CN104630219B - 抑癌基因IRX1的saRNA分子及其组合物和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体地说，本发明涉及一抑癌基因IRX1的saRNA分子及其组合物和其应用。本发明公开了一抑癌基因IRX1的saRNA分子，其特征在于其序列与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上‑1781至‑2930区域的序列SEQ ID NO：1互补，增加IRX1基因的表达。本发明首次发现了抑癌基因IRX1的saRNA分子，其能有效地激活癌细胞内失活的抑癌基因IRX1，具有抑制癌细胞增殖的生物学功效，为肿瘤的基因治疗提供了新方法和新分子靶点，对开发肿瘤的靶向治疗新策略具有重要意义，具有潜在临床应用价值。

Description

抑癌基因IRX1的saRNA分子及其组合物和其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体地说，本发明涉及一抑癌基因IRX1的saRNA分子及其组合物和其应用。

背景技术

抑癌基因是一大类可抑制细胞生长，并潜在抑制癌变的基因群。正常情况下它们对细胞的发育、生长和分化起重要调控作用。染色体上某些位点等位基因的杂合性丢失（LOH）及启动子区高甲基化是导致抑癌基因失活的重要分子机制，如何实现抑癌基因功能复活是目前肿瘤预防和治疗的一条重要方向。

Iroquois homeobox protein1(IRX1)基因属于易洛魁家族同源盒基因，基因定位于5号染色体短臂5p15.33区，已被证实在胃癌和头颈癌中IRX1发挥抑癌基因作用(Guo X,et al.Oncogene, 2010.29(27):3908-20；Bennett KL,et al.Cancer Res,2008.68(12):4494-9)。

小分子激活RNA（small activating RNA，saRNA）是新近发现的靶向基因启动子DNA序列的双链小RNA分子,由saRNA激活靶基因使之再活化的现象被称之为RNA激活(RNAactivation,RNAa)。saRNA是通过靶向基因启动子区特定序列实现激活靶基因的功效，已有用于抑癌基因的调控和实验性治疗研究的报道。RNA激活技术的开发为以抑癌基因为靶点的实验研究与靶向治疗提供了极其有前景的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一抑癌基因IRX1的saRNA分子，以激活癌细胞内失活的抑癌基因 IRX1，实现治疗肿瘤的目的。

为此，本发明公开了一抑癌基因IRX1的saRNA分子，其特征在于其序列与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1781至-2930区域的序列（SEQ ID NO：1）互补，增加IRX1基因的表达，其中优选所述其序列与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1955至-2728区域的序列（SEQ ID NO：2）互补。

在一些实施例中，所述saRNA分子其序列为SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO： 5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8，其中优选为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

本发明提供如上所述saRNA用于在执行IRX1基因在哺乳动物细胞中的激活（例如，增加基因的表达）针对IRX1基因的启动子序列的区域。

另一方面，本发明还公开了一种用于激活IRX1基因的组合物，包括至少第一条核糖核酸链，所述第一条核糖核酸链，其序列为SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQID NO： 6，SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8，与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上区域的序列（SEQ ID NO：2）互补，增加IRX1基因的表达。

在某些方面，组合物可以包括第二条核糖核酸链，其特征在于，当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO：3所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ ID NO：4；当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO：5所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ ID NO：6；当第一核糖核酸链序列为SEQ ID NO：7所示，第二个核糖核酸链序列为SEQ ID NO：8。

在某些实施例中，所述组合物可包含至少一种saRNA分子，其含有一个核糖核酸的序列为与选自序列SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO： 7，或SEQ ID NO：8，其中优选为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或为与序列SEQ ID NO： 3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8中之一具有至少99％，95％，90％，85％，或更少的序列同一性的序列。

在某些实施例中，所述组合物可包括两个或多个的saRNA分子，其中每个saRNA核糖核酸链，互补的靶基因IRX1的启动子区域内的不同的位置。

另一方面，本发明公开一种增强哺乳细胞中抑癌基因IRX1表达的方法。

另一方面，本发明公开如上所述saRNA在制备治疗细胞增生性疾病药物中的用途。

本发明首次发现了抑癌基因IRX1的saRNA分子，其能有效地激活癌细胞内失活的抑癌基因IRX1，具有抑制癌细胞增殖的生物学功效，为肿瘤的基因治疗提供了新方法和新分子靶点，对开发肿瘤的靶向治疗新策略具有重要意义，具有潜在临床应用价值。

附图说明

图1.几个小双链RNA序列作用靶点示意图。

图2.小双链RNA序列激活IRX1基因表达的荧光定量PCR检测。

图3.以小双链RNA dsIRX1-2119为例激活IRX1基因表达的免疫印迹法检测。

图4.小双链RNA序列dsIRX1-2119激活IRX1基因表达的细胞增殖活力检测。

图5.小双链RNA序列dsIRX1-2119激活IRX1基因表达的细胞克隆形成能力检测。

具体实施方式

如本文所用，术语“分离的”是为了描述的兴趣（例如，可以是多核苷酸或多肽）的化合物，其中化合物可能会自然发生的环境中，不同的是。

本文所用的术语“纯化的”用于此是指从生产环境，在该环境中取出的化合物，是至少60 ％，优选75％，并且最优选90％无与它是天然相关的其它构件或以其他方式与在生产过程中。

本文所用的术语“互补”是指多核苷酸形成碱基对彼此的能力。通常是在反平行的多核苷酸链的碱基单位之间通过氢键形成碱基对。多核苷酸链互补碱基对沃森-克里克的方式（如A -T，A-U，C-G），或以任何其他方式，允许形成复式。

