JP2022530937A - オリゴ核酸分子及びその急性間欠性ポルフィリン症の治療における応用 - Google Patents

オリゴ核酸分子及びその急性間欠性ポルフィリン症の治療における応用 Download PDF

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Abstract

本発明は、HMBS遺伝子発現を向上させるための小分子活性化核酸分子及びその応用に関する。本発明の小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター領域に標的化する二本鎖又は一本鎖RNA分子であってもよく、第1核酸鎖と第2核酸鎖を含む。前記第1核酸鎖及び第2核酸鎖はそれぞれ、例えばRNA活性化メカニズムを通じてHMBS遺伝子の細胞での発現を促進し得る二本鎖核酸構造を形成できる相補領域を含有する。第1又は第2核酸鎖の長さが、それぞれ16~35個ヌクレオチド長であり、そのうち一本のヌクレオチド鎖は標的遺伝子プロモーター領域から選ばれるターゲットと少なくとも75%の同一性又は相補性を有し、もう一本の鎖は第1鎖と少なくとも75%の相補性を有し、2本のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端が0～6個ヌクレオチドの突出を有してもよい。HMBS遺伝子に対する小分子活性化核酸分子を用いると、HMBS遺伝子のmRNA及びタンパク質の細胞での発現をアップレギュレーションし、その酵素活性を促進することができる。

Description

本発明は、核酸の技術分野に属し、具体的には、遺伝子活性化に関連するオリゴ核酸分子、例えば小分子活性化核酸分子、及び小分子活性化核酸分子の、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）遺伝子発現の活性化/アップレギュレーションにおける応用、並びに、HMBS発現不足又は活性低下に起因する疾患、例えば急性間欠性ポルフィリン症の治療における応用に関する。
遺伝性ポルフィリン症は、ヘモグロビン生合成経路（ポルフィリン経路ともいう）における特定の酵素の活性欠乏により引き起こされる一連の疾患である。ポルフィリン経路の酵素欠乏によりヘモグロビンの産生が不足し、ポルフィリン前駆体とポルフィリンが蓄積し、組織での濃度の高いポルフィリン前駆体及びポルフィリンは組織の毒性を引き起こす。
遺伝性ポルフィリン症のうち、急性間欠性ポルフィリン症（acute intermittent porphyria, AIP、例えば、常染色体優性遺伝性AIP）、異型ポルフィリン症（VP、例えば、常染色体優性遺伝性VP）、遺伝性コプロポルフィリン症（クロム親和性細胞又はHCP、例えば常染色体優性HCP）、及び5'アミノレブリン酸（δ-アミノレブリン酸又はALAとも呼ばれる）デヒドラターゼ欠乏性ポルフィリン症（ADP、例えば常染色体劣性ADP）は、急性肝ポルフィリン症に分類され、自律神経、末梢神経や中枢神経に関する生命を脅かす可能性のある急性神経系の症状として、重度の腹痛、高血圧、頻脈、便秘、運動無力、麻痺やてんかん発作などなどが挙げられる。治療が妥当でないと、手足の麻痺、呼吸障害、さらに死亡を引き起こすことがある。シトクロムP450を誘導できる多くの医薬品、ダイエット及びホルモンレベルの変化のような因素は、肝臓の5'-アミノレブリン酸合成酵素1（ALAS1）の活性を向上させることでポルフィリン症の急性発作を誘発することがある（BalwaniとDesnick,Blood,120：4496-4504,2012）。
AIPは、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（porphobinogen deaminase、PBGD）欠乏症、又はヒドロキシメチルビランシンターゼ（hydroxymethylbilane synthase、HMBS）欠乏症としても知られており、最も一般的な急性肝ポルフィリン症であり、HMBS遺伝子の突然変異により引き起こされる常染色体優性遺伝病であり、発症率が10万人あたり5～10人であり、そのうち約5～10%の患者に症状がある。AIP患者では、HMBS遺伝子の1つの対立遺伝子に突然変異が発生し、ヒドロキシメチルビランシンターゼのタンパク質発現量が半分に減少し（ハプロ不全）、その結果、その酵素活性が低下し、ALAとPBG（ポルフォビリノーゲン）が体内に蓄積し、ヘモグロビン合成が不足になる。
ヘミン（hemin）の静脈注射は、通常、AIP患者の急性発作期間の治療や予防に用いられる。ヘミンは外因性ヘモグロビンを提供することでALAS1の負のフィードバックを抑制し、ALA及びPBGの産生を減少する。通常、患者の反応が良好であるが、効き目が遅く、通常、尿ALAとPBG濃度を正常にするのに2～4日間又はより長い時間がかかる。静脈注射されたヘミンが素早く代謝されるから、通常、急性発作を効果的に治療又は予防するには3～4回の注射が必要である。さらに、繰り返した注射により鉄の過負荷や静脈炎を引き起こす恐れがある。現在、治癒できる唯一な治療法は肝臓移植であるが、肝臓移植には顕著な合併症や死亡率が伴い、また肝臓ドナーが限られる。
現在の治療方法の欠陥に鑑み、より効果的で、作用時間がより長く、より効き目が早く、安全的な代替治療方法が求められる。
本発明は、小分子活性化RNAを用いて体内のHMBS遺伝子の発現レベルを特異的に活性化させることで、細胞による内因性ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ヒドロキシメチルビランシンターゼともいう）の産生を長期的に促進して、上記内因性ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ヒドロキシメチルビランシンターゼともいう）が細胞内での正常なレベルを回復させることにより、AIPを効果的に治療する方法を提供する。
上記問題を解決するために、本発明はRNA活性化プロセスに基づく小分子活性化核酸分子（saRNA）を提供し、HMBS遺伝子転写を活性化/アップレギュレーションすることで、HMBSタンパク質の発現量を向上させることによりHMBS発現不足又は活性低下に起因する疾患、例えば急性間欠性ポルフィリン症を治療する。
本発明の一態様では、細胞中のHMBS遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションする小分子活性化核酸分子を提供し、前記小分子活性化核酸分子の1本の鎖はHMBS遺伝子プロモーター領域の長さ16～35個ヌクレオチドの核酸配列とは少なくとも75%の相同性又は相補性を有し、前記遺伝子発現の活性化又はアップレギュレーションを実現することである。プロモーター領域とは、HMBS遺伝子の転写開始部位の上流の400個のヌクレオチド配列を含むことである。具体的には、本発明の小分子活性化核酸分子の1本の鎖は、HMBS遺伝子プロモーター領域中の任意の連続した16～35個のヌクレオチドと少なくとも75%以上の相同性又は相補性を有するヌクレオチド配列を含み、ここでプロモーター領域とは、HMBS遺伝子の転写開始部位の上流の400個のヌクレオチドを含むものを意味する。特定の一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子の1本の鎖はHMBS遺伝子プロモーターの上流-395bp～-351bpの領域（領域1）（tagcctgggcaacatagtgaggccacctccccgctgtctctataa、SEQ ID NO：1）と-179bp～-1bpの領域（領域2）（tgctgcctatttcaaggttgtagcaaagctaagtttgaacagagcaaaggaagcgccatagaagctgcactacttgctcatgtcacagctggggaatggggtggtcgaatggggaggtccactgtcgcaatgttccaattcccgcccagagggagggacctccccttcgagggagggcg, SEQ ID NO：2）中の連続した16～35個のヌクレオチドと少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は100%の相同性又は相補性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はこれらから選ばれる。より具体的には、一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子の1本の鎖は、SEQ ID NO：1とSEQ ID NO：2から選ばれるいずれか1つの連続した16～35個のヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約99%の相同性又は相補性を有する。特定の一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子の1本の鎖は、SEQ ID NO：1とSEQ ID NO：2から選ばれるいずれか1つの連続した16～35個のヌクレオチド配列とは少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の相同性又は相補性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はこれらから選ばれる。別の一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子の1本の鎖は、SEQ ID NO：1とSEQ ID NO：2から選ばれるいずれか1つの連続した16～35個のヌクレオチド配列とは少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の相同性又は相補性を有するヌクレオチド配列からなる。
