JP5769084B2 - Ｃａｇ伸長遺伝子産物の発現および遺伝子産物の発現および凝集を抑制するための方法、ならびに同様に抑制するために有用である薬剤を特定するための方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
この非仮出願は、米国特許法第１１９条第（ａ）項に基づき、２０１０年１２月１０日に、中華民国、台湾において出願された、特許出願第０９９１４３３３６号による優先権を主張し、その内容全体は本明細書において参照により援用される。

配列表
本発明は配列表を含む。

本発明は、細胞内での伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を調節するための方法に関する。また、本発明はポリグルタミン媒介性タンパク質凝集を調節または阻止するための方法、および前記調節方法の実行において有用である薬剤を特定するための方法を提供する。

ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病は９つの遺伝学的に異なる疾患から成る部類の疾患である。それらはハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、ＳＢＭＡならびに脊髄小脳失調症１、２、３、６、７および１７（ＳＣＡ１／２／３／６／７／１７）を含む。これらの疾患は、グルタミンをコードするＣＡＧリピートの翻訳物の伸長によって引き起こされるため、それらはＣＡＧリピート病としても知られている。

これらの遺伝学的に異なる疾患の間で共有される１つの共通な生理学的特徴は、該疾患にかかる患者は全て、彼らの脳内にタンパク質性の沈着物を有することが発見されていることである。これらの各疾患において、タンパク質性沈着物は種々のタンパク質と関連しているが、全てのタンパク質はグルタミンの伸長ストレッチを含んでいる。現在まで、疾患関連タンパク質におけるこのｐｏｌｙＱ配列の伸長ストレッチは、全てのｐｏｌｙＱ病に関与する唯一知られている遺伝子変異である。

一般に、遺伝子内のＣＡＧリピート数は、３６未満の良性の数字から３７以上の病理学的な数字に及び得る。ＣＡＧリピートのより大きな数字は病理学的表現型と相関すると考えられている。なぜなら、長いストレッチのグルタミンを含むタンパク質およびポリペプチドは、生体内においてアミロイド様繊維（βシート構造を有するタンパク質凝集体の重合）を形成する特有の傾向を有しており（Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、１９９７年）、かつ伸長ｐｏｌｙＱ鎖を有する変異タンパク質は、異なるタンパク質構造をもたらし、それは凝集および最終的には神経細胞死をもたらすと考えられているからである（ＺｏｇｈｂｉおよびＯｒｒ、２０００年）。

ヒトにおいて、伸長ｐｏｌｙＱ変異タンパク質は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞において広範囲にわたって発現されている。しかしながら、それぞれの異なる疾患において、ニューロンの特定集団は他のものよりも脆弱である。そのため、脆弱性における差異によって、各９つの異なる疾患に対する神経変性の特徴的パターンおよび臨床的特徴がもたらされる。疾患の重症度はＣＡＧリピート数に相関し得る。例えば、ＨＤでは、２８−３５の間のＣＡＧリピート数は中間と考えられ、３５−４０は不完全浸透と考えられ、かつ４０を超える数は完全浸透と考えられている。

表１は、伸長ＣＡＧリピート、疾患遺伝子、およびそれらを定義付ける病原リピート長を原因とする８つの疾患を記載している。ＳＣＡ６はその他のｐｏｌｙＱ病と異なり、ＳＣＡ６におけるＣＡＧリピート長が症状が現れる年齢に対する決定的要因ではないため、本リストには含まれていない。また、ＳＣＡ６における病理学的リピート長はその他のｐｏｌｙＱ病よりもはるかに短く、２１−３０の間の数は病理学的表現型をもたらすのに十分である。

上記の８つの疾患のうちで、ＨＤは患者に対するそれの破壊的な影響によって、おそらく世間で最もよく知られている疾患であろう。該疾患は主に皮質および線条体において発生する選択的神経細胞死と関連している。それは、患者から、体の動き、認識力、および人格を徐々に奪う、致死的かつ残酷な疾患であり、患者およびその家族に重大な経済的および感情的な負担を強いる。ＨＤの頻度においては、西欧系の人々の間で特によく見られる（約２０，０００人に１人）。残念ながら、現在のところ、この恐ろしい疾患に対する治療法はない。

現在、ＨＤに対する可能な治療は、主に肉眼的症状に対処することに限定されている。例えば、ＦＤＡに承認された最新の化合物の１つであるテトラベナジンは、ＨＤ患者において運動過剰を減少させるための薬である。テトラベナジンは神経伝達物質の早期の分解を促進する小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ）阻害剤である。従って、この薬は単に症状を治療するのみであり、疾患の根源を治療するものではない。現在ＨＤを治療するために使用されているその他の薬としては、神経遮断薬およびベンゾジアゼピンが挙げられる。疾患が進行するにつれて、異なる症状に対処するための、抗精神病薬、および運動機能低下症のための薬を含めた、より幅広い範囲の薬局方が必要とされている。現在知られているどの治療においても、ＨＤの根本的原因に取り組む努力が行われていない。

上述のように、ＨＤの根本的原因は、ＣＮＳ細胞内の遺伝子、特にハンチンチンタンパク質（Ｈｔｔ）をコードする遺伝子ＨｔｔにおけるＣＡＧリピートの異常な伸長である。健常人では、Ｈｔｔ遺伝子内に約８−２５のＣＡＧヌクレオチド配列の構成リピートがある。ＨＤ患者では、ＣＡＧリピートの数は３６以上に伸長されている。このタイプの変異は優性であるため、人は１コピーの変異ハンチンチン遺伝子を受け継ぐだけでＨＤを発症する。

