KR20220098378A - 기능이 향상된 면역 세포의 제공 방법 - Google Patents

기능이 향상된 면역 세포의 제공 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기능이 향상된 면역 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 명세서에는 면역 세포의 기능을 향상시키는 방법으로서, 면역 세포가 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 변형시키는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 또한 본 명세서에는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 면역 세포로 분화할 수 있는 줄기 또는 전구 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 또한 본 명세서에는 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역 세포 또는 줄기 세포, 뿐만 아니라 치료학적 치료에서의 면역 세포의 용도가 개시된다.

Description

기능이 향상된 면역 세포의 제공 방법
[0001] 본 출원은 2019년 11월 20일자, 미국 가출원번호 제62/938,022호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체 내용이 참조 문헌으로 포함된다.
기술 분야
[0002] 본 발명은 기능이 향상된 면역 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 명세서에는 면역 세포의 기능을 향상시키는 방법으로서, 면역 세포가 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 변형시키는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 또한 본 명세서에는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 면역 세포로 분화할 수 있는 줄기 또는 전구 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 또한 본 명세서에는 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역 세포 또는 줄기 세포, 뿐만 아니라 치료학적 치료에서의 면역 세포의 용도가 개시된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
[0003] 2020년 11월 3일에 생성된 10KB의 37830WO_ND201903_SequenceListing.txt ASCII 텍스트 파일의 서열 목록이 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
[0004] 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포 (CAR-T 세포)는 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 비호치킨 림프종 (NHL)와 같은 질병에서 종양 세포를 사멸하는데 매우 효과적인 것으로 나타났다. B 세포 항원 CD19을 표적화하는 승인된 제품은 CAR 유전자 작제물을 환자 유래의 ("자가") T 세포에 도입하여 제조된다 (Kershaw et al., Gene-engineered T cells for cancer therapy, Nat Rev Cancer, 2013, 13(8): 525-41). 다발성 골수종과 같은 다른 다른 혈액암에 대한 B 세포 성숙화 항원 (BCMA)과 같은 다른 혈액 세포 마커를 표적화하는 추가적인 자가 제품이 개발중이다 (Sadelain et al., Therapeutic T cell engineering, Nature, 2017, 545(7655): 423-431).
[0005] 혈액 기반의 암에서 CAR-T 세포의 임상 결과는 인상적이었지만 고형 종양 치료에서는 유사한 결과가 나오지 않았다. 고형 종양에서 효능이 상대적으로 부족한 데에는 여러 가지 이유가 있는데, 예를 들어 종양 부위에 대한 제한된 접근, 종양 미세 환경의 면역 억제 특성 및 고형 종양 특이적 표적 항원의 부족이 있다. 또한, 투여된 CAR-T 세포의 지속성 부족 및 "고갈"은 일관되게 관찰되는 한계점이다 (Newick et al., CAR T Cell Therapy for Solid Tumors, Annu Rev Med, 2017, 68: 139-152).
[0006] CTLA-4, PD-1 또는 LAG-3과 같은 억제 수용체는 CAR-T 세포의 활성화를 약화시키고 T 세포 고갈을 가속화할 수 있다. PD-1이 게놈 편집에 의해 파괴된 후에 T 세포의 개선된 항종양 활성이 예상되었다 (Liu et al., CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T 세포, 세포 Res, 2017, 27(1): 154-157). 그러나, T 세포에서 PD-1을 제거하면 피로에 대한 감수성이 또한 증가하고 수명이 단축되며, 항종양 효과가 개선되지 않을 수 있다.(Odorizzi et al., Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells, J Exp Med, 2015, 212(7): 1125-37). 이러한 이유로, T 세포의 유전자 편집이 항종양 활성을 강화하는지 여부는 사례별로 평가해야 한다.
[0007] CRISPR/Cas9는 박테리아가 박테리오파지를 기억하고 파괴할 수 있도록 하는 박테리아 면역계의 중요한 구성 요소이다. 포유류 세포에서, CRISPR/Cas9는 TALEN 및 ZFN과 같은 다른 유전자 편집 기술과 마찬가지로 유전자 편집에 적용될 수 있다. CRISPR 시스템은 Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 두 가지 주요 구성 요소를 포함한다. 구체적으로, 설계된 가이드 RNA는 인간 게놈의 사용자 정의 절단 부위에 Cas9 뉴클레아제 가이드 Cas9-gRNA 리보핵단백질(RNP) 복합체와 복합체를 형성한다. RNP 절단은 게놈에서 이중 가닥 DNA 파손을 초래하고, 이중 가닥 DNA 파손은 비-상동 말단 접합 (NHEJ)이라고 하는 오류가 발생하기 쉬운 프로세스에 의해 복구된다. NHEJ 경로에서, 뉴클레오타이드 결실 또는 삽입 ("인델")은 유전자 파괴 또는 녹아웃을 초래한다 (Addgene, CRISPR 101: A Desktop Resource (2nd Edition), 2017). 가이드 RNA의 표적 내 효율성과 표적 외 효과는 CRISPR/Cas9 유전자 표적 적용의 특이성과 안전성을 결정한다. 결과적으로, 특이적으로 설계된 가이드 RNA는 유전자 파괴의 성공에 중요한 역할을 한다.
[0008] 최근 연구는 CRISPR을 사용하여 면역 조절자의 게놈 전체 기능 상실 스크린을 수행하였으며, TCE2, SOCS1, RASA 및 CBLB와 같은 음성 조절자의 제거가 시험관 내에서 T 세포 세포독성을 유의하게 증가시킨다는 것을 발견하였다 (Shifrut et al., Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell, 2018, 175(7): 1958-1971, e15). 그러나, 단기간의 시험관 내 세포독성은 유전자 억제 또는 결실이 생체 내 기능 또는 수명에 미치는 영향에 대한 제한된 지침을 제공한다. 유전자 억제가 활성 또는 수명을 포함하여 면역 세포 (T 세포, NK 세포, NKT 세포 등 포함)의 기능에 미칠 수 있는 잠재적 영향은 시험관 내 및 생체 내에서 보다 광범위하게 평가할 필요가 있다.
[0009] 강화된 면역 세포가 암에 대한 잠재적인 무기이기 때문에, 면역 세포 제품을 수치적으로 생성, 확장 및 특성화하는 데 어려움이 있다. 면역 세포는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 생성될 수 있다. 따라서 만능 줄기 세포 기술이 이론적으로 만능 줄기 세포가 무제한의 재생 가능한 세포 공급원을 제공함에 따라 매우 유망한 기술이다. 여러 병원체와 암에 반응할 수 있는 광범위한 표적 인식 시스템 (TCR/CAR/세포독성 수용체)을 비롯하여, 기능이 향상된 줄기 세포 (예를 들어, 유도 만능 줄기 세포(iPSC))로부터 면역 세포를 효과적으로 무제한으로 직접 생성하는 능력은 주된 상업적 기회를 나타낸다. 그러므로, iPSC 생존, 자가 재생, 증식 능력 및 면역 세포로의 분화 능력에 대한 특정 관심 유전자의 억제의 영향을 이해하는 것과도 관련이 있다.
[0010] 본 명세서에서는 여러 유전자의 억제가 생체 내 세포독성 세포의 지속성 및 항종양 활성을 향상시키는 것을 입증하였다.
[0011] 일 양태에서, 본 명세서에는 면역 세포의 기능을 향상시키는 방법이 제공된다. 방법은 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 (즉, 하나 이상의 유전자)의 기능을 억제하도록 면역 세포를 변형시키는 것을 포함한다.
[0012] 또 다른 양태에서, 본 명세서에는 면역 세포로 분화할 수 있는 줄기 세포를 변형시키는 방법이 제공된다. 방법은 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하도록 줄기 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 줄기 세포는 면역 세포로 추가로 분화되며, 여기서 상기 적어도 하나의 유전자의 기능은 면역 세포에서 억제된다.
[0013] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 선택적으로 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 또는 안티센스 핵산을 통해 mRNA의 수준 또는 기능을 감소시킴으로써 달성된다.
[0014] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 임의로 항체 또는 소분자의 사용을 통해 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수준 또는 활성을 감소시킴으로써 달성된다.
[0015] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자 편집 시스템에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas, TALEN 및 ZFN으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 16로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적화 한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 가이드 RNA 의존성 뉴클레아제를 활용한다: Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4.
[0016] 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 (NKT 세포와 같은 세포 포함), 또는 세포로부터 선택된다.
[0017] 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 세포, 예컨대 변형된 면역 세포 또는 변형된 줄기 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
[0018] 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 면역 세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 TAG-72, CD19, CD20, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파 (FRα), 및 BCMA으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0019] 추가의 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 면역 세포가 본 명세서에 제공된다.
[0020] 또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 줄기 세포가 본 명세서에 제공된다.
[0021] 일 양태에서, 변형된 면역 세포가 본 명세서에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 유전자의 기능은 비변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포에서 억제되고, 적어도 하나의 (즉, 하나 이상의) 유전자는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RC3H1 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, RC3H2 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, A2AR 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, FAS 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, TGFBR1 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, TGFBR2 유전자는 변형된 면역 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로부터 선택된 여러 유전자가 억제된다.
[0022] 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포에서 유전자 기능의 억제는 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 기능, 또는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준 또는 활성 감소로부터 기인한다.
[0023] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자의 핵산 서열의 변형으로부터 기인한다.
[0024] 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 T 세포 (NKT 세포와 같은 세포 포함), 또는 세포로부터 선택된다.
[0025] 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다.
[0026] 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 TAG-72, CD19, CD20, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파 (FRα) 및 BCMA으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0027] 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 유전자의 핵산 서열 중 변형을 포함하는 면역 세포로 분화할 수 있는 변형된 줄기 세포가 본 명세서에 제공되며, 이러한 변형은 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하며, 적어도 하나의 유전자는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0028] 일부 구현예에서, RC3H1 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, RC3H2 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, A2AR 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, FAS 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, TGFBR1 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, TGFBR2 유전자는 변형된 줄기 세포에서 억제된다. 일부 구현예에서, RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로부터 선택된 여러 유전자가 억제된다.
[0029] 일부 구현예에서, 변형된 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포이다.
[0030] 일부 구현예에서, 변형된 줄기 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
[0031] 추가의 양태에서, 표적 유전자의 서열을 편집할 수 있는 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하는, 면역 세포의 기능을 향상시키기 위한 조성물이 본 명세서에 개시되며, 여기서 가이드 RNA는 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 16으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적화한다.
[0032] 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함한다: Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4.
[0033] 또 다른 양태에서, 대상체의 병태를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 개시된 변형된 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 병태는 암, 감염, 자가면역 장애, 기관의 섬유증, 또는 자궁내막증이다.
[0034] 본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)과 함께 공개된 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 특허청에 요청 및 필요한 요금 지불시 제공될 것이다.
[0035] 도 1A-1B. 변형된 면역 세포의 항종양 활성을 평가하는 예시적인 전략. (A) 면역 조절 유전자의 CRISPR 녹아웃을 포함하는 CAR-T 세포의 평가를 위해 구현된 전략에 대한 도식적 표현, 예시에서 사용된 1차 T 세포에서 렌티바이러스 CAR 형질도입, 유전자 표적화 및 기능 분석의 대표적인 타임라인을 도시한다. (B) 면역 조절 유전자의 CRISPR 녹아웃 이후에 렌티바이러스 CAR 형질도입 및 NK-92 세포의 기능 분석이 뒤따르는 변형된 NK-92 세포 생성의 대표적인 타임라인.
[0036] 도 2A-2B. TAG-72 CAR-T 세포를 생성하기 위한 인간 1차 T 세포의 렌티바이러스 형질도입. (A) 상기 연구에 사용된 TAG-72 특이적 CAR 구성의 개략도. (B) 1차 인간 T 세포에서 CAR의 형질도입 효율. 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후 10일에 발현을 조사하였다. 각 점 플롯에 포함된 값은 CAR 이벤트의 빈도를 실행 가능한 단일 세포의 백분율로 나타낸다. (한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 도시된다).
[0037] 도 3. CRISPR/Cas9 RNP 형질감염 후 TAG-72 CAR-T 세포의 성장 곡선 (한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 도시된다). NT: 형질도입되지 않은 T 세포; TAG-72 CAR: TAG-72 CAR로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/PD-1 KO T: PD-1을 표적화하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/A2AR KO T: A2AR을 표적화하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/FAS KO T: FAS를 표적화하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/RC3H1 KO T: RC3H1을 표적화하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/RC3H2 KO T: RC3H2를 표적화하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/TGFBR1 KO T: TGFBR1에 우성 음성 돌연변이를 도입하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/TGFBR2 KO T: TGFBR2에 우성 음성 돌연변이를 도입하는 TAG-72 CAR 및 CRISPR/Cas9 RNP로 형질도입된 T 세포.
[0038] 도 4A-4D. RNP가 형성된 가이드 RNA의 형질감염은 CAR-T 세포에서 특정 유전자의 개방 판독 프레임에 인델을 도입한다. ICE (Inference of CRISPR Edits) 분석으로 인델의 빈도를 평가하였다. (A) RC3H2 gRNA 형질감염된 CAR-T 세포 ("편집된 샘플")의 Sanger 시퀀싱 추적은 형질감염되지 않은 CAR-T 세포 ("대조군 샘플")와 대조적으로 절단 부위의 다운스트림에 있는 있는 염기의 이질적 혼합을 도시한다 (서열 번호: 17은 편집된 샘플에서 281 내지 346 bp를 나타내고; 서열 번호: 18은 대조 샘플에서 281 내지 346 bp를 나타낸다). 대조 샘플의 검은색 밑줄 영역은 가이드 시퀀스를 나타내고, 수평 빨간색 점선 밑줄 영역은 관련 PAM(Protospacer Adjacent Motif) 위치이다. 두 트레이스의 수직 검은색 점선은 절단 부위를 나타낸다. (B) RC3H2 RNP 형질감염된 CAR-T 세포의 게놈 DNA에서 편집된 각 서열(정규화됨)의 기여도에 대한 상대적 백분율. 위에서 아래로 서열은 각각 서열 번호: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26에 제시되어 있다. (C) RC3H2 RNP 형질감염된 CAR-T 세포의 편집된 전체 집단에서 인델 크기의 분포. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 이동을 나타내거나 또는 21bp 초과 길이인 인델의 비율이다. Pearson 상관 계수로 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다. (D) RNP 형질감염된 CAR-T 세포의 ICE 분석 결과 요약. RNP 복합체는 본 연구에 사용된 대표적인 가이드 RNA에 의해 형성되었다 (PD-1, 서열 번호: 1; RC3H1, 서열 번호: 2; RC3H2, 서열 번호: 4; A2AR, 서열 번호: 7; FAS, 서열 번호: 9; TGBFBR1, 서열 번호: 11; TGFBR2, 서열 번호: 14; 한 명의 공여자로부터의 T 세포의 대표적인 데이터가 도시된다.
[0039] 도 5A-5H. 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포는 표적 세포 (OVCAR-3 세포주)를 발현하는 TAG-72hi의 강력한 세포 사멸을 매개하지만 (도 5A, 5C, 5E 및 5G), TAG-72-neg/낮은 암 표적 세포 (MES-OV 세포주) (도 5B, 5D, 5F 및 5H)는 매개하지 않는다. 1:1의 이펙터 대 표적 비율로 CAR-T 세포를 첨가하기 전에 표적 세포를 밤새 플레이트에 부착시켰다. 형질도입되지 않은 T 세포(NT)를 대조군으로서 사멸 분석에 포함시켰다. 세포 임피던스 (정규화된 세포 지수 (NCI)로 표시되는 평균 ± SD)를 20시간 동안 모니터링하였다. 정상적인 성장 조건 ("표적 세포만") 하에서의 표적 세포 증식도 전체에 걸쳐 모니터링하였다. (기술적 삼중으로 수행된 한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 도시된다). CAR-T (도 5A-5H): TAG-72 CAR-T 세포; PD-1 (도 5A-5B): PD-1 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; RC3H1 (도 5C and 5D): RC3H1 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; RC3H2 (도 5C 및 5D): RC3H2 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; A2AR (도 5E 및 5F): A2AR 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; FAS (도 5E 및 5F): FAS 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; TGFBR1 (도 5G 및 5H): TGFBR1 우성 음성 TAG-72 CAR-T 세포; TGFBR2 (도 5G 및 5H): TGFBR2 우성 음성 TAG-72 CAR-T 세포.
[0040] 도 6. NOD scid 감마(NSG) 마우스 이종이식 모델에서 OVCAR-3 난소 종양의 종양 성장 곡선. 그룹당 4마리의 NSG 마우스에 1x107 OVCAR-3 종양 세포 (TAG-72 양성)를 피하 투여하였다. 종양이 약 150-200 mm3로 성장했을 때, 5x106 T 세포의 2회 용량을 5일 간격으로 정맥내 주사에 의해 입양 전달하였다. 수치 및 오차 막대는 평균 종양 크기 (mm3 ± SEM)를 나타낸다. NT: 형질도입되지 않은 T 세포; TAG-72 CAR-T: TAG-72 CAR로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/PD-1 KO T: PD-1 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; ??균 ± SEM; 한 명의 공여자로부터의 T 세포의 대표적인 데이터가 도시된다.
[0041] 도 7. OVCAR-3 난소 종양 NSG 마우스 이종이식 모델에서 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃 CAR-T 세포의 항종양 활성. 그룹당 4마리의 NSG 마우스에 1x107 OVCAR-3 종양 세포 (TAG-72 양성)를 피하 투여하였다. 종양이 약 150-200 mm3로 성장했을 때, 5x106 T 세포의 2회 용량을 5일 간격으로 정맥내 주사에 의해 입양 전달하였다. 수치 및 오차 막대는 평균 종양 크기 (mm3 ± SEM)를 나타낸다. NT: 형질도입되지 않은 T 세포; TAG-72 CAR-T: TAG-72 CAR로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/RC3H1 KO T: RC3H1 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; TAG-72 CAR/RC3H2 KO T: RC3H2 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; TAG-72 CAR/RC3H1,2 KO T: RC3H1 및 RC3H2 이중 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포. ** p<0.01, 모든 그룹 평균을 TAG-72 CAR-T 대조군과 비교하는 Greisser-Greenhouse 보정 및 Dunnett의 다중 비교 일원 분산 분석 테스트를 사용한 혼합 효과 분석. 한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 나타난다.
