JP2024506882A - 化学修飾された低分子活性化ｒｎａ - Google Patents

Abstract

本願が、標的遺伝子の発現レベルを促進するための低分子活性化ＲＮＡを提供し、前記の低分子活性化ＲＮＡは、センスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖からなり、前記のセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドは、２’フルオロ、２’－メトキシ、及びヌクレオチド骨格に対するホスホロチオエート修飾を有する。【選択図】なし

Description

本願は、生物医薬品分野に関し、具体的に、化学修飾された低分子活性化ＲＮＡ、すなわち遺伝子プロモーター配列を標的する二重鎖低分子ＲＮＡによって遺伝子発現を正に調節することに関する。

オリゴヌクレオチドは、複数の分子メカニズム（例えばＲＮＡｉ、ＲＮアーゼＨ活性、ｍｉＲＮＡ抑制とＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ））で標的遺伝子の発現を調節することができ、それらは、それぞれに、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡ模倣物又は阻害剤、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と呼ばれる。ｓｉＲＮＡおよびＡＳＯとは異なり、ｓａＲＮＡは、細胞核内の非コード配列を標的にし、転写レベルとエピジェネティックレベルで、標的遺伝子の発現を刺激する二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである（非特許文献１）。

現在、オリゴヌクレオチドの化学修飾が、オリゴヌクレオチド治療剤の開発において重要な役割を果たすことは現在広く認識される（非特許文献２、非特許文献３）。オリゴヌクレオチド配列の化学修飾が、ヌクレアーゼに対する耐性の増加、細胞摂取の増加、免疫刺激およびオフターゲット効果の減少などのさまざまな方法で、そのｉｎ ｖｉｖｏ活性を向上させることができるが、同時に、ＲＮＡｉにおける遺伝子ノックダウンの減少などのオリゴヌクレオチド自身の作用機序も産生し、オリゴヌクレオチドの活性に影響を与えてしまう（非特許文献３）。ｓｉＲＮＡとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の医薬品開発分野では、多くの異なる化学修飾が使用された。最もよく使用される修飾は、リボース糖基に対する２’－メトキシ（２’－Ｏ－メチル）および２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾、及びホスホジエステル結合の代わるためのホスホロチオエート（ＰＳ）結合修飾である（非特許文献４）。これらの修飾は、単独または組み合わせて、キメラ オリゴヌクレオチドを作成する。しかし、ｓａＲＮＡ オリゴヌクレオチドの安定性の向上、免疫刺激活性とオフターゲット効果の抑制などのｓａＲＮＡ オリゴヌクレオチドの薬学的特性を改善する方法は、依然として困難な問題である。

Ｌｉ、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２００７、９８３：１－２０ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００４，８（６）：５７０－５７９ ＫｈｖｏｒｏｖａとＷａｔｔｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７，３５（３）：２３８－２４８ Ｗａｔｔｓ、Ｄｅｌｅａｖｅｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）：８４２－８５５

本出願の目的の１つは、ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドの薬学的特性を改善し、ｓａＲＮＡ中のヌクレオチドに対する化学修飾を提供することであり、本発明者らは、驚くべきことに、最適化された化学修飾がｓａＲＮＡ二重鎖体の安定性を高め、その免疫刺激を阻害し、および／またはオフターゲット効果を低減できることを見出した。最も重要なことは、これらの修飾は、ｓａＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ活性化の効力も高めることができるということである。

本願は、標的遺伝子を活性化するために使用できる化学修飾された低分子活性化ＲＮＡを提供し、前記の低分子活性化ＲＮＡが、センスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖からなり、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーター配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の相同性又は相補性を有する；前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の２個のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されたヌクレオチドであり、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一個の化学修飾されたヌクレオチドを有する。具体的な実施形態において、前記の化学修飾は、以下の修飾方式から選ばれる一つ又は複数である：（１）ヌクレオチドのリボースの化学修飾；（２）ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾；（３）ヌクレオチドの塩基の化学修飾；（４）ヌクレオチドは、ロックド核酸である；及び（５）５’－末端ヌクレオチドのビニルホスホネート修飾。

本願のもう一つ目的は、標的遺伝子は、ヒトｐ２１^WAF1/CIP1遺伝子（Ｐ２１遺伝子）である低分子活性化ＲＮＡを提供する。ｐ２１遺伝子は、Ｃｌｐファミリーのメンバーであり、ｐ５３遺伝子の下流に位置するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤である。ＤＮＡ損傷は、修復なしには通過できないため、ｐ２１とｐ５３は、一緒に細胞周期のＧ１チェックポイントを構成することができ、損傷したＤＮＡの複製と蓄積が減少し、腫瘍抑制の役割を果たす。ｐ２１は、腫瘍抑制に密接に関連するだけでなく、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ、ＣＤＫ）複合体の活性を阻害することで、細胞周期とＤＮＡ複製・修復の関係を調整し、そして、腫瘍抑制効果を、細胞周期制御プロセスと密接に関連する。ｐ２１は、腫瘍の分化、浸潤深さ、増殖および転移に関連する。

本願はまた、前記の低分子活性化ＲＮＡをコードするフラグメントを含む核酸分子を提供する。同時に、前記の低分子活性化ＲＮＡまたは前記の核酸分子を含む細胞を提供する。

本願は、医薬品組成物を提供し、前記の医薬品組成物が、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、と任意の、薬学に許容される担体を含む。同様に、製剤を提供し、前記の製剤は、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物を含む。並びに、さらに、キットを提供し、前記の製剤は、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の製剤を含む。

本願が、さらに、前記の低分子活性化ＲＮＡ、と低分子医薬品を含む組み合わせ医薬組成物を提供する。任意的に、前記の低分子医薬品は、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）又はバルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）から選ばれる。

本願は、さらに、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする医薬品又は製剤の調製における前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の製剤の使用を提供する。一部の実施形態において、前記の使用は、悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製であっても良い。一部の実施形態において、前記の悪性腫瘍は、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、または結腸直腸がんであっても良い。一部の実施形態において、前記の膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん（ｎｏｎ－ｍｕｓｃｌｅ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ＮＭＩＢＣ）である。

本願は、さらに、悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する方法を提供し、前記の方法は、必要がある個体に前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記の悪性腫瘍は、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、または結腸直腸がんである。一部の実施形態において、前記の膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）である。

当業者は、以下の詳細な説明から、本願の他の態様および利点を容易に認識することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみが示される。当業者が理解するように、本願の内容により、当業者は、本願が関連する発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることができる。同様に、本出願の明細書における図面および説明は、限定的なものではなく、単なる例示的なものである。

本出願が関する本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本出願が関する本発明の特徴および利点は、以下に詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照して、よりよく理解することができる。図面を、以下の通り簡単に説明する。
図１は、化学修飾されたセンス鎖とアンチセンス鎖の具体的なパターンを示す。図１－Ａは、修飾されないセンスオリゴヌクレオチド鎖及びその４種類の修飾されたの誘導体配列であり、各誘導体配列は、異なる修飾パターンを有する。図１－Ｂは、修飾されないアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＡＳ）及びその１０種類の修飾されたの誘導体配列であり、各誘導体配列は、異なる修飾パターンを有する。 図２は、化学修飾されたｄｓＲＮＡ二重鎖体の具体的なパターンを示す。図１－Ａのセンスオリゴヌクレオチドと、図１－Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖をペアで組み合わせ、３２種類の異なるｓａＲＮＡ二重鎖体を得た。 図３は、化学修飾が、ＲＮアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）におけるｄｓＲＮＡ二重鎖体の安定性に対する影響を示す。１０μＬ ＰＢＳに希釈されたｄｓＲＮＡ（１．５μＬ、１０μＭ）とＲＮａｓｅ Ａ（最終濃度は０．０１μｇ／μＬ）を、３７℃の条件では異なる時間インキュベートした（レーン１：０分間；レーン２：５分間；レーン３：１０分間；レーン４：１５分間；レーン５：３０分間；レーン６：１時間）。上記の各時間点で得られた二重鎖体を１μＬの１０×ローディング緩衝液に加えた後、液体窒素で冷凍した。すべてのサンプルのインキュベーション後、二本鎖ＲＮＡを、４％アガロースゲル電気泳動によって検出し、各二本鎖の含有量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェアによって分析した。Ｍは、２０ｂｐ ＤＮＡマーカーである。 図４は、化学修飾が、ＲＮａｓｅ Ａにおける各ＲＮＡ二重鎖体の安定性に対する影響を示す。ＲＮａｓｅ Ａ（最終濃度は０．０１μｇ／μＬ）と、１０μＬ ＰＢＳに希釈された二本鎖ＲＮＡ（１．５μＬ、１０μＭ）を、３７℃の条件では、それぞれに０、２４、４８と９６時間インキュベートした。上記の各時間点で得られた二重鎖体を１μＬの１０×ローディング緩衝液に加えた後、液体窒素で冷凍した。すべてのサンプルのインキュベーション後、二本鎖ＲＮＡを、４％アガロースゲル電気泳動によって検出し、各二本鎖の含有量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェアによって分析した。図上部のＲＡＧ１－４０－ＸＸはサンプル名称であり、ＸＸを図の上の数字に置き換えて各サンプル名称となる。Ｍは、２０ｂｐ ＤＮＡマーカーである。 図５は、化学修飾が、ヒト尿中のＲＮＡ二重鎖体の安定性に対する影響を示す。１７．５μＬ ＰＢＳに希釈された二本鎖ＲＮＡ（７．５μＬ、１０μＭ）と、２５μＬのヒト新鮮尿を、３７℃の条件では、それぞれに０、１、２４と４８時間インキュベートした。上記の各時間点で得られた二重鎖体を１μＬの１０×ローディング緩衝液に加えた後、液体窒素で冷凍した。すべてのサンプルのインキュベーション後、二本鎖ＲＮＡを、４％アガロースゲル電気泳動によって検出し、各二本鎖の含有量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェアによって分析した。Ｍは、２０ｂｐ ＤＮＡマーカーである。 図６は、構造的に最適化されたｓａＲＮＡが、Ｋｕ－７－ＬＧの増殖を抑制できることを示す。図に示されるｓａＲＮＡを１０ｎＭでＫｕ－７－ＬＧ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクト時間は、３日である。図６Ａは、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞中の単一のｓａＲＮＡによるｐ２１ ｍＲＮＡの発現であり、図６Ｂは、単一のｓａＲＮＡに抑制されたＫｕ－７－ＬＧ細胞の増殖レベルであり、図６Ｃは、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞中の単一のｓａＲＮＡによるルシフェラーゼの活性であり、ルシフェラーゼの値がコントロールグループに近いほど、ｓａＲＮＡのオフターゲット効果の可能性は低くなる。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランク トランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。 図７は、化学修飾されたｓａＲＮＡが、ヒト膀胱がん細胞系にｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進することを示す。Ｋｕ－７－ＬＧとＴ２４細胞に、最終濃度１０ｎＭの図に示されるｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１１０－５３）を３日トランスフェクトし、トランスフェクション後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ キットでＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用し、ｑＰＣＲ増幅を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照として増幅した。図７Ａは、化学修飾されたｓａＲＮＡが、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞にｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進することを示し、図７Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡが、Ｔ２４細胞にｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進することを示す。破線は、化学修飾されない二重鎖体Ｒａｇ１－４０との比較を示し、線より上の値が、より強い活性を示す。コントロールは、オリゴヌクレオチドを含まないブランクトランスフェクションである。ｄｓＣｏｎ２は、無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡのトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。 図８は、Ｒａｇ１誘導体配列が、ヒト癌細胞系の増殖を抑制する作用を示す。図に示される二重鎖体を、それぞれに１０ｎＭの最終濃度で細胞に７２時間トランスフェクトし、トランスフェクト完了後、ＣＣＫ８キットで、生細胞の数を検測し、ブランクコントロール治療グループの百分比としてプロットした。図８Ａは、Ｒａｇ１誘導体配列がＫｕ－７－ＬＧ細胞を抑制する作用であり、図８Ｂは、Ｒａｇ１誘導体配列がＴ２４細胞を抑制する作用である。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルを、ブランクコントロールとする。非特異的二重鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクトサンプルはを、ネガティブコントロールとする。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均値±ＳＤとして表示される。破線は、化学修飾されない二重鎖体Ｒａｇ１－４０との比較を示し、線より下の値が、より強い生長抑制活性を示す。 図９は、化学修飾が、ＲＮＡ二重鎖体の免疫刺激活性を抑制することができることを示す。細胞を、最終濃度１０ｎＭの示された二本鎖またはポジティブ コントロールとするリポ多糖（ＬＰＳ）で２４時間処理した。細胞上清液中のＩＮＦ－αおよびＴＮＦ－αのレベルを、ＥＬＩＳＡキットで検測した。図９Ａは、ＰＢＭＣ細胞中のＩＮＦ－αの含有量であり、図９Ｂは、ＰＢＭＣ細胞中のＴＮＦ－αの含有量である。データは、２つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。破線は、化学修飾されない二重鎖体Ｒａｇ１－４０との比較を示し、線より下の値が、抑制された活性を示す。強い免疫刺激活性を有することが知られたＲＮＡ二重鎖ＲＡＧ１－ＩＳ－１を、ポジティブ コントロールとする（その配列は、表３にリストされる）。 図１０は、ｓａＲＮＡの化学修飾が、オフターゲット効果に対する影響を示す。標的部位Ｒａｇ１－４０を含む２６ｂｐフラグメントを、アンチセンス方向で、ｐｍｉｒＧＬＯ デュアル ルシフェラーゼ ベクターのホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ領域にクローンした。ベクタープラスミドと、示されたｓａＲＮＡとを、ＣＯＳ－１細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を、溶解し、得られた溶解物のルシフェラーゼ活性を評価した。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均値±ＳＤとして表示される。破線は、ブランクコントロール（上の破線）およびＲａｇ１－４０との比較（下の破線）を表し、上の破線付近の値は、オフターゲット効果がないことを示し、下の破線より上の値と下の値は、それぞれに、化学修飾されないＲａｇ１－４０と比較したオフターゲット効果の減少と増加を示す。 図１１は、異なる時間で処理した後の化学修飾ｓａＲＮＡ二重鎖体が、膀胱がん細胞に活性化活性を維持することを示す。図１1Ａは、１０ｎＭのＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３で、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞を処理した１、２、３、４、７と９日後のｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルであり、図１1Ｂは、１０ｎＭのＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３でＴ２４細胞を処理した１、２、３、４、７と９日後のｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルであり、コントロールとｄｓＣｏｎ２は、それぞれに、ブランクトランスフェクションと無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。 図１２は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二本鎖が、細胞周期の進行を阻止することによって、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞における細胞増殖を阻害することを示す。ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３を、０．１、１、１０と５０ｎＭの最終濃度でＫｕ－７－ＬＧ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクト時間は４８時間であり、各処理には、２つの重複ウェルを使用した。トランスフェクション完了後、細胞周期をフローサイトメトリーで分析し、収集したデータを、ＭｏｔＦｉｔ ソフトウェアで分析した。 図１３は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、Ｊ８２細胞とＰＢＭＣ細胞の共培養に細胞アポトーシスを促進すること示す。０．１、１、１０と２５ｎＭの最終濃度で、ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３を、Ｊ８２細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後、新鮮の培地に交換し、かつ一定の割合（Ｊ８２細胞：ＰＢＭＣ細胞＝１：４）のＰＢＭＣ細胞を添加し、４８時間共培養した。共培養完了後、細胞を收集し、かつフローサイトメトリーで細胞アポトーシス状況を検測した。ただし、図１３Ａ－１３Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃで組み合わせ処理後のＪ８２細胞の相対増殖比であり、図１３Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。コントロールとＤＭＳＯは、それぞれに、ブランクトランスフェクションコントロールと希釈薬物の溶媒コントロールである。 図１４は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、マイトマイシンＣと組み合わせて、Ｊ８２細胞の増殖を抑制することができることを示す。０．１、０．５、１、５、１０、２５と５０ｎＭの濃度で、ＲＡＧ１－４０－３１をＪ８２細胞に２４時間トランスフェクトした後、１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの濃度のＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを添加し、２つの濃度を組み合わせた組み合わせ投与を行い、処理完了後、細胞の増殖をＣＣＫ８キットで検出した。ただし、図１４Ａ－１４Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎで組み合わせ処理後のＪ８２細胞の相対増殖比であり、図１４Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。コントロールとＤＭＳＯは、それぞれに、ブランクトランスフェクションコントロールと希釈薬物の溶媒コントロールである。 図１５は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎと組み合わせて、Ｊ８２細胞の増殖を抑制することができることを示す。０．１、０．５、１、５、１０、２５と５０ｎＭの濃度で、ＲＡＧ１－４０－３１をＪ８２細胞に２４時間トランスフェクトした後、１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの濃度のｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを添加し、２つの濃度を組み合わせた組み合わせ投与を行い、処理完了後、細胞の増殖をＣＣＫ８キットで検出した。ただし、図１５Ａ－１５Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃで組み合わせ処理後のＴ２４細胞の相対増殖比であり、図１５Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。コントロールとＤＭＳＯは、それぞれに、ブランクトランスフェクションコントロールと希釈薬物の溶媒コントロールである。 図１６は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、マイトマイシンＣと組み合わせて、Ｔ２４細胞の増殖を抑制することができることを示す。０．１、０．５、１、５、１０、２５と５０ ｎＭの濃度で、ＲＡＧ１－４０－３１をＴ２４細胞に２４時間トランスフェクトした後、１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの濃度のＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを添加し、２つの濃度を組み合わせた組み合わせ投与を行い、処理完了後、細胞の増殖をＣＣＫ８キットで検出した。ただし、図１６Ａ－１６Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎで組み合わせ処理後のＴ２４細胞の相対増殖比であり、図１６Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。コントロールとＤＭＳＯは、それぞれに、ブランクトランスフェクションコントロールと希釈薬物の溶媒コントロールである。 図１７は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎと組み合わせて、Ｔ２４細胞の増殖を抑制することができることを示す。０．１、０．５、１、５、１０、２５と５０ｎＭの濃度で、ＲＡＧ１－４０－３１をＴ２４細胞に２４時間トランスフェクトした後、１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの濃度のｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを添加し、２つの濃度を組み合わせた組み合わせ投与を行い、処理完了後、細胞の増殖をＣＣＫ８キットで検出した。