最近の細胞および動物モデルの研究において、変異Ｈｔｔによって形成された凝集体はＨＤの進行において重要な役割を果たしていることが示されている。変異Ｈｔｔタンパク質は、タンパク質分解的切断にさらされるときに、ｐｏｌｙＱ伸長部分からのより短い断片を置き去りにし得ることが観察されている。グルタミンの過剰なコピーが変異Ｈｔｔにおいて存在すると、グルタミンの極性性質はその他のタンパク質との望ましくない相互作用をもたらす。特に、グルタミンの過剰なコピーを有する変異Ｈｔｔは互いに水素結合を形成し、機能性タンパク質に折り畳まれるよりも凝集する。時間とともに、蓄積されたタンパク質凝集体は、患者において神経細胞に損傷を与え、細胞死および神経障害をもたらす。タンパク質凝集体による損傷の影響は、マウスモデルにおいて、タンパク質凝集体の形成を阻害可能な化学試薬が、細胞の生存を高め、かつＨＤの病的状態を改善可能であることを示す実験によって裏付けられている（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００３年；Ｔａｎａｋａら、２００４年）。

タンパク質凝集を阻止するために阻害分子を使用することの他に、変異ハンチンチン遺伝子の発現を減少させることは、原理的に不溶性タンパク質凝集体の発生を阻害するための代替的手法となる。生体内研究において、ｐｏｌｙＱタンパク質凝集の程度はタンパク質の濃度に関連することが示されている（Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、１９９９年）。従って、変異ハンチンチン遺伝子の発現レベルを下げることによって、より低いレベルにおいて伸長ＰｏｌｙＱタンパク質が発現され、その結果、それはタンパク質凝集体の形成を減少させ、かつＨＤの発症を遅らせるであろう。

これらの結果は、Ｈｔｔ内のＣＡＧリピート変異から生じる不溶性タンパク質凝集体の形成を調節することで、ＨＤ病因と闘うための、潜在的に単純かつ強力な方針を提示している。例えば、ｐｏｌｙＱ変異遺伝子の発現またはｐｏｌｙＱ凝集体の形成を調節可能な治療薬は、それらの生理学的な症状だけでなく、ｐｏｌｙＱ病の根本的原因に対処することが可能である。残念ながら、変異ｐｏｌｙＱ遺伝子の発現を調節可能な細胞性因子および薬剤に関する知識の不足が、本治療方針の実用的な開発を妨げてきた。

したがって、伸長ＣＡＧリピート変異を伴う遺伝子の発現を調節または減少させることが可能な方法および手段、ならびに変異遺伝子の発現の調節または減少に効果的な薬剤を特定および開発するための方法および手段が、今もなお緊急に必要とされている。

上記のことを考慮して、本発明の目的は、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を調節または減少させることが可能な方法および手段を提供することである。

また、本発明の目的は、ｐｏｌｙＱ病を治療するための治療方法および治療薬を提供することである。

さらに、本発明の目的は、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現の調節または減少に効果的な薬剤を、スクリーニングおよび開発するための方法および手段を提供することである。

本発明の上記の目的は、微生物転写伸長因子Ｓｐｔ４およびそれの哺乳類オーソログであるＳｕｐｔ４ｈが、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現において調節の役割を担っているという予期せぬ発見によって充足された。

特に、発明者は、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現およびｐｏｌｙＱ配列の伸長ストレッチを有するタンパク質の凝集は、両方ともＳｐｔ４−／Ｓｕｐｔ４ｈ−欠損細胞において軽減されることを発見した。さらに、発明者は、Ｓｐｔ４／Ｓｕｐｔ４ｈは、ＣＡＧリピートが短いかまたはないものを含む遺伝子に対しては、ごくわずかしか影響しないことを発見した。これらの予期せぬ発見によって、Ｓｐｔ４／Ｓｕｐｔ４ｈはｐｏｌｙＱ病介入のための有用な標的として確立される。

本発明の他の発見では、発明者は、Ｓｐｔ４−／Ｓｕｐｔ４ｈ−欠損による軽減効果は、ＣＡＧ伸長遺伝子における転写伸長障害に起因し得るものであり、それは対応するｍＲＮＡおよびタンパク質の産生の減少につながることも発見した。本発見は、Ｓｐｔ４およびＳｕｐｔ４ｈのいくつかの周知特性において一貫した見解を可能とするものであり、それらは本発明において治療手段計画を誘導する機構モデルの基礎を形成している。

例えば、いくつかの最近の研究は、Ｓｐｔ４は酵母細胞における転写およびヘテロクロマチン形成の制御機構において、重要な役割を果たすことに関与するとしている（ＣｒｏｔｔｉおよびＢａｓｒａｉ、２００４年；Ｒｏｎｄｏｎら、２００３年）。転写制御へのそれの影響の分析によって、Ｓｐｔ４は伸長過程において正の制御因子であることが示されている。特に、Ｓｐｔ４は、酵母細胞内でＧＣを高含有率で有するかまたは３Ｋｂを超える大きさであるＤＮＡ鋳型からの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ媒介転写産物の合成を促進する（Ｒｏｎｄｏｎら、２００３年）。さらに、最近の証明において、Ｓｐｔ４は、転写の間、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力に影響を及ぼすことが明らかとなり、それはＳｐｔ４をクロマチン鋳型に沿ったポリメラーゼＩＩの持続性に対する重要な要因として特定するものである（ＭａｓｏｎおよびＳｔｒｕｈｌ、２００５年）。

