KR102665916B1 - Enpl 유전자의 신규한 용도 - Google Patents

Enpl 유전자의 신규한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 암관련 유전자로 알려진 ENPL 유전자가 절단된 도마뱀의 꼬리에서 다시 재생될 때 발현하는 유전자 중 가장 높은 수준으로 발현하는 ENPL인 것을 확인하였다. ENPL의 발현 증가의 원인으로써 소포체 스트레스(ER stress)이며 ATF6가 관련됨을 규명하였다. 본 발명의 유효성분은 연골 세포 특이적 프로테오글리칸인 COL2(collagen type Ⅱ) 및 AGG(aggrecan)의 다당류 및 프로테오글리칸을 축적시켜 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)의 발현을 유도함을 확인하였는 바, 연골세포 분화 및 재생에 뛰어나, 골 관련 질환 예방 및 치료에 이용 가능하다.

Description

ENPL 유전자의 신규한 용도{novel uses of ENPL genes}
본 발명은 ENPL 유전자의 신규한 용도에 관한 것으로, 구체적으로 연골세포로의 분화 또는 재생 용도에 관한 것이다.
사람의 관절 연골 조직은 한번 손상이 되게 되면 생체 내에서 정상적으로 재생이 되지 않는 특징을 갖고 있다. 이렇듯 관절 연골이 손상되면 일상적으로 생활에 제한 받을 정도로 심한 통증이 동반되며 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 한다.
최근 조직공학 분야의 급속한 발전에 따라 관절 연골의 손상을 치료하기 위해 환자 자신의 정상적인 연골 조직일부를 채취하여 연골세포를 분리 및 배양하여 이식하는 기술이 New York에 있는 Hospital for Joint Disease에서 처음 연구되었으며 스웨덴(Sweden)에 있는 University of Gothenburg와 Sahlgrenska University Hospital에서 그 기술을 발전시켰으며 세계의 많은 산업체에서 연골세포치료제를 GMP 시설에서 의약품으로 생산하고 있다.
이렇듯 손상된 관절 연골의 치료는 무릎 관절 연골이 손상된 환자로부터 사용을 하지 않는 관절의 연골을 일부 채취하여 세포배양기 내에서 연골세포에 적절한 영양성분이 공급되는 배양배지에서 이식에 필요한 수로 연골세포를 증폭하여 환자의 연골 결손부에 주입 또는 이식하는 방법으로 환자의 손상된 관절 연골을 재생시키는 것이다.
그러나, 연골세포는 부착성 세포로써 그 증식도가 매우 느리고 단층배양과정에서 배양 과정 중 세포주변의 환경조건에 따라 연골세포의 모양이 변화하는 고유의 특징을 지니고 있다.
현재 다양한 경로로 인해 발생하는 연골 손상 혹은 결손 환자의 연골 재생 및 수복을 위하여 성체줄기세포를 이용한 다양한 의공학적 접근방법들이 개발 중이다. 성체줄기세포는 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등의 다양한 세포로의 분화가 가능해 세포치료제의 세포원으로 주목을 받고 있다. 특히 최근 성체줄기세포 이식법에 의한 연골 재생이 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나, 아직까지 많은 한계점이 존재한다. 구체적으로 시술에 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 줄기세포의 표현형이 감소되며 탈분화 현상이 일어날 수 있다는 단점이 있다. 또한, 성체줄기세포가 연골세포로 분화되는데 있어서, 이식된 연골조직 부위의 비대화 현상(Hypertrophy)에 의해 생체 내에서 석회화(calcification)된 조직이 형성되는 등의 문제점이 발생할 가능성도 존재한다. 따라서 성체줄기세포를 이용하여 효과적으로 연골질환을 치료하기 위해, 연골재생을 위한 충분한 세포수의 확보 및 연골 조직 재생시 발생할 수 있는 비대화 현상을 극복할 수 있는 방안이 요구된다.
도마뱀은 잘린 꼬리가 스스로 재생되는 생물학적 특징으로 인해 생물학 및 재생의학계에서 주요한 의의를 가진다. 꼬리 재생능력을 가진 도마뱀들은 포식자로부터의 방어 기작으로 자가 꼬리 절단이라는 능력을 가지게 되었으며, 잘린 말단 부분은 수일 혹은 수 주 내로 새로운 꼬리로 대체된다. 하지만 형태학적으로 초기의 꼬리와는 다른 꼬리가 재생되는데, 새로운 꼬리는 뼈 대신 연골로 구성된다.
ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1)은 ATF6(Activating transcription factor 6)라는 전사인자의 활성화에 의해 전사되며, 소포체 내에 주로 존재하는 샤페론 단백질인 HSP90 그룹 중 하나이다. 최근 연구에 따르면, HSP90은 소포체 내에만 존재하는 것이 아니라, 소수는 핵 안에 존재하여 몇몇 유전자의 전사 활성에 관여하는 역할을 하며 또한 세포질에서도 발견이 된다. 뿐만 아니라 HSP90은 세포 표면에도 존재할 수 있는데 이러한 경우에는 HSP90이 항원 제시 세포(Antigen-presenting cell, APC)에게 항원을 인식하도록 하는 역할을 한다고 한다. HSP90는 사람의 연령이 증가할수록 그 발현량이 감소하며 특히 관절염과 같은 퇴행성 질환과 밀접한 연관성을 가지고 있음이 밝혀졌다. 한 연구에 따르면 연 골세포의 HSP90는 연골을 분해하는 단백질 분해 효소인 MMP13의 발현에 관여하여 세포의 자살산율 등에서 다소 차이가 나타난다.
연골 형성이 진행되는 동안 특정 인자들의 역할은 최근에 알려지기 시작하였으며 여전히 밝혀지지 않은 점들이 많다. 연골 형성은 배아 발생 중 가장 빨리 일어나는 형태학적 사건이며 여러 단계를 거쳐 진행되는데, 연골 전구체 세포의 증식과 응집 그리고 연골 모세포 및 연골 세포로의 분화를 거쳐 최종적으로는 세포 자살이 일어나며 골격 구조로 형질이 전환되는 과정을 겪는다. 따라서, 연골 연골세포 분화 또는 재생을 유도하고, 더 나아가 퇴행성 관절염 등과 관련된 골 질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제가 요구되는 실정이다.
1.Alibardi L. Original and regenerating lizard tail cartilage contain putative resident stem/progenitor cells. Micron. 2015;78:10-18. 2.Szarek D, Marycz K, Lis A, Zawada Z, Tabakow P, Laska J, Jarmundowicz W. Lizard tail spinal cord: a new experimental model of spinal cord injury without limb paralysis. FASEB J. 2016;30(4):1391-403. 3.Alibardi L. Tail regeneration reduction in lizards after repetitive amputation or cauterization reflects an increase of immune cells in blastemas. Zool Res. 2018;39(6):413-423. 4.Moghanjoghi SM, Ganjibakhsh M, Gohari NS, et al. Establishment and characterization of rough-tailed gecko original tail cells. Cytotechnology. 2018;70(5):1337-1347. 5.Shen C, Jiang T, Zhu B, et al. In vitro culture expansion impairs chondrogenic differentiation and the therapeutic effect of mesenchymal stem cells by regulating the unfolded protein response. J Biol Eng. 2018;12:26. 6.Haze K, Yoshida H, Yanagi H, Yura T, Mori K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 1999;10(11):3787-3799. 7.Chen YC, Chang YW, Tan KP, Shen YS, Wang YH, Chang CH. Can mesenchymal stem cells and their conditioned medium assist inflammatory chondrocytes recovery. PLoS One. 2018;13(11):e0205563. 8.Richardson SM, Kalamegam G, Pushparaj PN, et al. Mesenchymal stem cells in regenerative medicine: Focus on articular cartilage and intervertebral disc regeneration. Methods. 2016;99:69-80.
