TWI430812B - 調控細胞中ｃａｇ擴張基因之基因產物與其聚集的方法及其應用 - Google Patents

調控細胞中ｃａｇ擴張基因之基因產物與其聚集的方法及其應用 Download PDF

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Description

調控細胞中CAG擴張基因之基因產物與其聚集的方法及其應用
本發明係關於調控細胞中CAG擴張基因之表現的方法。本發明亦提供一種調控或防止多麩醯胺酸(polyglutamine)產生蛋白質聚集的方法，以及實施該調控方法的試劑。
多麩醯胺酸(Polyglutamine,簡稱PolyQ)疾病為一種因基因突變，進而引發九種不同病症之疾病，該疾病包括亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease，簡稱HD)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral pallidoluysian atrophy,簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bular muscular atrophy,簡稱SBMA)及第一型、第二型、第三型、第六型、第七型及第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spino-cerebellar ataxia 1、2、3、6、7及17,分別簡稱為SCA1、2、3、6、7及17)。多麩醯胺酸疾病的成因是由於細胞中的CAG擴張基因之重複序列的數目大於36個以上，使得所編碼出之多麩醯胺酸蛋白質形成聚集，因此多麩醯胺酸疾病亦稱為CAG重複序列疾病。
如表一中所列疾病之相關蛋白質的基因，若發生突變即會導致疾病之產生，例如亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)即是由於huntingtin(Htt)蛋白產生突變所導致，而脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bular muscular atrophy)則是由於androgen receptor(AR)蛋白產生突變所導致，這些疾病會導致病患大腦中產生蛋白沉積(proteinaceous deposits)，雖然表一中所列因蛋白沉積所導致之疾病係分別與不同的蛋白質有關，但這些蛋白卻皆與其基因產物含有麩醯胺酸(glutamine)序列之擴張延伸相關，迄今為止，在表一所列疾病相關之蛋白中，此polyQ序列之擴張延伸是所有polyQ疾病中唯一已知且共同存在的基因突變。
在一般情況下，基因中CAG重複序列之數目小於36個即屬於良性數目，但若基因中CAG重複序列之數目有37個或更多則屬於病理數目，因此當CAG重複序列之數目大於36個時就會被認為是與病理表現型的基因有關聯，也就是當蛋白有重複性polyQ出現時，這類蛋白質易傾向自然聚集成類澱粉纖維狀結構(amyloid-like fibrils)(具有β-折疊結構之蛋白質聚集)(Scherzinger等人，1997)，這些結構會沉積於身體之組織或器官中，致該組織或器官產生不同功能程度的障礙，而引起許多不同疾病(Scherzinger等人，1997)，且具有擴張之polyQ突變蛋白會引起蛋白結構摺疊異常，這些摺疊異常的蛋白會累積聚集在神經細胞內，最後導致神經細胞死亡(Zoghbi與Orr,2000)。
於人體內，擴張之polyQ突變蛋白係在中樞神經系統(CNS)細胞中廣泛地表現，然而在前述蛋白所導致之各個不同的疾病中，神經元之特定群組相較於其他更為脆弱，因此可依照病患神經的脆弱度，及其所造成之神經退化性疾病的特徵型態與臨床特徵，進而區分為九種不同的疾病，這些疾病包含亨丁頓氏舞蹈症、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症、脊髓延髓肌肉萎縮症及第一型、第二型、第三型、第六型、第七型及第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群。疾病之嚴重程度與CAG重複序列之數目相關，以HD為例，臨床研究顯示正常的CAG重複次數會低於26次，當CAG重複序列數目在28-35個之間仍屬正常，但仍有發病的風險，35-40個被認為是低外顯率(reduced penetrance)，而重複序列數目大於40個則認為是高外顯率(full penetrance)，意即CAG的重複次數越多，其發病的機率就越大。
表1列出了因基因中含有擴張之CAG重複序列之基因所衍生的八種疾病，這些疾病係經由擴張之CAG重複序列、受影響之基因、及其定義可導致患病之重複序列長度。於此列表中並不包括第六型小腦脊髓幹運動失調症候群(SCA6)，因為SCA6不像其他polyQ疾病，SCA6中之CAG重複序列長度並不是決定發病時間的決定性因素，相較於其他polyQ疾病，SCA6中之病理重複序列長度亦短得多，SCA6之CAG重複序列的次數為21-30個之間，即足以引起病理表現型。
於上述八種疾病中，因為亨丁頓氏舞蹈症對病患之影響較為一般大眾所熟知，以亨丁頓氏舞蹈症為例，該疾病係與選擇性神經細胞死亡有關，其主要發生在皮層與紋狀體中，這是一種致命的疾病，該疾病會逐漸使病患之行動能力及認知上產生遲緩，造成病患及病患家人需承受重大經濟與情感上之負擔。亨丁頓氏舞蹈症之出現率在西歐人後裔之中特別普遍(約20,000之1)，不幸的是，目前無法治癒這種可怕的疾病。
目前，針對亨丁頓氏舞蹈症之現有治療方法係主要限於症狀的控制。例如，由FDA所批准最新化合物之一：丁苯那嗪(tetrabenazine)，為一種用於減少亨丁頓氏舞蹈症病患運動機能亢進之藥物，丁苯那嗪(Tetrabenazine)為一種囊泡單胺轉運體(VMAT)抑制劑，會促進神經傳導物之早期降解，因此，此藥物僅能治療症狀，而非根治該疾病。目前用於治療亨丁頓氏舞蹈症之其他藥物有抗精神病藥(neuroleptics)與苯二氮平類藥物(benzodiazepines)這二種，隨著病情的發展，針對不同亨丁頓氏舞蹈症之症狀做治療的藥物，還包括抗精神病藥物(antipsychotics)，以及用於運動機能減退之藥物，但是目前並沒有任何的治療方法是試圖去解決亨丁頓氏舞蹈症之根本原因。