[0042] 도 8. OVCAR-3 난소 종양 NSG 마우스 이종이식 모델에서 A2AR 및 FAS 유전자 녹아웃 CAR-T 세포의 항종양 활성. 그룹당 4마리의 NSG 마우스에 1x107 OVCAR-3 종양 세포 (TAG-72 양성)를 피하 투여하였다. 종양이 약 150-200 mm3로 성장했을 때, 5x106 T 세포의 2회 용량을 5일 간격으로 정맥내 주사에 의해 입양 전달하였다. 수치 및 오차 막대는 평균 종양 크기 (mm3 ± SEM)를 나타낸다. NT: 형질도입되지 않은 T 세포; TAG-72 CAR-T: TAG-72 CAR로 형질도입된 T 세포; TAG-72 CAR/A2AR KO T: A2AR 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포; TAG-72 CAR/FAS KO T: FAS 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포. * p<0.05, ** p<0.01, # p<0.001, 양방향 ANOVA에 이어 모든 그룹 평균을 CAR-T 대조군과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 테스트. 한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 나타난다.
[0043] 도 9. OVCAR-3 난소 종양 NSG 마우스 이종이식 모델에서 TGFBR1 및 TGFBR2 우성 음성 유전자 돌연변이 CAR-T 세포의 항종양 활성. 그룹당 4마리의 NSG 마우스에 1x107 OVCAR-3 종양 세포 (TAG-72 양성)를 피하 투여하였다. 종양이 약 150-200 mm3로 성장했을 때, 5x106 T 세포의 2회 용량을 5일 간격으로 정맥내 주사에 의해 입양 전달하였다. 수치 및 오차 막대는 평균 종양 크기 (mm3 ± SEM)를 나타낸다. NT: 형질도입되지 않은 T 세포, TAG-72 CAR-T: TAG-72 CAR로 형질도입된 T 세포, TAG-72 CAR/TGFBR1 KO T: TGFBR1 우성 음성 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포, TAG-72 CAR/TGFBR2 KO T: TGFBR2 우성 음성 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, 양방향 ANOVA에 이어 모든 그룹 평균을 CAR-T 대조군과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 테스트. 한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 나타난다.
[0044] 도 10. Raji 림프종 종양 NSG 마우스 이종이식 모델에서 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃이 있는 CD19 CAR-T 세포의 항종양 활성. 그룹당 4마리의 NSG 마우스에 Raji 종양 세포 (CD19 양성)를 피하 투여하였다. 종양 접종 3일 후, 마우스를 정맥 내 주사에 의해 단일 용량의 5x106 CAR-T 세포로 처리하였다. (A) 종양 크기를 23일 동안 모니터링하였다. 수치 및 오차 막대는 평균 종양 크기 (mm3 ± SEM)를 나타낸다. Holm-Sidak 보정을 사용한 다중 t-검정을 수행하여 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포 그룹을 형질감염되지 않은 CD19 CAR-T 세포와 비교하였다. (*p<0.005; **p<0.001) (B) Kaplan-Meier 생존 곡선은 Log-rank(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 분석하였다. NT: 형질도입되지 않은 T 세포; CD19 CAR: CD19 CAR-T 세포; CD19 CAR/RC3H1 KO: RC3H1 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포; CD19 CAR/RC3H2 KO: RC3H2 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포; CD19 CAR/RC3H1,2 KO: RC3H1 및 RC3H2 이중 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포. 한 명의 공여자의 T 세포의 대표적인 데이터가 나타난다.
[0045] 도 11. 지속적인 활성화 노출 후 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 KO가 있거나 없는 CD19 CAR-T 세포에서 활성화 마커의 발현. 그래프는 항원 노출 7일 후 CAR+ 세포에서 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현을 도시한다. CD19 CAR-T 세포는 한 명의 건강한 공여자로부터 생성되었다. 결과는 기술적 삼중 반복의 평균 ± SEM를 나타낸다.
[0046] 도 12. 단일 및 이중 녹아웃 T 세포에서 RC3H1 및 RC3H2 유전자의 CRISPR 녹아웃 분석. RC3H1 및 RC3H2 가이드 RNA 형성 RNP를 인간 활성화 T 세포에 형질감염시켜, RC3H1 또는 RC3H2 단일 KO (RC3H1 KO T 세포 또는 RC3H2 KO T 세포) 또는 RC3H1 및 RC3H2 이중 KOT 세포 (RC3H1,2 KO T 세포)를 생성하였다. 녹아웃 효율은 ICE 분석을 사용하여 분석하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 이동을 나타내거나 또는 21bp 초과 길이인 인델의 비율이다.
[0047] 도 13. CAR이 없는 T 세포 (CD8+, CD4+)의 기능에 대한 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO의 효과. T 세포 ± RC3H1 및/또는 RC3H2 KO는 DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28 비드 (Thermofisher, 미국, Massachusetts) (DB)의 존재 하에 T 세포 확장 배지에서 1:1의 비드 대 세포 비율로 최소 92시간 동안 유지하였다. xCELLigence® 분석에서 이펙터 세포를 사용하기 전에 비드를 자기적으로 제거하였다. 효과기 세포는 1:1의 효과기 대 표적(E:T) 비율로 표적 암 세포 (이 경우 OVCAR-3)에 추가하였다. NCI를 20 시간 동안 모니터링하였다. 모든 조건에서 표적 세포 제거 (NCI 감소로 관찰됨)가 나타났다. 중요하게도, CD3/CD28 매개 활성화를 지속한 후, RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자가 유전적으로 결실된 세포는 시험관 내에서 표적 세포를 보다 효과적으로 제거할 수 있었다. 결과는 생물학적 및 분석 내 삼중의 평균 + SEM을 나타낸다.
[0048] 도 14. 단일 및 이중 녹아웃 NK-92 세포에서 RC3H1 및 RC3H2 유전자의 CRISPR 녹아웃 분석. RNP를 형성한 RC3H1 및 RC3H2 가이드 RNA를 NK-92 세포에 형질감염시켜 RC3H1 또는 RC3H2 단일 KO (RC3H1 KO NK-92 세포 또는 RC3H2 KO NK-92), 또는 RC3H1 및 RC3H2 이중 KO NK-92 세포 (RC3 KO NK-92)를 생성하였다. 녹아웃 효율은 ICE 분석을 사용하여 분석하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 이동을 나타내거나 또는 21bp 초과 길이인 인델의 비율이다. Pearson 상관 계수로 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0049] 도 15. NK-92 세포의 기능에 대한 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO의 효과(TAG-72 CAR 포함 및 미포함). NK 세포주인, NK-92 ± RC3H1 KO (녹색) 또는 RC3H2 KO (보라색) 또는 RC3H1,2 KO (주황색) ± TAG-72 CAR 시험관 내에서 암 세포를 제거하는 능력 실시간 세포 모니터링 시스템, xCELLigence®을 사용하여 평가하였다. (A) RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자(들)은 CRISPR/Cas9를 사용하여 NK-92 세포주에서 삭제하였다. 생성된 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 이펙터 세포를 1:1의 E:T 비율로 표적 암세포(MES-OV(왼쪽 패널) 또는 OVCAR-3(오른쪽 패널))에 추가하였다. NCI를 40 시간 동안 모니터링하였다. 표적 세포 제거 (표적 세포 단독 (파란색)에 비해 NCI 감소로 관찰됨)는 모든 조건에서 관찰되었다. 결과는 기술적 삼중 반복의 평균 ± SEM를 나타낸다. (B) NK-92 세포의 추가 유전자 조작을 수행하여 TAG-72 CAR을 도입하였다. 렌티바이러스 형질도입을 형질감염 후에 수행하였다. 형질도입 효율은 각 점 플롯 내에 포함된 값이 생존 가능한 단일 세포의 빈도로서 CAR+ 세포의 비율을 나타내는 배양에서 ~72시간 후에 유세포 분석에 의해 평가하였다. 생성된 TAG-72 CAR/RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포를 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분리하고 이들의 시험관내 기능을 이전에 기재된 바와 같이 평가하였다. (C) NCI를 40 시간 동안 모니터링하였다. 결과는 평균 ± SEM, n=1-3을 나타낸다.
[0050] 도 16. 입양 세포 치료를 위한 세포의 공급원으로서 CRISPR 유전자 녹아웃 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성. iPSC에서 유전자 녹아웃 면역 세포를 유도하는 작업 흐름. iPSC는 관심 녹아웃 유전자로 형질감염된다. 그런 다음 이 세포를 시퀀싱하여 녹아웃을 특성화하고 확인한 다음 CD34+ 세포와 면역 세포로 분화한다.
[0051] 도 17A-17B. iPSC(RC3H1,2 KO iPSC)에서 RC3H1 및 RC3H2 이중 KO는 다능성에 영향을 미치지 않는다. 이것은 다음을 특징으로 한다: (A) 분화된 세포가 존재하지 않는 형태 (축척 막대 = 200μm) 및 (B) iPSC 마커 TRA-1-60, TRA-1-81 및 SSEA-4에 대한 유세포 분석. 히스토그램 플롯이 형질감염되지 않은 iPSC 또는 RC3H1,2 KO iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. 모든 살아있는 세포의 99% 초과는 모든 iPSC 마커를 발현한다.
[0052] 도18A-18C. RC3H1 및 RC3H2 가이드 RNA 형성된 RNP의 형질감염은 iPSC에서 특정 유전자의 오픈 리딩 프레임에 삽입 및 결실 (indel)을 도입한다. RC3H1 및 RC3H2 gRNAs 동시 형질감염된 iPSC ("편집된 샘플")의 Sanger 시퀀싱 추적은 형질감염되지 않은 iPSC ("대조군 샘플")과는 대조적으로 RC3H1 유전자 (A) 및 RC3H2 유전자 (B)의 절단 부위의 다운스트림에 있는 염기의 이질적 혼합을 도시한다 (A에서 SEQ ID NO: 27은 편집된 샘플에서 184 내지 249 bp를 나타내고, SEQ ID NO: 28은 대조 샘플에서 183 내지 248 bp를 나타내고; B에서 SEQ ID NO: 29는 270에서 336 bp를 나타내고; 편집된 샘플에서, SEQ ID NO: 30은 대조군 샘플에서 272 내지 337 bp를 나타낸다). 대조 샘플의 검은색 밑줄 영역은 가이드 시퀀스를 나타내고, 수평 빨간색 점선 밑줄 영역은 관련 PAM 위치이다. 두 트레이스의 수직 검은색 점선은 절단 부위를 나타낸다. (C) RC3H1 및 RC3H2 gRNA 동시 형질감염된 iPSC의 CRISPR 녹아웃 분석. RC3H1 및 RC3H2 유전자의 녹아웃 효율을 ICE 분석을 사용하여 평가하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 이동을 나타내거나 또는 21bp 초과 길이인 인델의 비율이다. Pearson 상관 계수로 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0053] 도 19. iPSC에서 RC3H1 및 RC3H2 이중 KO는 iCD34+ 세포로의 분화를 차단하지 않는다. CD34+에 대한 항체로 염색된 세포 및 염색되지 않은 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. 히스토그램 플롯이 형질감염되지 않은 iPSC 또는 RC3H1,2 KO iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 CD34+ 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. RC3H1 및 RCH32 유전자의 삭제는 iPSC가 iCD34 세포의 하위 집합으로 발달하는 것을 방지하지 못했다.
[0054] 도 20. RC3H1 및 RC3H2 이중 KO를 포함하는 iPSC는 NKG2D 및 NKp46의 NK 세포독성 수용체 발현으로 CD56+ 세포로 분화할 수 있다. CD56+ 히스토그램이 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. NKp46 및 NKG2D 플롯은 CD56+ 세포에서 차단되었다. 비염색 및 동형 대조군은 각각의 수용체에 대한 각 항체의 양성 염색을 나타내기 위해 제시된다. NK 기능 수용체(NKp46 또는 NKG2D)와 CD56의 동시발현은 RC3H1,2 KO iPSC에서 유래된 CD56+ 세포가 NK 매개 세포독성 기능을 수행할 가능성이 있음을 나타낸다.
[0055] 도 21A-21B. iPSC의 A2AR KO는 다능성에 영향을 미치지 않는다. 이것은 다음을 특징으로 한다: (A) 분화된 세포가 존재하지 않는 형태 (축척 막대 = 200μm) 및 (B) iPSC 마커 TRA-1-60, TRA-1-81 및 SSEA-4에 대한 유세포 분석. 히스토그램 플롯이 형질감염되지 않은 iPSC 또는 A2AR KO iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. 모든 살아있는 세포의 95% 초과는 모든 iPSC 마커를 발현한다.
[0056] 도 22A-22C. RNP가 형성된 A2AR 가이드 RNA의 형질감염은 iPSC에서 A2AR 유전자의 오픈 리딩 프레임에 삽입 및 결실 (indel)을 도입한다. ICE 분석으로 인델의 빈도를 평가하였다. (A) A2AR KO iPSC ("편집된 샘플")의 Sanger 시퀀싱 추적은 형질감염되지 않은 iPSC ("대조군 샘플")과는 대조적으로 절단 부위의 다운스트림에 있는 염기의 이질적 혼합을 도시한다 서열 번호: 31은 편집된 샘플의 134 내지 199 bp를 나타내고; 서열 번호: 32는 대조 샘플로부터 137 내지 202 bp를 나타낸다. 대조 샘플의 검은색 밑줄 영역은 가이드 시퀀스를 나타내고, 수평 빨간색 점선 밑줄 영역은 관련 PAM 위치이다. 두 트레이스의 수직 검은색 점선은 절단 부위를 나타낸다. (B) A2AR KO iPSC의 게놈 DNA에서 편집된 각 서열(정규화됨)의 기여도에 대한 상대적 백분율. 위에서 아래로 서열은 각각 서열 번호: 33, 34, 35, 36, 37 및 38에 제시되어 있다. (C) RNP 형질감염된 iPSC의 편집된 전체 집단에서 인델 크기의 분포. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 이동을 나타내거나 또는 21bp 초과 길이인 인델의 비율이다. Pearson 상관 계수로 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0057] 도 23. iPSC에 A2AR KO 포함은 iCD34+ 세포로의 분화를 차단하지 않는다. CD34에 대한 항체로 염색된 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. 염색되지 않은 세포 및 동형 대조군으로 염색된 세포를 대조군으로 포함시켰다. 히스토그램 플롯이 형질감염되지 않은 iPSC 또는 A2AR KO iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. KO의 포함은 iCD34+ 세포의 아형의 발달을 차단하지 않는다.
[0058] 도 24. A2AR KO iPSC는 iNK 세포로 분화할 수 있다. NK 세포 마커에 대한 항체로 염색된 세포 및 염색되지 않은 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. CD56+ 히스토그램이 형질감염되지 않은 iPSC 또는 A2AR KO iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. 염색되지 않은 샘플은 각각의 수용체에 대한 각 항체의 명확한 양성 염색을 나타내기 위해 제시된다. 적절한 동형 대조군도 실행하였으며, 음성이었다. NK 기능적 수용체 (NKp46, NKp30, NKp44 및 NKG2D)의 발현은 A2AR KO iPSC에서 유래된 CD56+ 세포가 iNK 세포이고 잠재적으로 세포독성 기능을 할 수 있음을 입증한다.
[0059] 도 25. A2AR KO iPSC는 시험관 내 사멸 활성이 강화된 기능성 iNK 세포로 분화할 수 있다. iNK 세포는 형질감염되지 않은 iPSC 및 A2AR KO iPSC에서 유래되었다. 생성된 iNK 세포의 기능은 OVCAR-3 세포를 표적으로 사용하는 실시간 세포 모니터링 시스템 (xCELLigence®)을 사용하여 시험관 내에서 평가하였다. 1:2의 이펙터 대 표적 비율을 사용하였다. (A) NCI의 감소가 표적 세포 사멸을 나타내는 공동 배양의 최소 10시간에 걸쳐 15분 간격으로 NCI의 변화가 기록되었다. (B) 공동 배양의 5 시간 (왼쪽 패널) 및 10 시간 (오른쪽 패널) 모두에서 표적 세포 단독 대조군에 대한 iNK 세포의 % 세포독성으로 나타낸 (A)의 결과. 세포는 단일 iNK 분화로부터 유래된다. 각 데이터 포인트는 기술적 복제를 나타낸다.
[0060] 본 명세서에서, 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 하나의 요소, 정수 또는 단계, 또는 복수의 요소, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 하나의 요소, 정수 또는 단계, 또는 복수의 요소, 정수 또는 단계를 배제하는 것은 아니다.
[0061] 명세서 및 청구범위를 통해 단수형 용어 ("a" 및 "an")는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 간주되어야 하며, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 "둘 이상"을 배제하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
[0062] 본 명세서에서 사용된 "핵산 작제물"은 일반적으로 인공적으로 또는 재조합적으로 작제 또는 제조된 핵산 분자를 지칭하며, 핵산 벡터로도 상호교환적으로 지칭된다. 예를 들어, 핵산 작제물은 세포에 전사되고자 하는 관심의 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록, 일부 경우에는, 원하는 기능의 RNA 분자 (예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA, 또는 gRNA)를 제조하도록, 및 다른 경우에는, 관심 단백질 (예를 들어, Cas 단백질)로 번역되는 mRNA를 제조하도록 제조될 수 있다. 핵산 작제물의 관심 뉴클레오타이드 서열은 5' 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 예컨대 이종 프로모터), 및/또는 3' 조절 영역 (예를 들어, 3' 비번역 영역 (UTR) 예컨대 이종 3' UTR)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 핵산 작제물은 원형 (예를 들어, 플라스미드) 또는 선형 형태일 수 있고, 통합 핵산 (즉, 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있는 핵산, 예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 벡터)일 수 있거나, 또는 에피솜 (예를 들어, 플라스미드)로 남을 수 있다.