본 발명의 목적은 ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 (1)시료에 골질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계;
(2)상기 세포에서 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질의 발현수준 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(3)상기 후보물질 비처리군에 비해 상기 ENPL 단백질의 발현수준 또는 활성을 증가시키는 물질을 골 질환의 예방 또는 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 (1)ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(2)상기 세포에서 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질의 발현수준 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(3)상기 후보물질 비처리군에 비해 상기 ENPL 단백질의 발현수준 또는 활성을 증가시키는 물질을 골 질환의 예방 또는 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 암관련 유전자로 알려진 ENPL 유전자가 절단된 도마뱀의 꼬리에서 다시 재생될 때 발현하는 유전자 중 가장 높은 수준으로 발현하는 ENPL인 것을 확인하였다. ENPL의 발현 증가의 원인으로써 소포체 스트레스(ER stress)이며 ATF6가 관련됨을 규명하였다. 본 발명의 유효성분은 연골 세포 특이적 프로테오글리칸인 COL2(collagen type Ⅱ) 및 AGG(aggrecan)의 다당류 및 프로테오글리칸을 축적시켜 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)의 발현을 유도함을 확인하였는 바, 연골세포 분화 및 재생에 뛰어나, 골 관련 질환 예방 및 치료에 이용 가능하다.
도 1은 인간 편도선 유래 간엽 줄기세포의 연골 형성 및 발달의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2a는 편도 유래 중간엽(Tonsil-drived Mesenchymal)의 줄기 세포 (T-MSC)의 섬유아세포와 같은 모양의 성장을 확인한 도이다
도 2b는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs) 배지에서 16일간 배양하고 연골 세포, 골 세포, 지방 세포로 분화 능력을 나타낸 도이다(DI : 분화 유도(Differentiation induction).
도 2c는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 처리에 따른 세포 독성 평가를 나타낸 도이다.
도 3a는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 처리 및 경과에 따른 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)의 발현을 나타낸 도이다.
도 3b는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 처리 및 경과에 따른 연골 형성 특이적 세포 마커인 SOX9, COL2, AGG (Aggrecan) 및 비 특이적 세포 마커인 MMP13의 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 4a는 도마뱀 꼬리를 절단하고 6일후, 12일후 조직에서 얻은 추출물을 단백체 분석(proteomic analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에서 ENPL의 상대적인 mRNA발현을 나타낸 도이다 (D0, D4, D8, D12 : 각각 0,4,8 및 12 일).
도 5a는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 또는 억제제 처리 및 경과에 따른 ATF6 및 ENPL의 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 5b는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 또는 억제제 처리 및 경과에 따른 연골 형성 / 비 특이적 세포 마커 (SOX9, COL2, AGG 및 MMP13)의 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 5c는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSCs)에 도마뱀의 꼬리 추출물(LTEs) 또는 억제제 처리 및 경과에 따른 연골 형성 특이적 세포 마커의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 6a는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC에서 ENPL mRNA의 발현 증가를 나타낸 도이다 (OV_0,OV_4,OV_8,OV_12는 ENPL의 과발현 벡터를 형질주입한 세포에 연골 세포로 분화 유도를 시킨 후 각각 0일, 4일, 8일, 12일을 의미함).
도 6b는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC의 연골 형성 특이적 마커로서 COL2 및 AGG mRNA의 발현을 나타낸 도이다(OV_0,OV_4,OV_8,OV_12는 ENPL의 과발현 벡터를 형질주입한 세포에 연골 세포로 분화 유도를 시킨 후 각각 0일, 4일, 8일, 12일을 의미함).
도 6c는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC의 연골 형성 마커인 COL2 및 AGG의 단백질 수준으로 나타낸 도이다.
도 7a는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC를 각 배지(ENPL 억제제가 처리된 일반 배지; 분화 유도 배지; ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지)에 배양한 뒤 ARF6 및 ENPL mRNA 수준을 나타낸 도이다.
("OV_0"은 분화를 유도되지 않은 T-MSC를 의미함, "OV_4" 형질주입 후 4일간 분화 유도 된 T-MSC를 의미함. "+1'는 OV_0 또는 OV_4의 각각의 각각 ENPL 억제제로 처리 된 것을 의미함).
도 7b는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC를 각 배지(ENPL 억제제가 처리된 일반 배지; 분화 유도 배지; ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지)에 배양한 뒤 연골 형성 마커의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 7c는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC를 각 배지(ENPL 억제제가 처리된 일반 배지; 분화 유도 배지; ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지)에 배양한 뒤 연골 형성 마커의 단백질 수준으로 나타낸 도이다.
도 7c는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC를 각 배지(ENPL 억제제가 처리된 일반 배지; 분화 유도 배지; ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지)에 배양한 뒤 연골 형성 마커의 단백질 수준으로 나타낸 도이다.
도 7d는 ENPL 과발현 벡터에 의해 형질주입된 T-MSC를 각 배지(ENPL 억제제가 처리된 일반 배지; 분화 유도 배지; ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지)에서 염색한 세포를 나타낸 도이다.
도 8a는 ERK signaling을 단백질 수준에서 확인한 도이다.
도 8b는 ERK signaling 조절을 통한 ENPL의 연골 세포 분화 유도 및 가설 메커니즘을 모식화한 도이다.
본 발명은 ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "ENPL"은 ATF6(Activating transcription factor 6)라는 전사인자의 활성화에 의해 전사되며, 소포체 내에 주로 존재하는 샤페론 단백질인 HSP90 그룹 중 하나이다.
본 출원인은 HSP90 그룹 중 ENPL의 자극으로 인해 중간엽 줄기세포에서 연골 세포로의 분화가 유도되는지 연구하고자 하였다. 먼저 연골 세포 분화를 유도하는 과정에서, 세포의 내재적인 ENPL이 증가하는 것을 확인하였고 ENPL의 발현 증가의 원인으로써 ER stress를 파악하였다. 일반적으로 ER stress는 세포의 비정상적인 반응을 유도하여 다양한 질병의 주요 원인으로써 알려져있지만, 최근 연구 결과에 의하면 적절하고 유익한 ER stress는 세포의 생리학적 현상에 상당히 주요한 시그널을 제공한다고 밝혀져 있으며, ER stress는 연골 세포 뿐만 아니라 뼈세포 그리고 신경계 세포 등과 같은 다양한 세포의 분화 과정에 관여한다고 알려져있다. ER stress로 인해 활성화되는 인자들에는 ATF6, PERK, IRE1 등이 있으며, 본 출원인은 연골 분화 유도 기간에 따른 ATF6와 ENPL의 발현 및 연골 세포 특이적 마커들을 파악하였으며 결과적으로 연골 세포 분화 과정에 ATF6와 ENPL이 관여함을 확인하였다. 이후 ENPL의 과발현 벡터를 형질주입한 중간엽 줄기세포를 이용하여 연구를 진행했을 때, ENPL이 보다 높은 수준으로 발현될수록 더 빠른 기간내에 연골 세포 특이적 마커들이 발현되는 것을 확인하였다.