特定の理論になんら束縛されるものではないが、発明者は、Ｓｐｔ４がｐｏｌｙＱ含有タンパク質の発現に必要とされる理由は、ポリメラーゼＩＩが移動するのに長時間を要するそれらのＤＮＡ鋳型（例えば、ＣＡＧ伸長領域を含む鋳型）から、転写機構が早期に解離することを阻止するその役割のためであると確信している。このモデルは、Ｓｐｔ４−／Ｓｕｐｔ４ｈ−欠損細胞がＣＡＧ伸長遺伝子の発現の軽減を示す結果を説明する。従って、Ｓｐｔ４またはＳｕｐｔ４ｈを標的とすることで、治療方法を有利に考案することが可能である。

さらに、本発明の他の発見では、発明者は、Ｓｐｔ４欠損による軽減効果は、Ｓｐｔ４との相互作用に不具合を有する特異的Ｓｐｔ５変異体によって再現可能であることを発見した。一般に、Ｓｐｔ４は細胞内でＳｐｔ５と複合体を形成するため、本発見は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体もまた治療標的であることをさらに確立する。

本発明の上記の様々な驚くべき発見に基づいて、発明者は、伸長ＣＡＧリピート配列を含む遺伝子の発現を調節するための様々な手段および方法を着想かつ具体化した。

したがって、一態様において、本発明は３６を超えるリピート数を有する伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。本発明のこの態様による実施形態では、概して、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現に関与する転写伸長因子を標的とすることに努める。転写伸長因子を標的とすることは、直接的または間接的のどちらであってもよい。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、細胞内での転写伸長因子遺伝子の発現を抑制する段階を含む。転写伸長因子遺伝子は、好ましくは、酵母細胞に対してはＳＰＴ４遺伝子、または哺乳類細胞に対してはＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子である。伸長ＣＡＧ遺伝子は、好ましくは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ，およびＨｔｔの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。

その他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、転写伸長因子複合体の形成を阻害する段階を含む。転写伸長因子複合体は、好ましくは、酵母細胞内ではＳｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体、または哺乳類細胞内ではＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体である。また、伸長遺伝子は、好ましくは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ，およびＨｔｔの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。

さらに、その他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現に関連する、転写伸長因子の抑制および転写因子複合体の形成の阻害における両段階を含み得る。転写伸長因子遺伝子は、好ましくは、酵母細胞に対してはＳＰＴ４、または哺乳類細胞に対してはＳＵＰＴ４Ｈである。転写因子複合体は、好ましくは、酵母細胞内ではＳｐｔ４／Ｓｐｔ５、または哺乳類細胞内ではＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈである。また、伸長遺伝子は、好ましくは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ，およびＨｔｔの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。

他の態様では、本発明は、伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現の調節またはポリグルタミン病の治療のために、有用な医薬剤を特定するための方法をさらに提供する。伸長遺伝子は、好ましくは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ，およびＨｔｔの遺伝子から成る群より選択される。ＣＡＧリピートの数は、好ましくは３６を超える。

本発明のこの態様による方法は、一般に、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体またはＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体形成の破壊に対するその有効性を評価するために候補化合物を試験する段階、および所定の水準において効果的であるかどうか、前記化合物を先導化合物として特定する段階を含む。好ましくは、タンパク質間相互作用アッセイが候補化合物の有効性を評価するために使用される。

本発明のその他の態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

図１はＳｐｔ４−／Ｓｕｐｔ４ｈ−欠損がＣＡＧ含有遺伝子の発現に与える下方制御効果を示している。（ａ）は、非病原数のＣＡＧリピート（灰色）を含むＤＮＡ鋳型（波線で表示）に沿って移動するＲＮＡポリメラーゼＩＩ（斑点球体で表示）で開始する遺伝子転写工程により、ｍＲＮＡが産生され、その後タンパク質産物に翻訳されることを示している。（ｂ）は、どのようにグルタミンの伸長数を含むタンパク質が凝集してタンパク質性沈着物が形成されるかを示している。（ｃ）は、Ｓｐｔ４−およびＳｕｐｔ４ｈ−が下方制御されたときに、Ｓｐｔ４−およびＳｕｐｔ４ｈ−欠損がｐｏｌｙＱタンパク質の産生へ与える軽減効果を示している。 図２Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定された、線条体細胞内のＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウン後のＨｔｔｍＲＮＡ発現レベルを示している。 図２Ｂは、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウン後のＨｔｔｍＲＮＡ発現レベルの変化を示している。 図３は、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡ形質移入を行う場合と行わない場合の細胞内タンパク質発現レベルを示している。 図４は、Ｓｕｐｔ４ｈ下方制御が正常および変異Ｈｔｔそれぞれの発現に与える効果を示している。 図５は、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンを行う場合と行わない場合の、７Ｑ−ｅＧＦＰまたは８１Ｑ−ｅＧＦＰを発現するＳＴ１４Ａ線条体細胞の生存率を示している。 図６（ａ）および６（ｂ）は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体を阻害するＳＰＴ４欠損またはＳＰＴ５変異体が伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を抑制可能であり、それはコロニーカラーアッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｌｏｒ ａｓｓａｙ）によって明らかとなるｐｏｌｙＱ凝集の減少につながることを示している。 図６（ａ）および６（ｂ）は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体を阻害するＳＰＴ４欠損またはＳＰＴ５変異体が伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を抑制可能であり、それはコロニーカラーアッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｌｏｒ ａｓｓａｙ）によって明らかとなるｐｏｌｙＱ凝集の減少につながることを示している。 図７は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体形成を阻害することによって生じたｐｏｌｙＱ変異タンパク質の発現および凝集のパターン変化を示している。 図８は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体形成を阻害することによって生じた伸長ＣＡＧリピートを含む転写産物の減少した発現を示している。