상세한 설명
[0063] 본 명세서에는 하나 이상의 선택된 유전자의 기능을 억제함으로써 기능이 향상된 면역 세포를 제공하는 방법이 개시된다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 하나 이상의 선택된 유전자를 제거하면 생체 내에서 세포독성 림프구의 지속성 및 항종양 활성이 향상된다는 것이 본 명세서에서 입증되었다. 따라서, 방법은 면역 세포로 분화될 수 있는 면역 세포, 또는 줄기 세포에서 하나 이상의 선택된 유잔자의 기능을 억제함으로써 제공된다. 또한 본 명세서에는 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역 세포 또는 줄기 세포, 뿐만 아니라 치료학적 치료에서의 면역 세포의 용도가 개시된다.
면역 세포
[0064] 본 명세서에서 사용된 "면역 세포"는 포유동물 면역 시스템의 세포, 예를 들어, 포유동물 면역 시스템의 세포로부터 유래된 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포), 호중구, 및 단핵구 (대식세포 및 수지상 세포 포함), 및 세포주를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 면역 세포는 포유동물 개체로부터 분리되거나, 포유동물 개체의 면역 세포로부터 유래된 세포주의 배양물로부터 수집되거나, 또는 줄기 세포로부터 분화에 의해 생성될 수 있다.
[0065] 본 개시내용은 기능이 향상된 면역 세포를 제공하는 것에 관한 것이다. "기능 향상"은 결과적으로 본 명세서에 개시된 변형 또는 조작의 결과로서 제공된 면역 세포가, 대조군 면역 세포 (즉, 변형 도는 조작되지 않은 면역 세포)와 비교하여 향상된 활성 (예를 들어, 세포독성), 증식, 생존, 지속성, 및/또는 침윤을 나타내는 것을 의미한다. 면역 세포의 세포독성은 일반적으로 수용체-기반 메커니즘을 통해 표적 세포를 사멸하는 면역 세포의 능력을 지칭한다.
[0066] 일부 구현예에서, 면역 세포는 세포독성 면역 세포, 예를 들어, 세포독성 림프구이다.
[0067] 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 NKT 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이다.
[0068] “T 세포”에 대한 언급은 T 세포 수용체를 포함하는 임의의 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여, T 세포 수용체는 α, βγ또는 δ사슬 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, NKT 세포는 또한 T 세포 수용체를 발현하므로 표적 항원 특이적 NKT 세포도 본 발명에 따라 생성될 수 있다. 일 구현예에서 대상 T 세포가 α/βTCR 이량체를 발현함에도 불구하고, 본 발명은 T 세포의 임의의 특정 서브클래스에 제한되도록 의도되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 킬러 T 세포, 또는 NKT 세포이다. CD8+ T 세포는 세포독성 세포로도 공지되어 있지만, 본 발명을 의 하나의 이론 또는 작용 방식에 제한되고자 하는 것은 아니다. 적응 면역 시스템의 주요 부분으로서, CD8+ T 세포는 주로 감염된 세포를 표적으로 삼고 파괴하기 위해 세포 내 환경을 스캔한다. 세포 내 함량에서 유래된 작은 펩타이드 단편은 처리되어 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 표시되는 세포 표면으로 수송된다. 그러나, CD8+ T 세포는 바이러스 감염에 반응하는 것 외에도, 암을 비롯하여 손상된 또는 비정상적인 세포를 모니터링하고 제거함으로써 추가적인 수준의 면역 감시를 제공한다. MHC I 제시된 펩타이드의 CD8+ T 세포 인식은 일반적으로 세포독성 과립 또는 림포카인의 방출 또는 FAS/FASL 상호작용을 통한 세포자멸 경로의 활성화를 유도하여 대상 세포를 파괴한다. 반면에 CD4+ T 세포는 일반적으로 MHC 클래스 II의 맥락에서 항원 제시 세포에 의해 제시된 펩타이드를 인식하여, B 세포 및/또는 CD8+ T 세포 면역 반응을 조절하도록 설계된 사이토카인의 방출을 유도한다. 세포독성 활성을 가지는 CD4+ T 세포는 다양한 면역 반응에서도 관찰되었다. 더욱이, CD4+ CAR-T 세포는 시험관 내에서 CD8+ CAR-T 세포와 동등한 세포 독성을 보여주며 심지어 더 긴 항종양 활성을 위해 생체 내에서 CD8+ CAR-T 세포를 능가한다 (예를 들어, Wang et al., JCI Insight. 2018;3(10):e99048; Yang et al., Sci Transl Med.　2017 Nov 22;9(417), eaag1209 참조)
[0069] 자연 살해 T 세포 (NKT 또는 T/NK 세포라고도 함)는 반불변 T 세포 수용체(TCR α-β및 일반적으로 자연 살해 세포와 관련된 표면 항원을 발현하는 특수화된 T 세포 집단이다. NKT 세포의 TCR은 MHC I 유사 분자 CD1d가 제시하는 당지질 항원을 일반적으로 인식한다는 점에서 독특하다. 대부분의 NKT 세포는 불변 TCR 알파 사슬과 소수의 TCR 베타 사슬 중 하나를 발현한다. I 형 NKT 세포에 존재하는 TCR은 일반적으로 항원 알파-갈락토실세라마이드 (알파-GalCer)를 인식한다. 상기 그룹 내에서, CD4+CD8- 세포, CD4-CD8+ 세포 및 CD4-CD8- 세포를 비롯한 구별 가능한 하위 집단이 식별되었다. II 형 NKT 세포 (또는 비불변 NKT 세포)는 더 넓은 범위의 TCR α 사슬을 발현하며 알파-GalCer 항원을 인식하지 않는다. NKT 세포는 염증을 촉진하거나 내성을 포함한 면역 억제를 유도하는 등 여러 가지 반대 효과를 갖는 사이토카인을 생성한다. 결과적으로, 항균 및 항바이러스 면역 반응에 기여하고 종양 관련 면역 감시를 촉진하며 자가면역 질환의 발병을 억제하거나 촉진할 수 있다. 자연 살해 세포와 마찬가지로 NKT 세포도 퍼포린, FAS 및 TNF 관련 세포 독성을 유발할 수 있다. 따라서, T 세포에 대한 언급은 NKT 세포에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[0070] 자연 살해 (NK) 세포는 선천 면역계의 일부를 형성하는 일종의 세포독성 림프구이다. NK 세포는 바이러스에 감염된 세포에 대해 감염 후 약 3일 후에 작용하여 신속하게 반응하고 종양 형성에도 반응한다. 일반적으로, T 세포와 같은 면역 세포는 감염되거나 형질전환된 세포 표면에 존재하는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)를 감지하여, 사이토카인 방출을 촉발하고 표적 세포의 용해 또는 세포자멸사를 유발한다. 그러나, NK 세포는 항체나 MHC가 없을 때 스트레스를 받은 세포를 인식하는 능력이 있어 훨씬 더 빠른 면역 반응을 가능하게 한다. MHC I 마커가 없는 유해한 세포는 T 세포와 같은 다른 면역 세포에 의해 감지 및 파괴될 수 없기 때문에 이러한 역할이 특히 중요하다. NKT 세포와 달리, NK 세포는 TCR 또는 CD3을 발현하지 않지만 일반적으로 표면 마커 CD16 (Fcγ및 CD56을 발현한다.
[0071] 일부 구현예에서, 본 방법에 따라 변형되거나 조작되는 면역 세포는 예를 들어 혈액(전혈, 혈청 또는 혈장), 골수, 흉선, 림프절을 비롯한 포유동물 대상체로부터 단리될 수 있다.
[0072] 일부 구현예에서, 본 방법에 따라 변형되거나 조작될 면역 세포는 포유동물 대상체의 면역 세포, 예를 들어 T 세포주로부터 유래된 세포주의 배양물로부터 수집될 수 있다.
[0073] 일부 구현예에서, 본 방법에 따라 변형 또는 조작될 면역 세포는 줄기 세포 또는 다른 전구 세포 (예컨대 줄기 세포로부터 배양 및 분화된 세포)로부터 분화될 수 있다. 줄기 세포를 면역 세포, 특히 T 세포 또는 NK 세포로 분화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Li et al., Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity, Cell Stem Cell, 2018, 23(2): 181-192 e5; Themeli et al., Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy, Nat Biotechnol, 2013, 31(10): 928-33; Maeda et al., Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity, Cancer Res, 2016, 76(23): 6839-6850).
줄기 세포
[0074] 본 명세서에 사용된 "공급원 세포"는 재프로그래밍 또는 분화에 의해 "유도된 세포"로 전환되는 세포를 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 공급원 세포의 예로는 줄기 세포를 포함한다. "유래된 세포"의 예는 T 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포를 포함한다.
[0075] 용어 "줄기 세포"는 자가 재생이 가능하며, 특정 표현형이 주어지면, 여러 계통의 방향으로 발달하여, 새로운 유기체를 형성하거나 유기체의 조직 또는 세포 집단을 재생하는 잠재력을 나타내는 모든 세포를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따라 활용되는 줄기 세포는 만능 및 다능성이며 둘 이상의 계통에 따라 분화할 수 있으며 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 배아 줄기 세포 (ESC), 성체 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 전구 세포, 전구 세포, 만능 세포, 다능 세포 또는 역분화 체세포 (예컨대 유도 만능 줄기 세포). "만능"은 대상 줄기 세포가 분화하여 특히 외배엽, 내배엽 및 중배엽인 3개의 배엽 중 어느 하나의 세포를 형성할 수 있음을 의미한다.
[0076] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 또한 적어도 하나의 동형 접합 주요 HLA 유전자형을 발현한다. 일부 구현예에서, 공급원 세포는 주요 이식 항원이고 바람직하게는 집단의 상당한 비율, 예컨대 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20% 또는 그 이상에 의해 발현되는 적어도 하나의 동형 접합 HLA 유전자형을 발현한다. 동형접합 HLA 유전자형이 우성 MHC I 또는 MHC II HLA 유형 (조직 거부의 관점에서)에 해당하는 경우, 이러한 세포의 사용은 치료 요법의 맥락에서 본 발명의 세포를 수용하는 보다 광범위한 집단에서 조직 거부와 관련된 문제를 상당히 감소시킬 것이다. 다른 구현예에서, 공급원 세포는 1개 초과의 HLA 항원, 예를 들어, 2개, 3개 또는 그 초과의 HLA 항원과 관련하여 동형접합성일 수 있다. 관심의 HLA 항원은 예를 들어, HLA A1, B8, C7, DR17, DQ2, 또는 HLA A2, B44, C5, DR4, DQ8, 또는 HLA A3, B7, C7, DR15, DQ6으로부터 선택될 수 있다.
[0077] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 억제된 유전자와 관련하여 동형접합성이다.
[0078] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 본 명세서에서 식별된 하나 이상의 유전자에서 유전적으로 변형되어 유전적으로 변형된 공급원 세포로부터 분화된 유래 세포에서 변형된 유전자(들)의 기능이 억제된다.
[0079] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 또한 CAR (즉, 키메라 항원 수용체)을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. CAR을 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 방법에 의해 공급원 세포 내로 도입될 수 있다.
[0080] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서 공급원 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다.
[0081] 일부 구현예에서, 면역 세포로 분화할 수 있는 전구세포를 사용하여 변형된다; 예를 들어, 만능 줄기 세포 (예컨대 iPSC)에서 배양된 세포는 배양물에서 면역 세포에 대해 약간의 분화를 겪지만, 면역 세포로 완전히 분화되지 않았다.
iPSC
[0082] iPSC는 일반적으로 체세포에서 직접 생성된다. iPSC는 원칙적으로 예를 들어 혈액 및 피부 세포의 단핵구를 비롯한 모든 유핵 세포로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC는 완전히 분화된 T 세포로부터; 또는 전구 T 세포가 TCR의 재배열을 시작하거나 완료하고 관심 항원 특이성을 나타내는 흉선 세포와 같은 전구 T 세포로부터 생성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, iPSC는 관심 항원 결정기(예를 들어, 종양 항원 결정기)에 대한 TCR (예컨대 재배열된 TCR 유전자)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 형질감염된다. 하나의 구현예에서, iPSC는 재배열된 TCR, 바람직하게는 재배열된 αβTCR을 발현하는 세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 재배열된 γδTCR을 발현한다. 본 발명의 iPSC를 생성하는 데 사용하기에 적합한 세포의 예로는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NKT 세포, 흉선세포 또는 다른 형태의 전구 T 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0083] 또 다른 구체예에서 iPSC는 NK 세포와 같은 또 다른 유형의 면역 세포로부터 유래된다.
[0084] 성숙 또는 분화된 세포 (예컨대 T 세포 또는 전구체 T 세포)로부터 iPSC를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (Themeli, Kloss et al. 2013, Li, Hermanson et al. 2018).
[0085] 일부 구현예에서 공급원 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다.
[0086] 일부 구현예에서, 공급원 세포는 제대혈 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)로부터 생성된다.
[0087] 일부 구현예에서, 대상 공급원 세포는 만능 줄기 세포와 비교하여 면역 세포에 대해 더 분화된 세포이다.
[0088] 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 유도된 면역 세포는 면역 세포로 분화할 수 있는 조혈 계통 세포, 및 특정 유형의 면역 세포를 포함한다. 유도된 면역 세포의 예로는 HE, 전-HSC, HSC, 다능성 전구 세포, 공통 림프성 전구 세포, 초기 흉선 전구 세포, 전-T 세포 전구 세포, 전-NK 전구 세포, T 전구 세포, NK 전구 세포, 대식세포 및 기타 면역 세포 예컨대 T 세포, NK-T 세포 및 NK 세포이다.
[0089] 본 명세서는 분화에 의해 생성되는 기능이 강화된 면역 세포 또는 유래된 면역 세포를 제공하는 것에 관한 것이다. "기능 향상"은 결과적으로 본 명세서에 개시된 변형 또는 조작의 결과로서 제공된 면역 세포가, 대조군 면역 세포 (즉, 변형 도는 조작되지 않은 면역 세포)와 비교하여 향상된 활성 (예를 들어, 세포독성), 증식, 생존, 지속성, 및/또는 침윤을 나타내는 것을 의미한다. 면역 세포의 세포독성은 일반적으로 수용체-기반 메커니즘을 통해 표적 세포를 사멸하는 면역 세포의 능력을 지칭한다.
억제되는 유전자
[0090] 본 개시내용에 따르면, 본 명세서에서 식별된 하나 이상의 유전자의 기능의 억제는 면역 세포의 기능을 향상시킬 수 있다.
[0091] 본 명세서에서 사용된 "유전자 기능의 억제"는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수준 및/또는 활성이 궁극적으로 감소되거나 제거됨을 의미한다. 따라서, 유전자의 기능은 유전자의 게놈 DNA 서열 조작 또는 변형의 결과로서 (예를 들어, 유전자의 파괴를 야기), mRNA를 억제한 결과로서 (예를 들어, 전사 또는 번역을 억제함으로써, 예를 들어 mRNA의 수준 또는 기능을 감소), 또는 단백질 억제의 결과로서 (예를 들어, 단백질의 수준 또는 활성 감소에 의해) 억제될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 정도는 변형된 세포에서 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 비변형된 세포에서의 단백질의 단백질의 수준 및/또는 활성과 비교하여 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다.
[0092] 일부 구현예에서, 기능이 억제되어야 하는 유전자는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 억제는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 단일 유전자; 예를 들어, RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 또는 TGFBR2인 a 단일 유전자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 억제는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 단일 유전자와, 적어도 또 다른 유전자의 억제의 조합에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 억제는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 유전자, 예를 들어, RC3H1 및 RC3H2 유전자, TGFBR1 및 TGFBR2 유전자, TGFBR1 및 RC3H2 유전자; 및 선택적으로 적어도 또 다른 유전자의 억제와의 조합에 관한 것이다.
[0093] 후술하는 바와 같이, RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 유전자 그룹의 구성원은 당업계에 면역 세포 기능에 연루되는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이러한 유전자의 기능 억제가 개별적으로 또는 조합되어 불리한 결과를 초래할 수 있는지 여부는 당업계에 알려져 있지 않다. 특히, 이러한 유전자의 기능을 (예를 들어, 유전자 편집에 의해) 완전히 제거하면, 중요한 세포 기능에 부정적인 영향을 미치므로, 세포의 생존 능력이나 복제 능력이 감소할 것으로 예상할 수 있다. 게다가, 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)에서 이러한 유전자의 기능을 제거하면 생존, 자가 재생, 다능성, 특정 세포 유형 (예를 들어, 면역 세포)으로 분화하는 능력 및 해당 세포 유형이 기능을 발휘하는 것과 같은 세포 기능에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있다. 이러한 중요한 세포 기능의 유지가 본 발명의 중요한 특징이라는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다.
RC3H1, RC3H2
[0094] RC3H1은 RC3H1, Roquin-1, 링 핑거(Ring Finger) 및 CCCH-유형 도메인 1, 링 핑거 ?? CCCH-유형 징크 핑거 도메인-함유 단백질 1, 링 핑거 및 C3H 징크 핑거 단백질 1, 링 핑거 및 CCCH-유형 징크 핑거 도메인 1, ROQ1, RNF198, 또는 링 핑거 단백질 198로서도 알려져 있다.
[0095] RC3H2는 또한 Roquin-2, Roquin2, 링 핑거 And CCCH-유형 도메인 2, 링 핑거 And CCCH-유형 징크 핑거 도메인-함유 단백질 2, 링 핑거 및 CCCH-유형 징크 핑거 도메인 2, MNAB, ROQ2, RNF164, 또는 링 핑거 단백질 164로도 알려져 있다.