本発明では、本発明の小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター領域に標的化する二本鎖小分子活性化核酸分子を含み、第1核酸鎖と第2核酸鎖を含み、第1核酸鎖はHMBS遺伝子プロモーター中のSEQ ID No.1又は SEQ ID No.2中のいずれか1つの連続した16～35個のヌクレオチドと少なくとも75%の相同性又は相補性を有し、第2核酸鎖は第1核酸鎖と少なくとも75%の相補性を有し、第1核酸鎖と第2核酸鎖は、相補することで、HMBS遺伝子の細胞での発現を活性化させる二本鎖核酸構造を形成することができる。
本発明の小分子活性化核酸分子のセンス核酸鎖とアンチセンス核酸鎖は2本の異なる核酸鎖上に存在してもよく、同一の核酸鎖上に存在してもよい。センス核酸鎖とアンチセンス核酸鎖がそれぞれ2本の鎖上にある場合、小分子活性化核酸分子の少なくとも1本の鎖は、5'末端と3'末端のいずれか1つの末端に突出又はオーバーハングを有してもよく、例えば3'末端には0～6個ヌクレオチド長の突出を有する。好ましくは、本発明の小分子活性化核酸分子の2本の鎖は全て突出を有し、より好ましくは、小分子活性化核酸分子の2本の鎖の3'末端のいずれにも0～6個ヌクレオチドの突出を有し、最も好ましくは、3'末端に2又は3個ヌクレオチドの突出を有する。好ましくは、突出したヌクレオチドは、dT又はUであってもよいし、天然ヌクレオチド突出であってもよい。本発明では、前記天然ヌクレオチド突出とは、センス核酸断片又はアンチセンス核酸断片の末端から突出したヌクレオチドが対応するターゲット配列のヌクレオチドと相同又は相補であることを意味する。
小分子活性化核酸分子は、二本鎖領域のヘアピン構造を形成可能な一本鎖RNA分子を含んでもよい。一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター領域に標的化する一本鎖小分子活性化RNA分子であり、前記一本鎖小分子活性化核酸分子は二本鎖領域ヘアピン構造を形成することができる。センス核酸鎖とアンチセンス核酸鎖が同一の核酸鎖上に存在する場合、好ましくは、小分子活性化核酸分子は、ヘアピン型一本鎖核酸分子であってもよく、センス核酸断片とアンチセンス核酸断片との相補領域は、例えばRNA活性化メカニズムを通じてHMBS遺伝子の細胞での発現を促進し得る二本鎖核酸構造を形成する。
前記小分子活性化核酸分子では、センス核酸断片及びアンチセンス核酸断片の長さは、16～35個、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35個のヌクレオチドであってもよい。
一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子のセンス鎖は、SEQ ID NO：30～48から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有し、且つ、そのアンチセンス鎖はSEQ ID NO：49～67から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有する。一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子のセンス鎖は、SEQ ID NO：30～48から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有する配列を含むか、又はこれらから選ばれ、且つ、そのアンチセンス鎖は、SEQ ID NO：49～67から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有する配列を含むか、又はこれらから選ばれる。一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子のセンス鎖は、SEQ ID NO：30～48から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有する配列からなり、且つ、そのアンチセンス鎖は、SEQ ID NO：49～67から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも75%、例えば少なくとも約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%の同一性又は相同性を有する配列からなる。特定実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子のセンス鎖は、SEQ ID NO：30～48から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列に示される配列であってもよく、且つ、そのアンチセンス鎖は、SEQ ID NO：49～67から選ばれるいずれか1つのヌクレオチド配列に示される配列であってもよい。
一実施形態では、本明細書に記載の小分子活性化核酸分子は、合成するもの、インビトロで転写したもの又はベクターで発現させたものであってもよい。
本明細書に記載の小分子活性化核酸分子における全てのヌクレオチドは、化学修飾を行われていない天然のヌクレオチドであってもよく、少なくとも1種の修飾を含んでもよい。一実施形態では、本明細書の前記小分子活性化核酸分子中の修飾は、化学修飾であってもよく、例えば、少なくとも一個のヌクレオチド上に化学修飾がある。本発明で使用される化学修飾は、下記修飾のうちの1種又は複数種又はこれらの任意の組み合わせを含むか、又はこれらから選ばれる。
（1）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドのホスホジエステル結合に対する修飾、
（2）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるリボースの2'-OHに対する修飾、
（3）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における塩基に対する修飾、
（4）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも1個のヌクレオチドは鎖核酸である。
前記化学修飾は、当業者に公知されるものであり。前記ホスホジエステル結合修飾とは、ホスホジエステル結合における酸素に対する修飾であり、ホスホロチオエート修飾及びボラノホスフェート修飾を含むが、これだけではないというものである。2種の修飾はともに小分子活性化核酸分子の構造を安定化させ、塩基ペアリングの高特異性及び高親和力を保持できる。
リボース修飾とは、ヌクレオチドペントースにおける2'-OHに対する修飾であり、即ち、リボースのヒドロキシ位置にいくつかの置換基が導入され、例えば、2'-フルオロ修飾、2'-オキシメチル修飾、2'-オキシエチレンメトキシ修飾、2,4'-ジニトロフェノール修飾、ロック核酸（LNA）、2'-アミノ修飾、2'-デオキシ修飾などを含むが、これだけではないというものである。
塩基修飾とは、ヌクレオチドの塩基に対する修飾であり、例えば、5′-ブロモウラシル修飾、5′-ヨードウラシル修飾、N-メチルウラシル修飾、2,6-ジアミノプリン修飾などを含むが、これだけではないというものである。
これらの修飾は、小分子活性化核酸分子のバイオアベイラビリティを向上し、標的配列との親和性を高め、細胞内のヌクレアーゼ加水分解に対する耐性を向上させる。
また、小分子活性化核酸分子の細胞への進入を促進するために、上記の修飾に加えて、小分子活性化核酸分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に、脂質二重層からなる細胞膜及び核膜を介して細胞核内の遺伝子のプロモーター領域と作用するようにコレステロールなどの脂肪親和性の基を導入することができる。
本発明に係る小分子活性化核酸分子は、細胞と接触すると、細胞中のHMBS遺伝子の発現を効果的に活性化又はアップレギュレーションし、好ましくは、少なくとも発現を10%アップレギュレーションことができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸に関する。一実施形態では、前記核酸はDNA分子であってもよい。
本発明の別の態様では、以上に記載の小分子活性化核酸分子又は本明細書に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞を提供する。一実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター領域に標的化する二本鎖小分子活性化核酸分子であってもよく、センス鎖とアンチセンス鎖を含む。別の実施形態では、本発明の小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター領域に標的化する一本鎖小分子活性化核酸分子であってもよい。
本発明の別の態様では、以上に記載の小分子活性化核酸分子又は本明細書に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸を含むキットを提供する。
本発明の別の態様は、前記の小分子活性化核酸分子、本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸の、細胞にHMBS遺伝子発現を活性化/アップレギュレーションするための医薬品の製造における使用に関する。
本発明の別の態様は、前記の小分子活性化核酸分子、本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸、本発明の細胞の、対象のHMBS発現不足又は活性低下に起因する疾患を治療する医薬品の製造における使用に関する。一実施形態では、HMBS発現不足又は活性低下に起因する疾患は、遺伝性ポルフィリン症を含んでもよい。遺伝性ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症を含んでもよい。
