JP2022515881A - オリゴ核酸分子及びその応用 - Google Patents
オリゴ核酸分子及びその応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022515881A JP2022515881A JP2021538368A JP2021538368A JP2022515881A JP 2022515881 A JP2022515881 A JP 2022515881A JP 2021538368 A JP2021538368 A JP 2021538368A JP 2021538368 A JP2021538368 A JP 2021538368A JP 2022515881 A JP2022515881 A JP 2022515881A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- small molecule
- acid molecule
- activated
- smn2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 216
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 172
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 172
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 137
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 130
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 80
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 72
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 claims description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 69
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 claims description 37
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 claims description 36
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 claims description 34
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 29
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 13
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 208000035969 Genetic neuromuscular disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 36
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 abstract description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 37
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 208000032225 Proximal spinal muscular atrophy type 1 Diseases 0.000 description 19
- 208000032471 type 1 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 13
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 11
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 101150113275 Smn gene Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 229940078677 sarna Drugs 0.000 description 8
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 208000033522 Proximal spinal muscular atrophy type 2 Diseases 0.000 description 4
- 208000033550 Proximal spinal muscular atrophy type 4 Diseases 0.000 description 4
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 208000032521 type II spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 4
- 208000005606 type IV spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 208000033526 Proximal spinal muscular atrophy type 3 Diseases 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000032527 type III spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 2
- XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N 1-methyluracil Chemical compound CN1C=CC(=O)NC1=O XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000008425 Protein deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091029810 SaRNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700024715 Survival of Motor Neuron 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000047185 Survival of Motor Neuron 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000386 athletic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 201000006913 intermediate spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028527 righting reflex Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006863 thiophosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
- A01K2217/077—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out heterozygous knock out animals displaying phenotype
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/122—Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
- C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療するための小分子活性化核酸分子及びその応用に関する。【解決手段】前記小分子活性化核酸分子は、センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖を含み、センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖はぞれぞれ長さが16～35個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖であり、そのうちの1本のヌクレオチド鎖が標的遺伝子SMN2のプロモーター領域から選択される標的部位と少なくとも75％の塩基相同性又は相補性を有する。また、本発明は、本発明に係る小分子活性化核酸分子及び薬学的に許容されるベクターを含む薬品組成物、本発明に係る小分子活性化核酸分子又は本発明に係る小分子活性化核酸分子を含む医薬組成物を用いて、細胞中での標的遺伝子の表現をアップレギュレーションする方法、及び標的遺伝子の表現不足に起因する疾病を治療する方法にも関する。
Description
本発明は、核酸技術分野に属し、具体的には、遺伝子活性化に関するオリゴ核酸分子及びその応用に関する。
脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy、SMA）は、1種の遺伝的神経筋疾患であり、骨格筋及び呼吸筋の筋力欠乏、萎縮を進行性に示し、2歳以下の子供の死亡を起きさせる首位の遺伝性疾患である。臨床的には、発病年齢及び病症の重症度に応じて、最も重いSMA I型から最も軽いSMA IV型までの4種に分けられる（1）。SMAは、最も一般的な子供期常染色体劣性遺伝性疾患の1つであり、生産児での発病率が1/11,000である一方、成人携帯者の比率が1/67～1/40と高く（2）、中国人の携帯率が約1/42である（3）。
SMAは、生存運動ニューロンタンパク質1（survival of motor neuron 1、SMN1）遺伝子の突然変異に起因するものであり、また、SMA患者は、コピー数が等しくない高い同性を有するSMN2遺伝子を持つ（4；5）。SMN2遺伝子とSMN1遺伝子はともに染色体5q13領域にあり、同一の生存運動ニューロンタンパク質（survival of motor neuron、SMN）と呼ばれるタンパク質をコードするが、SMN2遺伝子は、SMN1遺伝子と比べて、11個のヌクレオチドサイトが異なり、他の配列が全く同じものである。この11個のヌクレオチドのうちの1つのみがSMN2のタンパク質コード領域に出現し、すなわち、エクソン7の6番目のヌクレオチドのCがTで置換され（C6T）、当該領域がエクソンのスプライシングエンハンサー領域となる。この置換により、タンパク質のコード配列を変えないが、SMN2のエクソン7の有効なスプライシングへ影響を与えて、大部分のSMN2の前駆体伝令RNA（pre-mRNA）がスプライシング時にエクソン7を落とし、大量の不安定な突然変異SMNタンパク質（SMNΔ7）と少量の正常に機能する全長SMNタンパク質に翻訳される（5；6）。従って、SMA患者では、SMN2によって発生した少量の全長SMNタンパク質の機能は、SMN1の突然変異に起因するSMNタンパク質の欠乏を補償するには不十分となる。従って、SMN2遺伝子からの全長SMNタンパク質の発現を増加可能な方法であれば、SMAの治療に有効な方法となる可能性がある。
小分子化合物又はオリゴヌクレオチドを用いてSMN2遺伝子のスプライシングを変えることにより、全長タンパク質の発現量を増加させるというスプライシング調整ポリシは、既に動物SMAモデル及び臨床試験で検証された（7－11）。そのうち、アンチセンスオリゴヌクレオチドSpinrazaは、2016年に最初の子供及び成人の脊髄性筋萎縮症を治療するための小核酸医薬品として米国FDAに承認された。pre-mRNAのスプライシングの調整は有効な治療方針であるが、SMN2 pre-mRNAの使用可能量によって制限され、すなわち、SMN2 pre-mRNA自体の発現量が一定又は低下すると、この医薬品の影響で産生される全長SMNタンパク質の量も有限である。SMNタンパク質レベルを向上させるもう1つのポリシーは、SMN2の転写レベルを向上させ、さらに全長SMN2タンパク質の発現を増加させることである。小分子ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（histone deacetylase inhibitor；HDAC阻害剤）は、ヒストン脱アセチル化酵素を抑制することによってSMN2遺伝子を活性化させ、SMN2転写レベルを向上させて、SMN2 pre-mRNAをより多く生成することができ、SMA動物モデルにおいても良好な薬効を表現するようなデータが存在する（12；13）。しかし、SMA患者において臨床的治療効果が得られなく、その原因として、小分子HDAC阻害剤はヒストン脱アセチル化酵素を抑制した後に、多くの遺伝子の表現がアップレギュレーションするため、SMN2プロモーターに対する高特異性及び高活性を有しない可能性がある（14；15）。本発明は、SMN2プロモーターを標的することによりSMN2転写を高度特異的に活性化させる小分子活性化核酸分子を提供する。
本発明は、上記課題を解決するために、SMN2の転写を活性化/アップレギュレーションさせることにより、全長SMNタンパク質の表現量を向上させて、例えば脊髄性筋萎縮症などの全長SMNタンパク質の欠乏による疾患や状況を治療する、RNA活性化による例えば小分子活性化RNA（saRNA）分子などの小分子活性化核酸分子を提供する。
本発明の一側面によれば、細胞中でのSMN2遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションする、例えば小分子活性化RNA（saRNA）分子などの小分子活性化核酸分子であって、その1本の鎖がSMN2遺伝子のプロモーター領域の長さが16～35個のヌクレオチドの断片と少なくとも75％以上の相同性又は相補性を有し、プロモーター領域が転写開始点より上流の2000個のヌクレオチドを含むことにより、前記遺伝子の発現の活性化又はアップレギュレーションを実現する小分子活性化核酸分子を提供する。具体的には、前記小分子活性化核酸分子は、その1本の鎖がSMN2遺伝子のプロモーターにおける転写開始点から-1639～-1481の領域（SEQ ID NO：476）、-1090～-1008の領域（SEQ ID NO：477）、-994～-180の領域（SEQ ID NO：478）又は-144～-37（SEQ ID NO：479）のうち長さが連続的な１６～３５個のヌクレオチドの断片と少なくとも75％、例えば少なくとも約79％、約80％、約85％、約90％、約95％又は約99％の相同性又は相補性を有する。より具体的には、前記小分子活性化核酸分子は、その1本の鎖がSEQ ID NO：315～471から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約99%の相同性又は相補性を有する。