本願発明の実施形態は、以下の特定の具体的な実施例で説明されるが、当業者は、本明細書に開示された内容から、本願発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。

本願は、標的遺伝子を活性化するために使用できる低分子活性化ＲＮＡを開示し、前記の低分子活性化ＲＮＡが、センスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖からなり、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーター配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の相同性又は相補性を有する；前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の２個のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されたヌクレオチドであり、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一個の化学修飾されたヌクレオチドを有する。

本願に記載される化学修飾は、本分野における単一ヌクレオチド残基、オリゴヌクレオチド鎖上の単一ヌクレオチド間、及びオリゴヌクレオチド鎖の異なる位置における原子／化学基の変更、増加、減少、又は置換、あるいは原子間の化学結合の変更、増加、減少、又は置換、あるいはオリゴヌクレオチド鎖の任意位置のヌクレオチドとの共有連結基、リガンドあるいは複合物であっても良い。一部の実施形態において、前記の化学修飾は、以下の修飾方式中から選ばれる一つ又は複数である：
（１）ヌクレオチドのリボースの化学修飾；
（２）ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾；
（３）ヌクレオチドの塩基の化学修飾；
（４）ヌクレオチドは、ロックド核酸である；及び
（５）５’－末端ヌクレオチドのビニルホスホネート修飾。

本願に記載されるリボースの化学修飾は、当分野によく使用されるもの、例えば、ヌクレオチドペントースにおけるヒドロキシル（２’－ＯＨ）の修飾を含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドペントースにおけるヒドロキシルの修飾は、２’－フルオロ（２’－ｆｌｕｒｏ、略語２’Ｆ）、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ、略語２’－ＯＭｅ）、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２，４’－ジニトロフェノール修飾（２’－ＤＮＰ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－アミノ（２’－ａｍｉｎａ）などの修飾を含む。あるいは、一部の実施形態において、前記の化学修飾は、ヌクレオチドにおけるリボースの２’－ＯＨは、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチル、２，４’－ジニトロフェノール、ロックド核酸、２’－アミノ修飾、２’－Ｈのうちの一つ又は複数に置換されても良い。ただし、リボースの２’－ＯＨが２’－Ｈに置換されること、または化学修飾されたヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に変化することであっても良い。ヌクレオチドの典型的な化学修飾は、たとえば、以下の図のヌクレオチドを含む：

一部の実施形態において、前記の塩基修飾とは、ヌクレオチドの塩基の化学修飾を指し、例えば、５’－ブロモウラシル修飾、５’－ヨードウラシル修飾、Ｎ－メチルウラシル修飾及び／又は２，６－ジアミノプリン修飾などを含む。一部の実施形態において、前記のホスホジエステル結合の修飾は、当分野によく使用されるものであり、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子に対する修飾を含むが、これに限定されなく、例えばホスホロチオエート修飾（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ、略語ＰＳ）及び／又はボラノホスフェート修飾（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含んでも良い。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡは、センスオリゴヌクレオチド鎖を含んでも良く、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の２個のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されたヌクレオチドであっても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の２個のヌクレオチドと３’末端の２個のヌクレオチドの間に、化学修飾されたヌクレオチドの割合は、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であってもよく、または化学修飾されたヌクレオチドを完全に含まなくてもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端及び／又は３’末端の２個のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されたヌクレオチドであっても良い。ある場合、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の他のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されないヌクレオチドであっても良い。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端にある最後の２個のホスホジエステル結合の一つは、化学修飾を有してもよく、あるいは３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらも化学修飾されたものであっても良い。一部の実施形態において、３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、それぞれに、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子を、硫黄およびボランに置換されても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子を、硫黄に置換されても良く、すなわちホスホロチオエート（ＰＳ）修飾である。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一つの化学修飾されたヌクレオチドを含有する。前記の化学修飾は、ヌクレオチド中のリボース２’－ＯＨの化学修飾であってもよく、ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾であってもよく、ヌクレオチド中の塩基の化学修飾であってもよく、または任意のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）によって置換されてもよく、またはオリゴヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドに対してビニルホスホネート修飾が行われてもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２、少なくとも２３個、あるいはこれ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは１００％の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖を構成する全てのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであっても良い。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端あるいは５’末端にある最後の２個のホスホジエステル結合の一つは、化学修飾を有してもよく、あるいは３’末端あるいは５’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらも化学修飾されたものであっても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び／又は５’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート修飾又はボラノホスフェート修飾又は二つの組み合わせを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾であっても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾であっても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾であっても良い。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２、少なくとも２３個、あるいはこれ以上）の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。前記の化学修飾は、ヌクレオチドのリボース２’－ＯＨの化学修飾であっても良く、例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチル、２，４’－ジニトロフェノール、ロックド核酸、２’－アミノ修飾中の一つ又は複数であっても良い；ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾であっても良く、例えば、ホスホロチオエート修飾又はボラノホスフェート修飾であっても良い；ヌクレオチドの塩基の化学修飾であっても良い；任意の一つのヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）に置換されたものであっても良い；あるいは、オリゴヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドにビニルホスホネート修飾を行っても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２、少なくとも２３個、あるいはこれ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは１００％の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を構成する全てのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであっても良い。

一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、５’－末端の１－５６個のヌクレオチドにおいて、一定の割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又はこれ以上の２’－フルオロ修飾を有する。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、３’－末端の１－６個のヌクレオチドにおいて、より高い割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又はこれ以上の２’－フルオロ修飾を有する。本発明者らは、これらの位置での２’－フルオロ修飾が、安定性にとって重要である可能性があることを発見した。

一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の中央にある１－５個のヌクレオチドは、より高い割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、中央にある少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又はこれ以上のヌクレオチドは、リボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよい。

一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、２’－フルオロ修飾、２’－メトキシ修飾とホスホロチオエート修飾（ＰＳ）の三つの修飾の組み合わせを採用してもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、２’－フルオロ修飾、２’－メトキシ修飾とホスホロチオエート修飾（ＰＳ）の三つの修飾の組み合わせを採用してもよい。一部の実施形態において、前記の低分子活性化ＲＮＡの二重鎖体は、２’－フルオロ修飾、２’－メトキシ修飾とホスホロチオエート修飾（ＰＳ）の三つの修飾の組み合わせを採用してもよい。

発明者らは、２’－フルオロ修飾、２’－メトキシ修飾とホスホロチオエート修飾（ＰＳ）の三つの修飾からなる組み合わせ（三つの組み合わせ）が、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体が遺伝子発現を誘導する能を増加することができることを発見した；一部の実施形態において、前記の三者組み合わせが、低分子活性化ＲＮＡがｐ２１遺伝子発現を誘導する能を増加することができる；一部の実施形態において、前記の三者組み合わせが、低分子活性化ＲＮＡが、癌細胞増殖を抑制する作用を増加することができる；一部の実施形態において、前記の癌細胞は、膀胱がん細胞を含んでも良い。

一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖には、リボースヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドに置換することができる修飾を含有しない。発明者らは、オリゴヌクレオチド鎖中のＲＮＡをＤＮＡに変換する修飾が、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体が細胞の増殖を抑制する活性を低減することができる。ある場合、オリゴヌクレオチド鎖中のＲＮＡをＤＮＡに変換する修飾は、できるだけ避けるべきである。

一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の大部分（例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）あるいは全部ヌクレオチドを（例えば、２’－フルオロ修飾及び／又は２’－メトキシ修飾で）化学修飾する際に、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個又はこれ以上の２’－メトキシ修飾を採用してもよい。発明者らは、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の大部分あるいは全部ヌクレオチドを化学修飾することは、低分子活性化ＲＮＡ（例えばｐ２１を標的とするｓａＲＮＡ）が細胞の増殖を抑制する活性に悪影響を与える可能性がある。本発明者らは、また、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の大部分あるいは全部ヌクレオチドを完全に修飾することによって生じる細胞増殖を抑制する活性に対する悪影響が、センスオリゴヌクレオチド鎖の２’ＯＭｅ修飾によって打ち消すまたは修正することができることを見出した。

