JP2012125240A - 細胞内でのcag伸長遺伝子産物の発現および凝集を調節するための方法ならびに同様に調節するために有用である薬剤を特定するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第1遺伝子は36を超えるCAGトリヌクレオチドリピートを含み、かつグルタミン媒介タンパク質凝集を形成するタンパク質をコードするものである。第1遺伝子の抑制は、SPT4遺伝子またはSUPT4H遺伝子の発現を減少させることによって達成される。また、それは、Spt4/Spt5複合体またはSupt4h/Supt5h複合体の形成を阻害することによっても達成可能である。また、CAG伸長遺伝子産物の発現および凝集の調節またはハンチントン病などのポリグルタミン病の治療のために、有用な薬剤を特定するための方法。
【選択図】なし
Description
この非仮出願は、米国特許法第119条第(a)項に基づき、2010年12月10日に、中華民国、台湾において出願された、特許出願第099143336号による優先権を主張し、その内容全体は本明細書において参照により援用される。
本発明は配列表を含む。
本開示を通して、遺伝子の名称はイタリック体の大文字で表示し、遺伝子と関連するタンパク質は最初の文字のみが大文字の非イタリック体で表示する。例えば、SPT4遺伝子の場合、用語「SPT4」は遺伝子を表示し、用語「Spt4」は遺伝子によって産生されたタンパク質を表示する。唯一の例外はハンチンチン遺伝子であり、遺伝子の名称は「Htt」で表示し、遺伝子産物(ハンチンチンタンパク質)は「Htt」で表示する。
上述の通り、本発明は細胞内での遺伝子の発現を調節するための方法を提供し、遺伝子は伸長CAGリピートを含む。好ましくは、CAGリピートの数は36コピーより多い。伸長CAGリピートを含む遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子から成る群より選択される。
さらに他の態様では、本発明はpolyQ病を治療するための方法も提供する。polyQ病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択されるものである。
さらに、他の態様では、本発明はpolyQ病を治療するための先導化合物をスクリーニングおよび特定するための方法をさらに提供する。本発明のこの態様による方法は、一般に、タンパク質複合体の形成の破壊に対する候補化合物の有効性を試験する段階、および既定の限界量において有効であるかどうか、化合物を先導化合物として特定する段階を含む。
実施例
マウス線条体神経細胞株ST14A(ラット)、HdhQ7/Q7(マウス)、HdhQ111/Q111(マウス)、およびHdhQ7/Q111(マウス)を、33℃で5%CO2とともに10%ウシ胎仔血清(FBS)が追加されたダルベッコ変法イーグル培地(SH30022、HyClone)中で培養した。ST14Aは、pTet−Offプラスミド(BD Biosciences)で形質移入されることで安定な細胞株ST14Atetを確立し、それはテトラサイクリンの非存在下でpTRE2−7Q−eGFPまたはpTRE2−81Q−eGFPを発現した。DNAおよびsiRNAの形質移入は、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を使用して行った。100nMのSupt4h siRNA(5’−CUAUAGACCAGUUCGAAUA−3’(SEQ ID 1)、5’−UCAAAUACCAAUAAAGCGA−3’(SEQ ID 2)、5’−GGGAGUGUCUGGGCGGAUU−3’(SEQ ID 3)、5’−CCCAAGGAAUCGUGCGGGA−3’(SEQ ID 4)を含む、DHARMACON,ON−TARGET plus SMART pool,L−048866−01)、および(DHARMACON,J−086342−10,5’−UGGCCUACAAAUCGAGAGAUU−3’(SEQ ID 5))を使用して、マウスおよびラットの細胞それぞれにおいてSupt4hの発現を阻害した。いかなる遺伝子も標的としない等量のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチド(5’−UUCUCCGAACGUGUCACGUTT−3’(SEQ ID 6)、および5’−ACGUGACACGUUCGGAGAATT−3’(SEQ ID 7))の形質移入は、コントロールとしての役割を果たした。