完美的互补性或100％的互补性是指，其中每一个多核苷酸链的核苷酸单元的情况氢键与第二多核苷酸链的碱基单位，没有一个“不匹配”。不到完美的互补性指的情况是：不是所有的核苷酸单位的两股彼此的氢键。例如，对于2个20聚体，如果只有两个在每条链上的碱基对的氢键彼此的多核苷酸链表现出10％的互补性。在相同的例子中，如果在每条链上的18个碱基对可以彼此的氢键，表现出的多核苷酸链90％以上的互补性。实质性的互补性是指约79％，约80％，约85％，约90％，约95％或更大的互补性。

本文所用的术语“共轭物”（conjugate）是指一种多核苷酸，是共价键或非共价地与改变的多核苷酸的物理性能，如增加的稳定性和/或促进的双链RNA的细胞摄取的分子或基团，例如，但不显着影响的能力的多核苷酸的碱基配对与互补的多核苷酸。“末端共轭”可以具有直接或间接地连接，通过一个连接器的3'和/或5'末端的多聚核苷酸链或双链多聚核苷酸的分子或基团。可具有一个内部的共轭的分子或基团直接或间接地连接，通过一个连接基团对基础，如核糖的2'位，不干扰Watson-Crick碱基配对的其他位置，例如，5-氨基烯丙基尿苷。

在一个双链多核苷酸中的一个或两个5'端的多核苷酸链组成的双链多核苷酸可以承担的共轭分子或基团，和/或一个或两个3'末端的多聚核苷酸链的含有双双链多核苷酸能承受的共轭分子或基团。

共轭物可以含有，例如，氨基酸，肽，多肽，蛋白质，抗体，抗原，毒素，激素，脂质，核苷酸，核苷，糖，碳水化合物，聚合物，如聚乙二醇和聚丙二醇，以及类似物所有这些类的物质或衍生工具。另外的例子，共轭物包含类固醇，如胆固醇，磷脂，二-和三-甘油酯，脂肪酸，烃类，可含有或不含有不饱和基或取代，酶底物，生物素，地高辛，和多糖。还有其他的例子包括己基-S-三苯基甲硫醇，巯基胆固醇，烷基链如dodecandiol或十一烷基，磷脂如二-十六烷基-外消旋-丙三醇，三乙基1,2-二-O-十六烷基-硫醚邻3-H-膦酸酯，聚胺，聚乙二醇，金刚烷乙酸，棕榈基，十八烷基胺基团，hexylaminocarbonyl oxyc holesterol，法呢基，香叶基团。

共轭物也可包括可检测的标记。例如，共轭物可以是荧光团共价连接的多聚核苷酸。共轭物可以包括如TAMRA，BODIPY荧光团，Cy衍生物，例如Cy3或Cy5，Dabsyl，或本领域中已知的任何其他合适的荧光团。

一共轭分子或基团可以被连接到末端核苷酸上的任何位置，即方便又基本上不干扰而承受它的多核苷酸（次）所需的活性，例如核糖的3'或5'位。在培养的细胞在体外试验的功能，其中的测量是在24小时后转染，共轭分子或基团影响saRNA所需的活性，如果是不利的影响其功能，例如saRNA的能力介导基因激活作用的减少，如大于80％，其将被排除。

本文所用的术语“有效浓度”是指在细胞中的浓度为saRNA有效地引起在细胞中感兴趣的基因的转录增加。特别令人感兴趣的是，提供一个有效的浓度大于或等于至少约10％或以上， 20％或以上，30％或以上，45％以上的增加，其中包括约50％或更多，约60％或较多，约70 ％以上，约75％或更多，大约有80％或更多的增加相对于基底的表达水平在24，48，72，或 96小时给药后，靶序列活动。靶序列的活动可能是由在本领域中已知的任何方法测量。例如，当靶序列是启动子，靶序列的活性可被测量水平的转录，转录的蛋白质水平，其可操作地连接或可操作地与启动子或转录活性的蛋白质，其可操作地连接或可操作地与启动子。

本文所用的术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，并包括但不限于单链或双链分子，DNA， RNA，或DNA/RNA杂交体的多核苷酸链的定期和不定期交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分（即，其特征在于，备用核苷酸单位有一个-OH，和-H，-OH，然后一个-H等的糖基团的 2'位上），并修饰这些类型的多核苷酸，其中各种实体或基团的核苷酸单元，在任意的位置的替换或附加以及天然存在的或者非天然存在的主链均包括在内。

本文所用的术语“多核糖核苷酸”是指包括两个或更多的改性或未改性的核糖核苷酸和/或它们的类似物的多核苷酸。

术语“可操作地相关联”和“可操作地连接”是指功能相关的核酸序列的。通过举例的方式，调节序列可操作地连接，或与一种蛋白编码核酸序列可操作地相关联，如果调节序列编码的蛋白质的表达能发挥的效果。在另一个例子中，启动子被可操作地连接或可操作地相关联的蛋白质的编码核酸序列，如果启动子控制转录的编码的蛋白质。虽然可操作地相关联，或与他们所控制的，短语“可操作地相关联”和“可操作地连接”并不意味着被限制在那些情况下，它们控制与调节序列是连续的核酸序列可操作地连接的核酸序列可以是连续的核酸序列。