상기 조성물은 연골 세포 특이적 프로테오글리칸인 COL2(collagen type Ⅱ) 및 AGG(aggrecan)의 다당류 및 프로테오글리칸을 축적시켜 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)의 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 조성물은 연골의 세포외 기질의 주요 구성 성분인 상기 "COL2" 또는 "AGG" 발현을 유도하고, 편도 중간엽 줄기세포를 연골 세포로의 분화능이 우수하다. 종래 기술에서는, 생체 외에서 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화시킬 때 나타나는 hypertropy 과정은 여전히 해결해야할 문제점이었다. 분화가 진행 중인 세포가 상기 과정에 진입하게 되면, 결국 세포는 apoptosis 단계까지 진행이 된다. Hypertropy 과정이 진행 중인 연골 세포는 MMP13이라는 단백질 분해 효소를 분비하게 되는데, 이것은 연골의 세포외 기질의 주요 구성 성분인 COL2와 AGG를 분해한다. 따라서 연골 세포의 hypertropy를 지연 혹은 억제시키기 위한 연구들은 대부분 MMP13을 타겟으로 하고 있으며, MMP13을 조절하는 인자들 중 하나로 알려진 것이 HSP90이다. HSP90은 5개의 주요 도메인(N-terminal domain, Linker region/charged domain 1, middle domain, charged domain 2 그리고 C-terminal domain)으로 구성되어 있으며, 마찬가지로 HSP90 family에 속하는 ENPL 또한 이 도메인들로 구성되어 있다. ENPL은 HSP90의 생화학적 구조를 보존하고 있지만, 기능적인 측면에서는 일반 HSP90과는 구별되는 기능을 가지고 있다.
본 발명의 세포를 배양하기 위한 배양 배지는 제한되지 않으나, 배양 배지에서 배양하여 수득한 발효액, 농축 발효액, 발효액 의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로, 상기 세포를 포함하는 것 또는 배양한 후 세포를 제거한 배양 여액일 수 있다. 또한 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "배양"은 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
본 발명의 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하며,상기 배지는 특정 세포를 배양하기 위하여 배양 대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이며 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
본 발명의 세포를 배양하기 위한 배양 배지는 제한되지 않으나, 배양 배지에서 배양하여 수득한 발효액, 농축 발효액, 발효액 의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로, 상기 세포를 포함하는 것 또는 배양한 후 세포를 제거한 배양 여액일 수 있다. 또한 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "배양"은 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
본 발명의 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하며,상기 배지는 특정 세포를 배양하기 위하여 배양 대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 염기 서열은 이를 구성하는 염기 서열의 작용성 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 본 발명의 ENPL와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 ENPL 단백질은 서열번호 2의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 ENPL 단백질의 범위는 나문재로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 본 발명의 ENPL 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.ENPL 단백질의 변이체란 ENPL 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
상기 ENPL 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포을 제공한다.
상기 중간엽 줄기세폰는 편도, 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질에서 유래된 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 골 질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골형성 부전증, 골위축, 파제트(paget's disease), 치주염(periodontitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 대사성 골질환 및 암세포의 골전이에 의해 유발되는 뼈의 손상으로 이루어진 군에서 선택된 것이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 (1)시료에 골질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계;
(2)상기 세포에서 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질의 발현수준 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(3)상기 후보물질 비처리군에 비해 상기 ENPL 단백질의 발현수준 또는 활성을 증가시키는 물질을 골 질환의 예방 또는 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 실험 재료 준비 및 방법
실시예 1-1 실험동물 준비
실험 도마뱀은 표범도마뱀붙이과에 속하는 아프리칸 펫테일 게코 (Hemitheconyx caudicinctus)를 이용하였다. 실험 도마뱀은 Zools(서울)에서 구입하였으며, 사육 온도는 25 ~ 28℃를 유지하였고 먹이는 일주일에 한번 푸디웜(Foodyworm)의 도마뱀 전용 사료를 식이 하였다.
실시예 1-2 실험재료 준비
인간의 편도에서 유래한 중간엽 줄기 세포(T-MSCs)는 부산대학교 의학전문대학원 김재호 교수님 실험실에서 세포 분양을 받아 실험하였다. 배양에 사용한 α-MEM, Antibiotic-Antimycotic(100X)는 Gibco에서 구매하여 1X로 희석 후 사용하였으며, FBS는 Capricorn scientific에서 구매하였다. 1X PBS(Phosphate Buffered Saline)은 하이클론(Hyclone)에서 10X PBS를 구매하여 실험시 희석하여 사용하였다. 세포 독성 측정에 사용된 WST-1(Water Soluble Tetrazolium salt-1)은 Takara에서 구입하여 사용하였고, 연골 세포의 분화 확인에 사용된 Alcian-Blue Staining Solution은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 또한 뼈 세포 및 지방세포 분화능 확인을 위해 각각 사용된 Alizarin Red S 그리고 Oil Red O solution 모두 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 형질주입에 사용된 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent는 Thermofisher에서 구매하였고 ENPL 과발현 벡터는 pcDNA6/V5-His B vector를사용하여 벡터에 ENPL의 cDNA 전체 길이가 포함하도록 제작하였다. 실시간 중합 효소 연쇄반응 (Real time PCR)에 사용된 SYBR Green은 Takara에서 구입하였으며, 프라이머는 primer-blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 제작하였다. ENPL의 inhibitor로 사용한 Luminespib은 Medchemexpress에서 구매하였다. 웨스턴 블롯에 사용된 aggrecan, collagen type Ⅱ는 Proteintech, SOX9은 cell signaling technology(CST), ERK/p-ERK는 cell signaling technology(CST), GAPDH는 Enzo에서 구입하여 사용하였다.
실시예 1-3. 도마뱀 추출물 만들기
인위적으로 도마뱀의 꼬리를 절단한 후, 최대한 자른 꼬리의 피부 조직만을 벗겨내고 껍질을 벗긴 꼬리 조직을 일차적으로 잘게 다지고 그 후 1X PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) 1ml가 포함된 균질기용 튜브에 넣고 균질기를 이용하여 분쇄하였다. 다음 4℃, 13000rpm으로 11분간 원심 분리를 한 뒤 상층액만을 얻어 새 튜브로 옮긴다. 그리고 상층액에 존재하는 DNA 및 RNA를 분해하기 위해 초음파 분쇄기를 이용하여 2 watt, 2초 간격으로 5회 분쇄한다. 초음파 분쇄는 모두 얼음 위에서 진행되었다. 이후 한번 더 4℃, 13000 rpm으로 11분간 원심 분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브에 옮긴다. 새로운 튜브에 존재하는 상층액을 무균실험대 안에서 실린지 필터(syringe filter) 0.2㎛를 이용하여 여과하였다. 96칸 배양 접시에 샘플 10㎕와 0, 2, 4, 6, 8, 10㎍/㎕ 의 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin) 10㎕를 각 well에 분주하고 BCA kit solution 200㎕를 각 well에 추가로 분주하였다. 30분 뒤 microplate reader(FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) 장비를 이용하여 550nm 파장으로 농도를 측정하여 표준곡선을 만든 후 샘플의 농도를 측정하였다.
실시예 1-4. 세포 배양 및 세포 분화 유도
세포는 편도암 환자의 편도 절제술을 통해 잘라낸 편도 조직에서 얻어낸 중간엽 줄기 세포인 T-MSCs를 사용하였으며 세포의 일반적인 배양 배지는 α-MEM에 10% FBS, 1X Antibiotic-Antimycotic을 첨가하여 사용하였다. 이후 연골세포로의 분화를 유도하는 배지는 α-MEM에 10% FBS, 1X Antibiotic-Antimycotic가 첨가된 일반 배양 배지에 0.1μM dexamethasone(Sigma), 50μM ascorbate 2-phosphate (Sigma), 1% Sodium Pyruvate(Invitrogen), 10 ng/mL Transforming Growth Factor-β1 human(Sigma), 50 nM Insulin(Roche)을 첨가하여 연골 분화 유도 배지에서 배양하였다. 또한 도마뱀 꼬리에서 얻은 추출물은 0.5 μg/mL을 분화 유도 배지에 첨가하였다. 세포의 빠른 증식 속도 및 primary cell임을 고려하여 계대 배양을 최소화하기 위해 초기 세포는 배양 접시의 약 20%~30%의 밀도가 되도록 분주하였다. 배양 환경은 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 진행하였고, 세포의 배양 배지는 1~2일마다 교환해주었으며 세포가 배양 접시의 90% 정도 자라면 1X PBS로 씻어낸 후 1X trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 계대 배양하였다. 모든 실험은 무균 실험대에서 시행하였다.
