CN117015608A - 用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法。本文公开了用于修饰能够分化成免疫细胞的干细胞或祖细胞以抑制至少一种选自DGKα和DGKζ的基因的功能，并且指导该干细胞或祖细胞向增强的免疫细胞分化的方法。本文还公开了通过本发明方法制备的免疫细胞或干细胞，以及免疫细胞在治疗性治疗中的用途。

Description

用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法和组 合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年2月10日提交的美国临时申请No.63/147,933以及于2021年8月25日提交的63/236,828的优先权的权益，其内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法。更具体地，本文公开了用于修饰能够分化成免疫细胞的干细胞或祖细胞以抑制至少一种选自DGKα和DGKζ的基因的功能，并且指导该干细胞或祖细胞向增强的免疫细胞分化的方法。本文还公开了通过本发明方法制备的免疫细胞或干细胞，以及免疫细胞在治疗性治疗中的用途。

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2022年1月27日创建的ASCII文本文件中的序列表(命名为39095WO_SequenceListing.txt，8KB)以引用方式并入本文。

背景技术

本说明书中对任何先前出版物(或由其衍生的信息)、或任何已知事项的引用不是且不应视为确认或承认或以任何形式暗示：该先前出版物(或由其衍生的信息)或已知事项构成了本说明书所涉及的致力领域中的公知常识的一部分。

恶性肿瘤或癌症以不受控制的方式生长，侵入正常组织，并且通常转移并生长在远离起源组织的部位。一般来讲，癌症衍生自一种或仅数种正常细胞，这些细胞经历了称为恶性转化的了解甚少的过程。癌症几乎可以由身体的任何组织产生。衍生自上皮细胞的那些(称为癌)是最常见的癌症种类。肉瘤是间叶组织的恶性肿瘤，由细胞如成纤维细胞、肌细胞和脂肪细胞产生。淋巴组织的实体恶性肿瘤称为淋巴瘤，并且淋巴细胞和其它造血细胞的骨髓和血源性恶性肿瘤称为白血病。

癌症是工业化国家三大死因之一。随着感染性疾病治疗和心血管疾病预防的不断改善，以及平均预期寿命的增加，癌症很可能成为这些国家中最常见的致命疾病。因此，成功治疗癌症需要在不使患者致死的情况下移除或破坏所有恶性细胞。实现这一目标的理想方式是诱导针对肿瘤的免疫反应，该免疫反应区分肿瘤细胞及其正常细胞对应物。

免疫疗法是利用身体的自身免疫系统的最近出现的新治疗领域。这种治疗可以使用从活体生物获得或在实验室中产生的细胞，如T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等，这些细胞是增强的并注射到患者的体内，以有助于其免疫系统对抗癌症、感染和其它疾病。几种类型的免疫疗法目前正在开发当中。

这些治疗中的一些使用表达嵌合抗原受体(CAR-T细胞)的T细胞，这些细胞显示极其有效地在疾病如急性淋巴细胞性白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)中杀伤肿瘤细胞。经批准的靶向B细胞抗原CD19的产品通过将CAR基因构建体引入患者衍生的(“自体同源”)T细胞中而产生(Kershaw等人,Gene-engineered T cells for cancer therapy,Nat RevCancer,2013,13(8):525-41)。靶向其它血细胞标记，如其它血液恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤)的B细胞成熟抗原(BCMA)的额外自体同源产品正在开发当中(Sadelain等人,Therapeutic T cell engineering,2017,Nature,545(7655):423-431)。

其它治疗已成功地利用针对血液恶性肿瘤的NK细胞。基因编辑工具已被应用于NK和CAR-NK细胞以增强治疗效应。细胞因子(如IL-15和IL-2)的自主分泌或膜结合表达可以改善NK细胞的扩增和持久性(Nagashima等人,Stable transduction of theinterleukin-2gene into human natural killer cell lines and their phenotypicand functional characterization in vitro and in vivo,Blood,1998年5月15日,第91卷(10),第3850-61页；Hoyos等人,Engineering CD19-specific T lymphocytes withinterleukin-15and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemiaeffects and safety,Leukemia,2010年6月,第24卷(6),第1160-70页；Imamura等人,Autonomous growth and increased cytotoxicity of natural killer cellsexpressing membrane-bound interleukin-15,Blood,2014年8月14日,第124卷(7),第1081-8页)。T细胞中主要研究的靶向免疫检查点也在NK细胞中显示出有前景性的结果。敲除TIGIT(NK细胞检查点受体)显示出防止NK细胞衰竭并促进抗肿瘤活性(Zhang等人,Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion andelicits potent anti-tumor immunity,Nature Immunology,2018年7月,第19卷(7),第723-73页)。此外，来自肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞因子受体(如A2AR、TGFβR2)的基因破坏显示出中和来自TME的抑制并且恢复NK细胞效应子功能(Wang等人,SMAD4 promotesTGF-beta-independent NK cell homeostasis and maturation and antitumorimmunity,The Journal of clinical investigation,2018年11月01日,第128卷(11),第5123-5136页；Rouce等人,The TGF-beta/SMAD pathway is an important mechanism forNK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia,Leukemia,2016年4月,第30卷(4),第800-811页；Young等人,A2AR Adenosine Signaling SuppressesNatural Killer Cell Maturation in the Tumor Microenvironment,Cancer research,2018年2月15日,第78卷(4),第1003-1016页)。

与T细胞和CAR-T细胞相比，基于NK细胞和CAR-NK细胞的治疗呈现出几种优势，如(1)更好的安全性，特别是在潜在危及生命的不良事件如细胞因子释放综合征和移植物抗宿主病方面，(2)影响细胞毒活性的多种机制，以及(3)“现货型”制造的较高可行性(Xie等人,CAR-NK cells:A promising cellular immunotherapy for cancer,EBioMedicine,2020年9月,第59卷；Liu等人,Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors,The New England journal of medicine,2020年2月6日,第382卷(6),第545-553页)。

虽然基于细胞的免疫疗法在针对基于血液的癌症的临床试验中显示出令人印象深刻的结果，但在实体瘤的治疗中尚未取得类似的结果。对于实体瘤中的功效相对缺乏存在着多种原因，包括进入肿瘤部位受限、肿瘤微环境的免疫抑制性质，以及缺乏实体瘤特异性靶抗原。

此外，所施用的CAR细胞缺乏持久性和“衰竭”是持续观察到的局限性(Newick等人,CAR T Cell Therapy for Solid Tumours,Annu Rev Med,2017,68:139-152)。

抑制性受体如CTLA-4、PD-1或LAG-3可以减弱CAR-T细胞的活化并加速T细胞衰竭。在通过基因组编辑破坏PD-1之后，预计T细胞的抗肿瘤活性得到改善(Liu等人,CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells,Cell Res,2017,27(1):154-157)。然而，T细胞上PD-1的消融也可能增大对衰竭的易感性，降低寿命，并且无法改善抗肿瘤效应(Odorizzi等人,Genetic absence of PD-1promotes accumulation ofterminally differentiated exhausted CD8+T cells,J Exp Med,2015,212(7):1125-37)。出于这些原因，免疫细胞中的基因编辑是否增强抗肿瘤活性需要根据具体情况进行评价。

工程化免疫细胞显然是一种针对癌症的潜在武器，并因此挑战之一是在数量上生成、扩增和保留它们。免疫细胞由造血干细胞(HSC)创建，而造血干细胞继而由多能性干细胞(PSC)创建。因此，PSC技术是极具前景性的技术，因为在理论上PSC提供了无限的可再生细胞来源。

发明内容

本发明涉及用于将细胞(如人PSC)基因编辑并分化成造血干细胞样细胞并且最终分化成功能性免疫细胞的组合物和方法，其中此类免疫细胞具有相对于等同的非基因编辑的免疫细胞的益处。本领域的技术人员应当理解，缺失一种或多种非冗余细胞基因可能显著影响正常细胞功能，并且实际上可使得细胞无活力、无功能，或者在干细胞的情况下不能分化成功能性细胞。本发明公开了iPSC中DGKα和/或DGKζ基因的基因敲除(KO)，并且令人惊奇地证明DGK KO iPSC是有活力的并且能够分化成DGK KO免疫细胞，特别是NK和T细胞。此外，DGK KO NK细胞在体外和体内均具有全功能，并且事实上展示出优于不具有DGK KO的NK细胞的功能。相似地，iPSC衍生的DGK KO T细胞在体外具有全功能，并且还与不具有所述DGK KO的T细胞相比表现出改善的功能。

在一个方面，本文提供了一种生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法。该方法包括修饰干细胞以抑制至少一种选自DGKα和DGKζ的靶基因的功能；其中经修饰干细胞能够分化成干细胞衍生的免疫细胞，该干细胞衍生的免疫细胞保留经修饰干细胞的靶基因抑制并且包含增强的活性。

在一些实施方案中，干细胞是选自诱导型多能性干细胞(iPSC)或胚胎干细胞的多能性干细胞。在一些实施方案中，干细胞选自pre-HSC、生血内皮细胞(HE)或造血干细胞(HSC)或HSC样细胞。在一些实施方案中，干细胞衍生自三纯合HLA单倍型供体。

在一些实施方案中，该方法还包括选择所生成的经修饰干细胞，其中靶基因的两个等位基因均受到抑制。

在一些实施方案中，该方法还包括：(i)使本文所生成的经修饰干细胞或由它们生成的克隆细胞与组合物接触，以获得中胚层细胞；(ii)使中胚层细胞与组合物接触，以获得CD34+细胞；以及(iii)使CD34+细胞与组合物接触，以获得干细胞衍生的免疫细胞。

在一些实施方案中，至少一种靶基因为DGKα。在一些实施方案中，至少一种靶基因为DGKζ。在一些实施方案中，DGKα基因和DGKζ基因均为靶基因。

在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞选自多能祖细胞、淋巴样祖细胞(例如共同淋巴样祖细胞)、早期胸腺祖细胞、前T细胞祖细胞、前NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、髓系祖细胞(例如共同髓系祖细胞)、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是表达选自CD2、CD5、CD7、CD4、CD8a、CD8b、CD3、TCRαβ和TCRγδ的标记中的至少一种的T细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是表达CD56+和CD45+的NK细胞。

在一些实施方案中，其中靶基因的功能的抑制通过基因编辑系统来实现。在一些实施方案中，基因编辑系统选自CRISPR/Cas、TALEN以及ZFN。

在一些实施方案中，基因编辑系统是包含向导RNA-核酸酶复合体的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，向导RNA靶向选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统利用选自以下的向导RNA依赖性核酸酶：Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12、Cas13、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3，以及Csf4。

在一些实施方案中，经修饰干细胞被进一步修饰以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在一些实施方案中，经修饰干细胞表达CAR。

在一些实施方案中，由该方法产生的免疫细胞被修饰以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在一些实施方案中，由该方法产生的免疫细胞表达CAR。

在一些实施方案中，由该方法产生的免疫细胞识别一种或多种靶抗原。在一些实施方案中，由该方法产生的免疫细胞识别肿瘤靶标或感染性病原体靶标。在一些实施方案中，靶抗原选自TAG-72、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD47、叶酸受体α(FRα)、BCMA、间皮素、粘蛋白1。

在另一个方面，本文提供了一种由本文所公开的方法产生的免疫细胞。

在另一方面，本文提供了一种经修饰细胞，其中至少一种选自DGKα和DGKζ的靶基因的功能受到抑制，其中经修饰细胞能够分化成保留经修饰细胞的基因抑制并且包含增强的活性的免疫细胞。

在一些实施方案中，经修饰细胞是选自胚胎干细胞、脐血干细胞和诱导型多能性干细胞的干细胞。在一些实施方案中，其中经修饰细胞选自生血内皮细胞、造血祖细胞、造血前体细胞、造血干细胞或造血样干细胞。在一些实施方案中，经修饰细胞衍生自三纯合HLA单倍型供体。

在一些实施方案中，靶基因的两个等位基因均受到抑制。在一些实施方案中，至少一种靶基因为DGKα。在一些实施方案中，至少一种靶基因为DGKζ。在一些实施方案中，DGKα和DGKζ基因均为靶基因。

在一些实施方案中，经修饰细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在一些实施方案中，经修饰细胞表达CAR。

在另一方面，本文提供了一种用于修饰细胞以抑制至少一种选自DGKα和DGKζ的靶基因的功能的组合物，其包含：能够编辑靶基因的序列的向导RNA-核酸酶复合体，其中向导RNA靶向选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16。

在一些实施方案，核酸酶包含至少一种选自以下的蛋白质：Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12、Cas13、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3，以及Csf4。

在另一个方面，本文提供了一种治疗受试者的病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫细胞。在一些实施方案中，病症是癌症、感染、自身免疫病症、器官纤维化、或子宫内膜异位症。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公开的副本在提出申请并支付必要费用后由办公室提供。

图1.iPSC基因编辑和单细胞克隆的示意图。CRISPR/Cas9基因编辑用于在iPSC中敲入(KI)TAG-72CAR(如专利PCT/AU2020/050800和WO2017/088012中所述，它们以引用方式并入本文)或敲除(KO)DGK基因(DGKα和/或DGKζ)，或CAR iPSC克隆中KO DGK基因(DGKα和/或DGKζ)。允许iPSC或CAR iPSC克隆从电穿孔恢复，直到iPSC再次正常生长。这典型地为电穿孔后4-6天以后的任何时间。在单细胞分选之前，在达到80％集落汇合度时，使iPSC扩增直至第11天(第I阶段)。未转染的iPSC称为野生型。在第I阶段结束时编辑的iPSC或CARiPSC克隆在以下实例中称作预分选。使用FACSAria^TM Fusion细胞分选仪来执行iPSC的单细胞分选，并且允许单细胞的集落形成进展9至12天。此后，使克隆扩增，直至达到所需的细胞数量(第II阶段)，并进行遗传分析以确定克隆iPSC的准确度和纯度。第II阶段结束时的iPSC在以下实例中称作单细胞克隆。

图2A-2C.CRISPR/Cas9将插入和缺失(插入缺失)引入iPSC中DGKα基因的开放阅读框中。将靶向DGKα基因的靶序列的向导RNA(gRNA)(SEQ ID NO:3)形成的核糖核蛋白(RNP)转染到iPSC中，并通过CRISPR编辑(Inference of CRISPR Edits，ICE)推断分析来评估插入缺失的频率。(A)显示了来自靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA的RNP转染的iPSC(“编辑样本”)(SEQ ID NO:17)和未转染的iPSC(“对照样本”)(SEQ ID NO:18)的Sanger测序轨迹。与未转染的对照样本形成对比，编辑的样本显示出切割位点下游的碱基的异质混合物。对照样本的黑色下划线区域代表向导序列，并且水平红色点状下划线区域是相关联的(前间隔序列相邻基序)PAM位点。两种轨迹上的垂直黑色虚线代表切割位点。(B)在来自靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA的RNP转染的iPSC的基因组DNA中，每种编辑序列的贡献的相对百分比(归一化)。插入缺失+1：SEQ ID NO:19；插入缺失0：SEQID NO:20；插入缺失-1：SEQ ID NO:21；插入缺失-8：SEQ ID NO:22；插入缺失-11：SEQ IDNO:23；插入缺失-11：SEQ ID NO:24；插入缺失-2：SEQ ID NO:25；插入缺失-11：(SEQ IDNO:26)；插入缺失-2：SEQ ID NO:27。(C)在靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA的RNP转染的iPSC的整个编辑群体中插入缺失大小的分布。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。由皮尔逊相关系数计算的R²值指示插入缺失百分比的置信度。

图3A-3B.DGK基因的CRISPR/Cas9编辑在几种iPSC品系中成功地介导。将靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(SEQ ID NO:11)的gRNA形成RNP转染到从两家独立公司由不同的细胞类型并使用不同的方法递送的两种不同iPSC品系中：iPSC品系1(A)或iPSC品系2(B)，以生成DGKα或DGKζ单KO(DGKαKO或DGKζKO iPSC)、或DGKα和DGKζ双重KO(DGKαζKO iPSC)。iPSC品系1是使用iPSC重编程因子的游离基因(episomal)递送由单核细胞衍生的。iPSC品系2是由脐带血级分获得并使用iPSC因子的仙台病毒递送进行重编程的细胞而衍生的。使用ICE来分析DGKα和DGKζ基因的KO效率。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。由皮尔逊相关系数计算的R²值指示插入缺失百分比的置信度。

图4A-4D.gRNA介导了单细胞克隆中DGK基因的成功CRISPR/Cas9编辑。靶向DGKα基因的靶序列gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:11)的gRNA形成的RNP转染到iPSC中，并使用ICE在不同的单细胞克隆中分析DGKαKO(A)、DGKζKO(B)和DGKαζKO DGKα插入缺失％(C)，以及DGKζ插入缺失％(D)的效率。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。选择具有99％至100％框外插入缺失百分比的iPSC单细胞克隆作为单细胞克隆候选。克隆名称指定为基因名称以及随后的数字。