本発明では、前記小分子活性化核酸分子は、センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片を含み、前記センス核酸断片及び前記アンチセンス核酸断片が相補的領域を含み、相補的領域は、2本鎖核酸の構造を形成可能であり、当該2本鎖核酸分子は、RNA活性化の機制により細胞中でのSMN2遺伝子の発現を促進する。小分子活性化核酸のセンス核酸断片及びアンチセンス核酸断片は、2本の異なる核酸鎖上に存在していてもよいし、同一の核酸鎖上に存在していてもよい。センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片がそれぞれ2本の鎖に存在する場合、小分子活性化核酸の少なくとも1本の鎖は長さが０～６個のヌクレオチドの3'突出端を有し、好ましくは、2本の鎖は長さが2又は3個のヌクレオチドの3'突出端を有し、突出端のヌクレオチドはdTである。センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片が同一の核酸鎖上に存在する場合、当該小分子活性化核酸分子がヘアピン型1本鎖核酸分子であり、そのうち、センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片の相補的領域が2本鎖核酸の構造を形成することが好ましい。前記小分子活性化核酸分子では、センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片の長さは、１６～３５個、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35個のヌクレオチドであってもよい。
1つの実施形態においては、本発明に係る小分子活性化核酸分子は、そのセンス鎖がSEQ ID NO：1～157から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約99%の相同性を有するとともに、そのアンチセンス鎖がSEQ ID NO：158～314から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約99%の相同性を有する。具体的には、本発明に係る小分子活性化核酸分子は、そのセンス鎖がSEQ ID NO：1～157から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、又はSEQ ID NO：1～157から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列からなり、又はSEQ ID NO：1～157から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列であり、そのアンチセンス鎖がSEQ ID NO：158～314から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、又はSEQ ID NO：158～314から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列からなり、又はSEQ ID NO：158～314から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列である。
本明細書に記載の小分子活性化核酸分子における全てのヌクレオチドは、天然又は化学修飾されていないヌクレオチドであってもよく、少なくとも1つのヌクレオチドが化学修飾されたヌクレオチドであってもよく、前記化学修飾は、以下の（1）～（3）の修飾のうちの1種又はその組み合わせである。
（1）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドのホスホジエステル結合に対する修飾、
（2）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるリボースの2'-OHに対する修飾、
（3）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における塩基に対する修飾。
（1）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドのホスホジエステル結合に対する修飾、
（2）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるリボースの2'-OHに対する修飾、
（3）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における塩基に対する修飾。
本発明の化学修飾は、当業者が周知しているものであり、前記ホスホジエステル結合の修飾は、ホスホジエステル結合における酸素を修飾することを意味し、チオリン酸化修飾及びボラン化リン酸塩修飾を含む。これらの2種類の修飾はいずれもsaRNA構造を安定させ、塩基対の高い特異性及び高い親和性を保持することができる。
前記リボース修飾とは、ヌクレオチドのペントースにおける2‘-OHに対する修飾であり、すなわち、リボースの水酸基位置にある置換基を導入し、例えば、2'-フルオロ修飾、2'-O-メチル化修飾、2'-オキシエチレンメトキシ修飾、2，4'-ジニトロフェノール修飾、ロックド核酸（Locked nucleic acid、LNA）、2'-アミノ修飾、2'-デオキシ修飾がある。
前記塩基修飾とは、ヌクレオチドの塩基を修飾するものであり、例えば、5'-ブロモウラシル修飾、5'-ヨードウラシル修飾、N-メチルウラシル修飾、2，6-ジアミノプリン修飾がある。
これらの修飾は、前記小分子活性化核酸分子の生物利用可能性を高め、標的配列との親和性を高め、細胞内でヌクレアーゼ加水分解に抵抗する能力を増強することができる。
また、小分子活性化核酸分子の細胞への進入を促進するために、上記の修飾に加えて、小分子活性化核酸分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に、脂質二重層からなる細胞膜及び核膜を介して細胞核内の遺伝子のプロモーター領域と作用するようにコレステロールなどの脂肪親和性の基を導入することができる。
本発明が提供する小分子活性化核酸分子は、細胞と接触すると、細胞中でのSMN2遺伝子の発現を効果的に活性化又はアップレギュレーションすることができ、好ましくは、発現を少なくとも10%アップレギュレーションすることができる。
本発明の一側面によれば、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を提供する。一実施形態において、本発明の核酸分子は、小分子活性化RNA（saRNA）分子である。一実施形態において、前記核酸は、DNA分子である。
本発明の一側面によれば、本発明に記載の小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞を提供する。一実施形態において、前記細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。上記細胞は、例えば細胞系や細胞株などのような単離体であってもよいし、例えば人体などの哺乳動物体に存在していてもよい。
本発明の他側面によれば、上記小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸及び（任意の）薬学的に許容されるベクターを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一実施形態において、前記薬学的に許容されるベクターが、水性ベクター、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドを含む。一実施形態において、前記薬学的に許容されるベクターが、水性ベクター、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドから選択されるものである。一実施形態において、前記水性ベクターは、例えばRNaseフリー水、又はRNaseフリー緩衝液であってもよい。前記組成物は、前記小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を１～１５０ｎＭ、例えば１～１００ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～２０ｎＭ、１０～１００ｎＭ、１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、２０～１００ｎＭ、５０ｎＭ含むことができる。
本発明の他側面によれば、前記小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、前記小分子活性化核酸分子又は本発明の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物の、細胞中でのSMN2遺伝子の発現を活性化/アップレギュレーションするための製剤の製造での応用に関する。
本発明は、前記小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、前記小分子活性化核酸分子又は本発明の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物を細胞に投与することを含む、細胞中でのSMN2遺伝子の発現を活性化/アップレギュレーションする方法に関する。
前記小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、前記小分子活性化核酸分子又は本発明の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物は、細胞に直接導入されてもよく、当該小分子活性化核酸分子をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入した後に細胞内に生成してもよい。前記細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましい。上記細胞は、例えば細胞系や細胞株などのような単離体であってもよいし、例えば人体などの哺乳動物体に存在していてもよい。当該人体は、SMN全長タンパク質の発現減少、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び/又はSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患又は症状を有する患者であり、前記小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、前記小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物は、前記疾患又は症状の治療に十分な量で投与される。具体的には、前記SMN全長タンパク質の欠乏、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び/又はSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する症状は、例えば脊髄性筋萎縮症を含む。一実施形態において、前記SMN全長タンパク質の発現不足、又はSMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足に起因する疾患は、脊髄性筋萎縮症である。一実施形態において、本発明に記載の脊髄性筋萎縮症は、SMA I型、SMA II型、SMA III型、及びSMA IV型を含む。
本発明の他側面によれば、SMN2遺伝子のプロモーター領域における任意の連続的な16～35個のヌクレオチド配列を有し、好ましくは、SEQ ID NO：476～479から選択されるいずれか1つの配列における任意の連続的な16～35個のヌクレオチド配列である、単離したSMN2遺伝子の小分子活性化核酸分子の作用部位を提供する。具体的には、前記作用部位は、SEQ ID NO：315～471から選択されるいずれかのヌクレオチド配列で示される配列であり、又はこの配列を含む。
本発明の他側面は、上記の小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、本発明の小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物を、個体に治療有効量で投与することを含む、SMN全長タンパク質の発現不足、SMN1遺伝子の突然変異や欠失、及び/又はSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する個体の疾患の治療方法に関する。前記個体は、例えば人間などの哺乳動物であってもよい。一実施形態において、前記SMN全長タンパク質の発現不足又はSMN1遺伝子の突然変異に起因する疾患は、例えば脊髄性筋萎縮症を含むことができる。一実施形態において、前記SMN全長タンパク質の発現不足、SMN1遺伝子の突然変異や欠失、又は/及びSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患は、脊髄性筋萎縮症である。一実施形態において、本発明に記載の脊髄性筋萎縮症は、SMA I型、SMA II型、SMA III型、及びSMA IV型を含む。
本発明の他側面は、本発明の小分子活性化核酸分子、本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は、本発明の小分子活性化核酸分子又は本発明に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む組成物の、SMN全長タンパク質の発現不足、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の表現不足、又は/及びSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患又は状況を治療するための薬品の製造での応用に関する。前記個体は、例えば人間などの哺乳動物であってもよい。一実施形態において、前記SMN全長タンパク質の発現不足、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の表現不足、又は/及びSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患は、例えば脊髄性筋萎縮症を含むことができる。一実施形態において、前記SMN全長タンパク質の発現不足、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の表現不足、又は/及びSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患は、脊髄性筋萎縮症である。一実施形態において、本発明に記載の脊髄性筋萎縮症は、SMA I型、SMA II型、SMA III型、及びSMA IV型を含む。
本発明によれば、SMN2遺伝子の発現を効率的かつ特異的にアップレギュレーション可能であるとともに、全長SMN2 mRNAの表現量を増加させることができ、かつ、毒性・副作用が低く、SMN全長タンパク質の発現不足に関する病症、SMN1遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び/又はSMN2全長タンパク質の発現不足に起因する疾患又は状況を治療するための薬品の製造に用いることができる、SMN2遺伝子の発現を活性化/アップレギュレーションする例えば小分子活性化RNA（saRNA）分子などの小分子活性化核酸分子を提供することができる。
本発明では、関連用語は、以下のように定義される。
本明細書で使用される「相補」という用語は、2本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド同士が水素結合により形成されるものである。相補的オリゴヌクレオチド鎖は、Watson-Crick方式で塩基対合してもよく（例えば、A-T、A-U、C-G）、又は、二本鎖体の形成を許可するいずれの方式（例えば、Hoogsteen型又は逆Hoogsteen型塩基対合）で塩基対合してもよい。