실시예 1-5. 세포 독성 측정
도마뱀 꼬리 추출물(Lizard tail extracts, LTEs)이 T-MSCs에 세포 독성을 유발하는지 혹은 세포 독성을 유발하지 않는 최적의 농도 범위를 파악하기 위하여 WST-1 assay를 통해 세포 독성을 측정하였다. T-MSCs를 96 well plate에 1 well 당 1 X 104세포 수의 밀도로 분주하였고, 24시간 후 plate에 부착된 세포에 LTEs를 농도별 (0, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 μg/mL)로 처리하고 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 이후 1 X PBS를 이용하여 세포를 세척한 뒤 WST-1 reagent (배지 100 ㎕ + WST-1 10 ㎕)를 제조하여 1 well 당 110㎕를 분주하였다. 이후 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 배양 후에 440nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-6. Alcian blue 염색법
연골 세포로의 분화능을 시각적으로 확인할 수 있는 Alcian blue 염색은 분화 유도 기간에 따른 분화 정도 그리고 LTEs 처리 유무에 따른 분화 정도를 비교하기 위하여 진행되었다. 6well plate에 1well 당 1 X 105세포 수의 밀도로 분주하였고, 분화 유도 기간 (0, 4, 8, 12, 16일)에 맞추어 분화를 유도한 후 염색을 진행하였다. 먼저 세포의 배지를 모두 제거한 후 well에 10% formalin 1mL를 분주하여 10분 동안 고정 과정을 진행한다. 고정 후 1X PBS를 이용하여 세포를 3번 씻어주고 Alcian blue solution(Sigma)을 처리하여 1시간 동안 염색시킨다. 1시간 후 연골 세포 이외의 염색을 제거하기 위해 0.1M HCl을 이용하여 한번 씻은 뒤, 1 X PBS를 이용하여 세포를 2번 씻어준다. 세포가 마르지않도록 새로운 1 X PBS를 분주한 상태로 현미경 관찰을 한다.
실시예 1-7. 실시간 중합 효소 연쇄반응(Real time PCR)
연골 세포 특이적 유전자들의 상대적 발현량을 비교하기 위하여 각각의 프라이머들을 제작한 후(표 1) 실시간 중합 효소 연쇄반응을 진행하였다. SYBR Green, primer set, DNA 그리고 H2O를 이용하여 샘플을 만들었으며, 타겟으로한 모든 유전자들의 PCR 조건은 95℃에서 30초간 초기 변성 단계(Initial denaturation)를 1회 수행한 후, 95℃에서 30초(변성, denaturation), 62℃에서 30초(프라이머 결합, annealing), 72℃에서 2분(DNA 신장, elongation)을 총 40회 반복 수행하였다.
실시간 PCR Primer 서열 (Primer sequences for real time PCR)
Genes Sequence Size(bp)
Type Ⅱ collagen (F) 5`-TGAGCCATGATTCGCCTCGG-3’
(R) 5`-CACAGACACAGATCCGGCA-3’		 178
SOX9 (F) 5`-CTGAACGAGAGCGAGAAGCG-3’
(R) 5`-CCCGTTCTTCACCGACTTCC-3’		 120
Aggrecan (F) 5`-GAAGGAGGTAGTGCTGCTGG-3’
(R) 5`-GGGTAGTTGGGCAGTGAGAC-3’		 87
MMP13 (F) 5`-CGCCAGACAAATGTGACCCT-3’
(R) 5`-TACGGTTGGGAAGTTCTGGC-3’		 162
ENPL (F) 5`-TCTGGAAATGAGGAACTAACAGTC-3’
(R) 5`-ACTCGCTTGTCCCAGATTTG-3’		 142
ATF6 (F) 5`-TTCAGTCTCGTCTCCTCGGT-3’
(R) 5`-ATCTTCCTTCAGTGGCTCCG-3’		 154
Actin (F) 5`-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3’
(R) 5`-AGGTAGTTTCGTGGATGCCA-3’		 132
실시예 1-8. 형질도입
ENPL의 과발현을 유도하여 분화 유도 기간 동안 연골 세포 분화능의 차이를 확인하기 위해 ENPL 과발현 플라스미드 벡터(overexpression plasmid vector)를 형질 주입(Transfection)하였다. T-MSC를 6well의 1well 당 1X105세포 수의 밀도로 분주하였고, 세포의 밀도가 70% 이상으로 증식되면 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Thermofisher)의 프로토콜대로 형질 주입을 진행하였다. 먼저 세포의 배지를 모두 새로운 배지로 교환한다. 1well 기준으로, FBS와 Antibiotic-Antimycotic이 들어가지 않은 초기의 α-MEM을 1.5 mL tube 2개에 각각 250㎕씩 넣는다. 이후 각각의 1.5mL tube에 plasmid DNA 4㎍과 Lipofectamine reagent 10㎕씩 추가한 후 잘 혼합되도록 vortex를 진행한다. Plasmid DNA가 존재하는 1.5mL tube의 용액을 모두 reagent가 존재하는 1.5mL tube에 옮긴 후 상온에서 5~10분 방치한다. 시간이 지나면 용액 약 500㎕를 모두 1well에 분주하는데 이때 방울방울 떨어지도록 천천히 분주한다. 이후 세포는 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 새로운 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시킨다. 형질 주입 후 총 48시간 이후, 각각의 분화 유도 기간에 맞추어 배양을 지속하였다.
실시예 1-9. 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)
연골 세포 특이적 마커들의 발현을 단백질 수준에서 파악하기 위하여 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)을 진행하였다. 6well plate의 1well 당 1X 105세포 수의 밀도로 분주 후 연골 세포로의 분화를 유도하였다. 분화 유도 기간, 도마뱀 꼬리 유래 추출물의 처리 유무, 그리고 ENPL plasmid DNA 형질 주입에 따라 각각의 분화 유도 과정을 진행하였다. 분화 기간과 실험 조건에 맞춘 세포는 1X PBS로 2회 세척한 후 RIPA buffer 150㎕와 Phosphatase inhibitor 15㎕ 그리고 Protease inhibitor 15㎕를 분주한다. Well을 잘 흔들며 도포한 후 얼음 위에 1분정도 방치한다. 이후 스크래퍼로 세포를 긁어 모은 후 1.5mL tube에 옮겨 담은 후 30분동안 얼음에 보관한다. 시간이 지나면 세포가 들어있는 1.5mL tube를 13.000 rpm, 4℃, 10분의 조건으로 원심분리한다. 피펫으로 오직 상층액만 채취하여 새로운 1.5mL tube에 옮겨 담고 이후 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo, Lot# NJ179719)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 각 샘플은 단백질 농도가 40㎍이 되도록 모두 통일하였으며, 이후 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. 반 건조 단백질이동장치 (Semi-dry transfer; Bio-Rad)로 25V 400mA 45분 동안 0.45㎛ NC membrane (Cytiva, formerly GE Healthcare)에 단백질을 이동시켰으며, 이동이 완전히 끝나면 membrane을 5% 탈지분유에 담근 후 1시간동안 교반하여 blocking 과정을 진행하였다. 1시간 후, 1X TBST(0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 1.37 M NaCl, 0.05% Tween20) 10 mL로 3번 세척한 후 확인하려는 단백질의 1차 항체를 1X TBST 에 각각 희석하여 넣고 4℃에서 밤새도록 교반하였다. 다음 날, 다시 membrane을 1X TBST로 10분씩 3회 세척하였다. 2차 항체(HRP Streptavidin conjugated)를 5% 탈지분유 10㎖에 1:5000으로 희석하여 2시간 교반하였다. 2시간 후, 1X TBS-T를 이용하여 다시 10분씩 3회 세척을 진행하고, 세척이 끝난 멤브레인(membrane)을 OHP 필름 두 장 사이에 넣은 후 Pierce ECL Plus western blotting substrate(Thermo, Lot# 171297) 1mL를 멤브레인(membrane)에 골고루 분주하였다. 그런 다음 카세트 위에 올리고 최종적으로 빛이 차단된 암실에서 X-ray 필름으로 현상하였다.