图5A-5B.对未转染的(野生型)、DGKαζKO预分选的iPSC和DGKαζKO iPSC单细胞克隆01中DGK基因中gRNA切割位点的Sanger测序轨迹。在RNP转染后，将碱基混合物引入DGKKO预分选的iPSC基因组中切割位点的下游。在分选和单细胞克隆后，从DGK KO预分选的iPSC中鉴定出具有一个胸腺嘧啶(T)插入(+1)的单细胞iPSC克隆(DGKαζKO iPSC单细胞克隆01)，这通过移除DGKα(A)和DGKζ(B)基因中切割位点下游的碱基混合物所证实。对照样本的黑色下划线区域代表向导序列，并且水平红色点状下划线区域是相关联的PAM位点。两种轨迹上的垂直黑色虚线代表切割位点。在(A)中，显示了以下序列：未转染的(野生型)iPSC：SEQ ID NO:28；DGKα和DGKζRNP转染的批量iPSC：SEQ ID NO:29；DGKα和DGKζRNP共转染的iPSC单细胞克隆：SEQ ID NO:30。在(B)中，显示了以下序列：未转染的(野生型)iPSC：SEQID NO:31；DGKα和DGKζRNP转染的批量iPSC：SEQ ID NO:32；DGKα和DGKζRNP共转染的iPSC单细胞克隆：SEQ ID NO:33。

图6.成功地介导了TAG-72CAR iPSC单细胞克隆中DGK基因的CRISPR/Cas9编辑。TAG-72CAR iPSC单细胞克隆如图1所述生成。随后，靶向DGKα基因的靶序列的gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:11)的gRNA形成的RNP转染到三种不同的TAG-72CAR iPSC单细胞克隆(TAG-72CAR iPSC单细胞克隆B11、C4和D7)中，以生成TAG-72CAR克隆/DGKαζKO iPSC。使用ICE来单独地分析TAG-72CAR克隆/DGKαζKO预分选的iPSC中DGKα和DGKζ基因KO的KO效率。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。由皮尔逊相关系数计算的R²值指示插入缺失百分比的置信度。

图7.TAG-72CAR/DGKαζKO iPSC单细胞克隆的成功生成。TAG-72CAR iPSC单细胞克隆如图1所述生成。随后，靶向DGKα基因的靶序列的gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:11)的gRNA形成的RNP转染到TAG-72CAR iPSC单细胞克隆B11中，并且生成TAG-72CAR/DGKαζKO iPSC单细胞克隆(1-12)。使用ICE来单独地分析DGKα和DGKζ基因的KO效率。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。选择具有99％至100％框外插入缺失百分比的克隆作为单细胞克隆候选。数字1-12表示TAG-72CAR/DGKαζKO iPSC单细胞克隆，并且突出显示的那些表示成功的KO。

图8A-8B.iPSC中DGKα和/或DGKζ的基因缺失不影响iPSC多能性。这以(A)集落形态(比例尺＝1mm)和(B)多能性标记物TRA-1-60和SSEA-4的表面表达为特征。使用CRISPR/Cas9编辑进行iPSC中的TAG-72CAR KI、DGK亚型的单基因(DGKα或DGKζ)和双基因(DGKαζ)KO。通过流式细胞术分析多能性干细胞标记物(TRA-1-60和SSEA-4)，其中直方图(图8B)表示在所有活细胞上每种多能性标记物的表达(死细胞(经由PI)、碎片和双联体(doublet)被剔除)。直方图中包括未染色的对照，以突出显示阳性抗体染色。

图9A-9B.与未转染的(NT)对照相比，DGKα和/或DGKζ的基因缺失以及TAG-72CAR插入iPSC中不影响iPSC的生长。这些图表示iPSC扩增的时程。(A)每个等位基因KO之间的直接比较。(B)对两种不同CAR iPSC单细胞克隆执行的DGKαζKO；两者均相对于未转染的iPSC(NT)品系。(A)：蓝线(NT)表示未转染的iPSC；红线(DGKα)表示DGKαKO iPSC单细胞克隆16；绿线(DGKζ)表示DGKζKO iPSC单细胞克隆02；紫线表示DGKαζKO iPSC单细胞克隆24。(B)：蓝线(NT)表示未转染的iPSC；红线TAG-72CAR(克隆D7)表示TAG-72CAR iPSC单细胞克隆D7(不具有DGKα和/或DGKζKO)；绿线TAG-72CAR克隆/DGKαζKO(克隆D7)表示预分选的TAG-72CAR克隆D7/DGKαζKO iPSC。

图10.iPSC向iNK分化方法的示意图。在第1阶段，使iPSC提升并分化为生血/造血谱系。然后，CD34+细胞在第2阶段向淋巴样祖细胞分化，并在第3阶段向iNK细胞分化。

图11A-11B.TAG-72CAR KI和DGK基因KO不影响iPSC向CD34+细胞的分化。使用CRISPR/Cas9编辑进行iPSC中的TAG-72CAR KI、DGK亚型的单基因(DGKα或DGKζ)或双基因(DGKαζ)KO。iPSC随后分化为CD34+细胞并通过流式细胞术进行分析。代表性流式细胞术图显示了在不存在(A)或存在(B)TAG-72CAR的情况下CD34+细胞的群体频率。A：iPSC(未转染的)表示衍生自未转染的iPSC的CD34+细胞；DGKαKO(克隆16)表示衍生自DGKαKO iPSC单细胞克隆16的CD34+细胞；DGζKO(克隆07)表示衍生自DGKζKO iPSC单细胞克隆07的CD34+细胞；DGKαζKO(克隆24)表示衍生自DGKαζKO iPSC单细胞克隆24的CD34+细胞。B：iPSC(未转染的)表示该实验中衍生自未转染的iPSC的CD34+细胞；TAG-72CAR(克隆D7)表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆(克隆D7)的CD34+细胞；预分选的TAG-72CAR(克隆D7)/DGKαζKO表示衍生自TAG-72CAR克隆D7/DGKαζKO预分选的iPSC的CD34+细胞。CD34的细胞表面表达的直方图表示是在培养物中的活细胞上的。死细胞、碎片和双联体被剔除。直方图中包括未染色的对照(蓝色)，以突出显示阳性抗体染色。

图12A-12B.在具有或不具有TAG-72CAR的情况下CRISPR/Cas9介导iNK中DGK基因的KO。TAG-72CAR iPSC单细胞克隆如图1所述生成。靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(SEQ ID NO:11)的gRNA形成的RNP用于生成TAG-72CAR克隆/DGKαζKO预分选的iPSC(A)。相似地，靶向DGKα基因的靶序列(SEQ ID NO:3)的gRNA和靶向DGKζ基因的靶序列(SEQ ID NO:11)的gRNA形成的RNP用于生成DGKαζKO iPSC，并且DGKαζKO iPSC单细胞克隆如图1(B)所述形成。TAG-72CAR克隆D7/DGKαζKO预分选的iPSC和DGKαζKO iPSC单细胞克隆24然后分化成iNK细胞。使用ICE来分析iNK细胞中DGKα和DGKζ基因的KO效率。框外插入缺失百分比是指示移码或长度超过21bp的插入缺失的比例。

图13.TAG-72CAR KI和DGK基因KO不影响每个iPSC生成的iNK细胞的数量。如前所讨论的使用CRISPR/Cas9编辑进行iPSC中的TAG-72CAR KI、DGK亚型的单基因(DGKα或DGKζ)或双基因(DGKαζ)KO。iPSC然后分化为iNK细胞。与未转染iPSC生成的iNK细胞的基线产量相比，从包含和不包含CAR构建体的KO iPSC单细胞克隆分化的iNK细胞(CD56+细胞)的代表性产量表示为来自2-5个样本的平均值±标准偏差(SD)，即，任何基因编辑样本中的代表性产量得分为1指示该样本生成了与未转染iPSC相同数量的iNK细胞，因此基因编辑对iNK产量没有影响。iNK(未转染的)表示衍生自未转染的iPSC的iNK；iNK DGKαKO表示衍生自DGKαKOiPSC单细胞克隆的iNK；iNK DGKζKO表示衍生自DGKζKO iPSC单细胞克隆的iNK；iNK DGKαζKO表示衍生自DGKαζKO iPSC单细胞克隆的iNK；iNK TAG-72CAR表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆的iNK；iNK TAG-72CAR/DGKαζKO表示衍生自预分选的TAG-72CAR克隆/DGKαζKOiPSC的iNK。对所有组执行单因素ANOVA统计分析。并未鉴定出显著的差异。

图14A-14B.TAG-72CAR KI和DGK基因KO不改变iNK的表型。使用CRISPR/Cas9编辑进行iPSC中的TAG-72CAR KI、DGK亚型的单基因(DGKα或DGKζ)或双基因(DGKαζ)KO。iPSC然后分化为iNK细胞，并通过流式细胞术评估表型。在不存在(A)或存在(B)TAG-72CAR的情况下，对从KO iPSC分化的iNK进行代表性表型分析。对于流式分析，死细胞、碎片和双联体已被剔除，使得每个直方图代表培养物中的所有活细胞。未染色的对照(蓝色)包括在直方图中以突出显示针对NK受体CD56、CD45、NKp46、NKG2D、Nkp44和2B4的阳性抗体染色。iNK(未转染的)表示衍生自未转染的iPSC的iNK；iNK DGKαKO(克隆16)表示衍生自DGKαKO iPSC单细胞克隆16的iNK；iNK DGKζKO(克隆07)表示衍生自DGKζKO iPSC单细胞克隆07的iNK；iNKDGKαζKO(克隆24)表示衍生自DGKαζKO iPSC单细胞克隆24的iNK；iNK TAG-72CAR(克隆D7)表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆D7的iNK；iNK TAG-72CAR(克隆D7)/DGKαζKO(预分选的)表示衍生自TAG-72CAR克隆D7/DGKαζKO预分选的iPSC的iNK；iNK TAG-72CAR(克隆C4)表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆C4的iNK；iNK TAG-72CAR(克隆C4)/DGKαζKO(预分选的)表示衍生自TAG-72CAR(克隆C4)/DGKαζKO预分选的iPSC的iNK。

图15A-15C.TAG-72CAR KI和DGK基因KO增强iNK细胞针对OVCAR-3肿瘤细胞的细胞毒性，以及在重复暴露于相同细胞后增强存活/寿命。使用CRISPR/Cas9编辑进行iPSC中的TAG-72CAR KI和DGK亚型的双基因(DGKαζ)KO。iPSC然后分化为iNK细胞，并使用实时细胞监测系统来确定针对OVCAR-3细胞的细胞毒性。在重复抗原暴露测定中评估iNK细胞的存活/寿命。TAG-72CAR iNK细胞(具有和不具有DGKαζKO)的细胞毒性功能显示为在72小时内OVCAR-3细胞的杀伤效率(A)。杀伤效率计算为处理后剩余的OVCAR-3细胞相对于未经处理的OVCAR-3对照的比例。此外，使用xCELLigence来评估预暴露的iNK细胞对OVCAR-3细胞的细胞毒性功能，并以20小时内的归一化细胞指数表示(B)。根据制造商的建议来计算归一化细胞指数。(C)还显示了重复暴露于OVCAR-3细胞72小时后培养物中剩余的iNK细胞的数量。iNK TAG-72CAR(克隆C4)表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆(克隆C4)的iNK细胞；iNK TAG-72CAR(克隆C4)/DGKαζKO(预分选的)表示衍生自TAG-72CAR(克隆C4)/DGKαζKO预分选的iPSC的iNK细胞；iNK TAG-72CAR(克隆D7)表示衍生自TAG-72CAR iPSC单细胞克隆D7的iNK细胞；iNK TAG-72CAR(克隆D7)/DGKαζKO(预分选的)表示衍生自TAG-72CAR(克隆D7)/DGKαζKO预分选的iPSC的iNK细胞。

图16A-16B.与未转染的iNK对照相比，DGKαζKO iNK细胞展示出改善的杀伤能力。(A)DGKαζKO和未转染的iNK细胞在24小时内的归一化细胞指数(CI)读数，如由实时细胞监测系统所测量。误差条＝SEM，NGM＝用于OVCAR-3细胞的正常生长培养基。(B)在OVCAR-3细胞的重复抗原刺激120小时后，或在正常NK生长条件下培养物中留下的DGKαζKO iNK细胞上促增殖标记物Ki67的表达提高。如由120小时重复抗原刺激结束时通过流式细胞术所测定，Ki67+CD56+阳性细胞的比例。误差条＝SEM。

图17.与未转染的iNK细胞(不具有DGKαζKO的iNK细胞)相比，iNK细胞中包含DGKαζKO提供的体内功能优势在于，减小了肿瘤尺寸并延长了携带皮下卵巢癌(OVCAR-3)肿瘤的nod-skid-γ(NSG)小鼠的存活。iNK细胞(具有和不具有DGKαζKO)以3×10⁶个细胞注射，间隔14天。虚线表示每次iNK注射执行之时。注射前在NK生长培养基中体外恢复iNK细胞7天。在体内实验期间没有共同施用的细胞因子支持(n＝4只小鼠/组)。

图18A-18C.DGKαζ基因缺失使iNK对TGFβ免疫抑制有抗性。(A)经由xCELLigence，在添加或不添加10ng/m的TGFβ的培养基中，评估具有和不具有DGKαζKO的iNK细胞在体外靶向卵巢癌细胞(OVCAR-3)的细胞毒性功能。(B)如由实时细胞监测系统所测量的归一化细胞指数(CI)读数证明，在2:1(效应物:靶标)的比率下，添加的TGFβ抑制的未转染的iNK细胞功能，但不抑制含有DGKαζKO的细胞中的iNK功能。xCELLigence曲线表示平均值+标准偏差(n＝3)。(C)经由xCELLigence，在添加或不添加100ng/mL的TGFβ的培养基中，评估具有或不具有DGKαζKO的TAG-72CAR(克隆D7)iNK细胞在体外针对卵巢癌细胞(OVCAR-3)的细胞毒性功能。/>曲线表示平均值+标准偏差(n＝3)。

图19.TGFβR1/2基因编辑导致iPSC多能性损失和自发分化。RNP转染后通过光学显微镜来检查iPSC集落形态。与未转染的(NT)iPSC形成对比，TGFβR1和TGFβR2显性阴性敲除iPSC集落在靶向转染后展现出自发分化。

TGFβR KO gRNA

TGFβR1	CTCGATGGTGAATGACAGTG(SEQ ID NO:34)
		TGFβR2	GCTTCTGCTGCCGGTTAACG(SEQ ID NO:35)

图20A-20C.基因编辑的iNK细胞的表型和功能的体外表征。(A)在体内施用之前对不同iNK效应物群体的流式细胞术分析。CAR和NK表面受体表达以CD45+CD56+双阳性群体的百分比来反映。(B)对由具有DGKαζKO的富集TAG-72CAR iPSC品系(非克隆衍生的)生成的iNK细胞，执行DGKα和ζ基因座的ICE分析(如由插入缺失％表征)(n＝2)。(C)iNK功能性杀伤测定：将效应物以1:2和1:1的E:T比率添加到OVCAR-3靶细胞，并使用系统监测20小时。NCI＝归一化细胞指数。

图21A-21E.TAG-72CAR和TAG-72CAR/DGKαζiNK细胞的体内功能。(A，B)来自两个独立实验的带有萤火素酶标记的OVCAR-3肿瘤细胞的免疫受损NSG小鼠的代表性生物发光图像(BLI)。图像反映了如所指示的冻融NK细胞施用后的几个时间点。(C)肿瘤负荷的量化，绘制为相对于每组小鼠的第-1天基线BLI读数而言通量单位(光子/秒)随时间推移的倍数变化(显示为每组的中值BLI)。(D，E)显示出处理后每个时间点的个体小鼠BLI信号(绘制为相对于基线的倍数变化)的直方图。n＝4-5只小鼠/组，3次独立实验。误差条表示每组的平均值±SEM。

图22A-22C.用TAG-72CAR+DGKαζ基因编辑的iPSC分化为iT细胞。(A)通过TIDE分析得到的TAG-72CAR iPSC中DGKα和DGKζ的插入缺失效率。(B)T细胞标记物和CAR表达的流式细胞术分析，将未编辑的iT细胞与TAG-72CAR+DGKαζiT细胞(非克隆衍生的)进行比较。(C)与iT(未编辑的)和从靶向卵巢癌细胞系OVCAR-3的TAG-72CAR+DGKαζKO iPSC(其表达TAG-72)分化的iT细胞比较，对从健康供体的外周血单核细胞(PBMC)级分中分离的T细胞的细胞毒性功能分析。