発明者らは、低分子活性化ＲＮＡセンスオリゴヌクレオチド鎖およびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド位置に対する異なる種類の化学修飾の無数の順列および組み合わせを探索することにより、驚くべきことに、本願に開示される低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖に対する化学修飾によれば、本願の低分子活性化ＲＮＡがより良好な薬学的特性（例えばｓａＲＮＡ二重鎖体の安定性、より低い免疫刺激とより少ないオフターゲット効果）を示すことができることを見出した；さらに重要なことに、これらの修飾は、ｓａＲＮＡがＲＮＡ活性化を誘導する効力も改善することができる。一部の実施形態において、ｓａＲＮＡがＲＮＡを誘導して標的遺伝子を活性化する効力は、コントロールグループ又は細胞における遺伝子発現の基礎レベルの少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、あるいはより高い倍数であっても良い。一部の実施形態において、本願に記載される標的遺伝子は、ヒト又はマウスのｐ２１^WAF1/CIP1遺伝子（Ｐ２１遺伝子）であっても良い。一部の実施形態において、本願に記載される標的遺伝子は、ヒトのｐ２１^WAF1/CIP1遺伝子であっても良く、低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖に対する化学修飾で、ｓａＲＮＡがＲＮＡを誘導して標的遺伝子を活性化する効力は、コントロールグループ又は細胞における遺伝子発現の基礎レベルの少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、あるいはより高い倍数である。

発明者らは、低分子活性化ＲＮＡセンスオリゴヌクレオチド鎖およびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド位置に対する異なる種類の化学修飾の無数の順列および組み合わせを探索することにより、一部の実施形態の低分子活性化ＲＮＡが、免疫活性の増強を刺激できることを発見してさらに驚いた。

一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｃ、とＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄの四種類のパターンからなる群から選ばれてもよい。
一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｉ、とＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊの十種類のパターンからなる群から選ばれてもよい。

一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｃ、とＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄの四種類のパターンからなる群から選ばれてもよく、かつ前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｉ、とＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊの十種類のパターンからなる群から選ばれてもよい。

一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄに示されるパターンであっても良く、かつ前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇに示されるパターンであっても良い。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の一つ又は二つは、どちらも６個、５個、４個、３個、２個、１個又は０個のヌクレオチドの突出を有してもよく、前記の突出は、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖及び／又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖のそれぞれの５’末端及び／又は３’末端に位置しても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、０－６個のヌクレオチドの突出を有してもよい。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、２個又は３個のヌクレオチドの突出を有してもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端には、突出を有しなく、あるいは平滑な末端であっても良い。一部の実施形態において、前記の突出は、ｄＴｄＴ又はｄＴｄＴｄＴであり、又は標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一又は相補するヌクレオチド、又は標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一でも相補もしないヌクレオチドであっても良い。一部の実施形態において、前記の突出は、標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと相補するヌクレオチドであっても良い。

本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、異なる標的遺伝子、標的遺伝子の異なる作用位置、あるいは異なる長さによる異なる活性化効果に応じて選択できる。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、それぞれに、１７－３０個のヌクレオチド、例えば、それぞれに、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドであっても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖が形成する塩基を相補する二重鎖領域は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個ヌクレオチドの長さ、例えば、それぞれに、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の塩基ペアのヌクレオチドペアであっても良い。

一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖には、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在しても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖３’又は５’領域の、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’又は３’領域に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在してもよく、例えば、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖３’領域の、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’領域に対応するヌクレオチドには、１、２、又は３個のヌクレオチドのミスマッチが存在してもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’又は３’末端以外の中間領域に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在しても良い。

一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’又は５’末端の、標的遺伝子に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在してもよい。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’又は５’末端の、標的遺伝子に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチがあってもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の、標的遺伝子に対応するヌクレオチドには、１、２又は３個のヌクレオチドのミスマッチが存在してもよい。

一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、以下の組み合わせの１つまたは複数の基と複合しても良い：脂質、脂肪酸、蛍光基、リガンド、糖類、高分子化合物、ポリペプチド、抗体、及びコレステロール。前記の基と複合することは、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖または前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端にあっても良く、または３’末端と５’末端との間にあっても良い。一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つの脂質基と複合しても良い。一部の実施形態において、前記の脂質基は、脂肪酸アシル（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ）、カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）、アニオン性脂質（ａｎｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）、イオン化可能脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、グリセロ脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ）、グリセロリン脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、ステロール脂質（ｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｉｄ）、スフィンゴール脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）、プレノール脂質（ｐｒｅｎｏｌ ｌｉｐｉｄ）、およびポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）の１つまたは複数から選択される。一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、例えばオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つのコレステロール基と複合しても良い。一部の実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、例えばオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つの糖類基と複合しても良い。前記の糖類基は、例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）と他の好適な糖類基を含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の基との複合により、本願の低分子活性化ＲＮＡ分子が、特定の器官、組織または細胞へのより良好な送達能力を示す、及び／又は、本願の低分子活性化ＲＮＡ分子が、所望の薬学的特性、例えば、薬物動態（ｐＫ）、薬力学（ｐＤ）、毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、および外因性化学物質に対する身体の吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、代謝（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）および排泄（ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）の特性などを有することが可能になる。

本願が、低分子活性化ＲＮＡを開示し、前記の低分子活性化ＲＮＡの標的遺伝子は、ヒトｐ２１^WAF1/CIP1遺伝子であっても良い。特に、一部の実施形態において、前記の低分子活性化ＲＮＡが、ｐ２１遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的する。一部の実施形態において、前記の低分子活性化ＲＮＡが、ｐ２１遺伝子プロモーターの転写開始位置（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ、ＴＳＳ）の約－１０００ヌクレオチド上流からＴＳＳまでの領域を、特異的に標的にすることができる。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７－３０個のヌクレオチドであっても良く、及び／又は、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７－３０個のヌクレオチドであっても良い。例えば、前記の低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドであっても良い；及び／又は、前記の低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドであっても良い；前記の低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖長さと同じであっても良く、異なっても良い。

一部の実施形態において、本願のｐ２１を標的する前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖配列中の少なくとも１５個ヌクレオチド長さの配列は、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖と塩基相補になっていても良い。例えば、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖における標的遺伝子プロモーター配列とマッチするヌクレオチド配列の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個ヌクレオチドであっても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、２個のヌクレオチドの突出を有してもよく、前記の突出の２個のヌクレオチドには、少なくとも１個が、標的遺伝子プロモーター配列と相補しても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、１、２、又は３個のヌクレオチドの突出を有してもよく、例えば、前記の突出のヌクレオチドのいずれも標的遺伝子プロモーター配列と相補しても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’領域と、標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖の間に、１個のヌクレオチドのミスマッチがあってもよい。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチドと、標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖の対応位置の間に、１個ヌクレオチドのミスマッチがあっても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチドと、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の間に、１個のヌクレオチドのミスマッチがあっても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチドと、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の間に、１個のヌクレオチドのミスマッチがあっても良い。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１４、１５、１６からなる群から選ばれてもよい。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１１、１２、１３、１８、１９からなる群から選ばれてもよい。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、表２におけるペアになる配列から選ばれてもよい。

本願に提供されるｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡには、本願の低分子活性化ＲＮＡがより良好な薬学的特性（例えばｓａＲＮＡ二重鎖体の安定性、より低い免疫刺激とより少ないオフターゲット効果）を示すように、本願に記載される低分子活性化ＲＮＡに対して行われる全ての異なるタイプの化学修飾を適用しても良い；さらに重要なことに、これらの修飾は、ｓａＲＮＡがＲＮＡ活性化を誘導する効力も改善することができる。一部の実施形態において、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡの化学修飾は、特定の免疫刺激活性、例えば、癌細胞の増殖の抑制（例えば、膀胱がん細胞の増殖抑制）を引き起こすのに十分な免疫刺激活性を維持する必要がある可能性がある。

一部の実施形態において、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一つの化学修飾されたヌクレオチドを含有する。前記の化学修飾は、ヌクレオチドのリボース２’－ＯＨの化学修飾であっても良く、例えば、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチル、２，４’－ジニトロフェノール、ロックド核酸、２’－アミノ修飾中の一つ又は複数であっても良い；ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾であっても良く、例えば、ホスホロチオエート修飾又はボラノホスフェート修飾であっても良い；ヌクレオチドの塩基の化学修飾であっても良い；任意の一つのヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）に置換されたものであっても良い；あるいは、オリゴヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドにビニルホスホネート修飾を行っても良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個、あるいはこれ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは１００％の化学修飾されたヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡを構成するアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドは、部分的にのみ化学修飾されたヌクレオチドであり、例えば、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下の化学修飾されたヌクレオチドを含有し、あるいは化学修飾されたヌクレオチドを含有しない。前記の化学修飾は、ヌクレオチド中のリボース２’－ＯＨの化学修飾であってもよく、ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾であってもよく、ヌクレオチド中の塩基の化学修飾であってもよく、または任意のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）によって置換されてもよく、またはオリゴヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドに対してビニルホスホネート修飾が行われてもよい。発明者らは、低分子活性化ＲＮＡの免疫刺激活性を改善する必要がある場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖のより低い（例えば８０％未満あるいは６０％未満の）化学修飾ヌクレオチド割合を選択することが適切であることを見出した。

一部の実施形態において、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡを構成するセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一つの化学修飾されたヌクレオチドを含有する。前記の化学修飾種類は、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖と同じである。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２、少なくとも２３個、あるいはこれ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは１００％の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖を構成する全てのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドである。

一部の実施形態において、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡを構成するセンスオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドは、部分的にのみ化学修飾されたヌクレオチドであり、例えば、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下の化学修飾されたヌクレオチドを含有しても良く、あるいは化学修飾されたヌクレオチドを含有しなくても良い。前記の化学修飾のタイプは、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖と同じである。

同様に、発明者らは、低分子活性化ＲＮＡの免疫刺激活性を改善する必要がある場合、センスオリゴヌクレオチド鎖のより低い（例えば８０％未満や６０％未満や４０％未満や２０％未満の）化学修飾ヌクレオチド割合を選択することが適切であることを見出した。

発明者ら、化学修飾されたヌクレオチドの位置が、ｓａＲＮＡの活性、安定性、免疫刺激性、及び／又はオフターゲット効果に影響することを見出した。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、５’－末端の１－５個のヌクレオチドにおいて、一定の割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個を有する。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、３’－末端の１－６個のヌクレオチドにおいて、より高い割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個を有する。一部の実施形態において、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の中央にある１－５個のヌクレオチドは、より高い割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよく、例えば、中央にある１個、２個、３個、４個、５個のヌクレオチドは、リボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよい。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡは、ヌクレオチドのリボースの化学修飾、例えば、ヌクレオチドのリボース２’－ＯＨの化学修飾を含有する。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドにおいて、リボース２’－ＯＨは、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチル、２，４’－ジニトロフェノール、ロックド核酸、２’－アミノ修飾の中の一つ以上に置換されても良い。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのヌクレオチドの間の少なくとも一個のホスホジエステル結合の化学修飾は、ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の修飾であっても良く、例えばホスホロチオエート修飾、又はボラノホスフェート修飾、又は二者の組み合わせを含んでも良い。

一部の実施形態において、本願に記載されるｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡの前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端にある最後の２個のホスホジエステル結合の一つは、化学修飾を有してもよく、あるいは３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらも化学修飾されたものである。前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖のホスホジエステル結合の修飾は、当分野によく使用されるものであり、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子に対する修飾を含むが、これに限定されなく、例えばホスホロチオエート修飾（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ、略語ＰＳ）及び／又はボラノホスフェート修飾（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む。一部の実施形態において、３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、それぞれに、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子を、硫黄およびボランに置換されても良い。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子を、硫黄に置換されても良く、すなわちホスホロチオエート（ＰＳ）修飾である。発明者らは、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾、又はボラノホスフェート修飾、又は二者の組み合わせであると、前記の低分子活性化ｓａＲＮＡの遺伝子活性化効力を向上できることを見出した。一部の実施形態において、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾、又はボラノホスフェート修飾、又は二者の組み合わせであると、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体の細胞増殖を抑制する活性を増強する；一部の実施形態において、前記の低分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１遺伝子を標的しても良い。一部の実施形態において、前記の細胞可は、がん細胞であっても良い。一部の実施形態において、前記の癌細胞は、膀胱がん細胞を含んでも良い。

一部の実施形態において、本願に記載されるｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡの前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端にある最後の２個のホスホジエステル結合の一つは、化学修飾を有してもよく、あるいは３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらも化学修飾されたものであっても良い。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的するアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート修飾又はボラノホスフェート修飾又は二つの組み合わせを含んでも良い。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的するアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾であっても良い。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾であっても良い。一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的するアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の中央にある１－３個のヌクレオチドは、より高い割合のリボース２’－ＯＨの化学修飾を有し、例えば、中央にある１個、２個、又は３個のヌクレオチドは、リボース２’－ＯＨの化学修飾を有してもよい。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート結合に置換されても良く、かつ前記の低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の２個のヌクレオチドは、２’フルオロ化学修飾であっても良い。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後２個のホスホジエステル結合の一つは、ホスホロチオエート結合に置換されても良く、５’末端の最後２個のホスホジエステル結合の一つは、ホスホロチオエート結合に置換されても良く、且つ５’末端の５個のヌクレオチドの内の３個は、２’フルオロ又は２’－メトキシ化学修飾であっても良く、３’末端の６個ヌクレオチドの内の３個は、２’フルオロ又は２’－メトキシ化学修飾であっても良い。