如上文所述，亨丁頓氏舞蹈症之發病機制，是由於一種位於中樞神經細胞內之基因，含有異常擴張之CAG重複序列所導致，特別是基因Htt ，其會轉譯為huntingtin(Htt)蛋白，於一個正常人的身體內，大約有8-25個基本的CAG核苷酸重複序列在Htt 基因中。但於亨丁頓氏舞蹈症病患之體內，CAG重複序列之數目擴大增加至36個或更多，因為這種類型的突變是顯性的，所以若一旦經遺傳而得到一個突變的亨丁頓(Htt )基因就會發展亨丁頓氏舞蹈症。
根據2003年及2004年Sanchez及Tanaka等人的細胞與動物模式研究顯示：在亨丁頓氏舞蹈症之發展中，突變Htt 所形成之蛋白聚集扮演著關鍵角色。據觀察當蛋白水解時，突變的Htt蛋白可自polyQ擴張之部份，留下較短的片段，如果有太多重覆之麩醯胺酸(glutamine)序列存在於突變之Htt 中，則其基因產物麩醯胺酸(glutamine)之極性(polar nature)會導致Htt與其他蛋白產生不良的相互作用。尤其是突變Htt 若具有太多重覆之麩醯胺酸(glutamine)序列，則其所產生之基因產物將會互相形成氫鍵且聚集在一起，如此一來這些蛋白質的結構就會產生變異，無法折疊成具有功能之蛋白，隨著時間的推移，積累之蛋白聚集會損害神經細胞，導致病患神經細胞死亡與神經功能缺損。此蛋白聚集之破壞作用已經由實驗證實，確實會造成人體神經傷害，並顯示藉由抑制蛋白聚集形成之化學試劑，可增強細胞存活，且改善小鼠模式中亨丁頓氏舞蹈症之病理變化。
除了使用抑制劑來防止蛋白聚集之外，減少突變亨丁頓(Htt )基因之表現也是一種替代治療的方法，以抑制不溶性蛋白聚集之發生。根據1999年Scherzinger等人的活體外研究已顯示polyQ蛋白聚集之程度與蛋白濃度相關，因此，理論上可藉由降低突變亨丁頓(Htt )基因表現，以產生較低含量之PolyQ擴張蛋白，並藉此降低蛋白聚集之形成及延緩亨丁頓氏舞蹈症之發病。
這些結果指出可藉由一種簡單而有效的策略來打擊亨丁頓氏舞蹈症的發病機制，該策略為調控Htt 中之CAG重複序列突變所產生的不溶性蛋白聚集之形成，例如：一種可調控polyQ突變基因之表現或polyQ聚集形成之試劑，該試劑有可能解決polyQ疾病之根本原因，而非僅治療其生理症狀，但目前仍缺乏能調控突變polyQ基因表現之有關細胞因子與試劑，因此造成此治療策略之實際發展的限制。
因此，對於一包含擴張之CAG重複序列突變的基因，目前仍迫切需要可調控或降低該基因表現之方法或工具，因此本發明提供一種治療與鑑定方法，用以調控或減少一種含有擴張之CAG重複序列突變之基因的表現，並提供方法與工具，進而開發一藥劑，以有效的調控或減少突變基因的表現。
有鑑於此，本發明為提供關於檢測與篩選治療藥物的方法，透過本發明之篩選平台，可篩選出可能之化合物，進而調控或減少一種含有擴張之CAG重複序列之基因的表現。
本發明係藉由：微生物轉錄延伸因子Spt4與其哺乳類同源因子Supt4h，來調控或減少一種含有擴張CAG重複序列基因之表現。
此外，在Spt4-/Supt4h-缺失的細胞中，本發明所提及之一種含有擴張CAG重複序列之基因的表現，與具有polyQ序列之擴張延伸的蛋白聚集，皆有受到抑制之現象。本發明進一步發現，Spt4/Supt4h在未含有或含有較短的CAG重複序列之基因上不會發生作用。本發明因而藉由Spt4/Supt4h來做為polyQ疾病干預之有效標靶。
本發明亦發現，在Spt4-/Supt4h-缺失的細胞所產生之抑制作用，可以歸因於在CAG擴張基因中轉錄延伸功能的受損，導致其相對應之mRNA與蛋白質產物的減少。由此得知可將Spt4與Supt4h做為抑制含有CAG重複序列之基因的機制模式，因此本發明即為利用該抑制轉錄延伸之機制而設計的治療方法。
根據2004及2003年Crotti、Basrai及Rondon等人的研究發現，在酵母細胞中，Spt4於轉錄與異染色質形成的控制機制中扮演一個重要角色。Spt4對於轉錄控制作用之分析顯示：Spt4為一種延伸過程之正調解蛋白，特別的是Spt4係從DNA模板(其具有高百分比之GC含量，或在酵母細胞中大於3 Kb之大小)促進RNA聚合酶Ⅱ導引之轉錄合成(Rondon等人，2003)。此外，根據2005年Mason與Struhl的研究證據顯示，於CAG重複序列的轉錄過程，Spt4會影響RNA聚合酶II之持續合成能力，意即Spt4為染色質模板上之聚合酶II持久性的重要因子。
目前尚未有任何研究指出Spt4可調控polyQ蛋白表現的理論，本發明則指出Spt4對包含polyQ之蛋白的表現是必須的，其原因在於Spt4可防止DNA模板轉錄機制過早分離，而對於經過該模板(例如，包含CAG-擴張之區域之模板)移動之聚合酶II而言，需花費很長的時間。此模式解釋了具有Spt4-/Supt4h-缺失的細胞會顯出CAG-擴張之基因的抑制表現。因此，可以有效地藉由Spt4或Supt4h設計出針對polyQ疾病的治療方法。
另外，本發明發現因Spt4基因缺失所產生之抑制作用可經由特定的Spt5突變基因而重現，該Spt5突變喪失與Spt4相互作用之能力。由於在細胞中Spt4與Spt5通常形成一複合體，所以本發明進一步證明該Spt4/Spt5複合體亦為治療之標靶。
本發明所述之抑制轉錄延伸因子複合體形成之流程可包括以下兩種步驟：一、抑制轉錄延伸因子，二、抑制轉錄因子複合體之形成(該複合體係與含有擴張之CAG重複序列的基因表現有關)。該轉錄延伸因子基因係以酵母細胞之SPT4 或哺乳動物細胞之SUPT4H 為較佳。該轉錄因子複合體係以酵母細胞中之Spt4/Spt5或哺乳動物細胞中之Supt4h/Supt5h為較佳。該擴張之基因亦選自以下組成之組群者：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 、及Htt 基因或其組合為較佳。