本発明は、様々な結果の完全な理解を促進するために、例示的な実施形態および実施例によって次に示される。本発明は例示的な実施形態および実施例の観点から説明されるが、本明細書において開示される実施形態は例示を目的とするのみであり、様々な改良および変更が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって行われ得ることを理解されたい。

定義
本開示を通して、遺伝子の名称はイタリック体の大文字で表示し、遺伝子と関連するタンパク質は最初の文字のみが大文字の非イタリック体で表示する。例えば、ＳＰＴ４遺伝子の場合、用語「ＳＰＴ４」は遺伝子を表示し、用語「Ｓｐｔ４」は遺伝子によって産生されたタンパク質を表示する。唯一の例外はハンチンチン遺伝子であり、遺伝子の名称は「Ｈｔｔ」で表示し、遺伝子産物（ハンチンチンタンパク質）は「Ｈｔｔ」で表示する。

本明細書において、遺伝子ＳＰＴ４は転写伸長タンパク質Ｓｐｔ４をコードする遺伝子を指す。遺伝子は（Ｍａｌｏｎｅら、１９９３年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Ｓｐｔ４は（Ｍａｌｎｅら、１９９３年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。

本明細書において、遺伝子ＳＰＴ５は転写伸長タンパク質Ｓｐｔ５をコードする遺伝子を指す。遺伝子は（Ｓｗａｎｓｏｎら、１９９１年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Ｓｐｔ５は（Ｓｗａｎｓｏｎら、１９９１年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。

本明細書において、遺伝子ＳＵＰＴ４Ｈは哺乳類転写伸長因子Ｓｕｐｔ４ｈをコードする遺伝子を指す。遺伝子は（Ｈａｒｔｚｏｇら、１９９６年；Ｃｈｉａｎｇら、１９９６年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Ｓｕｐｔ４ｈは（Ｈａｒｔｚｏｇら、１９９６年；Ｃｈｉａｎｇら、１９９６年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。

本明細書において、遺伝子ＳＵＰＴ５Ｈは哺乳類転写伸長因子Ｓｕｐｔ５ｈをコードする遺伝子を指す。遺伝子は（Ｓｔａｃｈｏｒａら、１９９７年；Ｃｈｉａｎｇら、１９９８年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Ｓｕｐｔ５ｈは（Ｓｔａｃｈｏｒａら、１９９７年；Ｃｈｉａｎｇら、１９９８年）によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。

本発明との関係においては、用語「ｐｏｌｙＱ病」は、表１に記載の８つの疾患を指す。

本発明との関係においては、用語「ｐｏｌｙＱ変異タンパク質」は、３６グルタミン残基より長いｐｏｌｙＱ鎖を有するタンパク質を指す。

本発明との関係においては、用語「伸長ＣＡＧリピート」は、３６よりも大きいＣＡＧリピート数を指す。

伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子の発現を抑制するための方法
上述の通り、本発明は細胞内での遺伝子の発現を調節するための方法を提供し、遺伝子は伸長ＣＡＧリピートを含む。好ましくは、ＣＡＧリピートの数は３６コピーより多い。伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子は、好ましくは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ，およびＨｔｔの遺伝子から成る群より選択される。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、酵母細胞内でのＳｐｔ４または哺乳類細胞内でのＳｕｐｔ４ｈの発現を抑制する段階を含む。

遺伝子産物の発現を抑制するための手段は特に限定されない。遺伝子産物（すなわち、Ｓｐｔ４およびＳｕｐｔ４ｈタンパク質）の発現を抑制可能である限り、それらは当技術分野におけるあらゆる周知の遺伝子サイレンシング法またはその他の将来開発される遺伝子抑制法であり得る。例示的な遺伝子サイレンシング法は、限定されるものではないが、ＳＰＴ４またはＳＵＰＴ４Ｈの遺伝子の発現を抑制可能である、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、化学試薬を用いて、またはそれらの混合を含み得る。

好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡおよび遺伝子ノックアウトは、哺乳類細胞内のＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および酵母細胞内のＳＰＴ４遺伝子それぞれを制御するために使用される。遺伝子ノックダウンを生じさせるために使用されるＲＮＡ干渉配列は、好ましくはＳＵＰＴ４Ｈの相補的遺伝子配列であり、より好ましくは８０％以上の配列相同性を有するものである。

特定の理論になんら束縛されるものではないが、ＳＰＴ４およびＳＵＰＴ４Ｈを抑制することによって、長いＣＡＧリピートを有する遺伝子転写産物を生成する細胞の能力が減少するため、伸長ｐｏｌｙＱ鎖を有するタンパク質の発現が軽減すると考えられている。

図１はＨｔｔ遺伝子が転写されてＨｔｔタンパク質に翻訳される工程を図示している。

図１（ａ）を参照すると、正常Ｈｔｔ遺伝子２０上に（斜線部分で示される）ＣＡＧリピート２１を有するＤＮＡ鋳型に沿って移動するＲＮＡポリメラーゼＩＩ（灰色球体）１０が示されている。転写の間、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ１０は、初めにＨｔｔ遺伝子２０のＤＮＡ鋳型と関連し、次いで鋳型に沿って移動することで、ＣＡＧリピートを含む遺伝子のｍＲＮＡ（つまり、Ｈｔｔ遺伝子ｍＲＮＡ）３０が生産される。その後、Ｈｔｔ遺伝子ｍＲＮＡ３０を翻訳することで、Ｈｔｔタンパク質４０が産生される。つまり、図１（ａ）は正常ＣＡＧリピート、すなわち「短いＣＡＧリピート」２２を含む遺伝子の場合において起こることを示している。