一部の実施形態において、前記のｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後２個のホスホジエステル結合のどちらも、ホスホロチオエート結合に置換されても良く、５’末端の最後２個のホスホジエステル結合のどちらも、ホスホロチオエート結合に置換されても良く、且つ５’末端の５個のヌクレオチドの内の３個は、２’フルオロ化学修飾であっても良く、３’末端の６個ヌクレオチドの内の３個は、２’フルオロ化学修飾であっても良い。一部の実施形態において、前記の５’末端の３、４、と５個目のヌクレオチドは、２’フルオロ化学修飾であり、かつ３’末端の２、５、と６個目のヌクレオチドは、２’フルオロ化学修飾であっても良い。

一部の実施形態において、本願に記載されるｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾パターンは、図１Ａから選ばれてもよい。一部の実施形態において、本願に記載されるｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾パターンは、図１Ｂから選ばれてもよい。一部の実施形態において、本願に記載されるｐ２１を標的する低分子活性化ＲＮＡセンスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾パターンは、図２から選ばれてもよい。

本願の低分子活性化ＲＮＡの調製方法は、当分野によく使用された調製方法に基づき改良されても良い。一部の低分子活性化ＲＮＡを調製する実施形態において、当該調製方法は、実質的に、以下の工程を含んでも良い：
１）標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖をテンプレートとして、１７～２８個の塩基を含む配列を標的部位とする；
２）工程１）で得られた標的部位配列に対応するＲＮＡ配列を合成し、基礎配列として、センスオリゴヌクレオチド鎖を得る；
３）長さ１７～３０個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を合成し、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖が、工程２）で得られたセンスオリゴヌクレオチド鎖と少なくとも１５個のヌクレオチドの相補的な配列を有するようにする；
４）工程２）で得られたセンスオリゴヌクレオチド鎖と、工程３）で得られたアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖とを、同じのモル数で、ＲＮＡアニーリング緩衝液に混合し、加熱し、そして室温まで自然冷却し、二重鎖の低分子活性化ＲＮＡを得る。

本願はまた、前記の低分子活性化ＲＮＡをコードするフラグメントを含む核酸分子を提供する。同時に、前記の低分子活性化ＲＮＡまたは前記の核酸分子を含む細胞を提供する。

任意的に、本願は、さらに、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡをコードするフラグメントを含む核酸分子を提供する。同時に、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡまたは前記の核酸分子を含む細胞を提供する。

本願は、さらに医薬品組成物を提供し、前記の医薬品組成物が、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、と任意の、薬学に許容される担体を含む。同様に、製剤を提供し、前記の製剤は、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物を含む。並びに、さらに、キットを提供し、前記の製剤は、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の製剤を含む。

任意的に、前記の医薬品組成物は、ｐ２１遺伝子を標的する医薬品組成物であり、ｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡ、核酸分子と任意の、薬学に許容される担体を含む。任意的に、前記の製剤は、ｐ２１遺伝子を標的する製剤であり、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡ、核酸分子、細胞、又は医薬品組成物を含む。任意的に、前記のキットは、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡ、核酸分子、細胞、医薬品組成物、又は製剤を含有しても良い。

本願に記載される薬学のに許容される担体は、通常に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のような小核酸系活性分子分野で使用される脂質ベースのカプセル化システム、生体内の糖類受容体を標的とした、例えばＮ－アセチルガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）及びその他の好適な糖類基を含む複合体、異なる脂質またはポリペプチド基をリガンドとする共有結合複合体（ｃｏｖｌｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を含んでも良く、適切な担体を選択すると、小核酸分子が投与される臓器や組織に到達するのを寄与することだけでなく、小核酸分子が標的細胞や細胞内構造にさえ入ること、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が細胞質に進入したり、ｓａＲＮＡ分子が核に進入したりすることを寄与し、それによって小核酸分子に対応する生物学的調節効果を得ることができる。

さまざまな送達技術の中でも、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、一般に、イオン化脂質、コレステロール、リン脂質、ＰＥＧの４つの成分で構成され、オリゴヌクレオチドを効率的にパッケージし、ヌクレアーゼ消化から保護するために使用できる。イオン化脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＬＮＰの製造に最もよく使用されるカチオン性脂質の一つ）またはＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを使用すると、脂質ナノ粒子は、静脈内注射後に、オリゴヌクレオチドを肝臓に送達することに成功した。しかし、ＬＮＰ配合、プロセス、および限定された標的臓器（肝臓に特異的；送達効率は、肝臓＞脾臓＞腎臓の順で；静脈内注射後のマウスの十二指腸、肺、心臓および脳への蓄積はごくわずか）が、医薬組成物におけるＬＮＰ技術の応用を制限する。

本願に記載されるｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡは、必要に応じて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と製剤又は医薬品組成物を形成しても良い。ＬＮＰによってパッケージされる前記のｐ２１遺伝子を標的とする低分子活性化ＲＮＡは、肝臓に送達し、肝臓がんを治療したり、または、全身投与または局所投与によって、結腸直腸、前立腺、または膀胱に送達し、結腸直腸がん、前立腺がん、または膀胱がんを治療したりすることができる。ＲＮＡ分子とＬＮＰの組成物、その配合、及びその調製方法は、当分野の既有の開示された内容、例えば、ＵＳ２０１９０２４０３５４Ａ１，ＵＳ２０１９０３３６４５２Ａ１，ＵＳ２０１６００３８６１２Ａ１などを参照しても良い。一部の実施形態において、本願は、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡとＬＮＰを含む製剤を提供し、膀胱で局所投与し、膀胱がんを治療する。一部の実施形態において、本願は、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡとＬＮＰを含む製剤を提供し、膀胱灌流で、膀胱がんを治療する。一部の実施形態において、本願は、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡとＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡに基づくＬＮＰを含む製剤を提供し、膀胱灌流で、膀胱がんを治療する。一部の実施形態において、本願は、前記のｐ２１遺伝子を標的する低分子活性化ＲＮＡとＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡに基づくＬＮＰを含む製剤を提供し、膀胱灌流で、筋層非浸潤性膀胱がん（ｎｏｎ－ｍｕｓｃｌｅ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ＮＭＩＢＣ）を治療する。

本願が、さらに、前記の低分子活性化ＲＮＡ、と低分子医薬品を含む組み合わせ医薬組成物を提供する。任意的に、前記の低分子医薬品は、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）又はバルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）から選ばれる。一定の医薬品濃度では、本願に記載される低分子活性化ＲＮＡが、前記の低分子医薬品（例えばマイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）又はバルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ））と相乗効果を有し、膀胱がん細胞増殖に対するより強い抑制作用を表す。

本願は、さらに、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする医薬品又は製剤の調製における前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の組み合わせ医薬組成物、又は前記の製剤の使用を提供する。一部の実施形態において、前記の使用は、悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製であっても良い。一部の実施形態において、前記の悪性腫瘍は、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、または結腸直腸がんを含んでも良い。一部の実施形態において、前記の膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がんである。

本願は、さらに、免疫刺激活性を有する医薬品の調製における前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の組み合わせ医薬組成物、又は前記の製剤の使用を提供する。

本願は、さらに、悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する方法を提供し、前記の方法は、必要がある個体に前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の組み合わせ医薬組成物、又は前記の製剤を投与することを含む。一部の実施形態において、前記の悪性腫瘍は、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、または結腸直腸がんを含んでも良い。一部の実施形態において、前記の膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）である。一部の実施形態において、前記の低分子活性化ＲＮＡ、又は前記の核酸分子、又は前記の細胞、又は前記の医薬品組成物、又は前記の組み合わせ医薬組成物、又は前記の製剤は、いずれもｐ２１遺伝子を標的しても良い。

つまり、化学修飾が、ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドの薬学的特性を改善できる。最適化された化学修飾は、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体の安定性を増加し、その免疫刺激を抑制し、且つオフターゲット効果を減少することができる。最も重要なことは、これらの修飾は、ｓａＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ活性化の効力も高めることができるということである。化学修飾された低分子活性化ＲＮＡと他の低分子化学療法医薬品との組み合わせ使用は、より強い抗腫瘍活性を表す。

以下、具体的な説明を通じて本発明をさらに説明する。他に定義されない限り、本願で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本願が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本願では、文脈上明らかに特に指示がない限り、単数形の「一つ」と「当該」は、複数の指示対象が含まれる。

＜用語の定義＞
本願で使用されるように、「相補」という用語は、２つのオリゴヌクレオチド鎖が、互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は通常、逆平行オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオチド単位の間の水素結合により形成される。相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリーク（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）方式で塩基のマッチ（例えば、Ａ－Ｔ、Ａ－Ｕ、Ｃ－Ｇ）を行うことができ、または二重鎖体を形成することを可能にする他の任意の方法（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基の対）で塩基のマッチを行うことができる。「１００％ペアリング」とは、１００％相補性、すなわち２つの鎖のすべてのヌクレオチド単位が互いに水素結合していることを意味する。

完全に相補することまたは１００％相補性とは、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域には、第一のオリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチド単位が、第二のオリゴヌクレオチド鎖と、ミスマッチがないように水素結合を形成することができることを指す。不完全に相補することとは、２本の鎖のヌクレオチド単位が、すべてに互いに水素結合で結合できないことを指す。例えば、２本の二重鎖領域が、２０個ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド鎖について、各鎖に２つの塩基対だけが互いに水素結合で結合できる場合、オリゴヌクレオチド鎖は１０％の相補性を示す。同じ例では、各鎖上の１８個塩基対が、互いに水素結合で結合できる場合、オリゴヌクレオチド鎖は９０％の相補性を示す。実質的な相補性とは、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上の相補性を指す。

本願で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの一本鎖または二本鎖分子、規則的および不規則に交互するデオキシリボース部分とリボース部分を含むオリゴヌクレオチド鎖（つまり、候補ヌクレオチド単位が、糖部分の２’位に、－ＯＨを有し、次に－Ｈであり、次に－ＯＨであり、次に－Ｈである）、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾含むが、これらに限定されなく、ここで、置換又は連結される様々な実体または部分は、任意の位置のヌクレオチド単位および天然に存在するまたは非天然に存在する結合と結合する。本願に記載される標的遺伝子の転写を活性化するためのオリゴヌクレオチドは、低分子活性化ＲＮＡである。

本願で使用されるように、「オリゴヌクレオチド鎖」および「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用され、３０個塩基以下の短鎖ヌクレオチドの総称を指す（デオキシリボ核酸ＤＮＡまたはリボ核酸ＲＮＡ内のヌクレオチドを含む）。本願において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７～３０個ヌクレオチドのいずれかであっても良い。

本願に使用されるように、「遺伝子」という用語は、一本のポリペプチド鎖又は機能性ＲＮＡを産生するのに必要な全てのヌクレオチド配列を指す。「遺伝子」は、宿主細胞にとって内因性である、または完全もしくは部分的に組み換えられた遺伝子（例えば、プロモーターをコードする外因性オリゴヌクレオチドおよびコード配列の導入、または内因性コード配列に隣接する異種プロモーターの宿主細胞への導入によるもの）であっても良い。例えば、「遺伝子」という用語は、エクソンおよびイントロンから構成され得る核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンの間のオープンリーディングフレーム内のエクソン内に含まれる配列であり、本願で使用されるように、「遺伝子」は、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの遺伝子調節配列、および、他の遺伝子にコード配列が含まれているか非コード配列が含まれているかには関わらず、他の遺伝子の転写、発現または活性を制御する当技術分野で知られている他のすべての配列を含むことを指しても良い。ある場合では、例えば、「遺伝子」は、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列を含む機能性核酸を記述するために使用されても良い。組換え遺伝子の発現は、１つまたは複数の異種調節配列によって制御されてもよい。

本願で使用されるように、「標的遺伝子」という用語は、生物体内に天然に存在する核酸配列、組み換え遺伝子、ウイルス配列または細菌配列、染色体または染色体外、および／または一時的または安定にトランスフェクトされるか、または細胞および／またはそのクロマチンに組み込まれる核酸配列であっても良い。標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってもよく、タンパク質をコードしない遺伝子（例えばマイクロＲＮＡ遺伝子、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子）であってもよい。通常に、標的遺伝子は、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも呼ばれる）を有する低分子活性化ＲＮＡを設計することで、標的遺伝子の正の調節を達成でき、これは標的遺伝子の発現のアップレギュレーションを表す。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を指し、本願において、「標的遺伝子プロモーター配列に相補」における標的遺伝子プロモーター配列は、当該遺伝子コード配列と同じ核酸配列である、非テンプレート鎖としても知られる当該配列のコード鎖を指す。

本願に使用されるように、「コード鎖」という用語は、転写できないＤＮＡ鎖を指し、当該鎖のヌクレオチド配列は、転写によって生成されるＲＮＡの配列と一致し（ＲＮＡでは、ＵでＤＮＡにおけるＴを置換する）、センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とも呼ばれる。本願に記載される標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のコード鎖とは、標的遺伝子のＤＮＡコード鎖と同じＤＮＡ鎖上のプロモーター配列を指す。

