細胞（例えばｉＮＫ細胞）の機能を増強するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、これらの免疫細胞の負の免疫調節因子を排除したことが示されている。ＣＡＲを含むＴ細胞の場合、細胞をまず、活性化後にレンチウイルスＣＡＲベクターによって形質導入し、次いで、特異的に設計されたガイドＲＮＡを有するＣａｓ９ヌクレアーゼ複合体をＣＡＲ－Ｔ細胞にトランスフェクトして、免疫調節因子遺伝子を除去した（図１Ａ）。ＣＡＲを含むＮＫ－９２細胞の場合、細胞をまず、特異的に設計されたガイドＲＮＡを有するＣａｓ９ヌクレアーゼ複合体を用いてトランスフェクトして、免疫調節因子遺伝子を除去し、次いで、レンチウイルスＣＡＲベクターを使用して形質導入した（図１Ｂ）。ゲノムＤＮＡ配列決定に基づく定量によって遺伝子編集効率を調査した。次いで、細胞のインビトロ増殖中に細胞傷害性および拡大培養率をモニタリングした。インビボ持続性を評価するために、ＣＡＲ細胞（以下の実施例ではＣＡＲ－Ｔ細胞）をマウス異種移植腫瘍モデルに養子移入した（図１Ａ～図１Ｂ）。
実施例１－第２世代ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＴＡＧ－７２は、腺癌について確立された腫瘍マーカーであり、特定の固形腫瘍ではＣＡＲ－Ｔ細胞のための標的でもある。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８８０１２号パンフレットに記載されているように、第２世代ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ発現カセットには、シグナルペプチドとしてカッパリーダー配列と、腫瘍抗原結合部分として抗ＴＡＧ－７２ ｓｃＦｖと、ヒトＣＤ８由来のヒンジ領域および膜貫通領域と、４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータの細胞質活性化シグナル伝達ドメインとを含めた。Ｐ２Ａは、タンパク質分解的切断を導くシグナル配列であり、ＣＡＲ発現の蛍光レポーターとしてＥＧＦＰを放出する（図２Ａ）。したがって、レンチウイルス形質導入後にＧＦＰフローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞におけるＣＡＲ形質導入効率および発現レベルを検出することができた（図２Ｂ）。
ヒトＴ細胞の単離および培養
初代ヒトＴ細胞を、新鮮な全血から、またはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから得られたバフィーコート（臨床目的に適さない不適合／廃棄材料）のいずれかから、健康なヒトドナーから単離した。患者および健常ドナー全例がインフォームドコンセントを提供した。製造業者の指示に従って、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣを使用前に凍結保存した。形質導入およびトランスフェクションに使用するために、ＰＢＭＣを解凍し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用してＴ細胞を単離し、活性化した。細胞およびビーズを、連続的に穏やかに混合しながら室温で１時間にわたり、１：３の比でインキュベートした。次いで、細胞ビーズ懸濁液を磁石上に１～２分間置くことによって、未結合細胞を除去した。上清を除去し、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）および１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２とともに、細胞ビーズ混合物をＴ細胞培地：ＴｅｘＭＡＣＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中３７°Ｃ ５％ＣＯ２で約６５時間インキュベートした。２０～５０回混合することによる細胞ビーズ複合体の解離によってＴ細胞を収集し、直ちに磁石上に１～２分間置き、細胞含有上清を収集した。単離されたＴ細胞懸濁液をＭＵＳＥ（商標）細胞カウンター（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を用いて計数し、トランスフェクションのために調製した。
レンチウイルス形質導入
レンチウイルスＣＡＲベクターを使用して、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８８０１２号パンフレットに記載されているように、活性化ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を形質導入した。レンチウイルスＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）被覆プレート内でレンチウイルス粒子とともに活性化ヒトＣＤ３＋／ＣＤ２８＋Ｔ細胞を４８時間インキュベートした。
ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー。
レンチウイルスによって形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞内のＣＡＲ構築物の発現を検出するために、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。ＧＦＰ発現を分析した。ヨウ化プロピジウム溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）またはＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０色素を使用して、生細胞および死細胞を識別した。
実施例２－ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウト（ＫＯ）ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、それぞれ５日目のレンチウイルスＴＡＧ－７２ ＣＡＲ形質導入の４８時間後に、代表的なガイドＲＮＡ（ＰＤ１ ＫＯ、配列番号１；ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ、配列番号２；ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ、配列番号４；Ａ２ＡＲ ＫＯ、配列番号７；ＦＡＳ ＫＯ、配列番号９；ＴＧＢＦＢＲ１ ＫＯ、配列番号１１；ＴＧＦＢＲ２ ＫＯ、配列番号１４）によって形成されたＲＮＰ複合体をＴ細胞にトランスフェクトした（図１Ａ～図３）。エレクトロポレーションによって誘導された細胞死が生じたにもかかわらず、本明細書に開示されるプロトコルを使用して、非トランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、ＲＮＰトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞を回収および拡大培養することができた（図３）。ＲＮＰトランスフェクションの４日後、遺伝子編集の定量分析のためにＣＡＲ－Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＩＣＥ（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ）アッセイ（Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０１８，１０．１１０１／２５１０８２（２５１０８２）を使用して、遺伝子編集効率を分析した。ＩＣＥアッセイの代表的な結果として、ＲＣ３Ｈ２遺伝子編集効率分析をここに示した（図４Ａ～図４Ｃ）。ＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡ（配列番号４）は、インデルをＲＣ３Ｈ２遺伝子の初期エクソンに導入する高い活性を示した（総インデル頻度＝９２％）。さらに、これにより、オープンリーディングフレームの高頻度のフレームシフト（フレーム外インデル頻度＝９１％）がもたらされ、それによって、機能性ＲＣ３Ｈ２タンパク質の翻訳が破壊された（図４Ｂおよび図４Ｃ）。本試験では、あらゆるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集済みＣＡＲ－Ｔ細胞について、極めて高い遺伝子編集効率（総インデルパーセンテージ＝８９％～９６％）と、効率的な遺伝子ノックアウト結果（フレーム外インデル頻度＝６１％～９１％）とが達成された（図４Ｄ）。要約すると、これらの結果は、試験で使用したｇＲＮＡが、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ拡大培養を乱すことなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞内の対応する遺伝子の発現を破壊する高い活性を有することが検証されたことを示している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集
