TR201808029T4 - Genişlemiş tri-nükleotid tekrarı barındıran genlerin zararlı aktivitesinin seçici şekilde indirgenmesi. - Google Patents

Genişlemiş tri-nükleotid tekrarı barındıran genlerin zararlı aktivitesinin seçici şekilde indirgenmesi. Download PDF

Info

Publication number
TR201808029T4
TR201808029T4 TR2018/08029T TR201808029T TR201808029T4 TR 201808029 T4 TR201808029 T4 TR 201808029T4 TR 2018/08029 T TR2018/08029 T TR 2018/08029T TR 201808029 T TR201808029 T TR 201808029T TR 201808029 T4 TR201808029 T4 TR 201808029T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
protein
ade2
cells
spt4
polyq
Prior art date
Application number
TR2018/08029T
Other languages
English (en)
Inventor
Cheng Tzu-Hao
Liu Chia-Rung
Wang Tzu-Han
N Cohen Stanley
Original Assignee
Univ Leland Stanford Junior
Univ Nat Yang Ming
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Leland Stanford Junior, Univ Nat Yang Ming filed Critical Univ Leland Stanford Junior
Publication of TR201808029T4 publication Critical patent/TR201808029T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1075—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against an enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Bu buluş, bir hücredeki bir birinci genin ekspresyonunun modüle edilmesine yönelik bir yöntem sağlamakta olup, burada birinci gen, 36'dan fazla CAG trinükleotit tekrarı içeren ve poliglutamin-aracılı protein agregasyonunu meydana getiren bir proteini kodlayan bir gendir. Birinci genin baskılanması, SPT4 geni veya SUPT4H geninin ekspresyonunun indirgenmesiyle elde edilmektedir. Bu ayrıca, bir Spt4/Spt5 kompleksinin veya bir Supt4h/Supt5h kompleksinin oluşumunun inhibe edilmesi vasıtasıyla da elde edilebilmektedir. Ayrıca, CAG-genişlemeli gen ürününün ekspresonu ve agregasyonunun modüle edilmesi veya Huntington hastalığı gibi bir poliglutamin hastalığının tedavi edilmesi için kullanılabilen bir maddenin belirlenmesine yönelik bir yöntem sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME GENISLEMIS TRI-NÜKLEOTID TEKRARI BARINDIRAN GENLERIN ZARARLI AKTIVITESININ SEÇICI SEKILDE INDIRGENMESI ÖNCEKI TEKNIK Poliglutamin (PolyQ) hastaliElarÇlgenetik olarak farklljüokuz bozukluktan olusan hastalilZlarI bir sIlElüllE Bunlar, Huntington hastallglEIHD), dentatorubraI-pallidoluysian atrofi (DRPLA), tercüme edilmis bir CAG'I tekrarlarII genislemesinden kaynaklandiglIan dolayÇlayrlEh CAG tekrarlîliiastalllîlarlîblarak bilinmektedir.
Genetik olarak farklüblan bu hastalilZlar taraflîitlan paylasllân yaygI bir fizyolojik özellik, bu hastalliîlardan muzdarip olan hastalar. beyinlerinde proteinli birikintilerin bulunmasIlÜ Bu hastalllZlarI her birinde, protein birikiminin farklElbir protein ile iliskili olmas. ragmen, tüm proteinler bir genislemis glütamin uzamasEbarlEUünaktadlE Bugüne kadar, hastalllZIa iliskili proteinlerdeki poIyQ sekansII bu genislemis glütamin uzamasütüm poIyQ hastalilZlarEUa bulunan, bilinen tek genetik mutasyondur.
TekrarI genislemesinin, genin protein kodlamayan bölgelerinde bulundugu, ilave tri-nükleotit tekrarlElhastalIJZIar mevcuttur. Bu tür tekrarlarI örnekleri, CAG veya CTG tri-nükleotit tekrarlarIüapsamaktadE Bu tür tekrarlarEkodlayan genler tarafIan kodlanan RNA, RNA baglama proteinlerini yanllgl sekilde lokalize eden veya regüle eden odak noktalarlîlneydana getirerek, zararlßtkilere yol açmaktadlEl PolyQ hastallElarlEllEl arasIa, HD, hastalarlE üzerindeki ylKiEZletkilerinden dolayElhalk araleUa muhtemelen en iyi bilinenidir. Hastalllgl kortekste veya striyatumda meydana gelen seçici nöronal hücre ölümleri ile iliskilidir. HastalarEhareketten, bilisten ve kisilikten mahrum bßkan, hastalar ve ailelerine ekonomik ve duygusal açin ciddi bedeller ödeten ölümcül ve acIiaslZl bir hastalllZIE HD'nin s[lZI[g]Çl BatDAvrupa'lElinsanlar araleUa özellikle yaygIlEl (yaklaslEl olarak 20,000'de 1). Ancak ne yalel ki bu korkunç hastaligll simdilik hiçbir tedavisi yoktur.
Bu günlerde, HD için uygun tedaviler, yalnlîta makroskopik semptomlar. yönetilmesiyle sIIlElllEl Örnegin, FDA taraflEUan kabul edilen en yeni bilesiklerden biri olan tetrabenazin, HD hastalarlEldaki hiperkinetik hareketlerin indirgenmesine yönelik bir ilaçtE Tetrabenazin, nörotransmiterlerin erken bozunmasIlZltetikleyen bir zesiküler monoamin tasMElZlWMAT) inhibitörüdür. Dolaylglýla, ilaç yalnlîta hastaligiI semptomunu tedavi etmektedir, hastaligi. kökenini degil. HD'nin tedavi edilmesinde kullanllân diger Ilaçlar, nöroleptikleri ve benzodiazepinleri kapsamaktadlEl Günümüzde bilinen hiçbir tedavi, HD'nin kökenindeki sebebe hitap etmemektedir.
Yukarlâla açlElandlglüüzere, HD'nin kökenindeki sebep, CNS hücrelerindeki bir gendeki, özellikle huntingtin (Htt) proteinini kodlayan Htt genindeki CAG tekrarlarII anormal sekilde genislemesidir. Normal bir insanda, Htt genindeki CAG nükleotit sekansII yaklasllZl 8 ila 25 kurucu tekrarülnevcuttur. Bir Hd hastasIia ise CAG tekrarlEayElÇBö veya daha fazla olacak sekilde genislemistir. Bu mutasyon türü dominant oldugundan dolayElHD gelistirebilmesi için bir insanlyalnlîl:a bir mutasyonlu huntingtin geni kopyasIBilmasEýeterlidir.
Hücre ve hayvan modeline yönelik güncel çallglnalar, mutant Htt taraflEUan meydana getirilen agregatlarlEl, HD'nin ilerleyisinde kritik bir role sahip olduguna dair kanlflhr sunmaktadE Mutant Htt proteinlerinin, proteolitik bölünmelere maruz kaldllZlarEUa, polyQ genislemesinin daha kisa fragmanlarIlZlarkalarIa bükabildikleri gözlemlenmistir. Eger mutant Htt'de çok fazla miktarda glutamin kopyasülnevcutsa, glutaminin polar dogasÇldiger proteinlerle gerçeklesen istenmeyen etkilesimlere yol açacaktE Özellikle, çok fazla miktarda glutamin kopyalela sahip mutant Htt, birbiriyle hidrojen baglarEblusturacaktB ve islevsel proteinler haline gelmekten ziyade kümelesecektir. Zamanla, biriken protein agregalarü nöronal hücrelere zarar vererek, hücre ölümüne ve hastada nörolojik kayba sebep olacaktB Protein agregalarII zararlEletkileri; protein agregalarII olusumunu inhibe edebilen kimyasal ayßçlarlül, hücrelerin hayatta kalnlarlügelistirdiklerini ve bir fare modelindeki HD patolojisini iyilestirdiklerini gösteren deneyler tarafIan desteklenmistir. Ancak, bu kan[tlhra karsüilmasa da, görünür agregalarlîil, genislemis polyQ bölgeleri içeren toksik proteinlere el koymak üzere hücrelerin kullandlglübir kopya yanLtZlEItemsil ettigi, kimi bilim insanlarEI tarafIan öne sürülmektedir.
Genislemis trinükleotit tekrar alanlar. sahip genler ile iliskili hastalIKIarEkonu alan çesitli yaklasIilar, önceki teknikte açiElanmlStlB Sanchez ve meslektaslarHNATURE, cilt 421, no: genislemis trinükleotit tekrar alanID(huntingtin) içeren bir gen hücresindeki zararllZl kullanIia yönelik bir genisletilmis trinükleotit tekrarEbölgesine sahip bir Sirna hedeflemeli mutant huntingtini açlElamaktadlE Furling ve meslektaslarEQGENE THERAPY, cilt 10, no. 9, 1 alanIEhedefleyen bir antisens RNA'sIlZJeksprese eden bir vektörün kullanIilZl/asißsüla DMPK islevinin yerine getirilmesini göstermektedir. 5950-5955), belirteç olarak indüksiyonun üzerine bir varyant huntingtin-EGFP füzyon proteini eksprese eden fare PC12 hücrelerindeki protein agregalarülusumu kullanilârak, bir mutant genislemis trinükleotit tekrar alanElçeren bir hedef gen taraflEUan kodlanan bir proteinin aktivitesinin, bir bilesik tarafIan modüle edilip edilmediginin belirlenmesine yönelik bir yöntemi açlElamaktadB KISA AÇIKLAMA Mevcut bulus, bir mutant genislemis trinükleotit tekrar alanEiçeren bir genden ortaya çilZlan bir hastallglliîl, bir sujedeki ilerleyisinin modifiye edilmesinde kullanla yönelik bir madde saglamakta olup, burada maddenin etkili bir miktar.. sujeye uygulanmasÇI sujedeki hastallgll ilerleyisinin modifiye edilmesi amaslsîla genin zararllîlaktivitesinin seçici bir sekilde indirgenmesi adlEla bir SPT4 aracll]1] transkripsiyonel aktiviteyi seçici bir sekilde indirgemektedir. Bulus ayrlîla, bir test bilesiginin; bir mutant genislemis trinükleotit takrar alanEliçeren bir hedef geni tarafIan kodlayan bir proteinin aktivitesini modüle edip etmediginin belirlenmesine yönelik bir yöntemi kapsamakta olup, yöntem asaglkileri içermektedir: bilesigin, SPT4 proteini aktivesini seçici bir sekilde modüle edip etmediginin ve hedef gen taraf-an kodlanan proteinin aktivitesini modüle edip etmediginin belirlenmesi adi, bir SPT4 proteinine faal olarak baglanan bir sinyal üretim sistemini içeren bir hücreye sahip bilesigin görüntülenmesi. Burada açllZlanan yöntemler ve bilesimler, birçok farklElJygulamada kullanllîhaktadlîj mutant genislemis trinükleotit tekrarlarIEl içeren genlerin varlfglEüe iliskili hastalllîldurumlarIlEl, örnegin Huntington HastallgllZüI (HD) önlenmesi veya tedavi edilmesi bunlara dahildir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Bu patentin dosyasürenkli sekilde sergilenen en az bir sekil içermektedir. Bu patentin, renkli sekillerin bulundugu kopyalarütalep ve gerekli ücretin ödenmesi üzerine Patent ve Marka Ofisi tarafIdan sunulacaktiü Sekil 1. SPT4 mutasyonu, azalan 97Q-Ade2 agregasyonunu saglamaktadIE (A) Koloni renklendirme demesi ilkesi Ade2 yetersizligi, AIR birikmesine yol açmaktadiüve beyazdan klülniîlýh renk degisimini saglamaktadlEi (B) Ade2, 25Q-Ade2 ve 97Q-Ade2 eksprese eden plazmid yapHârII diyagramlIlFüzyon proteinleri, bir N- terminal FLAG epitopu içermektdir ve GALJ baslat-I kontrolü aItIa eksprese edilmektedir. (C) Belirtilen yapilârlîélsprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri.
Hem yaban tipi (W303-1A) hem de izojenik h5p104A hücreleri, adeZ-I mutant alleline sahiptir ve glukoz ortamIia klan-I (D) polyQ-Ade2 agregalarII tespit edilmesi için filtreli tutma denemesinin sonuçlarEl(C)'de gösterildigi üzere lizatlar hücrelerden toplanmlStEve yalnlîta agregalmroteini tutan bir selüloz asetat (CA) zarEI üzerine bosaltilBilStE Zar üzerinde polyQ-Ade2'nin tutulumu, bir anti-FLAG antikorunun kullanIiglEimmünoblot vasüâsisîla tespit edilmektedir. Nitroselüloz (NC) zarlarII kullanI[g]Elbir delikli blot denemesi, bir yükleme kontrolü olarak dahil edilmistir. (E) Klon 23-44'teki transpozon modülü yerlestirme bölgesini gösteren diyagram. (F) Spt4'ün yoklugunda veya varllglEtia 97Q-Ade2'yi elsprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri Bos vektör 415 veya Spt4 ekspresyon yaplEIZHIS- SPT4 ile birlikte 97Q-ADE2 plazmidi, belirtilen hücrelere dönüstürülmüstür. Karsilllg gelen genlerin tüm açiKl okuma çerçevesinin silinmesi vasißsiýla spt4A i/e hsp104A, yaban tipi (WT) hücrelerden elde edilmistir. Hücreler, tek karbon kaynaglîlolarak galaktozun bulundugu ortamda büyütülmüstür. (G) spt4 mutant hücrelerindeki 97Q- Ade2 agregasyonunun analizi. (F)'de açilîlandlglüüzere hücrelerden elde edilen karsüâstlîllâbilir protein özütleri, CA zarlarlîüzerine bosaltUBiStlElve anti-FLAG antikoru ile immünoblot gerçeklestirilmistir. a-Tubulin (d-Tub), slot blot denemesi (NC zarDIl vasltâslýla incelenmistir ve bir yük kontrolü olarak islev görmüstür. Ayri& baklîillîl Sekil 2. Spt4, genislemis polQ tekrarlarEIçeren proteinlerin ekspresyonunu ve agregasyonunu seçici bir sekilde regüle etmektedir (A) 97Q-Ade2 ve 25Q- Ade2 eksprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri. (B) Hücresel 97Q- ve25Q-Ade2 protein ekspresyonunun ve agregasyonunun analizi. Slot blot'tan bir NC zarÇlpoIyQ- Ade2 protein seviyelerinin belirlenmesi adlEb anti-FLAG antikoru ile immünoblotlanmlstlEi o-Tubulin (o-Tub), yük kontrolü olarak islev görmüstür. PolyQ- Ade2 agregasyonu, bir filtreli tutma denemesi (CA zarüjvasitîhslîla degerlendirilmistir.
(C) 97Q- veya 25Q-Ade2 kodlayan mRNA ekspresyonu, Northern blot ile incelenmistir. mRNA'Iar, polyQ kodlama sekansiElügerçeklestiren bir prob vasitîiisiEa tespit edilmistir.
SCRl ile normalizasyondan sonra, 97Q-ADEZ eksprese eden WT hücrelerinde mRNA bollugu %100 olarak ayarlanmigtiü Karsilâstlülna maksadlýla, belirtilen her bir hücre türündeki mRNA bollugu gösterilmektedir. (D) Üst paneller, yaban tipi ve spt4A hücrelerindeki polyQ-araciHUeGFP agregasyonunun analizi. 29Q- veya 65Q-eGFP plazmid yapllârIlZi barIilün hücreler, 2, 4 ve 8 saatte gerçeklesen gen indüksiyonundan sonra floresan mikroskopi vasßslýla incelenmistir. Her bir zaman noktaslütla, 200 hücre incelenmistir ve odak noktalarII görünümü, eGFP agregasyonunun belirteci olarak tanilanmlgtiiîi Odak noktalarII bulunmad[giEi hücreler, “ diffüz leke” göstermesiyle tannlanmaktadlîi Alt panel, 65Q-eGFP agregalar. sahip olan hücrelerin sayED zamanI islevi olarak gösterilmektedir.
Veriler, ortalama dört bagIisIZI deneyin verileridir ve bar, standart sapmayEI göstermektedir. (E) thpZA hücrelerindeki 97Q-Ade2 ve 25Q-Ade2 protein ekspresyonu, bir slot blot denemesi (NC) vasitîâislsîla analiz edilmistir. Ayrlâ, bir filtreli tutma denemesi (CA) de kullanilIhlStB THPZ, THO kompleksinin bir alt birimini kodlamaktadE (F) 97- veya 25Q-Ade2 eksprese eden thpZA hücrelerinin koloni renk fenotipleri. AyrlEla bakIlZISekiller 9, 10 ve 11.
Sekil 3. spt4 mutant hücreleri, CAG tekrarlarII uzun bir gerilmesi vastfhslýla, bozulmus RNA polimeraz II transkripsiyonunu göstermektedir Yaban tipi hücrelerde ve spt4zl hücrelerinde, 29 veya 99 CAG tekrarEiçeren bir transkripsiyon geni üzerindeki RNA polimeraz II miktarÇI kromatin immünopresipitasyon vasiüsiýla belirlenmektedir. Alt paneller, CAG tekrarlarII çöktürülmüs DNA fragmanEüst aklglüiüprimer seti A kullanliârak incelenmekteyken, primer setleri B ve C, CAG tekrarlarII DNA alt aklSIarII tespit edilmesi için kullaniEniStlB TRPJ baslat_ özgü primer seti D, kontrol olarak dahil edilmistir. Üst panel, her bir PCR primer seti ile genisletilen DNA bölgesi, plazmid diyagramlîida gösterilmektedir.
Sekil 4. Kßa polyQ içeren proteinlerin ortak agregasyonu, spt4 eksikligi ile atenüe edilmistir (A) Belirtilen yapHârEieksprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri. Sekil 10'da açUZlandlglEüzere plazmid yapllârlîile birlikte 29Q-ADE2-HA, hücrelerin içerisinde birlikte verilmistir. (B) polyQ-AdeZ ekspresyonu agregasyonu, slülea, slot blot (NC) ve filteli tutma (CA) denemesi vasltâslîila degerlendirilmistir.
Anti-FLAG antikoru, 29Q-Ade2-HA, 29Q-Ade2 ve 99Q-Ade2'nin problanmasEliçin kullanl1]1îlken, anti-HA antikoru, yalnlîta 29Q-Ade2-HA'ythespit etmistir. (C) polyQ- Ade2 proteinlerini kodlayan transkriptlerin ekspresyonu, Northern blot ile incelenmistir. QQQ-ADEZ ve ZýQ-ADEZ-HAhI konumlarÇloklar ile gösterilmektedir.
Sekil 5. Supt4h, striyatal nöral hücrelerdeki 81Q-eGFP'nin ekspresyonunu, agregasyonunu ve toksisitesini regüle etmektedir (A) Solda, kontrol (NC si) veya Supt4h siRNA (Supt4h si) ile birlikte 7Q-eGFP or 81Q-eGFP plazmid yaplîElle transfekte edilen mürin ST14A striyatal hücreleri, floresan mikroskopi vasltâslýla izlenmistir. Sagda, faz kontrast görüntüleri gösterilmektedir. Alt panel, bu sartlar aItIa 81Q-eGFP odak noktalarlügösteren hücrelerin yüzdeleri. Gösterilen degerler, üç bagIisIZI deneye yönelik ± SD yollarIIE (B) siRNA son darbesi üzerine Supt4h ekspresyonundaki degisimler, Western blot vaslüslýJa analiz edilmistir. Numuneler araletla karsllâbilir transfeksiyon veriminin saglanmasEladI, pRC-CMV-MnSOD, birlikte transfekte edilmistir ve bunun protein ekspresyonu belirlenmistir. (C) polyQ- eGFP ekspresyonu agregasyonu, sßslsîla, slot blot (NC) ve filteli tutma (CA) denemesi vaslüsüla degerlendirilmistir. (D) 7Q-eGFP veya 81Q-eGFP eksprese eden ST14A hücrelerinin yasayabilirligi, Supt4h siRNA son darbesinin varllglld ve yoklugunda ölçülmüstür. Belirtilen polyQ-eGFP ve siRNA ile transfeksiyondan sonra, minimum miktarda (%05) serum içeren bir gelisim ortamIElzla hücreler kültürlenmiltir ce nöronal hücre farklllâsmasIIündüklenmesi amaclsîla 39°C'de tutulmustur. Kontrol siRNA'nI varllgllElda 7Q-eGFP eksprese eden yasayabilir hücrelerin saylglîll olarak ayarlanmlStIElve diger numunelerin ilgili hücre yasayabilirlikleri gösterilmektedir (*, ** P < 0.05, Student t-testi ile).