本発明の別の態様は、前記の小分子活性化核酸分子、本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸、本発明の細胞の、対象の急性間欠性ポルフィリン症を治療する医薬品の製造における使用に関する。
本発明の別の態様は、また、前記小分子活性化核酸分子、本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸又は本発明の前記細胞を対象に投与することを含む対象のHMBS発現不足又は活性低下に起因する疾患の治療方法に関する。
本発明の別の態様は、また、前記小分子活性化核酸分子、本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は本発明の前記細胞を対象に投与することを含む対象の急性間欠性ポルフィリン症の治療方法に関する。
本発明は、また、前記小分子活性化核酸分子又は本明細書の前記小分子活性化核酸分子をコードする核酸を前記細胞に投与することを含む、細胞にHMBS遺伝子の発現を活性化/アップレギュレーションする方法に関する。
本発明の小分子活性化核酸分子は細胞に直接導入されてもよく、本発明の小分子活性化核酸分子をコードする核酸配列を細胞に導入することで細胞内で産生してもよく、前記細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。上記細胞は、細胞系や細胞株などのような単離体であってもよいし、又は人体などの哺乳動物体から分離してもよい。該人体は、HMBSタンパク質発現の減少により引き起こされる症状に罹患している患者であってもよい。本明細書の前記小分子活性化核酸分子は、HMBSタンパク質発現の減少により引き起こされる症状を治療するのに十分な量で投薬できる。具体的には、前記のHMBSタンパク質の量の欠乏により引き起こされる症状は、急性間欠性ポルフィリン症を含むか、又はこれから選ばれる。
本発明の他側面によれば、HMBS遺伝子のプロモーター領域における任意の連続した16～35個のヌクレオチド配列を有し、好ましくは、SEQ ID NO：1～2から選択されるいずれか1つの配列における任意の連続した16～35個のヌクレオチド配列である、単離したHMBS遺伝子の小分子活性化核酸分子の作用部位を提供する。具体的には、前記作用部位は、SEQ ID NO：11～29から選択されるいずれか1つのヌクレオチド配列で示されている。
本発明によるHMBS遺伝子発現を活性化/アップレギュレーション可能な小分子活性化核酸分子は、HMBS遺伝子を長期間活性化させることができ、このため、HMBS遺伝子とタンパク質の発現及び酵素の活性を効率よく特異的にアップレギュレーション又は回復させ、また、毒性や副作用が低く、細胞中のHMBS遺伝子とタンパク質の発現を活性化/アップレギュレーションする医薬品又は製剤の製造に用いられる。
HMBS遺伝子プロモーターの模式図である。図には、領域1と領域2は小分子核酸分子の設計に使用される標的配列領域である。TSSは転写開始部位である。
小分子核酸分子が介在するHMBS mRNAの表現の変化を示す図である。HMBSプロモーターの標的領域に標的化する180個の小分子核酸分子をそれぞれヒト肝細胞癌Huh7細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション濃度を10nMとし、72時間後、細胞を収集してワンステップRT-PCRによりHMBS mRNA発現を分析する。図には、対照処理（mock）に対するHMBS発現変化が降順で示されている。
小分子核酸分子が介在するHMBS mRNAの表現の変化を示す図である。HMBSプロモーターに標的化する180個の小分子核酸分子をそれぞれHuh7細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション濃度を10nMとし、72時間後、細胞を収集してワンステップRT-PCRによりHMBS mRNA発現を分析する。図には、対照処理（mock）に対する各小分子核酸分子誘導HMBS発現の変化の倍数が示されている。小分子核酸分子は、HMBS遺伝子プロモーター上の位置に従って最も上流からTSSまで並べ替えている。
候補saRNA（small activating RNA）が異なる肝臓細胞でHMBS遺伝子mRNA発現を活性化させる図である。示されるsaRNA（n=13、最終濃度20nM）を用いてそれぞれヒト肝細胞癌Huh7、HepG2、及びヒト胚性肝細胞CCC-HEL-1をトランスフェクションする。72時間後に細胞を収集してQiagen RNeasyキットでRNAを抽出し、逆転写後に7500FASTリアルタイムPCRシステムでHMBSに対してqPCR増幅を行い、同時にHPRT1及びTBP遺伝子を増幅して内部標準とする。Mock、dsCon2（センス鎖5'-ACUACUGAGUGACAGUAGATT-3'（SEQ ID NO：68）、アンチセンス鎖5'-UCUACUGUCACUCAGUAGUTT-3'（SEQ ID NO：69）、及びsiHMBS（センス鎖：5'- CCUGUUUACCAAGGAGCUUTT-3'（SEQ ID No：3）、アンチセンス鎖：5'- AAGCUCCUUGGUAAACAGGTT-3'（SEQ ID No：4））はそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA（siRNA）対照トランスフェクションである。
候補saRNAが肝臓細胞にてHMBSタンパク質発現を活性化させる図である。示されるsaRNA（最終濃度20nM）でヒト肝細胞癌HepG2細胞をトランスフェクションする。72時間後に細胞を収集してウエスタンブロット分析を行い、抗ヒトHMBS抗体を用いてHMBSタンパク質発現量を検出し、それと同時に、チューブリン（Tubulin）を検出してタンパク質注入量の正確性のコントロールとする。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。（A）ウエスタンブロット膜の走査図。（B）ImageJソフトウェアを用いてA図のバンドに対して定量的分析を行い、各処理のHMBSバンド強度とMock処理とを比較した相対値を得る。
ALA変換分析により得られた単位（mg）タンパク質のPPIX蛍光強度である。示されるsaRNAを用いてヒト胚性肝細胞CCC-HEL-1をトランスフェクションし、48時間後、細胞にALA基質を加え、添加前（0h）と添加後24時間（24h）に細胞を収集してPPIXの蛍光強度を分析し、また細胞を分解してタンパク質濃度を測定する。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。Y軸は単位（mg）タンパク質のPPIX蛍光強度である。
候補saRNAがLi-7細胞にてHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現を活性化させ、ALA変換分析により得られた単位（mg）タンパク質のPPIX蛍光強度である。（A）は、示されるsaRNAを用いて示される濃度でヒト肝癌細胞Li-7をトランスフェクションし、72時間後、細胞を収集してQiagen RNeasyキットを用いてRNAを抽出し、逆転写後、7500FASTリアルタイムPCRシステムを用いてHMBS遺伝子にqPCR増幅を行い、それと同時に、HPRT1遺伝子を増幅して内部標準とする。（B）上記図は、示されるsaRNAを用いて示される濃度でヒト肝癌細胞Li-7をトランスフェクションし、72時間後、細胞を収集してウエスタンブロット分析を行い、抗ヒトHMBS抗体を用いてHMBSタンパク質発現量を検出し、それと同時に、チューブリン（Tubulin）を検出してタンパク質注入量の正確性のコントロールとする。下記図はImageJソフトウェアを用いてA図のバンドを定量的に分析し、各処理のHMBSバンド強度とMock処理を比較した相対値である。M：Mock処理、C：dsCon2処理。（C）は、示されるsaRNAを用いて示される濃度でヒト肝癌細胞Li-7をトランスフェクションし、24時間後、細胞にALA基質を加え、添加後48時間（48h）に細胞を収集してPPIXの蛍光強度を分析し、それと同時に、細胞を分解してタンパク質濃度を測定する。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。
候補saRNAが急性間欠性ポルフィリン症（AIP）患者の細胞GM01623細胞にHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現を活性化させる。（A）は、示されるsaRNAを用いてGM01623細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してQiagen RNeasyキットを用いてRNAを抽出し、逆転写後、7500FASTリアルタイムPCRシステムを用いてHMBS遺伝子に対してqPCR増幅を行い、それと同時に、HPRT1とTBP遺伝子を増幅して内部標準とする。（B）は、示されるsaRNAを用いてGM01623細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してウエスタンブロット分析を行い、抗ヒトHMBS抗体を用いてHMBSタンパク質発現量を検出し、それと同時に、チューブリン（Tubulin）を検出してタンパク質注入量の正確性のコントロールとする。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。