图23A-23C.在TGFβ存在下TAG-72CAR iT/DGKαζKO细胞的体外功能。(A)用于评估TGFβ预调节对体外iT细胞功能的影响所实施的方法的示意图。(B-C)iT细胞体外细胞毒性测定：将效应物±TGFβ(B：10ng/mL，C：100ng/mL)以1:1的E:T比率添加到OVCAR-3靶标，并使用实时细胞监测系统来监测40小时。将TAG-72CAR-iT/DGKαζKO细胞(紫色)的功能与iT(未转染的)对照(灰色)进行比较。平行地维持和监测单独的靶细胞±TGFβ(蓝色)，提供了在不存在效应物的情况下OVCAR-3细胞系的生长动力学。数据归一化为效应细胞的添加时间并以任意单位呈现归一化细胞指数。每个数据点代表技术三次重复的平均值±SD。

具体实施方式

贯穿本说明书，词语“包含(comprise)”、或变型形式如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗示包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

贯穿本说明书和权利要求书，术语“一个”和“一种”应视为意指“至少一个”，并且不应视为排除“两个或更多个”，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，“核酸构建体”通常指人工或重组构建或制备的核酸分子，并且也可互换地称为核酸载体。例如，核酸构建体可被制备成包括期望在细胞中转录的所关注核苷酸序列，并且在一些情况下产生期望功能的RNA分子(例如，反义RNA、siRNA、miRNA、或gRNA)，并且在其它情况下产生mRNA，该mRNA被翻译成所关注的蛋白质(例如Cas蛋白)。核酸构建体中的所关注核苷酸序列能够可操作地连接至5'调控区(例如，启动子，如异源启动子)，和/或3'调控区(例如，3'非翻译区(UTR)，如异源3'UTR)。核酸构建体可为环状(例如，质粒)或线性形式，可为整合性核酸(即，能够整合到宿主细胞的染色体中，例如，病毒载体，如慢病毒载体)，或者可保持为游离型(episomal)(例如，质粒)。

术语“约”或“大约”应理解为自给定值的±10％变化。

术语“离体”是指细胞从活体生物中移除并在生物体外部(例如试管中)繁殖的过程。

术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物、和/或微生物)内发生的事件。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

一般描述

本文公开了用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法。例如，本文展示了使用CRISPR/Cas9基因编辑来消融干细胞中的一种或多种选定基因并不破坏干细胞分化为免疫细胞的能力。还展示了由这些经修饰干细胞生成的免疫细胞包含增强的持久性、体外抗肿瘤活性，以及对TGFβ免疫抑制效应的抵抗力。因此，提供的方法是通过抑制干细胞中的一种或多种选定基因的功能。此外，还提供了使这些干细胞分化为免疫细胞(如NK细胞和T细胞)的方法。另外，本文公开了经修饰干细胞和通过本发明方法生成的免疫细胞，以及免疫细胞在治疗性治疗中的用途。

源细胞

如本文所用，“源细胞”是指待通过重编程或分化而被转化为“衍生的细胞”的细胞。适用于本文所公开的方法的源细胞的实例包括干细胞。

术语“干细胞”应理解为提及表现出如下潜能的任何细胞：鉴于其特定基因组成，向多个谱系方向发展，并因此形成新的生物体或者再生出生物体的组织或细胞群。根据本发明利用的干细胞可为能够沿两个或更多个谱系分化的任何合适的类型，并且包括但不限于胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞、脐血干细胞、造血干细胞(HSC)、祖细胞、前体细胞、多能性细胞、多能细胞或去分化体细胞(如诱导型多能性干细胞)。所谓的“多能性”意指主题干细胞能够自我更新且分化形成尤其是三胚层(这些为外胚层、内胚层和中胚层)中任一者的细胞。

在一些实施方案中，源细胞还表达至少一种纯合HLA单倍型。在一些实施方案中，源细胞表达至少一种纯合HLA单倍型，该纯合HLA单倍型是主要移植抗原并且优选地由显著比例的群体表达，如群体的至少5％、至少10％、至少15％、至少17％、至少20％或更多。当纯合HLA单倍型对应于显性MHC I或MHC II HLA类型(就组织排斥而言)时，在治疗方案背景下使用这种细胞将导致接受本发明细胞的更广泛群体中的组织排斥问题显著减少。在其它实施方案中，源细胞关于多于一种HLA抗原，例如两种、三种、或更多种HLA抗原可以是纯合的。所关注的HLA抗原可选自例如HLA A1、B8、C7、DR17、DQ2，或HLAA2、B44、C5、DR4、DQ8，或HLAA3、B7、C7、DR15、DQ6。

在一些实施方案中，源细胞关于受抑制的基因是纯合的。

在一些实施方案中，源细胞已经在本文所鉴定的一种或多种基因中进行了遗传修饰，使得从经遗传修饰的源细胞分化的目标细胞中的一种或多种经修饰基因的功能受到抑制。

在一些实施方案中，源细胞也已被遗传修饰以包含编码CAR(即，嵌合抗原受体)的核酸。编码CAR的核酸可以通过本领域已知的方法引入源细胞中，如γ-逆转录病毒或慢病毒转导，以及CRISPR-Cas9、TALEN或ZFN介导的基因编辑(Themeli等人,Generation oftumor-targeted human T lymphocytes frominduced pluripotent stem cells forcancer therapy,Nat Biotechnol,2013,31(10):928-33；Sadelain等人,Therapeutic Tcell engineering,2017,Nature,545:423-431；Eyquem等人,Targeting a CAR to theTRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection,2017,Nature,543:113-17)。

iPSC

iPSC通常直接由体细胞生成。iPSC原则上可以从任何有核细胞诱导，包括例如来自血液的单核细胞和皮肤细胞。在一些实施方案中，iPSC可以从完全分化的T细胞生成；或者从前体T细胞(如胸腺细胞)生成，该前体T细胞已经开始或甚至完成了其TCR的重排并表现出所关注的抗原特异性。在另一个实施方案中，用一种或多种编码针对所关注的抗原决定簇(例如，肿瘤抗原决定簇)的TCR的核酸分子(如重排的TCR基因)转染iPSC。在一个实施方案中，iPSC衍生自表达重排的TCR优选重排的αβTCR的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表达重排的γδTCR。适合用于生成本发明的iPSC的细胞的实例包括但不限于CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、胸腺细胞或其它形式的前体T细胞。

用于从成熟或分化的细胞(如T细胞或前体T细胞)生成iPSC的方法是本领域的技术人员已知的。例如，iPSC可以通过将一组特定的多能性相关联的基因或“重编程因子”引入体细胞类型中而衍生。一组常用的重编程因子(也称为山中因子)是基因Oct4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4。虽然这种组合可为用于产生iPSC的最常规组合，但每种因子可在功能上被相关转录因子、miRNA、小分子、或甚至非相关基因(如细胞谱系特异性分子)替代。例如，已经实现了在使用逆转录病毒系统转染Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc后对iPSC进行诱导，当其已经经由使用慢病毒系统经由Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的转染。前一组转录因子称为山中因子，而后者通常称为Thomson因子。如本领域的技术人员所理解，已经对基本重编程因子表达载体进行了广泛的修饰，并设计了新递送模式以便增大效率并最小化或去除原本可能整合到重编程的iPSC基因组中的载体序列。这些方法是技术人员公知的，并且包括但不限于：采用Cre-Lox介导的转基因切除的单盒重编程载体，以及通过非整合病毒如腺病毒或仙台病毒进行重编程。或者，重编程因子表达为蛋白质提供了一种生成iPSC的手段，该iPSC不经历所引入的载体DNA向种系中的整合。还开发了非病毒重编程方法。这些包括但不限于：mRNA转染(Warren等人(2010))、miRNA感染/转染(Subramanyam等人(2011))；PiggyBac(Kaji等人(2009)；Woltjen等人(2009))；微环载体(Narsinh等人(2011))和附加体质粒(Chuo等人(2011))。已显示本领域中多种小分子增强重编程效率；参见例如下表中所列出的那些。

增大iPSC重编程效率的化合物

处理	受影响的过程
		丙戊酸	组蛋白脱乙酰酶抑制
丁酸钠	组蛋白脱乙酰酶抑制
		PD0325901	MEK抑制
A-83-01	TGFβ-抑制
		SB43152	TGFβ-抑制
维生素C	增强表观遗传修饰剂，促进抗氧化效应的存续
		噻唑威宁	ROCK抑制剂，促进细胞存活
PS48	P13K/Akit活化，促进糖酵解
		5％氧气	促进糖酵解

在一些实施方案中，源细胞为诱导型多能性干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，iPSC通过游离基因(episomal)或仙台病毒转化而衍生。

在一些实施方案中，iPSC对于SSEA-4和TRA-1-60呈>98％阳性。

在一些实施方案中，主题源细胞是与多能性干细胞相比更向免疫细胞分化的细胞。

在一些实施方案中，可以使用非病毒方法对干细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以使用非病毒方法(例如CRISPR/Cas编辑系统)来修饰iPSC。

在一些实施方案中，可以使用非病毒编辑系统(例如CRISPR-Cas9)将嵌合抗原受体(CAR)引入iPSC中。

在一些实施方案中，可以使用非病毒编辑系统(例如CRISPR-Cas9)在iPSC中操纵遗传物质的敲除(KO)。在一些实施方案中，使用非病毒编辑系统(例如CRISPR-Cas9)来实现iPSC中DGKα和/或DGKζ基因的KO。在一些实施方案中，iPSC包含DGKαζ基因的双重KO，针对其使用非病毒编辑系统(例如CRISPR-Cas9)进行遗传操纵。

在一些实施方案中，iPSC源细胞被遗传修饰以抑制DGKαζ基因的表达(DGKαζKOiPSC)。

在一些实施方案中，iPSC源细胞被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，其中所述抗原决定簇为肿瘤相关抗原TAG-72的抗原决定簇(TAG-72CAR iPSC)。

在一些实施方案中，iPSC源细胞被遗传修饰以抑制DGKαζ基因的表达并且进一步表达TAG-72CAR(TAG-72CAR/DGK KO iPSC)。在一些实施方案中，这种遗传修饰的iPSC维持多能性以及在培养物中繁殖的能力。

在一些实施方案中，iPSC源细胞可分化成CD34+细胞。在一些实施方案中，DGK KOiPSC和/或TAG-72CAR/DGK KO iPSC均可分化成CD34+生血祖细胞。

在一些实施方案中，iPSC源细胞可分化成CD45+CD56+NK细胞。在一些实施方案中，DGK KO iPSC和/或TAG-72CAR/DGK KO iPSC可分化成表达正常NK刺激受体的成熟NK细胞。

在一些实施方案中，iPSC源细胞可分化成祖T细胞。在一些实施方案中，DGK KOiPSC和/或TAG-72CAR/DGK KO iPSC均可分化成主要具有CD8+表型的成熟CD3+T细胞。在一些实施方案中，DGK KO iPSC和/或TAG-72CAR/DGK KO iPSC均可分化成表达TCRαβ或TCRgδ的成熟CD3+T细胞。

在一些实施方案中，使用非病毒编辑系统(例如CRISPR-Cas9)将CAR引入iPSC中。在一些实施方案中，所得的遗传编辑的iPSC可分化成CD34+细胞和/或祖T细胞。

在一些实施方案中，iPSC衍生的CD34+细胞能够分化成NK细胞(iNK细胞)。在一些实施方案中，DGK KO iPSC衍生的CD34+细胞和/或TAG-72CAR/DGK KO iPSC衍生的CD34+细胞均可分化成NK细胞，而对分化过程的效率没有显著影响。

在一些实施方案中，iPSC和/或TAG-72CAR iPSC中单一DGKα/DGKζ或双重DGKαζKO不影响所述iPSC衍生的NK细胞和/或TAG-72CAR iPSC衍生的NK细胞在分化后的正常表型。

在一些实施方案中，iPSC和/或TAG-72CAR iPSC中单一DGKα/DGKζ或双重DGKαζKO不影响所述iPSC衍生的T细胞和/或TAG-72CAR iPSC衍生的T细胞在分化后的正常表型。

中胚层细胞

在胚胎发育期间出现了三个主要的细胞群(初级生发层)：中胚层、外胚层和内胚层。这些细胞群通过称为原肠胚形成的过程而形成，并且在该过程之后，每个原始生殖细胞层生成一组特定的细胞群和组织。例如，中内胚层或中胚层群体产生心脏、血管和血细胞(例如免疫细胞)。

为了形成免疫细胞，中胚层细胞被诱导进入多个分化阶段，每个阶段均由主要可分为以下的具有不同潜能/表型的细胞亚群代表：生血内皮细胞(HE)、造血干细胞(HSC)、祖细胞和免疫细胞。每个分化阶段均使细胞更接近其最终细胞类型，例如通过改变其限制其成为不同细胞类型的潜能的基因表达。

在一些实施方案中，主题源细胞是能够分化成免疫细胞的中胚层细胞。

造血谱系细胞

术语“造血谱系细胞”应理解为从中胚层细胞(其可从多能性细胞获得)分化的任何细胞，并且包括例如HE、pre-HSC和HSC以及祖细胞(例如多能祖细胞、淋巴样祖细胞如共同淋巴样祖细胞、早期胸腺祖细胞、前T细胞祖细胞、前NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞，以及髓系祖细胞如共同髓系祖细胞)。术语“HE/HSC”在此处用于指造血谱系细胞的亚类。HE/HSC是能够产生髓系(例如巨噬细胞和单核细胞)和淋巴样细胞类型(例如B细胞、T细胞或NK细胞)的CD34+干细胞，并且包括HE、pre-HSC和HSC。iCD34+细胞表示已经从iPSC分化的CD34+表达细胞。

在胚胎发生期间，多能中胚层细胞分化成内皮细胞谱系。HE是该谱系的子组，它获取造血潜能并在称为内皮向造血转化的过程中产生多谱系造血干细胞和祖细胞。导致内皮细胞的生血特化以及从生血内皮细胞生成HSC的过程仍处于讨论中。

HSC是血液干细胞，理论上能够通过血生成过程变为淋巴样和髓系谱系的任何血细胞。HSC存在于成人骨髓、外周血和脐带血中。HSC可以通过既定技术从骨髓、外周血和脐带血中收集，并且通常与CD34+表达相关联。

在一些实施方案中，人HSC可定义为CD34+CD38-CD90+CD45RA-。在一些实施方案中，人HSC可定义为CD34+CD43+CD45+。在一些实施方案中，人HSC可定义为CD34+CD133+。

当HSC衍生自多能性干细胞时，它通常被称为iHSC(诱导型造血干细胞)。

“pre-HSC”应理解为从HE细胞分化的但不表达典型的HSC标记物的细胞，例如是表达CD34的CD45-细胞。

在一些实施方案中，从多能性干细胞(如iPSC)培养的在培养物中经历了一些向免疫细胞的分化但尚未完全分化成免疫细胞的细胞用作源细胞。

在一些实施方案中，能够分化成免疫细胞的造血谱系细胞用作源细胞。在一些实施方案中，造血谱系细胞尚未分化成造血干细胞(HSC)，例如是生血内皮细胞(HE)或pre-HSC。在一些实施方案中，该造血谱系细胞为HSC。

在一些实施方案中，主题源细胞为髓系祖细胞，例如共同髓系祖细胞。

在一些实施方案中，主题源细胞是为淋巴样祖细胞，例如多能祖细胞、共同淋巴样祖细胞、早期胸腺祖细胞、前T细胞祖细胞、前NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞(Galen等人,Theunfolded protein response governs integrity of the haemopoietic stem cellpool during stress,Nature,2014,第510卷(7504),第268页)。在一些实施方案中，主题源细胞是未成熟的T细胞，如胸腺细胞，或未成熟的NK细胞。

衍生的细胞

通过本文所公开的方法生成的干细胞衍生的免疫细胞包括能够分化成免疫细胞的造血谱系细胞，以及免疫细胞。干细胞衍生的免疫细胞的实例为HE、pre-HSC、HSC、多能祖细胞、淋巴样祖细胞如共同淋巴样祖细胞、早期胸腺祖细胞、前T细胞祖细胞、前NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、髓系祖细胞如共同髓系祖细胞，以及免疫细胞。

如本文所用，“免疫细胞”应理解为包括哺乳动物免疫系统的细胞，例如淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、嗜中性粒细胞和单核细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)，以及衍生自哺乳动物免疫系统的细胞的细胞系。

本公开涉及提供通过分化产生的具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞。所谓的“增强的功能”意指与对照免疫细胞(即，未经修饰或操纵的免疫细胞)相比，作为本文所公开的修饰或操纵的结果而提供的免疫细胞展现出增强的活性(例如细胞毒性)、增殖、存活、持久性、对免疫抑制效应(例如TGFβ抑制)的抵抗力和/或浸润。免疫细胞的细胞毒性是指免疫细胞通常通过基于受体的机制杀伤靶细胞的能力。

在一些实施方案中，根据本发明方法的干细胞衍生的免疫细胞可以从干细胞或其它更分化的细胞(如从干细胞培养和分化的细胞)分化而来。

在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞为T细胞。在一些实施方案中，T细胞为NKT细胞。在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞为NK细胞。在其它实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞是巨噬细胞或巨噬细胞谱系细胞(例如单核细胞、树突状细胞)。