Sekil 6. Mutant Htt ekspresyonu, Supt4h asaglîlregülasyonu vasEhsüla seçici bir sekilde inhibe edilmektedir (A) Htt mRNA bollugu, es genli yaban tipi (HdhQ7/Q7) veya mutant huntingtin allellerine (HdhQm/Qm) sahip striyatal hücrelerdeki Supt4h siRNA son darbesini takinen RT-PCR ile incelenmistir. RNA polimeraz III taraf-an transkripsiyonu gerçeklestirilen U6, yük kontrolü olarak islev görmektedir. Supt4h'nin, referans genlerin pol II-bagIilEtranskripsiyonu üzerindeki etkisinin belirlenmesi için Tubala dahil edilmistir. Ayrlîla bakIlîl Sekil 12. (B) Supt4h siRNA son darbeleri tarafIan mRNA ekspresyonu üzerinde gerçeklestirilen degisimler, gerçek zamanllîqRT-PCR vaslgslîla degerlendirilmistir. Her bir mRNA, U6 ile normalize edilmistir ve kontrol siRNA ile transfekte edilen hücrelerdeki transkript bollugu, 1 olarak ayarlanmlgtlü (C) Supt4h siRNA transfeksiyonunun varl[gilEUa veya yoklugunda hücrelerdeki protein ekspresyonunun analizi. Toplam protein özütlerinin esit miktarlarÇlHtt, Supt4h, Tbp, ve o-Tubulin için immünoblotlanmlstlîl Tbp, TATA kutusu baglama proteini, kigla CAG tekrarEiçeren genlerin bir temsili olarak dahil edilmistir. (D) FarkIEgenIi Htt allellerine (HdhQ7/Q111) sahip striyatal hücreler, Supt4h siRNA ile transfekte eidlmistir ve protein ekspresyonu, (C)'de açikland[g]|]izere analiz edilmistir. HttQ7 and HttQill konumlarÇiokIar ile gösterilmektedir.
Sekil 7. Spt4 (Supt4h) asagEl regülasyonunun, CAG-içeren genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini ve sonucunu betimleyen model. RNA polimeraz II, bir klgia CAG tekrarEKklîiinlZJIe gösterilen) içeren bir DNA sablonu boyunca hareket ettiginde, transkript uzamasESpt4 tarafIan regüle edilmemektedir.
Ancak, transkripsiyon uzamasüjaha az verimli hale gelmektedir ve uzun bir CAG gerilmesi gende mevcut oldugunda, Spt4 gerektirmektedir. Normal Spt4 islevinin eksik oldugu hücrelerde, yalniîta, genislemis CAG tekrarügerilmelerine sahip olan ve genislemis polyQ proteinlerini kodlayan genler etkilenmektedir. Genislemis polyQ tekrarlarIEl (kareler) içeren proteinler, konsantrasyona bagIilEl bir sekilde agregasyona ugramaktadlEi(dikdörtgen).
Sekil 8. Sekil 1 ile ilgili olarak, spt4 eksikligi, Hsp104 proteini ekspresyonuna veya maya prionlarIa [PIM] müdahale etmemektedir (A) Hsp104maya prionu [PIM] ve polyQ agregasyonu arasiEUaki iliskiyi gösteren sematik bir diyagram. Maya hücrelerinde, polyQ agregasyonu prion [PIM] gerektirmektedir.
Hsp104, puIyQ agregasyonunu saglayabilmektedir ve [PI/if] EtarEiçin gereklidir, (8) RNQl-GFP isaretleme vasüiislsîla [PI/if] durumunun analizi. RNQl-GFP plazmid yaplîlZl hücrelerin içine verilmistir ve floresan mikroskopi vasigislýla izlenmistir. [PM/*Te sahip hücreler, GFP-pozitif odak noktalarßergilerken, GFP sinyali, [PI/V*]'In yetersiz oldugu hücrelerde dengeli biçimde daglEIlEraktadE WT ve hsp104D, sÜsMa, [Pi/if] için pozitif ve negatif kontroller olarak islev görmüstür. (C) Belirtilen hücrelerdeki Hsp104 protein seviyeleri, anti-Hsp104 antikorunun kullanllgEi immünoblotlama ile incelenmistir.
Sekil 9. Sekil 2 ile ilgili olarak, azalan protein bolluguyla sonuçlanan azaItIBnE 97Q-Ade2 gen transkripsiyonu, polyQ proteini agregasyonunu önlemektedir (A) Rafinoz ön kültürlemeden önce WT hücreleri, GAL1 baslat-I kontrolü altIa 97074052 gen ekspresyonunun ündüklenmesi adiEb, belirtilen glukoz konsantrasyonlar- ilaveten %2 galaktoz içeren ortamda büyütülmüstür. Giderek azalan baslatlEEIaktivitesi, glukoz konsantasyonundaki artE olarak görülmektedir (Biggar, S.R., and Crabtree, G.R. (2001). Hücre sinyali, ikili veya kademeli indüksiyondan sonra, hücreler toplanmlgtlîlve 97Q-ADEZ mRNA seviyeleri, bir polyQ probunun kullanIIglüNorthern blot vasiüslýla analiz edilmistir. SCR1 transkript seviyeleri, bir yük kontrolü olarak islev görmüstür. spt4D hücrelerindeki 97Q-Ade2 proteininin ekspresyonu ve agregasyonu, süslîzla, slot blot (NC) ve filteli tutma (CA) denemesi vasiliislýla degerlendirilmistir. FLAG-epitopuna karsElantikor, 97Q-AdeZnin tespit edilmesi için kullanüüîlgtlü (C) (A)'da açilZIandgEilizere gelisim ortamIaki 97Q-ADEZ ekspresyon hücrelerinin koloni renk fenotipleri. WT (W303-1A) hücreleri, adeZ-J mutant allele sahiptir ve bos vektöre veya galaktoz-indükleyebilen AOL-'Zye sahip bu hücre, bir kontrol olarak dahil edilmistir.
Sekil 10. Sekil 2 ile ilgili olarak, Spt4, özellikle uzun CAG tekrar gerilmelerine sahip genlerin ekspresyonu için gereklidir (A) 99Q-Ade2 veya 29Q-Ade2 eksprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri. Bu haberci proteinlerde, 97Q-Ade2 ve 25Q-Ade2'den farklElolarak, ardISlKl glutamin kaIlEtilârü yalnlaa CAG tekrarlarEtaraflEUan kodlanmaktadlEl (B) POIyQ-Ade2 ekspresyonu ve agregasyonu, sÜsMa, slot blot (NC) ve filteli tutma (CA) denemesi vasßslýla degerlendirilmistir.
Anti-FLAG antikoru, haberci proteinlerin tespit edilmesi için kullanllîhlgtlrîl (C) Belirtilen hücrelerdeki 99Q-Ade2 veya 29Q-Ade2'yi kodlayan mRNA seviyeleri, bir polyQ probunun kullanIiglENorthern blot ile analiz edilmistir. SCR1 ile normalizasyondan sonra, 99Q-ADEZ eksprese eden WT hücrelerindeki mRNA seviyesi %100 olarak ayarlanm Etlîl Diger hücrelerdeki ilgili mRNA seviyeleri gösterilmektedir.
Sekil 11. Sekil 2 ile ilgili olarak, Bir spt5 SF mutantÇl genislemis CAG tekrarlarIa sahip genlerin ekspresyonunu spesifik olarak basküîimaktadlîl (A) 99Q-Ade2 or 29Q-Ade2 eksprese eden hücrelerin koloni renk fenotipleri. spt5 SF hücreleri, bir Spt4/5 kompleksinin olusumunu ketleyen spesifik bir SPTS S324F nokta mutasyonunu tasIiaktadB(Guo, M., Xu, F., Yamada, J., Egelhofer, T., Gao, Y., Hartzog, G.A., Teng, M., and Niu, L. (2008). Core structure of the yeast spt-4-spt5 complex: a conserved module for regulation of transcription elongation. Structure 16, filteli tutma (CA) denemeleri vasiÜislsîla incelenmistir. (C) polyQ-Ade2 kodlayan mRNA seviyeleri, bir polyQ probunun kullan-[gllîNorthern blot ile analiz edilmistir. SCR1 ile normalizasyondan sonra, QQQ-ADEZ eksprese eden WT hücrelerindeki mRNA seviyesi ve (E) Hsp104 protein ekspresyonu ve maya prionlarl:[P[A/*], Sekil 8'de aç[lZland[g]I:l üzere spt5SF hücrelerinde analiz edilmistir.
Sekil 12. Sekil 6 ile ilgili olarak, CAG tekrarlarII uzun bir gerilmesi, HD hastasIdan aIIan fibroblastlardaki azalan Httekspresyonu ile iliskilidir (A) Yaban tipi ve mutant allellerden Htt proteini ekspresyonu, Coriell Enstitüsünden elde edilen, belirtilen hücrelerin immünoblotlanmasEile incelenmistir. GM04795, normal bir fibroblast hücre hattIlEI (B) GM09197'de, yukari gösterildigi üzere, bir gag trinükleotitinin, mutant Httalleli tarafIan silindigi bir polimorfizm mevcuttur (Zhang, Y., Engelman, J., and Friedlander, R.M. (2009). AIIele-specific silencing of mutant Huntington's disease gene. J Neurochem 108,82-90.) Yaban tipini mutant Htt'den aylîilnak üzere bu bölgeyi (klîrlnlîmkateden primerler tasarlamglbulunmaktaylîl Htt ekson 60'Etiavlayan bir primer (5'-cgaggatctcgtcttctgaag-3') ile birlikte yaban tipi (WT) primer, bir sablon olarak W plazmidini kullanan bir PCR vasltBasls-Lla, bir 305 baz çifti fragmanII yükseltilmesi Için kullanUIhlStlEl Mutant (Mu) primer, M plazmidi kullanI[g]Ia karsllâstlîllâbilir bir amplifikasyon verimi sergilemistir. W ve M plazmidleri, slHisEIa GM09197 yaban tipi ve mutant Htt mRNA'nlEJ ekson 57'sinden ekson 61'ine kadar olan bir sekans içermektdir. (C) GM09197'deki Htt allellerinin ekspresyonu, (B)'de aç[lZ|anan primerler kullanilârak, RT-PCR vasißslýla analiz edilmistir.
A YRINTIU AÇIKLAMA Bulusun birinci yönü, bir hücredeki genleri içeren mutant genislemis trinükleotit tekrarII zararIElaktivitesini seçici bir sekilde indirgeyen maddeler ile ilgilidir. Bir mutant genislemis trinükleotit tekrarEliçeren genin zararlüaktivitesi (örnegin burada kodlanan ürünlerin toksisitesi ve/veya islev bozuklugu), SPT4 aracll]]]transkripsiy0nel aktivitenin seçici bir sekilde azaltllîhaslîlvaslßslîzla seçici bir sekilde indirgenmektedir. Ayrlaa, bulusun bir ikinci yönü, bulusun birinci yönünde kullanilân maddelerin belirlenmesine yönelik denemeler ile ilgilidir.
Mutant genislemis trinükleotit tekrarlarlEl içeren genlerin varllglEl ile iliskili hastaIlEl durumlarlillEl, örnegin Huntington Hastal[g]lZülE] (HD) önlenmesi veya tedavi edilmesinde, bu Mevcut bulus asagüh daha ayrlEtEEEElbir sekilde açlEIanmadan önce, bu bulusun, burada aç[Elanan belirli yapüândlîrlnalarla sIIHIEblmad[gll,`_ldegiskenlik gösterilebilecegi anlasUE1alIB Burada kullanllân terminoloji, yalnlîta belirli yapllândlElnalarI açlEIanmasü amaclýla kullanllîhaktadlüve mevcut bulusun kapsamEi/alnlîta ekli istemler ile sIlEllandlEllâcaglEUan dolaylÇbIlElandlEEEJImasßimaçlanmamaktadB Deger aralllZlarII verildigi yerlerde, baglam açlla bir sekilde aksini gerektirmedikçe alt limit biriminin ondallgl- kadar, verilen aral[glI üst ve alt limiti arasIaki her bir ara deger ve belirtilen arallthaki belirtilen herhangi bir diger deger veya ara degerin, bulusun kapsamlZl aItIda oldugu anlasllE1alIIEl Bu küçük arallElarI üst ve alt sIlîliarÇIbagIisE olarak daha küçük aralllîlara dahil edilebilmektedir ve ayrlEla belirtilen arallthaki, spesifik olarak dlglarlöla büküân herhangi bir SI& baglüolarak, bulusun kapsamElaltIadB Belirtilen aralllZl sIIlEIlar birini veya her ikisini birden kapsadlglia, kapsanan bu sIlEltarlEl birini veya her ikisini birden disari bükan aralllîlar da bulusun kapsamBItIadE Belirli aralllZlar, “yaklasllZl' terimi ile baslayan saylîlal degerler valeisls-Lla burada verilmektedir. yaklasllZJ olan bir saylýa literal destek saglanmaslZlamacEla burada kullanüü1aktadlü Bir sayIlEl, belirtilen sayma yakI olup olmadlgljieya buna yaklasllZl olup olmadlglEbelirlenirken, yakI olan veya yaklasan belirtilmemis sayüsunuldugu baglamda, spesifik olarak belirtilen sayII esas es degerini saglayan bir sayßlabilmektedir.
Aksi tanIiIanmad[gll3ürece, burada kullanüân tüm teknik ve bilimsel terimlerin anlamlarübu bulusun ait oldugu teknikte orta derecede uzman bir kisi tarafEUan yaygI bir sekilde anlasIlglEgibidir. Burada açlKlananlara benzer veya bunlarla esdegerde olan herhangi bir yöntem ve malzeme, mevcut bulusun uygulanmaslda veya test edilmesinde de kullantlâbilmesine ragmen, temsili örnek niteligindeki yöntemler ve malzemeler burada açllZlanmaktadE Herhangi bir yay.. referanslÇldosyalama tarihinden önceki tarifnamesine yöneliktir ve mevcut bulusun, önceki teknik olarak bu tür yaylElara eski tarih atma yükümlülügünde olmadlgll dair bir kabul anlamIa yorumlanmamalIE AyrlEla, burada sunulan yayIIar tarihleri, esas yayI tarihlerinden farkIEblabilmekte olup, bunun ayrlîla dogrulanmasgerekebilmektedir.
Burada ve ekli istemlerde kullanIlglEl üzere “bir” gibi tekil formlar, baglam aksini gerektirmedikçe çogul göndergeleri de kapsamaktadlEl Ayrlîla, herhangi bir opsiyonel elemanlEl kapsam dlgEla çllZlarlEhasüd. istemlerin taslagII hazlEllanabildigi de göz önünde bulundurulmalIlE Bundan ötürü, bu aç[lZlamanI; istem elemanlarII yeniden aktarlElle baglantiEiElolarak "sadece," “yalnlîta” ve benzeri gibi kapsaylElIlolmayan terminolojinin kullanIiEl/eya bir “negatif" sIIlÜandlElnan kullanIi- yönelik olarak bir ön temel olarak islev görmesi amaçlanmaktadlEl Bu tarifnamenin okunmasEilizerine teknikte uzman kisiler tarafIan anlasilâcaglîgibi, burada açilZIanan ve gösterilen bireysel yapilândlElnaIarI her biri, diger herhangi bir yapllândlElnanI özelliklerinden kolayca ayrüâbilen veya bununla birlestirilebilen belirli bilesenlere ve özelliklere sahiptir. AçiKIanan herhangi bir yöntem, açilZlanan etkinliklerin sßsia veya mantiElan mümkün olan herhangi bir sßda gerçeklestirilebilmektedir.
YÖNTEMLER YukarlZlla özetlendigi üzere, bulus; genislemis bir trinükleotit tekrarüçeren bir genin zararlEl etkisini seçici bir sekilde indirgeyebilen maddeleri açilZIamaktadB Diger bir deyisle, bulusun yapüândlülnalarügenin hücre içindeki zararIEl/e zedeleyici aktivitesini içeren bir genislemis trinükleotit tekrarII idirgenmesine yönelik bir maddeyi kapsamaktadlB Bu maddeler söz konusu aktiviteyi indirgediklerinden dolayü uygun kontrole klýlasla bu tür aktivitenin indirgenmesine yol açmaktadEllar.
Bu baglamda, bulusta kullanilâbilen maddeler, hedef genin zararllîlaktivitesine yönelik seçici indirgemeye ragmen, hedef genin istenen fizyolojik aktivitesinin mevcudiyetine yol açmaktadE Bulusun yapllândlElnaIarIa indirgenen hedef genin zararIEl etkisi veya aktivitesi degisebilmekte olup, burada zararlllktiviteler, toksisite (örnegin, protein agregasyonunun bir sonucu olarak), islev kaybEl/e benzerini kapsamaktadü ancak bunlarla sIlEliEtlegiIdir. Bu sekilde, bazthlurumlarda yöntem, bir hedef gene atfedilebilen toksisitenin indirgenmesiyle sonuçlanmakta olup, burada toksisite indirgemesinin büyüklügü degisebilmektedir, ve bazEl durumlarda, uygun bir kontrole klîlasla 2 kat veya daha fazla, örnegin 10 kat veya daha fazla dahil 5 kat veya daha fazla olabilmektedir. Asagi daha ayrlEtlIJDiJir sekilde açiElandiglülizere, toksisite birçok farklEIyoIla indirgenebilmekte olup, bu, belirli bir hedef gene bagllZl olabilmektedir. BazEUurumlarda, örnegin hedef genin, hedef gen taraflîidan kodlanan bir üründe genislemis poIyQ alanlarII mevcudiyeti ile sonuçlanan bir genislemis CAG tekrarEI içermesi durumunda, toksisite indirgemesine, hedef gen tarafIan kodlanan ürünlerin agregasyonundaki bir indirgeme eslik edebilmektedir. Bu gibi durumlarda, agregasyon indirgemesinin büyüklügü degisebilmektedir, ve bazlîrliurumlarda, indirgeme büyüklügü 2 kat veya daha fazla, örnegin 5 kat veya daha fazla ve hatta 10 kat veya daha fazla olabilmektedir. Protein agregasyonu, herhangi bir uygun protokolün kullanHB'iasMa denenebilmekte olup, protokol tarifnamesinin buraya referans maksadlýla dahil edildigi, protokolleri kapsamaktadlü ancak bunlarla sIlHllîlegildir.
Yukari bahsedildigi üzere, tarifnamenin yöntemleri ile indirgenen zararllltki veya aktivite, hedef gen tarafIan kodlanan bir ürünün islev kaybEblabilmektedir. Bu gibi durumlarda, hedef gen tarafIan kodlanan yaban tipteki veya normal aktivite, tamamen olmasa bile en az-an klgmen zarar görebilmektedir, zira hedef gen, genislemis trinükleotit tekrarIlj içermektedir. Bu durumlarda, hedef geni ürününün istenen islevinin artiEIlBiasEl/asliiisüla islev kaybEtamamen olmasa bile en azlEUan klgnen tersinebilmektedir. Kodlanan ürünün istenen islevi, uygun bir kontrole klýbsla istatistik olarak önemli bir miktarda artlElâbilmekte olup, burada istenen aktivitedeki artlglEl büyüklügü 2 kat veya daha fazla, örnegin hatta 10 kat veya daha fazla dahil 5 kat veya daha fazla olabilmektedir.
Hedef gen, bir mutant genislemis trinükleotit tekrarEliJarIEUßn bir gendir. Burada kullanIEgllII üzere “gen” terimi, bir ürünü kodlayan veya bunun üretimini saglayan ve bir baslatlEÇl intronalr, eksonlar ve artlElEliâr içeren bir kromosomun tanIiIEbir bölgesi veya klginIlEl Mutant genislemis trinükleotit tekrarlîlaynlîüç nükleotitin çoklu bitisik tekrarlarIEbarEtlEin bir genin bir alanlIQyani bölgesi) anlamlEb gelmektedir, burada murant genislemis trinükleotit tekrarII uzunlugu veya belirli bir sekansEl degisebilmektedir ve mutant genislemis trinükleotit tekrar alanÇlgenin normal versiyonlar-a mevcut degildir. Genislemis trinükleotit tekrar alanü hedef genin kodlamallîl veya kodlamallîl olmayan bölgesinde mevcut olabilmektedir. Yapllândlüinalarda, mutant tekrar alanlîlMiyotonik distrofiye (DM) yol açan, distroû miyotonika-protein kinazEgeninin 3' tercüme edilmemis bölgesinde konumlandlEllân CT G genlesmesi gibi, hedef genin kodlamaslîlbölgesinde bulunabilmektedir. Bazülurumlarda, mutant tekrar alanühedef genin bir kodlama bölgesinde bulunabilmektedir, böylelikle bazEI durumlarda, bunun hedef gendeki mevcudiyeti, gen tarafIan kodlanan bir üründeki ilgili bir alan veya bölge (örnegin polyQ alan lIlile sonuçlanmaktadlEl Mutant, genislemis trinükleotit tekrarÇl nükleotit bilesimine ve uzunluga göre degisebilmektedir. Ilgi odaglEUaki belirli trinükleotitler, sIlHlandlEllüiamak üzere sunlarlZl içermektedir: CAG, CT G ve benzeri. Bazlîrliurumlarda, genislemis trinükleotit tekrar alanIZlbir CAG tekrar alanIE CAG tekrar alanlElI belirli uzunlugu, zararlüaktiviteyle sonuçlanmasü kosuluyla spesifik hedef gene göre degisebilmektedir ve bazlîlurumlarda 25 tekrar veya daha fazla, örnegin 35 tekrar veya daha fazlasEUahil olmak üzere 30 tekrar veya daha fazla olabilmektedir. Spesifik hedef genler, bununla iliskili olan hastalilZlar ve genislemis CAG tekrarlarII tekrar sekanslarII spesifik uzunlugu, asaglöilaki Tablo 1'de sergilenenleri kapsamaktadlEl(ancak bunlarla sIlElllîlegildir).