候補saRNAが、急性間欠性ポルフィリン症（AIP）患者の細胞GM01624細胞にてHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現を活性化させる図である。（A）は、示されるsaRNAを用いてGM01624細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してQiagen RNeasyキットを用いてRNAを抽出し、逆転写後、7500FASTリアルタイムPCRシステムを用いてHMBS遺伝子に対してqPCR増幅を行い、それと同時に、HPRT1とTBP遺伝子を増幅して内部標準とする。（B）は、示されるsaRNAを用いてGM01624細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してウエスタンブロット分析を行い、抗ヒトHMBS抗体を用いてHMBSタンパク質発現量を検出し、それと同時に、チューブリン（Tubulin）を検出してタンパク質注入量の正確性のコントロールとする。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。
候補saRNAが、急性間欠性ポルフィリン症（AIP）患者の細胞GM01625細胞にてHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現を活性化させる図である。（A）は、示されるsaRNAを用いてGM01625細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してQiagen RNeasyキットを用いてRNAを抽出し、逆転写後、7500FASTリアルタイムPCRシステムを用いてHMBS遺伝子に対してqPCR増幅を行い、それと同時に、HPRT1とTBP遺伝子を増幅して内部標準とする。（B）は、示されるsaRNAを用いてGM01625細胞をトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、72時間後、細胞を収集してウエスタンブロット分析を行い、抗ヒトHMBS抗体を用いてHMBSタンパク質発現量を検出し、それと同時に、チューブリン（Tubulin）を検出してタンパク質注入量の正確性のコントロールとする。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。
本発明では、関連用語は、以下のように定義される。
本明細書で使用される「相補」という用語は、2本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド同士が水素結合により形成されるものである。相補オリゴヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック（Watson-Crick）方式で塩基ペアリング（例えば、A-T、A-U、C-G）を行うか、又は二本鎖体を形成させ得る任意のほかの方式（例えばHoogsteen型又は逆Hoogsteen型塩基ペアリング）で塩基ペアリングを行うことができる。
相補は、完全相補及び不完全相補の2種類を含む。完全相補又は100%相補は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域における第1オリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドが第2オリゴヌクレオチド鎖の対応する位置のヌクレオチドと「ミスマッチ」無しに水素結合を形成できることを意味する。不完全相補とは、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合することができないことを意味する。例えば、二本鎖領域の長さが20個ヌクレオチドである2本のオリゴヌクレオチド鎖に対しては、各鎖における2つの塩基対のみが互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は10%の相補性を有する。同じ実施例では、各鎖における18個の塩基対が互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は90%の相補性を有する。実質的な相補とは、少なくとも約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、又は約100%相補することを意味する。
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」、又は「小分子核酸分子」とは、ヌクレオチドの重合体を意味し、DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子を含むが、これらに制定されず、規則的・非規則的に交互するデオキシリボシル部分とリボシル部分のオリゴヌクレオチド鎖、並びにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾、天然に存在する、又は天然に存在しない骨格を含む。本発明に記載の標的遺伝子転写を活性化させるためのオリゴヌクレオチドは、小分子活性化核酸分子である。
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド鎖」と「オリゴヌクレオチド配列」は交換可能に使用することができ、35個以下の塩基を有する短鎖ヌクレオチドの総称（デオキシリボ核酸DNA又はリボ核酸RNA内のヌクレオチドを含む）である。本発明では、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、16～35個ヌクレオチドの任意の長さであってもよい。
本明細書で示される用語「第1核酸鎖」はセンス鎖であってもよいし、アンチセンス鎖であってもよい。小分子活性化RNAのセンス鎖とは、小分子活性化RNA二本鎖体に標的遺伝子のプロモーターDNA配列のコード鎖とは同一性を有する核酸鎖を含むことをいい、アンチセンス鎖とは、小分子活性化RNA二本鎖体においてセンス鎖と相補する核酸鎖をいう。
本明細書で示される用語「第2核酸鎖」はセンス鎖又はアンチセンス鎖であってもよい。第1オリゴヌクレオチド鎖がセンス鎖である場合、第2オリゴヌクレオチド鎖はアンチセンス鎖である。一方、第１オリゴヌクレオチド鎖がアンチセンス鎖である場合、第2オリゴヌクレオチド鎖はセンス鎖である。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、1本のポリペプチド鎖のコード又は1本の機能RNAの転写に必要な全てのヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、宿主細胞に対して内因性、あるいは完全又は部分的に組換えられた遺伝子であってもよい（例えば、コードプロモーターを導入した外因性オリゴヌクレオチド及びコード配列、又は内因性コード配列に隣接する異種プロモーターを宿主細胞に導入したもの）。例えば、「遺伝子」は、エクソン及びイントロンで構成される核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンとの間のオープンリーディングフレームにおけるエクソンに含まれる配列であり、本発明では、「遺伝子」は、他の遺伝子がコード配列又は非コード配列を含むか否かを問わず、例えばプロモーター、エンハンサーなどのような遺伝子制御配列及び本分野で知られている他の遺伝子の転写、発現又は活性を制御する他の全ての配列を含むことができる。1つの場合、例えば、「遺伝子」は、例えばプロモーターやエンハンサーなどの制御配列を含む機能性核酸の説明に用いることができる。組換え遺伝子の発現は、一種又は多種の異種制御配列により制御することができる。
本明細書で用いられる「標的遺伝子」は、生体内に天然に存在する核酸配列、組換え遺伝子、ウイルス又は細菌配列、染色体又は染色体外及び/又は細胞及び/又はその染色質に一時的又は安定的にトランスフェクション又は混入したものである。標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってもよいし、非タンパク質コード遺伝子であってもよい（例えば、マイクロRNA遺伝子、長鎖非コードRNA遺伝子）。標的遺伝子は、通常、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも言われる）を有する小分子活性化核酸分子を設計することにより、標的遺伝子に対する正調節を実現することができ、標的遺伝子の発現のアップレギュレーションとして表現される。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を意味し、本発明において「標的遺伝子プロモーター配列と相補する」における標的遺伝子プロモーター配列とは、当該配列のコード鎖（非鋳型鎖とも言われる）、すなわち、当該遺伝子コード配列と同一の核酸配列である。「標的配列」は、標的遺伝子プロモーター配列のうちの小分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同又は相補的な配列断片を意味する。
本明細書で使用される用語「センス鎖」、「センスオリゴヌクレオチド鎖」は交換可能に使用され、小分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖とは、小分子活性化核酸分子の二本鎖体に標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖と同一性を有する第1核酸鎖が含まれることを意味する。
本明細書で使用される用語「アンチセンス鎖」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、小分子活性化核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖とは、小分子活性化核酸分子の二本鎖体においてセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補する第2核酸鎖を指す。