基於本發明上述的發現，本發明將以較佳實施例來說明關於調控含有擴張之CAG重複序列之基因表現的方法。
本發明之一目的為提供一種調控細胞中一第一基因表現之方法，該第一基因含有一擴張之CAG重複序列，該擴張之CAG重複序列之重複數目大於36，該方法包括：抑制一第二基因之表現；其中該第二基因為選自以下組成之組群者：SPT4、SPT5、SUPT4H 及SUPT5H 。
本發明所述之調控含有擴張CAG重複序列基因表現的方法，一般係以一種轉錄延伸因子作為目標，該轉錄延伸因子係與含有擴張CAG重複序列之基因表現有關。而該轉錄延伸因子之導向可為直接或間接。
本發明之再一目的為提供一種調控細胞中一第一基因表現之方法，該方法包括：抑制Spt4/Spt5或Supt4h/Supt5h複合體於該細胞中形成；其中該第一基因係含有一擴張之CAG重複序列且具有大於36個CAG的重複序列。
較佳地，該第一基因係選自以下組成之組群：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因。
較佳地，第一基因係使該擴張之CAG重複序列延伸之蛋白編碼且在該細胞中形成聚集。
較佳地，該擴張之CAG重複序列為含有擴張之多麩醯胺酸(polyglutamine)，具有大於36個麩醯胺酸(glutamine)殘基。
較佳地，該方法可為基因抑制(gene knockdown)、基因剔除(gene knockout)、化學抑制劑或其組合之基因抑制方法加以進行。
較佳地，細胞為動物細胞或酵母細胞，其中該動物細胞指的是哺乳動物細胞。
本發明之再一目的為提供一種治療多麩醯胺酸疾病之方法，該方法包括：抑制該多麩醯胺酸疾病之病患的一第二基因之表現；該第二基因為選自以下組成之組群者：SPT4、SPT5、SUPT4H 及SUPT5H 。
本發明所述之治療方法一般係包括抑制轉錄延伸因子基因在細胞中之表現的步驟。其中該轉錄延伸因子基因為酵母細胞之SPT4 基因或哺乳動物細胞之SUPT4H 基因為較佳。擴張之CAG基因係以選自以下組成之組群者：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因或其組合為較佳。
本發明之再一目的為提供一種治療多麩醯胺酸疾病之方法，該方法包括：抑制Spt4/Spt5或Supt4h/Supt5h複合體於該細胞中之形成；其中該第一基因係含有一擴張之CAG重複序列且具有大於36個CAG的重複序列。
本發明所述之治療方法一般係包括抑制轉錄延伸因子複合體形成之步驟流程。該轉錄延伸因子複合體係為酵母細胞中之Spt4/Spt5複合體或哺乳動物細胞中之Supt4h/Supt5h複合體為較佳。該擴張之基因亦選自以下組成之組群者：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因或其組合為較佳。
較佳地，該多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病係選自以下組成之組群：第一型、第二型、第三型、第七型、第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spino-cerebellar ataxia type1、2、3、7或17,分別簡稱為SCA1、2、3、6、7或17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy,簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bular muscular atrophy,簡稱SBMA，又稱甘迺迪氏症(Kennedy’s disease))或亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)。
本發明之再一目的為提供一種篩選具有抑制一含有CAG基因重複序列擴張和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病的抑制劑之方法，該方法包括：提供一抑制劑，並且將該抑制劑與一Spt4/Spt5複合體或一Supt4h/Supt5h複合體接觸，當該抑制劑可有效抑制Spt4/Spt5複合體或Supt4h/Supt5h複合體形成，則表示該抑制劑係具抑制該含有CAG基因重複序列擴張和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病的可能性。
本發明所述之含有CAG基因重複序列擴張和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病，其中該含有CAG基因重複序列基因係選自以下組成之組群：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 之擴張基因，且該擴張基因之CAG重複序列之數目係大於36個為較佳。
本發明所述之對於調控含有CAG基因重複序列基因有抑制效果的抑制劑和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病之方法步驟流程一般係包括以下步驟：測試候選抑制劑，以評估其在Spt4/Spt5複合體或Supt4h/Supt5h複合體之干擾形成上之有效性，且若該抑制劑可於某種程度上干擾上述複合體的形成，則判斷該候選抑制劑對於含有CAG重複序列基因有抑制效果，和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病是有效的，因此可以認定該抑制劑作為領導化合物(lead compound)。較佳地，其中該抑制劑為抗體、化合物或胜肽。而評估候選抑制劑之有效性係使用蛋白交互作用檢測法較佳。
關於本發明之優點與精神，以及更詳細的實施方式可以藉由以下的實施方式以及所附圖式得到進一步的瞭解。
本發明目前係經由具體舉例之實施例與實例加以描述，以幫助充分理解各種本發明實驗所衍生之結果。本發明雖以較佳實例闡明如上，本文所揭示之實施例僅作說明目的用途，然其並非用以限定本發明精神與發明實體僅止於上述實施例。對熟悉此項技術者，當可輕易了解並利用其它元件或方式來產生相同的功效。在不脫離本發明之精神與範圍內所作之修改，均應包含在下述之申請專利範圍內。