本願に使用されるように、「テンプレート鎖」という用語は、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡ中のコード鎖と相補するもう一方の鎖を指し、ＲＮＡに転写するためのテンプレートとして使用することができ、当該鎖は、転写されたＲＮＡ塩基（Ａ～Ｕ、Ｇ～Ｃ）と相補する。転写中、ＲＮＡ ポリメラーゼは、テンプレート鎖に結合し、テンプレート鎖の３’→５’方向に沿って移動し、５’→３’方向で、ＲＮＡ合成を触媒する。アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｓｔｒａｎｄ）、マイナス鎖とも呼ばれる。本願に記載される標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のテンプレート鎖とは、標的遺伝子のＤＮＡテンプレート鎖と同じＤＮＡ鎖上のプロモーター配列を指す。

本願で使用されるように、「同一性」または「相同性」という用語は、低分子活性化ＲＮＡの１つのオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）と、標的遺伝子のプロモーター配列のある領域のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対して少なくとも６０％の類似性があることを意味する。

本願で使用されるように、「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードしない核酸配列を指し、タンパク質をコードする核酸配列またはＲＮＡをコードする核酸配列と位置的に関連することで、それらの転写に調節効果を及ぼす。通常に、真核プロモーターは、１００～５，０００塩基対を含むが、この長さの範囲は、本願で使用される「プロモーター」という用語を限定することを意味するものではない。プロモーター配列は通常に、タンパク質コード配列またはＲＮＡコード配列の５’末端に位置するが、プロモーター配列は、エクソン配列およびイントロン配列にも存在する。

本願で使用されるように、「転写開始部位」という用語は、遺伝子のテンプレート鎖に、転写の開始を示すヌクレオチドを指す。一つの遺伝子は、複数の転写開始部位を持つことができる。

本願で使用されるように、「突出」、「ｏｖｅｒｈａｎｇ」、および「オーバーハング」という用語は、互換的に使用され、末端（５’または３’）にある非塩基対のヌクレオチドを指し、それが、二本鎖オリゴヌクレオチド内の一方の鎖を越えて伸びるもう一方の鎖によって生成される。二本鎖の３’および／または５’末端を越えて伸びる一本鎖領域は、突出と呼ばれる。

本願で使用されるように、「遺伝子活性化」もしくは「活性化された遺伝子」という用語は、互換的に使用され、遺伝子転写レベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、クロマチンの状態または配置、翻訳レベル、または細胞または生物学的システムにおけるその活性または状態を測定することによる、特定の核酸の転写、翻訳もしくは発現もしくは活性の増加を測定することを指す。これらの活動または状態は、直接的または間接的に測定できる。さらに、「遺伝子活性化」もしくは「活性化された遺伝子」とは、そのような活性化が起こるメカニズムに関係なく、核酸配列に関連する活性の増加を意味し、例えば、調節配列として調節作用を有し、ＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、タンパク質の発現を増加させることを指す。

本願に使用されるように、「低分子活性化ＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、遺伝子発現を促進することができるリボース核酸分子を指し、標的遺伝子の非コード核酸配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど）と配列同一性を有するリボースヌクレオチド配列を含む第一のリボース核酸鎖（アンチセンス鎖；アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖とも呼ばれる）と、第一の鎖と相補するヌクレオチド配列を含む第二のリボース核酸鎖ト（センス鎖；センス鎖またはセンスオリゴヌクレオチド鎖とも呼ばれる）からなってもよく、ただし、第一の鎖と第二の鎖は、二重鎖体を形成する。低分子活性化ＲＮＡは、二本鎖領域にヘアピン構造を形成する一本鎖ＲＮＡ分子から構成され、ただし、第一の領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有するリボースヌクレオチド配列を含み、第二の領域は、第一の領域に相補するリボースヌクレオチド配列を含む。低分子活性化ＲＮＡ分子の二重鎖体領域の長さが、通常に、約１０～約５０塩基対、約１２～約４８塩基対、約１４～約４６塩基対、約１６～約４４塩基対、約１８～約４２塩基対、約２０～約４０塩基対、約２２～約３８塩基対、約２４～約３６塩基対、約２６～約３４塩基対、約２８～約３２塩基対、通常約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０塩基対である。さらに、「ｓａＲＮＡ」、「低分子活性化ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含有し、修飾されたヌクレオチドまたは類似体を含むが、これらに限定されない。

本願に使用されるように、「センス鎖」、「センスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互換的に使用され、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体の、標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖に対して同一性を有する第一のリボース核酸鎖を指す。

本願に使用されるように、「アンチセンス鎖」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互換的に使用され、低分子活性化ＲＮＡ二重鎖体の、センスオリゴヌクレオチド鎖と相補する第二のリボース核酸鎖を指す。

本願に使用されるように、「基礎配列という用語は、低分子活性化ＲＮＡの調製方法では、標的遺伝子プロモーター二重鎖ＤＮＡ配列のコード鎖をテンプレートとし、１７－３０、例えば１９個の塩基を含む配列を選択し、標的部位とし、得られた標的部位配列と対応するＲＮＡ配列を合成し、基礎配列とし、前記の基礎配列は、標的遺伝子プロモーター二重鎖ＤＮＡ配列のコード鎖の配列と完全に一致しても良く、６０％以上の相同性を有してもよい。

本願で使用されるように、「合成」という用語は、ＲＮＡを合成する方法を指し、化学合成、インビトロ転写などのＲＮＡを合成できる任意の方法を含む。
本願に使用されるように、「誘導体配列」という用語とは、特定のオリゴヌクレオチド配列を化学修飾して得たオリゴヌクレオチド配列を指す。

＜材料と方法＞
＜二重鎖ｓａＲＮＡとトランスフェクション＞
二重鎖ｓａＲＮＡは、ＧｅｎｅＰｈａｒｍ（中国上海）又はＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（中国南京）より化学合成された。

＜細胞の培養とトランスフェクション＞
ヒト膀胱癌細胞Ｋｕ－７－ＬＧ（ＡＴＣＣ）、Ｊ８２（ＡＴＣＣ）とＴ２４（ＡＴＣＣ）を、１０％子ウシ牛血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＭｃＣｏｙ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。Ｋｕ－７－ＬＧ、Ｊ８２とＴ２４細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、製造元の指示に従って、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、１０ｎＭの濃度で（特に指定しない限り）低分子ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は３日であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。ずべてのｓａＲＮＡ配列は、表２にリストされた。

＜二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ＞
トランスフェクション後、培地を捨て、ウェルごとに５００μｌの細胞溶解液を加え、室温で５分間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ キットを使用してＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲ分析を実行し、サンプルごとには、３つの複製ウェルで増幅され、ＰＣＲ反応条件は表５に示される。

ＰＣＲ反応条件は：９５℃で３０秒間、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクルを増幅した。同時に、内部参照としてＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅し、ただし、ｐ２１を、ｐ２１ Ｆ１／Ｒ１プライマー対を使用して増幅し、増幅プライマーの具体的な配列を表１に示す。

コントロール処理に対するｓａＲＮＡトランスフェクションサンプルのｐ２１（目的遺伝子）の発現値（Ｅｒｅｌ）を計算するために、式１を使用して、目的遺伝子と内部参照遺伝子のＣｔ値を代入して計算した。
Ｅ_rel＝２^(CtTm-CtTs)／２^(CtRm-CtRs) （式１）

ただし、ＣｔＴｍは、コントロール処理サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＴｓは、ｓａＲＮＡ処理サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＲｍは、コントロール処理サンプルからの内部参照遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＲｓは、ｓａＲＮＡ処理サンプルからの内部参照遺伝子のＣｔ値である。

＜細胞アポトーシスの検測＞
０．１、１、１０と２５ｎＭでＲＡＧ１－４０－３１をＪ８２細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後、ＰＢＭＣ細胞を含む新鮮培地に交換し、ＰＢＭＣとＪ８２細胞を４８時間共培養した後、上清を捨て、細胞を收集し、ウェルごとに５００μｌのＰＢＳを加えて１回洗浄し、ＰＢＳを捨て、ウェルごとに１００μｌのトリプシンを加え、９００μの培地を加えて、消化を停止し、１．５ｍＬ遠心管に移し、遠心分離（４００ｒｃｆ、５分間）し、すべての細胞を収集し、カウントした（１～２×１０⁵細胞／１００μｌバインディングバッファー）。１００μＬの１×バインディングバッファー（Ｂ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５１－６６１２１Ｅ）と５μＬのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５１－６５８７４Ｘ）と５μＬのＰＩ（Ｂ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５１－６６２１１Ｅ）をそれぞれ加え、室温、暗所で、１５分間インキュベートし、完了した後、１００μＬの１×バインディングバッファーを加え、均一に混合し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）分析のために９６ウェルプレートに移し、サンプルを１時間以内に分析する必要がある。

＜細胞周期の検測＞
細胞トランスフェクション後、上清を捨て、細胞を収集し、ウェルごとに５００μｌのＰＢＳを加えて１回洗浄し、ＰＢＳを捨て、ウェルごとに１００μｌのトリプシンを加え、９００μの培地を加えて、消化を停止し、１．５ｍＬ遠心管に移し、遠心分離（４００ｒｃｆ、５分間）して、すべての細胞を収集し、カウントした（２×１０⁵細胞／２００μｌ ＰＢＳ）。冷７０％無水エタノールを加え、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、２００μＬのＫｒｉｓｈａｎバッファーを加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、上清を捨て、２００μＬのＰＢＳを加え、細胞を再懸濁し、細胞をフローサイトメトリーによる分析のために９６ウェルプレートに移した。収集されたデータを、ＭｏｔＦｉｔ ソフトウェアで分析した。

＜細胞増殖の測定（ＣＣＫ８）＞
細胞を、２～４×１０³細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、一晩培養し、オリゴヌクレオチド二重鎖体でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用し、その説明書に従って細胞増殖を検測した。実験手順は次のように簡単に説明される：１０μＬのＣＣＫ８溶液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

＜ｓａＲＮＡの安定性分析＞
将ｓａＲＮＡ（１．５μＬ、１０μＭ）を、ＲＮａｓｅ Ａ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ＯＨ、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳに、０．０２ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、３７℃では、異なる時間インキュベートした。インキュベーション完了後、混合物を、液体窒素中で急速冷凍し、ヌクレアーゼ活性を停止させた。サンプルを、４％アガロースゲルで分析し、二重鎖の分解程度を検測した。

＜オフターゲット効果の分析（プラスミド構築とルシフェラーゼ活性分析）＞
Ｒａｇ１－４０標的部位を含む２６ｂｐフラグメントを、アンチセンス方向で、ｐｍｉｒＧＬＯ デュアル ルシフェラーゼ ベクターＰｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）のホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）にクローンし、ｐＯｆｆ－Ｔａｒｇｅｔプラスミドを製造した。インサートの生成に使用したすべてのオリゴヌクレオチド配列を、表４にリストした。大腸菌の形質転換および一晩の培養後、各構築物のプラスミドを、標準的な方法により調製した。各プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ＣＯＳ－１サル腎上皮細胞にトランスフェクトした。続いて、ＲＮＡｉ ＭＡＸを用い、ｓａＲＮＡをトランスフェクトした。２４時間の培養後、ＣＯＳ－１細胞を１×溶解緩衝液で溶解し、製造元の指示に従って、デュアルルシフェラーゼ レポーター ジーン アッセイ システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。

＜免疫刺激の測定（ＰＢＭＣサイトカイン放出測定）＞
ヒト末梢血単核細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カリフォルニア州アラメダ）を、９６ウェルマイクロプレートに約１０×１０⁴細胞／ウェルの密度で播種した。ｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して実施した。トランスフェクションの２４時間後に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ＩＦＮ－αとＴＮＦ－α産生をすぐに測定した。各処理グループを、３つに分け、分析した。

＜統計分析＞
結果は、平均値±標準偏差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ ソフトウェア）を使用して一元配置分散分析を実行し、続いて統計分析のためにＴｕｋｅｙのｔ検定を実行する。統計的有意性の基準は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１に設定される。

いかなる理論によっても制限されることは意図されておらず、以下の実施例は、本願の融合タンパク質、製造方法、および用途などを説明するためのものであり、本願発明の範囲を制限するためのものではない。

以下の実施例でさらに本願を説明する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、いかなる形でも本願の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。

＜実施例１ ｓａＲＮＡの化学修飾＞
表２、図１と図２に示されるように、ｓａＲＮＡの化学修飾は、それぞれに、２’－Ｏ－メチル（２’Ｍｅ）、２’－フルオロ（２’Ｆ）、ホスホジエステル結合のホスホロチオエート（ＰＳ）修飾、とリボースヌクレオチドのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の置換の四種類の化学修飾、又はＲａｇ１－４０ ｓａＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６）とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２）の修飾の異なる組み合わせを採用することで、４種類のセンス誘導体配列（ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６ＡからＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄ）と１０種類のアンチセンス誘導体配列（ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２ＡからＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊ）を産生することを含む（図１）。

^a 小文字のヌクレオチド（Ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ）＝ＤＮＡ；
^bｍ＝２’ＯＭｅ；
^cｆ＝２’Ｆ；
^d*＝ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ、ＰＳ）