レンチウイルスＴＡＧ－７２ ＣＡＲ形質導入の２日後、Ｃａｓ９ ＲＮＰトランスフェクションのためにｄＰＢＳによってＴ細胞を洗浄した。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（ＳｙｎｔｈｅｇｏまたはＩＤＴ）をアニールして、全長ガイドＲＮＡを形成した。Ｃａｓ９タンパク質を全長ｇＲＮＡと１：２の比で室温で１０～２０分間インキュベートすることによって、トランスフェクション前にＣａｓ９ ＲＮＰを調製した。Ｃａｓ９ ＲＮＰをトランスフェクトするために、Ｔ細胞にＮｅｏｎトランスフェクションデバイス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）または４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をエレクトロポレーションした。
ゲノム編集の定量的評価
ＩＣＥアッセイ（Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０１８，１０．１１０１／２５１０８２（２５１０８２））によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集効率の効果および変異スペクトルを分析した。製造業者の指示に従って、ＩＳＯＬＡＴＥ ＩＩ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、エレクトロポレーションの４日後に、細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｇＲＮＡゲノム標的部位にまたがるＰＣＲアンプリコンを生成した。精製したＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒ配列決定し、オンラインで入手可能なＩＣＥソフトウェアを用いて配列クロマトグラムを分析した。
実施例３－ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ機能
遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大培養期中に、インビボ評価の前にインビトロでｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイムアッセイを使用して、細胞の腫瘍殺傷能力を評価した。実施例１および２に記載されるように、遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、検証した。
Ｔ細胞インビトロ細胞傷害性アッセイ
リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効率をインビトロで決定した。１０，０００個の標的細胞／１００μＬ（例えば卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３）を、１０％～２０％ウシ胎児血清およびウシインスリンが補充された培養培地（例えばＲＰＭＩ－１６４０基本培地）に再懸濁し、ＲＴＣＡプレートに入れた。標的細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２で３～２０時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着後、１：５～５：１の範囲の様々なエフェクター対標的比でＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔエフェクター細胞を加えた。いくつかの例では、使用前にＦＡＣＳによるＧＦＰ発現に基づいて、エフェクター細胞を単離した。並行して、非トランスフェクトＴ細胞を標的細胞と共培養して、Ｔ細胞のバックグラウンド機能性をインビトロで実証した。全共培養物を最適な増殖条件で少なくとも２０時間維持した。全体を通して、細胞インピーダンスをモニタリングした。インピーダンスの低下は、細胞剥離および最終的には細胞死を示す。
遺伝子編集済みレンチウイルスＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞を溶解する初期能力を比較するために、ＴＡＧ－７２発現が高いまたは低い腫瘍細胞を遺伝子編集済みＣＡＲ－Ｔ細胞または他の陰性対照エフェクターＴ細胞（非トランスフェクト）とインキュベートし、インビトロ細胞傷害性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）によってモニタリングした。これらの遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞はいずれも、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同程度に効率的にＴＡＧ－７２高腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ－３）を殺傷したが（図５Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）、ＴＡＧ－７２低腫瘍細胞（ＭＥＳ－ＯＶ）の溶解は観察されなかった（図５Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）。これらの結果は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ手順を使用して生成された遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力および特異性を保持していることを示す。
実施例４－ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ機能
近年の試験では、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビボ卵巣腫瘍負荷を減少させることができたが、腫瘍再発を予防するために存続することができなかったことが示された（Ｍｕｒａｄ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＡＧ７２（＋）Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｏｖａｒｉａｎ Ｔｕｍｏｒｓ ｖｉａ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＡＲ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８，９：ｐ．２２６８）。実施例１、２および３に記載されるように生成され、検証されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、インビボマウス固形腫瘍（異種移植）モデルにおけるそれらの効果について評価した。このモデルでは、約１×１０７個のヒト由来ＴＡＧ－７２陽性ＯＶＣＡＲ－３癌細胞を６～１０週齢のマウスの側腹部に皮下注射することによって、ＮＳＧマウスの側腹部でヒト腫瘍細胞株を増殖させた。７～９週間以内に、完全に形成された１５０～２００ｍｍ３の腫瘍が注射部位に発生した。腫瘍がこの体積に達した後、処置のために群を無作為化した。様々な編集済み遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに静脈内投与し、注射１回当たり５×１０６個のＴ細胞の合計２回の注射を行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後に、腫瘍体積、体重および臨床スコアをモニタリングした。動物倫理承認に従って、８００ｍｍ３～１０００ｍｍ３の腫瘍サイズ、顕著な体重減少または不良な臨床スコアを有するマウスを処分した。この卵巣癌腫瘍モデルでは、第２世代ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞処置は、最初に腫瘍のサイズを減少させたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後約３０日の時点で腫瘍再発が観察された（図６）。遺伝子編集済みＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、実施例１および２に記載される方法に従って生成し、同じモデルを対象としてインビボ効果について評価した。ＰＤ－１遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性または持続性を改善しなかった（図６）。しかし、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子のノックアウトは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ療法の抗腫瘍活性および持続性の有意な改善をもたらした。さらに、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブル遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ Ｔ細胞）は、モニタリング期間にわたってＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ Ｔ細胞処置マウスに対する腫瘍再発の完全な予防によって証明されるように、これらの群では最良の抗腫瘍活性および持続性を示した（図７）。Ａ２ＡＲおよびＦＡＳ遺伝子ノックアウトも、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ療法の抗腫瘍効果および耐久性を改善し、これにより、ＮＳＧマウス異種移植モデルでは、腫瘍の再発が遅延した（図８）。ＣＲＩＳＰＲによるＴＧＦβ受容体１および２のドミナントネガティブ変異も、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を増強し、これは、ＣＡＲ－Ｔ処置の６０日後からの腫瘍体積のさらに恒久的な制御によって証明された（図９）。