실시예 2. 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells, T-MSCs)의 형태학적 특징 및 LTEs에 대한 TMSCs의 세포 독성 측정
일반적인 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)의 특징은 자가 재생 능력이 빠르며 특정 조직 세포로의 분화능이 뛰어나다는 특징이 있다. 더욱이 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells, T-MSCs)는 증식 능력이 다른 중배엽 기원의 조직 유래 MSCs 보다 월등하다는 사실이 알려져있다.
본 발명의 T-MSCs에서 연골세포로의 분화 과정 및 이를 확인하는 마커에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 연골 형성이 진행되는 동안 특정 인자들의 역할은 최근에 알려지기 시작하였으며 여전히 밝혀지지 않은 점들이 많다. 연골 형성은 배아 발생 중 가장 빨리 일어나는 형태학적 사건이며 여러 단계를 거쳐 진행되는데, 연골 전구체 세포의 증식과 응집 그리고 연골 모세포 및 연골 세포로의 분화를 거쳐 최종적으로는 세포 자살이 일어나며 골격 구조로 형질이 전환되는 과정을 겪는다.
이에, 100 Ø 세포 배양 접시에 passage 11의 T-MSCs를 1 X 105개(전체의 10%)의 배양한 후 90~100%의 density를 이루기까지 걸리는 시간을 확인해보았다.
그 결과, 섬유아세포와 유사한 형태(fibroblast-like cell morphology)를 유지하며 증식하는 것이 확인되었고(도 2a), in vitro 에서 T-MSCs 배양 시, 초기의 세포 밀도와 비교하여 약 5일만에 90% 이상의 세포 밀도가 되는 것을 확인하였다.
또한 T-MSCs의 분화능을 파악하기 위하여 연골 세포, 뼈 세포 그리고 지방 세포로의 분화를 유도하는 각각의 분화 유도 배지를 이용하여 T-MSCs를 16일 동안 배양하였다. 배양 후 연골 세포는 alcian blue staining, 뼈 세포는 alizarin red s staining 그리고 지방세포는 oil red o staining을 진행하여 각각의 분화 정도를 시각적으로 파악하였다.
그 결과, 일반 배지에서 배양한 T-MSCs와 비교하여 분화 유도 배지에서 배양한 T-MSCs에서 각각의 세포 특이적 staining 결과가 관찰되었다(도 2b).
이후 도마뱀 꼬리 추출물(Lizard tail extracts, LTEs) 처리에 의한 T-MSCs의 세포 생존율을 확인하기 위하여 WST-1 assay를 진행하였다. T-MSCs (passage 11)의 배지에 LTEs를 농도별(0, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100㎍/mL)로 처리한 후 24시간, 48시간 동안 배양하였고 각 시간별로 세포 생존율을 확인하였다 .
그 결과, LTEs 처리 24시간, 48시간 후 0~20㎍/mL의 농도는 T-MSCs에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다(도 2c). 일반적으로 저농도로도 분화 유도 효과를 보이는 유도 물질들과 LTEs의 상대적인 비교를 위해 분화 유도 배지에 첨가할 LTEs의 농도를 저농도인 0.5㎍/mL로 설정하였다.
실시예 3. 도마뱀 꼬리 추출물 (LTEs)의 처리 유무에 따른 연골 세포 분화 비교
MSCs에서 연골 세포로의 분화가 이루어질 때, 연골 세포 특이적 프로테오글리칸인 aggrecan (AGG), collagen type Ⅱ (COL2) 등을 포함하는 다양한 다당류 및 프로테오글리칸들이 축적되어 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)이 형성된다. 알시안블루(Alcian blue)는 일반적으로 연골의 GAGs를 파랗게 염색시킨다는 사실을 바탕으로, LTEs를 처리한 분화 유도 배지와 그렇지 않은 분화 유도 배지 각각에서 배양된 세포들의 분화능을 염색을 통해 확인하였다
그 결과, 배양 4일, 8일, 12일 16일 동안 도마뱀 꼬리 추출물 (LTEs)을 처리한 실험군에서 더욱 파랗게 염색되어, 연골 세포 특이적 프로테오글리칸인 aggrecan (AGG), collagen type Ⅱ (COL2) 등을 포함하는 다양한 다당류 및 프로테오글리칸들이 축적되어 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)이 형성됨을 확인하였다(도 3a).
또한, 일정 기간동안의 분화 유도 기간을 거쳐 세포 staining을 진행하였고, 그 결과 연골 분화 유도 8일째부터 LTEs를 첨가한 배지에서 배양된 세포가 동일한 유도 기간을 거친 대조군 세포보다 좀 더 진한 파란색으로 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 일차적으로 LTEs를 연골 분화 유도 배지에 첨가하여도 T-MSCs의 연골 분화가 정상적으로 유도됨을 시각적으로 확인하였고, 염색 결과에 신빙성을 더하기 위하여 LTEs의 처리 유무에 따른 연골 특이적 마커들의 발현 정도를 비교하였다. 분화 기간을 기준으로 하였을 때, LTEs를 처리하지 않은 일반 분화 유도 배지에서 배양한 세포보다 LTEs를 처리한 실험군에서 연골 세포 특이적 마커들의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 주목할 만한 점은 T-MSCs를 LTEs가 처리된 분화 유도 배지에서 12일동안 배양하였을 때, COL2, AGG등을 분해하는 단백질 분해 효소이자 연골 세포가 비대해지는 과정의 마커인 MMP13이 가장 낮은 발현을 보임을 확인하였다(도 3b). 따라서 MMP13의 발현이 가장 최소로 나타난 분화 유도 12일째를 상한선으로 하여 추가적인 실험을 진행하였다
실시예 4. 단백체학 분석을 통한 LTEs 속 연골 세포 분화의 관련 인자인 ENPL 발현 수준 확인
도마뱀 꼬리가 절단된 후 새롭게 재생되는 꼬리 조직을 이용하여 선행된 단백체학 분석 결과에서 재생이 진행되는 6일에서 12일 사이에 단백체 분석(proteomic analysis)에 의해, 발현의 변화를 보이는 인자들을 확인하였고, 그 중 이 기간동안 가장 큰 폭으로 발현량이 증가하는 인자가 ENPL이라는 것을 확인하였다(도 4a).