ただし、センスオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれに：
１）ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａの５’と３’末端に、それぞれに、２個の２’メトキシ修飾がある；
２）ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂの５’と３’末端に、それぞれに２個の２’－フルオロ修飾がある；
３）ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｃは、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａから由来し、ホスホロチオエート結合で最後２個の３’末端ホスホジエステル結合を置換する；
４）ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄは、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂから由来し、ホスホロチオエート結合で最後２個の３’末端ホスホジエステル結合を置換する；

アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれに：
１）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａが、５’末端から、１、３、４、５、１２、１６、１７、と２０位にそれぞれに、２’－フルオロ修飾を有し、すなわち、合計８個の２’－フルオロ修飾を有する；
２）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂが、５’末端から、１、５、１２、１６、と２０位にそれぞれに、２’－フルオロ修飾を有し、すなわち、合計５個の２’－フルオロ修飾を有する；
３）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃは、完全に修飾され、かつＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２から誘導されてなり、５’末端から、２、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１８、１９、と２１位にそれぞれに、２’ＯＭｅ修飾を導入する；
４）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄは、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂから由来し、ＰＳで最後２個の３’末端ホスホジエステル結合を置換する；
５）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅは、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄから誘導され、その５’末端から、１位のヌクレオチドには、２’Ｆ修飾を有しない；
６）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆは、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａから由来し、ＰＳで５’末端の最初の１個のホスホジエステル結合と３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合を置換する；
７）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇは、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆから誘導され、その５’末端から、１位のヌクレオチドには、２’Ｆ修飾を有しない；
８）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈは、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄと類似するが、５’末端から２、３と４位の３個リボースヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドに置換され、５’末端から１７位に２’－フルオロ修飾を有する；
９）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｉは、５’末端から２、３と４位に、３個のデオキシヌクレオチドを有する；
１０）ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊは、５’末端から２、３、４、５、６と７位に、６個のデオキシヌクレオチドを有する。

各センスオリゴヌクレオチド鎖誘導体配列は、最初の８個のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖誘導体配列（ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａ－ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈ）にアニーリングされ、合計に３２個の二重鎖体を産生し、各二重鎖体は、独自の修飾パターンを有する（図２）。尚、修飾されないセンスオリゴヌクレオチド鎖ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２ＩとＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊにアニーリングされ、二個の追加の二重鎖体（Ｒａｇ１－４０－３３とＲａｇ１－４０－３４）を産生した（図２）。

＜実施例２ 化学修飾が、ＲＮアーゼおよび尿中の二本鎖の安定性を大幅に向上する＞
ヌクレアーゼの存在下でのｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３８二重鎖体の安定性を評価するために、二重鎖体を０．０２μｇ／μＬのＲＮａｓｅＡ溶液中で、０～１時間の異なる期間インキュベートした。図３に示すように、二本鎖ｓａＲＮＡは、５分以内に分解が始まり、１時間以内に完全に分解された。

すべての化学修飾された二重鎖体（Ｒａｇ１－４０－１からＲａｇ１－４０－３２）を、０．０２μｇ／μＬのＲＮａｓｅＡとともに、異なる時間（０から９６時間）インキュベートした。インキュベーション完了後、二重鎖体のサイズと量を、アガロースゲル電気泳動によって検出した。図４に示されるように、３２個の誘導体配列には、２０個の二重鎖ｓａＲＮＡ（６２．５％）は、９６時間後に、ほとんど分解の兆候を示さなく、それらは、Ｒａｇ１－４０－１、Ｒａｇ１－４０－３、Ｒａｇ１－４０－６、Ｒａｇ１－４０－７、Ｒａｇ１－４０－８、Ｒａｇ１－４０－９、Ｒａｇ１－４０－１１、Ｒａｇ１－４０－１４、Ｒａｇ１－４０－１５、Ｒａｇ１－４０－１６、Ｒａｇ１－４０－１７、Ｒａｇ１－４０－１９、Ｒａｇ１－４０－２２、Ｒａｇ１－４０－２３、Ｒａｇ１－４０－２４、Ｒａｇ１－４０－２５、Ｒａｇ１－４０－２７、Ｒａｇ１－４０－３０、Ｒａｇ１－４０－３１とＲａｇ１－４０－３２を含むが、残りの１２個（３７．５％）の二重鎖ｓａＲＮＡ誘導体配列（Ｒａｇ１－４０－２、Ｒａｇ１－４０－４、Ｒａｇ１－４０－５、Ｒａｇ１－４０－１０、Ｒａｇ１－４０－１２、Ｒａｇ１－４０－１３、Ｒａｇ１－４０－１８、Ｒａｇ１－４０－２０、Ｒａｇ１－４０－２１、Ｒａｇ１－４０－２６、Ｒａｇ１－４０－２８、Ｒａｇ１－４０－２９）は、２４時間内、完全に分解された。これらのデータは、化学修飾を賢く使用すると、ｓａＲＮＡ二重鎖体の安定性を、大幅に延長できることを示した。

さらに、図４のデータを分析すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２ＤとＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ（例えば、Ｒａｇ１－４０－２、Ｒａｇ１－４０－４、Ｒａｇ１－４０－５、Ｒａｇ１－４０－１０、Ｒａｇ１－４０－１２、Ｒａｇ１－４０－１３、Ｒａｇ１－４０－１８、Ｒａｇ１－４０－２０、Ｒａｇ１－４０－２１、Ｒａｇ１－４０－２６、Ｒａｇ１－４０－２８、Ｒａｇ１－４０－２９）を含む二重鎖体は、いずれも２４時間内に分解されたが、残りの二重鎖体は、９６時間内には、安定である。この３個のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２ＤとＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ）は、５’末端から３、４、または１７位のヌクレオチドの２’Ｆ修飾を有しない点で異なる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖上の５’末端付近と３’末端付近のこれらの２’Ｆ修飾は、安定性にとって重要である。

ヒト尿中での化学修飾された二本鎖ｓａＲＮＡの安定性をさらに試験するために、二重鎖体を、尿中で０～４８時間の範囲の異なる時間インキュベートした。図５に示されるように、化学修飾されないＲａｇ１－０とＲａｇ１－４０は、２４時間内に、大部分が分解され、４８時間以内に、完全に分解された。しかし、選択された８種類の化学修飾誘導体配列であるＲａｇ１－４０（Ｒａｇ１－４０－２３、Ｒａｇ１－４０－２５、Ｒａｇ１－４０－３１、Ｒａｇ１－４０－１７、Ｒａｇ１－４０－２２、Ｒａｇ１－４０－７）は、４８時間以内に分解の兆候を示さないが、Ｒａｇ１－４０－２６とＲａｇ１－４０－２９は、４８ 時間後に、ほとんど分解された。ＲＮａｓｅＡの安定性分析と一致し、このデータは、化学修飾を賢く使用すると、尿中のｓａＲＮＡ二重鎖体の安定性を改善できることを示す。

＜実施例３ 構造的に最適化されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０が、細胞増殖抑制効果を増強し、オフターゲット効果を低下する＞
ＲＡＧ１－０は、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の標的配列であり、この構造に基づいて構造の最適化を行い、１６個のｓａＲＮＡを得た：ＲＡＧ１－２９、ＲＡＧ１－３０、ＲＡＧ１－３１、ＲＡＧ１－３２、ＲＡＧ１－３３、ＲＡＧ１－３４、ＲＡＧ１－３５、ＲＡＧ１－３６、ＲＡＧ１－３７、ＲＡＧ１－３８、ＲＡＧ１－３９、ＲＡＧ１－４０、ＲＡＧ１－４１、ＲＡＧ１－４２、ＲＡＧ１－４３、ＲＡＧ１－４４。

図６Ａは、図に示すように構造的に最適化されたｓａＲＮＡを、１０ｎＭで、トランスフェクトした３日後の、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞におけるｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。コントロールグループと比較して、すべてのｓａＲＮＡは、より高い活性を示した。標的配列ＲＡＧ１－０と比較して、すべてのｓａＲＮＡは、ＲＡＧ１－０よりも活性が低かったが、それでも高い（２倍を超える）活性を維持した。図６Ｂは、ＲＡＧ１－４０の細胞増殖比（３２．４％）が、ＲＡＧ１－０（４８．９％）よりも低く、ＲＡＧ１－４０が細胞増殖抑制効果を増強することを示す。図６Ｃは、ＲＡＧ１－４０のルシフェラーゼ活性（０．８４倍）が、ＲＡＧ１－０のルシフェラーゼ活性（０．７７倍）よりも高いことを示し、ＲＡＧ１－４０のオフターゲット効果が、ＲＡＧ１－０のそれよりも低いことを示す。上記の結果は、標的配列ＲＡＧ１－０と比較して、構造的に最適化されたＲＡＧ１－４０が、細胞増殖抑制効果を増強し、オフターゲット効果を低減できることを示す。

＜実施例４ 化学修飾が、ｓａＲＮＡ二重鎖体のＲＮＡ活性化活性を保持または増強する＞
遺伝子調節オリゴヌクレオチドに化学修飾を導入する主な目的は、生体内での安定性の向上やオフターゲット効果（例えば、無関係な遺伝子の配列依存性ターゲティング、配列依存性または独立した免疫刺激）の抑制を含む薬学的特性を改善するとともに、遺伝子調節能力（遺伝子のノックダウンまたは活性化）を維することである。ｐ２１遺伝子に対するｓａＲＮＡのＲＮＡａ活性に対する化学修飾の影響を評価するために、１０ｎＭの未修飾（Ｒａｇ１－４０）と修飾（Ｒａｇ１－４０－１～Ｒａｇ１－４０－３４）された二重鎖体を、それぞれに、Ｋｕ－７－ＬＧとＴ２４細胞に、トランスフェクトした。７２時間後、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルを評価した。

すべての二重鎖体は、すべての３つの細胞系において、コントロールグループの少なくとも２倍のｐ２１ ｍＲＮＡ発現を誘導した。図７Ａは、Ｒａｇ１－４０と比較して、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞には、Ｒａｇ１－４０－３２、Ｒａｇ１－４０－３３およびＲａｇ１－４０－３４を除くすべての化学修飾された誘導体配列が、改善されたまたは同様のＲＮＡ活性化活性を示した。図７Ｂは、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞と同様に、Ｔ２４細胞には、化学修飾された誘導体配列の２９（８５．３％）種類が、Ｒａｇ１－４０と同等又はそれ以上のＲＮＡ活性化活性を有する；Ｒａｇ１－４０と比較して活性が低下していたのは５種類（Ｒａｇ１－４０－１１、Ｒａｇ１－４０－３１、Ｒａｇ１－４０－３２、Ｒａｇ１－４０－３３とＲａｇ１－４０－３４）だけである。

化学修飾された二重鎖体Ｒａｇ１－４０－３２、Ｒａｇ１－４０－３３、とＲａｇ１－４０－３４では、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端から２～４位のヌクレオチド領域を、デオキシヌクレオチドで置換し、試験したすべての細胞系において、活性の減弱が示され（図７Ａ～７Ｂ）、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末付近の領域には、リボヌクレオチドのＤＮＡ置換は、ＲＮＡ活性化にとって劣化である設計戦略であることを示す。

つまり、これらのデータは、ｓａＲＮＡ二重鎖体に２’Ｆ、２’ＯＭｅ、およびＰＳ修飾を合理的に使用することは、ＲＮＡａ活性に悪影響を及ぼさないことを示し、逆に、ほとんどの組み合わせで活性が向上する；これは主に、化学修飾が、ヌクレアーゼに対するｓａＲＮＡ二重鎖体の耐性を向上することに起因する可能性があり、また、核へのｓａＲＮＡの侵入を増加させ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅｓ（Ａｇｏｓ）が、ガイド鎖として、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を使用する確率を高める化学修飾にも関連する可能性がある。そのルールは次の通りであった：

１）２’Ｆ、２’ＯＭｅ、ＰＳ修飾の組み合わせは、ｓａＲＮＡ二重鎖体が、ｐ２１発現を誘導する能力を増加した；
２）二重鎖体のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の２個のＰＳ修飾が、二本鎖の遺伝子活性化能力を向上することができる。これは、この修飾を含むｓａＲＮＡ二重鎖体（Ｒａｇ１－４０－１７からＲａｇ１－４０－３２）と、この位置に修飾のないｓａＲＮＡ二重鎖体（Ｒａｇ１－４０－１からＲａｇ１－４０－１６）の遺伝子活性化能力を比較することで解明できる。