実施例５－ＣＲＩＳＰＲおよびインビボ機能を使用したＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子編集済みＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍のために承認された最初の成功したＣＡＲ－Ｔ治療である（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１１．３６５（８）：ｐ．７２５－３３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウトによって増強される、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性がＯＶＣＡＲ－３腫瘍モデルに限定されないことを検証するために、ＴＡＧ－７２抗原またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトを有するＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞も、インビボでの機能評価のために生成した。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ ＣＡＲ発現カセットを以前に記載されたように構築した（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１１．３６５（８）：ｐ．７２５－３３；Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００９．１７（８）：ｐ．１４５３－６４；国際公開第２０１７０８８０１２号パンフレットも参照）。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ ＣＡＲレンチウイルスベクターを生成し、ヒト活性化Ｔ細胞に形質導入して、実施例１に記載されるようにＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、次いで、実施例２に記載されるように、ＲＣ３Ｈ１ ｇＲＮＡ（配列番号２）および／またはＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡ（配列番号４）によって形成されたＲＮＰ複合体によってトランスフェクトして、ＣＲＩＳＰＲ ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。
ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞インビボ細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞のインビボ効果を、バーキットリンパ腫異種移植モデルにおいて評価した。このモデルでは、６～１０週齢のＮＳＧマウスの側腹部に、５×１０５個のＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種の３日後に、５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞の単回用量をマウスごとに静脈内注射した。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後に、腫瘍体積、体重および臨床スコアをモニタリングした。動物倫理承認に従って、８００ｍｍ３～１０００ｍｍ３の腫瘍サイズ、顕著な体重減少または不良な臨床スコアを有するマウスを処分した。このリンパ腫腫瘍モデルでは、ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ Ｔ細胞処置は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞処置と比較して、マウスの腫瘍増殖を有意に遅延させ、腫瘍担持マウスの生存期間中央値を改善した（図１０Ａ～図１０Ｂ）。この結果は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子およびＲＣ３Ｈ２遺伝子のノックアウトが、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察されたものと同様に、インビボでＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善することを示した。
実施例６－継続的な活性化曝露後のＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞の活性化マーカー
実施例５に記載されるように、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。
抗原曝露後の活性化マーカーの差について、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞±ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯを評価した（図１１）。操作されたＣＤ１９過剰発現細胞株、ＯＶＣＡＲ－３（ＣＤ１９）を照射し（３０Ｇｙ）、８０，０００細胞／ｍＬ／２４ウェル組織培養プレートのウェルで播種した。１×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞のアリコート（ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ有りおよび無し）を０日目に各ウェルに加えた。その後、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を、照射されたＯＶＣＡＲ－３（ＣＤ１９）細胞の触れられていない単層に７日間にわたって連日移入した。継続的な抗原曝露の７日後、エフェクター細胞を遠心分離によって１回洗浄し、マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の活性化の発現について評価した。これらのマーカーは、それぞれ、発現がＴＣＲライゲーションと関連する早期活性化および後期活性化に関連している。ＣＡＲ－Ｔ細胞上のこれらの活性化マーカーの発現を検出するために、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を使用してフローサイトメトリー分析を行った。共発現されたＧＦＰの検出によって、ＣＡＲ発現を間接的に検出した。細胞を蛍光コンジュゲート化抗体と４°Ｃで１５分間インキュベーションし、光から保護した標準的なプロトコルを使用して、ＣＤ６９およびＣＤ２５に関する細胞表面染色を行った。分析前にＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を２回洗浄した。ヨウ化プロピジウム溶液を使用して、生細胞および死細胞を識別した。ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）ソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、データ分析を行った。
継続的な抗原曝露の後、いずれかまたは両方の遺伝子を欠くＣＤ１９ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞は、さらに高い頻度のＣＡＲ＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋発現細胞に関する証拠を示した。この増加は統計学的に有意ではなかったが、３つ全部のＫＯ Ｔ細胞にわたって一致しており、非トランスフェクトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して活性化の増加が示された（図１１）。
実施例７－ＣＲＩＳＰＲおよびインビトロ機能を使用したＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞の生成