T细胞

提及“T细胞”应理解为对包含T细胞受体的任何细胞的提及。就这一点而言，T细胞受体可包含α、β、γ或δ链中的任一种或多种。如本领域的技术人员所理解，NKT细胞也表达T细胞受体，因此也可以根据本发明生成靶抗原特异性NKT细胞(并且理解为包括在T细胞的定义中)。本发明不旨在限于任何特定的T细胞亚类，尽管在一个实施方案中主题T细胞表达α/βTCR二聚体。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+辅助T细胞、CD8+杀伤T细胞、或NKT细胞。在不将本发明限制于任一种理论或作用方式的情况下，CD8+T细胞也称为细胞毒性细胞。作为适应性免疫系统的主要部分，CD8+T细胞扫描胞内环境，以主要靶向和破坏受感染的细胞。衍生自胞内内容物的小肽片段被加工并运输到细胞表面，在该处它们在MHC I类分子的背景下呈递。然而，除了对病毒感染做出反应之外，CD8+T细胞还通过监测和移除受损或异常细胞(包括癌症)来提供额外水平的免疫监视。CD8+T细胞对MHC I呈递的肽的识别通常导致细胞毒性颗粒或淋巴因子的释放，或经由FAS/FASL相互作用活化细胞凋亡途径以破坏主题细胞。另一方面，CD4+T细胞通常在MHC II类的背景下识别由抗原呈递细胞呈递的肽，从而导致释放设计成调节B细胞和/或CD8+T细胞免疫反应的细胞因子。在各种免疫反应中也观察到具有细胞毒活性的CD4+T细胞。此外，CD4+CAR-T细胞展示出在体外与CD8+CAR-T细胞等同的细胞毒性，并甚至对于更久的抗肿瘤活性，在体内表现优于CD8+CAR-T细胞(参见例如Wang等人,Glioblastoma-targeted CD4+CAR T cells mediate superiorantitumor activity,JCI Insight,2018,3(10):e99048；Yang等人,TCR engagementnegatively affects CD8 but not CD4 CAR T cell expansion and leukemicclearance,Science Translation Medicine,2017年11月22日；9(417),eaag1209)。

在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞为细胞毒性免疫细胞，例如细胞毒性淋巴细胞。

在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞为淋巴谱系细胞。在一些实施方案中，淋巴谱系细胞为T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+辅助T细胞、CD8+杀伤T细胞、或NKT细胞。

在一些实施方案中，本文所公开的干细胞衍生的T细胞展示出体外抗肿瘤活性。在一些实施方案中，iPSC衍生的TAG-72CAR/DGKαζKO T细胞在体外显示出针对卵巢癌细胞系的在靶活性。在一些实施方案中，与未转染的iPSC衍生的T细胞和分离自PBMC的未转染的T细胞相比，TAG-72CAR/DGKαζKO T细胞显示出对人卵巢癌细胞系(OVCAR-3)增强的杀伤。

在一些实施方案中，iPSC衍生的T细胞保留了在肿瘤的免疫抑制微环境中的功能。在一些实施方案中，iPSC衍生的DGKαζKO T细胞对肿瘤抑制效应的敏感性下降，如例如通过在TGFβ(肿瘤微环境中免疫抑制的关键介质之一)存在下此类细胞保留针对OVCAR-3细胞的体外细胞毒性功能所展示。

NK细胞自然杀伤T细胞(也称为NKT或T/NK细胞)是一种表达半不变T细胞受体(TCRαβ)和典型地与自然杀伤细胞相关的表面抗原的特化T细胞群。NKT细胞上的TCR是独特的，因为它通常识别由MHC I样分子CD1d呈递的糖脂抗原。大多数NKT细胞表达不变TCRα链和少数TCRβ链之一。I型NKT细胞上存在的TCR通常识别抗原α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)。在该组内，已鉴定出可区分的亚群，包括CD4⁺CD8^-细胞、CD4^-CD8⁺细胞和CD4^-CD8^-细胞。II型NKT细胞(或非不变NKT细胞)表达更广泛的TCRα链，并且不识别α-GalCer抗原。NKT细胞产生具有多种通常相反效应(例如促进炎症或诱导免疫抑制(包括耐受性))的细胞因子。因此，它们可以有助于抗菌和抗病毒免疫反应，促进肿瘤相关的免疫监视，并抑制或促进自身免疫疾病的发展。与自然杀伤细胞一样，NKT细胞也可诱导穿孔素、Fas和TNF相关的细胞毒性。因此，提及到的T细胞应理解为包括对NKT细胞的提及。

自然杀伤(NK)细胞是一类细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的一部分。NK细胞提供对病毒感染的细胞的快速反应，在感染后3天左右起作用，并对肿瘤的形成也作出反应。典型地，免疫细胞(如T细胞)检测受感染或转化细胞表面上存在的主要组织相容性复合体(MHC)，从而触发细胞因子释放并导致靶细胞裂解或凋亡。然而，NK细胞能够在不存在抗体或MHC的情况下识别应激细胞，从而允许更快的免疫反应。该作用尤为重要，因为缺失或具有低于正常水平的MHC I标记的有害细胞无法被其它免疫细胞(如T细胞)检测到和破坏。与NKT细胞形成对比，NK细胞不表达TCR或CD3，但它们通常表达表面标记CD16(FcγRIII)和CD56。在一些实施方案中，干细胞衍生的免疫细胞是NK细胞。

在一些实施方案中，本文公开了具有增强功能的干细胞衍生的NK细胞。在一些实施方案中，在体外与靶癌细胞扩展的共培养中，与它们相应的未转染的iPSC衍生的NK对照细胞相比，iPSC衍生的DGKαζKO NK细胞展现出增强的功能和存活期。本文已确立了DGKαζKO对于iPSC衍生的NK细胞的存活和增强细胞毒性抗肿瘤功能的重要性。

在一些实施方案中，iPSC衍生的TAG-72CAR/DGKαζKO NK细胞显示出增强的体外肿瘤细胞杀伤(与未编辑的iPSC衍生的NK细胞和从健康成人供体的外周血单核细胞(PBMC)级分中分离的NK细胞相比)。

在一些实施方案中，本文公开了具有改善的增殖能力的干细胞衍生的NK细胞。在一些实施方案中，本文公开了iPSC衍生的DGKαζKO NK细胞，其与未转染的iPSC衍生的NK细胞相比展示出改善的增殖能力。

在一些实施方案中，iPSC衍生的NK细胞保留了在肿瘤的免疫抑制微环境中的功能。在一些实施方案中，本文公开了对肿瘤抑制效应的敏感性下降的iPSC衍生的DGKαζKONK细胞，如例如通过在TGFβ(肿瘤微环境中免疫抑制的关键介质之一)存在下此类细胞保留体外细胞毒性功能所展示。

在一些额外的实施方案中，本文公开了iPSC衍生的TAG-72/DGKαζKO NK细胞，其保留了在肿瘤的免疫抑制微环境中的功能。在一些实施方案中，本文所公开的iPSC衍生的TAG-72/DGKαζKO NK细胞能够在代表免疫抑制微环境的条件下诱导肿瘤细胞(例如OVCAR-3细胞系)的杀伤。在一些实施方案中，所述iPSC衍生的TAG-72/DGKαζKO NK细胞在TGFβ存在下保留了体外细胞毒性功能。

在一些实施方案中，本文所公开的干细胞衍生的NK细胞展示出体内抗肿瘤活性。本文公开了与使用未编辑的(未转染的)iPSC衍生的NK细胞治疗相比，在采用或不采用细胞因子共同施用的情况下，用iPSC衍生的DGKαζKO NK细胞治疗荷瘤小鼠导致了肿瘤尺寸减小和存活改善。

在一些实施方案中，本文所公开的干细胞衍生的TAG-72CAR/DGKαζKO NK细胞展示出延长的体内抗肿瘤活性。本文显示，与PBMC-NK细胞、未编辑的(未转染的)iPSC衍生的NK细胞、或TAG-72CAR iPSC衍生的NK细胞相比，用iPSC衍生的TAG-72CAR/DGKαζKO NK细胞治疗荷瘤小鼠导致了较低的平均肿瘤负荷和优异的长期功效。

受抑制的基因

根据本公开，可以通过修饰源细胞以抑制本文所鉴定的一种或多种基因的功能并使所述经修饰源细胞分化成干细胞衍生的免疫细胞来生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞。

如本文所用，所谓的“基因功能的抑制”意指由基因编码的蛋白质的水平和/或活性最终降低或消除。因此，基因的功能可以由于对基因的基因组DNA序列进行操纵或修饰(例如，导致基因的破坏)，由于抑制mRNA(例如，降低mRNA的水平或功能，例如通过抑制转录或翻译)，或者由于抑制蛋白质(例如，通过降低蛋白质的水平或活性)而被抑制。在一些实施方案中，当经修饰细胞中基因编码的蛋白质的水平和/或活性与未经修饰细胞中蛋白质的水平和/或活性相比时，抑制程度为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

根据本公开，其功能受抑制的基因选自DGKα和DGKζ。

DGKα和DGKζ

二酰甘油激酶(DGK)是将二酰甘油(DAG)磷酸化为磷脂酸(PA)的酶。存在多种亚型，其中两种亚型DGKα和DGKζ与免疫细胞具有很强的功能联系。在T和NK细胞中，DAG是活化和发挥功能的主要信使之一，并且DGKα和DGKζ充当一类新型免疫“检查点”，这可降低DAG依赖性活化(Riese等人,Diacylglycerol Kinases(DGKs):Novel Targets for Improving TCell Activity in Cancer,Frontiers in cell and developmental biology,2016,Vol.4,pp.108；Noessner,DGK-alpha:A Checkpoint in Cancer-Mediated Immuno-Inhibition and Target for Immunotherapy,Frontiers in cell and developmentalbiology,2017,第5卷,第16页)。DAG与参与CD3信号转导的必需蛋白如蛋白激酶C(PKC)和Ras活化蛋白(RasGRP1)相互作用。因此，据信DGK的活化导致TCR远端分子的下调，包括胞外信号相关激酶1/2(ERK1/2)。DGKα和DGKζ主要在T和NK细胞中表达，并且它们的功能似乎并不完全冗余，因为它们的表达和活化以不同的方式受到调节。

根据本公开，其中DGKα和DGKζ基因中的至少一种的功能已被抑制的干细胞仍然能够分化，并且从经修饰干细胞分化的干细胞衍生的免疫细胞包含增强的功能。

抑制基因的功能

基因功能的抑制可以通过多种方法来实现，例如，通过基因编辑，经由例如RNA干扰或反义寡核苷酸抑制翻译，或通过使用直接拮抗蛋白产物的化合物如小分子或抗体。

通过基因编辑抑制

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过使用修饰基因的基因组序列的基因编辑系统来实现。

基因编辑系统典型地涉及与核酸酶偶联的DNA结合蛋白或DNA结合核酸。DNA结合蛋白或DNA结合核酸与基因的靶向区域特异性结合或杂交，并且核酸酶在基因的靶向区域中产生一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂。靶向区域可为基因的编码区域，例如在外显子中，靠近编码区的N末端部分(例如，在第一或第二外显子中)。双链或单链断裂可以经由细胞修复过程经历修复，如通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在一些情况下，修复过程引入插入、缺失、错义突变、或移码突变(包括例如双等位移码突变)，导致基因的破坏和基因功能的抑制。

基因编辑系统的实例包括包含DNA结合蛋白和核酸酶(如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应核酸酶(TALEN))的融合物，或RNA指导的核酸酶，如规律间隔成簇短回文核酸(CRISPR)/Cas系统。然而，本发明不应限于这些类型的基因编辑系统。相反，本领域已知或待鉴定的任何类型的抑制剂均可用于抑制基因的功能。

ZFP和TALEN

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过利用基因编辑系统来实现，该基因编辑系统包括与内切核酸酶融合的DNA结合蛋白，如一种或多种锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样蛋白(TAL)。实例包括ZFN、TALE，以及TALEN。

ZFP和TAL的DNA结合结构域可被“工程化”成与所关注的靶DNA序列结合。例如，可以修饰天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区的一个或多个氨基酸，以便直接与预定的DNA序列结合。用于合理设计的标准描述于例如美国专利6,140,081、美国专利6,453,242、美国专利6,534,261、WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536、WO 03/016496，以及美国专利公布No.20110301073A1。

在一些实施方案中，DNA结合蛋白包含锌指蛋白(ZFP)或ZFP的一个或多个锌指结构域。ZFP或其结构域通过一个或多个“锌指”(结合结构域内的氨基酸区域，其结构通过锌离子的配位而稳定化)以序列特异性方式与DNA结合。天然存在的ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的某些位置处进行氨基酸置换来改变。此外，许多工程化基因特异性锌指可商购获得(参见例如用于锌指构建的CompoZr平台，由Sangamo Biosciences(Richmond,Calif.,USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,USA)合作开发)。因此，在一些实施方案中，ZFP被工程化成结合本文鉴定为待抑制的基因内的靶序列。典型的靶序列包括外显子、编码序列的N末端区域附近的区域(例如，第一外显子、第二外显子)和5'调控区(启动子或增强子区域)。ZFP与内切核酸酶或DNA切割结构域融合，以形成锌指核酸酶(ZFN)。DNA切割结构域的实例包括IIS型限制性酶的DNA切割结构域。

在一些实施方案中，经由转染包含编码ZFN的核酸序列的核酸构建体(例如，质粒、mRNA或病毒载体)将ZFN引入细胞(例如干细胞)中。ZFN然后在细胞中由构建体表达，并导致靶基因的编辑和破坏。在一些实施方案中，ZFN以其蛋白质形式引入细胞中。

在一些实施方案中，DNA结合蛋白包含天然存在或工程化的转录激活因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，如在转录激活因子样蛋白效应物(TALE)蛋白中。参见例如US20110301073 A1，其以引用方式并入本文。TALE DNA结合结构域是包含一个或多个TALE重复序列的多肽，每个重复序列的长度为33-35个氨基酸并包括1或2个DNA结合残基。已确定TAL重复序列的位置12和13处的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG与T结合，NI与A结合，并且NN与G或A结合。参见US20110301073 A1。在一些实施方案中，TALE可被设计成具有对本文鉴定为待抑制的基因内的所关注的靶DNA序列具有特异性的TAL重复序列阵列。定制设计的TALE阵列也可通过Cellectis Bioresearch(Paris,France)、TransposagenBiopharmaceuticals(Lexington,Ky.,USA)和Life Technologies(Grand Island,N.Y.,USA)商购获得。在一些实施方案中，TAL DNA结合结构域与内切核酸酶融合以形成TALE-核酸酶(TALEN)，其切割本文鉴定为待抑制的基因内的核酸靶序列。

在一些实施方案中，经由转染包含编码TALEN的核酸序列的核酸构建体(例如，质粒、mRNA或病毒载体)将TALEN引入细胞(例如干细胞)中。TALEN然后在细胞中由构建体表达，并导致靶基因的编辑和破坏。在一些实施方案中，TALEN以其蛋白质形式引入细胞中。

CRISPR/Cas

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过利用用于基因编辑的CRISPR(对于“规律间隔成簇短回文重复序列”)/Cas(对于“CRISPR相关核酸酶”)系统来实现。CRISPR/Cas是本领域中公知的，其中试剂和方案易于获得(Mali等人,RNA-Guided Human GenomeEngineering via Cas9,Science,2013年2月15日,第339卷(6121),第823(4)页；Hsu等人,Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering,Cell,2014年6月05日,第157卷(6),第1262-1278页；Jiang等人,RNA-guided editing of bacterialgenomes using CRISPR-Cas systems,Nature Biotechnology,2013,第31卷(3),第233页；Anzalone等人,Search-and-replace genome editing without double-strand breaksor donor DNA,Nature,2019年12月,第576卷(7785),第149-157页；Komor等人,Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage,2016,Nature 533:420-424；Gaudelli等人,Programmable base editingof A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage,Nature,2017,第551卷(7681),第464页)。示例性CRISPR/Cas基因编辑方案描述于Jennifer Doudna和PrashantMali,CRISPR-Cas:A Laboratory Manual,2016(CSHL Press,ISBN:978-1-621821-30-4)和Ran等人,Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system,Nature Protocols,2013,第8卷(11),第2281页。

CRISPR/Cas系统通常包含两种组分：(1)RNA依赖性DNA核酸酶，本文也称为CRISPR核酸内切酶或Cas蛋白，如Cas9、Cas12或其它替代核酸酶；以及(2)非编码短“向导RNA”，其包含含有crRNA(“CRISPR RNA”)和tracrRNA(“反式活化crRNA”)的双RNA、或单链全长向导RNA，并且包含将核酸酶引导至基因组中的靶位点的靶向序列。向导RNA(gRNA)将核酸酶引导至靶位点，其中核酸酶在靶位点处的DNA中生成双链断裂(DSB)。然后，所得的DSB通过两种一般修复途径之一进行修复：非同源末端连接(NHEJ)途径和同源定向修复(HDR)途径。NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能够快速修复DSB，但经常导致DSB位点处小核苷酸插入或缺失(插入缺失)，从而导致移码突变，这导致产生非功能性基因产物。HDR途径效率较低，但具有高保真度。当向CRISPR内切核酸酶提供与断裂区域同源的DNA模板时，使用同源DNA模板经由HDR修复双链断裂。HDR途径允许将大基因插入序列与RNP一起插入细胞中。