本明細書で使用される「コード鎖」は、標的遺伝子における転写が不可能な1本のDNA鎖を指し、該鎖のヌクレオチド配列は、転写により生成されたRNAの配列と一致する（RNAではUでDNAにおけるTを置換した）。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列のコード鎖は、標的遺伝子DNAコード鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「鋳型鎖」とは、標的遺伝子の二本鎖DNAのうちコード鎖に相補的な他本の鎖であって、鋳型としてRNAに転写可能な鎖を意味し、当該鎖は、転写したRNA塩基と相補的なものである（A-U、G-C）。転写過程において、RNAポリメラーゼは、鋳型鎖に結合し、鋳型鎖の3'→5'方向に沿って移動し、5'→3'方向に従ってRNAの合成を触媒する。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列の鋳型鎖は、標的遺伝子DNA鋳型鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「プロモーター」とは、タンパク質コード又はRNAコード核酸配列と位置的に関連付けることによりそれらの転写に対して調節作用を果たす配列である。通常、真核遺伝子プロモーターは、100～5,000個の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」を限定する趣旨ではない。プロモーター配列は、一般的にタンパク質コード又はRNAコード配列の5'末端に位置するが、エクソン及びイントロン配列にも存在する。
本明細書で使用される「転写開始部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖に転写開始を標識するためのヌクレオチドを意味する。転写開始部位は、プロモーター領域の鋳型鎖に出現することができる。1つの遺伝子は、1つ以上の転写開始部位を有することができる。
本明細書で使用される「同一性」又は「相同性」という用語は、小分子活性化RNAのうちの1本のオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖）が標的遺伝子のプロモーター配列のある領域のコード鎖又は鋳型鎖と類似性を有することを意味する。本明細書では、前記「同一性」又は「相同性」は、少なくとも約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%又は約100%であってもよい。
本明細書で使用される用語「突出」、「overhang」、「オーバーハング」は交換可能に使用され、オリゴヌクレオチド鎖の末端（5'又は3'）の非塩基対ヌクレオチドを意味し、二本鎖オリゴヌクレオチド内の一方の鎖から延出する他方の鎖から産生するものである。二本鎖体の3'及び/又は5'末端からはみ出した一本鎖領域は、「突出」と称される。
本明細書で使用される用語「遺伝子活性化」又は「活性化遺伝子」又は「遺伝子のアップレギュレーション」又は「アップレギュレーションされた遺伝子」は交換可能に使用され、遺伝子の転写レベル、mRNAレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、染色質状態又は立体配置、翻訳レベル、又は細胞又は生物系でのこの活性又は状態を測定することで、ある核酸の転写、翻訳、発現又は活性の増加を測定することを意味する。これらの活動又は状態は、直接的又は間接的に測定することができる。また、「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」、「遺伝子のアップレギュレーション」、「アップレギュレーションされた遺伝子」は、このような活性化のメカニズムによらず、核酸配列に相関する活性が増加したことを意味し、例えば、調節配列として調節作用を発揮したり、RNAに転写されたり、タンパク質に翻訳されてタンパク質の発現を増加させたりする。好ましくは、本発明による小分子活性化RNA分子は、遺伝子又はタンパク質発現をアップレギュレーションするか、又は活性を少なくとも10%増加することができる。
本明細書で使用される用語「小分子活性化RNA」、「saRNA」、「小分子活性化核酸分子」は交換可能に使用され、遺伝子発現を促進できる核酸分子を指し、且つ標的遺伝子の非コード核酸配列（例えばプロモーター、エンハンサー等）とは配列相同性又は同一性を有するヌクレオチド配列を含む第1核酸断片（アンチセンス鎖；アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいう）と、第1核酸断片と相補するヌクレオチド配列を含む第2核酸断片（センス鎖;センス鎖又はセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいう）からなり、そのうち、前記第1核酸断片と第2核酸断片は二本鎖体を形成する。小分子活性化核酸分子は、合成され又はベクターで発現されるとともに二本鎖領域のヘアピン構造を形成できる一本鎖RNA分子で構成されてもよい。そのうち、第1領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、第2領域に含まれるヌクレオチド配列は、第1領域と相補的なものである。小分子活性化核酸分子の二本鎖体領域の長さは、通常は約10個～約50個の塩基対、約12個～約48個の塩基対、約14個～約46個の塩基対、約16個～約44個の塩基対、約18個～約42個の塩基対、約20個～約40個の塩基対、約22個～約38個の塩基対、約24個～約36個の塩基対、約26個～約34個の塩基対、約28個～約32個の塩基対であり、通常、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個の塩基対である。また、「saRNA」、「小分子活性化RNA」、「小分子活性化核酸分子」には、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含まれ、修飾されたヌクレオチド又はその類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。
本明細書で使用される「ホットスポット」という用語は、長さが少なくとも30 bpである遺伝子プロモーター領域を意味する。これらの領域では、機能性小分子活性化核酸分子標的の凝集が現われ、即ち、これらのホットスポット領域を標的とする小分子活性化核酸分子の少なくとも30%は、標的遺伝子mRNAの発現が1.2倍以上になるまで誘導することができる。
本明細書で使用される「合成」とは、オリゴヌクレオチドの合成方式を意味し、例えば化学合成、人体外転写、ベクター表現などのRNAを合成可能な任意の方式が含まれる。
本発明は、RNA活性化によってHMBS遺伝子の発現をアップレギュレーションし、HMBSタンパク質の発現量を増加することによりヘモグロビンの生成を促進する。本発明では、HMBS遺伝子は標的遺伝子ともいう。
本発明が提供する小分子活性化核酸分子の製造方法は、配列設計と配列合成を含む。
前記小分子活性化核酸分子配列の合成は、化学合成の方法を採用してもよく、核酸合成を専門事業とするバイオテクノロジー会社に依頼してもよい。
一般的には、化学合成の方法には、以下の4つの工程が含まれる：（1）オリゴリボヌクレオチドの合成；（2）脱保護；（3）精製分離；（4）脱塩及びアニール。
例えば、本発明の前記オリゴ核酸分子の化学合成の具体的なステップは以下のとおりである。
（1）オリゴ核酸分子の合成
自動DNA/RNA合成機（例えば、Applied Biosystems EXPEDITE8909）にて1ミクロモルRNAの合成を設置するとともに、1サイクルのカップリングタイムを10～15分間に設定する。固相連結の5'‐O‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、1回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、n回目（19≧n≧2）のサイクルでn‐1回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
（2）脱保護
オリゴ核酸分子に連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール/アンモニア水溶液（体積比1：3）を1mL入れた後に、栓をした状態で25～70℃のインキュベータに置き、2～30時間インキュベーションする。オリゴ核酸分子の固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を2回溶出して（1回1mL）ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で1～12時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（1M）を1mL入れて、室温で4～12時間静置し、更にn－ブタノールを2mL入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、saRNA一本鎖の粗産物を得た。
（3）精製分離
取得したsaRNAの粗産物を1モル/mL濃度の2mL酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフィー逆相C18カラムにて分離して、精製したオリゴ核酸分子一本鎖産物を得た。
（4）脱塩及びアニール