定義
在整個揭示內容中，基因名稱係以斜體大寫字母表示，而與基因有關之蛋白係以非斜體字母表示，只有第一個字母大寫。例如，關於SPT4 基因，「SPT4 」一詞表示基因，而「Spt4」一詞表示由基因所產生之蛋白。唯一的例外是亨丁頓(Huntingtin)基因，其中基因名稱係以“Htt ”表示，而基因產物(蛋白Huntingtin)係以“Htt”表示。
如本發明文中所使用之基因SPT4 係指使轉錄延伸蛋白Spt4編碼之基因。該基因係經由(Malone等人，1993)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白Spt4係經由(Malone等人，1993)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本文中所使用，基因SPT5 係指使轉錄延伸蛋白Spt5編碼之基因。該基因係經由(Swanson等人，1991)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白Spt5係經由(Swanson等人，1991)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本發明文中所使用之基因SUPT4H 係指使哺乳動物的轉錄延伸因子Supt4h編碼之基因。該基因係經由(Hartzog等人，1996;Chiang等人，1996)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白Supt4h係經由(Hartzog等人，1996;Chiang等人，1996)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本發明文中所使用，基因SUPT5H 係指使哺乳動物的轉錄延伸因子Supt5h編碼之基因。該基因係經由(Stachora等人，1997;Chiang等人，1998)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白Supt5h係經由(Stachora等人，1997;Chiang等人，1998)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
於本發明之上下文中，「polyQ疾病」一詞係指表1 中所列示之八種疾病。
於本發明之上下文中，「polyQ突變蛋白」一詞係指具有polyQ序列段長於36個麩醯胺酸(glutamine)殘基之蛋白。
於本發明之上下文中，「擴張之CAG重複序列」一詞係指CAG重複序列數目大於36個。
抑制含有擴張之CAG重複序列之基因表現之方法
如上所述，本發明係提供了一種調控細胞中之基因表現的方法，其中該基因含有擴張之CAG重複序列。較佳地，CAG重複序列之數目超過36個。含有擴張之CAG重複序列之基因較佳係選自以下組成之組群：SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因。
較佳地，根據本發明之一種調控細胞中基因表現的方法，一般係包括抑制酵母細胞中之Spt4或哺乳動物細胞中之Supt4h表現的步驟。
本發明所述之抑制基因產物表現之方式並未被特別限制。該方式可為此技術領域中任何普遍已知的基因靜默方法(gene silencing method)或其他未來發展的基因抑制方法，只要該方式能抑制基因產物(意即Spt4和Supt4h蛋白)之表現即可。舉例來說，基因靜默方法可應用於本發明，但該基因靜默方法不限定於基因抑制(gene knockdown)、基因剔除(gene knock-out)，或利用有能力抑制SPT4 或SUPT4H 基因表現之化學試劑或其混合物。
較佳地，使用siRNA與基因剔除(gene knock-out)法來調控哺乳動物細胞中之SUPT4H 基因與酵母細胞中之SPT4 基因，藉以達成基因抑制(gene knockdown)之RNA干擾序列，較佳地該序列係為SUPT4H 之互補基因序列，更佳地該序列係具有序列同源性達80%以上。
目前尚未有任何特定的理論證據可以指出SPT4 與SUPT4H 之抑制會削弱細胞轉錄延伸的能力，降低具有長的CAG重複序列之基因轉錄，從而抑制具有擴張polyQ序列之蛋白表現。
第1圖 係以圖說明經由何種機制將Htt 基因轉譯成Htt蛋白之過程。
參照第1(a)圖 ，顯示RNA聚合酶II(灰色圓圈)10 在正常Htt 基因20 上，沿著具有CAG重複序列21 (顯示為具有斜線之片段)之DNA模板移動，於轉錄期間RNA聚合酶II10 會與Htt 基因20 之DNA模板結合，然後，沿著模板移動，以產生含有CAG重複序列(意即，Htt 基因mRNA)30 之mRNA，隨後Htt蛋白40 係經由轉譯Htt 基因mRNA30 而產生。總而言之，1(a)圖 顯示在含有正常CAG重複序列或「短的CAG重複序列」22 之基因的情況下發生之變化，其中該「短的CAG重複序列」指的是CAG重複的數目小於36個的序列。
第1(b)圖 顯示在含有擴張之CAG重複序列或「長的CAG重複序列」23 之突變Htt 基因20 之情況下發生之變化，其中該「長的CAG重複序列」指的是CAG重複的數目大於36個的序列。如上所述，當Htt蛋白40 係以擴張之polyQ重複序列而產生時，容易聚集且積累在器官或組織中，而導致HD的表現型。
在第1(c)圖 中，SUPT4H 基因降低表現，因此在轉錄延伸期間聚合酶II10 無法持續地與突變Htt 基因20 結合，導致Htt蛋白之減產，因此得以預防或紓緩polyQ疾病的表現。