本领域描述了包含靶向所关注基因中的靶位点的序列的gRNA序列的设计或选择。靶位点可以包括调控区序列(如启动子和增强子)，以及编码区内的序列(如外显子，例如5'端附近的外显子，或编码蛋白质的特定结构域或区域的外显子)。在一些实施方案中，基于其紧邻前间隔序列相邻基序(PAM)序列5'的位置来选择靶位点，如典型地NGG或NAG。

指导序列被设计成包括与靶序列(靶位点处的核苷酸序列)具有互补性的靶向序列。不一定需要完全互补性，只要互补性足以引起向导序列与靶序列之间的杂交并促进靶位点处形成CRISPR复合物即可。在一些实施方案中，gRNA的靶向序列与靶序列之间的互补性程度为至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高(例如，100％或完全互补)。

在一些实施方案中，向导序列的长度为至少15个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，向导序列的长度为不超过75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、或20个核苷酸。在一些实施方案中，向导序列的靶向序列部分的长度为约20个核苷酸。具有靶标互补性的区域较短(<20个核苷酸)的截短gRNA描述为有效且改善的靶标特异性(参见例如Fu等人,Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs,Nature Biotechnology,2014,第32卷(3),第279页)。因此，在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列的长度为17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列与靶位点处的核苷酸序列完全互补。在向导RNA的靶向序列与靶位点处的核苷酸序列不完全互补的一些实施方案中，靠近基因组中的PAM序列的靶向序列的部分(也称为种子区域)与靶位点处的核苷酸序列完全互补。换句话讲，向导序列(即非种子区域)的核苷酸5'的一些变化是允许的。例如，向导序列可被设计成包括长度为至少17个核苷酸(例如，长度为17、18、19或20个核苷酸)的靶向部分，其具有与靶序列中至少17个核苷酸完全互补的17个核苷酸的种子区域。

表1提供了特定基因中靶序列的实例。

在一些实施方案中，向导序列包括17-20个核苷酸的靶向序列，其中种子区域中的至少17个核苷酸(靶向序列的3'部分)与靶序列中的至少17个核苷酸完全互补，例如与靶序列3'端起的17个核苷酸完全互补。

表1

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用于CRISPR基因组编辑的gRNA数据库可公开获得，该数据库提供了人类基因组或小鼠基因组中基因的组成型外显子中的示例性sgRNA靶序列(参见例如由GenScript和由Massachusetts Institute of Technology提供的gRNA-数据库；另参见Sanjana等人,Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening,NatureMethods,2014,第11卷(8),第783页)。在一些实施方案中，gRNA序列是或者包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。

适用于本文的Cas蛋白或CRISPR核酸内切酶的实例包括Cpf1(Zetsche等人,Cpf1Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System,Cell(Cambridge),2015年10月22日,第163卷(3),第759-771页)、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas12、Cas13、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、或Csf4、或它们的功能衍生物(即，天然存在的CRISPR核酸内切酶的突变体形式或衍生物，如其片段，其基本上保留了天然存在形式的RNA依赖性核酸内切酶活性)。参见例如US20180245091A1和US20190247517A1。在一些实施方案中，Cas蛋白为Cas9，例如来自酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白是来自化酿脓链球菌的Cas9蛋白，其氨基酸序列在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2提供。CRISPR-Cas9后鉴定的许多Cas蛋白提供了期望的特征。例如，CRISPR-Cas12进行交错切割，并可编辑表观基因组——可告知基因启动或关闭的化合物。Cas13通过靶向RNA而非DNA来影响基因表达。CRISPR-CasX比Cas9更小，并且可用于控制基因表达，而不仅仅是编辑基因。CasY的作用与Cas9非常相似，但由完全不同的蛋白质结构构成，允许其在不同的条件下发挥作用。

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过CRISPR介导的基因编辑实现，其包括向细胞(例如，多能性干细胞、或iPSC、或HE、或HSC、或祖细胞)中引入编码Cas核酸酶的第一核酸，以及编码对本文鉴定为待抑制的基因中的靶序列特异性的向导RNA(gRNA)的第二核酸。两种核酸可以包括在一个核酸构建体(或载体)中，或者提供在不同的构建体(或载体)上，以实现Cas蛋白和gRNA在细胞中的表达。Cas核酸酶和gRNA在细胞中的表达指导在靶序列处形成CRISPR复合体，从而导致DNA切割。

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过CRISPR介导的基因编辑来实现，其包括将gRNA和Cas核酸酶之间的组合或复合体引入细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白/gRNA组合或复合体可以经由例如电穿孔、基因枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压、脂质体、纳米粒子、显微注射、裸DNA质粒转移、蛋白质转导结构域介导的转导或病毒介导(包括整合型病毒载体，如逆转录病毒和慢病毒，以及非整合型病毒载体，如腺病毒、AAV、HSV、痘苗病毒)而递送至细胞中。

无论使用何种特定基因编辑方法，为了确认基因序列已被修饰并且基因功能已被抑制，可以执行多种测定，包括例如通过经由Southern和Northern印迹、PCR(包括RT-PCR)、或核酸测序来检查DNA或mRNA，或者通过经由例如免疫学手段(ELISA和Western印迹)来检测特定蛋白质或肽的存在或活性。

在一些实施方案中，DGKα和DGKζ基因中的至少一种的功能通过CRISPR/Cas9系统将一种或多种插入缺失引入这些基因中的至少一种的早期外显子来抑制，这导致这些基因的至少一种中的一种或多种移码突变，使得不从经编辑基因翻译功能性蛋白质。在一些实施方案中，这两种基因的功能通过使用CRISPR/Cas9将插入缺失引入到两种基因的早期外显子中来抑制，导致两种基因中的移码突变，使得不从经编辑基因翻译功能性蛋白质。在一些实施方案中，两种基因中的一者或两者的抑制与另一个基因的抑制组合地进行。

通过使用切口酶(即CAS9切口酶)和高保真酶，也可以在没有双链断裂或供体DNA的情况下使用CRISPR/Cas系统。参见例如Anzalone等人,Search-and-replace genomeediting without double-strand breaks or donor DNA,Nature,2019年12月,第576卷(7785),第149-157页；Komor等人,Programmable editing of a target base in genomicDNA without double-stranded DNA cleavage,Nature,2016,533:420-424；Gaudelli等人,Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage,Nature,2017,第551卷(7681),第464页)。

通过降低或消除mRNA的水平或功能来抑制

在一些实施方案中，基因功能的抑制通过降低或消除从基因转录的mRNA的水平或功能(即抑制mRNA)来实现。与通过基因编辑系统抑制不同，mRNA的抑制是暂时的。

在一些实施方案中，mRNA的抑制可以通过使用例如反义核酸、核酶、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、miRNA(微RNA)或它们的前体、或可在细胞中转录产生反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA或它们的前体的核酸构建体来实现。

反义——反义技术是一种公知的方法。反义RNA是与内源性mRNA的全长或一部分互补并通过与内源性mRNA形成双链体来阻断从内源性mRNA翻译的RNA分子。反义RNA可以合成制备并引入所关注的细胞(例如，干细胞)中，或者在所关注的细胞中通过由外源引入的核酸构建体转录而制备，以实现所关注基因表达的抑制。反义RNA不必与来自所关注基因的全长mRNA互补。然而，反义RNA的长度应足以与靶mRNA形成双链体并阻断基于靶mRNA的翻译。典型地，反义RNA的长度为至少15个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、75、100、200、300、400、500个核苷酸或更多个。在一些实施方案中，反义RNA的长度为不超过500、400、300、200、100、75或50个核苷酸。

核酶——核酶(即催化性RNA)可被设计成与靶RNA特异性配对并在特定位置处切割磷酸二酯骨架，由此使靶RNA在功能上失活。参见例如美国专利No.6,423,885、美国专利No.5,254,678和Perriman等人,Effective ribozyme delivery in plant cells,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,1995年6月20日,第92卷(13),第6175-6179页。核酶可以合成制备并引入所关注的细胞(例如，干细胞)中，或者在所关注的细胞中通过由外源引入的核酸构建体转录而制备。

RNAi(RNA干扰)——通过RNAi抑制基因表达或翻译是本领域已知的，并且可以利用RNA分子如siRNA(对于“小干扰RNA”)、shRNA(对于“短发夹RNA”)以及miRNA(对于“微RNA”)来实现。已知siRNA和shRNA参与RNA干扰途径并干扰特定基因的表达。siRNA是小型(长度典型地为20-25个核苷酸)双链RNA，并且可设计成包括与靶mRNA(即由所关注基因转录的mRNA)或靶mRNA的一部分同源或互补的序列。shRNA被核糖核酸酶DICER切割以产生siRNA。鉴于靶基因的序列，siRNA或shRNA可以合成设计和制备并引入所关注的细胞(例如，干细胞)中，或者在所关注的细胞(例如，干细胞)中由外源引入的编码此类RNA的核酸构建体制备。miRNA也是从由非蛋白质编码基因转录的长前体加工的小RNA分子(通常约21-22个核苷酸)，并通过与靶mRNA的不精确碱基配对而中断翻译。miRNA或其前体(miRNA初始体或miRNA前体)可以合成制备并引入所关注的细胞(例如，干细胞)中，或者在所关注的细胞(例如，干细胞)中由外源引入的编码miRNA或其前体的核酸构建体制备。

在一些实施方案中，mRNA的抑制可以使用CRISPR/Cas系统的经修饰形式来实现，其中作为酶失活核酸酶的Cas分子与靶向所关注基因的gRNA组合使用。靶位点可以处于基因的5'调控区(例如，启动子或增强子区)。在一些实施方案中，Cas分子是酶失活的Cas9分子，其包含消除或显著降低DNA切割活性的突变，例如点突变(参见例如WO2015/161276)。在一些实施方案中，酶失活的Cas9分子直接或间接地与转录阻遏蛋白融合。

通过其它手段抑制

本发明包括本领域已知的用于抑制基因功能，包括用于降低由该基因编码的蛋白质的水平或活性的其它方法，例如，通过向细胞(例如干细胞)中引入直接抑制由该基因编码的蛋白质的活性的化合物(例如小分子、抗体等)。

CAR

在一些实施方案中，修饰成抑制一种或多种所选基因的细胞(例如干细胞)也已被修饰成含有编码嵌合抗原受体(或“CAR”)的核酸。

在一些实施方案中，可以在修饰细胞以抑制所选基因的功能之前、同时、或之后将编码CAR的核酸引入细胞中。在抑制是瞬时的(例如，通过反义RNA或RNAi)的实施方案中，优选地在细胞被修饰以实现抑制之前将编码CAR的核酸引入细胞中。在抑制是永久性的(例如，通过基因编辑)的实施方案中，可以在细胞被修饰以实现抑制之前、同时、或之后将编码CAR的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，编码CAR的核酸被设计成允许在引入DSB之后通过HDR插入基因编辑的靶位点，即，通过敲入或插入编码CAR的核酸来破坏基因。

在一些实施方案中，由修饰成抑制一种或多种所选基因的细胞(例如干细胞)衍生的细胞(例如，造血谱系细胞或免疫细胞)也已被修饰成含有编码嵌合抗原受体(或“CAR”)的核酸。

术语“嵌合抗原受体”(“CAR”，也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”和“嵌合免疫受体”)应理解为提及使抗原识别部分移植到免疫细胞上的工程化受体。一般而言，CAR由彼此可操作地连接的对靶抗原特异性的抗原识别部分、跨膜结构域，以及在免疫细胞上天然表达的受体的胞内/胞质信号结构域构成。所谓的“可操作地连接”意指单独的结构域彼此连接，使得在抗原识别部分与靶抗原结合时，经由胞内信号转导结构域诱导信号以活化表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)并使其效应子功能被活化。

CAR的抗原识别部分是受体的细胞外部分，其识别并结合靶抗原的表位。抗原识别部分通常为但不限于scFv。

CAR的胞内结构域可以包括免疫细胞的天然存在的受体的初级胞质信号转导序列，和/或免疫细胞的天然存在的受体的次级或共刺激序列。初级胞质信号转导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域包含来自CD3ζ的胞质信号转导序列。在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域可以包含来自CD3ζ的胞质信号转导序列与共刺激分子的共刺激信号转导序列的组合。合适的共刺激分子的实例包括CD27、CD28、4-lBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、TIM3、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3等。在一些实施方案中，CAR的胞质结构域被设计成包含CD3ζ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。

CAR的跨膜结构域通常是典型的疏水性α螺旋，其跨越膜并且可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域可以衍生自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或者衍生自免疫球蛋白如IgG4。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。

术语“靶抗原”应理解为提及由细胞表达的任何蛋白质或非蛋白质分子，其是试图被表达受体的免疫细胞如T细胞或NK细胞所靶向的。靶抗原可为“自身”分子(在患者体内表达的分子)或非自身分子(例如，来自感染性微生物)。本文所提及到的靶抗原不限于天然能够引发T或B细胞免疫反应的分子；相反，“靶抗原”是指试图被靶向的任何蛋白质或非蛋白质分子。在一些实施方案中，靶抗原在细胞表面上表达。应当理解，靶抗原可以仅由靶细胞表达，或者其也可以由非靶细胞表达。在一些实施方案中，靶抗原是非自身分子，或仅由试图被靶向的细胞表达或由试图被靶向的细胞以比正常细胞显著更高的水平表达的分子。靶抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-I)、gplOO(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的糖蛋白，如MUC1和MUC16；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如巴二氏病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它肿瘤相关抗原包括叶酸受体α(FRa)、EGFR、CD47、CD24、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl 85erbB2、pl80erbB-3、cMet、nm-23Hl、PSA、CA19-9、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG-72、TLP、TPS、PSMA、间皮素、或BCMA。

在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原，特别是蛋白质、糖蛋白或非蛋白肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，靶抗原选自CD47、叶酸受体α(FRα)和BCMA。

在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤相关抗原TAG-72。

在其它实施方案中，靶抗原是表面蛋白，例如CD24，并且在另一个实施方案中是可用于肿瘤靶向的表面蛋白，例如CD19或CD20。

在一些实施方案中，源细胞包含一种或多种编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸分子，其中所述受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。在一些实施方案中，源细胞表达至少一种CAR。

在其它实施方案中，衍生的细胞包含一种或多种编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸分子，其中所述受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。在一些实施方案中，衍生的细胞表达至少一种CAR。

本领域的技术人员应当理解，借以将遗传修饰(例如，引入编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸分子)引入细胞中的机制可以采取本领域的技术人员公知和理解的任何合适的形式。例如，通常经由使用表达构建体将遗传物质方便地引入细胞中。

CAR可以通过质粒DNA或mRNA的转染；病毒载体的转导，包括γ-逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒；以及CRISPR-Cas9、TALEN或ZFN介导的基因编辑引入细胞中。

分化方法

本发明一般涉及用于修饰干细胞，特别是iPSC，并使它们进一步分化成包含增强的活性的干细胞衍生的免疫细胞的方法和组合物。

用于使源细胞(例如多能性干细胞)分化成免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法在本领域中是已知的(Li等人,Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineeredwith Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity,Cell Stem Cell,2018,23(2):181-192e5；Themeli等人,Generation of tumor-targeted human Tlymphocytes frominduced pluripotent stem cells for cancer therapy,NatBiotechnol,2013,31(10):928-33；Maeda等人,Regeneration of CD8alphabeta T Cellsfrom T cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity,Cancer Res,2016,76(23):6839-6850)。

它们典型地遵循三个主要阶段：1)从PSC生成和扩增CD34+细胞，2)从CD34+细胞分化祖细胞/免疫细胞，以及3)祖细胞/免疫细胞的扩增。

多能性细胞的制备

在一些实施方案中，可以在向中胚层细胞分化之前制备和/或分选PSC。选择过程可以基于一种或多种基因或一种或多种标记。

在重编程生成iPSC后，可以基于胚胎样形态、重编程后的转基因沉默、经由碱性磷酸酶测定的多能性评估、或多能性和更新标记(如TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog和Oct4)的检测来表征细胞。通过类胚体形成和/或畸胎瘤形成来监测分化潜能。通常还评估了核型分析、身份匹配和不育性(Huang等人,Human iPSC banking:barriers and opportunities,Journal of Biomedical Science,2019年10月28日,第26卷(1))。