HastallKI Gen ismi/protein ürünü Patojenik tekrar uzunlugu Spinoserebellar ataksi tip 1 SCA1 SCAJ/ataksin 1 40 ~ 82 Spinoserebellar ataksi tip 3 SCA3(MJD) 5CA3/ataksin 3 61 ~ 84 Spinoserebellar ataksi tip 7 SCA7 $CA7/ataksin 7 37 N 306 Dentatorubral pallidoluysian atrofi DRPLA DRPLA/atrofin 1 49 ~ 88 Spinal veya bular müsküler atrofi SBMA AR/androjen reseptörü 38 ~ 62 Huntington hastallglü HD Htt/huntingtin 40 ~ 121 Uygulanan belirli yapllândlElnalara baglElolarak, birçok farkllZltürdeki aktif maddeler kullanilâbilmektedir. Bazüdurumlarda, ekspresyonu takiben madde, proteinin aktivitesini modüle etmektedir, böylelikle madde, hedef genden protein ekspresyonunu takiben, hedef gen tarafIan kodlanan proteinin aktivitesini degistiren bir maddedir. Bu durumlarda, madde, dogrudan hedef gen tarafIan kodlanan protein birlikte hareket edebilen bir maddedir. Bu durumlarda, madde; kodlanan protenin zararIEl aktivitesini, örnegin agregasyonunu seçici bir sekilde indirgeyen, ancak kodlanan proteinin faydallîaktivitesini en azlEUan tespit edilebilir bir seviyede tutan veya artlßn bir madde olabilmektedir. Belirli yapllândlElnalarda, protein agresyonu inhibitörleri degildir, ancak bunun yerine, baska bir mekanizma vasitâslýla, örnegin agregasyona uygun olan hücredeki protein miktarIü azaltarak, agregasyon egiliminden bagIislZl olarak hücrelere zarar veren bir proteinin üretimini azaltarak, kodlanan proteinin yanllgl katlanmasIlIlönIeyerek, proteinin zararllII aktivitesini seçici bir sekilde indirgeyebilmektedir.
Baska durumlarda ise madde, genden RNA'nI ve/veya proteinin ekspresyonunu modüle etmektedir, böylelikle bir sekilde hedef genden RNA veya protein ekspresyonunu degistirmektdir. Bu durumlarda, madde, RNA veya proteinin ekspresyonunu birçok farkIEl sekilde degistirebilmekte olup, ilgi odagIaki maddeler, seçici SPT4 modülatör maddelerini kapsamaktadE Seçici SPT4 modülatör maddeler, bir hücredeki SPT4 aktivitesini seçici bir sekilde degistiren, örnegin bir hücredeki SPT4 aktivitesini azaltan maddelerdir. BazEl durumlarda, aktif madde taraflEUan modüle edilen, örnegin azaltllân hedef SPT4 aktivitesi, bir transkripsiyon aktivitesidir ve özellikle, uzun nükleotit tekrar alanlarÇIörnegin uzun CAG tekrar alanlarEl/asltâslsîla RNA polimeraz II isleyebilirligini baslatan bir aktivitedir. Bu tür maddeler tarafIan modüle edilen hedef SPT4 aktivitesi, bir SPT4 proteininden kaynaklanan bir aktivitedir. Burada kullanllglELizere SPT4 proteini terimi, topluca, yalnlîta maya Spt4 proteinlerine degil, aynleamanda bunlarI memeli homologlar., örnegin insan SUPT4H; mürin Supt4h, vb. isaret etmektedir. Bu sekilde, aktivitesi, seçici SPT4 modülatör maddeler tarafIan module edilebilen, ilgi odagIaki SPT4 proteinleri, sIlEIlandIElIhamak üzere sunlarlZRapsamaktadlB 5, cerev/siae Spt4; insan SUPT4H ve mürin Supt4h.
Kullanllân madde bir SPT4 modülatör maddesi oldugunda, modülatör madde; bir hücreye verilmesinin üzerine hücrenin SPT4 aktivitesini degistiren ve sujedeki genislemis trinükleotit tekrarljaracllESPT4 transkripsiyon aktivitesini Indirgeyen herhangi bir madde olabilmektedir.
SPT4 modülatör madde, birçok farkllîlsekilde aktiviteyi modüle edebilmektedir; örnegin bir SPT4 proteinin ekspresyonunu indirgeyerek, bir SPT4 proteinin baska bir proteine, örnegin SPT4 ile etkilesen bir proteine (örnegin Spt5 veya SUPTSH gibi bir SPTS proteini) baglanmasIEinhibe ederek, vb. FarklEllürdeki modülatör maddelerin örnekleri, asag- daha ayrlEtEElIlliir sekilde incelenecektir.
Belirli yapllândlElnalarda, madde, islevsel bir SPT4 proteinin ekspresyonunu indirgeyen, örnegin inhibe eden bir maddedir. SPT4 proteini ekspresyonunun inhibisyonu, SPT4 protein ekspresyonunu inhibe eden bir maddenin kullanIilIilla dahil olmak üzere herhangi bir uygun yöntemin kullanilBiasEile gerçeklestirilebilmekte olup, söz konusu madde, sIEIlandlEllüîamak üzere sunlar olabilmektedir: antisens maddeleri, RNAI maddeleri, örnegin rekombinant teknikleri, vb. vasltâsElai SPT4 geninin bir baslatlEElsekansI baglanan transkripsiyon faktörüne veya SPT4 geninin inaktivasyonuna müdahale eden maddeler. Örnegin, antisens molekülleri, hücredeki bir SPT4 geninin aktivasyonunun asaglýla dogru regüle edilmesinde kullanllâbilmektedir. Anti-sens ayraclZl antisens oligodeoksinucleotitleri (ODN), özellikle yerli nükleik asitlerden veya bu tür anti-sens moleküllerini RNA olarak eksprese eden nükleik asit yapiiârlüdan kimyasal modifikasyonlar saglayan sentetik ODN olabilmektedir. Antisens sekansÇl hedeflenen proteinin mRNA'lellEl tamamlay-lEl ve hedeflenen proteinin ekspresyonunu inhibe etmektedir. Antisens molekülleri, çesitli mekanizmalar vasßslîla, örneginRNAse H'nin aktivasyonu yoluyla, tercüme için uygun olan mRNA miktarII veya sterik engelin indirgenmesi vaslßslýla gen ekspresyonunu inhibe etmektedir. Bir antisense molekülü veya bunlari bir kombinasyonu uygulanabilmekte olup, burada bir kombinasyon, farklBekanslarERapsayabilmektedir.
Antisens molekülleri, uygun bir vektörün içerisinde, hedef gen sekansII tümünün veya bir klginIlEl ekspresyonu vaslüsMa üretilebilmekte olup, burada transkripsiyonun baslamasübir antisens zinciri, bir RNA molekülü olarak üretilecek sekilde yönlendirilmektedir. Alternatif olarak, antisens molekülü, bir sentetik 0Iigonükle0tittir. Antisens oligonükleotitleri, genel olarak, uzunluk bakIiIan en az yaklasüZl 7, genellikle en az yaklasDZl 12, daha genellikle en az yaklasilZlZO nükleotit olacaktlElve uzunluk hakli-an yaklas[lZlSOO nükleotitten daha fazla olmayacaktlEl genellikle yaklasilZlSO'den daha fazla olmayacaktEl daha genellikle 35'ten daha fazla olmayacaktlB burada uzunluk; çapraz-tepkenligin yoklugu dahil olmak üzere inhibisyon verimi, spesifiklik ve benzeri taraflEUan belirlenmektedir. Uzunluk bakIilEUan 7 ila 8 bazIEI olan kisa oligongkleotitlerin, gene ekspresyonu bakIiIan güçlü ve seçici olabildikleri Endojen yolcu dizi mRNA sekansII spesifik bir bölgesi veya bölgeleri, antisens sekansEl tarafian tamamlanmak üzere seçilmektedir. Oligonükleotit için bir spesifik sekansII seçilmesi süsIa ampirik bir yöntem kullanllâbilmekted olup, burada çesitli aday sekanslar, bir in vitro veya hayvan modelinde hedef genin ekspresyonunun inhibe edilmesine yönelik olarak denenebilmektedir. SekanslarI bir kombinasyonu da kullanllâbilmekte olup, burada mRNA sekansII çesitli bölgelerinin, antisens tamamlamasliilsn seçilmektedir Antisens 0Iigünükleotitleri, teknikte bilinen yöntemler tarafli-Klan kimyasal olarak sentezlenebilmektedir (bakllîl Wagner ve meslektaslarEl(1993), supra, ve Milligan ve meslektaslarüsupra.) Intraselüler stabilitelerinin ve baglama afinitelerinin artlîllîhasüaduîb oligonükleotitler, yerli fosfodiester yap-an kimyasal olarak modifiye edilebilmektedir.
OmurganlEl, sekerlerin veya heterosiklik bazlar. kimyasIEl degistiren bu tür modifikasyonlardan birkaçEDteratürde açIKlanmStlEI Omurga kimyalellEl kullanlglîljegisimler arasia fosforotioatlar; köprülemesiz oksijenlerden her ikisinin sülfür ile ikame edildigi fosforoditioatlar; fosforoamiditler; alkil fosfotriesterler ve boranofosfatlar bulunmaktadlü Akiral fosfat ütrevleri 3'-O'-5'-S-fosf0r0tioat, 3'-S-5'-O- fosforotioat, 3'-CH2-5'-O-fosfonat ve 3'-NH-5'-O-fosf0roamidatElkapsamaktadlü Peptit nükleik asitleri, tüm riboz fosfodiester omurgasElile peptit baglant-Eldeistirmektedir. Seker modifikasyonlarü ayriEla, stabilitenin ve afinitenin artiEllüiasü Için kullanHBiaktadlEI Deoksiribozun o-anomeri kullanllâbilmekte olup, burada baz, dogal natural ß-anomere döre evirtilmektedir. Riboz sekerinin 2'-OH'si, afinite içermeksizin bozunmaya direnç saglayan 2'- O-metil or 2'-O-aIIiI sekerlerinin meydana getirilmesi için degistirilebilmektedir. Heterosiklik bazlarI modifikasyonu, uygun baz eslesmesini korumalIlEl KullanISIEl bazEl ikameler deoksitimidin için deoksiuridin; deoksisitidin için 5-metiI-2'-deoksicitidin ve 5-bromo-2'- deoksisitidini kapsamaktadlEl 5- propinilI-2'-deoksiuridin ve 5-propinill-2'-deoksisitidinin, sßsüla deoksithimidin ve deoksisitidin için ikame edildiginde afiniteyi ve biyolojik aktiviteyi artül lg'lügiösterilmistir.
Antisens inhibitörlere bir alternatif olarak, katalitik nükleik asit bilesikleri, örnegin ribozomlar, anti-sens konjugatlarü vb. gen ekspresyonunun inhibe eidlmesi için kullanllâbilmektedir.
Ribozomlar in vitro sekilde sentezlenebilmektedir ve hastaya uygulanabilmektedir veya hedeflenen hücrede ribozomun sentezlendigi bir ekspresyon vektörü üzerinde kodlanabilmektedir (örnegin, bakIlZl International patent application WO 9523225, ve oligonükleotit örnekleri, WO 9506764 numarallîpatent dokümanEUa açllZIanmaktadlEl mRNA hidrolizlerine aracillEiedebilen, bir metal komplekse sahip anti-sens ODN konjugatlarüörnegin referansEUa açlKlanmaktadB Ilaveten, bir SPT4 proteinin transkripsiyon seviyesi, RNAi maddelerinin, örnegin çift-Zincirli RNA'nI kullanIIgiEgen susturma vasiüislîla regüle edilebilmektedir (Sharp (1999) Genes and Development 13: veya küçük interferansIEl RNA (siRNA) gibi RNAi, nematod C. eleganlarIa kapsamIEl bir sekilde genlerin “devrilmesinde” rutin bir sekilde kullanilüîaktadE RNAI maddeleri, dsRNA veya dsRNA'nI bir hücrede üretilmesi için kullanilâbilen ribonükleik asite müdahale eden bir transkripsiyonel sablon olabilmektedir. Bu yapilândlElnalarda, transkripsiyonel sablon, interferanslljlibonükleik asidi kodlayan bir DNA olabilmektedir. RNAi ile iliskili olan yöntemler olup, bunlarI tümü, referans maksadlýla buraya dahil edilmistir. dsRNA, sentetik kimyasal yaklasIiIIar yanlis& in vitro ve in vivo yöntemler dahil olmak üzere, teknikte bilinen birkaç yöntemden herhangi birine göre hazlElianabilmektedir. Bu yöntemlerin örnekleri, sIlEliandlEllBiamak üzere, her birinin, tüm yanlarlîla referans olarak buraya dahil edildigi yöntemleri kapsamaktadlîl Tek-Zincirli RNA ayrlîia, enzimatik ve organik sentezlerin kullanllüîaslýla veya tamamen organik sentezler vasltâslýia üretilebilmektedir. Sentetik kimyasal yöntemlerin kullanIilJistenen modifiyeli nükleotitlerin veya nükleotit analoglarIlEJ, dsRNA'ya verilmesini mümkün kHBiaktadlB dsRNA ayrIEla, birkaç oturmus yönteme göre in vivo sekilde hazlEllanabilmektedir (bakIlîJ örnegin, Sambrook, ve meslektaslarEl(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Transcription and Translation (B.D.
Hames, and S.J. Higgins, Eds., 1984); DNA Cloning, volumes I and II (D.N. Glover, Ed., 1985); ve Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed., 1984, her biri, tümüyle referans maksadlýla buraya dahil edilmistir). DsRNA'nIEI, bir hücreye veya örnegin bir hücre kültürü, doku, organ veya embryo gibi hücre popülasyonlarlEb verilmesine yönelik olarak birkaç seçenekteri faydalanllâbilmektedir. Örnegin, RNA, intraselüler olarak dogrudan verilebilmektedir. Çesitli fiziksel yöntemlerden, genellikle, örnegin mikroenjeksiyon ile uygulama gibi durumlarda faydalanüâbilmektedir (bakIlîJ örnegin, Zernicka-Goetz, ve Chromosoma 107: 430-439). Hücresel dagEElEia yönelik diger seçenekler, hücre zari. geçirgen hale getirilmesi ve dsRNA'Iljbrtamda elektroporasyon, Iipozom-aracmilransfeksiyon veya kalsiyum fosfat gibi kimyasallari kullanIlgiEtransfeksiyonu kapsamaktadlü Oturmus gen terapi tekniklerinden birkaçlEhan da dsRNA'nI bir hücreye verilmesi için faydalanllâbilmektedir. Bir viral yapII bir viral tanecik içine verilmesi vasßslýla, örnegin, bir ekspresyon yap-I hücre içine etkili bir sekilde verilmesi ve yaplîltarafIan kodlanan RNA'nI transkripsiyonu elde edilebilmektedir.
Bir baska yapilândlüinada, islevsel bir proteini eksprese etmemesi için SPT4 geni inaktive edilmektedir. Inaktif; örnegin bir hedef genindeki genislemis trinükleotit tekrarlarII bir bölgesi vasiüslîtla en azIdan SPT4 transkripsiyon aktivitesine göre islevsel bir SPT4 proteini eksprese edememesi ad. genin, örnegin kodlama sekansüve/veya bunun regülatör elementlerinin, genetik olarak modifiye edilmesi anlamlEla gelmektedir. Bir degisim veya bir mutasyon, örnegin bir veya daha fazla nükleotit kallEt-I silinmesi vasüslýla, bir veya daha fazla nükleotit kallEt-I allgrverisi ve benzeri vasltâislgla, birçak farklüformu alabilmektedir. Kodlama sekanletla bu tür degisimlerin yapiIB1asII bir yolu, homolog rekombinasyon vasüslýladlîl Homolog rekombinasyI vasitâsüa hedef gen modifikasyonlarII meydana getirilmesine yönelik yöntemler teknikte bilinmekte olup, su ,612,205; bunlar tarifnameleri, referans maksadlýla buraya dahil edilmektedir.
AyrEla belirli yapllândlîilrialarda, SPT4 proteinlerinin dominant negatif mutantlarEügi odagIlîJ burada bu tür mutantlarI hücredeki ekspresyonu, bir hücredeki genislemis trinükleotit tekrarlarII SPT4 arac[l]]Zl transkripsiyonundaki bir modülasyonla, örnegin azalmayla sonuçlanmaktadlEl SPT4'ün dominant negatif mutantlarlZIdominant negatif SPT4 aktivitesi sergileyen mutant proteinleridir. Burada kullanIlglEüzere, "dominant-negatif SPT4 aktivitesi” terimi veya “dominant negatif aktivite” terimi, belirli mutlak SPT4 aktivitelerinin inhibisyonu, negasyonu veya azalmasi, ve özellikle genislemis trinükleotit tekrarlarII SPT4 aracllII] transkripsiyonuna isaret etmektedir. Dominant negatif mutasyonlar, ilgili proteinler için kolay bir sekilde üretilmektedir. Bunlar, bir substrat-baglama alanlEtlaki mutasyonlar; bir katalitik alandaki mutasyonlar; bir protein baglama alanlEtlaki mutasyonlar (örnegin multimer olusumu, efektör veya aktive edici protein baglama alanlarlîj hücresel Iokalizasyon alanIaki mutasyonlar, ve benzeri dahil olmak üzere çesitli farkIEmekanizmaIar vasißslýla hareket edebilmektedir. Bir mutant polipeptit, yaban tipi polipeptitler (diger allelden meydana getirilen) ile etkilesime girebilmetkedir ve islevsel olmayan bir multimeri meydana getirebilmektedir. Belirli yapliândlünalarda, mutant polipeptit, aslîllîhiiktarda üretilecektir. Bu tür bir etkiye sahip olan nokta mutasyonlarümeydana getirilmektedir. Ilaveten, çesitli uzunluklardaki farklEpolipeptitIerin, bir proteinin terminusuna füzyonu veya belirli alanlar. çilZlarllEnasü dominant negatif mutantlarI elde edilmesini saglayabilmektedir. Dominant negatif mutantlarI meydana getirilmesine yönelik genel stratejiler mevcuttur (bakIlZl Protein islevinin belirlenmesinde kullaniglljalan islev kaybÜnutasyonIarII olusturulmaleda bu tür teknikler kullanllîhaktadß Teknikte uzman kisiler taraflEtlan iyi bilinen yöntemler, kodlama sekanslarlîlve bir hücreye verilen bir d& kökenli genin artlEllE1l$ ekspresyonuna yönelik transkripsiyonel ve translasyonel kontrol esinyalleri içeren ekspresyon vektörlerinin olusturulmasüad. kullanllâbilmetkedir. Bu yöntemler, örnegin in vitro rekombinant DNA teknikleri, sentetik teknikler ve in vivo genetik rekombinasyonu kapsamaktadlîl Alternatif olarak, gen ürünü sekanslarIElkodlayabilen RNA örnegin sentezleyicilerin kullanlßîaslsîla kimyasal sekilde sentezlenebilmektedir. BakIlîJ örnegin “Oligonucleotide Synthesis”, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford referanleUa açiElanan teknikler.
Diger yapilândlîilnalarda, madde; SPT4'e baglanma ve/veya SPT4'ün bir ikinci proteine, örnegin Spt5 veya SUPTSH gibi bir SPT5 proteinine baglanmasi. inhibe edilmesi vasitâslýla SPT4 aktivitesini modüle eden, örnegin inhibe eden bir maddedir. Örnegin, SPT4'e baglanan ve aktivitesini (örnegin bir SPT5 proteine baglanma) inhibe eden küçük moleküller ilgi alanIdadlEl Dogal olarak meydana gelen veya sentetik küçük molekül bilesikleri; organik müleküller, örnegin 50 daltondan fazla ve yaklasila 2,500 daltondan az olan bir moleküler aglülfgh sahip küçük organik bilesikler gibi çesitli kimyasal sIührElkapsamaktadlEl Aday maddeler, proteinler ile yapisal etkilesim, özellikle h,idrojen baglanmasi yönelik islevsel gruplar içermektedir ve tipik olarak, en az bir amin, karbonil, hidroksil veya karboksil grubunu, tercihen en az iki islevsel kimyasal grubu kapsamaktadB Aday maddeler, siklik karbon veya heterosiklil yapüâr ve/veya yukarlöhki islevsel gruplardan biri veya daha fazlasEI ile ikame edilen aromatik veya poliaromatik yapllârllapsamaktadlü Aday maddeler ayrlEla, peptitler, sakkaritler, yag asitleri, steroidler, pürinler, pirimidinler, türevler, yapElaI analoglar veya bunlari kombinasyonlarEl dahil biyomoleküller arasIa bulunmaktadlEl Bu tür moleküller, diger yöntemler arasIan, asaglüh açllZIanan görüntüleme protokollerinin kullanllîhasûla tannlanabilmektedir.
Bulusun yapllândlülnalar- göre maddeler kullanlüîken, aktif bir maddenin, örnegin SPT4 modülatör maddesinin etkili bir miktarlIhedef hücrelere veya hücrelere verilmektedir. BazEI durumlarda, modülatör maddenin etkili miktarl,`_l hücrenin modülatör madde ile temas ettirilmesi vasüâslýla hücreye verilmektedir. Hücrenin modülatör madde ile temasÇiuygun herhangi bir protokolün kullanilfnasMa meydana gelebilmektedir. Hedef hücrenin temasIEIsaglamaktadlEl Temas, maddenin hücrenin içine girisine içerebilmektedir veya içermeyebilmektedir. Örnegin, hedef hücrenin izole bir hücre olmasü/e modülatör maddenin SPT4 ekspresyonunu modüle eden bir madde olmaslîöurumunda, modülatör madde, hedef hücrenin yasayabilirligine izin veren hücre kültürü SartlarElaltlEtla dogrudan hücreye verilebilmektedir. Bu tür teknikler, yandakileri içermektedir, ancak bunlarla sIlEllEUegiIdir: viral enfeksiyon, transfeksiyon, konjugasyon, protoplast füzyonu, elektroporasyon, parçadEl silahElieknolojisi, kalsiyum fosfat çökeltisi, dogrudan mikroenjeksiyon, viral vektör daglEiEliüve benzeri. Yöntem seçimi, genellikle, temas ettirilen hücre tipine, modülatör maddenin dogaleta ve trasformasyonun meydana geldigi sartlara (örnegin in vitro, ex vivo veya in vivo) baglIlE Bu yöntemlere dair genel bir tartlg'na, Ausubel, ve meslektaslarÇlShort Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995 referanletIa bulunabilmektedir.