本文所用的术语“基因”包括，在适当的宿主细胞中存在时，有利于生产的基因产物的核酸序列。“基因”可以包含的核酸序列编码的蛋白质，不编码蛋白质的序列，包括基因的宿主细胞是内源性的，或者是完全或部分重组（例如，由于启动子的外源多核苷酸，其编码的引入和的编码序列，或相邻的内源性的编码序列，导入宿主细胞）的异源启动子的介绍。例如，术语“基因”包括核酸，可以由外显子和内含子。编码蛋白质的序列，例如，包含于外显子的序列，该序列在起始密码子和终止密码子的开放阅读框之间。“基因”在本文中是指一种核酸，包括，例如，调节序列如启动子，增强子和本领域中已知的所有其他序列可操作地连接或可操作地相关联的调节序列的核酸序列的转录，表达或活性的核酸序列，包括编码序列或非编码序列。在一个上下文中，例如，“基因”被用于描述包括调节序列，如启动子或增强子和编码和非编码序列的核酸。由一个或多个异源调节序列的重组基因的表达可被控制。“异源”指的是两个要素，一般都不会在本质上相关联。

本文所用的术语“靶基因”是含有核酸的序列，诸如，例如，启动子或增强子，针对一个的saRNA可以直接表达活化的影响为目的。其中一个或两个“基因”和“靶基因”，可以是天然存在的核酸序列的生物体，转基因，病毒或细菌的序列，染色体或染色体外，和/或瞬时或慢性转染的细胞和/或它的染色质或掺入。在saRNA介导的激活后，“目标基因”可以压制另一个“基因”，如编码一个蛋白（作为测量表达，转录，翻译，或存在或活性的基因的蛋白产物）的基因的活性。在另一个例子中，一个“靶基因”可以包括增强子，saRNA增强介导的激活可能增加的功能的一个可操作地连接或可操作地相关联的启动子，从而增加另一个如编码基因的“基因”的活性的蛋白质，可操作地连接到增加的启动子和/或增强。

本文所用的术语“调控元件”是调节，诱导，抑制，或以其他方式介导的转录，翻译与它们可操作地连接，或可操作地相关联的核酸序列编码的蛋白质或RNA的核酸序列。通常情况下，例如，如调节元件或序列，增强子或阻遏序列，可操作地链接的可操作地与编码核酸序列的蛋白质或RNA的调控元件或调控序列介导的转录，翻译或表达水平控制转录，翻译和/或表达的蛋白编码核酸序列的响应中的一个或多个调控因子的存在或不存在。调控因子包括，例如，转录因子。可能会发现在内含子的调节序列。

调节序列或元件包括，例如，“TATAA盒，CAAT盒，分化的特定元素，cAMP结合蛋白反应元件，固醇调节元件，血清反应元件，糖皮质激素反应元件，转录因子结合的元素，例如SPI结合单元等。“CAAT”框中，然后通常位于基因的真核的核酸序列编码的蛋白质或RNA 的从起始密码子上游（5'方向）。其他调节序列的例子包括剪接信号，多聚腺苷酸化信号，终止信号等。另外的例子包括调节序列的核酸序列，包括Rous肉瘤病毒和其他逆转录病毒的长末端重复。控制组织特异性的转录调节序列的一个例子是干扰素-ε监管的序列，该序列优先诱导可操作地连接的序列编码胎盘，气管，和子宫组织中的蛋白质，相对于肺，脑，肝，肾，脾，胸腺，前列腺，睾丸，卵巢，小肠，胰腺组织。众多的调节序列在本领域中是已知的，以上所述仅仅是说明性的几个。

本文所用的术语“增强子”和“增强子序列”一词指的各种调节序列，可以提高转录效率，不考虑的方位的增强子序列，或从该启动子在空间的距离或位置，转录起始位点，或第一个密码子的核酸序列，其编码的蛋白质与该增强子可操作地连接或关联。

本文所用的术语“启动子”是指一种核酸序列，该序列不编码的蛋白质，可操作地连接或可操作地相关联的蛋白质编码或编码核酸序列的RNA，转录，可操作地连接的或可操作地相关蛋白编码或RNA编码核酸序列的启动子控制。通常情况下，真核启动子包括100和5000 个碱基对之间，尽管该长度范围内，并不是要进行限制，对于本文所用的术语“启动子”。

虽然通常情况下发现5'蛋白编码的核酸序列，其可操作地连接，或可操作地相关联，启动子可以被发现在内含子序列中。术语“启动子”指的是包括可操作地连接的调节序列具有相同的蛋白质或RNA的编码序列。启动子可以包括很多元素，包括调控元件。

本文所用的术语“非编码靶序列”或“非编码的核酸序列”指的是一不包含在一个外显子的基因的核酸序列。实施例的“非编码靶序列”或“非编码核酸序列”包括启动子区，增强子区域等。

本文所用的术语“核苷酸类似物”包括具有碱，糖和/或磷酸盐，包括，但不限于，5-位修饰嘧啶，8-位的嘌呤修饰，修饰在胞嘧啶环外胺的化学结构的修饰的核苷酸取代的5-溴尿嘧啶，2'-位糖修饰，包括但不限于，糖修饰核糖核苷酸的2'-OH等基团为H，OR，R，卤素取代 SH，SR，NH2，NHR，NR2，或CN，其中R是如本文所定义的烷基部分。核苷酸类似物也意味着包括如，Q苷(queuosine)，肌苷，黄嘌呤，2'-甲基核糖。

本文所用的术语“修饰的碱基”是指核苷酸的碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶，黄嘌呤，肌苷，q苷）替换或添加了一个或多个原子或基团已被修饰的。修饰可以包括修饰的核苷酸的碱基部分，类型的一些例子包括，但不限于，烷基化，卤化，硫醇化，胺化，酰胺化或乙酰化的基础，单独或结合使用。修饰的核苷酸还包括相对于糖基团被修饰的那些核苷酸以及具有糖或类似物。例如，甘露糖，阿拉伯糖，吡喃，半乳糖，4'硫代核糖的，和其他糖类，杂环，或碳环。在本领域公知，术语核苷酸也意味着包括作为通用的碱基。通过举例的方式，通用的碱基包括但不限于3-硝基吡咯，5-硝基吲哚，或nebularine。术语“核苷酸”的意思也包括N3'P5'氨基磷酸酯，产生与氨基中的一个核糖的3'氧取代。