多种方法被用于人类iPSC的维持和制备，这些包括使用失活鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养细胞依赖性培养、使用MEF条件培养基培养iPSC、使用无血清和无饲养层扩增培养基或MEF条件培养基由iPSC创建类胚体和基质依赖性繁殖。iPSC使用酶促或机械传代方法进行传代，一般来讲，这在集落变得过大/致密或者发生增加的分化时完成。最佳iPSC集落是观察到具有明确边缘和集落间形态一致的那些。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9最常用于PSC的基因组编辑。通常，使用克隆载体来设计和克隆TALE阵列或CRISPR向导RNA。单细胞人PSC采用载体转染或转导，并且可以经由荧光报告基因采用FACS或者经由选择标记通过抗生素部分来选择靶细胞。在富集后1至2周之后，挑选并扩增PSC以进行基因组DNA分析以及靶向克隆恢复和扩增。两种基因编辑方法均已用于生成敲入和/或敲除iPSC品系(Hendricks等人,GenomeEditing in Human Pluripotent Stem Cells:Approaches,Pitfalls,and Solutions,Cell stem cell,07January 2016,第18卷(1),第53-65页)。

在一些实施方案中，使用如Accutase，将iPSC从贴壁态提升为溶液中的单细胞，然后在用于特定基因KO的含有向导RNA的RNP复合体和/或含有可能期望在细胞中所关注基因位点处敲入的序列的质粒的存在下进行电穿孔。

在一些实施方案中，基因编辑后，在功能研究(如分化为NK细胞)中的任何进一步操纵或测试之前，使iPSC稳定化并返回至正常培养物。由多能性干细胞生成和表达CD34+细胞

本领域中的大多数方法均是从PSC分化为中胚层细胞开始的。随后中胚层细胞分化为HE/HSC，HE/HSC也可同时扩增。

PSC分化方法可以遵循多种方法，其包括类胚体(EB)形成、饲养细胞共培养、二维细胞外基质包被培养以及使用转录因子转导进行编程或重编程(Lim等人,Hematopoieticcell differentiation from embryonic and induced pluripotent stem cells Stemcell research&therapy,2013年6月18日,第4卷(3),第71页；Tajer等人,Ex VivoExpansion of Hematopoietic Stem Cells for Therapeutic Purposes:Lessons fromDevelopment and the Niche,Cells,18 2019年2月,第8卷(2))。这些方法可以产生造血祖细胞。越来越多的证据表明，生血内皮(HE)细胞是瞬态中间体，有助于从头产生多能HSC。

PSC分化的三维EB模拟体内胚胎发育，因此利用EB形成的几种方法已被开发用于PSC的造血分化。这些包括自发EB形成、悬滴EB形成和单细胞聚团EB(spin-EB)形成。为了特异性诱导造血谱系，将EB的单细胞悬浮液导入甲基纤维素培养基中，该培养基用于在造血细胞因子和生长因子存在下支持造血发育。基于单细胞聚团EB方法的HSC分化可能花费4至11天的培养。

饲养细胞共培养是将一层饲养细胞与PSC一起培养的方法，以支持它们在适当的培养基中向造血谱系发育。基质细胞共培养用于获得HE/HSC。OP9基质细胞、衍生自主动脉-性腺-中肾区域的基质细胞、胎肝衍生的基质细胞以及骨髓衍生的基质细胞(如S17和M210)以及AFT04基质细胞是用于共培养的示例品系。基质细胞共培养方法通常是动物衍生的，并且可为血清依赖性或非依赖性。

在包被有细胞外基质(如胶原蛋白和纤连蛋白)的培养皿中的二维培养被用作单层培养来分化PSC。使用人纤连蛋白或IV型胶原蛋白的基质主要用于生成造血祖细胞。PSC还在基质组分如层粘连蛋白、I型胶原蛋白、巢蛋白和肝素硫酸蛋白聚糖以及生长因子和几种其它未定义化合物的存在下分化为中胚层细胞。在用造血混合物培养基替换后，这些中胚层细胞能够诱导造血细胞。

在用于使PSC分化为HE/HSC的造血混合物培养基中，需要几种细胞外源性因子。化学物质、细胞因子和生长因子的组合包括但不限于bFGF、BMP4、激活素A、SB431542、DKK、CHIR99021、VEGF、IL-6、IGF-1、IL-11、SCF、EPO、TPO、IL-3和FLT3-L。

经由内皮细胞直接编程或重编程为HE/HSC的转录因子转导已被用于PSC向HSC的分化。转录因子包括但不限于ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1、SPI1、FOSB、GFI1、ETV2和GATA2。

造血混合物用于扩增CD34+细胞/HSC。这些包括但不限于以上所提及的那些。造血混合物商业试剂盒也可用于CD34+细胞的扩增。

其它小分子、蛋白质和化学物质也可以与以上所提及的细胞因子/生长因子结合用于HSC/CD34+细胞扩增。这些包括但不限于四亚乙基戊胺、HOXB4、前列腺素E2、Stemreginin 1、UM729、UM171、Notch配体、血管生成素样蛋白5、IGFBP2、多效生长因子、丙戊酸以及组蛋白脱乙酰酶和DNA甲基转移酶的小分子抑制剂。三维纳米纤维支架也已用于HSC扩增。

HE/HSC分化为淋巴/髓系谱系细胞

除骨髓外，HSC/CD34+造血细胞祖细胞(HSC)的主要来源是血液。具体地，这些可以从外周血或脐带血中分离。iPSC细胞系也是这些细胞的来源。HSC/CD34+造血祖细胞的富集可以使用抗CD34免疫磁性粒子/珠粒来进行。

CD34+祖细胞可以用包括多种细胞因子、生长因子和/或小分子的扩增混合物进行分化和扩增。抗体染色和标记表达的流式细胞术分析用于监测分化成功。造血潜能通过克隆源性集落形成单位测定进行监测。相关造血基因表达经由PCR、转录组分析或其它基于分子生物学的方法进行监测。可以在动物(如NOD/SCID小鼠)中测试移植。

细胞因子和生长因子组合用于驱动HSC分化为免疫细胞。例如，IL-3、SCF、IL-15和FLT3-L与IL-2、IL-15和IL-7组合使用，以在存在或不存在饲养细胞如EL081D2的情况下生成具有EB的NK细胞。

为了诱导淋巴定型，在SCF、FLT3L和IL-7或IL-15存在下，利用表达Notch配体δ-样-1(OP9-DLL1)或OP9-DLL4的OP9细胞系来生成不具有CD34富集或单细胞聚团EB形成的NK细胞。

可以使用饲养细胞(如具有膜结合IL-5和4-1BB配体的K562)来扩增衍生自PSC/HSC的NK细胞。用于NK细胞扩增的其它细胞系包括膜结合IL-21人工抗原呈递细胞。商业试剂盒可用于将HSC分化为NK细胞，例如StemSpan^TMNK Cell Generation试剂盒(STEMCELLTechnologies)。

OP9和OP9-DLL1在FLT3L、IL-7和IL-2存在下培养，随后用抗CD3抗CD28刺激也可以诱导T细胞。商业试剂盒也可用于将HSC分化为T细胞，例如StemSpan^TMT Cell Generation试剂盒(STEMCELL Technologies)。

单核细胞和巨噬细胞可以使用基于基质细胞的方法生成，例如使用SC17细胞系或单细胞聚团EB方法，并随后在IL-3、CSF-1和M-CSF存在下进行培养。

经修饰细胞的药物组合物和治疗性用途

在另一个方面，本文提供了组合物，该组合物含有通过本文所公开的方法产生的细胞，即，其中一种或多种所选基因的功能已被抑制的经修饰细胞以及衍生自它们的细胞。

在一些实施方案中，本文提供了包含本文所产生的细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物。药学上可接受的载剂包括溶剂、分散介质、等渗剂等。载剂的实例包括油、水、盐水溶液、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、防腐剂等、或它们的组合。在一些实施方案中，药物组合物典型地以单位剂量可注射形式(溶液剂、混悬剂、乳剂)制备和配制用于向患者施用，如例如用于过继细胞疗法。在一些实施方案中，药物组合物可以采用定时释放、延缓释放和持续释放递送系统。

在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量的细胞，如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方案中，药物组合物包括本文所公开的经修饰细胞，其量为约100万至约1000亿个细胞，例如至少100、500、1000、2500、5000、10000、20000、30000、40000或50000万个细胞，多至约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000亿个细胞。

在一些实施方案中，药物组合物还包含另一种活性剂或药物，如化疗剂。

在另一方面，本文提供了本文所公开的经修饰细胞的方法和用途，如过继细胞疗法中的治疗性方法和用途。

在一些实施方案中，该方法包括将本文所公开的经修饰细胞或包含本文所公开的经修饰细胞的组合物施用于患有疾病或病症或处于发展疾病或病症风险的受试者。

在一些实施方案中，疾病或病症是赘生性病症(即，癌症)、或微生物或寄生虫感染(如HIV、STD、HCV、HBV、CMV或抗生素抗性细菌)、或自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎(RA)、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克隆氏病、多发性硬化症、哮喘)。

在一些实施方案中，赘生性病症包括中枢神经系统肿瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、儿科肿瘤、头颈癌(例如鳞状细胞癌)、乳腺癌和前列腺癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌两者)、肾癌(例如肾细胞腺癌)、食管胃癌、肝细胞癌、胰胆管肿瘤(例如腺癌和胰岛细胞瘤)、结直肠癌、宫颈癌和肛门癌、子宫和其它生殖道癌、泌尿道癌(例如输尿管和膀胱)、生殖细胞瘤(例如睾丸生殖细胞瘤或卵巢生殖细胞瘤)、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、原发灶不明转移癌、人类免疫缺陷相关恶性肿瘤(例如卡波济氏肉瘤)、淋巴瘤、白血病、恶性黑素瘤、肉瘤、内分泌肿瘤(例如甲状腺)、间皮瘤和其它胸膜或腹膜肿瘤、神经内分泌肿瘤和类癌瘤。

在一些实施方案中，本发明的方法例如通过在治疗疾病的背景下抑制肿瘤生长和/或转移，或者通过在治疗病毒感染的背景下减少病毒载量和/或传播而导致病症的治疗，即减少或改善病症、或病症的任一种或多种症状。术语“治疗”并不一定意味着完全恢复。在一些实施方案中，本发明方法导致病症的预防，即预防病症、降低病症发展的风险、或延迟病症的发作。类似地，“预防”并不一定意指受试者最终不会感染该病症。

在一些实施方案中，向其施用细胞或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，典型地灵长类，如人类。

在一些实施方案中，细胞或包含细胞的组合物经肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。

所期望剂量的衍生细胞或包含衍生细胞的组合物可以通过组合物的单次施用、多次施用、或连续输注施用来递送。治疗或预防功效可以通过对治疗的受试者的定期评估来监测。

在一些实施方案中，源细胞由分离自受试者的细胞生成，然后根据本文所公开的方法进行修饰(抑制一种或多种基因的功能)，进一步分化，然后施用于同一受试者。

在一些实施方案中，过继细胞疗法通过同种异体转移进行，其中源细胞由来自与待接受细胞疗法的受试者(受者受试者)不同的供体受试者的细胞生成。在一些实施方案中，供体和受者受试者表达相同的HLA类别或超类型。

实施例

在以下实施例中，已经说明但不限于，为了生成具有增强的肿瘤治疗功能的干细胞衍生的免疫细胞，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术来消除两个DGK基因。通过基于基因组DNA测序的定量来检查基因编辑效率。使用Accutase，将iPSC作为单细胞提升，然后将具有专门设计的向导RNA的Cas9核酸酶复合体转染到这些iPSC中，以消融一种或多种免疫调节基因。iPSC然后分化成CD34+细胞。CD34+细胞进一步分化成iNK细胞。细胞毒性在体外进行监测。

实施例1——TAG-72CAR iPSC单细胞克隆的生成

干细胞如iPSC可以无限地自我更新并分化成各种细胞类型，包括造血干细胞(HSC)和免疫细胞。免疫细胞如T细胞和NK细胞已经从iPSC生成用于癌症疗法(Li等人,Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric AntigenReceptors Enhance Anti-tumor Activity,Cell Stem Cell,2018,23(2):181-192e5；Themeli等人,Generation of tumor-targeted human T lymphocytes frominducedpluripotent stem cells for cancer therapy,Nat Biotechnol,2013,31(10):928-33；Maeda等人,Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T cell-Derived iPSCImparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity,Cancer Res,2016,76(23):6839-6850)。CAR-T或CAR-NK细胞可以按照类似的方法衍生自慢病毒CAR转导的iPSC。为了生成TAG-72CAR iPSC，经由非病毒CRISPR/Cas9基因敲入方法(如描述于WO2017/088012和PCT/AU2020/050800中，其以引用方式并入本文)，将TAG-72CAR表达盒引入AAVS1安全港(safe harbor)位点中。对TAG-72CAR阳性iPSC进行分选，以生成纯化的TAG-72CAR iPSC单细胞克隆(图1)。通过流式细胞术表征iPSC表面的CAR表达。

单细胞克隆

对于单细胞克隆，首先将96孔板用含CellAdhere^TMLaminin-521的PBS在37℃下包被2小时。将TAG-72CAR iPSC分选并以1个细胞/孔的平均密度接种到96孔板中。使用将转染的iPSC作为单细胞提升，随后进行计数，洗涤并重悬，用于根据需要用相关抗体混合物进行染色。在用BD FACSAria^TM Fusion分选之前，将细胞在4℃下染色15分钟。使用碘化丙啶(PI)染色来排除死细胞。对细胞进行门控以移除碎片、双联体和死细胞，随后将其分选到96孔板中。将板立即置入37℃细胞培养箱中48小时，并在细胞适于传代时每天执行培养基更换。

实施例2——DGK KO iPSC的生成(预分选和单细胞克隆)

DGKα和DGKζ均具有多个转录物。为了消除DGKα和DGKζ的所有主要亚型，设计了一系列向导RNA来靶向DGKα基因和DGKζ基因(表1)。因此，可以将框外插入缺失引入其开放阅读框(ORF)的早期外显子中，以破坏DGKα和DGKζ的翻译。

为了生成CRISPR DGKα和/或DGKζ基因双重敲除iPSC，将由代表性gRNA(SEQ IDNO:3；SEQ ID NO:11)形成的RNP复合体使用Lonza4D-Nucleofector^TM系统转染到iPSC中。首先，将12孔板用含CellAdhere^TM Laminin-521(STEMCELL Technologies)的PBS包被，并在37℃下孵育2小时。转染前，使iPSC与含有RevitaCell^TM补充剂(Life Technologies)的mTeSRPlus^TM培养基(STEMCELL Technologies)一起预孵育2小时。通过将全长向导RNA(gRNA)与Lonza P3缓冲液和Cas9结合来制备RNP。然后将RNP混合物在室温下孵育10-20分钟。在预孵育后，使用(Life Technologies)，将iPSC作为单细胞提升，并且每个反应获得1×10⁶个细胞用于电穿孔。为了生成基因敲除iPSC，将Lonza P3缓冲液和RNP混合物中的细胞合并到PCR管中；为了生成基因敲入iPSC，将Lonza P3缓冲液中的细胞与RNP混合物和供体DNA组合。将含有RNP混合物的细胞装载到Lonza4D-Nucleofector^TM中进行电穿孔。随后，将含有CloneR^TM培养基的mTeSR Plus^TM添加到反应中并在室温下孵育10分钟。在孵育后，将细胞添加到Laminin-521预包被的板中的含有CloneR^TM培养基的mTeSR Plus^TM中。每天执行mTeSR Plus^TM的培养基更换，持续72小时，并且在达到约80％汇合度时(电穿孔后6-7天)，使细胞传代。在该阶段结束时，细胞被称作DGK KO预分选iPSC。

在RNP转染和扩增后，从iPSC中提取基因组DNA，以用于基因编辑的定量分析。使用ICE(CRISPR编辑推断)测定来分析基因编辑效率(Hsiau等人,Inference of CRISPR Editsfrom Sanger Trace Data.bioRxiv,2018,10.1101/251082(251082))。DGKαgRNA(SEQ IDNO:3)iPSC转染的样本的DGKα基因编辑效率分析在此处作为ICE分析的代表性结果显示(图2A-2C)。此外，还显示了DGKαgRNA(SEQ ID NO:3)和DGKζgRNA(SEQ ID NO:11)可将插入缺失引入多种iPSC品系中(图3A-3B)。

为了生成CRISPR DGKα和DGKζ基因单一/双重敲除iPSC和单细胞克隆，需要两个阶段(图1)。首先，第I阶段由CRISPR/Cas9基因编辑构成，包括iPSC的电穿孔及其恢复，继之以转基因iPSC的后续扩增。第二阶段由转染的iPSC的单细胞克隆构成，其涉及单细胞分选和后续的克隆iPSC扩增。