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で1～2mLの緩衝液（10mM Tris、pH=7.5‐8.0、50mM NaCl）に混ぜる。この溶液を95℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、オリゴ核酸分子が含む溶液を得た。
以下、具体的な実施例及び図面を参照しながら、本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例では、具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、一般的な条件、例えばSambrookら、分子クローニング：実験室ハンドバック（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）に記載の条件、又はメーカーが推薦する条件を用いる。
実施例1 HMBSプロモーターに標的化する小分子活性化核酸分子の設計及び合成
UCSCゲノムデータベース（genome.ucsc.edu）からHMBS遺伝子の転写開始部位（TSS）から上流-395bpまでの長さ395bpのセンスプロモーター配列を取得し、その一部の反復配列（-350～-180）をターゲットから排除する以外、残りの2つの配列（長さ45bpの領域1：-395～-351と長さ179bpの領域2：-179～-1）をテンプレートとして、最上流から下流へ、サイズ19bpのターゲットを選択し、領域1では合計27個のターゲット、領域2では合計161個のターゲットが得られた（図1）。その後、標的配列をフィルタリング処理し、1）GC含有量が35%～75%の間であり、2）5個又は5個以上の連続的に同一のヌクレオチドを含まなく、3）3個より多いジヌクレオチド反復配列を含まなく、4）3個より多いトリヌクレオチド反復配列を含まないことを基準として標的配列を保留する。フィルタリング後、残りの180個の標的配列は候補としてスクリーニングプロセスに移行した。これらの候補配列に基づいて、対応する二本鎖オリゴ核酸分子を化学合成する。そのうち、当該実験で使用される二本鎖オリゴ核酸分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さが共に21個のヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴ核酸分子の第1リボ核酸鎖（センス鎖）の5'領域の19個のヌクレオチドがプロモーターの標的配列と100%の同一性を有し、その3'末端がＴＴ配列を含む。第2リボ核酸鎖の5'領域の19個のヌクレオチドが第1リボ核酸鎖の配列と相補し、その3'末端がＴＴ配列を含む。前述オリゴ核酸分子の2本の鎖を同等量のモル数で混合し、アニールして、二本鎖オリゴ核酸分子を形成した。
実施例2 HMBSプロモーターに標的化するsaRNAのスクリーニング
（1）細胞培養及びトランスフェクション
ヒト肝癌細胞系Huh7、HepG2をDMEM培地（Gibco）にて培養した。ヒト胚性肝細胞CCC-HEL-1とヒト肝癌細胞Li-7を10%子牛血清（Sigma-Aldrich）と1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco）を含有するRPMI-1640培地（Gibco）で培養した。細胞を5%CO2、37℃の条件下で培養した。メーカーの指示に従って、RNAiMax（Invitrogen, Carlsbad, CA）を10nM（別に断らない限り）濃度で逆トランスフェクションの方式により二本鎖オリゴ核酸分子をトランスフェクションした。
（2）ワンステップ法RT-qPCR
トランスフェクション終了後、培地を捨てて、ウェルごとに150μlのPBSを加えて1回洗浄し、PBSを捨てて、ウェルごとに50μlの細胞分解液（分解液の成分又は由来?）を加えて、室温で5分間インキュベートした。ウェルごとに1μlの細胞分解物を取り、ワンステップTB GreenTM PrimeScripTM RT-PCRキット II （Takara,RR086A）を用いてLightCyclerR480システム（Roche）上でqPCR分析を行い、各サンプルについて3個の重複ウェルを繰り返して増幅し、PCR反応条件を以下の表1に示す。
Figure 2022530937000001
反応条件としては、段階1 逆転写反応：42℃、5分間;95℃ 10秒;段階2 PCR反応：95℃ 5秒、60℃ 20 秒、増幅45サイクル。HPRT1及びTBPを内部標準遺伝子とする。HMBS、HPRT1及びTBP用のPCRプライマーは、以下の表1に示す。そのうち、HMBSは、HMBS F1/R1プライマー対で増幅される。
Figure 2022530937000002
あるsaRNAトランスフェクションサンプルのHMBS（目標遺伝子）の、対照処理（Mock）に対する発現値（Erel）を計算するために、式1に目標遺伝子及び2個の内部参照遺伝子のCt値を代入して計算した。
Figure 2022530937000003
そのうち、CtTmは、Mock試料に由来する目的遺伝子のCt値、CtTsは、saRNA処理試料に由来する目的遺伝子のCｔ値、CtR1mは、Mock処理試料に由来する内部参照遺伝子1のCt値、CtR1sは、saRNA処理試料に由来する内部参照遺伝子1のCt値、CtR2mは、Mock処理試料に由来する内部標準遺伝子2のCt値、CtR2sは、saRNA処理試料に由来する内部参照遺伝子2のCt値である。
（3）機能性saRNAのスクリーニング
活性化HMBSで転写させたsaRNAを得るために、上記180個の二本鎖オリゴ核酸分子を用いて10nMのトランスフェクション濃度でそれぞれHuh7細胞をトランスフェクションし、72時間後、前記と同様な方法により、細胞を溶解し、ワンステップRT-qPCRにより分析し、各saRNA処理サンプルのHMBS遺伝子の相対（Mockと比較して）発現値を得た。結果から明らかなように、19個のsaRNAには活性の活性化が認められた。これらの活性を活性化された二本鎖オリゴ核酸分子は活性化性saRNAと呼ばれる。
図2と図3は、さらに、HMBS saRNAの活性分布、及びsaRNAが仲介したHMBS mRNA発現の変化を示している。
Figure 2022530937000004
Figure 2022530937000005
実施例3 saRNAによるさまざまな細胞系におけるHMBS遺伝子発現の促進
表4に示すsaRNA（n=13,、最終濃度20nM）を用いて、実施例2に記載の方法によりそれぞれヒト肝細胞癌Huh7、HepG2、及びヒト胚性肝細胞CCC-HEL-1をトランスフェクションし、72時間トランスフェクション後、細胞を収集してQiagen RNeasyキットを用いてRNAを抽出し、逆転写後、7500FASTリアルタイムPCRシステムを用いてHMBS遺伝子に対してqPCR増幅を行い、それと同時に、HPRT1とTBP遺伝子を増幅して内部標準とした。Mock、dsCon2及びsiHMBSはそれぞれブランクトランスフェクション、無関係な配列の二本鎖RNAトランスフェクション及び低分子干渉RNA対照トランスフェクションである。実施例2に記載の方法によってPCR結果を分析し、図4に示す結果から、候補saRNAは、さまざまな細胞系においてHMBS遺伝子のmRNA発現レベルを促進できた。
実施例4 saRNAによるHMBSタンパク質発現の促進
図5に示すsaRNA（最終濃度20nM）を用いて、ヒト肝細胞癌HepG2を逆トランスフェクションし、72時間後、細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤を含有する適量の細胞分解液（1×RIPA緩衝液, Cell Signaling Technology）で分解した。BCA法によりタンパク質を定量化し、次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を行い、0.45μmのPVDF膜に移した。使用される一次抗体は、ウサギモノクローナル抗HMBS （Abcam,ab129092）であり、α/β-チューブリン抗体（Cell Signaling Technology, 2148s）はインプリントを検出し、二次抗体は、抗ウサギIgG、HRP-連結抗体（Cell Signaling Technology）を用いた。Image Lab（BIO-RAD, Chemistry Doctm MP Imaging System）を用いて検出信号を走査した。図5に示すように、候補saRNAは、HepG2細胞中のHMBSタンパク質発現量を約2倍増加し、一部のタンパク質発現量は2.5倍に向上された。活性化性saRNAは、肝臓細胞中のHMBSタンパク質発現に対する活性化効果が顕著であった。
実施例5 saRNAによるHMBS酵素活性の促進
AIPはヘモグロビン合成経路における3番目のヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）欠陥又は活性不足に起因するδ-アミノレブリン酸（ALA）とPBG（ポルフォビリノーゲン）の体内の蓄積によりヘモグロビン合成が不足して引き起こす疾患である。ALAは、簡単な内因性5炭素化学物質であり、ヘモグロビンの体内生合成に関与する。ヘモグロビンの前駆物としてのALAは、ALAデヒドラターゼなどの一連の酵素の作用により、高感光性のプロトポルフィリンIX（Proto-porphyrin IX、略語PPIX）をミトコンドリア内で生成し、PPIXがFeイオンと結合してヘモグロビンが生成され、ヘモグロビン生合成の最後のステップの中間体である。正常な場合は、ヘモグロビン生合成経路は、生体の負のフィードバックにより調整され、つまり、ALAの合成は細胞内のヘモグロビン含有量により調整され、このため、体内には過量のALAが蓄積することはない。細胞に外因性ALAを加える場合、細胞のヘモグロビン合成経路はALAをPPIXに転化することができる。PPIXの含有量は蛍光方法によって検出できる。したがって、PPIXの蛍光強度を検出することによって、HMBSの活性の強さ及びヘモグロビンの生合成量を間接的に反映できる（Sassaら, J Exp Med 1975;142：722-731, Divarisら, Am J Pathol 1990;136：891-897, Kennedyら, J Photochem Photobiol 1992;14：275？292）。このような検出方法は、ALA変換分析と呼ばれる。