図3では、実施例1から収集された細胞可溶化物を免疫ブロット法によって分析し、Supt4h siRNAノックダウンに応答したタンパク質発現の変化を決定した。全タンパク質抽出物の等量を、Htt、Supt4h、Tbp、およびα−Tubulinに対して免疫ブロットした。TATA−box結合タンパク質であるTbpを、短いストレッチのCAGリピートを有するコード遺伝子のタンパク質を代表するものとして含めた。
図4では、ヘテロ接合Htt対立遺伝子(HdhQ7/Q111)を有する線条体細胞にSupt4h siRNAが形質移入され、タンパク質発現を実施例2に記載されるように分析した。HttQ7およびHttQ111の位置を矢印で示す。SUPT4Hノックダウンに応答して、HttQ111のタンパク質レベルは減少したが、HttQ7のタンパク質レベルは不変である。それは伸長CAGリピートを含む遺伝子のみがSupt4hによって影響を受けることをさらに確認するものである。
7Q−eGFPまたは81Q−eGFPを発現するST14A細胞の生存率を、Supt4h siRNAノックダウンを行う場合と行わない場合で測定した。示されたpolyQ−eGFPおよびsiRNAで形質移入された後、最小量(0.5%)の血清を含み39℃に維持された増殖培地において細胞を培養し、神経細胞分化を誘導した。コントロールsiRNA存在下において7Q−eGFPを発現する生細胞の数を1に設定し、その他の試料の相対細胞生存率を図5に示す。7Q−eGFPで形質移入された細胞と比較すると、81Q−eGFPで形質移入されたST14Aは細胞生存率において減少を示したが、それはsiRNA介在SUPT4Hノックダウンによって反転した。一方で、私たちはSupt4h siRNAは7Q−eGFPを発現する細胞の生存に影響を及ぼさないことを観察した。これは伸長polyQリピートを含む凝集傾向にあるタンパク質の発現によって引き起こされる細胞生存率の減少は、SUPT4H遺伝子の下方制御によって改善可能であることを実証している。
この目的のために、私達の研究室によって開発されたコロニーカラーアッセイ(米国特許第7,375,190号B2)を使用して、polyQ含有タンパク質の凝集を決定した。本アッセイシステムにおいて、レポータータンパク質であるAde2は、29Qまたは99Qのストレッチのどちらかに融合される。融合タンパク質が溶解したときに、それは機能し、Ade2酵素活性によって細胞の色は白くなる。対照的に、タンパク質が凝集すると、Ade2は十分機能せず、細胞の色は赤くなる。29Q−Ade2はそれの短いpolyQリピート(36Q未満)のために凝集不可能であり、正常Htt遺伝子などの短いCAGトリヌクレオチドリピートを有する遺伝子を代表するものとして含める。図6では、29Q−ADE2および99Q−ADE2を発現する野生型(WT)細胞は、白色および赤色をそれぞれ示すことが明らかである。しかしながら、SPT4遺伝子欠損(SPT4Δ)またはSPT5 SF変異体がこれらの細胞に導入されると、99Q−ADE2発現細胞において赤色の細胞色は白色に変化する。SPT5 SF細胞は、Spt4/Spt5複合体の形成を阻害する特異的SPT5 S324F点突然変異を保有している。これらの結果は、polyQ凝集はSpt4/Spt5複合体の形成を妨げることによって影響を受けることを示唆している。
polyQ−Ade2タンパク質の発現および凝集は、スロットブロット法およびフィルタートラップ法それぞれによって調査した。フィルタートラップ法は酢酸セルロース(CA)膜を使用して凝集タンパク質のみを補足し、一方で、スロットブロット法はニトロセルロース(NC)膜を使用し、それは全てのローディングされたタンパク質を保持する。膜上でのpolyQ−Ade2の保持は、抗−FLAG抗体を用いて免疫ブロット法によって検出した。α−チューブリン(α−Tub)を、各試料において均等なタンパク質ローディングを確保するために含めた。図7では、99Q−Ade2タンパク質の凝集(CA、上方パネル)は、WT細胞と比較してSPT4ΔおよびSPT5 SF変異細胞において著しく減少することを示している。この発見は、実施例5において観察されるように、これらの変異細胞ではpolyQ凝集がより少ないという概念と一致している。凝集の減少に加えて、私たちは99Q−Ade2タンパク質の発現(NC、上方パネル)が、SPT4ΔおよびSPT5 SF細胞において減少していることも発見した。しかしながら、これらの変異細胞は29Q−Ade2の発現(NC、下方パネル)には影響しなかった。これらの結果は、Spt4/Spt5複合体の形成を妨げることによるpolyQ凝集の阻害が、現実的であることを確認するものである。さらに、短いものはそうではないが、長いpolyQの伸長ストレッチ(>36Q)を有するタンパク質の発現は、Spt4/Spt5複合体形成を阻止する変異に影響されやすい。