本文所用的术语“核苷酸单元”是指修饰或未修饰的含氮碱基，改性或未改性的糖和修饰或未修饰的部分，该部分可一起连接两个核苷酸或核苷酸的单核苷酸残基。

本文所用的术语“核吸收提高修饰”是指一种天然或者非天然存在的多核苷酸的变型，提供了增强的修饰的多核苷酸的核摄取。“核吸收增强修饰”的一个例子是一个稳定的变形例中，如改性核苷酸间连键赋予分子如核酸足够的稳定性，以使其具有足够的抵抗降解（如核酸酶酶解）等，导致外源性导入到细胞中的一个细胞的细胞核，相关的核酸可以积累。在这个例子中，容易进入细胞的细胞核的修饰的核酸的能力，抵抗核酸酶，使得在细胞核内的核酸可以实现一个有效的浓度。在细胞核内，一个有效的浓度可导致基因或靶序列的核酸转录活性的结果的可检测的变化。

本文所用的术语“原酸酯修饰的”和“原酸酯改性的”指糖部分的变形，所述糖部分是一个核糖基团与原酸酯的核苷酸单元之内，核苷酸间连接键连接。在一般情况下，原酸酯结构RC（OR'）3的方法，其中每个R'可以是相同的或不同的，R可为H，C是中心碳原酸酯。本发明的原酸酯组成的核苷酸单元中的氧键合，这是在键合到中心碳原酸酯，其中的糖基团的碳原子的原酸酯。原酸酯可以被放置在任何位置上的糖基团，诸如，例如，2'，3'和/或5'位上。修饰性原酸酯/原酸酯保护的多核苷酸的方法，描述在美国专利第5889136和6008400号，每一个通过引用将其全部并入本文。

术语“双链区”是指在两个互补的或基本上互补的多核苷酸形成碱基对彼此的区域，或者通过Watson-Crick碱基配对或其他任何方式，可以是互补的多聚核苷酸链之间的双链或基本上互补。例如，具有21个核苷酸单位的多聚核苷酸链可以与其他多核苷酸的21个核苷酸单位碱基配对，但每条链上仅有19个碱基互补的或基本上互补的，这样的双链区的19个碱基对组成。其它碱基对，例如，可能存在的5'和3'突出端。此外，双链区内，100％的互补性并不需要实质性的互补性是允许的双链区内。实质性的互补性，一般是指至少约79％，约80％，约85％，约85％，约90％，约95％或更大的互补。例如，双链区由19个碱基对组成的（即，18个碱基对和一个不匹配）中约94.7％的互补性的结果，使基本上互补的双链区中的不匹配。在另一个例子中，19个碱基对组成的3个错配的双链区（即，16个碱基对和3个错配）中约84.2％的互补性的结果，使双面的基本上互补的区域，依此类推。

术语“悬端”指的是一个终端（5'或3'）产生一条链延伸超出内的滞留一倍多核苷酸的另一条链的核苷酸碱基配对。两个多聚核苷酸，其能够通过氢键碱基对形成的双链中的一者或两者可具有5'和/或3'末端伸出的3'和/或5'端的两个多核苷酸的互补共享，伸出的3'和/或5'末端的双链的单链区域是悬端。

术语“基因沉默”，是指在核酸的转录，翻译或表达或活性中，所测得的转录水平，mRNA 水平，酶的活性，甲基化状态，染色质状态或配置，翻译水平的降低，这些活动或状态可以直接或间接检测。“基因沉默”是指减少或改善的核酸序列，如功能调节序列的能力，被转录的能力相关联的活动，它能够翻译和表达一种蛋白的结果，而不管发生这种沉默的机制。

术语“基因活化”，“激活的基因”或“基因激活”是可以互换的，是指在转录，翻译或表达或活性的核酸增加，所测得的转录水平，mRNA水平，酶的活性，甲基化，染色质状态或配置，翻译水平，其活动或在细胞或生物系统状态或其他措施。这些活动或状态可以直接或间接检测。此外，“基因活化”，“激活的基因”或“基因激活作用的”核酸序列，如其功能调节序列的能力相关联的活动的增加，它的能力是转录和结果的蛋白质的表达，无论发生这种激活的机制。

术语“RNA干扰”，而术语“RNA干扰”指的多核苷酸链或双链的多核苷酸，其包含至少一个核糖核苷酸单元，通过破坏基因表达的方法,破坏基因表达发挥生物过程中发挥，包括但并不限于通过降解mRNA的基因沉默，与氨酰tRNA，rRNA基因，hnRNA，cDNA和基因组DNA，以及甲基化DNA和辅助蛋白的相互作用。

术语“siRNA的”和“短干扰RNA（short interfering RNA）”是指能够进行RNA干扰的双链核酸，这是18至30个碱基对长度（即，双链区18之间的短语30个碱基对）。

另外，术语siRNA和短语“短干扰RNA”包括核酸，也包含部分以外的核糖核苷酸的部分，包括，但不限于，经修饰的核苷酸，改性核苷酸间核酸键，非核苷酸，脱氧核苷酸和上述核苷酸类似物。与此相反，本发明的saRNAs是截然不同的，不是siRNA。saRNAs不同于RNAi的基因沉默。