遺伝子ノックアウト免疫細胞を生成する方法がＣＡＲ－Ｔ細胞に限定されないことを実証するために、同等のＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウトを正常Ｔ細胞に対しても行った。
ＣＲＩＳＰＲ Ｔ細胞を生成するために、ヒトＴ細胞を単離し、実施例１に記載されるようにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。活性化ヒトＴ細胞を、活性化の３日後にＲＣ３Ｈ１ ｇＲＮＡ（配列番号２）および／またはＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡ（配列番号４）によって形成されたＲＮＰ複合体によってトランスフェクトし、実施例２に記載されるようにインビトロで拡大培養した。
トランスフェクトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲインデル頻度および遺伝子ノックアウト効率も、実施例２に記載されるようにＩＣＥアッセイによって分析した。ＩＣＥアッセイの結果は、これらのガイドＲＮＡが、活性化ヒトＴ細胞に対しても、フレーム外インデルを含むインデルを導入する高い活性を示すことを示した（図１２）。
Ｔ細胞の長期活性化によるインビトロ殺傷（図１３）
ＫＯの効果がＣＡＲ－Ｔ細胞に限定されるかどうかを決定するために、正常Ｔ細胞をそれらのＴＣＲおよびＣＤ２８共補助分子によってポリクローナルに活性化した（図１３）。ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞を、αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズの存在下で、１：１のビーズ対細胞比で少なくとも９２時間維持した。細胞計数を約２４時間ごとに行い、それに応じて新鮮なビーズを加えた。継続的な活性化の後、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ Ｔ細胞は、２０時間のモニタリング期間にわたって、非トランスフェクト（ＮＴ）Ｔ細胞と比較して、改善された機能をインビトロで示した。差は統計学的に有意ではなかったが、３つのＫＯ Ｔ細胞の各々は、非トランスフェクトＴ細胞よりも標的腫瘍細胞を殺傷するのに効率的であり、ＫＯ Ｔ細胞の長期活性化は、殺傷機能を「疲弊」させない可能性があることが示された。
実施例８－ＣＲＩＳＰＲを使用したＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞（ＣＡＲ有りおよび無し）の生成
遺伝子ノックアウト免疫細胞を生成する方法がＴ細胞だけに限定されないことを実証するために、同等のＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウトをＮＫ－９２細胞に対しても行った（図１Ｂ）。ＮＫ－９２は、癌標的に対する高い細胞傷害性を有するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株である。ＮＫ－９２機能は、ＣＡＲ発現を含む遺伝子改変によって改善することができる（Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．７：ｐ．９１）。ＮＫ－９２細胞株を２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２およびウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持し、拡大培養した。
ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＮＫ－９２細胞（それぞれ、ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ ＮＫ－９２細胞およびＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞）を生成するために、実施例２に記載されるように、ＮＫ－９２細胞に、ＲＣ３Ｈ１ ｇＲＮＡ（配列番号２）および／またはＲＣ３Ｈ２ ｇＲＮＡ（配列番号４）によって形成されたＲＮＰ複合体をトランスフェクトした。トランスフェクトＮＫ－９２細胞のＣＲＩＳＰＲインデル頻度および遺伝子ノックアウト効率も、実施例２に記載されるようにＩＣＥアッセイによって分析した。ＩＣＥアッセイの結果は、これらのガイドＲＮＡが、フレーム外インデルを含むインデルをＮＫ－９２細胞にも高頻度で導入することができることを示した（図１４）。
ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞を生成するために、実施例１に記載されるように、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲレンチウイルスベクターを使用して、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞を形質導入した。
実施例９－ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２およびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ ＫＯ ＮＫ－９２細胞のインビトロ機能
レンチウイルスＴＡＧ－７２ ＣＡＲベクターを使用して、実施例８に記載されるように、得られたＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞を形質導入した。ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２±ＣＡＲ細胞を生成し、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２が補充された、Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０中で培養して常用的に維持した。培養の少なくとも３日後、形質導入効率をフローサイトメトリーによって評価した。さらに、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２±ＣＡＲ細胞が癌細胞を排除する能力をインビトロで評価した。
リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞の殺傷効率をインビトロで決定した。標的細胞（１０，０００個の標的細胞／１００ｕＬ）（例えば、卵巣癌細胞株ＭＥＳ－ＯＶまたはＯＶＣＡＲ－３）を、ウシインスリンを含む（ＯＶＣＡＲ－３）または含まない（ＭＥＳ－ＯＶ）、１０～２０％ＦＢＳが補充された培養培地（例えば、ＭｃＣｏｙの５ａまたはＲＰＭＩ－１６４０基本培地）に再懸濁し、ＲＴＣＡプレートに分注した。標的細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２で少なくとも５時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着後、ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２エフェクター細胞を１：１のＥ：Ｔ比で加えた。並行して、非トランスフェクトＮＫ－９２細胞を標的細胞と共培養して、ＮＫ－９２細胞のバックグラウンド機能性をインビトロで実証した。全共培養物を最適な増殖条件で少なくとも４０時間維持した。細胞インピーダンスを全体を通してモニタリングした。
ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞が腫瘍細胞を溶解する能力を比較するために、腫瘍細胞をＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞または非トランスフェクトＮＫ－９２細胞とインキュベートし、インビトロ細胞傷害性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）によってモニタリングした。ＮＫ－９２細胞（図１５Ａ、左）はいずれも、ＭＥＳ－ＯＶ細胞と共培養した場合、細胞増殖抑制効果を示した。この効果は、非トランスフェクトＮＫ－９２対照と比較した場合、ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞およびＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞では改善され、インビトロでの機能の増強が実証された。さらに、ＮＫ－９２細胞（図１５Ａ、右）はいずれも、ＮＣＩの減少によって実証されるように、ＯＶＣＡＲ－３細胞と共培養した場合に細胞傷害効果を示した。この効果は、非トランスフェクトＮＫ－９２対照条件と比較して、ＲＣ２Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞およびＲＣ２Ｈ１／２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞ではそれぞれ改善され、インビトロでの機能の増強が実証された。
ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞を用いて同様のアッセイを行った。ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞へのＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞の形質導入を確認するために、フロー分析を行い（実施例１に記載されるように）、ＣＡＲの統合および発現のための代替としてＧＦＰを使用した（図１５Ｂ）。値は、生存細胞の割合として表される％ＣＡＲ（ＧＦＰ）を表し、デブリおよびダブレットは親ゲートで除外した。
ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２遺伝子ノックアウトＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞が腫瘍細胞を溶解する能力を比較するために、癌細胞株（この場合、ＯＶＣＡＲ－３）をＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞±ＲＣ３Ｈ１および／またはＲＣ３Ｈ２ ＫＯと共培養し、インビトロ細胞傷害性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）によってモニタリングした。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを有するＮＫ－９２細胞（図１５Ｃ）はいずれも、ＮＣＩのプラトーまたは減少によって実証されるように、ＯＶＣＡＲ－３細胞と共培養した場合に細胞傷害効果を有した。この効果は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１ ＫＯ ＮＫ－９２細胞、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞およびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ＮＫ－９２細胞では共培養の４０時間以内に顕著に大きく、インビトロでの機能の増強が実証された。
実施例１０－ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子ＫＯ ｉＰＳＣの生成
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞は、無限に自己再生し、造血幹細胞（ＨＳＣ）および免疫細胞を含む様々な細胞型に分化することができる。Ｔ細胞およびＮＫ細胞のような免疫細胞は、癌治療のために以前にｉＰＳＣから生成されている（Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３．３１（１０）：ｐ．９２８－３３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８．２３（２）：ｐ．１８１－１９２ ｅ５）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウトＴ細胞またはＮＫ細胞は、同様の方法に従って、ｉＰＳＣから得ることができる（図１６）。ＣＲＩＳＰＲ ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２遺伝子ダブルノックアウト（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣ）ならびにＡ２ＡＲ遺伝子ノックアウトｉＰＳＣ（Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ）を生成するために、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して、代表的なｇＲＮＡ（ＲＣ３Ｈ１、配列番号２；ＲＣ３Ｈ２、配列番号４；Ａ２ＡＲ、配列番号７）によって形成されたＲＮＰ複合体をｉＰＳＣにトランスフェクトした。最初に、Ｌａｍｉｎｉｎ－５２１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＰＢＳ溶液によって１２ウェルプレートをコーティングし、３７°Ｃで２時間インキュベートした。トランスフェクションの前に、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにｉＰＳＣを２時間プレインキュベートした。全長ｇＲＮＡをＬｏｎｚａ Ｐ３緩衝液およびＣａｓ－９と組み合わせることによって、ＲＮＰを調製した。次いで、ＲＮＰ混合物を室温で１０～２０分間インキュベートした。プレインキュベーション後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｉＰＳＣを単一細胞として剥離し、エレクトロポレーションのために反応１回当たり１×１０６個の細胞を得た。遺伝子ノックアウトｉＰＳＣを生成するために、Ｌｏｎｚａ Ｐ３緩衝液およびＲＮＰ混合物中の細胞を合わせてＰＣＲチューブ内に入れ、次いで、エレクトロポレーションのためにＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒに添加した。この後、ＣｌｏｎｅＲ（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）を反応物に加え、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｌｏｎｅＲ（商標）培地を含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）中、Ｌａｍｉｎｉｎ－５２１プレコートプレートに細胞を加えた。ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）による連日の培地交換を７２時間にわたり行い、約８０％コンフルエントに達した後、細胞を継代した（エレクトロポレーションの６～７日後）。トランスフェクション後、多能性幹細胞様形態を有するＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣコロニーおよびＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣコロニーを培養で維持した（図１７Ａおよび図２１Ａ）。
非トランスフェクトｉＰＳＣおよびトランスフェクトｉＰＳＣを、Ｌａｍｉｎｉｎ－５２１上のｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）中で培養し、ＥＶＯＳ（登録商標）明視野顕微鏡を使用して１０倍で撮像した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）によって細胞を剥離し、単一細胞として回収した。次いで、それらを、製造推奨に従って、ＴＲＡ－１－６０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＴＲＡ－１－８１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＳＳＥＡ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を標的とする抗体を使用して染色した。ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＳＳＥＡ－４は、多能性幹細胞上に発現される表面受容体であり、ｉＰＳＣを特性評価するための一般的な慣行と考えられている（Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）。未染色試料および適切なアイソタイプ対照を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、細胞を分析した。死細胞（ＰＩ染色による）、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）を使用してヒストグラムプロットを作成した（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯについては図１７Ａ～図１７Ｂ、Ａ２ＡＲ ＫＯについては図２１Ａ～図２１Ｂ）。ｉＰＳＣは、ＫＯの有無にかかわらず、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＳＳＥＡ－４についてほぼ同一の多能性マーカーを示し、これらはいずれも＞９５％で共発現した（図１７Ｂおよび図２１Ｂ）。ｉＰＳＣの形態に視覚的な差はなく（図１７Ａおよび図２１Ａ）、ＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ダブルＫＯ、またはＡ２ＡＲ ＫＯは、ｉＰＳＣの維持および多能性に悪影響を及ぼさなかったことが示された。
トランスフェクトｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲインデル頻度および遺伝子ノックアウト効率を、実施例２に記載されるように、ＩＣＥアッセイによって、分析した。ＩＣＥアッセイの結果は、ｇＲＮＡが、ｉＰＳＣにおけるフレーム外インデルを含め、高頻度でインデルをもたらすことを示した（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯについては図１８Ａ～図１８Ｃ、およびＡ２ＡＲ ＫＯについては図２２Ａ～図２２Ｃ）。