相補は、完全相補及び不完全相補の2種類を含む。完全相補又は100％相補は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域における第1オリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドが第2オリゴヌクレオチド鎖の対応する位置のヌクレオチドと「ミスマッチ」無しに水素結合を形成できることを意味する。不完全相補とは、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合することができないことを意味する。例えば、二本鎖領域の長さが20のヌクレオチドである2本のオリゴヌクレオチド鎖に対しては、各鎖における2つの塩基対のみが互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は10％の相補性を有する。同じ実施例では、各鎖における18個の塩基対が互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は90％の相補性を有する。「実質的に相補」とは、少なくとも約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%又は99%の相補性を有することを意味する。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語とは、ヌクレオチドのポリマーをいい、DNA、RNA、又はDNA／RNAハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子、規則的や不規則的に交互するデオキシリボース部分及びリボース部分を含むオリゴヌクレオチド鎖、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾及び天然又は非天然に存在する骨格を含むが、これらに限定されるものではない。本発明に記載の標的遺伝子転写を活性化させるためのオリゴヌクレオチドは、小分子活性化核酸分子である。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」及び「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、35個以下の塩基を有する短鎖のヌクレオチドの総称である（デオキシリボ核酸DNA又はリボ核酸RNA内のヌクレオチドを含む）。本発明において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、１６～３５個のヌクレオチドのいずれかの長さであってもよい。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、1本のポリペプチド鎖のコード又は1本の機能RNAの転写に必要な全てのヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、宿主細胞に対して内因性、あるいは完全又は部分的に組換えられた遺伝子であってもよい（例えば、コーディングプロモーターを導入した外因性オリゴヌクレオチド及びコード配列、又は内因性コード配列に隣接する異種プロモーターを宿主細胞に導入したもの）。例えば、「遺伝子」は、エクソン及びイントロンで構成される核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンとの間のオープンリーディングフレームにおけるエクソンに含まれる配列であり、本発明では、「遺伝子」は、他の遺伝子がコード配列又は非コード配列を含むか否かを問わず、例えばプロモーター、エンハンサーなどのような遺伝子制御配列及び本分野で知られている他の遺伝子の転写、発現又は活性を制御する他の全ての配列を含むことができる。1つの場合、例えば、「遺伝子」は、例えばプロモーターやエンハンサーなどの制御配列を含む機能性核酸の説明に用いることができる。組換え遺伝子の発現は、一種又は多種の異種制御配列により制御することができる。
本明細書で用いられる「標的遺伝子」は、生体内に天然に存在する核酸配列、組換え遺伝子、ウイルス又は細菌配列、染色体又は染色体外及び/又は細胞及び/又はその染色質を一時的又は安定的にトランスフェクション又は混入したものである。標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってもよいし、非タンパク質コード遺伝子であってもよい（例えば、マイクロRNA遺伝子、長鎖非コードRNA遺伝子）。標的遺伝子は、通常、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも言われる）を有する小分子活性化核酸分子を設計することにより、標的遺伝子に対する正調節を実現することができ、標的遺伝子の発現のアップレギュレーションとして表現される。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を意味し、本発明において「標的遺伝子プロモーター配列と相補する」における標的遺伝子プロモーター配列とは、当該配列のコード鎖（非鋳型鎖とも言われる）、すなわち、当該遺伝子コード配列と同一の核酸配列である。「標的配列」は、標的遺伝子プロモーター配列のうちの小分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同又は相補的な配列断片を意味する。
本明細書で使用される「センス鎖」及び「センスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化核酸分子の二本鎖体のうちの標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖と同一性を有する第1核酸鎖を意味する。
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化核酸分子の二本鎖体のうちのセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補的な第2核酸鎖を意味する。
本明細書で使用される「コード鎖」は、標的遺伝子における転写が不可能な1本のDNA鎖を指し、該鎖のヌクレオチド配列は、転写により生成されたRNAの配列と一致する（RNAではUでDNAにおけるTを置換した）。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列のコード鎖は、標的遺伝子DNAコード鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「鋳型鎖」とは、標的遺伝子の二本鎖DNAのうちコード鎖に相補的な他本の鎖であって、鋳型としてRNAに転写可能な鎖を意味し、当該鎖は、転写したRNA塩基と相補的なものである（A-U、G-C）。転写過程において、RNAポリメラーゼは、鋳型鎖に結合し、鋳型鎖の3'→5'方向に沿って移動し、5'→3'方向に従ってRNAの合成を触媒する。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列の鋳型鎖は、標的遺伝子DNA鋳型鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「プロモーター」とは、タンパク質コード又はRNAコード核酸配列と位置的に関連付けることによりそれらの転写に対して調節作用を果たす配列である。通常、真核遺伝子プロモーターは、１００～５，０００個の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」を限定する趣旨ではない。プロモーター配列は、一般的にタンパク質コード又はRNAコード配列の5'末端に位置するが、エクソン及びイントロン配列にも存在する。
本明細書で使用される「転写開始部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖に転写開始を標識するためのヌクレオチドを意味する。転写開始部位は、プロモーター領域の鋳型鎖に出現することができる。1つの遺伝子は、1つ以上の転写開始部位を有することができる。
本明細書で使用される「同一性」又は「相同性」という用語は、小分子活性化RNAのうちの1本のオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖）が標的遺伝子のプロモーター配列のある領域のコード鎖又は鋳型鎖と類似性を有することを意味する。ここで、本明細書では、「同一性」又は「相同性」は、少なくとも約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%又は99%であってもよい。
本明細書で使用される「突出」、「overhang」、「垂下」は、互いに置き換えることができ、オリゴヌクレオチド鎖の末端（5'又は3'）における塩基対合しないヌクレオチドであり、二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの1本の鎖からはみ出した他の鎖で産生されるものである。二本鎖体の3'及び/又は5'末端からはみ出した一本鎖領域は、「突出」と称される。
本明細書で使用される「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」、「遺伝子のアップレギュレーション」又は「アップレギュレーションされた遺伝子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子転写レベル、ｍRNAレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、染色質状態又は形態、翻訳レベル、又はそれらの細胞又は生物システムにおける活性又は状態を測定することにより、ある核酸の転写、翻訳又は発現、あるいは活性の増加を測定することを意味する。これらの活動又は状態は、直接的又は間接的に測定することができる。また、「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」、「遺伝子のアップレギュレーション」、「アップレギュレーションされた遺伝子」は、このような活性化のメカニズムによらず、核酸配列に相関する活性が増加したことを意味し、例えば、調節配列として調節作用を発揮したり、RNAに転写されたり、タンパク質に翻訳されてタンパク質の発現を増加したりする。
本明細書で使用される「小分子活性化RNA」、「saRNA」、「小分子活性化核酸分子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子発現を促進できる核酸分子であり、標的遺伝子の非コード核酸配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第1核酸断片（アンチセンス鎖やアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい）、及び第1核酸断片と相補的なヌクレオチド配列を含む第2核酸断片（センス鎖、センスストランドやセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい）からなる。そのうち、前記第1核酸断片と第2核酸断片により二本鎖体が形成される。小分子活性化核酸分子は、合成され又はベクターで発現されるとともに二本鎖領域のヘアピン構造を形成できる一本鎖RNA分子で構成されてもよい。そのうち、第1領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、第２領域に含まれるヌクレオチド配列は、第１領域と相補的なものである。小分子活性化核酸分子の二本鎖体領域の長さは、通常は約１０個～約５０個の塩基対、約１２個～約４８個の塩基対、約１４個～約４６個の塩基対、約１６個～約４４個の塩基対、約１８個～約４２個の塩基対、約２０個～約４０個の塩基対、約２２個～約３８個の塩基対、約２４個～約３６個の塩基対、約２６個～約３４個の塩基対、約２８個～約３２個の塩基対であり、通常、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個の塩基対である。また、「ｓａＲＮＡ」、「小分子活性化RNA」、「小分子活性化核酸分子」には、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含まれ、修飾されたヌクレオチド又はその類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。
本明細書で使用される「ホットスポット」という用語は、長さが少なくとも30ｂｐである遺伝子プロモーター領域を意味する。これらの領域では、機能性小分子活性化核酸分子標的の凝集が現われ、即ち、これらのホットスポット領域を標的とする小分子活性化核酸分子の少なくとも30%は、標的遺伝子mRNAの発現が1.2倍以上になるまで誘導することができる。
本明細書で使用される「合成」とは、オリゴヌクレオチドの合成方式を意味し、例えば化学合成、人体外転写、ベクター表現などのRNAを合成可能な任意の方式が含まれる。
本発明は、RNA活性化によりSMN2遺伝子の発現をアップレギュレーションし、全長SMNタンパク質の発現量を増加させることにより、関連疾患、特に脊髄型筋萎縮症を治療する。本発明では、SMN2遺伝子を標的遺伝子と言うこともある。
本発明が提供する小分子活性化核酸分子の製造方法は、配列設計と配列合成を含む。
前記小分子活性化核酸分子配列の合成は、化学合成の方法を採用してもよく、核酸合成を専門事業とするバイオテクノロジー会社に依頼してもよい。
一般的に、前記化学合成の方法は、（1）オリゴリボヌクレオチドの合成ステップ、（2）脱保護ステップ、（3）精製分離ステップ、（4）脱塩及びアニールステップ、を備える。
前記小分子活性化核酸分子配列の合成は、化学合成の方法を採用してもよく、核酸合成を専門事業とするバイオテクノロジー会社に依頼してもよい。
一般的に、前記化学合成の方法は、（1）オリゴリボヌクレオチドの合成ステップ、（2）脱保護ステップ、（3）精製分離ステップ、（4）脱塩及びアニールステップ、を備える。
例えば、本発明にかかるsaRNAの化学合成の具体的なステップは下記の通りである。
（1）オリゴリボヌクレオチドの合成
自動DNA／RNA合成機（例えば、Applied Biosystems EXPEDITE8909）にて1ミクロモルRNAの合成を設置するとともに、1サイクルのカップリングタイムを10～15分間に設定する。固相連結の5'‐O‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、1回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、ｎ回目（19≧n≧2）のサイクルでn‐1回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
（1）オリゴリボヌクレオチドの合成
自動DNA／RNA合成機（例えば、Applied Biosystems EXPEDITE8909）にて1ミクロモルRNAの合成を設置するとともに、1サイクルのカップリングタイムを10～15分間に設定する。固相連結の5'‐O‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、1回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、ｎ回目（19≧n≧2）のサイクルでn‐1回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
（2）脱保護