术语“细胞”是指任何哺乳动物的细胞，包括人类的哺乳动物细胞，是指在体内的细胞，诸如，例如，在生物体中，或在一个生物体的器官；或指在体外的细胞，如，例如，在细胞培养中的细胞保持。

术语“甲基化”指的是为甲基（-CH3），与另一分子的附着。通常情况下，当DNA进行甲基化，甲基添加到胞嘧啶核苷酸，通常在一个CpG序列，虽然甲基化可以发生在其他站点。蛋白，如，例如，组蛋白3，也有可能甲基化的赖氨酸。

术语“去甲基化”是指从另一分子的甲基（-CH3）去除。通常，当DNA发生去甲基化，甲基从轴承胞嘧啶核苷酸除去，常用的CpG序列的去甲基化，但可以发生在其他站点，如蛋白，例如组蛋白3，也可直接去甲基化的赖氨酸。

术语“药学上可接受的载体”是指有利于引入到细胞的dsRNA的组合物，包括但不限于溶剂或分散剂，涂料，抗感染剂，等渗剂，吸收时间或释放剂介导本发明的多核苷酸链和双链多核苷酸。作为“药学上可接受的载体”包括脂质体可以是中性或阳离子型的，也可以包括如氯喹和1,2-二油酰-sn-甘油3-磷酰乙醇胺，它可以帮助稳定内涵体的分子，从而有助于交付脂质体到细胞内，包括一个细胞的细胞核。

本发明saRNA可以是双链，并且可以由单独的链，例如，为约3至约23，或者可以包括一个单链的RNA，只要用发夹环形成短发夹双链RNA或更多个核苷酸，约5至约22，约6至约21，约7至约20，约8至约19，约9至约18个，约10至约17，约11至约16，约12至约15，约13至约14个碱基，如3或4，或5，或7，或12，或18，或21个核苷酸。

本发明saRNA的具有循环或发夹环可以包括循环的结构，其中由如柔性连接子的连接子连接。弹性接头可以选择各种各样的化学结构，只要它们有足够的长度和材料，以便能够有效的分子内杂交干元素。

虽然本文所公开的序列号的序列完全互补的靶基因中的启动子序列的区域，在一些实施例中，核糖核苷酸链可包括小于100％的序列，该序列中的序列互补靶基因的启动子区域，其中包括约99％的互补，互补的98％，97％的互补性，互补性的96％，95％互补的，互补的94 ％，93％互补的，互补的92％，91％以上的互补性，90％的互补85％的互补性，80％的互补性，互补性的75％，70％互补的靶基因的启动子区域。

本发明saRNA或至少有一个双链saRNA链的核苷酸，可能会被修饰，以提供所希望的特性。例如，可以包括本发明的saRNA分子的修饰的天然存在的或者非天然存在的多核苷酸，提供了增强的核吸收。

核摄取提高维护的一个例子是一个稳定的变形例中，改性核苷酸间连接键赋予分子如核酸足够的稳定性，以使其具有足够的抵抗退化（例如，通过核酸酶）等，相关的核酸可以积累时，外源性导入到细胞中的一个细胞的细胞核。在这个例子中，容易进入细胞的细胞核的修饰的核酸的能力，抵抗核酸酶降解，使得在细胞核内的核酸可以实现一个有效的浓度。

此外，saRNA可以是2'-O-双（2-羟基乙氧基）甲基原酸酯改性的，以提供稳定的核糖核酸分子。其他的变形例中，包括，例如一个骨架磷酸基团修饰（例如，甲基磷酸酯，硫代磷酸酯，磷酰胺和硫代磷酸酯核苷酸键的修饰），例如，增强他们在体内的稳定性，使得它们在治疗应用中特别有用。一个特别有用的磷酸基团修饰的saRNA磷酸酯或磷酸酯的形式转换。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯在体内降解更耐比未修饰的寡核苷酸同行，增加saRNA的半衰期。 saRNA可能还可以修饰包括P5N3'（NP）磷酸酯、MF、LNA），2'-O-甲氧基（MOE），或2'-氟，阿拉伯糖核酸（FANA），可以增强抵抗核酸酶降解（见Faria et al.(2001)NatureBiotechnol. 19:40-44;Toulme(2001)Nature Biotechnol.19:17-18）。

saRNA可采取使用化学合成的方法获得，如采用Dharmacon公司，Inc。的专有的的ACE （R）技术的方法。

另外，人们也可以使用依赖于模板的合成方法。合成方法也可以进行使用改性或非改性的，如本文所公开的天然或非天然的碱基。此外，合成有或没有本文所公开的改性或非改性的核酸骨架。

另外，saRNA分子可能在宿主细胞中合成，由现在已知的或涉及到已知的合成saRNA分子在宿主细胞中的任何方法进行。例如，可以表示saRNA分子使用任何合适的启动子的DNA载体。用于表达本发明的saRNA分子从载体中的合适的启动子包括，例如，U6或H1RNA聚合酶III的启动子序列以及巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域的技能内。与本发明中使用的合适的载体包括那些描述在美国专利第5624803号，其中披露在其完全纳入本文。本发明的重组质粒也可包括在特定组织或在特定的细胞内环境的的saRNA分子的表达的诱导型或调节的启动子。选择合适的载体，用于表达本发明的saRNA，插入saRNA到载体表达的核酸序列的方法，提供感兴趣的细胞的重组载体的方法是在本领域的技能范围内。见 Tuschl,T.(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448;Brummelkamp T R etal.(2002),Science296: 550-553;Miyagishi M et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500;Paddison P J et al.(2002),Genes Dev.16:948-958;Lee N S et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505;and Paul C P et al.(2002), Nat.Biotechnol.20:505-508，整个公开的内容在此引入作为参考。运载和细胞内的表达适于本发明中使用的其它方法中描述的，例如，美国专利申请公开第20040005593号，20050048647， 20050060771，全部公开内容在此引入作为参考。本发明saRNA分子在表达的重组核酸载体中，可作为两个独立的，互补的RNA分子，或作为一个与两个互补区的单个RNA分子。