[0096] ROQUIN 단백질 패밀리로는 선천 면역계와 적응 면역계 모두에서 중요한 역할을 하는 RNA 결합 단백질인 ROQUIN1 (RC3H1에 의해 인코딩됨) 및 ROQUIN2 (RC3H2에 의해 인코딩됨)를 포함한다 (Athanasopoulos, V., R.R. Ramiscal, and C.G. Vinuesa, ROQUIN signalling pathways in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol, 2016, 46(5): p. 1082-90). 마우스 (산로크 마우스)의 Rc3h1 돌연변이는 T 세포에서 ICOS 발현을 증가시켜 마우스에서 루푸스 유사 자가면역 증후군을 유발한다 (Yu, D., et al., Roquin represses autoimmunity by limiting inducible T-cell co-stimulator messenger RNA. Nature, 2007, 450(7167): p. 299-303). 마우스에서 RC3H1 또는 RC3H2 녹아웃 단독으로는 자가항체가 발생하지 않고 자가면역이 부족했지만, RC3H1 및 RC3H2 이중 녹아웃 마우스는 산로크 마우스와 유사한 면역생리학적 표현형을 나타냈다. 현재까지 RC3H1 또는 RC3H2에 돌연변이를 유발하는 질병을 가지고 있는 사람은 발견되지 않았다 (Athanasopoulos, V., R.R. Ramiscal, and C.G. Vinuesa, ROQUIN signalling pathways in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol, 2016, 46(5): p. 1082-90). 인간 T 세포에서 RC3H1 및 RC3H2 유전자의 역할, 특히 세포독성 세포에서의 기능은 본 개시내용 이전에는 알려지지 않았다.
[0097] 본 개시내용에 따르면, RC3H1 및 RC3H2 유전자 중 하나 또는 둘 모두의 기능의 억제는 면역 세포의 기능을 향상시킨다.
A2AR
[0098] A2AR은 ADORA2A, 아데노신 A2a 수용체, 아데노신 수용체 A2a, ADORA2, 아데노신 수용체 아형 A2a, 또는 RDC8로도 알려져 있다.
[0099] 종양 세포에 의해 생성된 세포외 아데노신은 세포독성 림프구의 활성화를 제한하며 아데노신2A 수용체 (A2AR)를 통한 항종양 면역 반응을 억제하는 주요 면역억제 대사물이다.
[00100] 본 개시내용에 따르면, 예를 들어 유전자 편집 (예를 들어, 특이적으로 설계된 가이드 RNA에 기초한 CRISPR/Cas9에 의해 매개됨)을 통한 A2AR 유전자의 기능 억제는 면역 세포의 기능을 향상시킨다.
FAS
[00101] FAS는 또한 Fas 세포 표면 사멸 수용체, APT1, CD95, FAS1, APO-1, FASTM, ALPS1A, 또는 TNFRSF6로도 알려져 있다.
[00102] FAS 수용체 (CD95 및 APO-1로도 알려짐)는 세포독성 T 세포의 세포자멸사 및 말단 분화를 유도한다. FAS와 리간드 FASL의 결합은 CAR-T 세포의 항종양 활성을 약화시킬 수 있다.
[00103] 본 개시내용에 따르면, 예를 들어 유전자 편집 (예를 들어, CRISPR/Cas9에 의해 매개됨)을 통한 FAS 유전자의 기능 억제는 면역 세포의 기능을 향상시킨다.
TGFBR1 및 TGFBR2
[00104] TGFBR1은 또한 TGFRBRI, TGFB 수용체 1, TGF-β수용체 1, AAT5, ALK5, ESS1, LDS1, MSSE, SKR4, TBRI, ALK-5, LDS1A, LDS2A, TBR-I, TGFR-1, ACVRLK4, tbetaR-I, 전환 성장 인자 베타 수용체 1, 또는 전환 성장 인자 베타 수용체 I로도 알려져 있다
[00105] TGFBR2는 또한 TGFBRII, AAT3, FAA3, LDS2, MFS2, RIIC, LDS1B, LDS2B, TAAD2, TBRII, TBR-ii, TGFR-2, TGFbeta-RII, 전환 성장 인자 베타 수용체 2, 또는 전환 성장 인자 베타 수용체 II로도 알려져 있다.
[00106] TGF-b는 전신면역억제작용을 하고 숙주의 면역감시를 억제하며 종양에서 면역억제성 미세환경의 주요인자 중 하나로 여겨진다.
[00107] 본 개시내용에 따르면, 예를 들어 유전자 편집 (예를 들어, 특이적으로 설계된 가이드 RNA에 기초한 CRISPR/Cas9에 의해 매개됨)을 통한 TGFBR1 및/또는 TGFBR2 유전자의 기능 억제는 면역 세포의 기능을 향상시킨다.
[00108] 본 개시내용에 따르면, RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1, 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능의 억제와, 적어도 또 다른 유전자의 억제의 조합은, 면역 세포의 기능을 향상시킨다.
유전자 기능의 억제
[00109] 유전자 기능의 억제는 다양한 접근법에 의해, 예를 들어, 유전자 편집, 예를 들어, RNA 간섭 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 통한 번역 억제를 통해, 또는 직접적으로 단백질 생성물을 길항하는 소분자 또는 항체와 같은 화합물의 사용을 통해 달성될 수 있다.
유전자 편집을 통한 억제
[00110] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자의 게놈 서열을 변형시키는 유전자 편집 시스템의 사용을 통해 달성된다.
[00111] 유전자 편집 시스템은 일반적으로 뉴클레아제와 결합된 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 포함한다. The DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산은 유전자의 표적 영역에 특이적으로 결합 또는 혼성화하여, 뉴클레아제가 유전자의 표적 영역에서 하나 이상의 이중 가닥 파손 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파손을 만든다. 표적 영역은 유전자의 코딩 영역, 예를 들어 엑손에서 (예를 들어, 제1 또는 제2 엑손에서) 코딩 영역의 N-말단 근처일 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 비상동 말단 접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 또는 상동성 지정 복구 (homology-directed repair, HDR)와 같은 세포 복구 프로세스를 통해 복구될 수 있다. 일부 예에서, 복구 과정은 삽입, 결실, 미스센스 돌연변이, 또는 프레임시프트 돌연변이 (예를 들어, 이중대립형 프레임시프트 돌연변이를 포함)를 도입하여 유전자의 파괴 및 유전자 기능의 억제를 초래한다.
[00112] 유전자 편집 시스템의 예로는 DNA-결합 단백질 및 뉴클레아제를 포함한 융합, 예컨대 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 RNA-가이드 뉴클레아제 예컨대 클러스터형 규칙적 간격의 짧은 회문 핵산 (CRISPR)-Cas 시스템을 포함한다.
ZFP 및 TALEN
[00113] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 엔도뉴클레아제에 접합된 하나 이상의 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성제-유사 단백질 (TAL)과 같은 DNA-결합 단백질을 포함하는 유전자 편집 시스템을 활용함으로써 달성된다. 예로는 ZFN, TALE, 및 TALEN을 포함한다.
[00114] ZFP 및 TAL의 DNA 결합 도메인은 관심 표적 DNA 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 하나 이상의 아미노산은 미리 결정된 DNA 서열에 대한 결합을 지시하도록 변형될 수 있다. 합리적인 설계에 대한 기준은, 예를 들어, U.S. 특허 6,140,081, U.S. 특허 6,453,242, U.S. 특허 6,534,261, WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536, WO 03/016496, 및 U.S. 특허 출원 20110301073 A1에 기재되어 있다.
[00115] 일부 구현예에서, DNA-결합 단백질은 징크-핑거 단백질 (ZFP) 또는 ZFP의 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 하나 이상의 "징크 핑거" (아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 영역)를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합한다. 자연 발생 ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선의 특정 위치에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 또한, 다수의 조작된 유전자-특이적 징크 핑거가 상업적으로 입수 가능하다 (예를 들어, Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA)와 협력하여 Sangamo Biosciences (Richmond, Calif., USA)에 의해 개발된 징크-핑거 작제물을 위한 CompoZr 플랫폼 참조). 따라서, 일부 구현예에서, ZFP는 본 명세서에서 억제되는 것으로 식별된 유전자 내의 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 전형적인 표적 서열은 엑손, 코딩 서열의 N-말단 영역 근처 영역 (예를 들어, 첫 번째 엑손, 두 번째 엑손), 및 5' 조절 영역 (프로모터 또는 인핸서 영역)을 포함한다. ZFP는 엔도뉴클레아제 또는 DNA 절단 도메인에 융합되어 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성한다. DNA 절단 도메인의 예는 유형 IIS 제한 효소의 DNA 절단 도메인을 포함한다.
[00116] 일부 구현예에서, ZFN은 ZFN을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드, mRNA 또는 바이러스 벡터)의 형질감염을 통해 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포) 내로 도입된다. 그런 다음 ZFN은 작제물로부터의 세포에서 발현되고 표적 유전자의 편집 및 파괴를 유도한다. 일부 구현예에서, ZFN은 그의 단백질 형태로 세포 내로 도입된다.
[00117] 일부 구현예에서, DNA-결합 단백질은 예를 들어 전사 활성제-유사 단백질 이펙터(TALE) 단백질에서와 같이 자연 발생 또는 조작된 전사 활성제-유사 단백질(TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, US 20110301073 A1를 참조한다 (상기 특허는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다). TALE DNA 결합 도메인은 하나 이상의 TALE 반복을 포함하는 폴리펩타이드이며, 각 반복은 길이가 33-35개의 아미노산이고 1 또는 2개의 DNA 결합 잔기를 포함한다. TAL 반복의 12번과 13번 위치에 있는 HD (히스타딘-아스파테이트) 서열은 시토신(C)에 결합하고, NG (아스파라긴-글리신)는 T에 결합하고, NI (아스파라긴-아이소류신)는 A에 결합하고, NN(아스파라긴-아스파라긴)은 G 또는 A에 결합하는 것이 확인되어 있다. 예를 들어, US 20110301073 A1를 참조한다. 일부 구현예에서, TALE은 억제되는 본 명세서에서 식별된 유전자 내의 관심 표적 DNA 서열에 특이성을 갖는 TAL 반복의 어레이를 갖도록 설계될 수 있다. 맞춤형으로 설계된 TALE 어레이는 또한 Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, Ky., USA), 및 Life Technologies (Grand Island, N.Y., USA)를 통해 상업적으로 입수 가능하다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, TAL DNA 결합 도메인은 엔도뉴클레아제에 융합되어 TALE-뉴클레아제 (TALEN)를 형성하고, 이는 억제되는 본 명세서에서 식별된 유전자 내의 표적 부위에서 뉴클레오타이드 서열을 절단한다.
[00118] 일부 구현예에서, TALEN은 TALEN을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드, mRNA 또는 바이러스 벡터)의 형질감염을 통해 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포) 내로 도입된다. 그런 다음 TALEN은 구성체의 세포에서 발현되고 표적 유전자의 편집 및 파괴를 유도한다. 일부 구현예에서, TALEN은 단백질 형태로 세포 내로 도입된다.
CRISPR/Cas
[00119] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자 편집을 위한 CRISPR ("클러스터형 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부")/Cas ("CRISPR-연계 뉴클레아제") 시스템을 활용하여 달성된다. CRISPR/Cas는 용이하게 이용 가능한 시약 및 프로토콜로서 당업계에 잘 알려져 있다 (Mali et al., 2013, Science, 339(6121), 823-826; Hsu et al., 2014, Cell, 157.6: 1262-1278; Jiang et al., 2013, Nature Biotechnology, 31, 233-239; Anzalone et al., Nature　(2019) doi:10.1038/s41586-019-1711-4; Komor et al., Nature 533: 420-424, 2016; Gaudelli et al., Nature 551: 464-471 (2017)). 예시적인 CRISPR-Cas 유전자 편집 프로토콜은 [Jennifer Doudna, and Prashant Mali, 2016, "CRISPR-Cas: A Laboratory Manual" (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4)] 및 [Ran et al. 2013, Nature Protocols, 8 (11): 2281-2308]에 기재되어 있다.
[00120] CRISPR/Cas 시스템은 일반적으로 다음의 두 가지 성분: (1) (1) 본 명세서에서 CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9, Cas12 또는 다른 대안적 뉴클레아제라고도 하는 RNA-의존성 DNA 뉴클레아제; 및 (2) crRNA ("CRISPR RNA") 및 tracrRNA ("트랜스활성화 crRNA")를 포함하는 이중 RNA 또는 단일 사슬 전장 가이드 RNA를 포함하고, 뉴클레아제를 게놈의 표적 부위로 지시하는 표적화 서열을 포함한다. 가이드 RNA (gRNA)는 뉴클레아제가 표적 부위의 DNA에서 이중 가닥 파손 (DSB)을 생성하는 표적 부위로 뉴클레아제를 지시한다. 생성된 DSB는 NHEJ (비상동 말단 접합) 경로 및 HDR (상동성 지정 복구) 경로의 두 가지 일반적인 복구 경로 중 하나에 의해 복구된다. NHEJ 복구 경로는 DSB를 신속하게 복구할 수 있는 가장 활동적인 복구 메커니즘이지만, 종종 DSB 부위에서 작은 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실 (인델)을 초래하여 기능적 유전자를 녹아웃시키는 프레임시프트 돌연변이를 초래한다. HDR 경로는 덜 효율적이지만 충실도가 높다. CRISPR 엔도뉴클레아제에 절단 영역과 상동인 DNA 주형이 제공되면 HDR을 통해 상동 DNA 주형을 사용하여 이중 가닥 절단이 복구된다. HDR 경로를 통해 RNP와 함께 큰 유전자 삽입체를 세포에 삽입할 수 있다.
[00121] 관심 유전자의 표적 부위를 표적화하는 서열을 포함하는 gRNA 서열의 설계 또는 선택은 당업계에 기재되어 있다. 표적 부위는 조절 영역의 서열 (예컨대 프로모터 및 인핸서), 또는 코딩 영역 내의 서열 (예컨대 엑손, 예를 들어, 5' 말단 근처의 엑손, 또는 단백질의 특정 도메인 또는 영역을 코딩하는 엑손)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 통상적으로 NGG 또는 NAG와 같은 PAM 서열의 바로 5' 위치에 기초하여 선택된다.
[00122] 가이드 서열은 표적 서열 (표적 부위의 뉴클레오타이드 서열)과 상보성을 갖는 표적 서열을 포함하도록 설계된다. 가이드 서열과 표적 서열 사이에 특이적 혼성화를 유발하고 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있는 한 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적화 서열과 표적 서열 사이의 상보성 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 (예를 들어, 100% 또는 완전히 상보적)이다.
[00123] 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20 이하의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열의 표적화 서열 부분은 길이가 약 20개 뉴클레오타이드이다. 표적 상보성의 더 짧은 영역 (< 20 뉴클레오타이드)을 갖는 절단된 gRNA는 개선된 표적 특이성으로 효과적인 것으로 기재되어 있다 (예를 들어, Fu et al., Nature Biotechnol., 32(3): 279-284, 2014를 참조한다). 이에 따라, 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열은 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열은 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이다 가이드 RNA의 표적화 서열이 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이지 않은 일부 구현예에서, 게놈의 PAM 서열에 가까운 표적화 서열의 부분 (시드 영역이라고도 함)은 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이다. 즉, 가이드 서열 (즉, 비-시드 영역)의 뉴클레오타이드 5'의 일부 변형은 허용된다. 예를 들어, 가이드 서열은 적어도 17개 길이의 (예를 들어, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이의) 뉴클레오타이드 표적화 부분을 포함하도록 설계될 수 있으며, 표적 서열의 적어도 17개의 뉴클레오타이드에 대해 완전히 상보적인 적어도 17개의 뉴클레오타이드의 시드 영역을 가질 수 있다.
[00124] 특정 유전자의 표적 서열의 예는 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 17-20개의 뉴클레오타이드의 표적화 서열을 포함하며, 시드 영역 (표적화 서열의 3' 부분)의 적어도 17 개의 뉴클레오타이드는 표적 서열의 적어도 17 개의 뉴클레오타이드에, 예를 들어, 표적 서열의 3' 말단으로부터 17 개의 뉴클레오타이드에 완전히 상보적이다.
유전자
공식 기호
 게놈
RefSeqGene		 표적 전사 표적 서열
(표적 위치에서 뉴클레오타이드 서열)
PDCD1 NG_012110.1 ENSG00000188389 GTCTGGGCGGTGCTACAACT (서열 번호: 1)
RC3H1 NC_000001.11 ENSG00000135870 TGCCTGTACAAGCTCCACAA (서열 번호: 2)GAGAGGAAATCCGTCCATTG (서열 번호: 3)
RC3H2 NC_000009.12 ENSG00000056586 TGTGAACAACCTAAACTGAT (서열 번호: 4)TGCCTGTGCAGGCAGCTCAA (서열 번호: 5)
AGCTTCCACAATGCCTGTGC (서열 번호: 6)
A2AR NG_052804.1 ENSG00000128271 CTCCACCGTGATGTACACCG (서열 번호: 7)CTCCTCGGTGTACATCACGG (서열 번호: 8)
FAS NG_009089.2 ENSG00000026103 GTGACTGACATCAACTCCAA (서열 번호: 9)GGAGTTGATGTCAGTCACTT (서열 번호: 10)
TGFBR1 ENSG00000106799 CTCGATGGTGAATGACAGTG (서열 번호: 11)GGTGAATGACAGTGCGGTTG (서열 번호: 12)
CCATCGAGTGCCAAATGAAG (서열 번호: 13)
TGFBR2 ENSG00000163513 GCTTCTGCTGCCGGTTAACG (서열 번호: 14)TTGAACTCAGCTTCTGCTGC (서열 번호: 15) GCAGAAGCTGAGTTCAACCT (서열 번호: 16)
[00125] CRISPR 게놈 편집을 위한 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용 가능하며, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에 있는 유전자의 구성 엑손에서 예시적인 sgRNA 표적 서열을 제공한다 (예를 들어, the gRNA-database provided by GenScript, and by Massachusetts Institute of Technology 참조; 또한 Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4 참조). 일부 구현예에서, gRNA 서열은 비-표적 유전자에 대한 최소의 표적외 결합을 가지는 서열이거나 또는 이를 포함한다.