saRNAに連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール／アンモニア水溶液（体積比1：3）を1mL入れた後に、栓をした状態で25‐70℃のインキュベータに置き、2‐30時間インキュベーションする。saRNAの固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を2回溶出して（1回1mL）ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で1‐12時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（1M）を1mL入れて、室温で4‐12時間静置し、更にn－ブタノールを2mL入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、saRNA一本鎖の粗産物を得た。
saRNAに連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール／アンモニア水溶液（体積比1：3）を1mL入れた後に、栓をした状態で25‐70℃のインキュベータに置き、2‐30時間インキュベーションする。saRNAの固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を2回溶出して（1回1mL）ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で1‐12時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（1M）を1mL入れて、室温で4‐12時間静置し、更にn－ブタノールを2mL入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、saRNA一本鎖の粗産物を得た。
（3）精製分離
取得したsaRNAの粗産物を1モル／mL濃度の2mL酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフ逆相C18カラムにて分離して、精製したsaRNA一本鎖産物を得た。
取得したsaRNAの粗産物を1モル／mL濃度の2mL酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフ逆相C18カラムにて分離して、精製したsaRNA一本鎖産物を得た。
（4）脱塩及びアニール
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で1‐2mLの緩衝液（10mM Tris，pH＝7．5‐8．0、50mM NaCl）に混ぜる。この溶液を95℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、saRNAが含む溶液を得た。
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で1‐2mLの緩衝液（10mM Tris，pH＝7．5‐8．0、50mM NaCl）に混ぜる。この溶液を95℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、saRNAが含む溶液を得た。
本研究により、上記のsaRNAを細胞に導入した後、全長SMN2 mRNA及びタンパク質の発現を効果的に向上させることができることを見出した。
以下、具体的な実施例及び図面を参照しながら、本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例において具体的な条件を明記していない実験方法は、通常の条件、例えばSambrookら、分子クローン：実験室マニュアル（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）に記載の条件や、メーカーが提案する条件に従って行う。
実施例1 SMN2プロモーターを標的とする小分子活性化核酸分子の設計及び合成
UCSCゲノムデータベース（genome.ucsc.edu）からSMN2遺伝子の転写開始点（TSS）から上流-2000bpまでのセンスプロモーター配列を取得する。
UCSCゲノムデータベース（genome.ucsc.edu）からSMN2遺伝子の転写開始点（TSS）から上流-2000bpまでのセンスプロモーター配列を取得する。
SMN2遺伝子の発現を活性化可能な機能性小分子活性化RNA（saRNA）をスクリーニングするために、長さが2000bpのSMN2のプロモーター配列をテンプレートとし（図1）、TSSより上流の－2000bpから大きさが19bpの標的を選択し、1bpずつ移動することでTSSサイトへ移動し、合計で1982個の標的配列を得た。その後、標的配列をフィルタリング処理し、1）GC含有量が35％～65％の間であり、2）5個以上の連続的に同一のヌクレオチドを含まなく、3）3個より多いジヌクレオチド反復配列を含まなく、4）3個より多いトリヌクレオチド反復配列を含まないことを基準として標的配列を保留する。フィルタリング後、残りの980個の標的配列は候補としてスクリーニングプロセスに移行した。これらの候補配列により、対応する二本鎖小分子活性化RNAを化学合成した。そのうち、当該実験で使用される二本鎖小分子活性化RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さが共に21個のヌクレオチドであり、前記二本鎖saRNAの第1リボ核酸鎖（センス鎖）の5'領域の19個のヌクレオチドがプロモーターの標的配列と100％の同一性を有し、その3'末端がｄＴｄＴ配列を含む。第2リボ核酸鎖の5'領域の19個のヌクレオチドが第1リボ核酸鎖の配列と相補し、その3'末端がｄＴｄＴ配列を含む。前記二本鎖saRNAの2本の鎖を同量のモル数で混合し、アニーリング後に二本鎖saRNAを形成した。
実施例2 SMN2プロモーターを標的とするsaRNAのハイスループットスクリーニング
（1）細胞培養及びトランスフェクション
ヒト胚性腎細胞系HEK293T（ATCC（登録商標） CRL-3216TM）をDMEM培地（Gibco）で培養した。全ての培地はいずれも10%ウシ胎児血清（Greco）及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Greco）を含有する。細胞を5%CO2、37℃の条件で培養した。HEK293T細胞を1ウェルあたり5,000個の細胞で96ウェルプレートに接種し、ウェル毎に0.3μl RNAiMAX（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて10nMの最終濃度（特別に説明がある場合を除き）で1つのsaRNAをHEK293T細胞に逆トランスフェクションし、トランスフェクションは72時間を持続する。対照処理は、ブランク対照（Mock）、非特異的オリゴヌクレオチド2本鎖体（dsCon2、センス鎖5'-ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]-3' （SEQ ID NO：472）、アンチセンス鎖5'- UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：473））、SMN2小干渉RNA（siMSN2-1、センス鎖5'-GGGAUGAUACAGCACUGAU[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：474）、アンチセンス鎖5'AUCAGUGCUGUAUCAUCCC[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：475））を含み、そのうち、ブランク対照（Mock）処理は、核酸を省略するトランスフェクション処理である。
（1）細胞培養及びトランスフェクション
ヒト胚性腎細胞系HEK293T（ATCC（登録商標） CRL-3216TM）をDMEM培地（Gibco）で培養した。全ての培地はいずれも10%ウシ胎児血清（Greco）及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Greco）を含有する。細胞を5%CO2、37℃の条件で培養した。HEK293T細胞を1ウェルあたり5,000個の細胞で96ウェルプレートに接種し、ウェル毎に0.3μl RNAiMAX（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて10nMの最終濃度（特別に説明がある場合を除き）で1つのsaRNAをHEK293T細胞に逆トランスフェクションし、トランスフェクションは72時間を持続する。対照処理は、ブランク対照（Mock）、非特異的オリゴヌクレオチド2本鎖体（dsCon2、センス鎖5'-ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]-3' （SEQ ID NO：472）、アンチセンス鎖5'- UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：473））、SMN2小干渉RNA（siMSN2-1、センス鎖5'-GGGAUGAUACAGCACUGAU[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：474）、アンチセンス鎖5'AUCAGUGCUGUAUCAUCCC[dT][dT]-3'（SEQ ID NO：475））を含み、そのうち、ブランク対照（Mock）処理は、核酸を省略するトランスフェクション処理である。
（2）ワンステップ法RT-qPCR
トランスフェクション終了後、培地を廃棄し、1ウェルあたりに150μl PBSを加えて1回洗浄し、PBSを廃棄し、1ウェル当たりに100μl細胞溶解液（Power SYBR（登録商標） Green Cells-to-CtTM Kit，Life Technologies）を加えて、室温で5分間インキュベートした。1ウェル当たり0.5μl細胞溶解液を取って、One Step TB GreenTM PrimeScripTM RT-PCR kit II （Takara, RR086A）及びBravo Automated Liquid Handling Platform （Agilent） を用いてRoche Lightcycler 480にてqPCR解析を行い、試料毎に増幅を3回繰り返し、PCR反応条件を表1に示す。
トランスフェクション終了後、培地を廃棄し、1ウェルあたりに150μl PBSを加えて1回洗浄し、PBSを廃棄し、1ウェル当たりに100μl細胞溶解液（Power SYBR（登録商標） Green Cells-to-CtTM Kit，Life Technologies）を加えて、室温で5分間インキュベートした。1ウェル当たり0.5μl細胞溶解液を取って、One Step TB GreenTM PrimeScripTM RT-PCR kit II （Takara, RR086A）及びBravo Automated Liquid Handling Platform （Agilent） を用いてRoche Lightcycler 480にてqPCR解析を行い、試料毎に増幅を3回繰り返し、PCR反応条件を表1に示す。
反応条件として、段階1逆転写反応は、42℃ 5分間、95℃ 10秒間であり、段階2 PCR反応は、95℃ 5秒、60℃ 20秒であり、45サイクルの増幅を行った。HPRT1及びTBPを内部標準遺伝子とする。SMN、HPRT1及びTBP用のPCRプライマーは、以下の表4に示す。そのうち、SMNは、SMN F1/R1プライマー対で増幅される。
あるsaRNAトランスフェクション試料のSMN2（目的遺伝子）の対照処理（Mock）に対する発現値（Erel）を計算するために、目的遺伝子及び2つの内部参照遺伝子のCt値を式1に代入して算出する。
そのうち、CtTmは、Mock試料に由来する目的遺伝子のCt値、CtTsは、saRNA処理試料に由来する目的遺伝子のCｔ値、CtR1mは、ブランク対照（Mock）処理試料に由来する内部参照遺伝子1のCt値、CtR1sは、saRNA処理試料に由来する内部参照遺伝子1のCt値、CtR2mは、Mock処理試料に由来する内部参照遺伝子2のCt値、CtR2sは、saRNA処理試料に由来する内部参照遺伝子2のCt値である。
（3）機能性saRNAのスクリーニング
SMN2転写を活性化可能なsaRNAを得るために、上記の980個のsaRNAでそれぞれHEK293T細胞を、トランスフェクション濃度が10nMであるようにトランスフェクションし、72時間後に細胞を分解してワンステップ法RTーqPCR解析を行い、各saRNA処理試料のSMN2遺伝子の相対的（ブランク対照（Mock）処理と比較する）発現値を得た。表2に示すように、157個（16.02%）のsaRNAでは活性化され、416個（42.45%）のsaRNAでは活性が抑制され、407個（41.53%）のsaRNAではSMN2の発現に顕著な影響を与えなかった。活性化の最大幅が1.82倍であり、最大抑制幅が0.33倍であった。これらの活性化の活性を有するsaRNAは、機能性小分子活性化核酸分子と呼ばれる。その活性標的配列、センス配列、アンチセンス配列及びSMN相対発現のデータを表3に示す。
SMN2転写を活性化可能なsaRNAを得るために、上記の980個のsaRNAでそれぞれHEK293T細胞を、トランスフェクション濃度が10nMであるようにトランスフェクションし、72時間後に細胞を分解してワンステップ法RTーqPCR解析を行い、各saRNA処理試料のSMN2遺伝子の相対的（ブランク対照（Mock）処理と比較する）発現値を得た。表2に示すように、157個（16.02%）のsaRNAでは活性化され、416個（42.45%）のsaRNAでは活性が抑制され、407個（41.53%）のsaRNAではSMN2の発現に顕著な影響を与えなかった。活性化の最大幅が1.82倍であり、最大抑制幅が0.33倍であった。これらの活性化の活性を有するsaRNAは、機能性小分子活性化核酸分子と呼ばれる。その活性標的配列、センス配列、アンチセンス配列及びSMN相対発現のデータを表3に示す。
図2は、SMN2 saRNAの高度活性化から高度抑制までの活性分布をさらに示している。同時に、980個のsaRNAの活性をSMN2プロモーターにおける位置に従って並んでおり、機能性saRNAの分布が集中し、すなわち、あるプロモーター領域において活性化saRNAが特定の「ホットスポット（hot spot）」領域に集中するという現象が顕著に認められる（図3）。図3に示すように、プロモーターの-1639～-1481の領域（H1）、-1090～-1008の領域（H2）、-994～-180の領域（H3）及び-144～-37の領域（H4）にそれぞれ4つのホットスポット領域が出現し、活性化saRNAが高度に集中すると表現されている。この分析結果から、活性化saRNAがプロモーターにランダムに分布するのではなく、特定のホットスポット領域が存在することが示された。
ホットスポットH1（-1639～-1481）配列（SEQ ID NO：476）：
agtcgcactctgtcactcaggctggagtgcagtggcgtgatcttggctcactgcaacctccgcctcccgagttcaagtgattctcctggctcagcctcccaagcagctgtcattacaggcctgcaccaccacacccggctgatttttgtatttttagga (SEQ ID NO: 476）
agtcgcactctgtcactcaggctggagtgcagtggcgtgatcttggctcactgcaacctccgcctcccgagttcaagtgattctcctggctcagcctcccaagcagctgtcattacaggcctgcaccaccacacccggctgatttttgtatttttagga (SEQ ID NO: 476）
ホットスポットH2（-1090～-1008）配列（SEQ ID NO：477）：
Aatactggaggcccggtgtggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcggtcggattacgaggtcagg (SEQ ID NO: 477）
Aatactggaggcccggtgtggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcggtcggattacgaggtcagg (SEQ ID NO: 477）
ホットスポットH3（-994～-180）配列（SEQ ID NO：478）：
Ctggccaacatggtgaaaccccatctttactaaaaatacaaaaattagccgggtgtggtggtgggcgcctgtaatcccagctactcggggggctgaggcagaattgcttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagctgagatcacgccactgcattccagcctgggtgacagagcaatactctgtcgcaaaaaaaaaaaagaatactggaggctgggcgaggtggctcacacctgtaatcccagcattttgggatgccagaggcgggcggaatatcttgagctcaggagttcgagaccagcctacacaatatgctccaaacgccgcctctacaaaacatacagaaactagccgggtgtggtggcgtgcccctgtggtcctagctacttgggaggttgaggcgggaggatcgcttgagctcgggaggtcgaggctgcaatgagccgagatggtgccactgcactctgacgacagagcgagactccgtctcaaaacaaacaacaaataaggttgggggatcaaatatcttctagtgtttaaggatctgccttccttcctgcccccatgtttgtctttccttgtttgtctttatatagatcaagcaggttttaaattcctagtaggagcttacatttacttttccaagggggagggggaataaatatctacacacacacacacacacacacacacacacacacactggagttcgagacgaggcctaagcaacatgccgaaaccccgtctctactaaatacaaaaaatagctgagcttggtggcgcacgcctatagtcctagctactggggaggctg (SEQ ID NO: 478）
Ctggccaacatggtgaaaccccatctttactaaaaatacaaaaattagccgggtgtggtggtgggcgcctgtaatcccagctactcggggggctgaggcagaattgcttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagctgagatcacgccactgcattccagcctgggtgacagagcaatactctgtcgcaaaaaaaaaaaagaatactggaggctgggcgaggtggctcacacctgtaatcccagcattttgggatgccagaggcgggcggaatatcttgagctcaggagttcgagaccagcctacacaatatgctccaaacgccgcctctacaaaacatacagaaactagccgggtgtggtggcgtgcccctgtggtcctagctacttgggaggttgaggcgggaggatcgcttgagctcgggaggtcgaggctgcaatgagccgagatggtgccactgcactctgacgacagagcgagactccgtctcaaaacaaacaacaaataaggttgggggatcaaatatcttctagtgtttaaggatctgccttccttcctgcccccatgtttgtctttccttgtttgtctttatatagatcaagcaggttttaaattcctagtaggagcttacatttacttttccaagggggagggggaataaatatctacacacacacacacacacacacacacacacacacactggagttcgagacgaggcctaagcaacatgccgaaaccccgtctctactaaatacaaaaaatagctgagcttggtggcgcacgcctatagtcctagctactggggaggctg (SEQ ID NO: 478）
ホットスポットH4（-144～-37）配列（SEQ ID NO：479）：
ctgcagtgagccgagatcgcgccgctgcactccagcctgagcgacagggcgaggctctgtctcaaaacaaacaaacaaaaaaaaaaggaaaggaaatataacacagtg(SEQ ID NO: 479）。
ctgcagtgagccgagatcgcgccgctgcactccagcctgagcgacagggcgaggctctgtctcaaaacaaacaaacaaaaaaaaaaggaaaggaaatataacacagtg(SEQ ID NO: 479）。
実施例3 SMN遺伝子を活性化可能な機能性saRNAのさらなるスクリーニングと検証
SMN遺伝子を活性化可能な機能性saRNAをさらにスクリーニング及び検証するために、ハイスループットスクリーニング結果に基づいて、157個の活性化の活性を有するsaRNAから50個のsaRNAをランダムに選択して、HEK293T、HS27及びNHDF細胞においてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を検証した。表5に示すsaRNA（n=50、最終濃度20nM）でそれぞれHEK293T細胞、HS27細胞及びNHDF細胞をトランスフェクションし、細胞培養は実施例2に記載のように行った。72時間後に細胞を収集してQiagen RNeasyキットでRNAを抽出し、逆転写後に7500FASTリアルタイムPCRシステムでSMNに対してqPCR増幅を行い、同時にHPRT1及びTBP遺伝子を増幅してその幾何平均値を内部標準とする。図4は、HEK293TにおいてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を示し、表5は、HS27及びNHDF細胞においてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を示す。これらの結果から、検証するsaRNAは、異なる細胞においてSMN遺伝子の発現を異なる程度で活性化させ、最高で19倍活性化させたことが分かった。
SMN遺伝子を活性化可能な機能性saRNAをさらにスクリーニング及び検証するために、ハイスループットスクリーニング結果に基づいて、157個の活性化の活性を有するsaRNAから50個のsaRNAをランダムに選択して、HEK293T、HS27及びNHDF細胞においてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を検証した。表5に示すsaRNA（n=50、最終濃度20nM）でそれぞれHEK293T細胞、HS27細胞及びNHDF細胞をトランスフェクションし、細胞培養は実施例2に記載のように行った。72時間後に細胞を収集してQiagen RNeasyキットでRNAを抽出し、逆転写後に7500FASTリアルタイムPCRシステムでSMNに対してqPCR増幅を行い、同時にHPRT1及びTBP遺伝子を増幅してその幾何平均値を内部標準とする。図4は、HEK293TにおいてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を示し、表5は、HS27及びNHDF細胞においてSMN遺伝子の発現に対するsaRNAの活性化効果を示す。これらの結果から、検証するsaRNAは、異なる細胞においてSMN遺伝子の発現を異なる程度で活性化させ、最高で19倍活性化させたことが分かった。
実施例4 RT-PCR及び酵素切断法によるSMN2の発現の検出
SMN2遺伝子とSMN1遺伝子とが高く類似するので、上記のRTーqPCRプライマーは、SMN2とSMN1のmRNA配列を十分に区別することができない。saRNA処理後のSMN2 mRNAの発現の変化、及びSMN2のエクソン7がmRNA前駆体を成熟mRNAにスプライシングする過程で切断されたか否かをを特異的に検出するために、プライマー対SMN-exon6-F及びSMN-exon8-RでsaRNA処理細胞からのcDNAを増幅し、その後、DdeI酵素でPCR産物を消化し、消化産物に対してゲル電気泳動を行った後にストリップの輝度の特定によりSMN2遺伝子の全長及びエクソン7欠失（SMN2Δ7）のmRNA発現レベルを判断した。具体的な方法としては、HEK293T細胞を２～３×105細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種し、オリゴヌクレオチド2本鎖体saRNAを10nMの最終濃度で逆トランスフェクションした。RNeasy Plus Miniキット（Qiagen）を用いて、その取扱説明書に従って細胞全RNAを抽出した。gDNA Eraser（Takara，Shlga、日本）を含むPrimeScript RTキットを用いてRNA（1μg）をcDNAに逆転写し、RTーPCRプライマーとしてSMN-exon6-F及びSMN-exon8-Rを使用した。Takara（RR010A）試薬を用いて、得られたcDNAに対して常軌PCR増幅を行い、反応条件として98℃ 10秒、60℃ 15秒、72℃ 32秒で28サイクル増幅し、具体的には、表6に示す。PCR終了後、PCR産物をDdeIで切断してSMN1とSMN2を区別し、その後、切断産物を2.5％アガロースゲル電気泳動で分離し、各PCR産物又は切断消化ストリップの強度をImage Lab（BIO-RAD，Chemistry Doctm MP結像システム）で解析し、Takara 100 bp DNAラダーストリップ（3407A）の500bpストリップ（５μｌロード量含有～１５０ ｎｇ ＤＮＡ）を参照標準とし、ブランク対照（Mock）で正規化を行い、切断システムと条件を表7に示す。HPRT1を内部参照遺伝子とし、表4に示すプライマー配列を使用した。
SMN2遺伝子とSMN1遺伝子とが高く類似するので、上記のRTーqPCRプライマーは、SMN2とSMN1のmRNA配列を十分に区別することができない。saRNA処理後のSMN2 mRNAの発現の変化、及びSMN2のエクソン7がmRNA前駆体を成熟mRNAにスプライシングする過程で切断されたか否かをを特異的に検出するために、プライマー対SMN-exon6-F及びSMN-exon8-RでsaRNA処理細胞からのcDNAを増幅し、その後、DdeI酵素でPCR産物を消化し、消化産物に対してゲル電気泳動を行った後にストリップの輝度の特定によりSMN2遺伝子の全長及びエクソン7欠失（SMN2Δ7）のmRNA発現レベルを判断した。具体的な方法としては、HEK293T細胞を２～３×105細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種し、オリゴヌクレオチド2本鎖体saRNAを10nMの最終濃度で逆トランスフェクションした。RNeasy Plus Miniキット（Qiagen）を用いて、その取扱説明書に従って細胞全RNAを抽出した。gDNA Eraser（Takara，Shlga、日本）を含むPrimeScript RTキットを用いてRNA（1μg）をcDNAに逆転写し、RTーPCRプライマーとしてSMN-exon6-F及びSMN-exon8-Rを使用した。Takara（RR010A）試薬を用いて、得られたcDNAに対して常軌PCR増幅を行い、反応条件として98℃ 10秒、60℃ 15秒、72℃ 32秒で28サイクル増幅し、具体的には、表6に示す。PCR終了後、PCR産物をDdeIで切断してSMN1とSMN2を区別し、その後、切断産物を2.5％アガロースゲル電気泳動で分離し、各PCR産物又は切断消化ストリップの強度をImage Lab（BIO-RAD，Chemistry Doctm MP結像システム）で解析し、Takara 100 bp DNAラダーストリップ（3407A）の500bpストリップ（５μｌロード量含有～１５０ ｎｇ ＤＮＡ）を参照標準とし、ブランク対照（Mock）で正規化を行い、切断システムと条件を表7に示す。HPRT1を内部参照遺伝子とし、表4に示すプライマー配列を使用した。
本実施例に用いられるSMN2過剰発現ベクターの構築及びトランスフェクションプロセスは、以下のとおりである。
HEK293T細胞から細胞全RNAを抽出し、OligodTプライマーで逆転写してcDNAを得、PCRクローニングプライマーcSMN2-F2（TAAGCA GGATCC ATG GCG ATG AGC AGC GGC GGC （SEQ ID NO：490））及びcSMN2-R2（TAAGCA GAATTC TTA ATT TAA GGA ATG TGA GCA （SEQ ID NO：491））を用いてSMN2全長ORFを増幅してPCR産物を得た。産物をBamHIとEcoRI酵素で消化した。同様の酵素でpcDNA3.1プラスミド（Invitrogen）を消化した。T4リガーゼで消化したプラスミドとPCR産物とを結合する。結合反応産物でコンピテント細胞DH5αをトランスフェクションし、一晩培養して細胞を増幅した後にQiagen Miniprepキットでプラスミドを抽出した。得られたプラスミド（1μg）をLipofectamine 3000 （Invitrogen）でHEK293Tにトランスフェクションし、72時間後に細胞を収集して全RNAを抽出し、RTーPCR及び酵素切断実験を行った。
図6及び図7Aに示すように、ブランク対照（Mock）及び対照オリゴヌクレオチド2本鎖体（dsCON2）処理（ストリップ51～52）と比較して、全てのsaRNA処理された細胞は、SMN2遺伝子の総mRNA発現量が最高で2.49倍と有意に増加した。同時に、大部分（28個、56%）のsaRNAは、SMN2遺伝子の全長mRNAとエクソン7欠失のmRNA発現との比を増加させた（図6における黒矢印で示す。図7B）。
実施例5 saRNAによるSMN発現の活性化及び全長SMN2 mRNAの増加とタンパク質の発現の線量効果関係の検討
saRNA処理とSMN活性化の線量効果関係を確定するために、2つのsaRNA （RAG6-281及びRAG6-550）を選択して異なる濃度（1nM、10nM、20nM、50nM、100nM）でそれぞれHEK293T細胞をトランスフェクションし、72時間後に細胞を収集してRNA及びタンパクを抽出し、RNA試料を逆転写してcDNAを得た後、それぞれRT-qPCR及び常軌RT-PCR増幅を行った後にDdeI酵素切断分析を行った。タンパク質の試料に対して、SMN特異的抗体でタンパク質ブロット解析を行い、SMNタンパク質の表現レベルを検出した。具体的には、細胞を収集し、細胞溶解液（1× RIPA緩衝液, Cell Signaling Technology （CST），Danvers, MA， USA， #9806））で溶解した。プロテアーゼ阻害剤（Sigma, Lot#126M4015v）を溶解液に添加した。BCA法によりタンパク質試料を定量した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を行い、電気泳動終了後にタンパク質試料を0.45μmのPVDF膜に移した。ブロットをマウスモノクローナル抗SMN（CST，#12976）又はウサギポリクローナル抗α/β-チューブリン（tubulin）抗体（CST，#2148）で検出し、二次抗体として抗マウスIgG，HRP-結合抗体（CST，#7076）又は抗ウサギIgG，HRP-結合抗体（CST, #7074）を用いた。信号をImage Lab膜のスキャンで検出した。