要約すると、本発明者らのデータは、本明細書に記載の遺伝子編集済みｉＰＳＣが、癌治療にその後使用するための公知の方法を使用して、ＣＤ３４＋／ＨＥ／ＨＳＣに分化し、次いで、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞に分化し得ることを実証している。
実施例１１－ｉＮＫ細胞（編集済みｉＮＫ細胞）へのＲＣ３Ｈ１およびＲＣ３Ｈ２ ＫＯ（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ）ｉＰＳＣの分化。
ｉＣＤ３４＋細胞
受容体ＣＤ３４は、免疫細胞を作製するためのプラットフォームを形成する幹細胞源であるＨＥおよびＨＳＣ上に発現される。ＣＤ３４＋細胞へのｉＰＳＣの分化は、ｉＰＳＣ由来免疫細胞を作製し得るための前提条件であり、必要不可欠である（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４ ｖｏｌ ３２（６）ｐ５５４－５６１，Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２（４）ｐ２７４－２８３，Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７ ｖｏｌ ９（６）ｐ１７９６－１８１２）。ｉＰＳＣと免疫細胞との間の中間細胞型としてのＣＤ３４＋発現の特性評価は、一般的な慣行と考えられており、ｉＰＳＣに遺伝子－ＫＯを含めても初期発生中に潜在的な分化経路を破壊しないことを実証するための重要な工程である。
ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して、非トランスフェクトｉＰＳＣおよびトランスフェクトｉＰＳＣ（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯを含む）をｉＣＤ３４＋細胞に分化させた。細胞を単離し、製造業者の推奨に従ってＣＤ３４を標的とする抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して染色した。未染色試料および適切なアイソタイプ対照を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、細胞を分析した。死細胞（ＰＩ染色による）、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）を使用してデータ分析を行った。
ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯを含めたまたは含めないｉＰＳＣ（図１９）をｉＣＤ３４＋細胞に分化させた。これらのデータは、ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣからのｉＣＤ３４＋細胞の作製の成功を実証し、また、ｉＰＳＣからあらゆる中間表現型を経てＣＤ３４発現細胞を含む細胞の集団に移行するために必要な重要な発達経路がインタクトなままであることを示す。
ｉＮＫ細胞
ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯを含むｉＰＳＣは、ｉＮＫ免疫細胞に分化することができる。
遺伝子ノックアウトｉＣＤ３４＋（ＲＣ３Ｈ１、２ ＫＯ ｉＰＳＣ由来）を、ＩＬ－１５、ＦＬＴ３およびＩＬ－７を含むサイトカインの組合せによって促進されるｉＮＫ細胞にさらに分化させた。ｉＮＫ細胞は、Ｌｉらによる米国特許第９，２６０，６９６号明細書（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｋｎｏｒｒ）に記載されている方法（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２０１８）１８１－１９７）などの公開されている方法を使用して、または市販の培養系ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して作製することができる。
分化細胞を単離し、製造推奨に従ってＣＤ５６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＮＫｐ４６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＮＫＧ２Ｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を標的とする抗体を使用して染色した。未染色試料および適切なアイソタイプ対照を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、分化細胞を分析した。死細胞（ＰＩ染色による）、デブリおよびダブレットをゲートアウトし、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）を使用してデータ分析を行った（図２０）。ＮＫ機能性受容体（ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄ）の発現は、ｉＣＤ５６＋細胞がＮＫ特異的細胞傷害機能を有することを裏付けている。
実施例１２－ｉＮＫ細胞（編集済みｉＮＫ細胞）へのＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣの分化。
ｉＣＤ３４＋細胞
ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して、非トランスフェクトｉＰＳＣおよびトランスフェクトｉＰＳＣ（Ａ２ＡＲ ＫＯを含む）をｉＣＤ３４＋細胞に分化させた。細胞を単離し、製造業者の推奨に従ってＣＤ３４を標的とする抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して染色した。未染色試料および適切なアイソタイプ対照を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、細胞を分析した。死細胞（ＰＩ染色による）、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）を使用してデータ分析を行った。
Ａ２ＡＲ ＫＯを含めたまたは含めないｉＰＳＣ（図２３）は、ｉＣＤ３４＋細胞に首尾よく分化した。これらのデータは、Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣからのｉＣＤ３４＋細胞の作製を実証し、また、ｉＰＳＣからあらゆる中間表現型を経てＣＤ３４発現細胞を含む細胞の集団に移行するために必要な重要な発達経路がインタクトなままであることを示す。
ｉＮＫ細胞
Ａ２ＡＲ ＫＯを含むｉＰＳＣは、ｉＮＫ免疫細胞に分化することができる。
非トランスフェクトｉＣＤ３４（非トランスフェクトｉＰＳＣ由来）および遺伝子ノックアウトｉＣＤ３４＋（遺伝子ノックアウトｉＰＳＣ由来）を、ＩＬ－１５、ＦＬＴ３およびＩＬ－７を含むサイトカインの組合せによって促進されるｉＮＫ細胞にさらに分化させた。ｉＮＫ細胞は、Ｌｉらによる米国特許第９，２６０，６９６号明細書（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｋｎｏｒｒ）に記載されている方法（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２０１８）１８１－１９７）などの公開されている方法を使用して、または市販の培養系ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して作製することができる。
分化細胞を、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞マーカーの発現について、評価した。図２４に示すＣＤ５６＋ヒストグラムが、非トランスフェクトｉＰＳＣ試料またはトランスフェクトｉＰＳＣ試料のいずれかから生成された培養物中の全生細胞を示すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。各それぞれの受容体に対する各抗体の明確な陽性染色を示すために、未染色試料を示す。適切なアイソタイプ対照は陰性であった。ＮＫ機能性受容体（ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄ）の発現により、ｉＣＤ５６＋細胞が細胞傷害機能を有するｉＮＫ細胞であることが確認される。
実施例１３－編集済みｉＮＫ細胞の機能
Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣを生成し（実施例１０）、編集済みｉＮＫ細胞に分化させた（実施例１２）。次いで、ｉＮＫ細胞を２０～４０日後に収集し、その後の機能アッセイに使用した。
リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して、ｉＮＫ細胞が癌細胞を殺傷する能力をインビトロで評価した。標的細胞（１０，０００個／１００ｕＬ）（例えば卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３）を、１０～２０％ＦＢＳおよびウシインスリンが補充された培養培地（例えば、Ｌ－グルタミン基本培地を含むＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁し、ＲＴＣＡプレートに分注した。標的細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２で少なくとも５時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着後、ｉＮＫエフェクター細胞を１：１のＥ：Ｔ比で加えた。並行して、ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞を標的細胞と共培養して、非トランスフェクトｉＮＫ細胞のバックグラウンド機能性をインビトロで実証した。全共培養物を最適な増殖条件で少なくとも１０時間維持した。全体を通して、細胞インピーダンスをモニタリングし、エフェクター細胞の添加時までに正規化が起こるＮＣＩとして本明細書に提示した。標的細胞のみ（対照）と比較したｉＮＫ±Ａ２ＡＲ ＫＯエフェクター細胞（試験）の細胞傷害率（％細胞傷害性）を、５時間および１０時間の共培養後に、以下の式を使用して計算した：
（（正規化された細胞指数対照－正規化された細胞指数試験）／正規化された細胞指数対照）×１００
Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞（Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＮＫ細胞）が腫瘍細胞を溶解する能力を比較するために、腫瘍細胞株をＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＮＫ細胞またはＮＴ ｉＮＫ細胞とインキュベートし、インビトロ細胞傷害性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）によってモニタリングした。ＮＴ ｉＮＫ細胞は、ＯＶＣＡＲ－３標的細胞と共培養した場合に細胞傷害効果を示した（図２５Ａ）。この効果は、非トランスフェクト対照と比較してＡ２ＡＲ ＫＯ ｉＮＫ細胞では改善され、インビトロでの機能の増強が実証された。さらに、Ａ２ＡＲ ＫＯ ｉＮＫでは、５時間の共培養（図２５Ｂ、左側）および１０時間の共培養後の細胞傷害性はともに、さらに高い細胞傷害性を示した（図２５Ｂ、右側）。まとめると、これらのデータは、Ａ２ＡＲ ＫＯが、非トランスフェクト対照細胞と比較して、Ｔ細胞だけでなくｉＮＫ細胞でも抗腫瘍活性を増強し得ることを示している。
特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文および学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された刊行物の各々は、その全体が、あらゆる目的のために、本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (48)

  1. ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように免疫細胞を改変することを含む、免疫細胞の機能を増強する方法。
  2. ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害するように幹細胞を改変することを含む、免疫細胞に分化することができる幹細胞を改変する方法。
  3. 前記改変された幹細胞を免疫細胞に分化させることをさらに含み、前記少なくとも１つの遺伝子の機能が、前記免疫細胞内で阻害される、請求項２に記載の方法。
  4. 遺伝子の機能の阻害が、遺伝子編集系によって達成される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記遺伝子編集系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記遺伝子編集系が、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択されるガイドＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを利用する、請求項６に記載の方法。
  9. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 遺伝子の機能の阻害が、場合により低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸を介して、ｍＲＮＡのレベルまたは機能を低下させることによって達成される、請求項１または２に記載の方法。
  11. 遺伝子の機能の阻害が、場合により抗体または小分子を使用することによって、前記遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルまたは活性を低下させることによって達成される、請求項１または２に記載の方法。
  12. 前記方法によって生成された改変された細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記方法によって生成された改変された免疫細胞が、１または複数の標的抗原を認識する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記標的抗原が、ＴＡＧ－７２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ２である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つの遺伝子がＡ２ＡＲである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの遺伝子がＦＡＳである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ２である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  21. 請求項１もしくは３～２０のいずれか一項に記載の方法によって生成された、または、請求項２もしくは４～２０のいずれか一項に記載の方法によって生成された改変された幹細胞から分化した、免疫細胞。
  22. 少なくとも１つの遺伝子の機能が、改変された免疫細胞内で阻害され、前記少なくとも１つの遺伝子が、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される、改変された免疫細胞。
  23. 遺伝子の機能の前記阻害が、前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルもしくは機能の低下、または前記遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルもしくは活性の低下に起因する、請求項２２に記載の改変された免疫細胞。
  24. 遺伝子の機能の前記阻害が、前記遺伝子の核酸配列における改変に起因する、請求項２２に記載の改変された免疫細胞。
  25. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはマクロファージから選択される、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  26. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  27. １または複数の標的抗原を認識する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  28. 前記標的抗原が、ＴＡＧ－７２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される、請求項２７に記載の改変された免疫細胞。
  29. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ１である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  30. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ２である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  31. 前記少なくとも１つの遺伝子がＡ２ＡＲである、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  32. 前記少なくとも１つの遺伝子がＦＡＳである、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  33. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ１である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  34. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ２である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