[00126] 본 명세서에 사용하기에 적합한 Cas 단백질 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제의 예로는 Cpf1 (Zetsche et al., Cell (2015) 163(3): 759-771), Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 known as Csn1 and Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 또는 Csf4, 또는 유도체 이의 기능적 유도체 (즉, 돌연변이 형태 또는 자연 발생 형태의 RNA-의존성 엔도뉴클레아제 활성을 실질적으로 유지하는 이의 단편과 같은 자연 발생 CRISPR 엔도뉴클레아제의 유도체)를 포함한다. 예를 들어, US20180245091A1 및 US20190247517A1를 참조한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9, 예를 들어 S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 아우레우스(S. aureus) 또는 S. 뉴모니애(S. pneumoniae)로부터의 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 SwissProt 데이터베이스에 제공된 아미노산 서열을 가지는 S. 피오게네스로부터의 Cas9 단백질이다.
[00127] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 CRISPR-매개 유전자 편집을 통해 달성되며, 이러한 편집은 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)에 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제1 핵산, 및 억제되도록 본 명세서에서 식별된 유전자의 표적 서열에 특이적인 가이드 RNA (gRNA)를 인코딩하는 제2 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 2 개의 핵산은 하나의 핵산 작제물 (또는 벡터)에 포함되거나 상이한 작제물 (또는 벡터)에 제공되어 세포에서 Cas 단백질 및 gRNA의 발현을 달성할 수 있다. 세포에서 Cas 뉴클레아제 및 gRNA의 발현은 표적 서열에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하고, 이는 DNA 절단으로 이어진다.
[00128] 일부 실시양태에서, 유전자 기능의 억제는 gRNA와 Cas 뉴클레아제 사이의 조합 또는 복합체를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 CRISPR-매개 유전자 편집을 통해 달성된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질/gRNA 조합 또는 복합체는 예를 들어, 전기천공, 입자총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축 또는 압착, 리포솜, 나노입자, 미세주사, 네이키드 DNA 플라스미드 전달, 단백질 형질도입 도메인 매개 형질도입 또는 바이러스 매개 (레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 통합 바이러스 벡터 및 아데노바이러스, AAV, HSV, 백시니아와 같은 비통합 바이러스 벡터 포함)을 통해 세포 내로 전달될 수 있다.
[00129] 사용된 특정 유전자 편집 방법에 관계없이, 유전자 서열이 변형되었고 유전자 기능이 억제되었는지 확인하기 위해, 다양한 분석이 수행될 수 있으며, 이러한 분석으로는 예를 들어, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR을 비롯한 PCR, 또는 핵산 시퀀싱을 통한 DNA 또는 mRNA 검사, 또는 예를 들어, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)을 통해 특정 단백질 또는 펩타이드의 존재 또는 활성 검출을 포함한다.[00130] 일부 구현예에서, RC3H1, RC3H2, A2AR, 및 FAS 유전자 중 적어도 하나의 기능은 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 이러한 유전자 중 적어도 하나의 초기 엑손에 인델(들)을 도입함으로써 억제되는데, 이는 편집된 유전자에서 기능적 단백질이 번역되지 않도록 이러한 유전자 중 적어도 하나에서 프레임 이동 돌연변이(들)을 초래한다. 일부 구현예에서, RC3H1, RC3H2, A2AR, 및 FAS 유전자 중 둘 이상의 기능은 CRISPR/Cas9를 사용하여 상기 유전자 중 둘 이상의 초기 엑손에 인델을 도입함으로써 억제되어, 기능적 단백질이 편집된 유전자에서 번역되지 않도록 이들 유전자 중 2개 이상에서 프레임 이동 돌연변이가 발생한다. 일부 구현예에서, RC3H1, RC3H2, A2AR, 및 FAS 유전자 중 둘 이상은 RC3H2와 조합으로, 또 다른 유전자, 예를 들어, RC3H2 및 RC3H1을 포함한다.
[00131] 일부 구현예에서, TGFBR1 및 TGFBR2 유전자 중 적어도 하나의 기능은 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 상기 유전자 중 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 도메인의 출발 아미노산 잔기에 대한 엑손 및 코돈의 업스트림에 인델을 도입함으로써 억제되어, 우성 음성 돌연변이인 세포 내 신호 전달 도메인을 제거하는 프레임 이동 돌연변이가 발생한다. 일부 구현예에서, TGFBR1 및 TGFBR2 유전자 둘 모두의 기능은 CRISPR/Cas9를 사용하여 상기 유전자 각각의 세포 내 신호 전달 도메인의 출발 아미노산 잔기에 대한 엑손 및 코돈의 업스트림에 인델을 도입함으로써 억제되어, 우성 음성 돌연변이인 세포 내 신호 전달 도메인을 제거하는 프레임 이동 돌연변이가 발생한다.
[00132] CRISPR/Cas 시스템은 또한 닉카제 (즉, Cas9 닉카제) 및 High Fidelity Enzymes를 사용하여 이중 가닥 파손 또는 기증자 DNA 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, Anzalone, A et al., Nature　(2019) doi:10.1038/s41586-019-1711-4; Komor et al., Nature 533: 420-424, 2016; Gaudelli et al., Nature 551: 464-471 (2017)를 참조한다.
mRNA의 수준 또는 기능 감소 또는 제거를 통한 억제
[00133] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 기능을 감소 또는 제거, 즉, mRNA의 억제함으로써 달성된다. 유전자 편집 시스템을 통한 억제와 달리 mRNA 억제는 일시적이다.
[00134] 일부 구현예에서, mRNA의 억제는 예를 들어, 안티센스 핵산, 리보자임, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), miRNA (마이크로RNA) 또는 이의 전구체, 또는 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이의 전구체를 생성하도록 세포에서 전사될 수 있는 핵산 작제물을 사용하여 달성될 수 있다.
[00135] 안티센스 - 안티센스 기술은 잘 알려진 방법이다. 안티센스 RNA는 내인성 mRNA의 전장 또는 일부에 상보적이며 내인성 mRNA와 이중체를 형성하여 내인성 mRNA로부터의 번역을 차단하는 RNA 분자이다. 리보자임은 합성으로 제조될 수 있으며, 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포)로 도입되거나, 또는 관심 유전자의 발현을 억제하도록 외인성으로 도입된 핵산 구성체로부터 전사를 통해 관심 있는 세포에서 만들어질 수 있다. 안티센스 RNA가 관심 유전자의 전장 mRNA에 상보적일 필요는 없다. 그러나, 안티센스 RNA는 표적 mRNA와 이중체를 형성하고 표적 mRNA에 기초한 번역을 차단하기에 충분한 길이여야 한다. 일반적으로, 안티센스 RNA는 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500 개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 RNA는 500, 400, 300, 200, 100, 75 또는 50 개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다. 안티센스 분자는 또한 DNA, DNA 유사체 및 RNA 유사체일 수 있다.
[00136] 리보자임 - 리보자임 (즉, 촉매 RNA)은 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 이루고 특정 위치에서 포스포다이에스터 백본을 절단하여 표적 RNA를 기능적으로 비활성화하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 출원 6,423,885, U.S. 특허 출원 5,254,678, 및 Perriman et al., PNAS 92(13):6175-6179 (1995)를 참조한다. 리보자임은 합성으로 제조될 수 있으며, 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포)로 도입되거나, 또는 외인성으로 도입된 핵산 구성체로부터 전사를 통해 관심 있는 세포에서 만들어질 수 있다.
[00137] RNAi (RNA 간섭) - RNAi를 통한 유전자 발현 또는 번역 억제가 당업계에 공지되어 있으며, RNA 분자 예컨대 siRNA ("짧은 간섭 RNA"), shRNA ("짧은 헤어핀 RNA"), 및 miRNA ("마이크로RNA")를 활용하여 달성될 수 있다. siRNA와 shRNA는 RNA 간섭 경로에 관여하여 특정 유전자의 발현을 간섭하는 것으로 알려져 있다. siRNA는 작은 (일반적으로 길이가 20-25개의 뉴클레오타이드) 이중 가닥 RNA이며 표적 mRNA 또는 표적 mRNA (즉, 관심 유전자에서 전사된 mRNA)의 일부에 상동성이거나 상보적인 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. shRNA는 리오보뉴클레아제 DICER에 의해 절단되어 siRNA를 생성한다. 표적 유전자의 서열이 주어지면, siRNA 또는 shRNA는 합성으로 제조되고, 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포) 내로 도입되거나, 또는 그러한 RNA를 코딩하는 외인적으로 도입된 핵산 구축물로부터 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포)에서 제조될 수 있다. miRNA는 또한 비단백질 인코딩 유전자로부터 전사된 긴 전구체로부터 처리되는 작은 RNA 분자 (일반적으로 약 21-22개 뉴클레오타이드)이며 표적 mRNA와의 부정확한 염기쌍을 통해 번역을 방해한다. miRNA 또는 이의 전구체 (pri-miRNA 또는 pre-miRNA)는 합성으로 제조되어 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포)에 도입되거나, miRNA 또는 이의 전구체를 암호화하는 외인적으로 도입된 핵산 구성체로부터 관심 세포 (예를 들어, 면역 세포)에서 만들어질 수 있다.
[00138] 일부 구현예에서, mRNA의 억제는 효소적으로 불활성인 뉴클레아제인 Cas 분자가 관심 유전자를 표적화하는 gRNA와 조합되어 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 변형된 버전을 사용하여 달성될 수 있다. 표적 부위는 유전자의 5' 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 영역)에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 분자는 DNA 절단 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이를 포함하는 효소적으로 불활성인 Cas9 분자이다 (예를 들어, WO2015/161276 참조). 일부 구현예에서, 효소적으로 불활성인 Cas9 분자는 전사 리프레서 단백질에 직접 또는 간접적으로 융합된다.
다른 수단을 통한 억제
[00139] 본 발명은 유전자의 기능을 억제하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법을 포함하며, 예를 들어 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 직접적으로 억제하는 화합물 (예를 들어, 소분자, 항체, 등)을 세포 (예를 들어, 면역 세포) 내에 도입하여 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준 또는 활성을 감소시키는 것을 포함한다.
CAR
[00140] 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택된 유전자의 억제를 갖도록 변형된 세포 (예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포)는 또한 키메라 항원 수용체 (또는 "CAR")를 코딩하는 핵산을 함유하도록 변형되었다.
[00141] 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 선택된 유전자의 기능을 억제하도록 세포가 변형되기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 세포 내로 도입될 수 있다. 억제가 (예를 들어, 안티센스 RNA 또는 RNAi를 통해) 일시적인 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 바람직하게는 억제를 달성하기 위해 세포가 변형되기 전에 세포 내로 도입된다. 억제가 (예를 들어, 유전자 편집을 통해) 영구적인 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 억제를 달성하기 위해 변형되는 세포 이전, 동시 또는 이후에 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산은 DSB의 도입 후 유전자 편집의 표적 부위에서 HDR에 의한 삽입을 허용하도록 설계되며, 즉 유전자는 CAR-인코딩 핵산의 녹인(knock-in)또는 삽입에 의해 파괴된다.
[00142] 일부 구현예에서, CAR 유전자는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터, 트랜스포존 시스템, CRISPR-Cas9 또는 TALEN 매개 유전자 녹인을 포함하는 다중 기술을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
[00143] 용어 "키메라 항원 수용체" ("CAR", 또한 "인공 T 세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 및 "키메라 면역수용체"로도 알려짐) 항원 인식 모이어티를 면역 세포에 이식하는 조작된 수용체에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 일반적으로 말해서, CAR은 표적 항원에 특이적인 항원 인식 모이어티, 막횡단 도메인, 및 면역 세포에서 천연적으로 발현되는 수용체의 세포내/세포질 신호전달 도메인으로 구성되며, 서로 작동가능하게 연결되어 있다. "작동가능하게 연결된"은 개별 도메인이 서로 연결되어 항원 인식 모이어티가 표적 항원에 결합할 때, 신호는 세포내 신호전달 도메인을 통해 유도되어 CAR을 발현하는 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 활성화하고 이의 이펙터 기능이 활성화될 수 있도록 한다.
[00144] CAR의 항원 인식 모이어티는 표적 항원의 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 수용체의 세포외 부분이다. 항원 인식 모이어티는 일반적으로 scFv이지만 이에 제한되는 것은 아니다.
[00145] CAR의 세포 내 도메인은 면역 세포의 자연 발생 수용체의 1차 세포질 신호전달 서열, 및/또는 면역 세포의 자연 발생 수용체의 2차 또는 공동-자극 서열을 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포 내 신호전달 도메인은 CD3-제타로부터의 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포 내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 공동자극 신호전달 서열과 조합하여 CD3-제타로부터의 세포질 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 적합한 공동자극 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-lBB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, TIM3, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
[00146] CAR의 막횡단 도메인은 일반적으로 막에 걸쳐 있는 전형적인 소수성 알파 나선이며 막-결합 또는 막횡단 단백질에서 유래될 수 있다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우 도메인은 막 결합 또는 막횡단 단백질에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬, 또는 면역글로불린, 예컨대 IgG4로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이러한 경우 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 우세하게 포함할 것이다.
[00147] 용어 "표적 항원"은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 수용체-발현 면역 세포에 의해 표적화되는 세포에 의해 발현되는 임의의 단백질성 또는 비-단백질성 분자에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 표적 항원은 "자가" 분자 (환자의 체내에서 발현되는 분자) 또는 비-자기 분자(예를 들어, 감염성 미생물로부터의 분자)일 수 있다. 본 명세서에 언급되는 표적 항원은 T 또는 B 세포 면역 반응을 자연적으로 유도할 수 있는 분자로 제한되지 않으며; 오히려, "표적 항원"은 표적화하고자 하는 임의의 단백질성 또는 비-단백질성 분자에 대한 참조이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 상에서 발현된다. 표적 항원은 표적 세포에 의해 독점적으로 발현될 수 있거나, 또한 비표적 세포에 의해 발현될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 비자기 분자, 또는 표적화되고자 하는 세포에 의해 독점적으로 발현되거나, 또는 표적화되고자 하는 세포에 의해 정상 세포보다 유의하게 더 높은 수준으로 발현되는 분자이다. 표적 항원의 비제한적인 예로는 다음을 포함한다: 분화 항원 예컨대 MART- 1/MelanA (MART -I), gplOO (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통 항원 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 당단백질 예컨대 MUC1 및 MUC16; 과발현된 배아 항원 예컨대 CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자 예컨대 p53, Ras, HER-2/neu; 염색제 전위로 인한 독특한 종양 항원 ; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 Epstein Barr 바이러스 항원 EBVA 및 인유두종 바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 종양 관련 항원으로는 다음을 포함한다: 엽산 수용체 알파 (FRα), EGFR, CD47, CD24, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl 85erbB2, pl80erbB-3, cMet, nm-23Hl, PSA, CA 19-9, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27. 29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, NB/70 K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결합 단백질\사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG-72, TLP, TPS, PSMA, 메소텔린, 또는 BCMA.
[00148] 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양-관련 항원, 특히 단백질, 당단백질 또는 비-단백질 종양-관련 항원이다.
[00149] 일부 구현예에서, 표적 항원은 CD47, 엽산 수용체 알파 (FRα) 및 BCMA으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[00150] 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양-관련 항원, 예를 들어, 종양-관련 항원 TAG-72이다.
[00151] 다른 구체예에서, 표적 항원은 표면 단백질, 예를 들어 CD24이고, 또 다른 구현예에서는, 종양-표적화를 위해 사용될 수 있는 표면 단백질, 예를 들어, CD19 또는 CD20이다.
변형된 세포의 약제학적 조성물 및 치료적 용도
[00152] 추가의 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 세포, 즉, 하나 이상의 선택된 유전자의 기능이 억제된 변형된 세포를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
[00153] 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제조된 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 용매, 분산 매질, 등장제 등을 포함한다. 담체의 예는 오일, 물, 염수 용액, 겔, 지질, 리포솜, 수지, 다공성 매트릭스, 방부제 등, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 일반적으로 단위 투여량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로, 입양 세포 요법과 같은 환자에 대한 투여를 위해 제조 및 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 시간-방출, 지연 방출 및 지속 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다.
[00154] 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예컨대 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 본 명세서에 개시된 변형된 세포를, 약 100만 내지 약 1000억 세포, 예를 들어, 적어도 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 또는 5억 세포, 최대 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 1000억 세포의 양으로 포함한다.
[00155] 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또 다른 활성 물질 또는 약물, 예컨대 화학요법제를 추가로 포함한다.
[00156] 또 다른 양태에서, 치료 방법 및 입양 세포 요법에서의 용도와 같은 본원에 개시된 변형된 세포의 방법 및 용도가 본 명세서에 제공된다.
[00157] 일부 구현예에서, 방법은 본 명세서에 개시된 변형된 세포 또는 본 명세서에 개시된 변형된 세포를 포함하는 조성물을 질병 또는 병태를 가지거나, 또는 질병 또는 병태가 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[00158] 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 신생물 병태 (즉, 암), 미생물 또는 기생충 감염(예컨대 HIV, STD, HCV, HBV, CMV, COVID-19 또는 항생제 내성 박테리아), 자가면역 질병 (예를 들어, 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식), 기관 (예를 들어, 심장, 폐, 간 등)의 섬유증, 또는 자궁내막증이다.