saRNA処理とSMN活性化の線量効果関係を確定するために、2つのsaRNA （RAG6-281及びRAG6-550）を選択して異なる濃度（1nM、10nM、20nM、50nM、100nM）でそれぞれHEK293T細胞をトランスフェクションし、72時間後に細胞を収集してRNA及びタンパクを抽出し、RNA試料を逆転写してcDNAを得た後、それぞれRT-qPCR及び常軌RT-PCR増幅を行った後にDdeI酵素切断分析を行った。タンパク質の試料に対して、SMN特異的抗体でタンパク質ブロット解析を行い、SMNタンパク質の表現レベルを検出した。具体的には、細胞を収集し、細胞溶解液（1× RIPA緩衝液, Cell Signaling Technology （CST），Danvers, MA， USA， #9806））で溶解した。プロテアーゼ阻害剤（Sigma, Lot#126M4015v）を溶解液に添加した。BCA法によりタンパク質試料を定量した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を行い、電気泳動終了後にタンパク質試料を0.45μmのPVDF膜に移した。ブロットをマウスモノクローナル抗SMN（CST，#12976）又はウサギポリクローナル抗α/β-チューブリン（tubulin）抗体（CST，#2148）で検出し、二次抗体として抗マウスIgG，HRP-結合抗体（CST，#7076）又は抗ウサギIgG，HRP-結合抗体（CST, #7074）を用いた。信号をImage Lab膜のスキャンで検出した。
図8Aに示すように、RAG6-281及びRAG6-550は、トランスフェクション濃度が1nMであるとSMN mRNA発現を1.5倍以上と顕著に活性化させることができ、濃度が50nMであると、SMNに対する活性化効果が最高となり、SMN発現をそれぞれ2.38倍及び2.16倍にアップレギュレーションし、濃度が100nMとなると、SMNの発現がさらに増加しなかった。同時に、出願人は、これらのcDNA試料を常軌PCR増幅してDdeI酵素で消化し、消化産物に対してゲル電気泳動を行った。その結果、RAG6ー281及びRAG6ー550はいずれもSMN1及びSMN2のmRNA発現をアップレギュレーションし、RTーqPCRの結果と一致していることが示された。SMN2全長ストリップとSMN2Δ7ストリップとの比率を定量分析した結果、RAG6ー281及びRAG6ー550は、いずれの濃度でもSMN2全長mRNAの発現を顕著に増加させたことが見出された（図8B）。ブランク対照（Mock）処理と比較すると、RAG6-281は、1nM，10nM，20nM，50nM，100nMのトランスフェクション濃度でのSMN2全長mRNAの増加とSMN2Δ7 mRNAの増加との比率がそれぞれ1.9、2.39、2.41、2.39、2.1倍である。一方、RAG6-550は、同じ濃度でのSMN2全長mRNAの増加とSMN2Δ7 mRNAの増加との比率がそれぞれ1. 52、1.99、1.91、2.3、1.7倍である。両者に起因する変化は、トランスフェクション濃度が1nM～50nMの範囲内でいずれも用量依存性を示す（図8B）。さらに、ウェスタンブロッティング解析した結果、SMNタンパク質の発現の変化がSMN RTーqPCRの結果と高く一致し、RAG6ー281及びRAG6ー550はいずれも濃度依存的にSMN全長タンパク質の発現を顕著にアップレギュレーションした（図8C）。しかし、エクソン7が欠失したSMNタンパク質（SMN2Δ7）ストリップを検出できない。その原因として、SMN2Δ7タンパク質が非常に不安定でウエスタンブロット法で検出できないためであり、従来の文献報告の結果と一致（Hua et al, PLoS Biol 2007;5（4）e73）。
実施例6 saRNAによるSMA I型マウスの運動能力の改善効果のin vivo検証
SMA I型マウスモデルの繁殖及び同定
Smn1+/-、SMN2-/-とSmn1-/-、SMN2+/+に由来する遺伝子欠失マウスが交配して新生マウスを繁殖し（北京瑞希珍しい病気遺伝子治療技術研究所より入手）、新生マウスは、ゲノムPCRによりSmn1がホモ接合欠失又はヘテロ接合であるかを同定した。具体的な同定結果を図9に示す。Smn1ホモ接合欠失マウス（SMA I型マウス）の遺伝子型は、Smn1-/-、SMN2+/-である。Smn1ヘテロ接合マウス（正常対照群）の遺伝子型は、Smn1+/-、SMN2+/-である。
SMA I型マウスモデルの繁殖及び同定
Smn1+/-、SMN2-/-とSmn1-/-、SMN2+/+に由来する遺伝子欠失マウスが交配して新生マウスを繁殖し（北京瑞希珍しい病気遺伝子治療技術研究所より入手）、新生マウスは、ゲノムPCRによりSmn1がホモ接合欠失又はヘテロ接合であるかを同定した。具体的な同定結果を図9に示す。Smn1ホモ接合欠失マウス（SMA I型マウス）の遺伝子型は、Smn1-/-、SMN2+/-である。Smn1ヘテロ接合マウス（正常対照群）の遺伝子型は、Smn1+/-、SMN2+/-である。
in vivo jetPEIとHKP封入のオリゴヌクレオチドを調製した。
in vivo jetPEI製剤の調製は、SMN2-saRNA RAG6-539（DS06-0013B）をRNaseフリー水（Invitrogen，2063810）に溶解して5mg/mLの保存溶液とした。DS06-0013B 5μL及び10%グルコース溶液（Polyplus-transfection，G181106）12.5μLを取ってRNaseフリー水3.5μLとゆるやかに均一に混合し、DS06-0013B作動液を調製した。この作動液をin vivo-jetPEI（Polyplus-transfection，26031A1C）4μLに加えて均一に混合し、室温で15分間インキュベートし、最終濃度が1mg/mLとなった。
in vivo jetPEI製剤の調製は、SMN2-saRNA RAG6-539（DS06-0013B）をRNaseフリー水（Invitrogen，2063810）に溶解して5mg/mLの保存溶液とした。DS06-0013B 5μL及び10%グルコース溶液（Polyplus-transfection，G181106）12.5μLを取ってRNaseフリー水3.5μLとゆるやかに均一に混合し、DS06-0013B作動液を調製した。この作動液をin vivo-jetPEI（Polyplus-transfection，26031A1C）4μLに加えて均一に混合し、室温で15分間インキュベートし、最終濃度が1mg/mLとなった。
HKP製剤の調製は、SMN2-saRNA RAG6-538（DS06-0002B）をRNaseフリー水に溶解して4mg/mLの保存溶液を調製した。HKP（蘇州聖諾生物医薬技術有限公司、AKF271/042-79-11）を取ってRNaseフリー水に溶解し、16mg/mLの保存溶液を調製した。HKP保存溶液7.5μLをDS06-0002B保存溶液7.5μLとを速やかに混合し、室温で30分間放置し、最終濃度が2mg/mLとなった。
SMA I型マウス側脳室へのin vivo jetPEIとHKP封入のオリゴヌクレオチドの注射
得られた新生マウスを、正常対照群マウス（Het）、SMA I型対照群マウス（未治療）、invivo jetPEI封入SMN2-saRNA（DS06-0013B，1 mg/mL）群、及びHKP封入SMN2-saRNA（DS06-0002B，2 mg/mL）群の4群に分ける。新生マウスが生まれた後の1日目に側脳室注射（ICV）により投与し、注射体積が5μLであり、具体的な投与経路、注射体積及び投与時点は表8に示される。
得られた新生マウスを、正常対照群マウス（Het）、SMA I型対照群マウス（未治療）、invivo jetPEI封入SMN2-saRNA（DS06-0013B，1 mg/mL）群、及びHKP封入SMN2-saRNA（DS06-0002B，2 mg/mL）群の4群に分ける。新生マウスが生まれた後の1日目に側脳室注射（ICV）により投与し、注射体積が5μLであり、具体的な投与経路、注射体積及び投与時点は表8に示される。
SMA I型マウスの運動能力の検出
投与後の7や8日目にフリップ反射実験によりSMA I型マウスの運動能力を検出した。具体的には、正常な立位姿勢を保持したマウスを完全に反転して放置し、その背部が実験台の上面に接触し、四肢を上にした後、手を離してマウスが正常な姿勢に完全に回復したまでの時間をカウントし始め、時間の記録単位が秒（s）であり、この時間がいわゆる反転反射時間（Righting-reflex time）又は回復時間である。マウスが60秒以内に正常な姿勢に反転することができないと、回復時間＞60秒と記録する。回復時間は、マウスの運動能力を反映し、回復時間が短いほどマウスの運動能力が良く、具体的なマウスの回復時間は表9に示す。
投与後の7や8日目にフリップ反射実験によりSMA I型マウスの運動能力を検出した。具体的には、正常な立位姿勢を保持したマウスを完全に反転して放置し、その背部が実験台の上面に接触し、四肢を上にした後、手を離してマウスが正常な姿勢に完全に回復したまでの時間をカウントし始め、時間の記録単位が秒（s）であり、この時間がいわゆる反転反射時間（Righting-reflex time）又は回復時間である。マウスが60秒以内に正常な姿勢に反転することができないと、回復時間＞60秒と記録する。回復時間は、マウスの運動能力を反映し、回復時間が短いほどマウスの運動能力が良く、具体的なマウスの回復時間は表9に示す。
図10は、SMN2-saRNA投与後のSMA I型マウスの運動能力を示す。表9のマウスの回復時間に示すように、正常対照群マウス（Het）の回復時間はいずれも2秒以内である一方、SMA I型対照群マウス（未治療）の回復時間はいずれも12秒を超え、そのうちの2匹の運動能力が完全に失った（回復時間＞60秒）。RAG6-538（DS06-0002B-H群）及びDS06-0013B（DS06-0013B-J群）で治療した2組、特にDS06-0002B-H群のマウスの回復時間は正常マウスに接近する。SMA I型対照群マウスと比較して、DS06-0002B-H群マウスの回復時間が約10倍短縮し、DS06-0013B-J群マウスの回復時間が2.5倍短縮した（表9、図10）。上記の結果から、SMA2ーsaRNA投与後に、SMA I型マウスの運動能力が著しく改善されていることが示された。これは、saRNAによる治療は、発病時間を遅らせることができることを示唆している。
上記の結果を総合して、出願人は、SMNプロモーターを標的とするsaRNAをハイスループットスクリーニングすることにより、SMN遺伝子の発現を顕著に活性化できるsaRNAを複数発見した。これらのsaRNAは、用量依存的にSMN2遺伝子の発現をアップレギュレーションするだけでなく、細胞内の全長SMN2タンパク質とSMN2Δ7タンパク質の割合を顕著に増加させた。また、生体内実験により、本発明のsaRNAがSMA I型マウスの運動能力を顕著に改善することができることを証明した。これらの結果から、SMN2プロモーターを標的とするsaRNAが転写レベルでSMN2転写を活性化して全長SMNタンパク質の発現を増加させることは、良好な将来性を有するSMA治療ポリシーであることが明確に提示される。
参照文献
1. Kolb SJ, Coffey CS, Yankey JW, Krosschell K, Arnold WD, et al. 2017. Natural history of infantile-onset spinal muscular atrophy. Ann Neurol 82:883-91
2. Sugarman EA, Nagan N, Zhu H, Akmaev VR, Zhou Z, et al. 2012. Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72,400 specimens. Eur J Hum Genet 20:27-32
4. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, Clermont O, Burlet P, et al. 1995. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 80:155-65
5. Lorson CL, Hahnen E, Androphy EJ, Wirth B. 1999. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 96:6307-11
6. Monani UR, Lorson CL, Parsons DW, Prior TW, Androphy EJ, et al. 1999. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet 8:1177-83
7. Hua Y, Sahashi K, Hung G, Rigo F, Passini MA, et al. 2010. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes Dev 24:1634-44
8. Hua Y, Sahashi K, Rigo F, Hung G, Horev G, et al. 2011. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature 478:123-6
9. Naryshkin NA, Weetall M, Dakka A, Narasimhan J, Zhao X, et al. 2014. Motor neuron disease. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science 345:688-93
10. Palacino J, Swalley SE, Song C, Cheung AK, Shu L, et al. 2015. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nat Chem Biol 11:511-7
11. Michelson D, Ciafaloni E, Ashwal S, Lewis E, Narayanaswami P, et al. 2018. Evidence in focus: Nusinersen use in spinal muscular atrophy: Report of the Guideline Development, Dissemination, and Implementation Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology
12. Avila AM, Burnett BG, Taye AA, Gabanella F, Knight MA, et al. 2007. Trichostatin A increases SMN expression and survival in a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest 117:659-71
13. Somers E, Riessland M, Schreml J, Wirth B, Gillingwater TH, Parson SH. 2013. Increasing SMN levels using the histone deacetylase inhibitor SAHA ameliorates defects in skeletal muscle microvasculature in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. Neurosci Lett 544:100-4
14. Swoboda KJ, Scott CB, Crawford TO, Simard LR, Reyna SP, et al. 2010. SMA CARNI-VAL trial part I: double-blind, randomized, placebo-controlled trial of L-carnitine and valproic acid in spinal muscular atrophy. PLoS One 5:e12140