Alternatif olarak, hedef hücrenin veya hücrelerin, çok hücreli bir organizmanI parçaslîdilmaslîl durumunda, örnegin bir in vivo veya ex vivo protokolü vasßslîla madde, hedef hücrelere temas edebilecek sekilde, madolatör madde organizmaya veya sujeye uygulanabilmektedir. vivo," hücrelerin veya organlarlEl, vücudun dlgiüba modifiye edilmesi anlam. gelmektedir.
Bu hücreler veya organlar, tipik olarak yasayan bir vücuda geri döndürülmektedir.
KullanIi sßsia, istenen aktivite ile sonuçlanan, uygun herhangi bir uygulama protokolünün kullanilmaslsîla aktif maddeler, hedeflenen hücrelere uygulanabilmektedir.
Dolaylslýla, terapötik uygulamaya yönelik olarak madde, çesitli formülasyonlarliîi, örnegin farmasötik olarak kabul edilebilir tasMEBrI içerisine dahil edilebilmektedir. Daha özel olarak, mevcut bulusun maddeleri; uygun, farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlîllâr veya seyrelticiler ile kombinasyon vasitâsüla farmasötik bilesimler olarak formüle edilebilmektedir ve tabletler, kapsüller, tozlar, granüller, merhemler (örnegin cilt kremleri), çözeltiler, fitiller, enjeksiyonlar, inhalanlar ve aerosoller gibi katü yarElkatÇl sülîlveye gaz formundaki preparasyonlar olarak formüle edilebilmektedir. Bu sekilde, maddelerin uygulanmasEçesitli yollarla gerçeklestirilebilmekte olup, oral, aglîl yoluyla, rektal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, intratrakeal ve benzeri uygulamalar bunlara dahildir.
Farmasötik dozaj formlarIa, maddeler; farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarII formunda uygulanabilmektedir veya farmasötik olarak aktif diger bilesikser ile kombinasyonun yanlîlslüi tek baslEia veya uygun bir birlesim halinde kullanüâbilmektedir.
Asaglêlhki yöntemler ve eksipiyanlar, yalnlîta örnek niteligindedir ve hiçbir sekilde sIlEllandiElElîilegildir.
Oral preparasyonlar için, maddeler tek bas. kullanilâbilmektedir veya tabletlerin, tozlarIEl, granüllerin veya kapsüllerin meydana getirilmesi için uygun katkünaddeleri, örnegin Iaktoz, manitol, mElEl nisastasElveya parates nisastasügibi konvansiyonel katkElmaddeleri ile kombinasyon halinde; kristalin selüloz, selüloz türevleri, akasya, mEanisastasül/eya jelatinler gibi baglayEIEr ile kombinasyon halinde; mlîIEI nisastasü patates nisastasEh/eya sodyum karboksimetilselüloz gibi yapElgidericilerle kombinasyon halinde; talk veya magnezyum stearat gibi kaydlEiEllârla kombinasyon halinde; ve eger istenirse seyrelticiler, tampon maddeleri, nemlendirici maddeler, prexervatifler ve tatlandiEiEEinaddeler ile kombinasyon halinde kullanilâbilmektedir.
Maddeler; birtki veya diger benzer yaglar, sentetik alifatik asit gliseritleri, yüksek alifatik asitlerin esterleri veya propilen glikol gibi sulu veya susuz bir çözücünün içerisinde çözündürme, süspansiyon halinde tutma veya emülsiyonlastlElna vasßslýla ve eger istenirse çözündürücüler, izotonik maddeler, süspansiyon maddeleri, emülsiyonlastlüna maddeleri, stabilizörler ve prezervatifler gibi konvansiyonel katkElmaddeleri ile birlikte, enjeksiyona yönelik preparasyonlar halinde formüle edilebilmektedir.
Maddeler, inhalasyon yoluyla uygulama için aerosol formülasyonlarlia kullanllâbilmektedir.
Mevcut bulusun bilesikleri, diklorodiflorometan, propan, nitrojen ve benzeri gibi baslüçlü kabul edilebilir iticiler halinde formüle edilebilmektedir.
Dahaslgl emülsiyonlastlElna bazlarElveya suda çözünebilen bazlar gibi çesitli bazlar ile karlgtlîilna vasltâslîla maddeler fitil haline getirilebilmektedir. Mevcut bulusun bilesikleri, bir fitil vasifîiislîla rektal sekilde uygulanabilmektedir. Fitiller; vücut slîlakliglia eriyen, ancak oda lelakllg'lIa katilâsan kakao yagükarbovakslar ve polietilen glikoller gibi tasElEBrEl kapsayabilmektedir.
Suruplar, iksirler ve süspansiyonlar gibi oral veya rektal uygulamaya yönelik birim dozaj formlarßaglanabilmekte olup, burada her bir dozaj birimi, örnegin çay kasigüyemek kasigÇl tablet veya fitil, bir veya daha fazla inhibitör içeren bilesimin önceden belirlenmis bir miktarIü içermektedir. Benzer sekilde, enjeksiyon veya intravenöz uygulamaya yönelik birim dozaj formlari: steril suda, normal tuzda veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir baska taslîIElEIhki bir solüsyon olarak, bir bilesimdeki inhibitörleri içerebilmektedir.
Burada kullanIiglEüzere “birim dozaj formu” terimi, insan veya hayvan sujelere yönelik üniter dozajlar olarak uygun olan fiziksel olarak ayrEbirimlere isaret etmekte olup, her bir birim, farmasötik olarak kabul edilebilir bir seyreltici, taslýlEEl/eya vehikül ile Iliskili olarak istenen etkinin elde edilmesi için yeterli olan bir miktarda hesaplanan mevcut bulusun bilesiklerinin önceden belirlenmis bir miktarIEilçermektedir. Mevcut bulusun yeni birim dozaj formlarII belirlenmesi, kullanllân belirli bilesige ve elde edilecek olan etkiye ve konaktaki her bir bilesik ile iliskili olan farmakodinamiklere baglIlE Vehiküller, adjuvanlar, taslEölâr ve seyrelticiler gibi farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar halka açlthE DahasÇl pH ayarlama ve tampon maddeleri, tonisite ayarlama maddeleri, stabilizörler, Elatma maddeleri ve benzeri gibi farmasötik olarak kabul edilebilir yard Iicljlnaddeler de halka açlEtlEI Maddenin bir polipeptit, polinükleotit ve bunlar. analogu veya mimetigi olmasülurumunda, viral enfeksiyon, mikroenjeksiyon veya vesikül füzyonu dahil olmak üzere çok saylElh yol araclIlglMa dokulara veya konak hücrelere verilebilmektedir. Furth ve meslektaslarE(1992), Anal Biochem 205:365-368 referansIa aç[lZland[glEüzere, jet enjeksiyon da intramüsküler uygulamaya yönelik olarak kullanllâbilmektedir. DNA, altI mikroparçacllZlarI üzerine kaplanabilmektedir ve literatürde açIJZland [glEüzere (baklEllîl örnegin, Tang ve meslektaslarlîl intradermal olarak verilebilmektedir, burada aItI mikroprojektilleri, DNA ile kaplanmaktadlîl ve ardIan deri hücrelerinin içine bombalanmaktadE Nükleik asit terapötik maddelerine yönelik olarak, teknikte bilindigi üzere viral veya viral olmayan vektör sistemleri dahil olmak üzere bir takIi farklEllaslsîlaIvehikül kullanllîrhaktadlü Teknikte uzman kisiler, belirli bilesigin, taslýlEEl/ehikülün dogasIlEl ve benzerinin bir islevi olarak doz seviyelerinin degisiklik gösterebilecegini kolaylllZla anlayacaktlEI Belirli bir bilesige yönelik tercih edilen dozajlar, teknikte uzman kisiler taraflEtlan, çesitli yöntemler yoluyla kolayllEla belirlenebilmektedir.
Yukarlîlh degerlendirildigi üzere, suje maddeler, bir hedef hücre veya hücrelerdeki genislemis bir trinükleotit tekrar geninin zararlEIaktivitesinde seçici bir indirgemeye yol açmaktadlîl burada hedef hücreler in vitro veya in vivo olabilmektedir. Belirli yapllândlEInaIarda, suje maddeler, örnegin burada kodlanan bir protein agregasyonundaki bir indirgeme vasißsüa, hedef hücrelerdeki bir hedef genin toksisitesinde bir indirgemeye yol açmaktadlEI Belirli yapllândülnalarda, maddeler, bir hedef gen tarafIan kodlanan bir proteinin islevinde artisa yol açmaktadE YukarElbki maddeler, çesitli farklEluygulamalarda kullanllBiaktadE Belirli uygulamalar, asag-ki YararllHEJklglnIdadegerlendirilmektedir.
YARARLILIK Suje maddeleri, bir mutant genislemis trinükleotit tekrar alanEiçeren genin zararlljktivitesine yönelik bir indirgemenin beklendigi çesitli uygulamalarda kullanllüiaktadlü Bu sekilde, bulusun yönleri; ihtiyaç sahibi herhangi bir sujede, örnegin yukarlBlaki sonuçlardan sujede mevcut olanlarI biri veya daha fazlaleb etki edilmesi vaslüsüla tedavi edilebilen bir durum teshisinin konuldugu bir sujede, burada açlKland[gll:üzere bir gen taraf-an kodlanan bir proteinin toksisitesinîn indirgenmesi ve/veya islevinin artlîllîhasIEkapsamaktadlü Bulusun maddelerinin, mutant genislemis trinükleotit tekrar alanlarIEilçeren genlerin zararlllktivitesi ile iliskili olan hastallEl durumlarII ilerleyisinin modifiye edilmesine yönelik olarak kullanüîhaslýla ilgilenilmektedir. “Ilerleyisin modifiye edilmesi" terimi, ilerleyis h-aki indirgemenin (örnegin hastalilg durumunun bir veya daha fazla semptomunun meydana gelisinin ertelenmesinde ortaya çlEtEglEüzere) yanlis& bir hastalllZl durumunun iyilestirilmesi de dahil olmak Üzere ilerleyisinin tersine çevrilmesini (hastalllgdurumunun bir veya daha fazla semptomunun siddetinin indirgenmesinde ortaya çlthlgiEl üzere) kapsayacak sekilde kullanllîhaktadE Bulusun yöntemlerinin ve bilesiklerinin kullanIElEbelirli hastallladurumlarlîl Spinoserebellar ataksi tip 1, Spinoserebellar ataksi tip 2, Spinoserebellar ataksi tip 3, Spinoserebellar ataksi tip 7, Spinoserebellar ataksi tip 17, Dentatorubral palIidquysian atroû, Spinal veya bular müsküler atrofi, and Huntington hastal[gEgibi polyQ hastal[glEdurumlarII:l kapsamaktadlü ancak bunlarla sIlBIÜlegildir.
BazEtlurumlarda, bulusun maddelerinin kullanIiÇlbir hastaI[El durumuna yönelik olarak bir sujenin tedavi edilmesiyle sonuçlanmaktadß Tedavi, sujeye s-Ü/eren hastalik] durumu ile iliskili bir veya daha fazla semptomun en azIan iyilestirilmesi anlam. gelmekte olup, burada iyilestirme; örnegin bilissel islev kaybüvb. gibi tedavi edilen patolojik durum ile iliskili olan semptomun bir parametresinin siddetindeki en azIan indirgemeye isaret edecek sekilde, genis kapsamlEblarak kullanilBiaktadE Bu sekilde, tedavi; patolojik durumun, en azEUan bununla iliskili olan semptomlarliîl tamamen inhibe edildigi, örnegin meydana gelmesinin önlendigi veya durduruldugu, örnegin suje, patolojik durumdan veya en azIan patolojik durumu karakterize eden semptomlardan muzdarip olmayacak sekilde sonland-[glEl durumlarDlapsamaktadE Suje maddelere göre çesitli konaklat tedavi edilebilmektedir. Genellikle, bu tür konaklar kemirgenler (örnegin fare, gine domuzlarüve slglanlar) ve primatlar (örnegin insanlar, sempanzeler ve maymunlar) dahil olmak üzere memeli sI-I bünyesinde olan organizmalar!] tanIiIamak üzere, genis kapsamllîl sekilde kullanilB'iaktadIE Birçok yapllândlîrlnada, konaklar, insanlar olacaktB TARAMA DEN EM ELERI Bulusun yönleri ayrlEia, örnegin yukari degerlendirildigi üzere bulusta kullanllân maddelerin tanIilanmasEliçin yapUândlEllân tarama denemelerini kapsamaktadlE] Ilgilenilen tarama denemeleri; bir test bilesiginin, bir mutant genislemis trinükleotit takrar alanEilçeren bir hedef gen tarafian kodlanan bir proteinin aktivitesini modüle edip etmediginin belirlenmesine yönelik yöntemleri kapsamaktadlîl Belirlemek, belirli bir test bilesiginin, istenen aktiviteye sahip olacagi. en azIan tahmin edilmesi anlam. gelmektedir, bu sekilde hayvan modeli ve/veya klinik denemeler gibi ilave denemelerde bilesigin ilaveten test edilmesi istenmektedir.
Mutant genislemis trinükleotit tekrarlarEl içeren genlerin transkripsiyonunda, SPT4 proteinlerinin rolünün belirlenmesi, yolagI in vitro sekilde yeniden yapllândlîllüiaslü mümkün kllüîaktadß Iki veya daha fazla yolak bileseni, örnegin bir SPT4 ve bir SPT5 proteini in vitro sekilde birlestirilebilmektedir ve test bileseninin var olmasEtlurumundaki davranlgl birçok farklElyöntem vasltâslýla, örnegin belirli hedef sekanslarlElI transkripsiyonunun aktivasyonu bak“an, yalnlîta yolak bilesenlerinin etkilesimi üzerine meydana gelen bir sinyalin üretimi, vb. vasttâslîla belirlenebilmektedir.
Ilaç taramaslÇl bir In vitro model, genetik olarak degistirilmis bir hücre veya hayvan veya saflastlEllB'iE SPT4 proteininin kullanllßiaslîla gerçeklestirilebilmektedir. SPT4 proteininin faaliyetiyle yarlglan, bunu modifiye eden veya taklit eden ligandlar veya substratlar tanIiIanabilmektedir. Ilaç taramasüantagonist olarak veya agonist olarak, SPT4 aktivitesini taklit eden maddeleri tannlamaktadlEI Isaretli in vitro protein-protein baglama denemeleri, elektroforetik mobilite geçisi denemeleri, protein baglamaya yönelik immünodenemeler ve benzeri dahil olmak üzere çok çesitli denemeler bu amaç için kullanüâbilmektedir.
SaflastlElBwlgl sentetik SPT4 proteinin kristalizasyonundan elde edilen, 3-b0yutlu SPT4 yap_ dair bilinenler, spesiûk bir sekilde SPT4 aktivitesini inhibe eden küçük ilaçlara yönelik mantUZl Eliasarllar ile sonuçlanmaktad lü Burada kullanIlgEüzere “madde" terimi, bir SPT4 proteininin fizyolojik islevini degistirebilen veya taklit edebilen, örnegin protein veya farmasötik olmak üzere herhangi bir molekülü açEamaktadB Genel olarak, çesitli konsantrasyonlara yönelik farklEtepkilerin elde edilmesi ad. birden çok deneme karlSIEiiüfarklElmadde karmlarMa parallel sekilde hareket etmektedir. Tipik olarak, bu konsantrasyonlardan biri bir negatif kontrol, yani sIflEl konsantrasyonda veya tespit seviyesinin altlEUa islev görmektedir.
Aday maddeler; organik müleküller, örnegin 50 daltondan fazla ve yaklasIlZl 2,500 daltondan az olan bir moleküler aglîll[gb sahip küçük organik bilesikler gibi çesitli kimyasal sIElhrEl kapsamaktadlEl Aday maddeler, proteinler ile yaplglal etkilesim, özellikle hidrojen baglanmasi yönelik islevsel gruplar içermektedir ve tipik olarak, en az bir amin, karbonil, hidroksil veya karboksil grubunu, tercihen en az iki islevsel kimyasal grubu kapsamaktadlE Aday maddeler genellikle, siklik karbon veya heterosiklil yapüâr ve/veya yukarlöhki islevsel gruplardan biri veya daha fazlasElile ikame edilen aromatik veya poliaromatik yapilârEl kapsamaktadß Aday maddeler ayrEti, peptitler, sakkaritler, yag asitleri, steroidler, pürinler, pirimidinler, türevler, yaplghl analoglar veya bunlari kombinasyonlarlîldahil olmak üzere biyomoleküller arasIia bulunmaktadlEl Aday maddeler; sentetik veya dogal bilesiklerin kütüphaneleri dahil olmak üzere çok çesitli kaynaklardan elde edilmektedir. Örnegin, rastlantlgbl oligonükleotitler ve oligopeptitlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, çok çesitli organik bilesiklerin ve biyomoleküllerin rastlantlgal ve yönlendirilmis sentezine yönelik olarak çesitli yöntemler mevcuttur. Alternatif olarak, bakteriyel, fungal, bitki ve hayvan özütleri formundaki dogal bilesiklerin kütüphaneleri mevcuttur veya kolaylllZIa üretilebilmektedir. Ilaveten, dogal veya sentetik olarak meydana getirilen kütüphaneler ve bilesikler, konvansiyonel kimyasal, fiziksel ve biyokimyasal yöntemler vasßslýla kolaylikla modifiye edilmektedir ve birlesimsel hütüphanelerin üretiminde kullanilâbilmektedir. Bilinen farmakolojik maddeler, yapisial analoglar. üretilmesi adEla asilasyon, alkilasyon, esterifikasyon, amidifikasyon ve benzeri gibi yönlendirilmis veya rastlantlgial kimyasal modifikasyonlara tabi tutulabilmektedir. Belirli yapüândünalarda, kan- beyin bariyerini geçen bilesikler ilgi alanIadlE Tarama denemesinin bir baglama denemesi olmaslîiurumunda, moleküllerden biri veya daha fazlasÇl bir sinyal üretim sisteminin bir eleman., örnegin bir isarete katllâbilmektedir, burada isaret, dogrudan veya dolaylEbIarak, tespit edilebilir bir sinyali saglayabilmektedir. Çesitli isaretler yandakileri içermekte olup, bunlarla sIIEllEdegildir: radyoizotoplar, floseran Sigüyayanlar, kimyasal parlakIlEl Iglgllîlyayanlar, enzimler, spesifik baglama molekülleri, örnegin manyetik parçaciElar ve benzeri. Spesifik baglama molekülleri biyotin, streptavidin, digoksin ve antidigoksin ve benzeri gibi çiftleri kapsamaktadlîl Spesifik baglama elemanlarlEb yönelik olarak, normalde tamamlayEIîleman, bilinen prosedürlere göre tespiti mümkün kilân bir molekül ile Isaretlenebilmektedir.
Diger çesitli ayßçlar da tarama denemelerine dahil edilebilmektdir. Bumlar, optimal protein- protein baglanmasIEIbaslatan ve/veya spesifik olmayan veya arka plan etkilesimlerini indirgeyen tuz, nötr proteinler, örnegin albümin, deterjan ve benzeri gibi aylßçlarü kapsamaktadlEl Denemenin verimini artßn protaz inhibitörleri, nükleaz inhibitörleri, anti- mikrobiyel maddeler ve benzeri gibi aylüçlar kullanliâbilmektedir. Bilesenlerin karisir-mü gerekli baglanmayElsaglayan herhangi bir süda eklenmektedir. Inkübasyonlar, uygun herhangi bir lethHZJa, tipik olarak 4 ve 40 °C arasIa gerçeklestirilmektedir. Inkübasyon süreleri optimum aktiviteye yönelik olarak seçilmektedir, ancak hlîlüyüksek ç[th[I]]]taramanI gerçeklestirilmesi içn optimize edilebilmektedir. Tipik olarak 0.1 ve 1 saat araslîbir süre yeterlidir.
Istenen farmakolojik aktiviteye sahip bilesikler, genislemis trinükleotit tekrarlarDçeren bir genin aktivitesi ile iliskili olan bir hastal[glI tedavi edilmesi veya önlenmesine yönelik bir konaga, fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tasls-LIEJEII içerisinde verilmektedir. Maddeler çesitli yollar vasltaslýla, oral, topikal, parenteral olarak, örnegin deri altlfihan, intraperitoneal olarak, viral enfeksiyon yoluyla, intravasküler sekilde, vb. olarak uygulanabilmektedir. Verilme sekline baglßlarak, bilesikler çesitli yöntemlerle formüle edilebilmektedir. Formülasyondaki terapötik olarak aktif bilesigin konsantrasyonu, aglEIllEl cinsinden yaklasElZl %0.1 ila 10 arasEUa degisebilmektedir.