[00159] 일부 구현예에서, 신생물 병태는 중추신경계 종양, 망막모세포종, 신경모세포종, 소아 종양, 두경부암 (예를 들어, 편평세포암), 유방암 및 전립선암, 폐암 (소세포 및 비소세포 폐암 모두), 신장암 (예를 들어, 신장 세포) 선암종), 식도위암, 간세포 암종, 췌담도 종양(예를 들어, 선암종 및 섬 세포 종양), 결장직장암, 자궁경부암 및 항문암, 자궁 및 기타 생식관암, 요로암 (예를 들어, 요관 및 방광), 생식 세포 종양 (예를 들어, 고환 생식 세포 종양 또는 난소 생식 세포 종양), 난소암 (예를 들어, 난소 상피암), 원발성 미지의 암종, 인간 면역결핍 관련 악성 종양 (예를 들어, 카포시 육종), 림프종, 백혈병, 육종, 악성 흑색종 내분비 종양 (예를 들어, 갑상선), 중피종 및 기타 흉막 또는 복막 종양, 신경내분비 종양 및 카르시노이드 종양을 포함한다.
[00160] 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 병태의 치료를, 예를 들어, 암을 치료하는 맥락에서 종양 성장 및/또는 전이를 억제함으로써, 또는 바이러스 감염을 치료하는 맥락에서 바이러스 부하 및/또는 확산을 감소시킴으로써, 즉, 병태, 또는 병태의 임의의 하나 이상의 증상을 감소 또는 개선을 유도한다. 용어 "치료"는 반드시 완전한 회복을 의미하는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 병태의 예방, 즉, 병태의 발병을 예방, 발병 위험 감소, 또는 시작의 지연을 유도한다. 이와 유사하게, "예방"이 대상체가 결국 병태에 걸리는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다.
[00161] 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어 환자는 포유동물, 일반적으로 인간과 같은 영장류이다.
[00162] 일부 구현예에서, 세포 또는 세포를 포함하는 조성물은 비경구로 투여된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "비경구"는 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여를 포함한다.
[00163] 변형된 세포 또는 변형된 세포를 포함하는 조성물의 원하는 투여량은 단일 투여, 다중 투여, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다. 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다.
[00164] 일부 구현예에서, 입양 세포 요법은 자가 이식에 의해 수행된다. 면역 세포 (예컨대 T 세포)는 세포 요법을 받을 대상체, 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 일부 구현예에서, 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 대상체로부터 단리되고, (하나 이상의 유전자의 기능을 억제하기 위한) 본 명세서에 개시된 방법에 따라 변형된 다음, 동일한 대상체에 투여된다.
[00165] 일부 구현예에서, 입양 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 단리 및/또는 세포 요법을 받는 대상체 (수혜자 대상체)와는 상이한 공여자 대상체로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 공여자 및 수용자 대상체는 동일한 HLA 부류 또는 수퍼타입을 발현한다.
실시예
[00166] 다음의 실시예에서, 제한 없이, 종양 치료를 위한 CAR-T 세포, T 세포, NK 세포 및 유도된 세포 (예를 들어 iNK 세포)의 기능을 향상시키기 위해, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 이러한 면역 세포의 음성 면역-조절기를 제거하는 것이 설명되어 있다. CAR를 포함하는 T 세포의 경우에, 세포는 활성화 후 렌티바이러스 CAR 벡터에 의해 먼저 형질도입된 다음, 특이적으로 설계된 가이드 RNA가 있는 Cas9 뉴클레아제 복합체가 CAR-T 세포로 형질감염되어 면역 조절 유전자(들)을 제거하였다 (도 1A). CAR을 포함하는 NK-92 세포의 경우, 면역 조절 유전자(들)을 제거하기 위해 특이적으로 설계된 가이드 RNA가 있는 Cas9 뉴클레아제 복합체로 세포를 먼저 형질감염시킨 다음, 렌티바이러스 CAR 벡터를 사용하여 형질도입하였다 (도 1B). 유전자 편집 효율은 게놈 DNA 시퀀싱 기반 정량화로 조사하였다. 그런 다음 세포의 시험관 내 확장 동안 세포 독성 및 확장 속도를 모니터링하였다. 생체 내 지속성을 평가하기 위해, CAR-세포 (하기 실시예에서 CAR-T 세포)를 마우스 이종이식 종양 모델로 채택적으로 옮겼다 (도 1A-1B).
실시예 1 - 2세대 TAG-72 CAR-T 세포의 생성
[00167] TAG-72는 선암종에 대해 확립된 종양 표지자이자, 특정 고형 종양에서 CAR-T 세포에 대한 표적이기도 하다. 2세대 TAG-72 CAR-T 세포는 WO2017/088012 (본 명세서에 참조 문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이 생성되었다. TAG-72 CAR 발현 카세트는 신호 펩타이드로서 카파 리더 서열, 종양 항원 결합 모이어티로서 항-TAG-72 scFv, 인간 CD8로부터의 힌지 및 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 CD3 제타의 세포질 활성화 신호전달 도메인을 포함하였다. P2A는 CAR 발현의 형광 리포터로서 EGFP를 방출하는 단백질 분해 절단을 지시하는 신호 서열이다 (도 2A). 따라서, T 세포에서 CAR 형질도입 효율 및 발현 수준은 렌티바이러스 형질도입 후 GFP 유세포 분석을 사용하여 검출할 수 있었다 (도 2B).
인간 T 세포 단리 및 배양
[00168] 1차 인간 T 세포는 신선한 전혈 또는 호주 적십자 혈액 서비스 (임상 목적에 적합하지 않은 부적합/폐기 물질)에서 얻은 버피 코트에서 건강한 인간 기증자로부터 분리되었다. 모든 환자와 건강한 기증자는 정보에 입각한 동의를 제공하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 제조사의 지침에 따라 Leucosep™튜브 (Greiner, Kremsm
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nster, 오스트리아)를 사용하여 Ficoll-Paque (GE Healthcare, Illinois, 미국) 원심분리에 의해 분리되었다. PBMC는 사용 전에 동결보존하였다. 형질도입 및 형질감염에 사용하기 위해 Dynabeads®Human T-Activator CD3/CD28 비드(Thermofisher, Massachusetts, United States)를 사용하여 PBMC를 해동하고 T 세포를 분리하고 활성화하였다. 세포와 비드를 실온에서 1시간 동안 1:3 비율로 인큐베이션하면서 지속적으로 부드럽게 혼합하였다. 그런 다음 세포-비드 현탁액을 자석에 1-2분 동안 놓아 결합되지 않은 세포를 제거하였다. 상층액을 제거하고 세포-비드 혼합물을 T 세포 배지: 5% 인간 AB 혈청 (Sigma-Aldrich, Missouri, 미국) 및 100U/mL IL-2를 포함하는 TexMACS 배지 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, 독일)에서 37 °C 5% CO2에서 ~65시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포는 20-50x를 혼합하여 세포-비드 복합체를 해리하여 수집하고, 즉시 자석에 1-2분 동안 놓고 상청액을 함유하는 세포를 수집하였다. 분리된 T 세포 현탁액을 MUSETM 세포 계수기 (Merck-Millipore, Massachusetts, 미국)에서 계수하고 형질감염을 위해 준비하였다.
렌티바이러스 형질도입
[00169] 렌티바이러스 CAR 벡터를 사용하여 WO2017/088012(본 명세서에 참조 문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이 활성화된 인간 CD3+ T 세포를 형질도입하였다. 렌티바이러스 CAR-T 세포를 생산하기 위해, 활성화된 인간 CD3+/CD28+ T 세포를 RetroNectin® (Takara Bio Inc) 코팅된 플레이트에서 48시간 동안 렌티바이러스 입자와 함께 인큐베이션하였다.
CAR 발현의 유세포 분석.
[00170] 렌티바이러스 형질도입된 CAR-T 세포에서 CAR 작제물의 발현을 검출하기 위해 MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)에서 유세포 분석을 수행하였다. GFP 발현을 분석하였다. 프로피듐 아이오다이드 용액 (Miltenyi Biotec) 또는 Viobility 405/520 염료를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하였다.
실시예 2 - CRISPR를 사용한 유전자 편집 TAG-72 CAR-T 세포의 생성
[00171] CRISPR 유전자 녹아웃 (KO) CAR-T 세포를 생성하기 위해, 대표적인 가이드 RNA (PD1 KO, 서열 번호: 1; RC3H1 KO, 서열 번호: 2; RC3H2 KO, 서열 번호: 4; A2AR KO, 서열 번호: 7; FAS KO, 서열 번호: 9; TGBFBR1 KO, 서열 번호: 11; TGFBR2 KO, 서열 번호: 14)에 의해 형성된 RNP 복합체를 각각 제5일에 렌티바이러스 TAG-72 CAR 형질도입 48 시간 후 T 세포에 형질감염시켰다 (도1A 내지 3). 전기천공 유도된 세포 사멸이 발생했지만, RNP 형질감염된 CAR-T 세포는 본 명세서에 개시된 프로토콜을 사용하여 형질감염되지 않은 CAR-T 세포뿐만 아니라 회수 및 확장될 수 있었다 (도 3). RNP 형질감염 4일 후, 유전자 편집의 정량적 분석을 위해 CAR-T 세포의 게놈 DNA를 추출하였다. 유전자 편집 효율은 ICE(Inference of CRISPR Edits) 분석을 사용하여 분석하였다 (Hsiau et al., Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. bioRxiv, 2018, 10.1101/251082 (251082). ICE 분석의 대표적인 결과로서 RC3H2 유전자 편집 효율 분석이 본 명세서에 제시되었다 (도 4A 내지 4C). RC3H2 gRNA(서열 번호: 4)는 RC3H2 유전자의 초기 엑손에 인델 (총 인델 빈도 = 92%)을 도입하는 높은 활성을 보였다. 또한, 오픈 리딩 프레임의 높은 프레임 이동 빈도 (프레임 외(out-of-frame) 인델 빈도 = 91%)를 초래하여 기능적 RC3H2 단백질의 번역을 방해한다 (도 4B 및 4C). 현재 연구에서 모든 CRISPR 유전자 편집된 CAR-T 세포에 대해 매우 높은 유전자 편집 효율 (총 인델 백분율 = 89% 내지 96%) 및 효율적인 유전자 녹아웃 결과 (프레임 외 인델 빈도 = 61% 내지 91%)가 달성되었다 (도 4D). 요약하면, 이러한 결과는 연구에 사용된 gRNA가 CAR-T 세포의 시험관 내 확장의 교란 없이 CAR-T 세포에서 해당 유전자의 발현을 방해하는 높은 활성을 갖는 것으로 확인되었음을 나타낸다.
CAR-T 세포의 CRISPR 유전자 편집
[00172] 렌티바이러스 TAG-72 CAR 형질도입 2일 후, T 세포를 Cas9 RNP 형질감염을 위해 dPBS로 세척하였다. crRNA 및 tracrRNA (Synthego 또는 IDT)를 풀링하여 전장 가이드 RNA를 형성하였다. Cas9 RNP는 Cas9 단백질을 전장 gRNA와 1:2 비율로 실온에서 10~20분 동안 인큐베이션하여 형질감염 전에 제조하였다. Cas9 RNP를 형질감염시키기 위해 T 세포를 Neon 형질감염 장치 (Thermofisher) 또는 4D-Nucleofector 장치(Lonza, Basel, 스위스)로 전기천공하였다.
게놈 편집의 정량적 평가
[00173] CRISPR/Cas9 게놈 편집 효율의 효능 및 돌연변이 스펙트럼을 ICE 분석으로 분석하였다 (Hsiau et al., Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. bioRxiv, 2018, 10.1101/251082(251082)). 제조사의 지시에 따라 ISOLATE II Genomic DNA Kit (Bioline)를 사용하여 전기천공 4일 후 세포에서 게놈 DNA를 추출하였다. gRNA 게놈 표적 부위에 걸친 PCR 앰플리콘은 High-Fidelity Taq 중합효소(New England Biolabs)를 사용하여 생성되었다. 정제된 PCR 산물은 Sanger 염기서열분석을 받았고, 염기서열 크로마토그램은 온라인에서 사용 가능한 ICE 소프트웨어로 분석되었다.
실시예 3 - CRISPR 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포의 시험관내 기능
[00174] 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포의 확장 단계 동안, 세포의 종양 사멸 능력은 시험관 내 xCELLigence®실시간 분석 후 생체 내 평가를 사용하여 평가하였다. 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포를 생성하고 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 검증하였다.
T 세포 시험관 내 세포독성 분석
[00175] 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하여 시험관 내에서 CAR-T 세포의 사멸 효율을 결정하였다. 10,000개 표적 세포/100μL (예를 들어, 난소암 세포주 OVCAR-3)를 10% - 20% 우태혈청 및 소 인슐린이 보충된 배양 배지 (예를 들어, RPMI-1640 기본 배지)에 재현탁하고 RTCA 플레이트에 담았다. 표적 세포는 세포 부착을 허용하기 위해 3-20시간 동안 37°C, 5% CO2에서 유지하였다. 표적 세포의 부착 후, TAG-72 CAR-T 이펙터 세포를 1:5 내지 5:1 범위의 다양한 이펙터 대 표적 비율로 첨가하였다. 일부 경우에, 이펙터 세포는 사용 전에 FACS를 통한 GFP 발현을 기반으로 단리하였다. 동시에, 형질감염되지 않은 T 세포를 표적 세포와 공동 배양하여 시험관내 T 세포의 배경 기능을 입증하였다. 모든 공동 배양은 최소 20시간 동안 최적의 성장 조건에서 유지하였다. 전체에 걸쳐 세포 임피던스를 모니터링하였고; 임피던스의 감소는 세포 분리 및 궁극적으로 세포 사멸을 나타낸다.
[00176] 종양 세포를 용해시키기 위한 유전자 편집된 렌티바이러스 TAG-72 CAR-T 세포의 초기 능력을 비교하기 위해, 높거나 낮은 TAG-72 발현을 가지는 종양 세포를 유전자 편집된 CAR-T 세포 또는 기타 음성 대조군 이펙터 T 세포 (형질감염되지 않음)와 함께 인큐베이션하고, 시험관 내 세포독성을 xCELLigence®로 모니터링하였다. 이러한 모든 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포는 TAG-72 CAR-T 세포만큼 효율적으로 TAG-72 높은 종양 세포 (OVCAR-3)를 사멸한 반면 (도 5A, C, E 및 G), TAG-72 낮은 종양 세포 (MES-OV)의 용해는 관찰되지 않았다 (도 5B, D, F 및 H). 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 CRISPR 절차를 사용하여 생성된 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포가 TAG-72 CAR-T 세포의 종양 사멸 능력 및 특이성을 유지한다는 것을 나타낸다.
실시예 4 - CRISPR 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포의 생체 내 기능
[00177] 최근 연구에 따르면 TAG-72 CAR-T 세포는 생체 내 난소 종양 부담을 줄일 수 있지만 종양 재발을 방지하기 위해 지속될 수는 없다 (Murad, J.P., et al., Effective Targeting of TAG72(+) Peritoneal Ovarian Tumors via Regional Delivery of CAR-Engineered T Cells. Front Immunol, 2018, 9: p. 2268). 실시예 1, 2 및 3에 기재된 바와 같이 생성 및 검증된 TAG-72 CAR-T 세포를 생체 내 마우스 고형 종양(이종이식편) 모델에서 이들의 효능에 대해 평가하였다. 상기 모델의 경우, 인간 종양 세포주는 대략 1x107 인간 유래 TAG-72 양성 OVCAR-3 암세포를 6-10주령 마우스의 옆구리에 피하 주사하여 NSG 마우스의 옆구리에서 성장하였다. 7-9 주 이내에 완전히 형성된 150-200mm3 종양이 주사 부위에 발생하였다. 종양이 상기 부피에 도달하면, 치료를 위해 그룹을 무작위로 지정하였다. 상이한 편집된 유전자를 가지는 CAR-T 세포를 주사당 5 x 106 T 세포의 총 2회 주사로 마우스에 정맥내 투여하였다. 종양 부피, 체중 및 임상 점수는 CAR-T 세포 주입 후 모니터링하였다. 동물 윤리 승인에 따라 800mm3에서 1000mm3 사이의 종양 크기, 상당한 체중 감소 또는 낮은 임상 점수를 가진 마우스는 도태되었다. 이 난소암 종양 모델에서, 2세대 TAG-72 CAR-T 세포 치료는 초기에 종양의 크기를 감소시켰지만, CAR-T 세포 투여 후 약 30일째에 종양 재발이 관찰되었다 (도 6). 유전자 편집된 TAG-72 CAR-T 세포를 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 따라 생성하고 동일한 모델에서 생체내 효능에 대해 평가하였다. PD-1 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포는 TAG-72 CAR-T 세포의 항종양 활성 또는 지속성을 개선하지 않았다 (도 6). 그러나, RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자의 녹아웃은 TAG-72 CAR-T 요법의 항종양 활성 및 지속성을 상당히 개선시켰다. 게다가, RC3H1 및 RC3H2 이중 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-T 세포 (TAG-72 CAR/RC3H1,2 KO T 세포)는 상기 그룹에서 최고의 항종양 활성 및 지속성을 나타냈으며, 이는 모니터링 기간 동안 TAG-72 CAR/RC3H1,2 KO T 세포 처리된 마우스에서의 종양 재발의 완전한 예방에 의해 입증되었다 (도 7). A2AR 및 FAS 유전자 녹아웃은 또한 NSG 마우스 이종이식 모델에서 종양의 재발을 지연시킨 TAG-72 CAR-T 요법의 항종양 효능 및 내구성을 개선시켰다 (도 8). CRISPR에 의해 지시된 TGFβ수용체 1 및 2의 우세한 음성 돌연변이는 또한 TAG-72 CAR-T 세포의 지속성을 향상시켰으며, 이는 CAR-T 처리 후 60일부터 종양 부피의 보다 지속적인 제어에 의해 입증되었다 (도 9).