図１（ｂ）は、伸長ＣＡＧリピート、すなわち「長いＣＡＧリピート」２３を含む変異Ｈｔｔ遺伝子２０の場合に起こることを示している。上述の通り、伸長ｐｏｌｙＱリピートのストレッチを有するＨｔｔタンパク質４０が産生されると、臓器または組織内で凝集および蓄積する傾向があり、それはＨＤ表現型の原因となる。

図１（ｃ）では、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子は下方制御されている。その結果、ポリメラーゼＩＩ１０は、転写伸長の間、変異Ｈｔｔ遺伝子２０と持続的に関連することが不可能となり、Ｈｔｔタンパク質産生の減少をもたらし、ｐｏｌｙＱ病表現型を阻止または改善する。

転写伸長因子遺伝子ＳＰＴ４およびＳＵＰＴ４Ｈの発現を抑制することに加えて、Ｓｐｔ４およびＳｕｐｔ４ｈタンパク質を直接標的にするかまたはそれらの相互作用パートナーを間接的に標的にすることによって、同様のｐｏｌｙＱ変異タンパク質軽減効果も達成可能である。例えば、Ｓｐｔ４タンパク質はＳｐｔ５タンパク質と関連することで、酵母細胞内で複合体を形成することが知られている。発明者は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を破壊することによっても、変異ｐｏｌｙＱタンパク質の発現が軽減することを発見した。同様に、Ｓｕｐｔ４ｈおよびＳｕｐｔ５ｈも哺乳類細胞（例えばヒト細胞）内で複合体を形成する。したがって、２つの複合体を抑制することは、ヒトまたは酵母の細胞内でのＣＡＧ伸長遺伝子の発現を抑制、およびｐｏｌｙＱ凝集を阻止するための、代替的かつ実用的な方法である。

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、転写伸長タンパク質複合体の形成を破壊する段階を含む。好ましくは、転写伸長タンパク質複合体は、酵母細胞内ではＳｐｔ４／Ｓｐｔ５、または哺乳類細胞内ではＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈである。

タンパク質複合体の形成を破壊するための手段は、特に限定されない。それらは当技術分野においてあらゆる周知の方法によって達成可能であり、例えば、酵母細胞の場合にはＳｐｔ４またはＳｐｔ５、および哺乳類細胞の場合にはＳｕｐｔ４ｈまたはＳｕｐｔ５ｈに対する、周知または後に開発される阻害剤を用いることを含む。また、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または当技術分野におけるあらゆるその他の周知の遺伝子サイレンシング法などの遺伝子サイレンシング法は、対応する複合体において少なくとも１つの発現因子を抑制するために有利に使用可能である。例えば、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５の場合、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、または両方の遺伝子抑制は、複合体の形成を未然に防ぐために有利に使用可能である。あるいは、変異のＳｐｔ４またはＳｐｔ５が、野生型Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を破壊するための破壊剤として導入されてもよい。

その他のさらなる実施形態では、遺伝子抑制段階もまた、タンパク質複合体破壊段階とともに有利に使用可能である。例えば、例示的な実施形態では、細胞内で変異ｐｏｌｙＱタンパク質の発現を調節するための方法は、酵母細胞に対してはＳＰＴ４遺伝子、または哺乳類細胞に対してはＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の発現を抑制する段階、および酵母細胞内ではＳｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体、または哺乳類細胞内ではＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体の形成を阻害する段階を含み得る。

ｐｏｌｙＱ病の治療方法
さらに他の態様では、本発明はｐｏｌｙＱ病を治療するための方法も提供する。ｐｏｌｙＱ病は、脊髄小脳失調症１、２、３、７、１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択されるものである。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、ＳＵＰＴ4Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子、または両方の発現を抑制するための、遺伝子サイレンシング剤の効果的な量を投与する一般的な段階を含み得る。遺伝子サイレンシング剤の種類は特に限定されない。薬剤がＳＵＰＴ４ＨまたはＳＵＰＴ５Ｈの遺伝子発現を抑制可能である限り、当技術分野において周知のあらゆる遺伝子サイレンシング剤、または将来開発される遺伝子サイレンシング剤を使用可能である。当業者は、種々の遺伝子サイレンシング剤には適切に選択された投与経路が必要であることを理解するであろう。例示的な実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはＤ−ＲＮＡｉである。

いくつかのその他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、Ｓｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体の形成を破壊可能な医薬剤を投与する一般的な段階を含み得る。また、生体内でＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体の形成を破壊可能である限り、医薬剤は特に限定されない。適した医薬剤はＳｕｐｔ４ｈまたはＳｕｐｔ５ｈの特異的阻害剤であってもよい。例示的な薬剤は、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、または抗体を含み得る。それはまた、Ｓｕｐｔ４ｈまたはＳｕｐｔ５ｈの工学的変異体であってもよい。