一旦合成，本发明的多核苷酸，可能会立即被使用，或者被存储以备将来使用。在一些实施例中，本发明的多核苷酸被存储在适当的缓冲液中的双链。多种缓冲液是已知在本领域适合用于存储saRNAs的。例如，缓冲液可以由100mM的氯化钾和30mM HEPES，pH值7.5，和 1mM氯化镁。

在代表性的实施方案中，本发明的双链多核苷酸的保留其活性的30％至100％时，在这样的缓冲存储在4度，一年。更优选地，存储在这样的缓冲液4℃，一年，它们保留其生物活性的80％至100％时。为了确保saRNA的稳定性，在使用前，它们可能会被保留在干的形式（如冻干形式），在-20℃直到他们准备使用。

在使用前，它们应该被重新悬浮，然而，即使是一次再悬浮，例如，在上述的缓冲液，它们应保持在-20℃

下直至使用。的上述缓冲液，在使用前，可被存储在约4℃下或室温下进行。进行转染的有效温度在本领域中的技术人员公知的，但包括，例如，室温下。

方法

本发明提供了增加IRX1基因的表达，包括引入saRNA分子到哺乳动物细胞的细胞核中，其中saRNA分子中有一个的IRX1基因的启动子序列的区域互补的链，导致IRX1基因的表达增加的结果。IRX1基因的表达或活性的测量可采用本领域中公知的各种方法中的任何一个，包括测量靶基因的核酸的转录水平，靶基因的mRNA表达水平，靶基因的蛋白质水平。

本发明是适用于整个范围广泛的哺乳动物，包括但不限于人类。哺乳动物如牛，马，山羊，猪，羊，犬科动物，啮齿动物，如仓鼠，小鼠和大鼠，和灵长类动物，大猩猩，黑猩猩和人。

转基因哺乳动物中也可以使用，例如，哺乳动物的嵌合基因序列。

本发明可以有利地使用具有不同类型的细胞，包括生殖细胞系、体细胞、干细胞或分化后的细胞。例如，细胞类型可以是胚细胞，卵母细胞，精子细胞，脂肪细胞，成纤维细胞，肌细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，神经细胞，神经胶质细胞，血细胞，巨核细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞，白细胞，粒细胞，角质形成细胞，软骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，肝细胞和内分泌或外分泌腺细胞。

从阅读了本文中，本领域的技术人员在本领域中可以得出结论，本发明的组合物和方法可应用的现在已知的任何方法使saRNA穿过细胞膜和/或核膜，将是有益于本发明。

这些方法包括，但不限于，任何方式，如转染，例如，采用DEAE-葡聚糖，磷酸钙，阳离子脂质/脂质体，胶束，操纵压力，显微注射，电穿孔，免疫穿孔，或使用载体，如病毒（如RNA病毒）、质粒，细胞融合，和耦合的多核苷酸的特定共轭物或配体，如抗体、抗原、受体，被动引进saRNA，促进其吸收。

本发明的saRNA可以用在一组不同的应用程序的激活的靶基因，包括但不限于基础研究，药物发现和开发，诊断和治疗。可本申请中的靶核酸序列的确定的激活（例如，增加表达）用于验证的基因产物是否是药物发现或开发的一个目标。例如，细胞接触一个特定的针对特定的目标序列的调节序列的saRNA，该信元被保持的条件下，使甲基化的目标DNA和/或甲基化的核蛋白质，例如一个或多个组蛋白，导致活性下降或一个基因的转录活动增加的程度，例如转录或翻译的基因以及与这样的活动增加的效果，然后进行评估，并判断为，如果活性增加，则核酸序列将是一种药物发现或发展目标。以这种方式，相关表型理想的saRNA在适当的情况下可以进行毒性和药代动力学研究和开发治疗制剂。

另外，本发明可以被用于在应用活动中，例如，预防，诊断和治疗。对于这些应用，一个体具有一个特定的靶核酸通过操纵调制的疾病或病症，经saRNA处理的结果可能是改善，缓和，预防，和/或诊断的一个特定的疾病或紊乱。在代表性的实施例中，saRNA带或不带稀释剂的药学上可接受的载体与药学上可接受的方式给药。

适于治疗用本发明的方法的涉及saRNAs的适应症包括具有细胞增生性疾病。细胞增生性疾病的例子包括，但不限于，异常刺激的内皮细胞（例如，动脉粥样硬化），实体瘤和肿瘤转移，良性的肿瘤，例如，前列腺癌，胃肠道癌，血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，化脓性肉芽肿，血管的故障，异常的伤口愈合，炎症和免疫疾病，白塞氏病，痛风和痛风性关节炎，异常血管生成伴随，例如，类风湿关节炎，牛皮癣，糖尿病性视网膜病变，其他眼部血管生成的疾病，如早产儿视网膜病变（晶状体后纤维组织），黄斑变性，角膜移植物排斥，青光眼和奥斯特韦伯综合征，银屑病，真菌、寄生虫和病毒感染，如巨细胞病毒感染。