除了抑制轉錄延伸因子基因SPT4 與SUPT4H 之表現，相對地降低polyQ突變蛋白之聚集作用亦可藉由間接針對Spt4與Supt4h之相互作用蛋白來達成。舉例來說，目前已知Spt4蛋白會與Spt5蛋白結合並於酵母細胞中形成一個複合體，經由干擾該Spt4/Spt5複合體之形成來達到減弱突變polyQ蛋白之表現的目的。同樣地，Supt4h與Supt5h亦在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中形成一個複合體，因此上述之兩種複合體之抑制機制為一種替代且實用之抑制CAG擴張之基因的表現方法，且可防止polyQ聚集在人類或酵母細胞中。
因此，於較佳實施例中，根據本發明所提供的一種調控細胞中之基因表現之方法，該方法一般係包括干擾轉錄延伸蛋白複合體之形成之步驟。較佳地，該轉錄延伸蛋白複合體為酵母細胞中之Spt4/Spt5或哺乳動物細胞中之Supt4h/Supt5h。
其中干擾蛋白複合體形成之方式並未被特別限制。該方式可以經由此技術領域中任何普遍已知之方法達成，其中包括一、利用一種酵母細胞中的Spt4或Spt5與哺乳動物細胞中的Supt4h或Supt5h之已知或未來開發之抑製劑。二、基因靜默方法，譬如siRNA、RNAi或此技術領域中任何其他已知基因靜默之方法亦可被善加利用，以抑制至少一個因子在相對應之複合體中之表現。以Spt4/Spt5為例來說，降低SPT4 、SPT5 或兩者之基因可有效地抑制Spt4/Spt5的複合體之形成，或者，可引入突變之Spt4或Spt5作為干擾劑，以干擾野生型Spt4/Spt5複合體之形成。
在其他進一步實施例中，該基因抑制步驟亦可與蛋白複合體干擾步驟一併實施並採用。
例如，在舉例之實施例中，一種調控突變polyQ蛋白在細胞中之表現之方法可包括，一、抑制酵母細胞之SPT4 基因或哺乳動物細胞之SUPT4H 基因表現；二、與抑制酵母細胞中之Spt4/Spt5複合體或哺乳動物細胞中之Supt4h/Supt5h複合體形成之步驟。
用於治療polyQ疾病之方法
另一實施例，本發明亦提供治療polyQ疾病之方法，其中polyQ疾病係選自以下組成之組群者：第一型、第二型、第三型、第七型及第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群、萎縮症、脊髓延髓肌肉萎縮症及亨丁頓氏舞蹈症。
於較佳實施例中，本發明揭露治療polyQ疾病之方法可包括投予有效量之基因靜默劑，該方法的實施步驟係以抑制SUPT4H 基因、SUPT5H 基因或兩者之表現，其中該基因靜默劑之類型並未被特別限制，可使用此技術領域中已知之任何基因靜默劑或未來開發之基因靜默劑，只要該試劑能夠抑制SUPT4H 或SUPT5H 基因之表現，則認定為此技術領域中之通常知識者皆所知悉，然而不同的基因靜默劑需要選擇適當的投藥途徑。在一舉例之實施例中，基因靜默劑可為siRNA、RNAi或D-RNAi。
在一些其他較佳實施例中，本發明揭露治療polyQ疾病之方法可包括投予能夠干擾Supt4h/Supt5h複合體形成之藥劑的步驟。該藥劑並未被特別限制，只要該藥劑能夠干擾活體內Supt4h/Supt5h複合體之形成。適當之藥劑可為Supt4h或Supt5h之特定的抑制劑。舉例之藥劑可包括小分子、胜肽或抗體。該藥劑亦可為Supt4h或Supt5h之基因工程突變體，但本發明並不限於此。
鑑定有用的試劑作為先導化合物之方法
在另一個實施例，本發明進一步提供一種篩選且鑑定治療polyQ疾病之先導化合物之方法。根據本發明揭露之篩選鑑定的方法，一般包括以下步驟，在干擾蛋白複合體之形成下，測試候選化合物的有效性，且該有效性係經過量化所得之一代表值，若該代表值落在一標準範圍內，則鑑定該測試候選化合物有效並得以作為先導化合物。
該測試鑑定步驟可對Spt4/Spt5或Supt4h/Supt5h複合體之交互作用進行一蛋白交互作用檢測法，該蛋白交互作用檢測之設計如下說明，但並不局限於此。例如，由Spt4/Spt5或Supt4h/Supt5h複合體所產生之蛋白交互作用為可被建立的鑑定方法，無論是在活體外或活體內，使用全長或部分這些蛋白皆為本發明所揭露之實施方式。若該檢測法係使用活體內檢測，則較佳的實施方式係以酵母細胞內之Spt4/Spt5交互作用與哺乳動物細胞內之Supt4h/Supt5h交互作用為基礎之檢測。
關於蛋白交互作用之量化數值可藉由螢光信號、FRET信號或酶反應所讀出。
較佳地，可做為干擾此蛋白交互作用之候選化合物係選自以小分子、胜肽或抗體。
特別指出的是，本發明揭露的蛋白基礎鑑定，其為一種用於鑑定先導化合物之有效方法，例如，Vassilev等人利用MDM2蛋白可結合至p53蛋白，抑制p53功能，造成腫瘤細胞生成之特性，發展抑癌藥物。Nutlin-3(一個對於癌症治療顯示有效的小分子)被鑑定有能力阻斷MDM2與p53蛋白間之交互作用(Vassilev等人，Science ，303:844-848，其整個內容係併入本文供參考)。除了上述典型例子之外，尚有一些其他的研究可對於本文所揭示之方法提供支持，該方法係為以複合體的蛋白交互作用為基礎所發展之藥物。
在一較佳實施例中，所使用之檢測為先前由本發明人所發展之顏色菌落檢測(color colony assay)，該檢測之詳細內容描述於美國專利7,375,190 B2中，其整個內容係併入本文供參考。
為了進一步說明本發明，因此提供下文具體實施例。
實施例1.　以Supt4h siRNA降低(knockdown)突變 Htt mRNA的表現量