单细胞克隆

对于单细胞克隆，首先将96孔板用含CellAdhere^TMLaminin-521的PBS在37℃下包被2小时。将DGKα(SEQ ID NO:3)和/或DGKζ(SEQ ID NO:11)RNP转染的iPSC分选并以1个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并且培养直至形成集落(例如5至9天)。使用将转染的iPSC作为单细胞提升，随后进行计数，洗涤并重悬，用于根据需要用相关抗体混合物进行染色。在用BD FACSAria^TM Fusion分选之前，将细胞在4℃下染色15分钟。使用PI染色来排除死细胞。对细胞进行门控以移除碎片、双联体和死细胞，随后将其分选到96孔板中。将板立即置入37℃细胞培养箱中48小时，并每天执行培养基更换直至细胞适于传代。在单细胞克隆后，使用Sanger测序和ICE测定来分析单细胞克隆的基因型。选择框外频率在99％至100％之间的单细胞克隆作为KO iPSC单细胞克隆(图4A-4D)。将这些选定克隆的基因型进一步与野生型Sanger测序轨迹进行比较。显示了来自DGKα和DGKζRNP共转染的iPSC的DGK双重基因KO克隆(DGKαζKO iPSC单细胞克隆01)的代表性基因分型结果。在单细胞克隆后，对预分选的DGKα和DGKζRNP共转染的iPSC进行纯化，这通过与未转染的(野生型)细胞相比移除了切割位点下游的碱基的异质混合物以及单克隆中的胸腺嘧啶(T)插入(+1)的鉴定所证实(图5A-5B)。总之，这些结果展示，DGKαgRNA和DGKζgRNA能够将插入缺失引入DGK基因中并有效导致移码突变iPSC，以生成DGK KO iPSC。

TGFβ发挥全身免疫抑制并抑制宿主免疫监视，并且被视为是肿瘤中免疫抑制微环境的主要因素之一。敲除胚胎干细胞中的TGFβ受体并直接抑制TGFβ信号转导导致了多能性丧失(Watabe和Miyazono,Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewaland differentiation,Cell Research,2009年1月,第19卷(1),第103-15页)。我们使用CRISPR/CAS9技术生成了显性阴性TGFβ1和TGFβR2 iPSC(如专利PCT/AU2020/051243中所述，其以引用方式并入本文)。然而，iPSC中的TGFβR1和TGFβR2显性阴性突变在基因编辑后丧失其多能性并开始自发分化(图19)。该结果指示iPSC中TGFβ受体的基因敲除或直接抑制不能生成用于免疫细胞疗法的源细胞。

实施例3——TAG-72CAR克隆/DGK KO预分选的iPSC和TAG-72CAR/DGK KO iPSC单细胞克隆的生成

为了生成预分选的TAG-72CAR克隆/DGK KO iPSC，首先如实施例1中所述创建TAG-72CAR iPSC单细胞克隆。然后如实施例2所述使用Lonza4D-Nucleofector^TM系统，将代表性gRNA形成的RNP复合体转染到TAG-72CAR iPSC中。ICE分析结果显示，DGKαgRNA和DGKζgRNA能够将插入缺失引入DGK基因中，并导致TAG-72CAR iPSC中以高频率移码突变(图6)。此外，TAG-72CAR/DGK KO iPSC单细胞克隆也可以使用实施例2中所提及的方法衍生(图7)。

实施例4——DGK KO iPSC单细胞克隆和TAG-72CAR克隆/DGK KO预分选的iPSC分化成CD34+细胞

干细胞，如诱导型多能性干细胞(iPSC)，可以无限地自我更新并分化成各种细胞类型，包括造血干细胞(HSC)和免疫细胞。

CD34+细胞可以使用一系列已公布的方法来制备，如描述于美国专利9,260,696B2(Kaufman,Knorr)、Li等人(Stem Cell,23(2018)181-197)中的那些，或者使用市售的培养系统如STEMdiff^TM Hematopoietic试剂盒(STEMCELL Technologies)。在这些方法的一种变型中，通过使用AggreWell^TM400 6孔板(STEMCELL Technologies)形成类胚体(EB)，有利于iPSC向CD34+生血祖细胞的定向分化。可将AggreWell^TM板用抗粘附冲洗溶液(Anti-adherence Rinsing Solution)(STEMCELL Technologies)进行预处理，并在使用前用温热的mTeSR Plus^TM洗涤一次。然后每孔添加2.5mL的含RevitaCell^TM补充剂的mTeSR Plus^TM。iPSC培养物繁殖直至达到70％汇合度，此时使用将iPSC解离为单细胞，并重新接种到AggreWell^TM板中，并用含有RevitaCell^TM补充剂的mTeSR Plus^TM加满培养基至每孔总计5mL。然后将AggreWell^TM板以100xg离心3分钟，以使细胞卷入各微孔中，并在37℃、5％CO₂下孵育24小时。在孵育期后，用血清移液管移除培养基，并且每孔添加5mL的STEMdiff^TM造血培养基A(STEMCELL Technologies)。这标志着生血特化的第0天。第2天，执行一半培养基更换，其中移除2.5mL培养基A，并用2.5mL新鲜培养基A替换。第3天，执行完全培养基更换，其中移除培养基A，并用5mL的STEMdiff^TM造血培养基B(STEMCELL Technologies)替换。第5天，通过将培养基强有力地针对每个孔的表面吸移以使EB脱落来收集EB。使悬浮液通过40μm过滤器。然后将过滤器倒置，并将收集在过滤器表面的EB用2.5mL培养基B洗涤到新鲜50mL塑料管中。然后将EB接种到非组织培养物处理的6孔板的孔中的2.5mL培养基B中。第7天，每孔添加2.5mL培养基B。在第9天和第11天，用培养基B执行一半的培养基更换，如上所概述。第12天，收集贴壁和非贴壁细胞级分，并根据制造商的说明书使用CD34 MicroBead试剂盒(Miltenyi Biotec)对CD34+细胞进行分选。

如上实施例所述，执行TAG-72KI、DGK KO和克隆。然后，iPSC单细胞克隆和TAG-72CAR克隆/DGK KO预分选的iPSC中的DGK KO分化成CD34+细胞。针对CD34表达，通过流式细胞术来确定所创建的CD34+细胞的分选纯度和生血祖细胞谱。对DGK KO iPSC或TAG-72CAR/DGK KO iPSC指定的生血祖细胞的流式细胞术分析显示出CD34的表达与未转染的对照相当，指示单独的DGK KO或TAG-72CAR KI和DGK KO的组合不影响iPSC向CD34+生血祖细胞的分化(图11A-11C)。

实施例5——DGK KO CD34+(具有或不具有TAG-72CAR)分化为iNK细胞

iNK细胞可以使用一系列已公布的方法来生成，如描述于美国专利9,260,696B2(Kaufman,Knorr)、Li等人(Stem Cell,23(2018)181-197)中的那些，或者使用市售的培养系统StemSpan^TMNK Cell Generation试剂盒(STEMCELL Technologies)。在这些方法的一种变型中，将衍生自DGK KO iPSC单细胞克隆或预分选的TAG-72CAR克隆/DGK KO iPSC的CD34+生血祖细胞(如例如实施例4中所述)重新接种到用StemSpan^TM淋巴祖细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies)中的StemSpan^TM淋巴分化包被材料(STEMCELL Technologies)包被的板中。这标志着NK细胞特化的第0天。第3天，将一个体积的扩增培养基添加到培养容器中。在第7和10天，用新鲜的扩增培养基执行一半培养基更换。第14天，收集非贴壁淋巴样祖细胞并以300xg离心5分钟。然后，使细胞重悬于补充有1μM UM729的StemSpan^TMNK细胞分化培养基中。第17天，将一个体积的NK分化培养基添加到培养容器中。在第21和24天，用新鲜的NK分化培养基执行一半培养基更换。NK细胞的分化至第28天完成。通过用细胞因子的组合(包括IL-15、FLT3和IL-7)补充培养基，可以增强NK细胞分化的效率。

DGK KO CD34+(具有或不具有TAG-72CAR)分化为iNK细胞，并分析DGK KO、NK细胞表型以及NK细胞功能。ICE分析确认，iNK+TAG-72CAR在α和ζ基因座处均具有插入缺失，其百分比与其亲本DGK KO iPSC+TAG-72CAR相当(图12A-12B)。此外，已显示在具有或不具有TAG-72CAR KI的iPSC中单一或双重基因DGK KO不影响从分化过程获得的NK细胞的产量(图13)。对NK细胞标记物CD56、CD45、NKp46、NKG2D、NKp44和2B4的流式细胞术分析显示出未转染iNK和转基因iNK之间的表达水平相当，指示在存在或不存在TAG-72CAR KI的情况下，单一或双重DGK KO对iNK细胞的表型没有影响(图14A-14B)。

实施例6——TAG-72CAR KO iNK细胞和KO iNK细胞的体外功能

采用实时细胞监测系统来测定iNK细胞的体外杀伤效率。将10,000/100μL的靶细胞(例如卵巢癌细胞系OVCAR-3)重悬于补充有20％胎牛血清和牛胰岛素的培养基(例如RPMI-1640基础培养基)中，并沉积到与/>系统兼容的RealTime Cell Analysis微量ePlate中。使靶细胞在37℃、5％ CO₂下维持3-20小时，以允许细胞贴壁。在靶细胞贴壁后，以1:1的效应物与靶标(E:T)比率添加具有或不具有TAG-72CAR或DGKαζKO的iNK效应细胞。所有共培养物均在最佳生长条件下维持至少20小时。在整个过程中，对细胞阻抗进行监测；阻抗的减小指示靶细胞脱落并最终细胞死亡。如实施例1、2和3中所述，对插入或不插入TAG-72CAR的iPSC克隆执行DGKαζKO。然后对这些细胞进行测序并将其分化为iNK细胞。将具有或不具有TAG-72CAR和DGKαζKO的iNK细胞置入/>测定(如上所述)中，以1:1的效应物与靶标的比率靶向OVCAR-3细胞，以评估延长暴露于OVCAR-3细胞之前的基线iNK功能。对于抗原暴露测定，将OVCAR-3细胞(按照ATCC建议常规培养)以8×10⁴个细胞/孔接种到12孔板中，并保持6小时以贴壁到板上。然后将8×10⁵个iNK细胞置入含有OVCAR-3的孔中并保持孵育总共72小时。每24小时(即共培养的24小时、48小时和72小时)，收集含有iNK细胞和任何死亡OVCAR-3细胞的培养物的非贴壁级分，以300xg离心10分钟，重悬于新鲜的iNK培养基中，并置入含有未接触的OVCAR-3细胞的孔中。使用胰蛋白酶-EDTA溶液酶促脱落未被iNK杀伤的剩余OVCAR-3细胞(即，剩余的贴壁级分)，并使用Cell计数器进行计数。这些细胞计数用于计算iNK杀伤效率，如图15A所显示。如先前所述，还使用/>评估了抗原暴露测定结束时iNK细胞的细胞毒性功能。

具有CAR KI和DGKαζKO的iNK细胞在体外显示出增强的针对OVCAR-3肿瘤细胞的长期细胞毒性功能(图15A)。在重复暴露于癌细胞系72小时后，揭示了包括DGKαζKO和CAR的效应。这些数据展示了在iPSC中包括DGKαζKO的新型功能，为iNK细胞提供了功能益处(图15A)。在重复暴露于OVCAR-3 72小时后，与基线(大约5小时)相比，消除靶细胞所花费的时间增加(15-20小时)(图15B)。然而，当比较在评估杀伤能力之前暴露于OVCAR-3细胞72小时的iNK细胞的功能时，TAG-72CAR/DGKαζKO iNK展示出功能的改善(图15B)。另外，与它们相应的未转染iNK对照相比，延长的抗原暴露测定中存活的iNK细胞的总数量在TAG-72CAR/DGKαζKO iNK克隆中得到了改善(图15C)。综上所述，这指示DGKαζKO对于iNK存活和增强针对肿瘤细胞的细胞毒性功能很重要。

实施例7——DGKαζKO iNK细胞的体外功能

如此前在以上实施例6中所述，采用实时细胞监测系统来测定iNK细胞的体外杀伤效率。对于延长的抗原暴露测定，将OVCAR-3细胞(按照ATCC建议常规培养)以2.5×10⁴个细胞/孔接种到48孔板中，并保持4-5小时以贴壁到板上。然后将5×10⁵个iNK细胞(E:T 20:1)置于OVCAR-3孔上并孵育24小时。在24小时后，收集含有iNK细胞(作为唯一的活细胞)的培养物的非贴壁级分，在300g下离心10分钟，重悬于新鲜的iNK培养基中，并使用/>Cell分析仪进行计数。然后将这些剩余的iNK置入含有在4小时前新鲜接种的OVCAR-3细胞的新孔中。通过胰蛋白酶-EDTA提升未被iNK杀伤的剩余OVCAR-3细胞，并使用/> Cell分析仪进行计数。该过程按每24小时的时间间隔重复，总共5天。抗原暴露测定结束时的iNK细胞也被置入/>测定中，以展示在暴露于OVCAR-3细胞120小时后iNK细胞毒性功能的效应。在实验终点时，还使iNK细胞样本经受流式细胞术分析，以评估增殖核标记物Ki67的表达。

具有DGKαζKO的iNK细胞在体外显示出增强的针对OVCAR-3肿瘤细胞的长期细胞毒性功能(图16A)。在重复抗原暴露120小时后，如由测定所测量，与未转染的iNK细胞相比，DGKαζKO iNK细胞展示出增强的杀伤能力(图16A)。这些数据展示了在iPSC中包括DGKαζKO的新型功能，其为iNK细胞提供了功能益处(图16A)。此外，重复抗原暴露后的流式细胞术分析表明，与未转染的iNK相比，DGKαζKO iNK中表达增殖标记物Ki67的细胞的比例增加(图16B)。这种Ki67表达提高的趋势暗示DGKαζKO iNK的增殖能力有所改善。

在存在TGFβ的情况下，经由实施例6所描述的体外细胞毒性功能测定，对肿瘤微环境处的iNK细胞中DGK KO的功能优势进行建模。作为一种常见现象，实体瘤微环境被一系列免疫检查点抑制剂和可溶性因子(如TGFβ)较强浸润，这引起肿瘤逃逸和对免疫细胞的抵抗力(Alsina-Sanchís,Elisenda等人,TGFβControls Ovarian Cancer CellProliferation,International journal of molecular sciences,2017-07-30,第18卷(8),第1658页)。例如，先前的研究显示TGFβ可以经由多种信号通路抑制自然杀伤细胞功能，并导致NK活化受体如自然杀伤细胞2组成员D(NKG2D)的下调(Yang,Li等人,TGF-βandimmune cells:an important regulatory axis in the tumor microenvironment andprogression,2010,第31卷(6),第220-227页综述)，并且其中损害杀伤能力。在标准NK培养基或补充10ng/mL的TGFβ中，未转染iNK细胞和DGKαζKO iNK细胞以2:1的效应物与靶标比率靶向OVCAR-3的反应在18A-18B中进行了探索。在具有或不具有TGFβ(不具有iNK细胞)的单独培养基中监测OVCAR-3细胞的生长，作为测定内的内部对照。在该研究中，与在补充TGFβ的培养基内杀伤反应降低的未转染的iNK细胞相比，在iNK细胞中包含DGKαζKO能够抵抗或避免TGFβ对于针对OVCAR-3细胞的细胞毒性功能的抑制效应。由于不能在不引起自发分化的情况下对iPSC执行直接TGFβKO(如图19所显示)，DGKαζKO通过最小化TGFβ相关途径内的抑制效应来实现iNK细胞的下游优势的能力展示了DGKαζKO在iPSC和iNK细胞中的新型优势。

在体外进一步评估了DGKαζKO与TAG-72CAR结合的功能优势。在该测定中，在更具挑战性的条件下，在针对OVCAR-3细胞的测定中，使用具有或不具有DGKαζKO的TAG-72CAR(克隆D7)iNK细胞作为效应细胞，其中效应物与靶标的比率降低至1:5，且NK培养基中TGFβ的补充增加至100ng/mL。在图18C中，TGFβ对效应细胞的免疫抑制影响在TAG-72CAR iNK细胞中比TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞中更大。添加100ng/mL的TGFβ消除了TAG-72CAR iNK细胞针对OVCAR-3细胞的细胞毒性功能。在相同条件下，在添加TGFβ的情况下，TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞毒性仅略有降低。这些数据支持了TAG-72CAR iNK细胞对模拟内源性肿瘤微环境方面的免疫抑制因子(包括TGFβ)是敏感的。DGKαζKO包含在iPSC细胞中并在分化后下游保留到iNK细胞中，减少了TGFβ对iNK针对OVCAR-3细胞的细胞毒性功能的影响。