本发明不应该被解释为仅限于具有细胞增生性疾病的患者的治疗。相反，本发明应被理解为包括或IRX1基因的表达减少的状况或疾病的患者的治疗，将受益于本发明的方法。

在一个或多个参数的显着改善疗效的指标，以及本领域技术人员的普通医护人员（例如，临床医生）来调整给药方案和剂量根据各种因素（例如，依赖于病人的严重程度等因素，以提供最佳的好处对患者疾病等，给药的化合物等）。

药物制剂

本发明提供的是上述的saRNA分子的药物制剂。

通过本领域常见各种方法，saRNA化合物可制备出用于治疗给药的各种剂型。

更具体地，本发明的化合物可配制成药物组合物与适当的药学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂和/或佐剂组合，并且可以配制成固体，半固体，液体或气体形式的制剂，如片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，注射剂，吸入剂和气溶胶，在无菌小瓶或注射器。

用于透皮给药制剂，该化合物优选配制没有检测到DMSO中，或与载体除了DMSO。该制剂可被设计用于施用于受试者或患者需要其通过许多不同的路由，包括口服，口腔，直肠，肠胃外，腹膜内，皮内，气管内等；给药可以是发货全身性或局部性的配方需要的治疗，例如，局部输送到肿瘤中的内部。

此外，药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，等渗调节剂，稳定剂，润湿剂和类似物，均为本领域技术人员所公知。

就本技术领域的技术人员而言，制备各种剂型的实际方法是已知的，或将是显而易见的，参见，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985;Remington:The Science and Practice ofPharmacy,A.R.Gennaro,(2000)Lippincott, Williams&Wilkins。在任何情况下，给药的组合物或制剂将含有一定量的，足以使受治疗者达到理想效果状态。

在药物剂型中，本发明的主题saRNA分子可能被它们的药学上可接受的盐的形式给药，或者它们也可以单独使用，或在适当的关联，以及组合，与其它药用活性化合物。

下列方法和赋形剂是仅仅是示例性的，决不是限制性的。

常规和药学上可接受的给药途径，包括鼻内，肺内肌内，气管内，瘤内，皮下，皮内，外敷，静脉注射，直肠，鼻腔，口腔及其他肠外给药途径。给药途径可能被合并，如果需要的话，或调整，这取决于治疗程序和/或所需的效果。该组合物可以以单一剂量或多次剂量给药。

根据主体和治疗条件和给药途径，saRNA分子可采用合适的剂量范围给药，1μg至10000μg 或10000μg/公斤体重每天。在某些实施例中，反复进行给药，直至达到所期望的效果的治疗给药。

使用本发明的化合物的组合疗法

在本发明方法中使用，本发明所述saRNA分子与其他药物如化疗药物联合给药，以实现治疗目的。或本发明化合物可用于增加另一种化学品的有效性，如一种药物，或在另一种化学物质的量的减少。

在联合治疗中使用的化学治疗剂包括，但不限于，柔红霉素，柔红霉素，放线菌素D，多柔比星，表柔比星，伊达比星，依索比星，博来霉素，马磷酰胺，异环磷酰胺，阿糖胞苷，卡莫司汀，白消安，丝裂霉素C，放线菌素D，光辉霉素，强的松，羟孕酮，睾酮，他莫昔芬（tamoxifen），达卡巴嗪，丙卡巴肼，六甲基蜜胺，五甲密胺，米托蒽醌，安吖啶，苯丁酸氮芥，氮芥，苯丙氨酸氮芥，环磷酰胺，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氮胞苷，脱氧柯福霉素，羟基脲，5-氟尿嘧啶（5-FU），5-氟脱氧尿苷（5-FUDR），甲氨蝶呤（MTX），秋水仙素，紫杉醇，长春新碱，长春碱，鬼臼乙叉甙（VP-16），三甲曲，伊立替康，拓扑替康，吉西他滨，替尼泊苷，顺铂和己烯雌酚（DES）。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1saRNA的制备

参考有关文献（Li,L.C.,S.T.Okino,etal.(2006).Small dsRNAs inducetranscriptional activation in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A103(46):17337;Huang,V.,Y.Qin,etal.(2010). "RNAa is conserved in mammalian cells."PLoSOne5(1):e8848）对IRX1基因启动子DNA序列 SEQ ID NO：1进行分析，设计出靶向IRX1基因启动子DNA序列的双链小RNA （dsRNA） 7对。dsRNA作用靶点距离转录起始位点(TSS)的位置分别为：

dsIRX1-2930 (靶点在-2930至-2912)

sense:5'UGGGAUGCUUUGGUGGCAA3'

antisense:5'UUGCCACCAAAGCAUCCCA3'

dsIRX1-2728(靶点在-2728至-2710)

sense:5'CCUGGCCUUGGGCAGAGAA3'（SEQ ID NO：3）

antisense:5'UUCUCUGCCCAAGGCCAGG3'（SEQ ID NO：4）

dsIRX1-2119(靶点在-2119至-2101)

sense:5'AGGAGGUUGAAGAUCGGAA3'（SEQ ID NO：5）

antisense:5'UUCCGAUCUUCAACCUCCU3'（SEQ ID NO：6）

dsIRX1-1973(靶点在-1973至-1955)

sense:5'CAGCCCGGAAUCUAUGUAA3'（SEQ ID NO：7）

antisense:5'UUACAUAGAUUCCGGGCUG3'（SEQ ID NO：8）

dsIRX1-1828(靶点在-1828至-1810)

sense:5'GGAGCUGGUUAUUAGUAAU3'

antisense:5'AUUACUAAUAACCAGCUCC3'

dsIRX1-1820(靶点在-1820至-1802)

sense:5'ACUACCAUCACGGGCAUUA3'

antisense:5'UAAUGCCCGUGAUGGUAGU3'

dsIRX1-1799(靶点在-1799至-1781)

sense:5'ACGGGCAUUAUUGUUGCUA3'

antisense:5'UAGCAACAAUAAUGCCCGU3'。阴性对照为dscontrol，设计要点是各序列与人类基因组其它编码序列无同源性。合成各dsRNA序列（附表1）。各dsRNAs作用靶点示意图见图1。