將小鼠紋狀體神經細胞株ST14A(大鼠)、HdhQ7/Q7 (小鼠)、HdhQ111/Q111 (小鼠)及HdhQ7/Q111 (小鼠)於10%胎牛血清(FBS)之Dulbecco's Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養基(SH30022，HyClone)中，在33℃與5%二氧化碳濃度下培養，使ST14A以pTet-Off質體(BD Biosciences)轉染，以建立單一細胞株ST14Atet，並使該細胞株表現pTRE2-7Q-eGFP或pTRE2-81Q-eGFP。DNA與siRNA轉染係使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)。使用含有100 nM之Supt4h siRNA(DHARMACON，ON-TARGET plus SMART pool，L-048866-01其包括5'-CUAUAGACCAGUUCGAAUA-3'(SEQ ID NO: 1)、5'-UCAAAUACCAAUAAAGCGA-3'(SEQ ID NO: 2)、5'-GGGAGUGUCUGGGCGGAUU-3'(SEQ ID NO: 3)、5'-CCCAAGGAAUCGUGCGGGA-3'(SEQ ID NO: 4))及(DHARMACON，J-086342-10，5'-UGGCCUACAAAUCGAGAGAUU-3'(SEQ ID NO: 5))，以抑制Supt4h在各個小鼠與大鼠細胞中之表現。本實施例亦使用加入等量之不會對任何基因表現產生影響的雙股寡核苷酸(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO: 6)與5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO: 7))的細胞做為對照組。
於第2A圖 中，Supt4h siRNA處理後，Htt mRNA表現量經由RT-PCR分析，在於具有野生型(HdhQ7/Q7 )或突變亨丁頓蛋白對偶基因(HdhQ111/Q111 )之紋狀體細胞中檢驗。由RNA聚合酶III所轉錄之U6做為對照校正組(loading control)。TUBA1A 被列入以檢驗Supt4h對於管家基因的影響。結果顯示在HdhQ111/Q111 細胞中突變Htt mRNA表現量隨著SUPT4H 基因抑制而下降。然而，在SUPT4H 基因也顯示類似程度之下降時，HdhQ7/Q7 內之正常Htt mRNA之表現中並沒有明顯的變化。
於第2B圖 中，Supt4h siRNA處理後，各mRNA表現量的變化，該變化係藉由即時性qRT-PCR進行評估。各mRNA都經過U6之常規化(normalized)，且以對照siRNA(NC siRNA)轉染之細胞中之轉錄含量(transcript level)設定為1。在此圖中，橫軸代表Htt 基因、SUPT4H 基因、TUBA1A 基因，而縱軸代表相對的mRNA含量。該圖顯示經由SUPT4H 基因的抑制後，突變Htt 的mRNA在HdhQ111/Q111 中大幅減少，而HdhQ7/Q7 中之正常Htt 的mRNA只有輕微減少。
第2A圖 與第2B圖 皆顯示突變的Htt 基因其表現是受Supt4h調控。
實施例2.　在具有與未具有Supt4h siRNA抑制下，細胞中Htt蛋白表現量之分析
於第3圖 中，從實施例1所收集之細胞藉由免疫印跡(immunoblot)分析，以測定Supt4h siRNA抑制所產生之蛋白表現量變化，對於Htt、Supt4h、Tbp及α-微管蛋白(α-Tubulin)係使用等量之總蛋白萃取物進行免疫印跡(immunoblotted)，本實施例係將Tbp(TATA-box結合蛋白)作為具有短CAG重複序列之蛋白編碼基因之代表。
相較於NC siRNA處理之HdhQ111/Q111 細胞，經過Supt4h siRNA處理之HdhQ111/Q111 細胞中，顯示突變的Htt蛋白含量較低，且其減少與相對應之mRNA在HdhQ111/Q111 細胞上之變化一致，如實施例1中所觀察的。此外，具有正常的CAG重複序列(CAG三核苷酸重複數目小於36個)之編碼基因之蛋白，譬如HttQ7 與Tpb蛋白，其表現量是不會受Supt4h siRNA抑制而有所影響。
實施例3. SUPT4H 基因的降低表現(down-regulation)會抑制突變，但不影響正常的Htt蛋白表現
於第4圖 中，使具有雜合子的Htt 對偶基因(HdhQ7/Q111 )之紋狀體細胞以Supt4h siRNA轉染，且蛋白表現係如實施例2所述之步驟進行分析。HttQ7 與HttQ111 的位置係以箭頭指示，第4圖 顯示HttQ7 與HttQ111 對於SUPT4H 抑制之反應，其中HttQ111 的蛋白量為下降的，而HttQ7 的蛋白量仍保持不變。因此本實施例進一步證實，僅含有擴張之CAG重複序列的基因會受到Supt4h影響。
實施例4. ST14A細胞表現81Q-eGFP所造成的生存能力下降可 經由Supt4h siRNA處理而提高
在具有與未具有Supt4h siRNA處理的情況下，測量ST14A細胞表現7Q-eGFP或81Q-eGFP的生存能力。本實施例係以所指示之polyQ-eGFP與siRNA進行轉染後，將細胞培養於含有小量(0.5%)血清之生長培養基中，並維持在39℃的環境下，以誘發神經細胞分化。細胞在7Q-eGFP與對照siRNA轉染後其細胞存活數目設定為1，且其他細胞相對生存能力係如第5圖 中所示。相較於以7Q-eGFP轉染之細胞，以81Q-eGFP轉染之ST14A細胞其細胞生存能力降低，但該細胞生存能力可藉由siRNA介導的SUPT4H 抑制而反轉。相比之下，Supt4h siRNA處理對於細胞表現7Q-eGFP的生存能力無任何影響。該結果證實，聚集傾向蛋白(含有擴張之polyQ重複序列)表現所產生細胞生存能力之降低可以經由SUPT4H 基因的降低表現(down-regulation)而減緩。
實施例5.　干擾Spt4/Spt5複合體在酵母細胞中之形成可抑制polyQ聚集
我們使用菌落顏色檢測法(colony color assay)，該檢測法係經由本實驗室發展(美國專利7,375,190 B2)，以測定含polyQ蛋白之聚集。在此檢測系統中，使蛋白Ade2與29Q或99Q融合。當融合蛋白為可溶時，它是具功能性的，且Ade2的活性會使細胞變白色。反之，若融合蛋白聚集，則Ade2會失去功能，其細胞顏色會變成紅色。29Q-Ade2不會聚集係由於其短的polyQ重複序列(小於36Q)所致，因此被納入作為具有短的CAG三核苷酸重複序列(譬如正常的Htt 基因)之基因代表。於第6圖 中，顯而易見的是，野生型(WT)細胞表現29Q-ADE2與99Q-ADE2分別呈現白色與紅色。然而，當SPT4 基因剔除(SPT4Δ )或SPT5 SF突變引入這些細胞時，在99Q-ADE2表現的細胞中，原呈現紅色的細胞會變成白色。SPT5 SF細胞係進行特定SPT5 S324F點突變，藉此抑制Spt4/Spt5複合體之形成。本實施例結果顯示，藉由干擾Spt4/Spt5複合體之形成可影響polyQ的聚集。