99Q−Ade2および29Q−Ade2をコードする転写産物の発現は、実施例5において説明したように、細胞内のノーザンブロット法によって分析した。polyQ−ADE2 mRNAsをpolyQプローブによって検出し、SCR1をローディングコントロールとして含めた。正常化の後、99Q−ADE2を発現するWT細胞内のmRNAレベルを100%に設定した。示された細胞における相対的99Q−ADE2および29Q−ADE2のmRNAレベルを図8に示す。WTと比較すると、SPT4ΔおよびSPT5 SFの細胞の両方は、99Q−ADE2のmRNA発現において減少を示しているが、29Q−ADE2のmRNA発現においては減少を示していない。この観察結果は、実施例6でのSPT4ΔおよびSPT5 SFの変異細胞内における99Q−Ade2タンパク質発現の変化と一致している。
Claims (17)
- 細胞内での第1遺伝子の発現を調節するための方法であって、前記第1遺伝子は36を超えるリピート数を有する伸長CAGリピートを含み、前記方法は第2遺伝子の発現を抑制する段階を含み、前記第2遺伝子はSPT4、SPT5、SUPT4HおよびSUPT5Hから成る群より選択されるものである方法。
- 請求項1の方法であって、前記第1遺伝子は、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR、およびHttの遺伝子から成る群より選択される方法。
- 請求項1の方法であって、前記第1遺伝子は、36を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。
- 請求項1の方法であって、前記抑制段階は、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、化学阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される遺伝子抑制法によって実施される方法。
- 請求項1の方法であって、前記細胞は動物細胞または酵母細胞である方法。
- 請求項5の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。
- 細胞内での第1遺伝子の発現を調節するための方法であって、該方法は、細胞内のSpt4/Spt5またはSupt4h/Supt5hの複合体形成を阻害する段階を含み、前記第1遺伝子は36を超えるリピートを有する伸長CAGリピートを含むものである方法。
- 請求項7の方法であって、前記第1遺伝子は、36を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。
- 請求項7の方法であって、前記第1遺伝子は、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR、およびHttの遺伝子から成る群より選択される方法。
- 請求項7の方法であって、前記阻害段階は、抗体、小試薬、またはペプチドから選択される阻害剤を細胞に投与することによって実施される方法。
- 請求項7の方法であって、前記細胞は動物細胞または酵母細胞である方法。
- 請求項11の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。
- ポリグルタミン病を治療するための方法であって、請求項1の方法を前記ポリグルタミン病を患う対象者に適用する段階を含む方法。
- 請求項13の方法であって、前記ポリグルタミン病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択される方法。
- ポリグルタミン病を治療するための方法であって、請求項7の方法を前記ポリグルタミン病を患う対象者に適用する段階を含む方法。
- 請求項15の方法であって、前記ポリグルタミン病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択される方法。
- 第1遺伝子の調節またはポリグルタミン病の治療に有用な化合物を特定するための方法であって、前記方法は、Spt4/Spt5複合体またはSupt4h/Supt5h複合体の形成を破壊可能な阻害活性を有するものを特定するために、複数の試験化合物をスクリーニングする段階を含み、前記第1遺伝子は伸長CAGリピートを含む方法。
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