先導化合物として有用である薬剤を特定するための方法
さらに、他の態様では、本発明はｐｏｌｙＱ病を治療するための先導化合物をスクリーニングおよび特定するための方法をさらに提供する。本発明のこの態様による方法は、一般に、タンパク質複合体の形成の破壊に対する候補化合物の有効性を試験する段階、および既定の限界量において有効であるかどうか、化合物を先導化合物として特定する段階を含む。

試験段階は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５相互作用、またはＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ相互作用に対して、タンパク質間相互作用アッセイを用いて実施可能である。タンパク質間相互作用アッセイの設計は、特に限定されない。例えば、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体またはＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体から生じるタンパク質間相互作用は、これらのタンパク質の全長または断片を用いて、生体内または生体外のどちらかにおいて確立可能である。アッセイが生体内アッセイである場合、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５相互作用に対しては酵母細胞をベースにしたアッセイ、およびＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ相互作用に対しては哺乳類細胞をベースにしたアッセイが好ましい。

タンパク質間相互作用の読み取りは、例えば、蛍光シグナル、ＦＲＥＴシグナル、または酵素反応であり得る。

このタンパク質間相互作用を妨げる、小分子、ペプチド、または抗体が、候補化合物として選択される。

先導化合物のタンパク質間相互作用に基づいた特定は、先導化合物を特定するための効果的で一般的な手法として示されていることに特に留意されたい。例えば、ＭＤＭ２は、腫瘍形成に関して、ｐ５３に結合して否定的に制御することが知られている。癌治療に対して有効性を示す小分子、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ＭＤＭ２とｐ５３タンパク質との間の相互作用を阻止するそれの能力によって特定された（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：８４４−８４８、その内容全体は本明細書において参照により援用される）。この例示的な事例によって、その他のいくつかの研究とともに、本明細書において開示されるタンパク質間相互作用に基づいた薬物の発見方法の妥当性が支持される。

好ましい実施形態では、使用されるアッセイは、発明者によって以前に開発されたカラーコロニーアッセイである。本アッセイの詳細は、米国特許第７，３７５，１９０号Ｂ２に記載されており、その内容全体は本明細書において参照により援用される。

本発明をさらに説明するために、以下の具体的な実施例を提供する。
実施例

変異ＨｔｔｍＲＮＡ発現はＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンによって阻害される。
マウス線条体神経細胞株ＳＴ１４Ａ（ラット）、Ｈｄｈ^{Ｑ７／Ｑ７}（マウス）、Ｈｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}（マウス）、およびＨｄｈ^{Ｑ７／Ｑ１１１}（マウス）を、３３℃で５％ＣＯ_２とともに１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が追加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＳＨ３００２２、ＨｙＣｌｏｎｅ）中で培養した。ＳＴ１４Ａは、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆプラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で形質移入されることで安定な細胞株ＳＴ１４Ａｔｅｔを確立し、それはテトラサイクリンの非存在下でｐＴＲＥ２−７Ｑ−ｅＧＦＰまたはｐＴＲＥ２−８１Ｑ−ｅＧＦＰを発現した。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの形質移入は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。１００ｎＭのＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡ（５’−ＣＵＡＵＡＧＡＣＣＡＧＵＵＣＧＡＡＵＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ １）、５’−ＵＣＡＡＡＵＡＣＣＡＡＵＡＡＡＧＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ２）、５’−ＧＧＧＡＧＵＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ３）、５’−ＣＣＣＡＡＧＧＡＡＵＣＧＵＧＣＧＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ４）を含む、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ，Ｌ−０４８８６６−０１）、および（ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，Ｊ−０８６３４２−１０，５’−ＵＧＧＣＣＵＡＣＡＡＡＵＣＧＡＧＡＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ５））を使用して、マウスおよびラットの細胞それぞれにおいてＳｕｐｔ４ｈの発現を阻害した。いかなる遺伝子も標的としない等量のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチド（５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ６）、および５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ７））の形質移入は、コントロールとしての役割を果たした。

図２Ａでは、ホモ接合の野生型（Ｈｄｈ^{Ｑ７／Ｑ７}）または変異（Ｈｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}）のハンチンチン対立遺伝子を所有する線条体細胞において、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウン後に、ＲＴ−ＰＣＲによってＨｔｔｍＲＮＡレベルを調査した。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されたＵ６は、ローディングコントロールとしての役割を果たした。ＴＵＢＡ１Ａは、Ｓｕｐｔ４ｈがハウスキーピング遺伝子のポリメラーゼＩＩ依存性の転写に及ぼす影響を調査するために含めた。変異ＨｔｔｍＲＮＡレベルは、Ｈｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}細胞において、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子ノックダウンに応答して減少することが示されている。しかしながら、同程度のＳＵＰＴ４Ｈ下方制御を有しながらも、Ｈｄｈ^{Ｑ７／Ｑ７}における正常ＨｔｔｍＲＮＡの発現において検出可能な変化はない。

図２Ｂでは、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウン後のｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。各ｍＲＮＡをＵ６を用いて正常化し、コントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ ｓｉＲＮＡ）で形質移入された細胞内の転写レベルを１に設定した。本図表において、横軸はＨｔｔ遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＴＵＢＡ１Ａ遺伝子を表し、縦軸は相対ｍＲＮＡレベルを表している。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子ノックダウンによって、Ｈｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}内の変異ＨｔｔｍＲＮＡレベルは大幅に減少する一方で、Ｈｄｈ^{Ｑ７／Ｑ７}内の正常ＨｔｔｍＲＮＡはわずかに減少するだけであることが示されている。