表1 7对dsRNA与阴性对照序列

上述下列3'末端TT为合成RNA常带碱基，它们可为除G外其他任何碱基。

实施例2saRNA对IRX1表达的影响

胃癌细胞SGC-7901、NCI-N87用含10%胎牛血清RPMI-1640，5%CO2、37°C培养箱培养。处于对数生长期的细胞，2×105接种于六孔板培养过夜。次日以上dsRNAs和dscontrol以50nM 的终浓度，通过脂质体Lipofectamine2000转染胃癌细胞株SGC-7901和NCI-N87，转染5天后收获细胞。TRIzol试剂法提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，荧光定量PCR法分析靶基因 IRX1的mRNA的表达差异。荧光定量PCR所使用引物序列见表2。

免疫印迹分析

采用PBS缓冲液清洗细胞，RIPA蛋白裂解液冰上裂解数分钟后12,000rpm/min离心15min 收集上清；BCA法检测蛋白浓度。12.5％SDS-PAGE凝胶电泳约2h后将蛋白转移至PVDF膜（polyvinylidene difluoride membranes）。5%脱脂牛奶封闭，加鼠抗人IRX1单克隆抗体(1： 250，bioworld)，和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（Monocolony mouse anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，1：5000，Sigma公司）4℃孵育过夜。荧光二抗1：5,000稀释，常温下孵育2h。Odyssey图像分析系统(Gene Company Limited)下显影和拍照。

表2靶基因IRX1表达分析用荧光定量PCR引物序列

上述操作发现，这7对中dsIRX1-1799、dsIRX1-1973、dsIRX1-2728、dsIRX1-2119以及 dsIRX1-2930这5对dsRNA均不同程度具有激活IRX1基因mRNA表达作用，但在不同细胞株中的激活效果存在差异，但两株胃癌细胞中dsIRX1-2119均显示出极好的激活效果（图2）。以dsIRX1-2119为例进行蛋白免疫印迹检测发现，dsIRX1-2119可以明显上调IRX1的蛋白表达（图3）。同时结果也表明若RNAa与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1955至-2728区域的序列（SEQ ID NO：2）互补，这些RNAa的激活效果也更加显著，这表明IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1955至-2728区域的序列是其中调控核心区域。

实施例3saRNA对胃癌细胞增殖的影响

将dsIRX1-2119序列转染胃癌细胞株后，利用CCK8法检测发现，SGC-7901和NCI-N87 两株胃癌细胞的增殖能力均明显受到抑制（图4）。

用dsRNAs、dscontrol或mock转染胃癌细胞12h后以每孔1000个细胞的密度铺入96孔板。每24h加入10μl的cell counting Kit-8检测试剂（DojinDo Laboratories,Japan）后继续培养4h，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值，连续检测5天。利用获得的6个时间点吸光度平均值绘制细胞增殖曲线。

用dsRNA-2119、dscontrol或mock转染胃癌细胞，12h后以每孔1000个细胞铺入6孔板, 继续以完全培养基培养。每3天换液一次，连续培养12至15天肉眼可见细胞克隆后用0.1% 结晶紫染色，显微镜下计数含有50个细胞以上的克隆数。dsIRX1-2119序列转染胃癌细胞株后，利用平板集落形成法检测胃癌细胞的克隆形成能力发现，胃癌细胞SGC-7901和NCI-N87 的克隆形成能力也明显受到抑制（图5）。

上述结果表明，RNAa方法可以有效恢复胃癌细胞中沉默的IRX1抑癌基因再表达。通过对 7对双链RNA进行筛选，其中5对不同程度激活了IRX1基因的再表达，其中以dsIRX1-2119 的激活作用最为明显，dsIRX1-2119在胃癌细胞内可以明显抑制胃癌细胞生长，表现出显著的抑癌作用。因此，RNA激活技术有望在胃癌靶向治疗中发挥关键作用，据此原理可以开发以抑癌基因为靶点的胃癌靶向治疗药物，改善胃癌治疗现状。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (8)

1.一种抑癌基因IRX1的saRNA分子，其特征在于所述saRNA分子中的一条链与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1781至-2930区域的序列SEQ ID NO：1互补，且与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上的-1973至-1955区域或-2119至-2101区域互补，增加IRX1基因的表达。

2.如权利要求1所述saRNA分子，其特征在于所述saRNA分子中的一条链与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1955至-2728区域的序列SEQ ID NO：2互补。

3.如权利要求1所述saRNA分子，其特征在于所述saRNA分子其序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

4.一种用于激活IRX1基因的组合物，包括saRNA分子，所述saRNA分子其序列为SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述saRNA分子中的一条链与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1799至-2930区域的序列SEQ ID NO：1互补，增加IRX1基因的表达。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于所述组合物包括两个saRNA分子，其中一个saRNA分子其序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，另一个saRNA分子其序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

7.如权利要求1所述saRNA在制备治疗细胞增生性疾病药物中的用途。

8.一种非治疗诊断目的增加IRX1基因表达的方法，其特征在于，设计saRNA分子并引入到细胞中，其中所述saRNA分子中的一条链与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上-1781至-2930区域的序列SEQ ID NO：1互补，且与IRX1基因启动子区距转录起始位点以上的-1973至-1955区域、或-2119至-2101区域互补。