ENPL은 HSP90 (Heat Shock Protein 90) family에 속하며, 이 그룹의 역할 중 하나가 MMP13의 발현을 조절한다는 것이고 이는 이미 다른 연구를 통해 밝혀진 사실이다. 이러한 결과를 바탕으로 연골 세포 분화 유도 기간 동안 ENPL의 발현 양상을 파악하기 위한 실험을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 분화를 유도 한 T-MSC에서 ENPL의 상대적인 mRNA 발현을 파악하였다(D0,D4,D8,D12 : 각각 0,4,8 및 12 일 연골 세포로 분화한다). 먼저, 이 실험에서는 MMP13의 발현이 최소로 나타난 분화 유도 12일을 최대로 설정하였고 그 외의 모든 실험 조건들(LTEs의 처리 유무, 배지 조성 및 환경 등)은 앞선 실험과 동일하게 진행하여 분화 유도 기간 동안 mRNA 수준에서 ENPL의 발현을 파악하였다(도 4b).
분화 유도 기간의 관점에서 보면, 분화 유도 약 8일째부터 ENPL의 발현이 증가함을 확인하였고 뿐만 아니라 분화 유도 12일 째에는 분화를 유도하지 않은 T-MSCs보다 ENPL의 발현량이 약 10배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 다음으로 LTEs의 처리 유무의 관점에서 보면, 분화 유도 8일, 12일째에서 LTEs를 처리한 분화 유도 배지에서 배양된 세포의 ENPL 발현량이 LTEs를 처리하지 않은 배지에서 배양된 세포보다 높게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 연골 세포 분화가 일어나는 동안 ENPL의 발현이 증가하며 뿐만 아니라 LTEs의 자극을 받은 세포는 내재적인 ENPL의 발현이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 적절한 ER stress에 의한 T-MSCs의 ENPL 발현 증가 및 연골 세포로의 분화 자극
앞선 실험에서 LTE의 처리 및 연골 세포 분화 동안 ENPL의 발현이 증가하는 것을 확인한 후, 연골 세포 분화에 ENPL이 관여함을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 우선적으로, ENPL 유전자 발현 증가에 영향을 미칠것으로 예상되는 ATF6(Activating transcription factor 6) 전사 인자의 발현과 ENPL의 발현을 함께 확인하였다.
ATF6는 소포체 스트레스(ER stress)로 인한 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response)에 관여하는 것으로 알려져있으며 또한 이로 인해 ENPL을 포함한 샤페론 단백질의 유전자 전사 과정에 전사인자로서 작용한다. 발현된 ENPL은 다시 ATF6의 활성화를 유도함으로써 ATF6와 ENPL은 상호작용을 한다고 알려져 있다. 이 두 인자의 상호작용으로 인한 연골 세포 분화 촉진을 확인하기 위하여 ENPL 억제제인 Luminespib을 이용하여 실험을 진행하였다(도 5a). ENPL의 발현이 수치적으로 크게 증가한 분화 유도 8일째를 기준으로하여, LTEs의 처리 유무 그리고 억제제의 처리 유무에 따라 실험군을 나누어 세포를 분화 유도 배지에서 8일 동안 배양하였다. 배양된 세포의 ATF6와 ENPL의 유전자 발현량을 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하여 상대적 mRNA 발현을 비교하였다. 모든 값들은 대조군으로써 분화를 유도하지 않은(0 day) T-MSCs의 액틴(actin)으로 보정하였다.
그 결과 분화 유도 배지에 LTEs만을 처리하여 8일동안 배양한 실험군의 ATF6 발현량이 LTEs를 처리하지 않은 분화유도 배지에서 배양된 실험군에 비해 2배 이상 증가한 것을 확인하였다. 또한, ENPL의 억제제만을 처리하여 8일동안 배양한 실험군에서는 ATF6의 발현량이 대조군인 초기 MSC의 ATF6와 차이가 없었으며, LTEs와 억제제 둘 다 처리한 실험군에서는 앞서 LTEs만을 처리한 실험군의 결과와는 달리 큰 증가폭을 보이지 않음을 확인하였다.
또한, ENPL의 발현량도 ATF6의 발현 양상과 유사하게 LTEs를 처리하지 않은 실험군에 비해 LTEs만을 처리한 실험군에서 ENPL의 발현량이 2배 이상 증가한 것을 확인하였고, ENPL 억제제 그리고 LTEs와 억제제를 같이 처리한 실험군에서는 ENPL의 발현량이 아무것도 처리되지 않은 분화 유도 8일째의 실험군에 비해 낮은 발현량을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 이 결과는 일반적으로 알려진 ATF6의 전사 및 활성화가 유도된 후 활성화된 ATF6는 핵 안에서 전사인자로 작용하여 ENPL의 발현을 조절한다는 사실에 부합하였고, 추가적으로 LTEs의 처리가 ATF6의 활성화를 더욱 빠르게 유도하여 ENPL의 발현을 증가시킨다는 결과를확인하였다(도 5a).
ENPL이 연골 세포 분화 과정에 관여함을 입증하기 위해 연골 세포 특이적 마커들과 MMP13의 발현량을 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하여 연골 형성 / 비 특이 적 세포 마커 (SOX9, COL2, AGG 및 MMP13)에 대한 상대적 mRNA 발현을 비교하였다. 구체적으로 모든 데이터의 0day는 T-MSC안에 액틴은 정성화 되어있다.
그 결과, 분화 유도 배지에 LTEs만을 처리하여 8일동안 배양한 실험군은 ENPL 및 모든 연골 세포 특이적 마커들의 발현량이 LTEs 및 억제제를 처리하지 않은 실험군에 비해 증가하였고, ENPL 억제제만 처리한 실험군에서는 모든 타겟들의 발현량이 대조군과 유사한 값을 보였다. 뿐만 아니라 LTEs를 처리한 실험군의 결과와는 대조적으로 LTEs와 ENPL 억제제를 함께 처리하였더니 타겟 유전자들의 발현이 대조군과 유사 혹은 확연한 발현량 증가가 일어나지 않는 것을 확인하였다. 또한 ENPL 억제제를 처리한 두 실험군에서 MMP13의 발현이 억제제를 처리하지 않은 두 실험군에 비해 2배 이상 높은 수준으로 나타났으며, 결과적으로 ENPL의 발현에 따라 연골 형성 특이적 마커들과 이들을 분해하는 MMP13의 발현이 조절되는 것을 확인하였다(도 5b).
mRNA 발현 수준에 이어 western blotting을 이용하여 단백질 수준에서 연골 형성 특이적 마커들(SOX9, AGG and COL2)의 발현량을 단백질 수준에서 확인하였다. 마찬가지로 아무런 첨가물을 처리하지 않은 분화 유도 8일째 T-MSCs의 연골 형성 마커들의 단백질 발현에 비해 LTE만을 첨가한 실험군에서 상대적으로 마커들의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 ENPL 억제제 혹은 LTE와 ENPL 억제제 모두를 처리한 실험군에서는 연골 형성 마커들의 발현이 증가하지 않았음을 확인하였다. 따라서 LTEs (0.5㎍/mL)는 T-MSCs의 적절한 ER stress를 유도하여 결과적으로 T-MSCs가 연골 세포로의 분화가 진행되도록 하며 또한 자극을 받은 세포는 연골 세포로의 분화능이 촉진되는데 이 과정에 LTEs 속에 포함된 인자들 중 ENPL의 역할이 큰 비중을 차지하고 있음을 ENPL 억제제를 사용함으로써 확인하였다(도 5c).
실시예 6. ENPL에 의한 T-MSCs의 연골 세포 분화 촉진
T-MSCs로부터 연골 세포로의 분화 과정동안 ATF6와 ENPL의 상호작용으로 인해 각각의 발현이 증가하고 결과적으로 ENPL의 발현에 따라 연골 세포 특이적 마커들의 발현량이 조절된다는 것을 확인한 후, 인위적으로 ENPL 과발현 벡터를 T-MSCs에 형질 주입하여 연골 분화를 유도했을 때 일어나는 결과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다(도 6).