図２Ａおよび２Ｂの両方は、変異Ｈｔｔ遺伝子の発現がＳｕｐｔ４ｈによって制御されることを示している。

Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンを行う場合と行わない場合の細胞内でのＨｔｔタンパク質発現の分析。
図３では、実施例１から収集された細胞可溶化物を免疫ブロット法によって分析し、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンに応答したタンパク質発現の変化を決定した。全タンパク質抽出物の等量を、Ｈｔｔ、Ｓｕｐｔ４ｈ、Ｔｂｐ、およびα−Ｔｕｂｕｌｉｎに対して免疫ブロットした。ＴＡＴＡ−ｂｏｘ結合タンパク質であるＴｂｐを、短いストレッチのＣＡＧリピートを有するコード遺伝子のタンパク質を代表するものとして含めた。

変異Ｈｔｔタンパク質のレベルは、ＮＣ ｓｉＲＮＡで処理したものと比較して、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡで処理したＨｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}細胞内においてより低いことが示されている。変異Ｈｔｔタンパク質の減少は、実施例１において観察されたように、Ｈｄｈ^{Ｑ１１１／Ｑ１１１}細胞内での対応するｍＲＮＡの変化と一致する。さらに、Ｈｔｔ^Ｑ７およびＴｐｂタンパク質などの正常ＣＡＧリピート（ＣＡＧトリヌクレオチドリピート数が３６以下）を有するコード遺伝子のタンパク質レベルは、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンによって影響されない。

ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の下方制御は変異Ｈｔｔ発現を阻害するが、正常Ｈｔｔ発現は阻害しない。
図４では、ヘテロ接合Ｈｔｔ対立遺伝子（Ｈｄｈ^{Ｑ７／Ｑ１１１}）を有する線条体細胞にＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡが形質移入され、タンパク質発現を実施例２に記載されるように分析した。Ｈｔｔ^Ｑ７およびＨｔｔ^Ｑ１１１の位置を矢印で示す。ＳＵＰＴ４Ｈノックダウンに応答して、Ｈｔｔ^Ｑ１１１のタンパク質レベルは減少したが、Ｈｔｔ^Ｑ７のタンパク質レベルは不変である。それは伸長ＣＡＧリピートを含む遺伝子のみがＳｕｐｔ４ｈによって影響を受けることをさらに確認するものである。

８１Ｑ−ｅＧＦＰを発現するＳＴ１４Ａ細胞の生存率はＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンによって向上した。
７Ｑ−ｅＧＦＰまたは８１Ｑ−ｅＧＦＰを発現するＳＴ１４Ａ細胞の生存率を、Ｓｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡノックダウンを行う場合と行わない場合で測定した。示されたｐｏｌｙＱ−ｅＧＦＰおよびｓｉＲＮＡで形質移入された後、最小量（０．５％）の血清を含み３９℃に維持された増殖培地において細胞を培養し、神経細胞分化を誘導した。コントロールｓｉＲＮＡ存在下において７Ｑ−ｅＧＦＰを発現する生細胞の数を１に設定し、その他の試料の相対細胞生存率を図５に示す。７Ｑ−ｅＧＦＰで形質移入された細胞と比較すると、８１Ｑ−ｅＧＦＰで形質移入されたＳＴ１４Ａは細胞生存率において減少を示したが、それはｓｉＲＮＡ介在ＳＵＰＴ４Ｈノックダウンによって反転した。一方で、私たちはＳｕｐｔ４ｈ ｓｉＲＮＡは７Ｑ−ｅＧＦＰを発現する細胞の生存に影響を及ぼさないことを観察した。これは伸長ｐｏｌｙＱリピートを含む凝集傾向にあるタンパク質の発現によって引き起こされる細胞生存率の減少は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の下方制御によって改善可能であることを実証している。

酵母細胞内でのＳｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を阻止することによるｐｏｌｙＱ凝集の阻害
この目的のために、私達の研究室によって開発されたコロニーカラーアッセイ（米国特許第７，３７５，１９０号Ｂ２）を使用して、ｐｏｌｙＱ含有タンパク質の凝集を決定した。本アッセイシステムにおいて、レポータータンパク質であるＡｄｅ２は、２９Ｑまたは９９Ｑのストレッチのどちらかに融合される。融合タンパク質が溶解したときに、それは機能し、Ａｄｅ２酵素活性によって細胞の色は白くなる。対照的に、タンパク質が凝集すると、Ａｄｅ２は十分機能せず、細胞の色は赤くなる。２９Ｑ−Ａｄｅ２はそれの短いｐｏｌｙＱリピート（３６Ｑ未満）のために凝集不可能であり、正常Ｈｔｔ遺伝子などの短いＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有する遺伝子を代表するものとして含める。図６では、２９Ｑ−ＡＤＥ２および９９Ｑ−ＡＤＥ２を発現する野生型（ＷＴ）細胞は、白色および赤色をそれぞれ示すことが明らかである。しかしながら、ＳＰＴ４遺伝子欠損（ＳＰＴ４Δ）またはＳＰＴ５ ＳＦ変異体がこれらの細胞に導入されると、９９Ｑ−ＡＤＥ２発現細胞において赤色の細胞色は白色に変化する。ＳＰＴ５ ＳＦ細胞は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を阻害する特異的ＳＰＴ５ Ｓ３２４Ｆ点突然変異を保有している。これらの結果は、ｐｏｌｙＱ凝集はＳｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を妨げることによって影響を受けることを示唆している。