  35. 少なくとも１つの遺伝子の核酸配列における改変を含む、免疫細胞に分化することができる改変された幹細胞であって、前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害し、前記少なくとも１つの遺伝子が、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、Ａ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲ１およびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される改変された幹細胞。
  36. 人工多能性幹細胞である、請求項３５に記載の改変された幹細胞。
  37. 前記人工多能性幹細胞が、３つのＨＬＡ遺伝子型についてホモ接合性のドナー細胞から生成される、請求項３６に記載の改変された幹細胞。
  38. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をさらに含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  39. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ１である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  40. 前記少なくとも１つの遺伝子がＲＣ３Ｈ２である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  41. 前記少なくとも１つの遺伝子がＡ２ＡＲである、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  42. 前記少なくとも１つの遺伝子がＦＡＳである、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  43. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ１である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  44. 前記少なくとも１つの遺伝子がＴＧＦＢＲ２である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の改変された幹細胞。
  45. 標的遺伝子の配列を編集することができるガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含む、免疫細胞の機能を増強するための組成物であって、
    前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、組成物。
  46. 前記ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項４５に記載の組成物。
  47. 請求項２１～３４のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象の病態を治療する方法。
  48. 前記病態が、癌、感染症、自己免疫障害、臓器の線維症、または子宮内膜症である、請求項４７に記載の方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11591381B2 (en) 2020-11-30 2023-02-28 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2023108107A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Beam Therapeutics Inc. Modified immune cells and methods of using the same
WO2023155924A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 Huidagene Therapeutics Co., Ltd. Guide rna and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10934550B2 (en) * 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
EP4219725A3 (en) * 2014-10-31 2023-08-30 The Trustees of the University of Pennsylvania Altering gene expression in modified t cells and uses thereof
SG11201809710RA (en) * 2016-05-06 2018-11-29 Juno Therapeutics Inc Genetically engineered cells and methods of making the same
EP3500276A4 (en) * 2016-08-19 2020-01-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center METHODS OF DIFFERENTIATING STEM CELLS IN ENDODERM
JP2019536480A (ja) * 2016-11-22 2019-12-19 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール Ｔ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのｃｄ７発現およびキメラ抗原受容体の遮断
CN110913870A (zh) * 2016-12-30 2020-03-24 细胞结构公司 遗传修饰的自然杀伤细胞
CN110446489A (zh) * 2017-03-20 2019-11-12 南加利福尼亚大学 具有表面缀合的载药纳米颗粒的car t细胞的过继转移及其用途
SG11202003862PA (en) * 2017-11-01 2020-05-28 Editas Medicine Inc Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy
WO2019106163A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Cellectis Reprogramming of genetically engineered primary immune cells
EP3724326A1 (en) * 2017-12-11 2020-10-21 Editas Medicine, Inc. Cpf1-related methods and compositions for gene editing
CA3088234A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-18 Curocell Inc. Enhanced immune cells using dual shrna and composition including the same
JP2021518160A (ja) * 2018-03-15 2021-08-02 ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
BR112021010297A2 (pt) * 2018-11-28 2021-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Edição de genomas multiplexadores de células imunes para aumentar a funcionalidade e resistência ao ambiente supressivo
BR112021016046A2 (pt) * 2019-02-15 2021-11-09 Editas Medicine Inc Células assassinas naturais modificadas (nk) para imunoterapia
WO2020219682A2 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Gene knock-outs to improve t cell function

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