15. Kissel JT, Scott CB, Reyna SP, Crawford TO, Simard LR, et al. 2011. SMA CARNIVAL TRIAL PART II: a prospective, single-armed trial of L-carnitine and valproic acid in ambulatory children with spinal muscular atrophy. PLoS One 6:e21296。
1. Kolb SJ, Coffey CS, Yankey JW, Krosschell K, Arnold WD, et al. 2017. Natural history of infantile-onset spinal muscular atrophy. Ann Neurol 82:883-91
2. Sugarman EA, Nagan N, Zhu H, Akmaev VR, Zhou Z, et al. 2012. Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72,400 specimens. Eur J Hum Genet 20:27-32
5. Lorson CL, Hahnen E, Androphy EJ, Wirth B. 1999. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 96:6307-11
6. Monani UR, Lorson CL, Parsons DW, Prior TW, Androphy EJ, et al. 1999. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet 8:1177-83
7. Hua Y, Sahashi K, Hung G, Rigo F, Passini MA, et al. 2010. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes Dev 24:1634-44
8. Hua Y, Sahashi K, Rigo F, Hung G, Horev G, et al. 2011. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature 478:123-6
9. Naryshkin NA, Weetall M, Dakka A, Narasimhan J, Zhao X, et al. 2014. Motor neuron disease. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science 345:688-93
10. Palacino J, Swalley SE, Song C, Cheung AK, Shu L, et al. 2015. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nat Chem Biol 11:511-7
11. Michelson D, Ciafaloni E, Ashwal S, Lewis E, Narayanaswami P, et al. 2018. Evidence in focus: Nusinersen use in spinal muscular atrophy: Report of the Guideline Development, Dissemination, and Implementation Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology
12. Avila AM, Burnett BG, Taye AA, Gabanella F, Knight MA, et al. 2007. Trichostatin A increases SMN expression and survival in a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest 117:659-71
13. Somers E, Riessland M, Schreml J, Wirth B, Gillingwater TH, Parson SH. 2013. Increasing SMN levels using the histone deacetylase inhibitor SAHA ameliorates defects in skeletal muscle microvasculature in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. Neurosci Lett 544:100-4
14. Swoboda KJ, Scott CB, Crawford TO, Simard LR, Reyna SP, et al. 2010. SMA CARNI-VAL trial part I: double-blind, randomized, placebo-controlled trial of L-carnitine and valproic acid in spinal muscular atrophy. PLoS One 5:e12140
15. Kissel JT, Scott CB, Reyna SP, Crawford TO, Simard LR, et al. 2011. SMA CARNIVAL TRIAL PART II: a prospective, single-armed trial of L-carnitine and valproic acid in ambulatory children with spinal muscular atrophy. PLoS One 6:e21296。
Claims (41)
- その１本の鎖がＳＭＮ２遺伝子のプロモーターにおける転写開始点から－１６３９～－１４８１の領域（配列番号４７６）、－１０９０～－１００８の領域（配列番号４７７）、－９９４～－１８０の領域（配列番号４７８）又は－１４４～－３７（配列番号４７９）のうちのいずれかの長さが１６～３５個のヌクレオチドの連続断片と少なくとも７５％の相同性又は相補性を有する、
ことを特徴とする小分子活性化核酸分子。 - センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖を含み、
前記センス核酸鎖及び前記アンチセンス核酸鎖が相補的領域を含み、
相補的領域は、２本鎖核酸の構造を形成可能であり、
当該２本鎖核酸は、細胞中でのＳＭＮ２遺伝子の発現を活性化させることができる、
ことを特徴とする請求項１に記載の小分子活性化核酸分子。 - 前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖は、２本の異なる核酸鎖に存在する、
ことを特徴とする請求項２に記載の小分子活性化核酸分子。 - 前記センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片は、同一の核酸鎖、好ましくはヘアピン型１本鎖核酸分子に存在し、
センス核酸断片とアンチセンス核酸断片の相補的領域は、２本鎖核酸の構造を形成する、
ことを特徴とする請求項２に記載の小分子活性化核酸分子。 - 少なくとも１本の鎖は、長さが０～６個のヌクレオチドの３’突出端を有する、
ことを特徴とする請求項３に記載の小分子活性化核酸分子。 - ２本の鎖は共に長さが２～３個のヌクレオチドの３’突出端を有する、
ことを特徴とする請求項５に記載の小分子活性化核酸分子。 - センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖の長さがそれぞれ１６～３５個のヌクレオチドである、
ことを特徴とする請求項２～６のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子。 - その１本の鎖が配列番号３１５～４７１から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７５％の相同性又は相補性を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の小分子活性化核酸分子。 - センス鎖が配列番号１～１５７から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７５％の相同性を有するとともに、そのアンチセンス鎖が配列番号１５８～３１４から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７５％の相同性を有する、
ことを特徴とする請求項８に記載の小分子活性化核酸分子。 - センス鎖が配列番号１～１５７から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号１～１５７から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含むとともに、そのアンチセンス鎖が配列番号１５８～３１４から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号１５８～３１４から選択されるいずれか１つのヌクレオチドを含む、
ことを特徴とする請求項９に記載の小分子活性化核酸分子。 - 少なくとも１つのヌクレオチドが化学修飾されたヌクレオチドである、
ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子。 - 前記化学修飾は、以下の（１）～（３）のうちの少なくとも１種である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の小分子活性化核酸分子；
（１）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドと繋がるホスホジエステル結合に対する修飾、
（２）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるリボースの２’－ＯＨに対する修飾、
（３）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における塩基に対する修飾。 - ＳＭＮ２遺伝子の発現を少なくとも１０％活性化／アップレギュレーションする、
ことを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子。 - 請求項１～１０のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸。
- 前記核酸は、ＤＮＡ分子である、
ことを特徴とする請求項１４に記載の核酸。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子、又は請求項１４又は１５に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子又は請求項１４又は１５に記載の核酸と、任意の薬学的に許容されるベクターとを含む組成物。
- 前記薬学的に許容されるベクターが、水性ベクター、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドであり、又はこれらを含む、
ことを特徴とする請求項１７に記載の組成物。 - 前記組成物が、前記小分子活性化核酸分子を１～１５０ｎＭ含有する、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の組成物。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物を、個体に治療有効量で投与することを含む、
ことを特徴とするＳＭＮタンパク質の発現不足、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び／又はＳＭＮ２全長タンパク質の発現不足に起因する個体の疾患又は状況の治療方法。 - 前記疾患又は状況が、遺伝的神経筋疾患を含み、好ましくは脊髄性筋萎縮症である、
ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。 - 前記個体が哺乳動物、好ましくはヒトである、
ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物の、ＳＭＮタンパク質の発現不足、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び／又はＳＭＮ２全長タンパク質の発現不足に起因する個体の疾患又は状況を治療するための医薬品の製造での応用。
- 前記疾患又は状況が、遺伝的神経筋疾患を含み、好ましくは脊髄性筋萎縮症である、
ことを特徴とする請求項２３に記載の応用。 - 前記個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである、
ことを特徴とする請求項２３又は２４に記載の応用。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物の、細胞中でのＳＭＮ２遺伝子の表現を活性化／アップレギュレーションするための製剤の製造での応用。
- 前記小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物が、前記細胞に直接導入される、
ことを特徴とする請求項２６に記載の応用。 - 前記小分子活性化核酸分子は、当該小活性化核酸分子をコードするヌクレオチド配列が前記細胞に導入された後に細胞内で発生したものである、
ことを特徴とする請求項２６に記載の応用。 - 前記細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、
ことを特徴とする請求項２６～２８のいずれか１項に記載の応用。 - 前記細胞が人体に存在する、
ことを特徴とする請求項２９に記載の応用。 - 前記人体は、ＳＭＮタンパク質の発現不足、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び／又はＳＭＮ２全長タンパク質の発現不足に起因する症状を有する患者であり、
前記小分子活性化核酸分子、前記核酸又は前記組成物は、前記症状の治療に十分な量で投与される、
ことを特徴とする請求項３０に記載の応用。 - 前記ＳＭＮ全長タンパク質の発現不足に起因する症状は、遺伝的神経筋疾患を含み、好ましくは脊髄性筋萎縮症である、
ことを特徴とする請求項３１に記載の応用。 - 配列番号４７６～４７９から選択されるいずれか１つの配列における任意の連続的な１６～３５個のヌクレオチド配列である、
単離したＳＭＮ２遺伝子の小分子活性化核酸分子の標的部位。 - 前記標的部位が、配列番号３１５～４７１から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列に示すものである、
ことを特徴とする請求項３３に記載の小分子活性化核酸分子標的部位。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物を細胞に投与することを含む、
細胞内でのＳＭＮ２遺伝子の発現を活性化／アップレギュレーションする方法。 - 前記小分子活性化核酸分子、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸、又は、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物が、前記細胞に直接導入される、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 - 前記小分子活性化核酸分子は、当該小活性化核酸分子をコードするヌクレオチド配列が前記細胞に導入された後に細胞内で発生したものである、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 - 前記細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、