Bazlîljurumlarda, yöntemler; bilesigin, bir mutant, genislemis trinükleotit tekrar alanEiçeren bir gen taraflEUan kodlanan proteinin aktivitesini modüle edip etmediginin belirlenmesi adlEb bir SPT4 proteinine operatif sekilde baglanan bir sinyal üretim sistemini barIBin bir hücre ile bilesigin taranmalelleapsamaktadlE Eger, örnegin floresan sinyali, belirlenebilen bir ürüne substratI dönüsümü vb, gibi sinyal üretim sistemi taraflîidan üretilen sinyal; bir SPT4 proteinin aktivitesine, örnegin SPT4 proteininin bir SPT5 proteini gibi bir ikinci proteine baglanabilmesi, bir SPT4 proteininin, bir mutant trinükleotit tekrar alanIlEl transkripsiyonuna yardIicüilabilmesi ve benzerine baglljblarak meydana gelirse veya meydana gelmezse, bir sinyal üretim sistemi, bir SPT4 proteinine faal olarak baglanmaktadlB Bu baglamda, hücrede bulunan sinyal üretim sistemi, bir SPT4 transkripsiyonel aktiviteye bagIIiIESekiIde bir sinyal üreten bir üretim sistemidir.
Sinyal üretim sisteminin, bir SPT4/SPT5 protein kompleksi olusumuna baglübir sekilde sinyal ürettigi denemeler ile ilgilenilmektedir. SPT4'ün, bir sinyal üretim sisteminin (burada sinyal üretim sistemi, bir SPT4 proteininin bir füzyonunu ve bir sinyal üretim sistemi isareti içermektedir) bir birinci elemanElle etiketlendigi ve SPT5'in, bir sinyal üretim sisteminin bir ikinci elemanülle isaretlendigi ve dogrudan veya dolayllîsekilde bir sinyalin saglanmasüdlüla SPT4 ve SPT5 proteinlerinin kompleks olusumunun, birinci ve ikinci sinyal üretim elemanlarII yaklEIasmasEile sonuçland[gll:yerde, bu tür bir deneme örnegi mevcuttur. Bu tür bir sistemin örnegi bir FRET denemesi olup, burada bir siyal üretim sisteminin birinci elemanEbir donör floresan klîlnIlE ve sinyal üretim sisteminin ikinci elemanElse bir allEEI floresan kEinIlEI AIEEroresan kElnII floresan emisyonuna yönelik tarama vasltâlea, bir aday maddesinin, bir SPT4 proteininin bir SPT5 proteinine baglanmasi müdahale edip etmediginin belirlenmesi adi bu tür denemeler kullanllâbilmektedir. Uygun olan herhangi bir FRET protokolü kullanilâbilmekte olup, burada bulusun denemeleri için kolayllKla uyarlanabilen protokoller ve belirli isaretler, lethndEllBiamak üzere sunlarDçermektedir: Dokümanlaria aç[lZlananIar.
Bir SPT4 transkripsiyonel aktivitesine baglljsekilde bir sinyal üreten diger bir deneme türü, hedef gen tarafIan kodlanan proteinin bir sinyal üretim sistemi alanlîiiçerdigi bir denemedir.
Bu tür denemelerde, mutant, genislemis trinükleotit tekrarIEbarlEUEin hedef gen, ayrEla, sinyal üretim sisteminin bir elemanlîlolan bir proteine yönelik bir kodlama sekansElda barIHnaktadlEl Bu tür proteinlerin örnekleri floresan proteinler, enzimler, ve benzerini kapsamaktadlEl Bu tür denemelerde, bir mutant, genislemis trinükleotit tekrar. sahip bir hedef gen tarafIan kodlanan bsr isaret proteininin islevini geri kazandlûn maddeler, sinyal üretim sistemi proteininin islevi, örnegin proteinden floresan emisyonu, proteinden enzimatik aktiviteye yönelik olarak denemeler tarafIdan kolayllEIa tanilanabilmektedir. Bu tür denemelerin örnekleri, deneysel klslînida daha ayriEtlIDblarak açHZlanan, GFP ve ADE2 temelli denemeleri kapsamaktadß Bu tür denemelerde, denemelerde kullanllân hedef gen, bir mutant, genislemis trinükleotit tekrar alan. operatif olaran baglanan isaret proteini için bir kodlama sekansIEl kapsamaktadlE Sinyal üretim sistemi isaretleri olarak kullanllâbilen floresan proteinlerinin ilave örnekleri, mercan resifi floresan proteinleri, örnegin Clontech bunlarla sllüllîldegildir. Ilgilenilen enzimatik isaretlerin ilave örnekleri, sIlEllandlEllBwamak üzere sunlarüçermektedir: Iüsiferaz, SEAP, baylElturbu peroksidazÇlß-galaktosidaz, vb. BazEl invazif olmayan tüm hayvan In vivo denemeleri, bulusun ilgi alanlEtladlB Ayrlîla, 7,375,190 numaralEIUS patent dokümanlEtla açllîlanan renk koloni denemesi de bulusun ilgi alanlEUadlEI Bu sekilde, tarifnamenin yönleri, ayrlîia SPT4 yolagÜnodülatör maddelerinin bulunmasEiçin tasarlanan tarama denemelerini kapsamakta olup, burada bu tür maddeler, örnegin genislemis trinükleotit tekrarlarIEiçeren bir genin aktivitesinden kaynaklanan durumlar. tedavi edilmesi veya önlenmesine yönelik, yukari açiKlandigilZIizere terapötik maddeler olarak kullanIiEldahil olmak üzere çesitli uygulamalarda kullanllâbilmektedir. Tarama yöntemleri, belirli bir aday terapötik maddenin varliglIa SPT4 aktivitesinin nitelikseI/niceliksel ölçümlerini saglayan denemeler olabilmektedir. Tarama yöntemi, in vitro veya in vivo formatIa olabilmektedir.
KOM BINASYON TEDAVILERI Bulusun aktif maddeleri, tek bas. veya diger aktif maddelerden biri veya daha fazlasEla kombinasyon halinde tedarik edilebilmektedir. Örnegin, seçici SPT4 inhibitör maddeleri, tek baslîila veya poIyQ hastaliElarII tedavisinde kullanilân ilaçlar gibi bir veya daha fazla ilaç ile birlikte tedarik edilebilmektedir. OIasEl kombinasyon partnerleri, örnegin Tetrabenazin (Ksenazin); haloperidol (Haldol) ve klozapin (Klozaril) gibi antipsikotik ilaçlar; klonazepam (Klonopin) gibi nöber karsiElDilaçlar ve diazepam (Valium) gibi sakinlestirici ilaçlar; escitalopram (Leksapro), floksetin (Prozac, Sarafem) ve sertralin (Zoloft) gibi IlaçlarEI kapsayan antidepresanlar; ve benzerini kapsayabilmektedir.
FARMASÖTIK PREPARASYONLAR Bulus konusu bilesiklerin farmasötik preparasyonlarüda saglanmaktadIEI Bulus konusu bilesikleri, bir sujeye uygulamaya yönelik olarak çesitli formülasyonlara dahil edilebilmektedir.
Daha özel olarak, mevcut bulusta kullan a yönelik bilesikler; uygun, farmasötik olarak kabul edilebilir taslîlîllâr veya seyrelticiler ile kombinasyon vasitâslîla farmasötik bilesimler olarak formüle edilebilmektedir ve tabletler, kapsüller, tozlar, granüller, merhemler, çözeltiler, fitiller, enjeksiyonlar, inhalanlar ve aerosoller gibi katÇiyarEkatlÇlslîÜ/eye gaz formlarIaki preparasyonlar olarak formüle edilebilmektedir. Formülasyonlar, uygulamaya yönelik olarak çesitli yollarla tasarlanabilmekte olup, oral, aglîi yoluyla, rektal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, transdermal, intratrakeal ve benzeri uygulamalar bunlara dahildir.
Farmasötik dozaj formlarlEUa, maddeler; farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarII formunda uygulanabilmektedir veya farmasötik olarak aktif diger bilesikler ile kombinasyonun yanßlâ tek bas. veya uygun bir birlesim halinde kullanilâbilmektedir. Asaglki yöntemler ve eksipiyanlar, yalniîta örnek niteligindedir ve hiçbir sekilde sIiElland Megildir.
Aktif bilesim maddesini içeren farmasötik bilesimler, örnegin tabletler, yuvarlak yassEihaplar, pastiller, sulu veya yagllZisüspansiyonlar, dagilâbilir tozlar veya granüller, emülsiyonlar, sert veya yumusak kapsüller veya suruplar veya iksirler gibi oral kullan! için uygun bir formda olabilmektedir. Oral kullanIia yönelik bilesimler, farmasötik bilesimlerin imalatEiçin teknikte bilinen herhangi bir yönteme göre halelanabilmektedir ve bu tür bilesimler, farmasötik olarak elegant ve lezzetki preparasyonlarI saglanmasüadiEia tatlandlîlülâr, lezzet verici maddeler, renk verici maddeler ve koruma maddelerinden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla maddeyi Içerebilmektedir. Tabletler, tabletlerin imalatEliçin uygun olan, toksik olmayan, farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar ile kariglûli halindeki aktif bilesim maddesini içermektedir. Bu eksipiyanlar, örnegin kalsiyum karbonat, sodyum karbonat, laktoz, kalsiyum fosfat veya sodyum fosfat gibi duragan seyreltiler; örnegin mlgiEinisastasEieya aljinik asit gibi granüllestirme ve daglElna maddeleri;örnegin nisasta, jelatin veya akasya gibi baglama maddeleri ve örnegin magnezyum stearat, stearik asit veya talk gibi yaglama maddeleri olabilmektedir. Tabletler kaplanmamgiolabilmektedir veya mide-bag [Bak yolunda dagißîanl ve emilmenin geciktirilmesi, böylelikle daha uzun bir süre boyunca sürdürülebilir olan etkinligin saglanmasiîl adlEia bilinen teknikler ile kaplanabilmektedir. Örnegin, gliseril monostearat veya gliseril distearat gibi bir zaman geciktirme malzemesi kullanilâbilmektedir.
Kontrol saIIiEiçin ozmotik terapötik tabletlerin meydana getirilmesi ad. bunlar, 4,256,108; kaplanabilmektedir.
Oral kullanma yönelik formülasyonlar ayriEia, aktif bilesim maddesinin, örnegin kalsiyum karbonat, kalsiyum fosfat veya kaolin gibi bir duragan katlîiseyreltici ile karSt-[gilîlsert jelatin kapsülleri olarak veya aktif bilesim maddesinin, su veya örnegin yerfiîtlgiEi/agüsiîiîi parafin veya zeytin yagiîgibi yagIEIbir ortam ile karlSt-[giü/umusak jelatin kapsülleri olarak sunulabilmektedir.
Sulu süspansiyonlar, sulu süspansiyonlarl imalatEiçin uygun olan eksipiyanlar ile karisim halindeki aktif malzemeyi içermektedir. Bu tür eksipiyanlar örnegin sodium carboxymethyl- ceIIuIose, metiI-selüloz, hydroksi-propilmetiselüIoz, sodyum aljinat, poliviniI-pirrolidon, kitre agacEzamkEi/e akasya zamklîgibi asklöh tutma maddeleri; örnegin Iesitin gibi dogal olarak meydana gelen fosfatid olabilen dagitîina veya Eiatma maddeleri veya örnegin polioksietilen stearat gibi yag asitlerine sahip bir alkilen oksitten olusan yogunlastiîrina ürünleri veya örnegin heptadekaetilen-oksisetanol gibi uzun zincirli alifayik alkollere sahip etilen oksitten olusan yogunlastlElna ürünleri veya yag asitlerinden ve polioksietilen sorbitol monooleat gibi bir heksitolden elde edilen klglni esterlere sahip etilen oksitten olusan yogunlastlEina ürünleri veya örnegin polietilen sorbitan monooleat gibi yag asitlerinden ve heksitol anhidritlerden elde edilen kElnElesterlere sahip etilen oksitten olusan yogunlastlîrlna ürünleridir. Sulu süspansiyonlar ayrlEh, Örnegin etil veya n-propil, p-hidroksibenzoat gibi bir veya daha fazla prezervatif, bir veya daha fazla renk verici madde, bir veya daha fazla lezzet verici madde, sukroz, sakkarin veya aspartam gibi bir veya daha fazla tatlandlElEljlnadde içerebilmektedir.
YaglDsüspansiyonlar, örnegin fEtllZl yagüzeytin yagÇlsusan yagEl/eya hindistan cevizi yagEI gibi bir bitkisel yagda veya learafin gibi mineral yag-a aktif bilesim maddesinin ask- tutulmasEl/asßsüla formüle edilebilmektedir. YaglElsüspansiyonlar, örnegin balmumu, katEl parafin veya setil alkol gibi bir klîlamlastlEEDmadde içerebilmektedir. Yukar- ortaya koyulanlar gibi tatlandlElEînaddeler ve lezzet verici maddeler, lezzetli bir oral preparasyonun elde edilmesi için eklenebilmektedir. Bu bilesimler, askorbik asit gibi bir anti-oksidanI eklenmesiyle korunabilmektedir.
Suyun eklenmesiyle bir smüspansiyonun hazlEllanmaslIiçin uygun olan dagllâbilir tozlar ve granüller, karElEli halindeki aktif bilesim maddesini, bir daglfîlna veya Elatma maddesi, ask. tutma maddesi veya bir veya daha fazla prezervatif ile donatmaktadB Uygun dagltîlna ve Elatma maddeleri ve asklflla tutma maddeleri, yukarida halihazlâla bahsedilenler tarafli-uriah örneklendirilmektedir. Örnegin tatlandlEElJlezzet verici ve renk verici maddeler gibi ilave eksipiyanlar da mevcut olabilmektedir.
Bulusta kullanma yönelik farmasötik bilesimler, ayrlîla, su-içinde-yag emülsiyonlarEllormunda olabilmektedir. YagllZfaz, örnegin zeytin yagEl/eya flâtlEl yagEgibi bir bitkisel yag veya slîlîl parafin gibi bir mineral yagEl/eya bunlarI karElEliIllabilmektedir. Uygun emülsiyonlastlîrlna maddeleri, örnegin soya fasülyesi veya Iesitin gibi dogal olarak meydana gelen fosfatidler ve örnegin sorbitan monoleat gibi yag asitlerinden ve heksitol anhidridlerden elde edilen esterler veya klîlnüesterler ve örnegin polioksietilen sorbitan monoleat gibi etilen oksite sahip söz konusu klElni esterlerden olusan yogunlastlîrlna ürünleri olabilmektedir. Emülsiyonlar ayrlEh tatland lEIEÜe lezzet verici maddeler içerebilmektedir.
Suruplar ve Iksirler, örnegin gliserol, propilen glikol, sorbitol veya sukroz gibi tatlandlElED maddeler ile birlikte formüle edilebilmektedir. Bu tür formülasyonlar ayrlîb, bir demulsent, bir prezervatif ve lezzet verici ve renk verici maddeler içerebilmektedir. Farmasötik bilesimler, steril, enjekte edilebilir, 5qu veya yaglIZI süspansiyon formunda olabilmektedir. Bu süspansiyon, yukarida açiiîlanan, uygun dagEÜEElve ElatiEElmaddelerin ve süspansiyon maddelerinin kullanIigilZl bilinen teknige göre formüle edilebilmektedir. Steril, enjekte edilebilir preparasyon, toksik olmayan, parenteral olarak kabul edilebilir bir seyreltici veya çözücünün içerisindeki bir steril, enjekte edilebilir solüsyon veya süspansiyon, örnegin 1,3- bütan diol içerisindeki bir solüsyon olabilmektedir. Kullanllâbilen, kabul edilebilir vehiküller ve çözücüler arasIa su, Ringer solüsyonu ve izotonik sotyum klorür solüsyonu bulunmaktadlîi Ilaveten, bir çözücü veya süspansiyon ortam Eölarak steril, sabit yaglar konvansiyonel olarak kullanilâbilmektedir. Bu amaç dogrultusunda, sentetik mono- veya digliseritler de dahil olmak üzere herhangi bir sabit yag kullanilâbilmektedir. Ilaveten, oleik asit gibi yag asitleri de enjeksiyonlarI haziîlianmaslda kullan [lîhaktadE Bilesikler; bitki yaglarEIveya diger benzer yaglar, sentetik alifatik asit gliseritleri, yüksek alifatik asitlerin esterleri veya propilen glikol gibi sulu veya susuz bir çözücünün içerisinde çözündürme, süspansiyon halinde tutma veya emülsiyonlastiîilna vasIBislîla; ve eger istenirse çözündürücüler, izotonik maddeler, süspansiyon maddeleri, emülsiyonlastlüna maddeleri, stabilizörler ve prezervatifler gibi konvansiyonel katkümaddeleri ile birlikte, enjeksiyona yönelik preparasyonlar halinde formüle edilebilmektedir.
Bilesikser, inhalasyon yoluyla uygulama için aerosol formülasyonlarlfiba kullanüâbilmektedir.
Mevcut bulusta kullanma yönelik bilesikler, diklorodiflorometan, propan, nitrojen ve benzeri gibi baleçIÇikabul edilebilir iticiler halinde formüle edilebilmektedir.
DahasÇI emülsiyonlastüina bazlariîlveya suda çözünebilen bazlar gibi çesitli bazlar ile karigtlEina vasißslýla bilesikler fitil haline getirilebilmektedir. Mevcut bulusta kullanma yönelik bilesikler, bir fitil vasßsma rektal sekilde uygulanabilmektedir. Fitiller; vücut leiakl[giiEtla eriyen, ancak oda lehklIgiIa katilâsan kakao yagLIIkarbovakslar ve polietilen glikoller gibi tasEIEllârükapsayabilmektedir.
Topikal uygulamada aktif olan, bu bulusta kullanma yönelik bilesikler ve bunlar farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarÇl transdermal bilesikler veya transdermal tasIia cihazlarEi ("yamalar”) olarak formüle edilebilmektedir. Bu tür bilesikler, örnegin bir destekleyici, aktif bilesik rezervuarü bir kontrol zarl,`_l kaplama maddesi ve temas yapEkanIEi kapsayabilmektedir. Bu tür transdermal yamalar, mevcut bulusun bilesiklerinin kesintisiz veya kesintili infüzyonlarlEllEl kontrollü miktarlarda saglanmasEiçin kullanllâbilmektedir. Farmasötik maddelerin dagiülüîaslîliçin transdermal yamalarI meydana getirilmesi ve kullanllBiasEl teknikte iyi bilinmektedir. BakIlZ] örnegin, 5,023,252 numarallJUS. Patent Dokümanü Bu tür yamalar, farmasötik maddelerin kesintisiz, pulsatil veya istege baglmlarak daglElEhEîÇin meydana getirilebilmektedir.
Opsiyonel olarak, farmasötik bilesim; tamponlar; yüzey etkin maddeleri, antioksidanlar, viskozite modifiyeli maddeler, prezervatifler ve benzeri gibi farmasötik olarak kabul edilebilen diger bilesenleri içerebilmektedir. Bu bilesenlerden her biri teknikte iyi bilinmektedir. BakIIîJ örnegin 5,985,310 numaralEllJ.S. Patent DokümanEl Mevcut bulusun formülasyonlaria kullanIia yönelik diger bilesenler, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985) referans'a bulunabilmektedir. Bir yapilândlülnada, sulu siklodekstrin solüsyonu ilaveten dekstroz, örnegin yaklasilZJO/os dekstroz içermektedir.
Gün basEla vücut ag EllfgiII yaklasilZl 0.01 mg ila yaklas[lZl 140 mg/kg'ü/eya alternatif olarak gün baslZhasta bas. yaklaslKIO.5 mg ila yaklasilZJ 7 g düzenindeki dozaj seviyeleri, temsili yapllândlîilnalarda kullanlglIE Örnegin, bilesigin, gün bas., vücut aglElllgiII kilogram basü yaklasim 0.01 ila yaklasllö 50 mg/kg'EbranlEda veya alternatif olarak gün basEhasta bas- yaklasilZl0.5 mg ila yaklasilZJ 3.5 9 uygulanmasülasltâslýla, inflamasyon etkili bir sekilde tedavi edilebilmektedir. Teknikte uzman kisiler, belirli bilesigin, semptomlar. siddetinin ve sujenin yan etkilere karsEüuyarlmgiII bir islevi olarak doz seviyelerinin degisiklik gösterebilecegini kolaylllîla anlayacaktE Belirli bir bilesige yönelik dozajlar, teknikte uzman kisiler tarafli-ndan, çesitli yöntemler yoluyla kolayllKla belirlenebilmektedir.
Tek bir doz formunun meydana getirilmesi için tasMEÜnaddeler ile birlestirilebilen aktif bilesim maddesi miktarütedavi edilen konaga veya belirli uygulama yöntemine baglüblarak degisecektir. Örnegin, insanlarda oral uygulamaya yönelik bir formülasyon, toplam bilesimin yaklas[lZl yüzde 5'i ila yaklas[lZl yüzde 95'i aras-a degisebilen taslEEElnaddenin uygun ve etkin bir miktarDIe bilestirilen 0.5 mg ila 5 9 aktif madde içerebilmektedir. Dozaj birimi formlarügenel olarak, yaklasllZl 1 mg ila yaklaslElSOO mg aktif madde, tipik olarak 25 mg, 50 madde içerecektir.