實施例6.　在具有 SPT4 基因剔除或 SPT5 SF突變之細胞中其polyQ-Ade2蛋白表現與聚集之分析
PolyQ-Ade2蛋白表現與聚集係經由狹縫點墨法(slot blot)與濾阱(filter-trap)檢測法分別進行檢驗。濾阱檢測法(filter-trap assay)使用醋酸纖維(cellulose acetate,簡稱CA membrane)，僅捕捉聚集之蛋白，而狹縫點墨檢測法(slot blot assay)使用硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane,簡稱NC membrane)，會保留所有蛋白。保留在薄膜上之polyQ-Ade2經由免疫印跡法(immunoblot)，使用anti-FLAG抗體進行偵測。本實施例加入α-微管蛋白(α-Tub)，以確保等量蛋白於各個樣品中，本實施例的實驗結果於第7圖 中顯示，相較於WT細胞，99Q-Ade2蛋白聚集(CA，第7圖上)在SPT4Δ 與SPT5 SF突變細胞中大大地降低。藉由實驗結果可以得知這些突變細胞具有較少的polyQ聚集，本實施例與實施例5中所觀察到結果是一致的。除了減少聚集以外，亦發現99Q-Ade2蛋白表現量(NC，第7圖上)在SPT4Δ 與SPT5 SF細胞中減少，然而，這些突變的細胞並不會影響29Q-Ade2(NC，第7圖下)之表現。這些結果證實，藉由干擾Spt4/Spt5複合體之形成以抑制polyQ聚集是可行的。此外，具有長延伸(>36Q)(而非短延伸)polyQ蛋白之表現是較容易受到Spt4/Spt5複合體缺陷的影響。
實施例7.　藉由北方點墨法(Northern blot)，在具有 SPT4 基因剔除或 SPT5 SF突變之細胞中，分析 polyQ-ADE 2的mRNA表現量
藉由北方點墨法(Northern blot)對於表達99Q-Ade2與29Q-Ade2之細胞進行分析，其使用之細胞如實施例5所述。polyQ-ADE2 mRNA係藉由polyQ探針進行檢測，且加入SCR1 作為對照校正組(loading control)。將99Q-ADE2 mRNA在WT細胞中的表現量設定為100%。其他細胞中相對之99Q-ADE2 與29Q-ADE2 mRNA表現量如第8圖 中所示，相較於WT，SPT4Δ 與SPT5 SF細胞皆顯示99Q-ADE2 mRNA表現量下降，但並不影響29Q-ADE2 的mRNA表現。此結果與實施例6中之SPT4Δ 與SPT5 SF突變細胞內99Q-Ade2蛋白表現量下降的變化係一致的。
此發現亦證實，經由干擾Spt4/Spt5複合體之形成，以抑制具有擴張CAG重複序列基因之表現，且不影響短的polyQ蛋白表達是可行的。
<110> 國立陽明大學
<120> 調控細胞中CAG基因擴張之基因產物與其聚集沉澱的方法及其應用/Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and using thereof
<130> 2010RDPA027
<150> TW 099143336
<151> 2010-12-10
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Supt4h siRNA
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<213> artificial sequence
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<223> Supt4h siRNA
<400> 5
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<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> control sequence that does not target any gene
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Control sequence that does not target any gene
<400> 7
10‧‧‧RNA聚合酶II
20‧‧‧含有CAG重複序列之基因(Htt 基因)
21‧‧‧CAG重複序列
22‧‧‧短的CAG重複序列
23‧‧‧長的CAG重複序列
30‧‧‧含有CAG重複序列之基因的mRNA
40‧‧‧含有CAG重複序列之基因的蛋白
第1圖 係說明細胞中Spt4-/Supt4h蛋白的缺乏對於含CAG基因之表現影響。第1 (a)圖 顯示基因轉錄過程，以RNA聚合酶II(以斑點球形顯示)開始，沿著含有短CAG重複序列(灰色)的DNA模板(以波浪線條顯示)移動，以產生mRNA，然後轉譯成蛋白產物。第1 (b)圖 說明含有擴張數目之麩醯胺酸(glutamine)的蛋白如何聚集，以形成蛋白沉積。第1 (c)圖 顯示當降低Supt4h與Spt4蛋白時，含有擴張數目之polyQ蛋白表現量下降並抑制蛋白聚集。
第2A圖 係顯示RT-PCR檢測時，在紋狀體細胞中經由Supt4h siRNA處理後，Htt mRNA表現量變化。
第2B圖 係顯示經由即時(real-time)qRT-PCR，評估siRNA抑制Supt4h後，Htt mRNA表現量之變化。
第3圖 係顯示在具有與未具有Supt4h siRNA轉染之情況下，細胞中蛋白表現量。
第4圖 係顯示Supt4h的表現量下降對正常與突變Htt蛋白表現的影響。
第5圖 係顯示在具有或未具有Supt4h siRNA抑制的情況下，表現7Q-eGFP或81Q-eGFP之ST14A紋狀體細胞之存活力。
第6(a)圖 與第6(b)圖 係說明能抑制Spt4/Spt5複合體形成之SPT4 基因剔除或SPT5 基因突變，可以抑制含有擴張之CAG重複序列基因的表現，從而降低經由菌落顏色檢測(colony color assay)所發現之polyQ聚集。