먼저 T-MSCs에 ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 후 일정 기간 동안 연골 세포로의 분화를 유도하였으며, 형질 주입된 세포는 앞선 실험들과 동일한 분화 유도 배지 및 분화 유도 조건에서 배양되었다. OV_0은 ENPL 과발현 벡터 형질 주입 후 일반 배지에서 24시간동안 안정화를 진행하였고 분화 유도는 하지 않은 세포를 의미하며, OV_4, 8 그리고 12는 마찬가지로 24시간 동안 안정화를 시킨 후 각각의 분화 유도 기간에 따라 연골 세포 분화 유도 배지에서 배양한 세포를 의미한다. Real-time PCR을 진행하여 상대적 mRNA 발현을 비교하였으며 모든 값들은 대조군으로써 ENPL 과발현 벡터를 형질 주입하지 않은 초기 T-MSCs의 actin으로 보정하였고, 대조군의 모든 타겟 유전자들(ENPL 및 연골 형성 마커들)은 1의 값을 나타내었다.
그 결과, 형질 주입된 세포에서 ENPL의 mRNA 발현 수준이 분화 유도 기간에 따라 증가하는 것을 확인하였다(도 6a).
뿐만 아니라 연골 형성 특이적 마커 COL2 및 AGG들의 발현량을 mRNA와 단백질 수준에서 각각 비교하였을 때 분화 유도 4일째부터 발현 정도가 상당히 증가하는 것을 확인하였다 (도 6b,도 6c).
또한, 앞선 실험에서 분화 유도 12일 이후부터 마커들이 높은 수준으로 발현되는 것에 비해(도 3b) ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 세포는 분화 유도 8일째에 AGG와 COL2의 발현량이 mRNA와 단백질 모두에서 가장 높은 수준으로 발현하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 ENPL 과발현 벡터가 형질 주입된 세포는 일반적인 연골 세포 분화 유도 기간 보다 약 1주일 정도 빠른 기간내에 연골 형성이 유도 및 촉진된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. ENPL 억제를 통한 ENPL의 연골 세포 분화 유도 기능 검증
ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 세포를 분화 유도 배지에서 배양하였을 때, 더 빠른 기간내에 연골 세포 특이적 마커들의 발현이 2배 이상 증가하였음을 확인한 후, ENPL 억제제를 처리하여 이 유전자들의 발현이 ENPL의 조절에 의한 것임을 증명하기 위한 추가 실험을 진행하였다.
억제제의 효과를 명확히 비교하기 위해 모든 세포는 ENPL 과발현 벡터를 형질 주입하여 ENPL의 발현을 높은 수준으로 유도한 후 실험에 사용되었다. 앞선 실험을 통해 ENPL 과발현을 유도한 세포를 8일동안 배양했을때의 ENPL 발현량은 초기 T-MSCs의 값에 비해 상대적으로 200배 이상 증가하는 것으로 확인되었다. 따라서 분화 유도기간 동안 급증하는 ENPL로 인해 세포 자체적으로 억제제(inhibitor)를 극복하는 현상을 최소화하기 위하여 발현 차이가 100배 미만인 분화 유도 4일째를 기준으로 실험을 진행하였다. 또한 ENPL 과발현을 유도한 후 4일 동안 분화를 유도한 실험군에서도 연골 세포 특이적 마커들의 확연한 증가가 나타났으므로 억제제 처리에 따른 발현 양상 비교에 적합하였다.
ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 후 세포를 일반 배지, ENPL 억제제가 처리된 일반 배지 그리고 4일동안 분화 유도 배지에서 배양 혹은 ENPL 억제제가 처리된 분화 유도 배지에서 배양하였을 때, ENPL 및 연골 형성 특이적 마커들의 발현량을 비교하기 위해 real-time PCR을 진행하여 상대적 mRNA 발현을 비교하였다 (도 7).
앞선 실험에서 연골세포 분화 기간 동안 발현의 증가를 보인 ATF6와 ENPL의 발현을 다시 한번 더 확인하였다(도 7a).
먼저 ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 후 분화 유도를 하지 않은 T-MSCs (OV_0)와 4일동안 분화 유도를 진행한 T-MSCs (OV_4)의 ATF6와 ENPL 발현량이 초기 MSCs에 비해 약 20배 이상 증가한 것을 확인하였다. 반대로 형질 주입 24시간 후 억제제가 처리된 일반 배지에서 24시간 동안 배양된 T-MSCs (OV_0+I)와 억제제가 처리된 분화 유도 배지에서 4일 동안 배양된 T-MSCs (OV_4+I) 두 실험군은 억제제가 처리 되지 않은 실험군에 비해 상대적으로 낮은 발현률을 보였다. 주목할만한 점은 ENPL 과발현 벡터의 형질 주입만으로도 ATF6의 발현 수준이 증가하였다는 것이다. 이 결과를 바탕으로 골지체에서 절단 과정을 겪은 활성화된 ATF6가 핵 내에서 ENPL의 전사를 촉진 시키는 전사인자로 작용하지만, 역으로 ENPL도 ATF6의 발현 및 소포체 내의 축적에 관여한다는 사실을 확인하였다. 또한 ENPL 억제제가 처리된 두 실험군에서는 ENPL 과발현 벡터에 의한 ENPL 발현 이외의 자체적인 ENPL 발현 증폭이 억제제(inhibitor)에 의해 억제되었음을 유추할 수 있었다. 이후 연골 세포 특이적 마커들의 발현량을 mRNA 수준에서 확인하였을 때(도 7b), ENPL 억제제가 처리된 실험군(OV_0+I 그리고 OV_4+I)의 마커들 대부분이 각각의 대조군인 초기 T-MSCs에서의 발현 수준과 유사하거나 혹은 약간의 발현 증가를 보였다. 하지만, ENPL 억제제를 처리하지 않은 실험군(OV_0 그리고 OV_4)에서는 연골 세포 특이적 마커들의 발현 양상이 앞선 ATF6와 ENPL의 발현과 유사하였으며, ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 후 분화 유도를 하지 않은 실험군에서도 각각의 마커들 발현이 증가하였고 형질 주입 후 4일 동안 분화 유도를 한 실험군에서 그 발현량이 더욱 증가하였다(도 7b).
또한, 동일한 실험 조건으로 연골 세포 특이적 마커들의 발현량을 단백질 수준에서도 확인하였으며(도 7c), ENPL 과발현 벡터의 transfection의 의한 GAGs 침착의 확인을 위해 알시안 블루(Alcian Blue) 염색을 실시한 결과도 마찬가지로 억제제가 처리되지 않은 실험군에서 각각의 연골 세포 특이적 마커들의 발현 정도가 높았고, 특히 OV_4에서 모든 마커들의 발현이 가장 활발히 일어났음을 확인하였다(도 7d).
결과적으로 ENPL의 활성을 억제하는 억제제를 처리한 실험군들에서 ATF6와 ENPL을 포함한 모든 연골 세포 특이적 마커들의 발현 정도가 억제제를 처리하지 않은 실험군에 비해 상당히 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 따라서 ENPL은 MSCs가 연골 세포로 분화하는 과정에 관여한다는 사실을 증명하였으며, 또한 ENPL의 발현량이 일정 수준까지 증가할수록 연골 세포 특이적 마커들의 발현도 증가함을 확인하였다.