ＳＰＴ４遺伝子欠損またはＳＰＴ５ ＳＦ変異を有する細胞内のｐｏｌｙＱ−Ａｄｅ２タンパク質の発現および凝集の分析
ｐｏｌｙＱ−Ａｄｅ２タンパク質の発現および凝集は、スロットブロット法およびフィルタートラップ法それぞれによって調査した。フィルタートラップ法は酢酸セルロース（ＣＡ）膜を使用して凝集タンパク質のみを補足し、一方で、スロットブロット法はニトロセルロース（ＮＣ）膜を使用し、それは全てのローディングされたタンパク質を保持する。膜上でのｐｏｌｙＱ−Ａｄｅ２の保持は、抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫ブロット法によって検出した。α−チューブリン（α−Ｔｕｂ）を、各試料において均等なタンパク質ローディングを確保するために含めた。図７では、９９Ｑ−Ａｄｅ２タンパク質の凝集（ＣＡ、上方パネル）は、ＷＴ細胞と比較してＳＰＴ４ΔおよびＳＰＴ５ ＳＦ変異細胞において著しく減少することを示している。この発見は、実施例５において観察されるように、これらの変異細胞ではｐｏｌｙＱ凝集がより少ないという概念と一致している。凝集の減少に加えて、私たちは９９Ｑ−Ａｄｅ２タンパク質の発現（ＮＣ、上方パネル）が、ＳＰＴ４ΔおよびＳＰＴ５ ＳＦ細胞において減少していることも発見した。しかしながら、これらの変異細胞は２９Ｑ−Ａｄｅ２の発現（ＮＣ、下方パネル）には影響しなかった。これらの結果は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を妨げることによるｐｏｌｙＱ凝集の阻害が、現実的であることを確認するものである。さらに、短いものはそうではないが、長いｐｏｌｙＱの伸長ストレッチ（＞３６Ｑ）を有するタンパク質の発現は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体形成を阻止する変異に影響されやすい。

ＳＰＴ４遺伝子欠損またはＳＰＴ５ ＳＦ変異を有する細胞内のノーザンブロット法によるｐｏｌｙＱ−ＡＤＥ２ ｍＲＮＡレベルの分析
９９Ｑ−Ａｄｅ２および２９Ｑ−Ａｄｅ２をコードする転写産物の発現は、実施例５において説明したように、細胞内のノーザンブロット法によって分析した。ｐｏｌｙＱ−ＡＤＥ２ ｍＲＮＡｓをｐｏｌｙＱプローブによって検出し、ＳＣＲ１をローディングコントロールとして含めた。正常化の後、９９Ｑ−ＡＤＥ２を発現するＷＴ細胞内のｍＲＮＡレベルを１００％に設定した。示された細胞における相対的９９Ｑ−ＡＤＥ２および２９Ｑ−ＡＤＥ２のｍＲＮＡレベルを図８に示す。ＷＴと比較すると、ＳＰＴ４ΔおよびＳＰＴ５ ＳＦの細胞の両方は、９９Ｑ−ＡＤＥ２のｍＲＮＡ発現において減少を示しているが、２９Ｑ−ＡＤＥ２のｍＲＮＡ発現においては減少を示していない。この観察結果は、実施例６でのＳＰＴ４ΔおよびＳＰＴ５ ＳＦの変異細胞内における９９Ｑ−Ａｄｅ２タンパク質発現の変化と一致している。

本発見はまた、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体の形成を妨げることによって、短いｐｏｌｙＱリピートをコードする遺伝子に影響することなく、伸長ＣＡＧリピートを有する遺伝子の発現を阻害することが現実的であることも立証する。

Claims (11)

1. 細胞内での第１遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記第１遺伝子は３６を超えるリピート数を有する伸長ＣＡＧリピートを含み、
   前記方法は第２遺伝子の発現を抑制する段階を含み、前記第２遺伝子はＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４ＨおよびＳＵＰＴ５Ｈから成る群より選択されるものであり、
   前記細胞はヒトを除く動物細胞または酵母細胞である方法。
2. 請求項１の方法であって、前記第１遺伝子は、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ、およびＨｔｔの遺伝子から成る群より選択される方法。
3. 請求項１の方法であって、前記第１遺伝子は、３６を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。
4. 請求項１の方法であって、前記抑制段階は、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、化学阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される遺伝子抑制法によって実施される方法。
5. 請求項１の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。
6. 細胞内での第１遺伝子の発現を抑制するための方法であって、該方法は、細胞内のＳｐｔ４／Ｓｐｔ５またはＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈの複合体形成を阻害する段階を含み、前記第１遺伝子は３６を超えるリピートを有する伸長ＣＡＧリピートを含むものであり、前記細胞はヒトを除く動物細胞または酵母細胞である方法。
7. 請求項６の方法であって、前記第１遺伝子は、３６を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。
8. 請求項６の方法であって、前記第１遺伝子は、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ７，ＳＣＡ１７，ＤＲＰＬＡ，ＡＲ、およびＨｔｔの遺伝子から成る群より選択される方法。
9. 請求項６の方法であって、前記阻害段階は、抗体、小試薬、またはペプチドから選択される阻害剤を細胞に投与することによって実施される方法。
10. 請求項６の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。
11. 第１遺伝子の発現抑制またはポリグルタミン病の治療に有用な化合物を特定するための方法であって、前記方法は、Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５複合体またはＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体の形成を破壊可能な阻害活性を有するものを特定するために、複数の試験化合物をスクリーニングする段階を含み、前記第１遺伝子は、ＣＡＧリピートの数が３６を超える伸長ＣＡＧリピートを含む方法。