实施例8——DGKαζKO iNK细胞的体内功能

对于该模型，通过将大约1×10⁷个人衍生的TAG-72阳性OVCAR-3癌细胞经皮下注射到6至10周龄小鼠的胁腹中，使人肿瘤细胞系在NSG小鼠的胁腹上生长。在6-7周内，注射部位发展出完全形成的～100mm³肿瘤。一旦肿瘤达到该体积，各组就被随机化接受治疗。将衍生自未经编辑的(即未转染的)iPSC来源或DGKαζKO iPSC细胞的iNK细胞以每次注射1×10⁶个NK细胞经静脉内施用于小鼠。注射前，iNK细胞在正常NK扩增条件下体外培养7天。并未将外源细胞因子与iNK细胞共同施用于小鼠。iNK细胞输注后监测肿瘤体积、体重和临床评分。根据动物伦理批准，肿瘤尺寸从800mm³到>1000mm³、显著体重减轻或临床评分较差的小鼠被剔除。

人细胞因子的施用已展示支持NSG小鼠中人NK细胞的存活和功能。然而，在该研究中，并未将人细胞因子与iNK细胞共同施用，并且iNK细胞仍然展示出抗肿瘤活性。用具有DGKαζKO的iNK细胞治疗的小鼠在测定的多个点期间展示出肿瘤尺寸减小，并且显示出存活改善(图17)。

实施例9——TAG-72CAR和TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞的体外和体内表征

在体内施用之前，通过一组优化的体外测定对效应细胞制剂进行预评价。这包括NK细胞纯度的流式细胞术分析、相关NK刺激受体的表型特征、TAG-72CAR表达、DGKαζKO状态，以及体外OVCAR-3杀伤活性。

TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞的流式细胞术分析展示出双阳性CD45+CD56+细胞的比例较高，表明NK细胞群相对较纯(图20A)。在这些双阳性TAG-72CAR/DGKαζKO细胞中，超过60％表达TAG-72CAR，表明CAR保留不受制造和编辑过程的影响(在可接受的范围内)。NK刺激受体NKG2D、NKp46和2B4以及早期活化标记物CD69也在TAG-72CAR/DGKαζKO细胞上以显著水平表达，并且表达与在TAG-72CAR iNK中观察到的相当(图20A)。使用基于阻抗的技术的功能评估展示，与未编辑的iNK和从健康成人供体外周血单核细胞(PBMC)中分离的NK细胞相比，TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞在1:2和1:1的效应物:靶标比率下(图20C显示了1:2比率，1:1比率的数据未呈现)增强了OVCAR-3细胞杀伤。此外，TAG-72CAR/DGKαζKO iNK与单独TAG-72CAR的iNK相比展示出相似的杀伤能力。Synthego开发的ICE工具用于分析DGKα和DGKζ插入缺失效率(图20B)。这展示DGKα和DGKζ基因座的插入缺失效率分别为大约60％和75％，表明在体外(图20A-20C)和体内(图21A-21E)观察到的细胞毒性效应主要由含有DGKαζ基因KO的细胞介导。

基于萤光素酶的生物发光成像(BLI)异种移植模型用于确定TAG-72CAR和TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞的体内功效，其如上实施例4和5中所述生成。基于其已知的靶抗原TAG-72表达、OVCAR-3细胞向NSG小鼠的有效移植，以及OVCAR-3细胞对TAG-72CAR和/或TAG-72CAR DGKαζKO iNK细胞在体外的敏感性，选择OVCAR-3人卵巢癌细胞系作为异种移植物(参见实施例6)。实验细节如下：在效应细胞施用前四天(第-4天)，向8周龄雌性免疫受损NSG小鼠经腹膜内(i.p)注射2×10⁵个萤光素酶标记的OVCAR-3细胞。在NK细胞施用前一天(第-1天)，使用AMI-HTX动物成像仪(Spectral Instruments Imaging)测量小鼠的基线肿瘤负荷，并将其置入可比较的萤光素酶表达组中。第0天，将1×10⁷个低温存储的iNK细胞解冻并i.p.注射到小鼠中。为了支持人iNK效应细胞的存活和扩增，在实验的前三周中，所有组接受每2-3天(持续21天)施用的1×10⁴U白介素(IL)-2、和/或每天(持续7天)施用的10ng的IL-15。每周通过BLI监测和量化肿瘤负荷，直至研究结束(84天)。

在该模型中，在84天的观察期内，与PBS、PBMC-NK对照和未经编辑的iNK处理的小鼠相比，用TAG-72CAR iNK或TAG-72CAR/DGKαζKO iNK细胞处理的小鼠展示出显著更低的肿瘤负荷(图21A-C)。从第70天起，在用TAG-72CAR iNK处理的小鼠中观察到生物发光信号逐渐增加，反映了肿瘤细胞的生长，但在TAG-72CAR/DGKαζKO iNK-处理的小鼠中却非如此(图21C)。对各个时间点的分析揭示了较强趋势，表明在iNK中包含DGKαζKO导致了优异的长期体内功效，如由与单独的TAG-72CAR的iNK相比平均肿瘤负荷始终较低所反映(图21D，E)。

实施例10——DGK KO CD34+(具有或不具有TAG-72CAR)分化为iT细胞

iT细胞可以使用一系列已公布的方法生成，如利用表达δ样配体1(DLL1)(Themeli等人,Generation of tumor-targeted human T lymphocytes frominduced pluripotentstem cells for cancer therapy,Nat Biotechnol.,2013年10月,第31卷(10),第928-933页)或δ样配体4(DLL4)(Flippe等人,Rapid and Reproducible Differentiation ofHematopoietic and T Cell Progenitors From Pluripotent Stem Cells,Front.CellDev.Biol.,2020年10月20日,第8卷,Article577464)的基因编辑的小鼠基质支持细胞(OP9)所描述的那些，或经由与悬浮液中的支持结构结合的notch配体信号传导(US20200399599A1，Method for generating cells of the T cell lineage)，细胞因子如IL-7、FLT3、SCF的存在，或者使用市售培养系统STEMdiff^TM T Cell试剂盒(STEMCELLTechnologies)。

iPSC源可以是未编辑的，或者含有以下DGKαKO、DGKζKO、DGKαζKO或CAR敲入的任何组合中的至少一种，并且可以是克隆衍生的富集群体，或者衍生自未纯化的批量基因编辑群体。这些iPSC来源向CD34+细胞分化。将预分选的CD34+细胞重新接种到用StemSpan^TM淋巴祖细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies)中的StemSpan^TM淋巴分化包被材料(STEMCELLTechnologies)包被的板上。这标志着T细胞分化的第0天。在14天后，每周执行培养基更换两次，收集祖T细胞并置入StemSpan^TMT细胞祖细胞成熟培养基(STEMCELL Technologies)中持续推荐的时间段。收集T细胞，然后使用CD8 SP T细胞成熟培养基(STEMCELLTechnologies)中的ImmunoCult^TM Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator(STEMCELLTechnologies)或人T-Activator CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher)活化，以创建主要具有CD8+表型的成熟CD3+T细胞。

首先使用CRISPR/Cas9基因编辑将靶向TAG-72的CAR构建体敲入iPSC中的安全港基因座中，然后使用CRISPR/Cas9将DGKα和DGKζ两者敲除(如实施例1-2中所述)。在基因编辑后克隆细胞，并且选择DGKαζKO和CAR的纯合子KI进行分化(参见实施例3)。TAG-72CARiPSC富集品系中的插入缺失效率对于DGKα为90％，且对于DGKζ为99％(图22A)。这些iPSC品系成功地分化为iT细胞，其中真实T细胞的标志标记物经由流式细胞术进行表征(图22B)。重要地，获得了共表达CD3+和TCRαβ和TCRγδ的细胞群，并且在具有或不具有CAR和DGKαζKO的情况下处于等同水平。这支持了iPSC中包含DGKαζKO不阻止iPSC发展为iT细胞的发现。CAR与CD3的共表达进一步确认了iT细胞明确保留CAR。

如图22C中所显示，iPSC衍生的TAG-72CAR+DGKαζKO iT细胞显示出针对表达TAG-72的卵巢癌细胞系OVCAR-3的在靶CAR介导的活性，如经由在体外所显示。相反，与OVCAR-3对照相比，未转染的iT细胞和从不具有CAR构建体的PBMC中分离的T细胞并未显示等同的功能。至关重要的是，衍生自经DGKαζKO和CAR KI基因编辑的iPSC克隆的iT细胞中保留了有力的细胞毒性功能，从而展示出具有DGKαζKO的功能性CAR iT细胞。

实施例11——在TGFβ存在下TAG-72CAR/DGK KO iT细胞的体外功能

iT细胞如实施例10所述生成。

在存在TGFβ的情况下，使用体外细胞毒性功能测定(如先前实施例7所概述)对肿瘤微环境中的iT细胞中DGK KO的功能优势进行建模，如图23A所显示。简而言之，在采用实时细胞监测系统之前，将具有或不具有CAR和DGKαζKO的iT细胞用最佳生长培养基中0ng/mL、10ng/mL或100ng/mL TGFβ预调节至少8小时，以测定体外iT细胞的杀伤效率。将10,000/100μL的靶细胞(例如卵巢癌细胞系OVCAR-3)重悬于补充有20％胎牛血清和牛胰岛素的培养基(例如RPMI-1640基础培养基)中，并沉积到与/>系统兼容的Real Time Cell Analysis微量滴定板中。使靶细胞在37℃、5％ CO₂下维持3-10小时，以允许细胞贴壁。在靶细胞贴壁后，以1:1的E:T添加具有或不具有TAG-72CAR和DGKαζKO以及暴露或不暴露于TGFβ的iT效应细胞。所有共培养物均在最佳生长条件±TGFβ下维持至少40小时。另外，平行地维持单独的靶细胞±TGFβ。在整个过程中，每15分钟间隔监测细胞阻抗；阻抗的减小指示靶细胞脱落并最终细胞死亡。

在不存在TGFβ预调节的情况下，在iT(未转染的)细胞中观察到细胞毒性功能(图23B和图23C，封闭符号)，其中在40小时监测时段内观察到接近完全的靶细胞死亡，如由归一化细胞指数0所指示。相比之下，iT(未转染的)细胞在10ng/mL TGFβ(图23B)或100ng/mLTGFβ(图23C)中的预调节和维持导致了体外细胞毒功能降低。在具有DGKαζKO的TAG-72CAR-iT细胞中没有观察到TGFβ对体外细胞毒性的这种抑制效应，指示DGKαζ的缺失(敲除)使这些细胞不易受到TGF-β对iT细胞的细胞毒性功能的抑制效应的影响。

序列表

<110> 卡瑟里克斯私人有限公司

株式会社图尔金

<120> 用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞

的方法和组合物

<130> 536509PCT

<150> 63/236,828

<151> 2021-08-25

<150> 63/147,933

<151> 2021-02-10

<160> 35

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

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<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 6

gctctgtctc tcaagctgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

cagccactcg catcatctgt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

gctcagacac atcccaatcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

taggaaagcc atcaccaagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 10

acgagcactc accagcatcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 11

ctaggagtca gcgacatatg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 12

gcagaagtcc ccggacacgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 13

gttcgagacc aacgtgtccg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 14

cggggacttc tgctacgttg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 15

ccgctctgac tcgctgcacg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 16

ccccgtgcag cgagtcagag 20

<210> 17

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 17

tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc gctgctagtg ctgctggttc 60

tgaaaa 66

<210> 18

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 18

tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct 60

ggagat 66

<210> 19

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n为a、c、g或t

<400> 19

tgggtccggg ctggggccac caccgntgcc actgctagtg ctgctgggtc tggagatggt 60

gagtaggaga gactt 75

<210> 20

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 20

tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct ggagatggtg 60

agtaggagag acttt 75

<210> 21

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 21

tgggtccggg ctggggccac caccggccac tgctagtgct gctgggtctg gagatggtga 60

gtaggagaga cttt 74

<210> 22

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 22

tgggtccggg ctggggccac caccgctagt gctgctgggt ctggagatgg tgagtaggag 60

agacttt 67

<210> 23

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 23

tgggtccggg ctggggccac caccggtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60

cttt 64

<210> 24

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 24

tgggtccggg ctggggccac tgctagtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60

cttt 64

<210> 25

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 25

tgggtccggg ctggggccac cactgccact gctagtgctg ctgggtctgg agatggtgag 60

taggagagac ttt 73

<210> 26

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 26

tgggtccggg ctggggccac cgctagtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60

cttt 64

<210> 27

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 27

tgggtccggg ctggggccac caccgccact gctagtgctg ctgggtctgg agatggtgag 60

taggagagac ttt 73

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 28

tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 29

tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc actgctagtg ctgctgggtc 60

<210> 30

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 30

tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc actgctagtg ctgctgggtc 60

tg 62

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 31

agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacatatggg gagcacatct ggttcgagac 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 32

agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacattatgg ggagcacatc tggttcgaga 60

<210> 33

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 33

agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacattatgg ggagcacatc tggttcgaga 60

c 61

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 34

ctcgatggtg aatgacagtg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 35

gcttctgctg ccggttaacg 20

Claims (39)

1.一种生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法，所述方法包括：

(I)修饰干细胞，以抑制选自DGKα和DGKζ的至少一种靶基因的功能；

其中所述经修饰干细胞能够分化成干细胞衍生的免疫细胞，所述干细胞衍生的免疫细胞保留所述经修饰干细胞的靶基因抑制并且包含增强的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是选自诱导型多能性干细胞(iPSC)或胚胎干细胞的多能性干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞选自pre-HSC、生血内皮细胞(HE)、造血干细胞(HSC)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞衍生自三纯合HLA单倍型供体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括选择步骤(I)中获得的所述经修饰干细胞，其中所述靶基因的两个等位基因均受到抑制。

6.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其还包括：

(i)使步骤(I)中获得的所述经修饰干细胞或由它们生成的克隆细胞与组合物接触，以获得中胚层细胞；

(ii)使所述中胚层细胞与组合物接触，以获得CD34+细胞；以及

(iii)使所述CD34+细胞与组合物接触，以获得干细胞衍生的免疫细胞。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种靶基因为DGKα。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种靶基因为DGKζ。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中DGKα基因和DGKζ基因均受到抑制。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞衍生的免疫细胞选自多能祖细胞、共同淋巴样祖细胞、早期胸腺祖细胞、前T细胞祖细胞、前NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、共同髓系祖细胞、巨噬细胞和单核细胞。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是表达选自CD2、CD5、CD7、CD4、CD8a、CD8b、CD3、TCRαβ和TCRγδ的标记中的至少一种的T细胞。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是表达CD56+和CD45+的NK细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶基因的功能的抑制通过基因编辑系统来实现。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因编辑系统选自CRISPR/Cas、TALEN以及ZFN。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因编辑系统是包含向导RNA-核酸酶复合体的CRISPR/Cas系统。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述向导RNA靶向选自以下的核苷酸序列：SEQID NO:1至SEQ ID NO:16。

17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统利用选自以下的向导RNA依赖性核酸酶：Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12、Cas13、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、和Csf4。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经修饰干细胞被进一步修饰以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述经修饰干细胞表达所述CAR。

20.根据权利要求1-17所述的方法，其中由所述方法产生的所述免疫细胞被修饰以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中由所述方法产生的所述免疫细胞表达所述CAR。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述方法产生的所述免疫细胞识别一种或多种靶抗原。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述方法产生的所述免疫细胞识别肿瘤靶标或感染性病原体靶标。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶抗原选自TAG-72、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD47、叶酸受体α(FRα)、BCMA、间皮素、Muc1。

25.一种免疫细胞，其由根据权利要求1-24中任一项所述的方法产生。

26.一种经修饰细胞，其中选自DGKα和DGKζ的至少一种靶基因的功能受到抑制，其中所述经修饰细胞能够分化成保留所述经修饰细胞的基因抑制并且包含增强的活性的免疫细胞。

27.根据权利要求26所述的经修饰细胞，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、脐血干细胞和诱导型多能性干细胞的干细胞。

28.根据权利要求26所述的经修饰细胞，其中所述细胞选自生血内皮细胞、造血祖细胞、造血前体细胞、造血干细胞或造血样干细胞。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的经修饰细胞，其中所述细胞衍生自三纯合HLA单倍型供体。

30.根据权利要求26-29中任一项所述的经修饰细胞，其中所述靶基因的两个等位基因均受到抑制。

31.根据权利要求26-30中任一项所述的经修饰细胞，其中所述至少一种靶基因为DGKα。

32.根据权利要求26-30中任一项所述的经修饰细胞，其中所述至少一种靶基因为DGKζ。

33.根据权利要求26-30中任一项所述的经修饰细胞，其中DGKα和DGKζ基因均受到抑制。

34.根据权利要求26-33中任一项所述的经修饰细胞，其中所述经修饰细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。

35.根据权利要求34所述的经修饰细胞，其中所述经修饰细胞表达所述CAR。

36.一种用于修饰细胞以抑制至选自DGKα和DGKζ的至少一种靶基因的功能的组合物，所述组合物包含：能够编辑靶基因的序列的向导RNA-核酸酶复合体，其中所述向导RNA靶向选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述核酸酶包含至少一种选自以下的蛋白质：Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12、Cas13、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、和Csf4。

38.一种治疗受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求25所述的免疫细胞。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述病症是癌症、感染、自身免疫病症、器官纤维化、或子宫内膜异位症。