ことを特徴とする請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。 - 前記細胞が人体に存在する、
ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。 - 前記人体は、ＳＭＮ全長タンパク質の発現不足、ＳＭＮ１遺伝子の突然変異や欠失又は全長タンパク質の発現不足、及び／又はＳＭＮ２全長タンパク質の発現不足に起因する症状を有する患者であり、
前記小分子活性化核酸分子、前記核酸又は前記組成物は、前記症状の治療に十分な量で投与される、
ことを特徴とする請求項３９に記載の方法。 - 前記ＳＭＮ全長タンパク質の発現不足に起因する症状は、遺伝的神経筋疾患を含み、好ましくは脊髄性筋萎縮症である、
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811634268.5 | 2018-12-29 | ||
| CN201811634268 | 2018-12-29 | ||
| PCT/CN2019/129025 WO2020135677A1 (zh) | 2018-12-29 | 2019-12-27 | 寡聚核酸分子及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022515881A true JP2022515881A (ja) | 2022-02-22 |
Family
ID=71125998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021538368A Pending JP2022515881A (ja) | 2018-12-29 | 2019-12-27 | オリゴ核酸分子及びその応用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220064642A1 (ja) |
| EP (1) | EP3904517A4 (ja) |
| JP (1) | JP2022515881A (ja) |
| KR (1) | KR20210110310A (ja) |
| CN (1) | CN112996913B (ja) |
| AU (1) | AU2019414608A1 (ja) |
| BR (1) | BR112021012422A2 (ja) |
| CA (1) | CA3120534A1 (ja) |
| IL (1) | IL284333A (ja) |
| MX (1) | MX2021007932A (ja) |
| PE (1) | PE20212248A1 (ja) |
| SG (1) | SG11202106327QA (ja) |
| WO (1) | WO2020135677A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20230287416A1 (en) * | 2020-07-31 | 2023-09-14 | Ractigen Therapeutics | Combinatory treatment of sma with sarna and mrna modulators |
| CN112779252B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-05-26 | 首都儿科研究所 | 靶向SMN2启动子区MeCP2结合的关键甲基化区域的反义寡核苷酸 |
| CN117377764A (zh) * | 2021-02-08 | 2024-01-09 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 多价寡核苷酸试剂及其使用方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006005042A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Cemines, Inc. | Methods and compositions for the diagnosis,prognosis,and treatment of cancer |
| US7838657B2 (en) * | 2004-12-03 | 2010-11-23 | University Of Massachusetts | Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences |
| CN1904900A (zh) * | 2005-07-28 | 2007-01-31 | 中国科学院生物物理研究所 | 人类的内源性siRNA序列及其应用和筛选方法 |
| US20080187512A1 (en) * | 2007-02-07 | 2008-08-07 | Academia Sinica | Treatment for spinal muscular atrophy |
| JP2015518714A (ja) * | 2012-05-16 | 2015-07-06 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法 |
| JP2016534035A (ja) * | 2013-10-04 | 2016-11-04 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 筋萎縮性側索硬化症を治療するための組成物及び方法 |
| CN104630219B (zh) * | 2013-11-15 | 2019-05-07 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 抑癌基因IRX1的saRNA分子及其组合物和其应用 |
| CN106032532A (zh) * | 2015-03-17 | 2016-10-19 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
| EP3286318A2 (en) * | 2015-04-22 | 2018-02-28 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
| WO2017075030A1 (en) * | 2015-10-26 | 2017-05-04 | Rana Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for increasing smn expression |
| WO2017087486A1 (en) * | 2015-11-16 | 2017-05-26 | Ohio State Innovation Foundation | Methods and compositions for treating disorders and diseases using survival motor neuron (smn) protein |
| US9669109B1 (en) * | 2015-11-24 | 2017-06-06 | Universita Di Ferrara | Modified human U1snRNA molecule, a gene encoding for the modified human U1snRNA molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy of familial dysautonomia and spinal muscular atrophy |
| WO2017218884A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Combinations for the modulation of smn expression |
| WO2018017991A1 (en) * | 2016-07-21 | 2018-01-25 | The General Hospital Corporation | Extracellular mrna markers of muscular dystrophies in human urine |
-
2019
- 2019-12-27 US US17/419,569 patent/US20220064642A1/en active Pending
- 2019-12-27 CA CA3120534A patent/CA3120534A1/en active Pending
- 2019-12-27 EP EP19906151.6A patent/EP3904517A4/en active Pending
- 2019-12-27 PE PE2021001108A patent/PE20212248A1/es unknown
- 2019-12-27 KR KR1020217020377A patent/KR20210110310A/ko unknown
- 2019-12-27 CN CN201980076095.6A patent/CN112996913B/zh active Active
- 2019-12-27 WO PCT/CN2019/129025 patent/WO2020135677A1/zh active Application Filing
- 2019-12-27 AU AU2019414608A patent/AU2019414608A1/en not_active Abandoned
- 2019-12-27 BR BR112021012422-5A patent/BR112021012422A2/pt unknown
- 2019-12-27 MX MX2021007932A patent/MX2021007932A/es unknown
- 2019-12-27 SG SG11202106327QA patent/SG11202106327QA/en unknown
- 2019-12-27 JP JP2021538368A patent/JP2022515881A/ja active Pending
-
2021
- 2021-06-23 IL IL284333A patent/IL284333A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112996913B (zh) | 2022-01-04 |
| US20220064642A1 (en) | 2022-03-03 |
| EP3904517A1 (en) | 2021-11-03 |
| BR112021012422A2 (pt) | 2021-10-26 |
| IL284333A (en) | 2021-08-31 |
| WO2020135677A1 (zh) | 2020-07-02 |
| SG11202106327QA (en) | 2021-07-29 |
| KR20210110310A (ko) | 2021-09-07 |
| EP3904517A4 (en) | 2022-12-28 |
| CA3120534A1 (en) | 2020-07-02 |
| AU2019414608A1 (en) | 2021-07-22 |
| PE20212248A1 (es) | 2021-11-24 |
| MX2021007932A (es) | 2021-08-16 |
| CN112996913A (zh) | 2021-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022519019A (ja) | オリゴヌクレオチド組成物及びその方法 | |
| JP2021513861A (ja) | Ｃａｍｋ２ｄアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 | |
| JP2022515881A (ja) | オリゴ核酸分子及びその応用 | |
| TWI430812B (zh) | 調控細胞中ｃａｇ擴張基因之基因產物與其聚集的方法及其應用 | |
| JP2018088888A (ja) | Ｓｃｎ１ａ遺伝子の発現増強法 | |
| JP7032140B2 (ja) | 嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物 | |
| CN113260702B (zh) | 寡聚核酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用 | |
| JP2024515344A (ja) | 補体成分３の発現を阻害するための組成物及び方法 | |
| US20230235332A1 (en) | Treatment of neurological diseases using modulators of gene transcripts | |
| JP6478416B2 (ja) | 慢性腎臓病治療用医薬組成物 | |
| WO2021000928A1 (zh) | 激活atoh1基因的寡聚核酸分子及其应用 | |
| CN112779252B (zh) | 靶向SMN2启动子区MeCP2结合的关键甲基化区域的反义寡核苷酸 | |
| WO2020155534A1 (zh) | 寡核苷酸分子及其在肿瘤治疗中的应用 | |
| Chen et al. | FTO Regulates Microglia-Induced Inflammation by Stabilizing ADAM17 Expression After Experimental Traumatic Brain Injury | |
| JP2023535832A (ja) | Ｓａｒｎａとｍｒｎａ調節剤によるｓｍａの併用治療 | |
| WO2023154848A1 (en) | Compositions and methods for modulating nuclear enriched abundant transcript 1 to treat cognitive impairment | |
| AU2015262889A1 (en) | Small interfering RNA (siRNA) for the therapy of type 2 (ADO2) autosomal dominant osteopetrosis caused by CLCN7 (ADO2 CLCN7-dependent) gene mutation | |
| JP2023529398A (ja) | Ｍｉｔｆ遺伝子を標的とする核酸分子及びその使用 | |
| TW202345866A (zh) | 用於抑制補體因子ｂ的組成物及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221206 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231017 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240115 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240314 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240416 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240618 |