6ウェルプレートにヒト胚性肝細胞CCC-HEL-1（2×105細胞/ウェル）を接種して、RNAiMax （Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、メーカーの取扱書に記載の逆トランスフェクション法により図6に示すsaRNAを細胞にトランスフェクションし、最終濃度を20nMとし、トランスフェクション48時間後、1mMのALAを用いて細胞を0時間（ベースライン）と24時間処理した。トランスフェクションして3日後、細胞を1.5mlの遠心分離管に収集し、サンプルの一部を取り出し、300μl 1N 1：1 MeOH-PCAを用いて氷上にて細胞を10分間分解し、10000g 4(Cで10分間遠心分離後、100μlの上清を黒色96ウェルプレートに加え、多機能マイクロプレートリーダー（TECAN Infintie M200PRO）を用いて、400nM励起光と660nM放射光で蛍光強度を検出した。サンプルの別の一部について1×RIPA分解液（Cell Signaling Technology）を用いて細胞を分解した後、BCA法によりタンパク質濃度を検出した。最後に、蛍光強度/タンパク質濃度を用いてデータに対して正規化処理を行った。
図6に示すように、Mock及びdsCon2対照群に比べて、活性化性saRNAをトランスフェクションした細胞では、単位タンパク質濃度に対応する蛍光強度は明らかに増加し、このことから、saRNAによるHMBS遺伝子の活性化がHMBS酵素の活性を向上させ、最終的にヘモグロビンの合成を促進したことを示した。
実施例6 HMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現に対するsaRNAの用量依存的促進、及びHMBS酵素活性に対するsaRNAの用量依存的増加
細胞を実施例2のように培養し、ヒト肝癌細胞（Li-7）を2×105細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種し、RNAiMax （Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてメーカーの取扱書に記載の逆トランスフェクション法により図7に示すsaRNA（RAG5-386）を細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの最終濃度をそれぞれ1、10、20、50、及び100nMとし、3群の同じsaRNA（RAG5-386）をトランスフェクションして、それぞれ異なる実験に用いた。これらのうち、1群の細胞を24時間トランスフェクションした後、1mMのALAを加えて細胞を48時間処理した後、細胞を収集してPPIXの蛍光強度を分析し、それと同時に細胞を分解してタンパク質濃度を測定した。残りの2群の細胞をトランスフェクションして72時間培養後、細胞を収集して、それぞれHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質の発現に用いた。細胞mRNA抽出及びタンパク質分解の定量的方法は、実施例3及び実施例4のとおりである。
図7に示すように、saRNA（RAG5-386）用量の増加に伴い、程度が異なるが、HMBS遺伝子のmRNA及びタンパク質の発現はいずれも増加した。（A）はsaRNA（RAG5-386）処理後のmRNAの発現であり、対照処理に比べて、siHMBS群のmRNA発現は90%以上低下し、このことから、実験におけるトランスフェクションシステムの有効性を示し、saRNA（RAG5-386）群は2倍程度の活性化効果を有し、特に20nMのsaRNA（RAG5-386）処理ではピークに達した。（B）はsaRNA （RAG5-386）処理後のタンパク質の発現量であり、対照処理に比べて、HMBSタンパク質の発現量は、saRNA（RAG5-386）用量の増加に伴いアップレギュレーションされ、いずれも1.5倍以上の活性化効果があり、明らかな用量依存的発現を示した。（C）は、saRNA（RAG5-386）処理後のPPIX蛍光強度の変化であり、saRNA（RAG5-386）群は、程度が異なるが、いずれもの増加を示した。上記結果から明らかなように、saRNA（RAG5-386）は、HMBS遺伝子活性化を促進し、HMBS酵素の活性を向上させ、最終的にヘモグロビンの合成を促進した。
実施例7 saRNAによるHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01623での発現の促進
GM01623、GM01624、及びGM01625細胞（Coriell Instituteから購入、Camden, NJ, USA）をMEM培地（Gibco）で培養し、全ての培地には、15%胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich）、1%NEAA（non-essential amino acids、Thermo Fisherから購入;商品番号：11140050）と1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco）を含有した。細胞を5% CO2、37℃の条件下で培養した。6ウェルプレートにGM01623細胞（1×105細胞/ウェル）を接種してRNAiMaxを用いてトランスフェクションし、トランスフェクションの最終濃度を20nMとし、トランスフェクション72時間後、細胞を収集した。細胞mRNA抽出及びタンパク質分解の定量的方法は、実施例3及び実施例4のとおりである。
図8に示すように、候補saRNAは、HMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01623での発現を促進した。（A）は、候補saRNA処理後のmRNAの発現であり、対照処理に比べて、siHMBSは90%以上ノックダウンされ、低分子干渉RNAとして顕著な効果を示し、このことから、実験におけるトランスフェクションシステムの有効性を示した。saRNA処理後のmRNAの相対発現量が全て対照処理群よりも高く、RAG5-126、RAG5-373、RAG5-179、RAG5-386、及びRAG5-374という5群の発現値はそれぞれ56%、14%、45%、96%、及び25%増加し、これは、本発明による候補saRNAが全てHMBS遺伝子mRNAの発現を活性化できることを示した。（B）は、候補saRNA処理後のタンパク質の発現であり、対照処理に比べて、程度が異なるが、saRNA処理後RAG5-126、RAG5-373、RAG5-179及びRAG5-386群のタンパク質量が全て増加を示し、これらのうち、RAG5-126群は50%上昇し、明らかな活性化効果があり、それは、本発明による候補saRNAが全てHMBSタンパク質の発現を活性化できることを示した。
実施例8 saRNAによるHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01624での発現の促進
GM01624細胞の培養及びトランスフェクションの条件は実施例7のとおりであり、細胞のmRNA抽出及びタンパク質分解の定量的方法は実施例3及び実施例4のとおりである。図9に示すように、候補saRNAは、HMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01624での発現を促進できた。（A）は、候補saRNA処理後のmRNAの発現であり、対照処理に比べて、siHMBSは90%ノックダウンされ、低分子干渉RNAとして顕著な効果があり、これは、実験におけるトランスフェクションシステムの有効性を示した。saRNA処理後のmRNAの相対発現量が全て対照処理群よりも高く、RAG5-126、RAG5-179、及びRAG5-386の3群の発現値がそれぞれ50%以上増加し、顕著な活性化効果があり、これは、本発明による候補saRNAがHMBS遺伝子mRNAの発現を活性化できることを示した。（B）は、候補saRNA処理後のタンパク質の発現であり、対照処理に比べて、程度が異なるが、saRNA処理後のRAG5-126、RAG5-373、RAG5-179、及びRAG5-386群のタンパク質量が全て増加を示し、これは、本発明による候補saRNAが、異なる程度でHMBSタンパク質の発現を活性化できることを示した。
実施例9 saRNAによるHMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01625での発現の促進