＜実施例５ 化学修飾は、ｐ２１ｓａＲＮＡの細胞増殖抑制効果を増強する＞
ｓａＲＮＡによるｐ２１の誘導は、ｐ２１タンパク質などのさまざまな腫瘍抑制因子の、がん細胞の増殖抑制効果によるものであることが知られる。がん細胞の機能に対する化学修飾されたｓａＲＮＡの影響を評価するために、１０ｎＭの修飾されないおよび修飾されたｓａＲＮＡを、細胞（Ｋｕ－７－ＬＧおよびＴ２４）に７２時間トランスフェクトし、ＣＣＫ８法によって、細胞増殖能を測定した。図８Ａ～８Ｂに示すように、二つの細胞系において、Ｒａｇ１－４０が、４０～６０％増殖抑制作用を引き起こし、かつほとんどの化学修飾されたＲａｇ１－４０誘導体配列は、全ての両方の細胞に、抑制効果の増強を示した。さらに、ＲＮＡ活性化活性（図７Ａ～７Ｂ）と、細胞増殖抑制活性（図８Ａ～８Ｂ）との間に、相関関係があった。強いｐ２１活性化剤は通常に、強力な細胞生長抑制剤でもある。例えば、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞では、Ｒａｇ１－４０－３２、Ｒａｇ１－４０－３３、とＲａｇ１－４０－３４の弱い細胞増殖抑制活性（図８Ａ）は、それらの弱いＲＮＡ活性化活性と相関した（図７Ａ）。安定性および遺伝子活性化活性のデータから判断すると、ｓａＲＮＡに選択された化学修飾を合理的に使用すると、それを、がん細胞にトランスフェクトする際に、顕著に増強された増殖抑制特性を示すことができ、この増強は、二重鎖体の安定性の向上によってもたらされることを認められる。

ｓａＲＮＡ 二重鎖体の細胞増殖抑制活性に基づいて、次のことがわかる：
１）ｓａＲＮＡ二重鎖体における２’Ｆ、２’ＯＭｅ、とＰＳ修飾の組み合わせ使用が、癌細胞増殖の抑制におけるｓａＲＮＡ二重鎖体の効果を増加する；
２）センスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の２個のＰＳ修飾のホスホジエステル結合は、（ＰＳ修飾を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖（Ｒａｇ１－４０－１７～Ｒａｇ１－４０－３２）と当該修飾のないセンスオリゴヌクレオチド鎖（Ｒａｇ１－４０－１～Ｒａｇ１－４０－１６）を比較することにより）ｓａＲＮＡ二重鎖体の増殖抑制活性を強化した；

３）アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖のリボヌクレオチドを、ＤＮＡに置き換えると、ｓａＲＮＡ二重鎖体の細胞増殖を抑制する活性（例、Ｒａｇ１－４０－８、Ｒａｇ１－４０－１６、Ｒａｇ１－４０－２４、およびＲａｇ１－４０－３２）を低下する；
４）Ｒａｇ１－４０－３およびＲａｇ１－４０－１９を除き、２’Ｆと２’ＯＭｅの修飾組み合わせでアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖上のすべての部位を修飾すると、増殖抑制活性に悪影響する（例えば、Ｒａｇ１－４０－１１、とＲａｇ１－４０－２７）。この４つの二重鎖体は、すべて同じアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃ）を含むが、Ｒａｇ１－４０－１１とＲａｇ１－４０－２７は、２’Ｆ修飾されたセンスオリゴヌクレオチド鎖を含むのに対し、Ｒａｇ１－４０－３とＲａｇ１－４０－１９は、２’ＯＭｅ修飾されたセンスオリゴヌクレオチド鎖を含む。この違いは、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を完全に修飾することによって産生される増殖抑制活性に対する悪影響は、センスオリゴヌクレオチド鎖の２’ＯＭｅ修飾によって打ち消すことができることを示す。

＜実施例６ ｓａＲＮＡの化学修飾は免疫刺激を抑制する＞
オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を妨害することによって疾患の治療に使用されるが、場合によって、オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果が、望ましくない副作用となる。化学修飾されたｓａＲＮＡの免疫刺激効果を評価するために、健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、二本鎖 ｓａＲＮＡと一緒にインキュベートし、２４時間後、処理グループの細胞の上清液中のＩＮＦ－αとＴＮＦ－αレベルを測定した。

図９Ａに示すように、ブランクコントロール（～６０ｐｇ／ｍｌ）と比較して、ポジティブコントロールとする二本鎖オリゴヌクレオチドＲＡＧ１－ＩＳ－１（強力な免疫刺激剤として知られ、その配列は表３にリストされる）で処理した細胞では、ＩＮＦ－αのタンパク質レベル（７０８ｐｇ／ｍｌ）が有意に増加した。化学修飾されないＲａｇ１－４０も、一定の免疫刺激活性を有し、それに処理された細胞内のＩＮＦ－αタンパク質レベルは、１５５ｐｇ／ｍｌに達した。しかし、化学修飾されたＲａｇ１－４０誘導体配列のうち１５個（全体の４６．９％）は、免疫刺激活性の低下を示し、Ｒａｇ１－４０－４、Ｒａｇ１－４０－５、Ｒａｇ１－４０－６、Ｒａｇ１－４０－７、Ｒａｇ１－４０－８、Ｒａｇ１－ ４０－９、Ｒａｇ１－４０－１０、Ｒａｇ１－４０－１１、Ｒａｇ１－４０－１２、Ｒａｇ１－４０－１３、Ｒａｇ１－４０－１５、Ｒａｇ１－４０－１６、Ｒａｇ１－４０－２２、Ｒａｇ１－４０－２７、Ｒａｇ１－４０－２９とＲａｇ１－４０－３２を含む。予想外なことに、Ｒａｇ１－４０と比較して、Ｒａｇ１－４０－２３、Ｒａｇ１－４０－２８、Ｒａｇ１－４０－３０、Ｒａｇ１－４０－３１は、ＩＮＦ－αに対するより強い刺激活性を表し、Ｒａｇ１－４０－３１は、さらに強く、その活性が、活性有することが知られるポジティブコントロール配列（Ｒａｇ１－ＩＳ－１）の活性よりも高かった。図９Ｂに示すように、すべての化学修飾されたＲａｇ１－４０誘導体配列は、ＴＮＦ－α誘導に対して抑制された免疫刺激効果を示し、唯一の例外は、Ｒａｇ１－４０－３であり、その免疫刺激活性は、Ｒａｇ１－４０と比べて変化しなかった。

これらのデータは、ｓａＲＮＡ二重鎖体の化学修飾のさまざまな組み合わせのほとんどは、二重鎖体の免疫刺激効果を抑制することができるが、特定の修飾の順列および組み合わせは、二本鎖ＲＮＡの免疫刺激活性を促進することを示す。このような免疫増強効果は、ある疾患の治療、例えば、膀胱灌流で筋層非浸潤性膀胱がん（ｎｏｎ－ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ、ＮＭＩＢＣ）の治療に価値があり、なぜなら、このようなｓａＲＮＡは、標的遺伝子に直接作用して役割を果たすだけでなく、免疫系を活性化し、腫瘍抑制の効果を達成することもできるからである。

＜実施例７ ｓａＲＮＡの化学修飾は、センスオリゴヌクレオチド鎖によって仲介されるオフターゲット効果を低減する＞
ＲＮＡ活性化では、プロモーターのセンスＤＮＡ鎖の配列と一致する鎖は、センスオリゴヌクレオチド鎖と呼ばれ、潜在的なオフターゲット効果を減らすために、その標的活性を抑制する必要がある。未修飾および修飾されたｓａＲＮＡのオフターゲット効果を評価するために、Ｒａｇ１－４０のセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補する配列を、ｐｍｉｒＧＬＯ デュアル ルシフェラーゼ ベクターのルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ領域にクローニングした。ベクタープラスミドと、ｓａＲＮＡとを、ＣＯＳ－１細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を、溶解し、得られた溶解物のルシフェラーゼ活性を評価した。プライマー配列は、表４を参照する。

図１０に示すように、修飾されないＲａｇ１－４０と比較して、Ｒａｇ１－４０の化学修飾された誘導体配列のほとんどは、完全に抑制されたオフターゲット効果、軽減されたオフターゲット効果、または同様のオフターゲット効果を示した。Ｒａｇ１－４０の３４種類の化学修飾された誘導体配列のうち、９個（２６．５％）の誘導体配列のオフターゲット効果は、完全に抑制され、Ｒａｇ１－４０－１、Ｒａｇ１－４０－３、Ｒａｇ１－４０－４、Ｒａｇ１－４０－５、Ｒａｇ１－４０－１０、Ｒａｇ１－４０－１１、Ｒａｇ１－４０－２２、Ｒａｇ１－４０－２４、Ｒａｇ１－４０－２７を含む；２２個（６４．７％）の誘導体配列、軽減されたオフターゲット効果又は同様のオフターゲット効果を示した（Ｒａｇ１－４０－２、Ｒａｇ１－４０－６、Ｒａｇ１－４０－７、Ｒａｇ１－４０－８、Ｒａｇ１－４０－９、Ｒａｇ１－４０－１２、Ｒａｇ１－４０－１３、Ｒａｇ１－４０－１４、Ｒａｇ１－４０－１５、Ｒａｇ１－４０－１７、Ｒａｇ１－４０－１８、Ｒａｇ１－４０－１９、Ｒａｇ１－４０－２０、Ｒａｇ１－４０－２１、Ｒａｇ１－４０－２３、Ｒａｇ１－４０－２５、Ｒａｇ１－４０－２８、Ｒａｇ１－４０－２９、Ｒａｇ１－４０－３０、Ｒａｇ１－４０－３１、Ｒａｇ１－４０－３３、Ｒａｇ１－４０－３４）。３個（８．８％）だけの誘導体配列は、増強されたオフターゲット効果を有する（Ｒａｇ１－４０－１６、Ｒａｇ１－４０－２６、とＲａｇ１－４０－３２）。

結果は、出願人が使用した化学修飾とその組み合わせが、ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドのオフターゲット効果を低減でき、そのメカニズムは、Ａｇｏがガイド鎖としてセンス鎖をロードするのを防ぐことであることを示した。オフターゲット効果の増加を示した３種類のｓａＲＮＡ二重鎖体については、それのうちの２種類（Ｒａｇ１－４０－１６とＲａｇ１－４０－３２）は、ＤＮＡ修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を有し、かつセンスオリゴヌクレオチド鎖に２’Ｆ修飾を持ち、これは、オリゴヌクレオチド鎖のＤＮＡが、特にそれが、センスオリゴヌクレオチド鎖の２’Ｆ修飾と組み合わせる場合、オリゴヌクレオチド鎖のＤＮＡ修飾は、避けるべき修飾戦略であることを示した。

＜実施例８ 異なる時間で処理した後の化学修飾ｓａＲＮＡ二重鎖体が、膀胱がん細胞に活性化活性を維持する＞
化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体で、異なる時間で処理した後のｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルをさらに評価するために、前記の化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体から２個のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３）をランダムに選択して検出した。ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３を、１０ｎＭの最終濃度でＫｕ－７－ＬＧとＴ２４細胞にトランスフェクトし、トランスフェクト時間はそれぞれ１、２、３、４、７と９日であり、各処理には、２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲは、前記の一般的な実験方法の通りであった。

図１１Ａは、異なる時間で処理されたＫｕ－７－ＬＧ細胞におけるＲＡＧ１－４０－３１およびＲＡＧ１－４０－５３によるｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。コントロールグループと比較して、ＲＡＧ１－４０－３１によるｐ２１ ｍＲＮＡ発現値は、１、２、３、４、７と９日の処理後、それぞれ１．３、１１．４、８．７、６．１、２．６、３．８倍増加し、ＲＡＧ１－４０－５３によるｐ２１ ｍＲＮＡの発現値は、１、２、３、４、７と９日の処理後、それぞれ１．４、１３．０、９．１、４．５、３．２および４．１倍増加した。図１１Ｂは、異なる時間で処理されたＴ２４細胞におけるＲＡＧ１－４０－５およびＲＡＧ１－４０－５３によるｐ２１ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。コントロールグループと比較して、ＲＡＧ１－４０－３１によるｐ２１ ｍＲＮＡ発現値は、１、２、３、４、７と９日の処理後、それぞれ２．１、３．７、４．７、３．３、１．２、１．３倍増加し、ＲＡＧ１－４０－５３によるｐ２１ ｍＲＮＡの発現値は、１、２、３、４、７と９日の処理後、それぞれ２．２、３．５、７．８、４．５、１．２および１．１倍増加した。

これは、ランダムに選択されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３には、処理時間の増加とともに、ｐ２１ ｍＲＮＡの発現値が、徐々に増加し、それぞれに処理の２日と３日後に、ピークに達し、その後、その発現は、減少し始めたが、依然として活性化活性を維持した。

＜実施例９は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二本鎖が、細胞周期の進行を阻止することによって、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞における細胞増殖を抑制する＞
前記の実施例５は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、細胞増殖を抑制できることを示し、細胞増殖抑制のメカニズムを研究するために、本実施例では、フローサイトメトリーを用いて細胞周期の変化を分析した。ランダムに選択されたＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３を、０．１、１、１０と５０ｎＭの最終濃度でＫｕ－７－ＬＧ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクト時間は４８時間であり、各処理には、２つの重複ウェルを使用した。細胞周期検出分析は、上記の一般的な実験方法の通りであった。