실시예 5 - CRISPR 및 생체 내 기능을 사용한 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 편집된 CD19 CAR-T 세포의 생성
[00178] CD19 CAR-T 세포 요법은 B 세포 악성 종양에 대해 승인된 최초의 성공적인 CAR-T 치료제이다 (Porter et al., N Engl J Med, 2011. 365(8): p. 725-33). CRISPR 유전자 녹아웃에 의해 향상된 CAR-T 세포의 항종양 활성이 OVCAR-3 종양 모델에 국한되지 않음을 확인하기 위해, TAG-72 항원 또는 TAG-72 CAR-T 세포, RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃이 있는 CD19 CAR-T 세포도 생체내 기능 평가를 위해 생성하였다. CD19 scFv-4-1BB-CD3 CAR 발현 카세트를 이전에 기재된 바와 같이 작제하였다 (Porter et al., N Engl J Med, 2011. 365(8): p. 725-33; Milone et al., Mol Ther, 2009. 17(8): p. 1453-64; see, 또한, WO2017088012). CD19 scFv-4-1BB-CD3 CAR 렌티바이러스 벡터를 제조하고 인간 활성화 T 세포로 형질도입하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD19 CAR-T 세포를 생성한 다음, 실시예 2에 기재된 바와 같이 RC3H1 gRNA (서열 번호: 2) 및/또는 RC3H2 gRNA (서열 번호: 4)에 의해 형성된 RNP 복합체에 의해 형질감염하여, CRISPR RC3H1 및/또는 RC3H 2 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포를 생성하였다.
CD19 CAR-T 세포 생체 내 세포독성 분석
[00179] T 세포의 생체 내 효능은 버킷 림프종 이종이식 모델에서 평가하였다. 상기 모델의 경우, 5x105 CD19 양성 Raji 림프종 세포를 6~10주령 NSG 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 접종 3일 후에 5x106 CAR-T 세포의 단일 용량을 마우스당 정맥 내 주사하였다. 종양 부피, 체중 및 임상 점수는 CD19 CAR-T 세포 주입 후 모니터링하였다. 동물 윤리 승인에 따라 800mm3에서 1000mm3 사이의 종양 크기, 상당한 체중 감소 또는 낮은 임상 점수를 가진 마우스는 도태되었다. 상기 림프종 종양 모델에서, CD19 CAR/RC3H1,2 KO T 세포 처리는 CD19 CAR-T 세포 처리와 비교하여 마우스에서 종양 성장을 유의하게 지연시키고 종양 보유 마우스의 중앙 생존을 개선시켰다 (도 10A-10B). 이러한 결과는 RC3H1 및 RC3H2 유전자의 녹아웃이 TAG-72 CAR-T 세포에서 관찰된 것과 유사하게 생체 내 CD19 CAR-T 세포의 항종양 활성을 개선함을 보여주었다.
실시예 6 - 지속적인 활성화 노출 후 CD19 CAR/RC3H1 및/또는 RC3H2 KO T 세포의 활성화 마커
[00180] RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃 CD19 CAR-T 세포를 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성하였다.
[00181] CD19 CAR T 세포 + RC3H1 및/또는 RC3H2 KO는 항원 노출 후 활성화 마커의 차이에 대해 평가하였다 (도 11). 조작된 CD19 과발현 세포주인 OVCAR-3(CD19)을 조사하고(30 Gy) 24웰 조직 배양 플레이트의 80,000개 세포/mL/웰로 시딩하였다. 제0일에 1x106 CAR-T 세포의 분취량 (RC3H1 및/또는 RC3H2 KO 포함 및 미포함)을 각 웰에 첨가하였고; 이러한 CAR-T 세포는 이후 7일 동안 조사된 OVCAR-3 (CD19) 세포의 손길이 닿지 않은 단층으로 매일 옮겼다. 7일 동안 계속된 항원 노출 후, 이펙터 세포를 원심분리를 통해 한 번 세척하고 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현을 평가하였다. 이러한 마커는 발현이 TCR 결찰과 연결된 초기 및 후기 활성화와 각각 관련되어 있다. CAR-T 세포에서 이러한 활성화 마커의 발현을 감지하기 위해 MACSQuant® Analyzer 10을 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. CAR 발현은 공동-발현된 GFP의 검출에 의해 간접적으로 검출하였다. CD69 및 CD25에 대한 세포 표면 염색은 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였고, 여기서 세포는 빛으로부터 보호하며 4 ℃에서 15분 동안 형광 결합 항체와 함께 배양하였다. 세포는 분석 전에 FACS 완충액으로 두 번 세척하였다. 프로피듐 아이오다이드 용액을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하였다. 데이터 분석은 FlowLogicTM 소프트웨어 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 수행하였다.
[00182] 계속된 항원 노출 후, 유전자 중 하나 또는 둘 모두가 결여된 CD19 CAR/RC3H1 및/또는 RC3H2 KO T 세포는 CAR+/CD25+/CD69+ 발현 세포의 빈도가 더 높다는 증거를 보여주었다. 증가가 통계적으로 유의하지는 않았지만, 이는 3개의 KO T 세포 모두에 걸쳐 일관되었고, 이는 비-형질감염된 CD19 CAR-T 세포와 비교하여 증가된 활성화를 나타낸다 (도 11).
실시예 7 - CRISPR 및 시험관내 기능을 사용한 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO T 세포의 생성
[00183] 유전자 녹아웃 면역 세포를 생성하는 방법이 CAR-T 세포에 국한되지 않음을 입증하기 위해 정상 T 세포에서도 동등한 CRISPR 유전자 녹아웃을 수행하였다.
[00184] CRISPR T 세포를 생성하기 위해, 인간 T 세포를 단리하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 CD3/CD28 비드를 사용하여 활성화시켰다. 활성화된 인간 T 세포는 활성화 3일 후 RC3H1 gRNA (서열 번호: 2) 및/또는 RC3H2 gRNA (서열 번호: 4)에 의해 형성된 RNP 복합체에 의해 형질감염하였고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 확장하였다.
[00185] 형질감염된 T 세포의 CRISPR 인델 빈도 및 유전자 녹아웃 효율은 또한 실시예 2에 기재된 바와 같이 ICE 분석에 의해 분석하였다. ICE 분석 결과, 이들 가이드 RNA는 또한 활성화된 인간 T 세포에서 프레임 외 인델을 포함하는 인델을 도입하는 높은 활성을 나타냈다(도 12).
T 세포의 장기간 활성화에 의한 시험관내 사멸 (도 13)
[00186] KO의 효과가 CAR-T 세포로 제한되었는지 여부를 결정하기 위해, 정상 T 세포는를 TCR 및 CD28 공동-액세서리 분자를 통해 다클론적으로 활성화하였다 (도 13). RC3H1 및/또는 RC3H2 KO T 세포를 CD3/CD28 비드의 존재하에 1:1의 비드 대 세포 비율로 적어도 92 시간 동안 유지하였다. 세포 계수는 대략 24시간마다 수행하였고, 이에 따라 신선한 비드를 추가하였다. 계속된 활성화 후, RC3H1 및/또는 RC3H2 KO T 세포는 20시간 모니터링 기간 동안 비형질감염(NT) T 세포와 비교하여 시험관 내에서 개선된 기능을 나타냈다. 차이가 통계적으로 유의하지는 않았지만, 3개의 KO T 세포 각각은 형질감염되지 않은 T 세포보다 표적 종양 세포를 죽이는 데 더 효율적이었으며, 이는 KO T 세포의 장기간 활성화가 사멸 기능의 "고갈"을 초래하지 않을 수 있음을 나타낸다.
실시예 8 - CRISPR를 사용한 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포의 생성(CAR 포함 및 미포함)
[00187] 유전자 녹아웃 면역 세포를 생성하는 방법이 단지 T 세포에 국한되지 않음을 입증하기 위해 NK-92 세포에서도 동등한 CRISPR 유전자 녹아웃을 수행하였다 (도 1B). NK-92는 암 표적에 대한 높은 세포독성을 가진 자연살해(NK) 세포주이다. NK-92 기능은 CAR 발현을 포함한 유전자 변형을 통해 향상될 수 있다 (Klingemann et al., Front Immunol, 2016. 7: p. 91). NK-92 세포주는 200U/mL IL-2 및 소 태아 혈청이 포함된 RPMI-1640 배지에서 유지 및 확장하였다.
[00188] RC3H1 및 RC3H2 유전자 녹아웃 NK-92 세포 (각각 RC3H1 KO NK-92 세포 및 RC3H2 KO NK-92 세포)를 생성하기 위해, NK-92 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 RC3H1 gRNA(서열 번호: 2) 및/또는 RC3H2 gRNA(서열 번호: 4)에 의해 형성된 RNP 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염된 NK-92 세포의 CRISPR 인델 빈도 및 유전자 녹아웃 효율은 또한 실시예 2에 기재된 바와 같이 ICE 분석에 의해 분석하였다. ICE 분석 결과는 이러한 가이드 RNA가 높은 빈도로 NK-92 세포에서 프레임 외 인델을 포함하는 인델을 도입할 수 있음을 보여주었다 (도 14).
[00189] TAG-72 CAR/RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포를 생성하기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 TAG-72 CAR 렌티바이러스 벡터를 사용하여 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포를 형질도입하였다.
실시예 9 - RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 및 TAG-72 CAR/RC3H KO NK-92 세포의 시험관 내 기능
[00190] 렌티바이러스 TAG-72 CAR 벡터를 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 생성된 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포를 형질도입하였다. RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 + CAR 세포가 생성되었고 10% FBS 및 100U/mL IL-2가 보충된 L-글루타민이 있는 RPMI-1640의 배양물에서 일상적으로 유지하였다. 배양에서 적어도 3일 후, 형질도입 효율을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 또한, RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 ± CAR 세포가 암 세포를 제거하는 능력을 시험관 내에서 평가하였다.
[00191] 실시간 세포 모니터링 시스템 (xCELLigence®)을 사용하여 시험관 내에서 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포의 사멸 효율을 결정하였다. 표적 세포 (10,000 표적 세포/100uL) (예를 들어 난소암 세포주 MES-OV 또는 OVCAR-3)를 10-20% FBS가 보충되며, (OVCAR-3)를 가지거나 또는 (MES-OV) 소 인슐린을 가지지 않는 배양 배지 (예를 들어, McCoy's 5a 또는 RPMI-1640 기본 배지) 에 재현탁하고 RTCA 플레이트에 분배하였다. 표적 세포는 세포 부착을 허용하기 위해 적어도 5시간 동안 37°C, 5% CO2에서 유지하였다. 표적 세포의 부착 후, RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 이펙터 세포를 1:1의 E:T 비율로 첨가하였다. 동시에, 형질감염되지 않은 NK-92 세포를 표적 세포와 공동 배양하여 시험관내 NK-92 세포의 배경 기능을 입증하였다. 모든 공동 배양은 최소 40 시간 동안 최적의 성장 조건에서 유지하였다. 세포 임피던스를 전체적으로 모니터링하였다.
[00192] 종양 세포를 용해시키기 위한 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포의 능력을 비교하기 위해, 종양 세포 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포 또는 형질감염되지 않은 NK-92 세포와 함께 인큐베이션하고, 시험관 내 세포독성을 xCELLigence®로 모니터링하였다. 모든 NK-92 세포 (도 15A, 왼쪽)는 MES-OV 세포와 공동 배양할 때 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 형질전환되지 않은 NK-92 대조군과 비교할 때 RC3H2 KO NK-92 세포 및 RC3H1,2 KO NK-92 세포에서 개선되어 시험관 내 기능의 향상을 입증하였다. 추가로, 모든 NK-92 세포 (도 15A, 오른쪽)은 NCI의 감소에 의해 입증된 바와 같이 OVCAR-3 세포와 공동 배양될 때 세포독성 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 형질전환되지 않은 NK-92 대조군 조건과 비교하여 각각 RC2H2 KO NK-92 세포 및 RC2H1/2 KO NK-92 세포에서 개선되어 시험관 내 기능의 향상을 나타내었다.
[00193] TAG-72 CAR NK-92 세포로 유사한 분석을 수행하였다. TAG-72 CAR NK-92 세포의 RC3H1 및/또는 RC3H2 KO NK-92 세포로의 형질도입을 확인하기 위해 흐름 분석을 수행하였으며 (실시예 1에 기재된 바와 같음), 여기서 GFP를 CAR의 통합 및 발현을 위한 대리물로 사용하였다 (도 15B). 값은 잔해물(debris) 및 이중체(doublet)가 부모 게이트에서 제외된 생존 세포의 백분율로 표현된 % CAR(GFP)을 나타낸다.
[00194] 종양 세포를 용해시키기 위한 RC3H1 및/또는 RC3H2 유전자 녹아웃 TAG-72 CAR-NK-92 세포의 능력을 비교하기 위해, 암 세포주 (이 경우에 OVCAR-3)를 TAG-72 CAR NK-92 세포 + RC3H1 및/또는 RC3H2 KO와 함께 공동배양하고, 시험관 내 세포독성을 xCELLigence®로 모니터링하였다. TAG-72 CAR을 보유하는 모든 NK-92 세포(도 15C)는 NCI의 안정기 또는 감소에 의해 입증된 바와 같이 OVCAR-3 세포와 공동-배양될 때 세포독성 효과를 나타냈다. 이러한 효과는 공동 배양 40시간 이내에 TAG-72 CAR/RC3H1 KO NK-92 세포, TAG-72 CAR/RC3H2 KO NK-92 세포 및 TAG-72 CAR/RC3H1,2 KO NK-92 세포에서 유의하게 더 크며, 시험관 내에서 기능의 향상을 입증하였다.
실시예 10 - CRISPR를 사용한 유전자 KO iPSC의 생성
[00195] 줄기 세포 예컨대 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)는 무제한으로 자가 재생될 수 있으며 조혈줄기세포(HSC) 및 면역 세포를 비롯한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다. T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포는 이전에 암 치료를 위해 iPSC에서 생성되었다 (Themeli et al., Nat Biotechnol, 2013. 31(10): p. 928-33; Li et al, Cell Stem Cell, 2018. 23(2): p. 181-192 e5). CRISPR 유전자 녹아웃 T 또는 NK 세포는 유사한 방법에 따라 iPSC로부터 유래될 수 있다 (도 16). CRISPR RC3H1 및 RC3H2 유전자 이중 녹아웃 (RC3H1,2 KO iPSC) 및 A2AR 유전자 녹아웃 iPSC (A2AR KO iPSC)를 생성하기 위해, 대표적인 gRNA (RC3H1, 서열 번호: 2; RC3H2, 서열 번호: 4; A2AR, 서열 번호: 7)에 의해 생성된 RNP를 Lonza 4D Nucleofector 시스템을 사용하여 iPSC로 형질감염시켰다. 먼저, 12웰 플레이트에 PBS 중 Laminin-521 (STEMCELL Technologies)을 코팅하고 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. iPSC는 형질감염 전 2시간 동안 RevitaCellTM Supplement (Life Technologies)를 함유하는 mTeSR PlusTM 배지(STEMCELL Technologies)와 함께 사전 인큐베이션하였다. 전장 gRNA를 Lonza P3 완충액 및 Cas-9와 결합하여 RNP를 제조하였다. 이어서, RNP 혼합물을 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, iPSC는 Accutase® (Life Technologies)를 사용하여 단일 세포로 들어올리고 전기천공을 위해 반응당 1 x 106 세포를 수득하였다. 유전자 녹아웃 iPSC를 생성하기 위해 Lonza P3 완충액의 세포와 RNP 혼합물을 PCR 튜브에 결합한 다음 전기천공을 위해 Lonza 4D Nucleofector에 로드하였다. 그 다음, CloneRTM 배지 (STEMCELL Technologies)가 있는 mTeSR PlusTM을 반응에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 CloneRTM 배지와 함께 mTeSR PlusTM의 Laminin-521 사전 코팅된 플레이트에 첨가하였다. mTeSR PlusTM로 매일 배지 교체를 72시간 동안 수행하고 ~80% 세포합류(confluency)에 도달하면 (전기천공 후 6-7일) 세포를 계대하였다. 형질감염 후, 다능성 줄기 세포 유사 형태를 가지는 RC3H1,2 KO iPSC 및 A2AR KO iPSC 콜로니가 배양물에서 유지하였다 (도 17A 및 21A).
[00196] 형질감염되지 않은 iPSC 및 형질감염된 iPSC를 Laminin-521의 mTeSR PlusTM에서 배양하고 EVOS® 명시야 현미경을 사용하여 10x로 이미지화하였다. 세포를 Accutase®를 통해 들어올려 단일 세포로 수집하였다. 제조 업체 권장 사항에 따라 TRA-1-60 (Miltenyi Biotec), TRA-1-81 (STEMCELL Technologies) 및 SSEA-4 (Miltenyi Biotec)를 표적화하는 항체를 사용하여 염색하였다. TRA-1-60, TRA-1-81 및 SSEA-4는 만능 줄기 세포에서 발현되는 표면 수용체이며 iPSC를 특성화하는 일반적인 관행으로 간주된다 (Baghbaderani et al. 2015, Stem Cell Reports). 세포는 염색되지 않은 샘플 및 적절한 동형 대조군과 함께 MACSQuant® 유세포 분석기 (Miltenyi Biotec)를 통해 분석하였다. 죽은 세포 (PI 염색을 통해), 잔해물 및 이중체를 차단하였고; FlowLogicTM을 사용하여 히스토그램 플롯을 생성하였다 (RC3H1,2 KO의 경우 도 17A-17B 및 A2AR KO의 경우 도 21A-21B). KO가 있거나 없는 iPSC는 TRA-1-60, TRA-1-81 및 SSEA-4에 대해 거의 동일한 다능성 마커를 표시했으며, 모두 >95%에서 공동-발현되었다 (도 17B 및 21B). iPSC 모폴로지에는 시각적 차이가 없었으며 (도 17A 및 21A), 이는 RC3H1 및 RC3H2 이중 KO 또는 A2AR KO가 iPSC 유지 및 다능성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
[00197] 형질감염된 iPSC 세포의 CRISPR 인델 빈도 및 유전자 녹아웃 효율은 실시예 2에 기재된 바와 같이 ICE 분석에 의해 분석하였다. ICE 분석 결과는 gRNA가 iPSC에서 프레임 외 인델을 포함하는 고주파수에서 삽입결실을 생성함을 보여주었다 (RC3H1,2 KO의 경우 도 18A-18C 및 A2AR KO의 경우 도 22A-22C).