실시예 8. ERK signaling 조절을 통한 ENPL의 연골 세포 분화 유도 및 가설 메커니즘
최종적으로 ENPL이 연골 세포 분화 과정에 어떤 신호 전달 체계를 조절함으로써 관여하는지 파악하기 위한 실험을 진행하였다. 연골 형성 과정에 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), Wnt/β-catenin 그리고 TGF-β signal pathway와 같은 다양한 일련의 신호 전달 체계들이 다이나믹하게 연관되어 있음에도 불구하고, 현재까지 특정 신호 전달 체계에 대해 명확히 밝혀진 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 ER stress와 밀접한 관계가 있는 ERK signaling에 주목하였다. 특정 조직 유래의 중간엽 줄기세포에서 ERK는 연골 세포 특이적 마커들의 주요 전사인자인 SOX9의 negative 조절자로써 역할을 한다는 연구를 바탕으로, 앞서 도 7의 실험과 동일한 조건들로 세포를 형질 주입 및 배양하였다. 4일 동안 연골 세포 분화를 유도한 후 ERK 1/2의 인산화 정도를 western blotting을 통해 확인하였다(도 8a).
그 결과, ENPL 과발현 벡터를 형질 주입한 후 분화 유도를 하지 않은 실험군(OV_C)과 형질 주입 후 4일 동안 분화 유도를 진행한 실험군(OV_4)에서 ERK 1/2의 인산화가 상당히 낮은 수준으로 일어났으며, 반대로 ENPL 억제제가 처리된 두 실험군(OV_C+I, OV_4+I)에서는 ERK 1/2의 인산화가 매우 높은 수준으로 일어나는 것을 확인하였다. 이 결과는 앞서 진행한 도 7에서 확인한 연골 세포 특이적 마커들의 발현 수준과 상응하는 결과임을 알 수 있다. 즉, OV_C와 OV_4 두 실험군에서 SOX9 활성화에 negative 조절자로 기능을 하는 ERK 1/2의 인산화가 억제되었으며 따라서 SOX9의 활성화로 인한 연골 세포 특이적 마커들의 발현량이 급격하게 증가하였고, ENPL 억제제가 처리된 두 실험군(OV_C+I, OV_4+I)에서는 인산화된 ERK 1/2에 의해 SOX9의 활성화가 억제되어 연골 세포 특이적 마커들의 발현이 초기 T-MSCs와 유사 혹은 미미한 증가를 보였음을 유추할 수 있다.
결과적으로 활성화된 ENPL은 ERK 1/2의 인산화에 관여하며 따라서 이후 연골 세포 특이적 마커들의 발현을 조절함으로써 연골 세포 분화 과정에 관여한다는 것을 규명하였다. 지금까지의 밝혀진 연구 결과들과 본 연구를 통해 확인한 결과들을 바탕으로 ENPL이 연골 세포 분화 과정에 관여하는 하나의 가설을 설정하였다(도 8b).
특정 자극에 의해 소포체 스트레스(ER stress)가 유도되면 소포체의 세포막에 존재하는 ATF6가 골지체로 이동하여 그곳에서 절단되는 과정을 겪는다. 절단된 ATF6는 핵안으로 이동하여 샤페론 단백질 유전자의 전사를 돕는 전사인자로 작용하게 되고 따라서 ENPL의 전사가 촉진된다. 또한 소포체 스트레스(ER stress)로 인해 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) 신호 전달 경로가 활성화되고 특히 ERK의 인산화가 촉진되는데, 인산화된 ERK는 하위 신호 전달 체계를 조절한다. ERK의 조절을 받는 하위 신호 전달 체계 중 연골 세포 분화 관점에서의 조절 한 가지는 소포체 스트레스(ER stress)로 인한 세포자연사(apoptosis) 촉진 인자들의 활성화이며 다른 한 가지는 SOX9의 활성화를 억제하는 것이다. 인산화된 ERK는 SOX9의 활성화를 억제하고 따라서 연골 세포 특이적 마커들의 전사 및 발현이 억제된다.
최종적으로, ENPL 억제제를 처리한 실험군에서는 연골 세포 특이적 마커들의 발현은 억제되고 ERK의 인산화는 높은 수준으로 일어나며, 반대로 ENPL이 활성화된 실험군에서는 연골 세포 특이적 마커들의 발현이 증가하고 인산화된 ERK가 상당히 낮은 수준으로 발현된다는 사실을 바탕으로, 활성화된 ENPL이 ERK의 인산화를 억제하여 결과적으로 SOX9의 활성화에 따른 연골 형성 관련 유전자의 전사 및 연골 세포의 분화 과정을 유도한다는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> novel uses of ENPL genes <130> PN2105-269 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENPL gene <400> 1 atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60 gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120 ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180 ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240 gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300 ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360 actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420 gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480 aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540 gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600 tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660 cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720 ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780 ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840 gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900 gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960 ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020 ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080 tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140 gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200 tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260 gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320 gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380 aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440 aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500 tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560 attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620 atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680 aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740 cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800 agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860 tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920 acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980 atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040 cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100 attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160 gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220 agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280 gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340 gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2400 gatgaattg 2409 <210> 2 <211> 803 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ENPL amino acid <400> 2 Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe 1 5 10 15 Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu 20 25 30 Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val 35 40 45 Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser 50 55 60 Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala 65 70 75 80 Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn 85 90 95 Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu 100 105 110 Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly 115 120 125 Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu 130 135 140 Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val 145 150 155 160 Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn 165 170 175 Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile 180 185 190 Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys 195 200 205 Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu 210 215 220 Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr 225 230 235 240 Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser 245 250 255 Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser 260 265 270 Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr 275 280 285 Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu 290 295 300 Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys 305 310 315 320 Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met 325 330 335 Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu 340 345 350 Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp 355 360 365 Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys 370 375 380 Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val 405 410 415 Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe 420 425 430 Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg 435 440 445 Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu 450 455 460 Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr 465 470 475 480 Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val 485 490 495 Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe 500 505 510 Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val 515 520 525 Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser 530 535 540 Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys 545 550 555 560 Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys 565 570 575 Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala 580 585 590 Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg 595 600 605 Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp 610 615 620 Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu 625 630 635 640 Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly 645 650 655 Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp 660 665 670 Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn 675 680 685 Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp 690 695 700 Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr 705 710 715 720 Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly 725 730 735 Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp 740 745 750 Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu 755 760 765 Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val 770 775 780 Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys 785 790 795 800 Asp Glu Leu

Claims (11)

  1. ENPL(Endoplasmin, Heat shock protein 90kDa beta member 1) 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것이고,
    상기 ENPL 유전자로 암호화된 단백질은 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 벡터.
  5. ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 줄기세포.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 편도, 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질에서 유래된 것인, 줄기세포.
  7. ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 연골세포로의 분화 또는 재생용 조성물로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  8. ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 약학 조성물로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것이고,
    상기 ENPL 유전자로 암호화된 단백질은 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골형성 부전증, 골위축, 파제트(paget's disease), 치주염(periodontitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 대사성 골질환 및 암세포의 골전이에 의해 유발되는 뼈의 손상으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  10. ENPL 유전자를 포함하는 연골세포로의 분화 또는 재생용 재조합 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 및 치료용 세포치료제 조성물로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 세포치료제 조성물.
  11. (1)시료에 골질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계;
    (2)상기 시료에서 ENPL 유전자 또는 ENPL 유전자로 암호화된 단백질의 발현수준 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (3)대조군에 비해 상기 ENPL 유전자로 암호화된 단백질의 발현수준 또는 활성을 증가시키는 물질을 골 질환의 예방 또는 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법으로서,
    상기 ENPL 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것이고,
    상기 ENPL 유전자로 암호화된 단백질은 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 것인, 방법.

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