Ancak, herhangi bir hastaya yönelik belirli bir doz seviyesinin; yas, vücut aglElllglÇlgenel saglllîl cinsiyet, beslenme sekli, uygulama zamanÇluygulama yolu, atma oran üilaç kombinasyonu ve tedavi edilen belirli hastallgiI siddeti de dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglüalacaglgöz önünde bulundurulacaktlü Bu sekilde, suruplar,iksirler ve süspansiyonlar gibi oral veya rektal uygulamaya yönelik birim dozaj formlarEtaglanabilmekte olup, burada her bir dozaj birimi, örnegin çay kas[giÇIyemek kas[glÇltablet veya fitil, bir veya daha fazla inhibitör içeren bilesimin önceden belirlenmis bir miktarIEiçermektedir. Benzer sekilde, enjeksiyon veya intravenöz uygulamaya yönelik birim dozaj formlarIÇlsteril suda, normal tuzda veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir baska tasülîlahki bir solüsyon olarak, bir bilesimdeki inhibitörleri içerebilmektedir. Burada kullanI[g]|:lüzere “birim dozaj formu” terimi, insan veya hayvan sujelere yönelik üniter dozajlar olarak uygun olan fiziksel olarak ayrEbirimlere isaret etmekte olup, her bir birim, farmasötik olarak kabul edilebilir bir seyreltici, taslîlEEl/eya vehikül ile iliskili olarak istenen etkinin elde edilmesi için yeterli olan bir miktarda hesaplanan mevcut bulusun bilesiklerinin önceden belirlenmis bir miktarIEiçermektedir. Mevcut bulusun yeni birim dozaj formlarII belirlenmesi, kullanllân belirli peptidomimetik bilesige ve edilecel olanetkiye ve konaktaki her bir bilesik ile iliskili olan farmakodinamiklere baglIIE

Claims (2)

  1. ISTEM LER Yukari açlElananlar gibi, yöntemlerin yapliândlîilnalarll uygulanmasüsüsia kullanllân kitler ve sistemler de burada tartlgllîhaktadlîl Burada kullanIlgllZüzere “sistem” terimi, tek veya ayrElbir bilesimde mevcut olan, bulusun konusu olan yöntemlerin uygulanmasümaclýla bir araya getirilen iki veya daha fazla farklElaktif maddenin bir koleksiyonuna isaret etmektedir. Kit terimi, bir paketli aktif maddeye veya maddelere isaret etmektedir. Örnegin, bulusun konusu olan yöntemlerin uygulanmas. yönelik kitler ve sistemler, bir veya daha fazla farmasötik formülasyon içerebilmektedir. Bu sekilde, belirli durumlarda kitler, bir veya daha fazla birim dozajünlarak mevcut olan tek bir farmasötik bilesimi kapsayabilmekte olup, burada bilesim, bir veya daha fazla ekspresyon/aktivite inhibirör bilesigi içerebilmektedir. Diger durumlarda ise kitler, her birinin farleJir aktif bilesik içerdigi iki veya daha fazla ayrEl farmasötik bilesim barlEUßbilmektedir. Ayrlîla, örnegin yukari açllZlandlgilîlüzere bulusun denemelerinde kullanllân kitler ve sistemler de bulusun ilgi alanIdadlEI Bu tür kitler ve sistemler, denemelerin bir veya daha fazla bilesenini, örnegin füzyon proteinlerini kodlayan vektörleri, enzim substratlarlElü tamponlarlîib. kapsayabilmektedir. Yukarlâlaki bilesenlere ilaveten, bulusa konu olan kitler ayrlîla bulusa konu olan yöntemlerin uygulanmalela yönelik yönergeleri de kapsayabilmektdir. Bu yönergeler bulusa konu olan kitlerin içerisinde çesitli formlarda mevcut olabilmektedir, bunlardan biri veya daha fazlasEl kitin içerisinde mevcut olabilmektdir. Bu yönergelerin mevcut olabildigi bir form, kit paketinin içerisinde, bir prospektüsün içerisinde, vb. uygun bir otamlEJ veya substratI üzerinde, örnegin bilginin üzerine basIIg'lElbir kag[El parçasElveya parçalar.. üzerine baslßilgl sekildedir. Diger bir araç, bilginin kaydedildigi, bilgisayar taraf-an okunabilir bir ortam, örnegin disket, CD, vb. olabilmektedir. Mevcut olabilen diger bir araç, kaldlülmlglbir bölgedeki bilgiye erismek adlEb internet vaslüsüa kullanllâbilen bir internet sitesi adresi olabilmektedir. Uygun herhangi bir araç, kitlerin içerisinde mevcut olabilmektedir. Asag-ki örnekler, örnek niteligindedir ve sIlEIland lEEIIrlIegildir. DEN EYSEL A. Maya suslarEI Tüm suslar, tek adilEgen parçalama yöntemi vasllîhslýla meydana getirilmistir ve yukar. açlEIand[gl]Jzere genomik PCR vasßsüla dogrulanmIStEI(Cheng, T.H., ve Gartenberg, M.R. (2000). Maya heterokromatini, sürekli olarak sessizlestirici gerektiren dinamik bir yapIlEl genlerinin PCR ile yükseltilmis bir KanMXgene ile degistirilmesi vasltâslsîla, parental W303-1A hücrelerinden türetilmistir. isaretleyici gen ile degistirilmesi vasüslsîla thpZA meydana getirilmistir. B. Plazmidler pYESZ-ADEZ yapELîlyukarI açManmlgtlB (Ghukasyan, V., Hsu, C.C., Liu, C.R., Kao, F.J., ve Cheng, T.H. (2010). Fluorescence lifetime dynamics of enhanced green fluorescent protein in protein aggregates with expanded polyglutamine. J Biomed Opt 15, 016008) ve poliglutamin kallEtHârIEQMeriin, A.B., Zhang, X., He, X., Newnam, G.P., Chernoff, Y.O., and Sherman, M.Y. (2002). Huntington toxicity in yeast model depends on poIy-glutamine gerilme (CAG CAG CAA CAG CAA CAA)n içeren pYESZ-ZSQ-eGFP ve pYE52-97Q-eGFP plazmidleri Dr. Michael Sherman taraf-an nezaketle saglanmlStE ADEZ açllZl okuma çerçevesi, sablon olarak pYESZ-ADEZ kullanilmasiyla PCR ile yükseltilmistir ve ardIan, süsüla, pYESZ-ZSQ-ADEZ ve pYE52-97Q-ADE2'nin meydana getirilmesi ad. pYESZ-25Q- eGFP ve pYESZ-97Q-eGFP'deki eGFP'nin degistirilmesi için kullanlliilgtlü Elde edilen yapüâr, galaktoz ile indüklenebilir baslatlEEGall'in kontrolü alt-a N-terminal FLAG-isaretli poIyQ- ADE2 eksprese etmistir. Haberci genler, ardIan, pRS424'e alt klonlanmlgtlEl Endojen genomik DNA'sII kullanIlgllIPCR vaslüslîla yükseltilmistir ve ardlEtlan pRS415-SPT4'ün meydana getirilmesi için pRS415'e klonlanmlgtlîl RNQi-GFP plazmidi, Dr. Chih-Yen King tarafian saglanmlStlE (CAG)n ile polyQ-ADEZ veya poIyQ-eGFP eksprese eden yapüâr, pYESZ-eGFP.2den türetilmistir (Ghukasyan ve meslektaslarü2010, supra). Oligonükleotitler, 5'-p-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:01) ve 5'-p-CTGCTGCTGCT- GCTGCTG-3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:02), karlgtlîlhlgtlîlve oda slîlaklkjlia tavlanmlStB ligatlanmlgtlü PCR ile yükseltilmistir ve pYESZ-(CAG)n-eGFP'nin meydana getirilmesi için pYESZ-eGFP Sma I bölgesine klonlanmlstIEl Kpn I ve Bam HI parçalanmasEl/asüâislýla CAG fragmanlarlîbu yapllârdan sallEh'ilgtlE ve pYESZ-(CAG)n-ADE2'nin elde edilmesi adlEla aynlII restriksiyon enzimlerle parçalanan pYESZ-25Q-ADE2'ye klonlanmgtlü AyrlEla, haberci genler de pRS424'e alt klonlanmlgtlE Memeli hücrelerinde poIyQ-eGFP'nin eksprese edilmesi adüla, sablon olarak pYESZ-(CAG)n-eGFP'nin çesitli formlarII kullanüîthaslýla ilgili DNA fragmanlarEl PCR ile yükseltilmistir ve pTRE2-(CAG)n-eGFP'nin meydana getirilmesi adlEla pTRE2hng- HA'ya (BD Biosciences) klonlanmlgtlü Tüm yaolBr, DNA sekanslama ile dogrulanmlStE C. Maya genomunun genis-taramasüie basküliyIIEBir belirlenmesi RastlantEbl transpozon-arac[[[l]mutajenez, Dr. Snyder'in laboratuvar.. internet sitesinde açllZland[gEl üzere gerçeklestirilmistir ("httD://"nin” snvderlab.stanford.edu”nun baslîilei kovulmaslîla olusturulan adresteki internet sitesi). Kisacasü bir mTn-IacZZLEUZ insersiyon hücrelerinin dönüstürülmesi için kullanilE1lgtlEl Transformantlar, zengin YPDA ortamIa 2 sa boyunca kurtarilmlgtlîlve uygun seçim plakalarII üzerine yayllBwlglardB Hücreler 3 boyunca 30°C'de Inkübe eidilmistir ve ardIan galaktoz (%2) ve limitli adenin (4 ug/ml) içeren plakalara kopyalanmlSlardB Maya koloni renginin meydana gelmesinden sonra, adaylar (beyaz veya pembe koloniler), seçilmistir ve poIyQ-Ade2 proteinin çözülebilirligi, bir filtreli- tutma denemesi vasltâslîla dogrulanmlStE 150,000'den fazla transformant, bu taramaya tabi tutulmustur. Transpozon insersiyon bölgesi, invers PCR ile tanIilanmEtlElßcholes, D.T., Baneijee, M., Bowen, B., ve Curcio, M.J. (2001)). Multiple regulators of Ty1 transposition in Saccharomyces cerevisiae have conserved roles In genome maintenance. Genetics 159, 1449-1465. Aday klonlarI genomik DNA'sElizole edilmistir ve Rsa I ile parçalanmlStlB ardIan IN1 and IN2 primer setinin kullanIiglüDNA ligasyonu ve PCR yükseltmesi gerçeklestirilmistir ve ardlEUan SEK primerinin kullanIiglElDNA sekanslama gerçeklestirilmistir (Tablo Sl, asaglElh). D. Antikorlar Huntingtin (MA karsüntikorlar satI allülnlStlEl Kromatin immünopresipitasyon için kullanilan monoklonal anti-RNA polimeraz E. Biyokimyasal analiz Maya IizatlarII hazlEllanmasüdlEla, hücrelerin 10 OD600'ü toplanmlgtlü 1 mM Na3VO4, 1 mM D'I'I', 1 mM PMSF ve bir protaz inhibitörü kokteyli (Sigma) ile desteklenen ESB tamponu (%2 SDS, 80 mM Tris-HCI [pH içerisinde ask. tutulmustur, ardIan cam küreciklerde ögütülmüstür. Süpernatant, düsük hlîda santrifüjlemeden (600 g) leta ham Iizat olarak toplanmlgtlîl Tüm adllar 4°C'de gerçeklestirilmistir. Kültürlenen nöronlar, 1 mM Na3VO4, 1 mM D'I'I', 1 mM PMSF ve bir protaz inhibitör kokteyli ile Ham lizatlar, TBS tamponu (20 mM Tris HCI [pH7.5], ile 100 kat seyreltilmistir ve ardIan filtreli tutma denemesi için 0.2 pm selüloz asetat zarII veya bir slot blot denemesi için 0.45 iJm nitroselüloz zarlarII üzerine bosaltllü'ilgtlü Iki TBST (%0.05 Tween 20 ile TBS) durulamasII ardlEtlan, zarlar, Bio-Dot (Bio-Rad) aparatIan çlEarllBilStlEl ve %5 yagslîl süt tozu içeren PBS-T (1X PBS, %0.2 Triton X-100) ile bloklanmlgtlü birincil antikorlar ile 1 sa problanmlStlEl PBS-T ile 15 dk üç kez ylKbnmlStElve 1 sa boyunca yaban turbu peroksidazlEb konjugatlanan ikincil antikorlar ile inkübe edilmistir. 15 dk'llEl üç PBS-T ylElamasIan sonra, Western AydIatma kullanüârak sinyaller belirlenmistir (PerkinElmer Life Sciences). Esit miktardaki (10 veya 15 pg) protein lizatü SDS-poliakrilamid üzerinde ayrllîhlg'tlîl ve ard-an nitroselüloz zarlari transfer gerçeklestirilmistir. Immünoblotlama, özellikle yukari açlKIand[g]Eûizere gerçeklestirilmistir. Huntingtin varyantlarII analiz edilmesi ad., Tris-asetat poliakrilamid jelleri, daha iyi bir rezolüsyonun elde edilmesi için kullanllIhlgtlEl(Hu, J., Matsui, M., Gagnon, K.T., Schwartz, J.C., Gabillet, S., Arar, K., Wu, J., Bezprozvanny, I., ve Corey, D.R. (2009). AIIeIe-specific silencing of mutant huntingtin and ataxin-3 genes by targeting expanded CAG repeats in mRNAs. Nat Biotechnol 27, 478-484). F. Northern blot MayanI toplam RNA'sÇllelak asit fenol yöntemi kullanüârak izole edilmistir (Cheng and Gartenberg, 2000, supra). her bir numuneden 15 pg RNA, %1 agaroz jelleri üzerine yüklenmistir ve ayrllîhgtß ardlEtlan bir Naylon zara transfer gerçeklestirilmistir (Schleicher & Schuell). PCR DIG Probe Sentez Kiti (Roche) tarafIdan isaretlenen poIyQ ve SCRl problarII kullanHÜiasÜ/asßâslýla, zar, imalatçII (DIG Northern Starter Kit, Roche) önerisi üzerine hibridize edilmistir. G. Kromatin Immünopresipitasyonu (ChIP) Asagidaki modifikasyonlarla birlikte, ChIP, açüîlandlgilîüzere (Cheng and Gartenberg, 2000, supra) gerçeklestirilmistir. 12 sa %2 galaktoz ortamIa kültürlendikten sonra hücrele toplanmlgtlîl(50 ODGOÜ). Formaldehit fiksasyonunu takiben, hücre lizisinin baslatlßiasüdljîb 1.
  2. 2 M sorbital içerisinde zimolyaz ile 1 sa islem görmüstür. Kromatin toplanmlgtlü 0.1X TE tamponu ile yilZlanmlStlEl ve mikrokokal nükleaz kullanilârak parçalanmlgtlEl (New England Biolabs). RNA polimeraz II ile iliskili olan kromatin, protein A agaroz küreciklerine (Upstate) baglanan anti-RNA polimeraz antikoru (Abcam) vasßslîla çökeltilmistir. YlKlama tamponu 3 ve ChIP dn alt akiglîdaki DNA bölgesi için; ChIP DNA alanlarlElI yükseltilmesi için kullanllBIIStE Oligonükleotit sekanslarÇl asag-ki Tamamlaylaîl'ablo Sl'de listelenmektedir. H. Hücre kültürü ve transfeksiyonu Mürin striyatal nöral hücre hatlarDST14A (sigian), HdhQ7/Q7 (fare), HdhQlll/Q111(fare), ve HdhQ7/Qlll (fare), %10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenen Dulbecco'nun modifiyeli Eagle ortamIa (SH30022, HyClone), 33°C'de %5 COZ ile kültürlenmektedir. Tetrasiklinin yoklugunda pTREZ-(CAG)n-eGFP eksprese eden sabit hücre hattII ST14Atat olusturulmaslîl ad. ST14A, pTet-Off plazmidi (BD Biosciences) ile transfekte edilmistir. DNA ve siRNA transfeksiyonlarlÇ] LipofectAMINE kullanilarak gerçeklestirilmistir. 100 nM Supt4h siRNA (DHARMACON, ON-TARGET plus SMART pool, L-048866-01) ve (DHARMACON, UCUCUCGAUUUGUAGGCCAUU-3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:04)), süsma fare ve sigian hücrelerin Supt4h ekspresyonunun inhibe edilmesi için kullanllüilgtß Hiçbir geni deheflemeyen, tavlanmlg çift zincirli oligonükleotitlerin (5'-UUCUC-CGAACGUGUCACGUTT-3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:05) ve 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA'lT-3' (SEKANS KIMLIK NUMARASI:06)) es deger bir miktari. transfeksiyonu, bir kontrol olarak islev görmüstür. AçllZland[g]i:üzere (King, C.Y., Wang, H.L., ve Chang, H.Y. (2006). Transformation of yeast by infectious prion particles. Methods 39, 68-71), maya hücreleri RNQl-GFP plazmid ile dönüstürülmüstür ve ardIan [PIM] priyonlarII izlenmesi acl. 100 nM CuSO4 içeren bir yetistirme ortamIa kültürleme gerçeklestirilmistir. PolyQ-eGFP agrega olusumu, %2 galaktozun bulundugu bir ortamda maya hücrelerinin kültürlenmesi vasüsüla gen indüksiyonundan sonra izlenmistir. 2, 4 ve 8 sa zaman noktalarlEkIa, bir agaroz pedi üzerindeki tek bir kavite slaytII yerlestirilmistir ve bir 100X yag Immersiyon objektifine sahip Axioskop 2 (Carl Zeiss) floresan mikroskopu kullanilarak görsellestirilmistir. Diferansiyel interferans kontrastüDIC) görüntüleri, faz kontrastEiçin aIlEmlgtE Benzer sekilde, ST14AtEt için, hücreler lamellerin üzerinde tohumlanmlgtßve siRNA ve poIi-eGFP plazmid yapilârlýla ko-transfekte edilmistir. Görüntüleme, 24 saatte gerçeklestirilmistir. J. Hücre yasayabilirligi Bu deneme, açllaandlglülizere (Varma, H., Voisine, C., DeMarco, C.T., Cattaneo, E., L0, D.C., Hart, A.C., ve Stockwell, B.R. (2007). Selective inhibitors of death in mutant huntingtin cells. Nat Chem Biol 3, 99-100.) ufak modifikasyonlarla birlikte gerçeklestirilmistir. ST14AtEt hücreleri, 1 x 105/çukurcuk yogunlugunda 12-çukurcuk plakasElhalinde plakalanmlgtlü SIRNA ve pTREZ-(CAG)n-eGFP plazmid yapüârII (7Q veya 81Q) ko-transfeksiyonunun ardIan, hücreler 33° C'de 36 sa inkübe edilmistir. Kültürler HBSS ile yllZhnmlStlElve ortam düsük serum içeren (%O.5 FBS) bir ortamla degistirilmistir, ve hücreler 39° C'de inkübe edilmistir. 4'üncü günde, hücreler tripsinlenmistir ve yasayabilir hücrelerin saylgütripan mavisi boya ile dlglama yöntemi kullanilârak sayilBiIStB K. Ters transkripsiyonlu PCR ve niceliksel RT-PCR Toplam RNA, TRI ayracE(Sigma) kullanllârak izole edilmistir ve her numuneden alIElan esit miktardaki (5 pg) RNA, ters transkriptaz vaslBisEla cDNA'ya dönüstürülmüstür (SuperScript dNTP'ler ile karlStlEllIB'ilStE Karisimi, 65° C'de 5 dk inkübe edilmistir ve ardlîitlan buz üzerinde sogutulmustur. Birinci-Zincir Tamponu D'I'I' (Cf = 10 mM) ve 1 pL ters transkriptazI ilave edilmesinden sonra, tepkime 42°C'de 1 sa gerçeklestirilmistir. Esit hacimdeki cDNA ürünleri, PCR vaslliislîla yükseltilmistir ve SnRNA U6'nI kontrol olarak islev görmesiyle birlikte ilgili transkript seviyelerinin belirlenmesi ad. ürünler, %2.5 agaroz jellerinin üzerinde ayrlgtlîlllÜilStlE PCR primer setleri, tamamlaylEEI'ablo Sl'de gösterilmektedir. Kantitatif gerçek zamanlü PCR, bir StepOnePlus Gerçek ZamanlE] PCR sisteminin (Applied Biosystem) kullanllîhaslýla gerçeklestirilmistir ve Kantitatif-Karsllâstlîilnallîl CT (AACT) programII kullanüîhasüla analiz edilmistir. L. Primerler TamamlaylEILTablo 51 Bu çallglnadaki deneylerde kullanllân oligonükleotit primerlerinin bir özeti SEK primerleri Northern blot problarlîl polyQ-5' primeri polyQ-3' primer SCR1-5' primeri SCR1-3' primeri 5'-ACTACAAGGACGACGATGAC-3' 5'-CCTCCTAATATACCAACTGTTC-3' 5'-GGCTGTAATGGCTTI'CTGGTG-3' TRP1-5' primeri TRP1-3' primeri ChIP prom-S' primeri ChIP prom-3' primer ChIP dnSOO-S' primer ChIP dn500-3' primer ChIP dnlOOO-S' primer ChIP dn1000-3' primeri 5'-CAATGGACCAGAACTACCTGTG-3' 5'-GAAGGCCTTCATCAGCT`ITI'C-3' Tubala rtPCR-S' primeri Tubala rtPCR-3' primeri Tubala qPCR-3' primeri Supt4 rtPCR-S' primeri Supt4 rtPCR-3' primeri Supt4 qPCR-3' primeri Htt rtPCR-S' primeri Htt rtPCR-3' primeri SnRNA U6 rt-PCR primeri SnRNA U6-5' primeri SnRNA U6-3' primeri 5'-CCATI'GGCAAGGAGATCATI'G-3' 5'-CTTFCCGTAATCCACAGAGAG-3' 5'-TCATTGCGATGATGAGTCCAG-3' 5'-GCTGTGTCTCTGGATI'I'GTAG-3' 5'-GTCACACTCCAACACATAGAG-3' 5'-AAAAATATGGAACGCTI'CACGA-3 5'-CTCGC'ITCGGCAGCACATAT-3' 5'-TATGGAACGCTTCACGAATITG-3' Uzun polyQ gerilmeleri içeren proteinler, yanllg katlanmaya ve bunun sonucu olarak agregasyona yatkI olduguna inanIIBiaktadIElve bu proteinlerin aktivite kaybÇIbu tür olaylara atfedilmistir (Krobitsch, S., ve Lindquist, S. (2000). Aggregation of huntingtin in yeast varies with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins. C.A., Bernstein, E.M., Cearley, J.A., Wiener, H.W., Dure, L.S.t., Lindsey, R., Hersch, S.M., Jope, R.S., ve meslektaslarlî(1997). Ectopically expressed CAG repeats cause intranuclear inclusions and a progressive late onset neurological phenotype in the mouse. Cell 91, 753- 763). Uzun-polyQ proteinlerine aktivitesini geri kazandlüan olasEl hücresel islevlerin kesfedilmesi ad., mutant maya klonlarII renk-baziEitanilamasIElmümkün kilân bir sistem gelistirdik, burada genislemis polyQ tekrarlarIEbarIiElnasEiçin tasarlanan bir maya proteini, enzimatik olarak islevsel hale gelmektedir. P-ribozilamino amidazolün (AIR) p- ribozilamino imidazol karboksilata (CAIR) metabolik sekilde dönüstürülmesi, Ade2 proteini tarafldan mayada dolayilanmaktadlElOones, E.W., and Fink, G.R. (1982). Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression içinde, J.N. Strathern, Jones, E.W., & Broach, J.R., ed. (Cold Spring Harbor NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. p.181- 299): ADE2 içerisinde kromozomsal olarak mutasyona ugrayan maya hücrelerinde, AIR birikmektedir ve koloni renginde beyazdan klülnlîlýla dogru bit degisimi baslatmaktadlE(Sekil 1A). Galaktoz ile indüklenebilen bir baslat-I kontolü altlEUa, yaban tipi Ade2 proteini, veya polyQ'nun klgla veya uzun tekrarlarIEKZSQ-AdeZ or 97Q-Ade2, sßsüla) içeren proteini üreten plazmidlerin bir serisini meydana getirdik (Sekil 18). Ade2 yetersizliginin künlîljenk özelligi, yaban tipi Ade 2 proteinin veya 25Q-Ade2'nin ektopik ekspresyonu vasltâslýla tersine çevrilmistir, ancak 97Q-Ade2 eksprese eden naya tarafüdan üretilen külnlîlîenkli kolonilerin istikrarliüglüll gösterdigi 97Q-Ade2 ekspresyonu vasißsiýla tersine çevrilmemektedir (Sekil 1C). Ancak, polyQ proteini agregasyonu için gerekli oldugu bilinen (Krobitsch and Lindquist, 2000, supra), saperonin proteini Hsp104'teki bir mutasyonu da taslîlan adeZ mutant maya hücrelerinde, 97Q-Ade2 proteininin, biyokimyasal olarak aktif hale getirildigini kesfetmis bulunmaktaylZ(Sekil 1C). Bir filtreli tutma denemesi (Scherzinger, E., Lurz, R., Turmaine, M., Mangiarini, L., Hollenbach, B., Hasenbank, R., Bates, G.P., Davies, S.W., Lehrach, H., ve Wanker, E.E. (1997)). Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-Iike birlikte H5P104+ 'de 97Q-Ade2 protein agregalarII olusumunu dogrulamlStlEl(Sekil 1D). Klgla polyQ tekrarlarElçeren diger proteinlerin bir özelligi oldugu üzere (Krobitsch ve Lindquist, HSP104* hücrelerinde gözlemlenmemistir. A. Uzun polyQ genislemeleri içeren proteinin aktivitesini sürdüren maya mutasyonlarII belirlenmesi 97Q-Ade2 yap-[El, enzimatik olarak aktif olan bir Ade2 proteini üretmesini mümkün kilân 5. cerew'5/ae mutasyonlar. yönelik fenotipik bir tarama, transpozon însersiyon mutajenezi kullanilârak gerçeklestirilmistir. Bu tarama, koloni renginin klan-n pembeye veya beyaza döndügü çoklu klonlarübelirlemistir. Nükleotit sekanslama ile birlikte invers PCR DNA sentezi, sasIlEEblmayan bir sekilde bu klonlardan bazllârllül, Hsp104 veya [PI/W] prion proteini Rnql'i kodlayan genlerin içerisinde bulunan bir transpozon içerdigini göstermistir, her bunlardan ikisinin de, mayadaki polyQ proteininin agregasyonu için gerekli oldugu bilinmektedir (Meriin ve meslektaslarü 2002, supra). Ancak, bizim taramamlî) Hsp104 ve Rnql'in saglam oldugu bir klonu (klon 23-44) tespit etmistir ve ayrlîla, bu klonda, transkripsiyon elongasyon faktörü Spt4'ü (Sekil 1E) kodlayan genin içerisine bir transpozonun yerlestirildigi, bunun da; 5P7'4'ün islev kaybIIîil, 97Q-Ade2 yap-I islevsel bir 97Q-Ade2 proteinini üretmesini mümkün kllBialeta yönelik olasll]g]l3brtaya çlâkrdlglllîgöstermektedir. Bu hipotez, bir spt4 kopmasII (spt4A), adeZ-J kromozomal mutasyonu içeren bir susun içine verilmesiyle dogrulanmlgtlü Klon 23-44 için gözlemlendigi üzere, Hsp104 proteini ve [PI/W] prion proteininin (Sekil 8) normal ekspresyonunu sergileyen 23-44 klonuna benzer spt4A susundaki 97Q-Ade2 proteini ekspresyonu, hem açllZJ pembe koloni rengiyle sonuçlanmlgtlîl hem de polyQ'ya baglIilElprotein agregalarlElEl olusumunun azalmasüla sonuçlanmlgtlîl (Sekiller IP ve 1G). B. $PT4 mutasyonu, çoklu CAG tekrarlarEliçeren mRNA'nI transkripsiyonuna seçici sekilde müdahale ederek, polyQ'nun uzun gerilmelerini içeren proteinin agregasyonunu azaltmaktadlIl spt4A hücreleri, bu transkriptler tarafIan kodlanan hem 97Q-ADEZnin hem de polyQ proteininin bollugunun indirgendigini göstermistir (Sekiller 28 ve 2C). PoIyQ proteinin in vitro agregasyonunun genislemesinin, protein konsantrasyonu ile ilgili oldugu bildirildiginden dolayEllScherzinger, E., Sittler, A., Schweiger, K., Heiser, V., Lurz, R., Hasenbank, R., Bates, G.P., Lehrach, H., ve Wanker, E.E. (1999). Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloidlike fibrils: implications for Huntington's disease pathology. 97-Ade2 proteini üretimindeki azalmanIEl, proteinin agregasyonunun azalmaleb ve islevselliginin artmaleb neden olmaya yeterli olup olmadlglIElögrenmeyi istedik. Kültür ortamIaki baslatlEEilnhibe edici glukoz konsantrasyonunun degistirilmesi vasßslýla, GALJ baslat-an 97Q-ADEZnin transkripsiyonunun kapsamIEçesitlendirdik (Sekil 11). 97Q- Ade2 ekspresyonu azaldllZlça, agregasyon bununla iliskili olarak azaIdEil'e 97Q-ADE2 eksprese eden kolonilerdeki klîrlnlZElrengin yogunluga da buna baglElolarak azaldEl(Sekil 11). Bu bulgular; spt42] hücrelerindeki 97Q-Ade2 proteini için gözlemlenen azalan agregasyon ve adeZ yetersizliginin es zamanlEl komplementasyonunun, mutant proteinin hücresel konsantrasyonundaki düsüsün bir sonucu oldugunu göstermektedir. RNA polimeraz II vasiûislîla mRNA sentezinin tümündeki azalma ile sonuçlanan maya hücresi mutasyonlarII aksine (Rondon, A.G., Garcia-Rubio, M., Gonzalez-Barrera, S., and Aguilera, A. (2003). Molecular evidence for a positive role of Spt4 in transcription elongation. EMBO J mRNA'niEl üretimi üzerinde (Sekiller 2C), veya bu mutant geni taslýbn maya kolonilerinin rengi üzerinde (Sekiller 28 ve 2A) oldukça az bir etki göstermektedir, bu da Spt4'ün, yalnlîta kisa bir CAG tekrarElgerilmesi içeren transkriptlerin uzatllfnasEliçin gerekli olmadlglIEl göstermektedir. Spt4'ün, özellikle uzun bir CAG tekrarlîgerilmesi içeren genlerin ekspresyonu için gerekli oldugu, kiîbya karslîüzun gerilmeleri (99Q-ADE2 and 29Q-ADE2, süsiîla, Sekil 10) barlEtlEn haberci gen yapllârII kullanilBiasMa dogrudan dogrulanmlStB Uzun trinükleotit tekrarElgerilmelerine sahip transkriptlerin spesifik olarak uzatllBias. yönelik maya hücresi gerekliligi, Ade2 kodlayan transkriptler ile sIlEllmegildir: 5P7'4 kopmasüja, 65 CAG tekrarübarilün bir yap-n (yani, 65Q-eGFP) GFP proteini agregasyonunun gecikmesi ve indirgenmesi ile sonuçlanmlstE(Sekil 2D). Spt4 gibi, Hpr1, Mftl, Th02, ve Thp2 proteinlerinin etkilesimi vasiûslîla olusturulan THO kompleksi, RNA polsmeraz II taraflEdan transkript uzatHBiasIEisaglamaktadlE Ancak THO kompleksi, çoklu, art arda tekrarIEsekanslarEbarIEtllßn maya genlerinin transkripsiyonu için gereklidir (Voynov, V., Verstrepen, K.J., Jansen, A., Runner, V.M., Buratowski, S., ve Fink, G.R. (2006). Genes with internal repeats require the THO complex for transcription. Proc Natl different mechanisms (Mason, P.B., and Struhl, K. (2005). Distinction and relationship between elongation rate and processivity of RNA polymerase II in vivo. Mol Cell 17, 831- zararlßlan hücrelerin, 25Q tekrarlarIEliçeren Ade2 proteininin yanüsß 97Q tekrarlarIIZI(Sekil 2E) içeren Ade2 varyantII üretiminin ciddi bir sekilde derecede bozulmus oldugunu göstermistir (Sekil 2E), ve tesadüfi bir sekilde eksprese edilen yapHârI her ikisi taraflEblan adeZ yetersizliginin komplementasyonunu göstermede basarlgZolmustur (Sekil 2F). Bu sonuçlar; Spt4'ün aksine, THO'nun, CAG trinükleotit tekrarII klîla veya uzun gerilmelerini Içeren transkriptler arasiEUa bir ayrn yapmad[gll3/e THO yetersizliginin, poIyQ protein sentezinde genel bir eksiklige yol açt[g]lElügöstermektedir. 5PT4teki mutasyonun, yüksek GC içerigine sahip genlerin transkripsiyonunu özellikle etkiledigi bildirilmistir (Rondon ve meslektaslarü2003, supra) ve biz de CAG tekrarlarII uzun gerilmelerinin, bu gen taraflEUan kodlanan transkripsiyon elongasyon faktörünün etkinlikleri tarafIan asilân RNA polimeraz II için bir lokal bariyer meydana getirebilecegine yönelik bir hipotez kurduk. DNA sablonlar.. farklEbölümleri üzerindeki RNA polimeraz II isgalinin belirlenmesi adlEh kromatin immünopresipitasyon denemelerini kullanarak, 99 CAG tekrarlarII bir gerilmesinin alt aklglüjaki transkript sekanslar- baglanan enzim miktarü spt4 yetersizligi tarafIan indirgenirken, bir 29 CAG tekrarüsegmentinin üst akEEl/eya alt aklSlEUaki DNA bölümlerinin isgalinin, SPT4+ ve spt4A hücrelerinde benzer oldugunu kesfrettik (Sekil 3). Bu bulgudan su çilZlarIiElyapmaktaylîl CAG tekrarlarII k& bir gerilmesini içeren bir bölgeden transkripsiyonel makinenin geçisi için Spt4 gereksizdir, ancak polimerazlEl, CAG tekrar sekansII uzun bir genislemesi boyunca ilerlemesi için gereklidir. C. $PT4 mutasyonu, kßh polyQ gerilmeleri içeren normal proteinin islevini, bir arada bulunan uzun polyQ proteini ile ko-agregasyonlarlazaltarak artlîhiaktadlIl Genislemis bir polyQ tekrarEliçeren proteinlerin, polyQ'nun klg, patojenik olmayan bir gerilmesini içeren proteinler ile etkilesimi, hem memeli hücrelerinde hem de mayadaki k& ve uzun polyQ proteinlerinin ko-agregasyonu ile sonuçlanmaktadlî](Duennwald, M.L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P.J., ve Lindquist, S. (2006). A network of protein interactions A., Preisinger, E., Dranovsky, A., Goldgaber, D., ve Housman, D. (1999). Insoluble detergent-resistant aggregates form between pathological and nonpathological lengths of yetersizligi taraflTiUan uzun polyQ proteini agregasyonunun indirgenmesinin, bir arada bulunan normal polyQ proteini etkileyip eykilemedigini ögrenmek adlEh, hemaglutinin ile C- terminal ucunda isaretlenen 29Q-Ade2 ile 99Q-Ade2'nin ko-agregasyonunu gerçeklestirdik (29Q-Ade2-HA) ve kolorimetrik deneme ve proteinlerin ko-agregasyonu üzerindeki Ade2 islevinin üzerindeki $PT4 mutasyonu etkilerini inceledik. Yukarlflia açlEland [gllîüzere, yaban tipi ekspresyonu, bir beyaz koloni rengi ile sonuçlanmlSIlEl Ancak, 29Q-Ade2-HA, 99Q-Ade2 ile birlikte eksprese edildiginde kEnlZEbir hücre rengi gözlemlenmis (Sekil 4A) olup, bu, yalnlZ üzerinde fenotipik olarak dominant oldugunu göstermektedir. Bu sonuç ile uyum olarak, normalde uzun polyQ proteinin yoklugunda çözünebilir olan 29Q-Ade2-HA, hücresel agregalarda mevcut olup, 99Q-Ade2 eksprese eden hücrelerde olusmaktaydEKFigure 4B). 99Q-Ade2 ekspresyonunun, birlikte var olan 29Q-Ade2-HA üzerindeki etkisi, Spt4 yetersizligi vasßlea büyük oranda indirgenmistir ki bu da, koloni renginin klEln-n beyaza dönüsmesi ile ortaya çiKlnlgtlEl (Sekil 4A). Ilaveten, ilgili protein ve mRNA miktarElSpt4 eksikliginden dolaylîdegismemis olsa da (Sekiller 48 ve 4C), 29Q-Ade2-HA agregasyonunun genel kapsamüspt4 mutant hücrelerinde büyük oranda azalmlgtlü (Sekil 48). Bu sonuçlar gösteriyor ki CAG tri-nükleotit tekrarlarlBJI uzun gerilmelerini içeren genler taraf-an kodlanan protein üretiminin, Spt4 tarafIan seçici regülasyonu, ilaveten, klgia CAG tekrarlarEl içeren, birlikte var olan allel tarafIan kodlanan proteinin agregasyonunu ve islevini de dolaylüilarak etkilemektedir. D. Spt4'ün bir memeli ortologu olan Supt4h, nöronlardaki polyQ proteinlerinin bollugunu ve agregasyonunu etkilemektedir SPT4 maya ve memeli hücreleri arasIa oldukça korumalIlEl ve maya Spt4 yetersizligi, memeli hücreli ortologu Supt4h tarafIdan islevsel olarak tamamlanabilmektedir (Hartzog, G.A., Basrai, M.A., Ricupero-Hovasse, S.L., Hieter, P., ve Winston, F. (1996). Identification and analysis of a functional human homolog of the SPT4 gene of Saccharomyces cerevisiae. indirgemek ad. siRNA kullanarak (Ehrlich, M.E., Conti, L., Toselli, M., Taglietti, L., Fiorillo, E., Taglietti, V., Ivkovic, S., Guinea, B., Tranberg, A., Sipione, S., ve meslektaslarE(2001). Supt4h'ün yaklaslEJ olarak %60 asagEregülasyonunu sergileyen bir hücre popülasyonunda, agregallZleGFP-pozitif odak noktalarElsergileyen hücre say-IE] yaklasilZl olarak yarlZl/arüla düstügünü (Sekiller 5A ve SB) ve polyQ'nun 81 amino asit gerilmesini içeren bir GFP proteininin (yani, 81Q-eGFP) hücresel bollugun indirgendigini, ve bir negatif kontrol siRNA ile transfekte edilen bir hücre popülasyonuna klýbsla eGFP proteinin tüm agregasyonunun, %65 oranIda azald[gliîllî(lSekil SC) kesfetmis bulunmaktaylîl Bunun aksine, 7Q-eGFP ekspresyonu, Supt4h son darbesinden yalnlîta minimal sekilde etkilenmis olup (Sekiller 5A, SB ve 5C) bu, kisa polyQ kodlayan mesajlari saglanmaslîl ad. diger transkripsiyon elongasyon bilesenlerinin, Supt4h'nin yoklugunu büyük oranda telafi ettiklerini göstermektedir. Genislemis polyQ gerilmeleri içeren proteinlerin agregasyonu nöronal hücreler için zehirli oldugundan dolayEQLi, H., Li, S.H., Johnston, H., Shelbourne, P.F., ve Li, X.J. (2000). Amino- terminal fragments of mutant huntingtin show selective accumulation in striatal neurons and synaptic toxicity. Nat Genet 25, 385-389; Varma, H., Voisine, C., DeMarco, C.T., Cattaneo, E., Lo, D.C., Hart, A.C., ve Stockwell, B.R. (2007). Selective inhibitors of death in mutant huntingtin cells. Nat Chem Biol 3, 99-100), Supt4h son darbesi aracllgllýla polyQ agregasyonunun atenüe edilmesi vasltâslýla hücre hayatta kalIiIlEl artlElIJBl artlîllâmayacagllîsorguladm ST14A hücreleri, Supt4h siRNA'nI varliglIa veya yoklugunda polyQ-eGFP yapllârlîile transfekte edilmistir. Sekil 5D'de görüldügü üzere, umulmadllö bir sekilde 81Q-eGFP proteinini eksprese eden ST14A hücrelerinin azalan yasayabilirligi, 5upt4/7'ye karsEyönlendirilmis olan siRNA tarafIan tersinmistir ve bu siRNA'nlEl, 7Q-eGFP proteinini üreten hücrelerin yasayabilirligi üzerinde saptanabilir bir etkisi olmamlgtlîl Supt4h son darbesinin, huntingtin (Htb'nin üretimi etkilerini ögrenmek ad., homozigot HdhQ7/Q7 ve HdhQlu/Qlll ile çarpllân farelerden elde edilen striyatal nöronlar (Trettel, F., Rigamonti, D., Hilditch-Maguire, P., Wheeler, V.C., Sharp, A.H., Persichetti, F., Cattaneo, E., ve MacDonald, M.E. (2000). Dominant phenotypes produced by the HD mutation in darbesinin ardIan analiz edilmistir. Hem RT-PCR hem de kantitatif gerçek zamanllZlRT-PCR, elongasyon faktörü eksik olan hücrelerdeki a-Tubu//n mRNA bollugu gibi, HttQ7 mRNA bollugunun, Supt4/1ye karsEyönlendirilen siRNA ile islem gören hücrelerde yalnlîta klîlnen azald [gllügöstermistin Ancak, mutant HttQlll mRNA bollugu, Supt4h mRNA'ya yönelik benzer bir indirgemeye sahip olan hücrelerde büyük oranda azalmßtlîl(Sekiller 6A ve 6B). HttQlll mRNA'nlEl gözlemlenen indirgenmesiyle es zamanlüalarak, H yalnlîta klgla glutamin gerilmeleri içeren HttQ7 ve Tbp üretimi, Supt4h asagüegülasyonu taraflEblan tespit edilebilecek kadar etkilenmemistir (Sekil 6C). Önemli olarak, heterozigot HdhQ7/Qlil hücrelerindeki Supt4h son darbesi, HttQ111 ve Supt4h proteinin, Supt4h siRNA'nI varllgilda birlikte indirgendigini, ancak aynlZlSupt4/7 son darbesinin, HttQ7 ekspresyonu üzerinde oldukça az etkili oldugunu göstermistir (Sekil 6D). Bu bulgular göstermektedir ki Supt4h, fare striyatal nöronlarIaki mutant Htt allel ekspresyonu için farkllîlaçllârdan gereklidir. Uzun tri-nükleotit tekrarlarEliçeren genlerin ekspresyonundaki transkripsiyon elongasyon faktörleri Spt4 and Supt4h'nin spesifik rolünü ortaya çlElaran arastlülnalarllîl diger mRNA'lar taraflEUan kodlanan proteinin normal sentezine izin verirken, uzun tri-nükleotit tekrarEI transkriptleri tarafIan etkilenen agregasyon proteinlerinin indirgenmesine yönelik bir yaklasli sunmaktadlE Ancak, genislemis polyQ traktlarülçeren proteinlerin, yanllglkatlamaya egilimli olduklarII belirtilmesine ragmen (Krobitsch and Lindquist, 2000, supra; Ordway ve meslektaslarÇl1997, supra), bizim elde ettigimiz sonuçlar göstermektedir ki eger üretimleri, agregasyonunu azaltmaya yeten bir seviyeye indirilirse uzun polyQ proteinleri, enzimatik aktiviteye yetecek kadar katlanabilmektedir. Mayada, uzun polyQ tekrarlarügeren proteinlerin sentezinin, Spt4 yetersizligi taraflEldan, proteinin islevselligini geri kazandßn bir seviyeye indirgendigini göstermis bulunmaktaylîl Bu sartlar altIa, genislemis polyQ tekrarlarEilçeren proteinin islevini etkileyen odak noktalarII belirlenmesi için kullandigEilZ denemede, agregasyonlu olmayan polyQ proteini, adeZnin yetersizligini tamamlayabilmektedir. Maya ve memeli hücreleri üzerindeki Spt4 (Supt4h) etkisinin allele özgü oldugunu göstermis bulunmaktaylîl Spt4 yetersizligi, RNA polimeraz II'nin CAG tekrarlarII genislemis gerilmeleri boyunca ilerlemesi yetisini spesifik sekilde azaltmlgtlüve birlikte var olan, mutant olmayan bir Htt allelinden elde edilen transkriptleri ciddi derecede etkilemeden, bu transkriptlerin kodladlgiEbroteinlerin bollugunu azaltmlgtlEl Htt, embriyonik olarak ve yetiskinlerdeki normak nörolojik islev için gerekli oldugundan dolayüDragatsis, I., Levine, M.S., and Zeitlin, S. (2000). Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nat Genet 26, 300-306; Nasir, J., Floresco, S.B., O'Kusky, J.R., Diewert, V.M., Richman, J.M., Zeisler, J., Borowski, A., Marth, J.D., Phillips, A.G., and Hayden, M.R. (1995). Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic Iethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell 81, 811-823), mutant Htt proteinin nörotoksisitesinin farkllîaçllârdan indirgenebilmesi HD hastalar. faydalEblacaktlEl ve Supt4h'nin küçük molekül inhibitörleri, Huntington hastal[glII tedavisi için uygulanabilir bir yaklasIidlEl Scherzinger ve meslektaslarlZl(1999, supra), monomer konsantrasyonu kritik bir seviyeyi asmadan, amiloid benzeri huntingtin protein agregalarII in vitro olusumunun gerçeklesmedigini kesfetmislerdir. Bizim elde ettigimiz sonuçlar, uzun polyQ gerilmeleri içeren proteinlerin konsantrasyonunun, bu proteinlerin I'n Viva sekilde patolojik agregasyona ugrayabilmesinde kritik bir belirleyici oldugunu göstermektedir ve ayrEb uzun polyQ proteinin, agregasyonun azaltIIgiüve islevselligin geri kazand-[gilZIbir konsantrasyona düsürülmesinin degerini göstermektedir. AyrIEla, önemli bir sekilde, önceden gözlemlenen (Duennwald ve meslektaslarü2006, supra), normal bir kisa polyQ proteininin, aynElhücredeki bir ikinci allel tarafldan meydana getirilen genislemis bir polyQ proteini ile ko- agregasyonunun, uzun polyQ varyant proteininin bollugundaki bir azalma ile ciddi derecede indirgenebildigini kesfetmis bulunmaktaylîl DolaylgEa, Supt4h islevi ile müdahale valeisEla mutant Htt proteini bollugundaki indirgeme, yalnlîta mutant proteini agregasyonunun dogrudan zehirli etkilerini azaltmamaktadß ayrlîb birlikte var olan yaban tipi proteinin islevinin aitlEIB1asIlIclla olanaklEIkiIâbilmektedir. Insan Supt4h, normalde, Supt5h ile bir kompleks olusurmaktadlÜ tlîikünaya ortologunun, transkripsiyon elongasyonunu regüle etmek için yapttglEgibi (Guo, M., Xu, F., Yamada, J., Egelhofer, T., Gao, Y., Hartzog, G.A., Teng, M., ve Niu, L. (2008). Core structure of the yeast spt4-spt5 complex: a conserved module for regulation of transcription elongation. Structure Ferdous, A., Imai, T., Hirose, S., Sugimoto, S., Yano, K., Hartzog, G.A., Winston, F., ve meslektaslarEI(1998). DSIF, a novel transcription elongation factor that regulates RNA polymerase II processivity, is composed of human Spt4 and Spt5 homologs. Genes Dev 12, the human transcription elongation factor DSIF hSpt4 subunit in complex with the hSpt5 dimerization interface. Biochem J 425, 373-380). Bu kompleks, RNA polimerazElI'nin sarmal alanlEla baglIlElve islenebilirligi tesvik etmek adüb DNA'yEevrelemektedir (Klein, B.J., Bose, D., Baker, K.J., Yusoff, Z.M., Zhang, X., ve Murakami, KS (2011). RNA polymerase and transcription elongation factor Spt4/5 complex structure. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 546- 550; Martinez-Rucobo, F.W., Sainsbury, S., Cheung, A.C., ve Cramer, P. (2011). Architecture of the RNA polymerase-Spt4/5 complex and basis of universal transcription processivity. baglama partneri Spt4 ile etkilesimde bulunamayan bir özgün 5pt5 mutantEitarafiEtlan yinelenebilmektedir (Sekil 11). Dolayßýla, transkripsiyon elongasyonuna yönelik bütünlüklü bir Spt4/5 kompleksi, genislemis polyQ'yu kodlayan mRNA'IarI üretimi aç-an önemlidir. SPT4, temel bir gen 0Imad[g]Ian dolayEdMalone, E.A., Fassler, J.S., and Winston, F. (1993). Molecular and genetic characterization of SPT4, a gene important for transcription initiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 237, 449-459) ve kristal yapüanalizlarlîl tarafIan gösterildigi üzere, bunun kodladlglürotein, RNA polimerainIe dogrudan temasta bulunmadtgiian dolayü Spt4'ün, DNA'ya, dlgtirln transkripyion kabarc[gi. baglanarak polimeraz/sablon komplekslerini stabilize eden bir “üst akE DNA tutucusu” olarak islev görmesi muhtemeldir (Klein ve meslektaslarÇiZOll, supra; Martinez-Rucobo ve meslektaslarÇI 2011, supra). Spt4'teki çinko parmak alanEibu protein-DNA etkilesimine araclIJIîl etmektedir ve bu alanüetkisizlestiren nokta mutasyonlarü uzun polyQ gen ekspresyonu üzerinde, SPT4 kopmasEiIe aynüatkiye sahiptir (veriler gösterilmemektedir)- bu da su anlama gelmektedir; Spt4'ün kompleksi stabilize eden etkinlikleri, çoklu CAG tekrarlarEiçeren sablon bölgeleri vasitîhsüla RNA polimerazEJI transkripsiyonu için önemlidir. Bu arastEnalar süleUa, CAG tekrarlarII uzun bir gerilmesinin, hem maya hem de memeli hücrelerindeki transkript bollugunu azalttlgllüesfetmis bulunmaktaylîl Özellikle, Supt4h'nin varllg1Ia bile, mutant Httallelinin transkriptleri, HD hastalarlEUan elde edilen fibroblastlarI yanlis& çarpilân farelerden elde edilen nöronlardaki yaban tipi transkriptlerinden daha az verim ile üretilmistir (Sekil 6A ve Sekil 12). In vitro sekilde, genislemis CAG tekrarlarIlEl, gövde tekrarlarlj/eya daha üst düzey DNA yaplßrüneydana getirdigi (Lenzmeier, B.A., ve Freudenreich, C.H. (2003). Trinucleotide repeat instability: a hairpin curve at the crossroads of replication, recombination, and repair. Cytogenet Genome Res 100, 7-24), ve RNA polimeraz II'nin geçici olarak duraklatllBias. ve sablondan ayrllBialeUa sebep olmaktadß Elde ettigimiz veriler göstermektedir ki bu tür bir yaplîal bariyer tarafIan meydana getirilen transkripsiyonel blok, tekrar sekansII uzunlugundan etkilenmektedir. Elde ettigimiz sonuçlar göstermektedir ki Spt4 islevinin yoklugunda, genislemis CAG tekrarEbölgelerindeki sablIan RNA polimerazII ayrliîhaslîlartmakta olup, bu, 1) genislemis tekrara uzak olan kalllîla baglEbolimerazI azalmasüZ) transkript bollugunda genel bir azalma, 3) uzun poIyQ protein üretiminin azalmasEl ve 4) bu proteinin agregasyonunun azalmaslZl ile sonuçlanmaktadlü Sekil 7'de gösterilen mekanik model, Supt4h islevlerini hedef alan HD karslZl önlemlerine yönelik bir moleküler temel saglamaktadlB Güncel çalismalar göstermektedir ki mutant Htt bollugundaki allele özgü indirgeme, RNAI- bazlüiaklasIiIlar kullanilîhaslýla (Hu, J., Matsui, M., Gagnon, K.T., Schwartz, J.C., Gabillet, S., Arar, K., Wu, J., Bezprozvanny, I., ve Corey, D.R. (2009). AlleIe-specific silencing of mutant huntingtin and ataxin-3 genes by targeting expanded CAG repeats in mRNAs. Nat Biotechnol 27, 478-484; Pfister, E.L., Kennington, L., Straubhaar, J., Wagh, S., Liu, W., DiFiglia, M., Landwehrmeyer, B., Vonsattel, J.P., Zamore, P.D., ve Aronin, N. (2009). Five siRNAs targeting three SNPs may provide therapy for three-quarters of Huntington's disease patients. Curr Biol 19, 774-778; van Bilsen, P.H., Jaspers, L., Lombardi, M.S., Odekerken, J.C., Burright, E.N., ve Kaemmerer, W.F. (2008). Identification and allele-specific silencing of the mutant huntingtin allele in Huntington's disease patient-derived fibroblasts. Hum Gene silencing of mutant Huntington's disease gene. J Neurochem 108, 82-90), veya bir poliglutamin baglama peptidi 1 (QBPl) ve iki farkllîlggoklu es asil]]:pr0tein 70 (HSC70)- baglama motifi içeren, degistirilmis bir füzyon proteini tarafian degradasyonun gerçeklestirilmesi Için mutant proteinin hedeflenmesi vaslüsûla gerçeklestirilebiImektedir (Bauer, P.O., Goswami, A., Wong, H.K., Okuno, M., Kurosawa, M., Yamada, M., Miyazaki, H., Matsumoto, G., Kino, Y., Nagai, Y., ve meslektaslarEQZOlO). Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol 28, 256-263). Ancak, güncel bulgular göstermektedir ki tri-nükleotit tekrarlarElçeren siRNA'Iar, asllEUa, mRNA'larlEl genislemis CAG tekrarlarlElE] zehirli etkilerine katk- bulunmaktadB(Yu, Z., Teng, X., and Bonini, N.M. (2011). Triplet repeat-derived siRNAs enhance RNA-mediated toxicity in a Drosophila model for myotonic dystrophy. PLoS Genet 7, e1001340). Ilaveten, siRNA ve protein-füzyonu bazlEyaklasIiIIar terapötik potansiyelinin, bu maddelerin, kan- beyin bariyerini (BBB) geçmeye yönelik yetersizlikleri tarafldan sIIEIlandlEIB1asEIOIaslZl görünmektedir (Lichota, J., Skjorringe, T., Thomsen, L.B., ve Moos, T. (2010). Macromolecular drug transport into the brain using targeted therapy. J Neurochem 113, 1- 13). Beyne erisebilen, Supt4h'nin küçük molekül inhibitörleri, bu tür sIlEIhndEnalarEl asacaktlEl Dahasüburada kullanllân tüm örnekler ve sartIEllil, bulusun prensiplerinin ve bulus sahipleri tarafIan teknige kazandlîllân konseptlerin okuyucu tarafIian anlasilîhas- yönelik olarak kullanilBiaktadlElve spesifik olarak aktarllân örnekler ve sartlara süllEllandHna getirmedikleri anlasllâcaktlEl AyrEla, bulusun prensiplerini, yönlerini ve yapllândIEInalarIII yanlîslß bulusun belirli örneklerini aktaran buradaki tüm ifadelerin, bunlarI hem yaplgal hem de islevsel mudaillerii kapsamasümaçlanmaktadlü Ilaveten, bu muadillerin, hem halihazlîdia bilinen mudailleri hem de gelecekte gelistirilecek olan mudailleri, yani yap_ bakllîhaks- aynElslevi gösteren herhangi bir elemanEkapsamaslîlamaçlanmaktadlEl Dolayßýla mevcut bulusun kapsamIlEI, burada gösterilen ve açiklanan örnek yapilândlîilnalar ile sIlElllîilmamasü amaçlanmaktadlü Tercihen, mevcut bulusun kapsamÇl ekli istemler tarafIan sekillendirilmektedir.
TR2018/08029T 2010-12-10 2011-12-08 Genişlemiş tri-nükleotid tekrarı barındıran genlerin zararlı aktivitesinin seçici şekilde indirgenmesi. TR201808029T4 (tr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW99143336 2010-12-10
US13/110,494 US8569254B2 (en) 2010-12-10 2011-05-18 Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same
US201161513970P 2011-08-01 2011-08-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201808029T4 true TR201808029T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=45528877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08029T TR201808029T4 (tr) 2010-12-10 2011-12-08 Genişlemiş tri-nükleotid tekrarı barındıran genlerin zararlı aktivitesinin seçici şekilde indirgenmesi.

Country Status (7)

Country Link
US (6) US8569254B2 (tr)
EP (2) EP2463372B1 (tr)
JP (1) JP5769084B2 (tr)
ES (1) ES2673028T3 (tr)
TR (1) TR201808029T4 (tr)
TW (1) TWI430812B (tr)
WO (1) WO2012078906A2 (tr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8569254B2 (en) 2010-12-10 2013-10-29 National Yang Ming University Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same
EP3303588A4 (en) * 2015-05-29 2019-01-23 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University NUCLEOSIDE AGENTS FOR REDUCING DELULATE GENE ACTIVITY CONTAINING EXTENDED NUCLEOTIDE REPEAT
AU2016335032B2 (en) * 2015-10-05 2022-04-14 Proqr Therapeutics Ii B.V. Use of single-stranded antisense oligonucleotide in prevention or treatment of genetic diseases involving a trinucleotide repeat expansion
KR20180136905A (ko) * 2017-06-15 2018-12-26 주식회사 툴젠 반복 확장 돌연변이에 대한 게놈 편집 시스템
CA3068005A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compounds for the reduction of the deleterious activity of extended nucleotide repeat containing genes
US11891601B2 (en) 2018-01-22 2024-02-06 National Yang Ming Chiao Tung University Method to enhance the transcription regulation of SUPT4H on genes containing repetitive nucleotide sequences
EP3797105A1 (en) * 2018-05-22 2021-03-31 Design Therapeutics, Inc. Methods and compounds for the treatment of genetic disease

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023252A (en) 1985-12-04 1991-06-11 Conrex Pharmaceutical Corporation Transdermal and trans-membrane delivery of drugs
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US6217847B1 (en) 1994-07-01 2001-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US7255851B2 (en) 1994-07-01 2007-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
PT1179600E (pt) 1996-06-04 2005-08-31 Univ Utah Res Found Monitorizacao da hibridacao durante a rcp
EP0877600B1 (en) 1996-08-09 2003-10-22 Alcon Manufacturing Ltd. Preservative systems for pharmaceutical compositions containing cyclodextrins
US6376257B1 (en) 1997-04-24 2002-04-23 University Of Rochester Detection by fret changes of ligand binding by GFP fusion proteins
WO2001004357A2 (en) 1999-07-13 2001-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Generic sbe-fret protocol
RU2002113663A (ru) 1999-10-26 2004-03-10 Дельтаджен, Инк. (Us) Трансгенные мыши, содержащие нарушения гена TRP
DE50106822D1 (de) 2000-11-16 2005-08-25 Roche Diagnostics Gmbh Farbstoffpaare für fluoreszenz-resonanz-energie-transfer (fret) messungen
US20050277133A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US7208285B2 (en) 2001-08-28 2007-04-24 Allergan, Inc. Fret protease assays for botulinum serotype A/E toxins
US7332567B2 (en) 2001-08-28 2008-02-19 Allergan, Inc. Fret protease assays for clostridial toxins
US20050096284A1 (en) * 2002-02-20 2005-05-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US20080176812A1 (en) 2002-08-05 2008-07-24 Davidson Beverly L Allele-specific silencing of disease genes
EP1556402B1 (en) * 2002-09-25 2011-06-22 University of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
US7183066B2 (en) 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
US20040152651A1 (en) * 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
CN1735808A (zh) 2002-11-07 2006-02-15 鹿特丹伊拉兹马斯大学 用于检测相互作用的分子的fret探针和方法
ES2808561T3 (es) * 2003-09-12 2021-03-01 Univ Massachusetts Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función
US8680063B2 (en) * 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
GB2442881B (en) 2005-03-25 2010-08-04 Uab Research Foundation Methods for altering gene expression and methods of treatment utilizing same
EP1866443A4 (en) 2005-04-04 2009-04-08 Blueshift Biotechnologies Inc SCREENING USING POLARIZATION ANISOTROPY IN FREIGHT EMISSIONS
US20070105803A1 (en) * 2005-08-18 2007-05-10 Muthiah Manoharan Methods and compositions for treating neurological disease
US7375190B2 (en) * 2006-09-19 2008-05-20 National Yang-Ming University Recombinant protein and method of screening for agents that modulate polypeptide aggregation
JP5866283B2 (ja) * 2009-07-28 2016-02-17 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド トリヌクレオチド反復疾患を治療するための方法および組成物
NZ599032A (en) * 2009-09-11 2014-09-26 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of huntingtin expression
US20130059902A1 (en) * 2010-02-08 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful in treatment of diseases or conditions related to repeat expansion
US8569254B2 (en) 2010-12-10 2013-10-29 National Yang Ming University Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same

Also Published As

Publication number Publication date
EP2705151A2 (en) 2014-03-12
EP2463372A1 (en) 2012-06-13
US20160152978A1 (en) 2016-06-02
EP2705151A4 (en) 2014-10-08
US10760077B2 (en) 2020-09-01
US9226935B2 (en) 2016-01-05
TWI430812B (zh) 2014-03-21
US9637741B2 (en) 2017-05-02
EP2463372B1 (en) 2015-09-02
US20180171336A1 (en) 2018-06-21
EP2705151B1 (en) 2018-03-21
ES2673028T3 (es) 2018-06-19
JP2012125240A (ja) 2012-07-05
US20160116456A1 (en) 2016-04-28
TW201223545A (en) 2012-06-16
US20130317088A1 (en) 2013-11-28
JP5769084B2 (ja) 2015-08-26
US8569254B2 (en) 2013-10-29
US9862947B2 (en) 2018-01-09
WO2012078906A2 (en) 2012-06-14
US9211303B2 (en) 2015-12-15
WO2012078906A3 (en) 2012-10-04
US20120149754A1 (en) 2012-06-14
US20130331437A1 (en) 2013-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201808029T4 (tr) Genişlemiş tri-nükleotid tekrarı barındıran genlerin zararlı aktivitesinin seçici şekilde indirgenmesi.
US9340785B2 (en) Selective inhibition of polyglutamine protein expression
AU2010335039B2 (en) Molecule for treating an inflammatory disorder
US20060178297A1 (en) Systems and methods for silencing expression of a gene in a cell and uses thereof
CN109576268A (zh) 用于治疗疾病的三环dna反义寡核苷酸、组合物和方法
JP2006520611A (ja) ｅＩＦ−５Ａ１の発現を抑制するための、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡの使用
CN104011208B (zh) 作为治疗靶的miRNA-212/132家族
ES2732351T3 (es) ARNip y su uso en métodos y composiciones para el tratamiento y/o la prevención de afecciones oculares
CN114375194A (zh) 血管生成素样7（angptl7）相关疾病的治疗
MX2015002802A (es) Siarn y su uso en los metodos y composiciones para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades de los ojos.
WO2006054555A1 (ja) がんまたは糖尿病治療のための医薬組成物
AU2018358016A1 (en) MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
EP2897633B1 (en) Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
AU2015262889B2 (en) Small interfering RNA (siRNA) for the therapy of type 2 (ADO2) autosomal dominant osteopetrosis caused by CLCN7 (ADO2 CLCN7-dependent) gene mutation
US20210380988A1 (en) Reducing Prominin2-Mediated Resistance to Ferroptotic Cell Death
US20230287427A1 (en) Inhibition of lncExACT1 to Treat Heart Disease
AU2015203577A1 (en) Molecule for treating an inflammatory disorder
US7723314B1 (en) Methods and compositions for treating pachyonychia congenita
Brull et al. Optimized allele-specific silencing of the dominant-negative COL6A1 G293R substitution causing collagen VI-related dystrophy
JP2012508224A (ja) 脂肪生成の調節のためのＰｌａｃ８活性の阻害剤の使用
WO2010123648A2 (en) Compositions and methods for the treatment of sepsis and other disorders involving phospholipase a2 induction