GM01625細胞の培養及びトランスフェクションの条件は実施例7のとおりであり、細胞のmRNA抽出及びタンパク質分解の定量的方法は実施例3及び実施例4のとおりである。図10に示すように、候補saRNAは、HMBS遺伝子mRNA及びタンパク質のAIP患者の細胞GM01625での発現を促進できた。（A）は、候補saRNA処理後のmRNAの発現であり、対照処理に比べて、siHMBSはHMBS mRNA発現の90%以上ノックダウンされ、低分子干渉RNAとして顕著な効果があり、これは、実験におけるトランスフェクションシステムの有効性を示した。saRNA処理後のmRNAの相対発現量が全て対照処理群よりも高く、RAG5-126、RAG5-373、RAG5-179、RAG5-386、及びRAG5-374群の発現値が、それぞれ4%、26%、60%、123%、及び14%増加し、RAG5-386は極めて顕著な活性化効果を有し、これは、本発明による候補saRNAがHMBS遺伝子mRNAの発現を活性化でき、且つ極めて顕著な活性化効果があることを示した。（B）は、候補saRNA処理後のタンパク質の発現であり、対照処理に比べて、saRNA処理後のRAG5-126、RAG5-373、RAG5-179、及びRAG5-374群のタンパク質の発現量が全て増加し、これは、本発明による候補saRNAがHMBSタンパク質の発現を活性化できることを示した。
上記結果から分かるように、出願者は、HMBS遺伝子プロモーターに標的化するsaRNAをハイスループットスクリーニングすることにより、HMBS遺伝子発現を顕著に活性化できる複数のsaRNAを見つけた。これらのsaRNAは、HMBS遺伝子のmRNA及びタンパク質の発現をアップレギュレーションすることにより、ヘモグロビンの生成を促進した。以上の結果から、HMBS遺伝子プロモーターに標的化するsaRNAの使用がAIP治療の手段として有望であることが明示された。

Claims (33)

  1. 第1核酸鎖と第2核酸鎖を含む小分子活性化核酸分子であって、前記第1核酸鎖はHMBS遺伝子プロモーターの配列番号1又は配列番号2のいずれか1つの連続した16～35個のヌクレオチドと少なくとも75%の相同性又は相補性を有し、前記第2核酸鎖は前記第1核酸鎖と少なくとも75%の相補性を有し、前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖は、相補することで、HMBS遺伝子の細胞での発現を活性化させる二本鎖核酸構造を形成できる小分子活性化核酸分子。
  2. 前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖は2本の異なる核酸鎖上に存在する、ことを特徴とする請求項1に記載の小分子活性化核酸分子。
  3. 前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖は同一の核酸鎖上に存在し、好ましくは、前記小分子活性化核酸分子はヘアピン型一本鎖核酸分子であり、前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖の相補領域が二本鎖核酸構造を形成する、ことを特徴とする請求項1に記載の小分子活性化核酸分子。
  4. 前記小分子活性化核酸分子の少なくとも1本の鎖は3'末端に0～6個のヌクレオチドの突出を有する、ことを特徴とする請求項2に記載の小分子活性化核酸分子。
  5. 前記小分子活性化核酸分子の2本の鎖はいずれも3'末端に0～6個のヌクレオチドの突出を有し、好ましくは2～3個のヌクレオチドの突出を有する、ことを特徴とする請求項4に記載の小分子活性化核酸分子。
  6. 前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖の長さはそれぞれ16～35個ヌクレオチドである、ことを特徴とする請求項1～5のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子。
  7. 前記小分子活性化核酸分子の1本の鎖は、配列番号11～配列番号29から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも75%の相同性又は相補性を有する配列を含むか、これらからなるか、ことを特徴とする請求項1～6に記載の小分子活性化核酸分子。
  8. 前記第1核酸鎖は、配列番号30～48から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列とは少なくとも75%の相同性を有し、前記第2核酸鎖は、配列番号49～67から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列とは少なくとも75%の相同性を有する、ことを特徴とする請求項1～7に記載の小分子活性化核酸分子。
  9. 前記第1核酸鎖は、配列番号30～48のいずれかのヌクレオチド配列に示される配列を含むか、又はこれらから選ばれる、前記第2核酸鎖は、配列番号49～67のいずれかのヌクレオチド配列に示される配列を含むか、又はこれらから選ばれる、ことを特徴とする請求項1～8に記載の小分子活性化核酸分子。
  10. 前記小分子活性化核酸分子は、少なくとも1つの修飾を含み、好ましくは、前記修飾は化学修飾である、ことを特徴とする請求項1～9のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子。
  11. 前記化学修飾は、下記修飾の少なくとも1種又は複数種を含むか、又はこれらから選ばれる、ことを特徴とする請求項10に記載の小分子活性化核酸分子：
    （1）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドと繋がるホスホジエステル結合に対する修飾、
    （2）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列におけるリボースの2'-OHに対する修飾、
    （3）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における塩基に対する修飾、
    （4）前記小分子活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも1個のヌクレオチドは鎖核酸である。
  12. 前記化学修飾は、2'-フルオロ修飾、2'-オキシメチル修飾、2'-オキシエチレンメトキシ修飾、2,4'-ジニトロフェノール修飾、ロック核酸（LNA）、2'-アミノ修飾、2'-デオキシ修飾、5′-ブロモウラシル修飾、5′-ヨードウラシル修飾、N-メチルウラシル修飾、2,6-ジアミノプリン修飾、ホスホロチオエート修飾及びボラノホスフェート修飾の1種又は複数種を含むか、又はこれらから選ばれる、ことを特徴とする請求項10に記載の小分子活性化核酸分子。
  13. 請求項1～9のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子をコードする核酸。
  14. DNA分子である請求項13に記載の核酸。
  15. 請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子又は請求項13又は14に記載の核酸を含む細胞。
  16. 請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項13又は14に記載の核酸、又は請求項15に記載の細胞を含む、キット。
  17. HMBS遺伝子発現を少なくとも10%活性化/アップレギュレーションする、ことを特徴とする請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子。
  18. 請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子又は請求項13又は14に記載の核酸の、細胞にHMBS遺伝子発現を活性化/アップレギュレーションさせる製剤の製造における使用。
  19. 前記小分子活性化核酸分子は直接前記細胞に導入される、ことを特徴とする請求項18に記載の使用。
  20. 前記小分子活性化核酸分子は、請求項13又は14に記載の核酸に前記細胞を導入して細胞内で発生するものである、ことを特徴とする請求項18に記載の使用。
  21. 前記細胞は哺乳動物細胞である、ことを特徴とする請求項18～20のいずれか1項に記載の使用。
  22. 前記細胞はヒト細胞である、ことを特徴とする請求項21に記載の使用。
  23. 前記細胞は人体に存在する、ことを特徴とする請求項22に記載の使用。
  24. 配列番号1～2のいずれか1つの配列上の任意の連続した16～35個のヌクレオチド配列を含むか、又はこれらから選ばれる、単離したHMBS遺伝子小分子活性化核酸分子の標的部位。
  25. 配列番号11～29のいずれかのヌクレオチド配列に示される配列を含むか、又はこれらから選ばれる、ことを特徴とする請求項24に記載の小分子活性化核酸分子の標的部位。
  26. 細胞にHMBS遺伝子の発現を活性化/アップレギュレーションする方法であって、前記細胞に請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子又は請求項13又は14に記載の核酸を投与することを含む。
  27. 前記小分子活性化核酸分子は直接前記細胞に導入される、請求項26に記載の方法。
  28. 前記小分子活性化核酸分子は、請求項13又は14に記載の核酸に前記細胞を導入して細胞内で発生するものである、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
  29. 前記細胞は哺乳動物細胞である、ことを特徴とする請求項26～28のいずれか1項に記載の方法。
  30. 前記細胞はヒト細胞である、ことを特徴とする請求項29に記載の方法。
  31. 前記細胞は人体に存在する、ことを特徴とする請求項30に記載の方法。
  32. 前記細胞に最終濃度が1～150nMの小分子活性化核酸分子を投与する、ことを特徴とする請求項26に記載の方法。
  33. 請求項1～12のいずれか1項に記載の小分子活性化核酸分子、請求項13又は14に記載の核酸又は請求項15に記載の細胞の、対象の急性間欠性ポルフィリン症を治療する医薬品の製造における使用。
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