[00198] 요약하면, 실시예의 데이터는 본 발명에 설명된 유전자 편집된 iPSC가 CD34+/HE/HSC로 분화한 다음 암 치료에서 후속 사용을 위해 알려진 방법을 사용하여 NK, NKT 또는 T 세포와 같은 면역 세포로 분화할 수 있음을 입증한다.
실시예 11 - RC3H1 및 RC3H2 KO(RC3H1,2 KO) iPSC의 iNK 세포로의 분화 (편집된 iNK 세포)
iCD34+ 세포
[00199] 수용체 CD34는 면역 세포를 생성하기 위한 플랫폼을 형성하는 줄기 세포 공급원인 HE 및 HSC에서 발현된다. iPSC에서 CD34+ 세포로의 분화는 iPSC 유래 면역 세포를 생성할 수 있는 전제 조건이자 필수적이다 (Sturgeon et al. Nature Biotechnology, 2014 vol 32 (6) p554-561, Knorr et al. STEM CELLS Translational Medicine vol 2 (4) p274-283, Zeng et al, Stem Cell Reports, 2017 vol 9 (6) p1796-1812). iPSC와 면역 세포 사이의 중간 세포 유형으로서 CD34+ 발현의 특성화는 일반적인 관행으로 간주되며, iPSC에 유전자-KO를 포함하는 것이 초기 개발 동안 잠재적인 분화 경로를 방해하지 않는다는 것을 입증하는 핵심 단계이다.
[00200] 형질감염되지 않은 및 형질감염된 iPSC (RC3H1,2 KO 함유)를 제조업체의 지침에 따라 STEMdiff™조혈 키트 (STEMCELL Technologies)를 사용하여 iCD34+ 세포로 분화시켰다. 제조업체 권장 사항에 따라 CD34 (Miltenyi Biotec)를 표적화하는 항체를 사용하여 세포를 단리하고 염색하였다. 세포는 염색되지 않은 샘플 및 적절한 동형 대조군과 함께 MACSQuant® 유세포 분석기 (Miltenyi Biotec)를 통해 분석하였다. 죽은 세포 (PI 염색을 통해), 잔해물 및 이중체를 차단하였고; 데이터 분석은 FlowLogicTM를 사용하여 수행하였다.
[00201] RC3H1,2 KO가 포함되거나 포함되지 않은 iPSC (도 19)를 iCD34+ 세포로 분화시켰다. 이러한 데이터는 RC3H1,2 KO iPSC에서 iCD34+ 세포의 성공적인 생성을 입증하며, iPSC에서 모든 중간 표현형을 통해 CD34 발현 세포를 포함하는 세포 집단으로 전환하는 데 필요한 주요 개발 경로가 손상되지 않은 상태로 남아 있음을 나타낸다.
iNK 세포
[00202] RC3H1,2 KO를 포함하는 iPSC는 iNK 면역 세포로 분화할 수 있다.
[00203] 유전자 녹아웃 iCD34+ (RC3H1,2 KO iPSC에서 유래)는 IL-15, FLT3 및 IL-7을 포함한 사이토카인의 조합에 의해 구동되는 iNK 세포로 추적으로 분화시켰다. iNK 세포는 공개된 방법 예컨대 미국 특허 9,260,696 B2 (Kaufman, Knorr)에 기재된 방법을 사용하여, [Li et al. (Stem Cell, 23 (2018) 181-197)]에 의해, 또는 상업적으로 입수 가능한 배양 시스템 StemSpan™NK Cell Generation Kit (Stem Cell Technologies)를 사용하여 제조될 수 있다.
[00204] 분화된 세포를 분리하고 제조 권장 사항에 따라 CD56 (Miltenyi Biotec), NKp46 (Miltenyi Biotec) 및 NKG2D (Miltenyi Biotec)를 표적화하는 항체를 사용하여 염색하였다. 분화된 세포는 염색되지 않은 샘플 및 적절한 동형 대조군과 함께 MACSQuantTM 유세포 분석기 (Miltenyi Biotec)를 통해 분석하였다. 죽은 세포 (PI 염색을 통해), 잔해물 및 이중체를 차단하였고; 데이터 분석은 FlowLogicTM를 사용하여 수행하였다 (도 20). NK 기능적 수용체 (NKp46 및 NKG2D)의 발현은 iCD56+ 세포가 NK-특이적 세포독성 기능을 할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 12 - A2AR KO iPSC의 iNK 세포로의 분화 (편집된 iNK 세포)
iCD34+ 세포
[00205] 형질감염되지 않은 및 형질감염된 iPSC (A2AR KO 함유)를 제조업체의 지침에 따라 STEMdiff™조혈 키트 (STEMCELL Technologies)를 사용하여 iCD34+ 세포로 분화시켰다. 제조업체 권장 사항에 따라 CD34 (Miltenyi Biotec)를 표적화하는 항체를 사용하여 세포를 단리하고 염색하였다. 세포는 염색되지 않은 샘플 및 적절한 동형 대조군과 함께 MACSQuant® 유세포 분석기 (Miltenyi Biotec)를 통해 분석하였다. 죽은 세포 (PI 염색을 통해), 잔해물 및 이중체를 차단하였고; 데이터 분석은 FlowLogicTM를 사용하여 수행하였다.
[00206] A2AR KO가 포함되거나 포함되지 않은 iPSC (도 23)를 iCD34+ 세포로 성공적으로 분화시켰다. 이러한 데이터는 A2AR KO iPSC에서 iCD34+ 세포의 생성을 입증하며, iPSC에서 모든 중간 표현형을 통해 CD34 발현 세포를 포함하는 세포 집단으로 전환하는 데 필요한 주요 개발 경로가 손상되지 않은 상태로 남아 있음을 나타낸다.
iNK 세포
[00207] A2AR KO를 포함하는 iPSC는 iNK 면역 세포로 분화할 수 있다.
[00208] 형질감염되지 않은 iCD34 (형질감염되지 않은 iPSC로부터 유래) 및 유전자 녹아웃 iCD34+ (유전자 녹아웃 iPSC에서 유래)는 IL-15, FLT3 및 IL-7을 포함한 사이토카인의 조합에 의해 구동되는 iNK 세포로 추적으로 분화시켰다. iNK 세포는 공개된 방법 예컨대 미국 특허 9,260,696 B2 (Kaufman, Knorr)에 기재된 방법을 사용하여, [Li et al. (Stem Cell, 23 (2018) 181-197)]에 의해, 또는 상업적으로 입수 가능한 배양 시스템 StemSpan™NK Cell Generation Kit (Stem Cell Technologies)를 사용하여 제조될 수 있다.
[00209] 분화된 세포를 유세포 분석에 의해 NK 세포 마커의 발현에 대해 평가하였다. 도 24에 제시된 CD56+ 히스토그램이 형질감염되지 않은 또는 형질감염된 iPSC 샘플로부터 생성된 배양물 중 모든 살아있는 세포를 나타내도록 죽은 세포, 잔해물 및 이중체를 차단하였다. 염색되지 않은 샘플은 각각의 수용체에 대한 각 항체의 명확한 양성 염색을 나타내기 위해 제시된다. 적절한 동형 대조군은 음성이었다. NK 기능적 수용체 (NKp46, NKp30, NKp44 및 NKG2D)의 발현은 iCD56+ 세포가 세포독성 기능을 할 수 있는 iNK 세포임을 재확인한다.
실시예 13 - 편집된 iNK 세포의 기능
[00210] A2AR KO iPSC를 생성하고 (실시예 10) 편집된 iNK 세포로 분화시켰다 (실시예 12). 그런 다음 iNK 세포를 20-40일 후에 수집하고 후속 기능 분석에 사용하였다.
[00211] 암 세포를 사멸하는 iNK 세포의 능력은 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하여 시험관 내에서 평가하였다. 표적 세포 (10,000/100uL) (예를 들어 난소암 세포주 OVCAR-3)를 10-20% FBS 및 소 인슐린이 보충된 배양 배지 (예를 들어, L-글루타민이 있는 RPMI-1640 기본 배지) 에 재현탁하고 RTCA 플레이트에 분배하였다. 표적 세포는 세포 부착을 허용하기 위해 적어도 5시간 동안 37°C, 5% CO2에서 유지하였다. 표적 세포의 부착 후, iNK 이펙터 세포를 1:1의 E:T 비율로 첨가하였다. 동시에, iPSC 유래 iNK 세포를 표적 세포와 공동 배양하여 시험관 내에서 형질감염되지 않은 iNK 세포의 배경 기능을 입증하였다. 모든 공동 배양은 최소 10 시간 동안 최적의 성장 조건에서 유지하였다. 전체에 걸쳐, 세포 임피던스를 모니터링하고 여기에서 이펙터 세포의 추가 시간에 대해 정규화가 일어나는 NCI로 제시하였다. 표적 세포 단독 (대조군)에 대한 iNK + A2AR KO 이펙터 세포 (테스트)의 퍼센트 세포독성 (% 세포독성)은 공동배양 5 시간 및 10 시간 이후 다음의 방정식을 사용하여 계산하였다:
((정규화된 세포 지수대조군 - 정규화된 세포 지수테스트)/정규화된 세포 지수대조군) x 100
[00212] 종양 세포를 용해시키기 위한 A2AR KO iPSC-유도된 iNK 세포 (A2AR KO iNK 세포)의 능력을 비교하기 위해, 종양 세포주를 A2AR KO iNK 세포 또는 NT iNK 세포와 함께 인큐베이션하고, 시험관 내 세포독성을 xCELLigence®로 모니터링하였다. NT iNK 세포는 OVCAR-3 표적 세포와 공동-배양될 때 세포독성 효과를 입증하였다 (도 25A). 이러한 효과는 형질전환되지 않은 대조군과 비교하여 A2AR KO iNK 세포에서 개선되었으며, 이는 시험관 내에서 기능의 향상을 입증한다. 또한, 5시간의 공동 배양 (도 25B, 왼쪽) 및 10시간의 공동 배양 후 세포독성은 모두 A2AR KO iNK에서 더 높은 세포독성을 나타내었다 (도 25B, 오른쪽). 종합하면, 이러한 데이터는 A2AR KO가 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 T 세포뿐만 아니라 iNK 세포에서도 항종양 활성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
[00213] 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 기사 및 학술 기사를 비롯한 다양한 간행물이 명세서 전체에 인용된다. 인용된 각 간행물은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
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Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 8 ctcctcggtg tacatcacgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 gtgactgaca tcaactccaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 ggagttgatg tcagtcactt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 ctcgatggtg aatgacagtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 ggtgaatgac agtgcggttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 ccatcgagtg ccaaatgaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 gcttctgctg ccggttaacg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 15 ttgaactcag cttctgctgc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 16 gcagaagctg agttcaacct 20 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (59)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 ataatgaatt tgatgagaat gtgcacaaac ccatcangtt aangttgttc acacantgnn 60 tgcaan 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 18 ataatgaatt tgatgagaat gtgcacaaac ccatcagttt aggttgttca cacactgttt 60 gcaaga 66 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 tgatgagaat gtgcacaaac ccatcnagtt taggttgttc acacactgtt tgcaagacct 60 gcttgaataa acttc 75 <210> 20 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 20 tgatgagaat gtgcaacact gtttgcaaga cctgcttgaa taaacttca 49 <210> 21 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 21 tgatgagaat gtgcacaaac ccatctttag gttgttcaca cactgtttgc aagacctgct 60 tgaataaact tca 73 <210> 22 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 22 tgatgagaat gtgcacaaac ccatcgttta ggttgttcac acactgtttg caagacctgc 60 ttgaataaac ttca 74 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 23 tgatgagaat gtgcacaaac ccatcaggtt gttcacacac tgtttgcaag acctgcttga 60 ataaacttca 70 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 24 tgatgagaat gtgcacaaac ccatcagttt aggttgttca cacactgttt gcaagacctg 60 cttgaataaa cttca 75 <210> 25 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 25 tgatgagaat gtgcacaaac ccacactgtt tgcaagacct gcttgaataa acttca 56 <210> 26 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 26 tgatgagaat gtgcacaaac ccatcttagg ttgttcacac actgtttgca agacctgctt 60 gaataaactt ca 72 <210> 27 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 27 ttgtaactcc agaagaatgc ctgtacaagc tccaacaagg gacggatttc ccctccggcc 60 cattt 65 <210> 28 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 28 ttgtaactcc agaagaatgc ctgtacaagc tccacaatgg acggatttcc tctcctgccc 60 aattt 65 <210> 29 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 29 ataatgaatt tgatgagaat gtgcacaaac ccatcaagtt taggttgttc acacactgtt 60 tgcaaa 66 <210> 30 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 30 ataatgaatt tgatgagaat gtgcacaaac ccatcagttt aggttgttca cacactgttt 60 gcaaga 66 <210> 31 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 31 ggccatgccc atcatgggct cctcggttgt acatcacggt ggagctggcc attgctgtgc 60 tggccat 67 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 32 ggccatgccc atcatgggct cctcggtgta catcacggtg gagctggcca ttgctgtgct 60 ggccat 66 <210> 33 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 atcatgggct cctcggtgta catcancggt ggagctggcc attgctgtgc tggccatcct 60 gggcaatgtg ctggt 75 <210> 34 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 34 atcatgggct cctcggtgga gctggccatt gctgtgctgg ccatcctggg caatgtgctg 60 gtg 63 <210> 35 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 35 atcatgggct cctcggtgta catcacggtg gagctggcca ttgctgtgct ggccatcctg 60 ggcaatgtgc tggtg 75 <210> 36 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 36 atcatgggct cctcggttgg ccattgctgt gctggccatc ctgggcaatg tgctggt 57 <210> 37 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 37 atcatgggct cctcggttgg agctggccat tgctgtgctg gccatcctgg gcaatgtgct 60 ggtg 64 <210> 38 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide, "N" represents any nucleotide <400> 38 atcatgggct cctcggtggt ggagctggcc attgctgtgc tggccatcct gggcaatgtg 60 ctggtg 66

Claims (48)

  1. 면역 세포의 기능을 향상시키는 방법으로서,
    RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하도록 면역 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 면역 세포로 분화할 수 있는 줄기 세포를 변형시키는 방법으로서,
    RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하도록 줄기 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 변형된 줄기 세포를 면역 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 유전자의 기능은 면역 세포에서 억제되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 기능의 억제는 유전자 편집 시스템에 의해 달성되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas, TALEN 및 ZFN으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 가이드 RNA는 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 16로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적화 하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, CRISPR/Cas 시스템은 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4로 구성된 군으로부터 선택된 가이드 RNA 의존성 뉴클레아제를 활용하는 것인 방법.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 대식 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 기능의 억제는 선택적으로 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 또는 안티센스 핵산을 통해 mRNA의 수준 또는 기능을 감소시킴으로써 달성되는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 기능의 억제는 임의로 항체 또는 소분자의 사용을 통해 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수준 또는 활성을 감소시킴으로써 달성되는 것인 방법.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 제조된 변형된 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 제조된 변형된 면역 세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 표적 항원은 TAG-72, CD19, CD20, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파 (FRα), 및 BCMA으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H1인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H2인 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 A2AR인 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 FAS인 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR1인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR2인 것인 방법.
  21. 제1항 또는 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되거나, 또는 제2항 또는 제4항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 변형된 줄기 세포로부터 분화된 면역 세포.
  22. 변형된 면역 세포로서, 적어도 하나의 유전자의 기능이 상기 변형된 면역 세포에서 억제되며, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 변형된 면역 세포.
  23. 제22항에 있어서, 유전자 기능의 억제는 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 기능, 또는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 수준 또는 활성 감소로부터 기인하는 것인 변형된 면역 세포.
  24. 제22항에 있어서, 유전자 기능의 억제는 유전자의 핵산 서열의 변형으로부터 기인하는 것인 변형된 면역 세포.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 대식 세포로부터 선택되는 것인 변형된 면역 세포.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것인 변형된 면역 세포.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 면역 세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식하는 것인 변형된 면역 세포.
  28. 제27항에 있어서, 표적 항원은 TAG-72, CD19, CD20, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파 (FRα) 및 BCMA로 구성된 군으로부터 선택된 변형된 면역 세포.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H1인 것인 변형된 면역 세포.
  30. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H2인 것인 변형된 면역 세포.
  31. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 A2AR인 것인 변형된 면역 세포.
  32. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 FAS인 것인 변형된 면역 세포.
  33. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR1인 것인 변형된 면역 세포.
  34. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR2인 것인 변형된 면역 세포.
  35. 적어도 하나의 유전자의 핵산 서열 중 변형을 포함하는 면역 세포로 분화할 수 있는 변형된 줄기 세포로서, 상기 변형은 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하고, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H1, RC3H2, A2AR, FAS, TGFBR1 및 TGFBR2로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 변형된 줄기 세포.
  36. 제35항에 있어서, 유도된 만능 줄기 세포인 것인 변형된 줄기 세포.
  37. 제36항에 있어서, 유도된 만능 줄기 세포는 3개의 HLA 유전자형에 동형 접합인 공여자 세포로부터 생성된 것인 변형된 줄기 세포.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 변형된 줄기세포.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H1인 것인 변형된 줄기 세포.
  40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 RC3H2인 것인 변형된 줄기 세포.
  41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 A2AR인 것인 변형된 줄기 세포.
  42. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 FAS인 것인 변형된 줄기 세포.
  43. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR1인 것인 변형된 줄기 세포.
  44. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 TGFBR2인 것인 변형된 줄기 세포.
  45. 면역 세포의 기능을 향상시키기 위한 조성물로서, 표적 유전자의 서열을 편집할 수 있는 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하며,
    여기서 가이드 RNA는 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 16로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 것인 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 뉴클레아제는 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  47. 대상체의 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 병태는 암, 감염, 자가면역 장애, 기관의 섬유증, 또는 자궁내막증인 것인 방법.
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