第7圖 係說明由抑制Spt4/Spt5複合體形成時，對含有擴張數目之polyQ蛋白的表現與聚集影響。
第8圖 係顯示含有擴張CAG重複序列之基因轉錄下降，該現象係由抑制Spt4/Spt5複合體形成而產生。
10．．．RNA聚合酶II
20．．．含有CAG重複序列之基因(Htt基因)
21．．．CAG重複序列
22．．．短的CAG重複序列
23．．．長的CAG重複序列
30．．．含有CAG重複序列之基因的mRNA
40．．．含有CAG重複序列之基因的蛋白

Claims (18)

  1. 一種體外調控細胞中一第一基因表現之方法，該第一基因含有一擴張之CAG重複序列，該擴張之CAG重複序列之重複數目大於36個，該方法包括：抑制一第二基因之表現；其中該第二基因係選自：SPT4、SPT5、SUPT4H 及SUPT5H 所組成之組群。
  2. 如專利範圍第1項之方法，其中該第一基因係選自SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因所組成之組群。
  3. 如專利範圍第1項之方法，其中該第一基因於細胞中編碼產生一蛋白質，該蛋白質含有一擴張之多麩醯胺酸(polyglutamine)，且該擴張之多麩醯胺酸數目大於36個麩醯胺酸(glutamine)。
  4. 如專利範圍第1項之方法，其中該抑制方法可用基因抑制(gene knockdown)、基因剔除(gene knockout)、化學抑制劑或其組合之方法進行。
  5. 如專利範圍第1項之方法，其中該細胞為動物細胞或酵母細胞。
  6. 如專利範圍第5項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  7. 一種體外調控細胞中之一第一基因表現之方法，該方法包括：抑制Spt4/Spt5或Supt4h/Supt5h複合體於該細胞中之形成；其中該第一基因係包含一擴張CAG重複序列，且該擴張CAG重複序列數目大於36個。
  8. 如專利範圍第7項之方法，其中該第一基因於細胞中編碼產生一蛋白質，該蛋白質含有一擴張之多麩醯胺酸(polyglutamine)，且該擴張之多麩醯胺酸數目大於36個麩醯胺酸(glutamine)。
  9. 如專利範圍第7項之方法，其中該第一基因係選自SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA17、DRPLA、AR 及Htt 基因所組成之群組。
  10. 如專利範圍第7項之方法，其中該抑制方法係經由對該細胞投予一抑制劑，該抑制劑包含抗體、化合物或胜肽。
  11. 如專利範圍第7項之方法，其中該細胞為動物細胞或酵母細胞。
  12. 如專利範圍第11項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  13. 一種第二基因的抑制劑作為製備治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病之醫藥組合物的用途，其中該第二基因為選自SPT4、SPT5、SUPT4H 及SUPT5H 所組成之群組。
  14. 如專利範圍第13項之方法，其中該多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病包含第一型、第二型、第三型、第七型或第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spino-cerebellar ataxia typel、2、3、7或17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy，簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bular muscular atrophy)或亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)。
  15. 一種Spt4/Spt5複合體或Supt4h/Supt5h複合體的抑制劑作為製備治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病之醫藥組合物的用途。
  16. 如專利範圍第15項之方法，其中該多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病包含第一型、第二型、第三型、第七型或第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spino-cerebellar ataxia typel、2、3、7或17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy，簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bular muscular atrophy)或亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)。
  17. 一種篩選具有抑制一含有CAG重複序列擴張基因和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病的抑制劑之方法，該方法包括：提供一抑制劑；及將該抑制劑與一Spt4/Spt5複合體或一Supt4h/Supt5h複合體接觸；其中當該抑制劑可有效抑制Spt4/Spt5複合體或Supt4h/Supt5h複合體形成，則表示該抑制劑係具抑制該含有CAG重複序列擴張基因和/或治療多麩醯胺酸(polyglutamine)疾病的可能性。
  18. 如專利範圍第17項之方法，其中該抑制劑包含抗體、化合物或胜肽。
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