図１２は、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞を、異なる濃度のＲＡＧ１－４０－３１およびＲＡＧ１－４０－５３で処理した後、各期間における細胞の百分比である。０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－３１で処理した場合、ＤＮＡ合成前期（Ｇ０／Ｇ１）が占める百分比は、それぞれ６２％、６９％、８１％、および８１％である；０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－３１で処理した場合、ＤＮＡ複製期（Ｓ期）が占める百分比は、それぞれ３２％、２２％、１１％、および６％である；０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－３１で処理した場合、ＤＮＡ分裂後期／有糸分裂期（Ｇ２／Ｍ）が占める百分比は、それぞれ６％、９％、８％、および１３％である。０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－５３で処理した場合、ＤＮＡ合成前期（Ｇ０／Ｇ１）が占める百分比は、それぞれ５７％、６６％、７９％、および７６％である；０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－５３で処理した場合、ＤＮＡ複製期（Ｓ期）が占める百分比は、それぞれ３６％、２４％、１２％、および１６％である；０．１、１、１０、および５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－５３で処理した場合、ＤＮＡ分裂後期／有糸分裂期（Ｇ２／Ｍ）が占める百分比は、それぞれ７％、１０％、９％、および８％である。

これは、ランダムに選択された化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＲＡＧ１－４０－５３が、細胞周期におけるＳ期の複製を阻止することによって、細胞増殖を抑制することを示す。

＜実施例１０は、化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体が、Ｊ８２細胞とＰＢＭＣ細胞の共培養において細胞アポトーシスを促進すること示す。＞
末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、末梢血中に単一核を有する細胞であり、リンパ球、単核細胞、樹状細胞を含む。ＰＢＭＣ細胞が、炎症因子を分泌することで、免疫刺激反応を活性化させ、そして、腫瘍細胞の生長と増殖を抑制することができる。

化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１が、より強い免疫刺激活性を示したことから（実施例６）、この特性を利用して腫瘍細胞の抑制を促進することができると推測した。この仮説を検証するために、本実施例には、ＲＡＧ１－４０－３１二重鎖体を、Ｊ８２細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後に、新鮮な培地に交換し、一定の割合（Ｊ８２細胞：ＰＢＭＣ細胞＝１：４）のＰＢＭＣ細胞を添加するか、あるいは、直接にＰＢＭＣを含まない細胞にコントロールとして交換し、４８時間共培養後に、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキットを用いて、フローサイトメータ上で腫瘍細胞のアポトーシスを検出した。図１３に示すように、Ｊ８２細胞とＰＢＭＣ細胞を、異なる濃度のＲＡＧ１－４０－３１と共培養した後に、フローサイトメトリー分析を行った。ＰＢＭＣフリー細胞培養において、ＲＡＧ１－４０－３１は０．１、１、１０及び２５ｎＭで処理した時、細胞早期アポトーシスが占める百分比は、それぞれ２．３％、２．６％、９．４％及び１５．５％であり、細胞晩期アポトーシスが占める百分比は、それぞれ５．３％、５．２％、６．７％、及び９．１％である。ＰＢＭＣ細胞との共培養において、ＲＡＧ１－４０－３１は０．１、１、１０及び２５ｎＭで処理した時、細胞早期アポトーシスが占める百分比は、それぞれ２．０％、４．５％、３１．５％及び４９．３％であり、細胞晩期アポトーシスが占める百分比は、それぞれ５．６％、７．３％、６．３％、及び５．８％である。結果として、ＰＢＭＣ細胞が存在する場合、特に高トランスフェクション濃度の場合、ＲＡＧ１－４０－３１は、より強い腫瘍細胞の早期アポトーシス発生を促進する活性を有し、これは、特定の化学修飾の組み合わせ及び配列上の分布が、二本鎖ＲＮＡの免疫刺激活性を高め、より高い腫瘍細胞を殺傷する効果を達成できることを示した。

＜実施例１１ 化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体と化学薬物の組み合わせの、Ｊ ８２細胞の増殖に対する相乗抑制作用＞
本実施例では、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１と臨床化学薬物を組み合わせ、組み合わせ投与による癌細胞の抑制効果を評価した。
マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ、ＭＭＣ）は、臨床的に腫瘍を治療するための化学薬物の一種であり、主にＤＮＡ架橋を産生する（癌細胞のＤＮＡに付着する）ことによって、ＤＮＡ合成を抑制し、細胞を分裂させず、最終的に細胞を死亡させる。

バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）は、臨床的に膀胱がんを治療する化学療法薬であり、主に、ＤＮＡトポロジイソメラーゼＩＩと相互作用することによって、ＤＮＡと酵素化合物の間の正常な断裂に影響し、さらにヌクレオシドが核酸に結合することを抑制し、染色体損傷を引き起こし、細胞周期がＧ２期に入るのを阻止する。

図１４ Ａ－１４ Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃとの組み合わせ処理後のＪ８２細胞の相対増殖比である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により０．１－５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１００、１０００、１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が３５％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により５－５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が４３％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により２５ｎＭと５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が２６％未満である。具体的な薬物を組み合わせた後のＪ８２細胞の相対増殖比を表６に示す。

図１４Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。ＣＩ値は０～０．３の間で強い相乗作用を表し、ＣＩ値は０．３～０．７の間で相乗作用を表す。具体的なＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃの組み合わせインデックスを表７に示す。

図１５Ａ－１５Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＶａｌｒｕｂｉｃｉｎとの組み合わせ処理後のＪ８２細胞の相対増殖比である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１を０．１－５０ｎＭで処理した場合、Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎは１０００ｎＭと１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が３０％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１を２５ｎＭと５０ｎＭで処理した場合、Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が３０％未満である。具体的な薬物を組み合わせた後のＪ８２細胞の相対増殖比を表８に示す。

図１５Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。ＣＩ値は０～０．３の間で強い相乗作用を表し、ＣＩ値は０．３～０．７の間で相乗作用を表す。具体的なＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃの組み合わせインデックスを表９に示す。

上記の結果は、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１が、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃやｖａｌｒｕｂｉｃｉｎと組み合わせることにより相乗効果があり、組み合わせることでより良いＪ８２腫瘍細胞抑制効果が得られることを示した。

＜実施例１２ 化学修飾されたｓａＲＮＡ二重鎖体と化学薬物の組み合わせが、Ｔ２４細胞の増殖に対する相乗抑制作用＞
化学薬物の情報は実施例１０に記載される。
図１６Ａ－１６Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃとの組み合わせ処理後のＴ２４細胞の相対増殖比である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により０．１－５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が１８％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により５－５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が４０％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により２５ｎＭと５０ｎＭで処理した場合、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が２１％未満である。具体的な薬物を組み合わせた後のＴ２４細胞の相対増殖比を表１０に示す。

図１６Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。ＣＩ値は０～０．３の間で強い相乗作用を表し、ＣＩ値は０．３～０．７の間で相乗作用を表す。具体的なＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃの組み合わせインデックスを表１１に示す。

図１７Ａ－１７Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎとの組み合わせ処理後のＴ２４細胞の相対増殖比である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により０．１－５０ｎＭで処理した場合、ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎは１０００ｎＭと１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が６０％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により５－５０ｎＭで処理した場合、ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎは１、１０、１００、１０００と１００００ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が４０％未満である。ｓａＲＮＡ ＲＡＧ１－４０－３１により２５ｎＭと５０ｎＭで処理した場合、ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎは１、１０、１００、１０００と１００００ ｎＭの薬物濃度で処理した後、細胞の相対増殖比が２１％未満である。具体的な薬物を組み合わせた後のＴ２４細胞の相対増殖比を表１２に示す。

図１７Ｃは、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１とｖａｌｒｕｂｉｃｉｎを組み合わせ使用する組み合わせインデックス（ＣＩ）である。ＣＩ値は０～０．３の間で強い相乗作用を表し、ＣＩ値は０．３～０．７の間で相乗作用を表す。具体的なＲＡＧ１－４０－３１とＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃの組み合わせインデックスを表１３に示す。

上記の結果は、化学修飾されたＲＡＧ１－４０－３１が、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃやｖａｌｒｕｂｉｃｉｎと組み合わせることにより相乗効果があり、組み合わせることでより良いＴ２４腫瘍細胞抑制効果が得られることを示した。

＜引用による組み込み＞
本願が引用する各特許文献及び科学文献の全ての開示内容は、全ての目的のために参照により本願に組み込まれる。

＜均等＞
本願は、その基本的な特徴を逸脱することなく他の具体的な形態で実施することができる。したがって、上記実施例は、本願に記載された本願の制限ではなく、例示的であるとみなされる。本願の範囲は、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって表され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内に含まれるすべての変更を包含することを意図する。

＜参考文献＞
［１］ Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰｓ） ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ９９，Ｐａｒｔ Ａ，１ Ａｐｒｉｌ ２０１６，ｐ１２９－１３７；
［２］ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｔ ｔｈｅ Ｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌｓ ａｆｔｅｒ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２０１１ Ａｕｇ；５９（８）：７２７－７４０．
［３］ ＷＯ２０１７１９２６７９Ａ１
［４］ ＵＳ２０１９０２４０３５４Ａ１
［５］ ＵＳ２０１９０３３６４５２Ａ１
［６］ ＵＳ２０１６００３８６１２Ａ１

Claims (49)

1. 化学修飾された低分子活性化ＲＮＡであって、前記の低分子活性化ＲＮＡが、センスオリゴヌクレオチド鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖からなり、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーター配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の相同性又は相補性を有する；前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の２個のヌクレオチドは、どちらも化学修飾されたヌクレオチドであり、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一個の化学修飾されたヌクレオチドを有することを特徴とする化学修飾された低分子活性化ＲＮＡ。
2. 前記の化学修飾は、以下の修飾方式から選ばれる一つ又は複数であることを特徴とする請求項１に記載された低分子活性化ＲＮＡ：
   ａ）ヌクレオチドのリボースの化学修飾；
   ｂ）ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾；
   ｃ）ヌクレオチドの塩基の化学修飾；
   ｄ）ヌクレオチドは、ロックド核酸である；及び
   ｅ）５’－末端ヌクレオチドのビニルホスホネート修飾。
3. 前記のヌクレオチドのリボースの化学修飾は、ヌクレオチドペントースのヒドロキシル（２’－ＯＨ）の修飾を含むことを特徴とする請求項１－２のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
4. 前記のヌクレオチドのリボースの化学修飾は、ヌクレオチドのリボース２’－ＯＨは、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチル、２，４’－ジニトロフェノール、ロックド核酸、２’－アミノ修飾、２’－Ｈの中の一つ又は複数に置換されるものを含むことを特徴とする請求項１－３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
5. 前記のヌクレオチドの塩基の化学修飾は、５’－ブロモウラシル修飾、５’－ヨードウラシル修飾、Ｎ－メチルウラシル修飾及び／又は２，６－ジアミノプリン修飾を含むことを特徴とする請求項１－４のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
6. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合の少なくとも一個は、請求項１－５のいずれか一つに記載される化学修飾を有することを特徴とする請求項１－５のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
7. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、それぞれに、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子が、硫黄とボランに置換された；及び／又は、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート（ＰＳ）修飾されたことを特徴とする請求項１－６のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
8. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一個の化学修飾されたヌクレオチドを含有し、前記の化学修飾は、前記のヌクレオチドのリボース２’－ＯＨの化学修飾、前記のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾、前記のヌクレオチドの塩基の化学修飾、いずれか一つの前記のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）に置換された化学修飾、及び／又は、前記のセンスオリゴヌクレオチドの５’－末端のヌクレオチドにビニルホスホネート修飾を行った化学修飾を含むことを特徴とする請求項１－７のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
9. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端あるいは５’末端の最後の２個のホスホジエステル結合の少なくとも一個は、請求項１－５のいずれか一つに記載される化学修飾を有することを特徴とする請求項１－８のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
10. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び／又は５’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート修飾及び／又はボラノホスフェート修飾を含有することを特徴とする請求項１－９のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
11. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも一個の化学修飾されたヌクレオチドを含有し、前記の化学修飾は、前記のヌクレオチドのリボース２’－ＯＨの化学修飾、前記のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の化学修飾、前記のヌクレオチドの塩基の化学修飾、いずれか一つの前記のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）に置換された化学修飾、及び／又は、前記のセンスオリゴヌクレオチドの５’－末端のヌクレオチドにビニルホスホネート修飾を行った化学修飾を含むことを特徴とする請求項１－１０のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
12. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び／又は５’末端のヌクレオチドは、リボース２’－ＯＨの化学修飾を有することを特徴とする請求項１－１１のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
13. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の中央の１－５個のヌクレオチドが、リボース２’－ＯＨの化学修飾を有することを特徴とする請求項１－１２のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
14. 前記のリボース２’－ＯＨの化学修飾は、２’－フルオロ修飾を含むことを特徴とする請求項１－１３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
15. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖、及び／又は前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、２’－フルオロ修飾、２’－メトキシ修飾とホスホロチオエート修飾（ＰＳ）の三つの修飾の組み合わせを採用することを特徴とする請求項１－１４のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
16. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、リボースヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドに置換することができる修飾を含有しないことを特徴とする請求項１－１５のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
17. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の２個のヌクレオチドと３’末端の２個のヌクレオチドの間に、前記の化学修飾されたヌクレオチドの割合は、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であり、または化学修飾されたヌクレオチドを完全に含まないことを特徴とする請求項１－１６のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
18. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最後の２個のホスホジエステル結合は、どちらもホスホロチオエート修飾及び／又はボラノホスフェート修飾であることを特徴とする請求項１－１７のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
19. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、あるいは１００％のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾及び／又は２’－メトキシ修飾の化学修飾を採用し、かつ、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個の２’－メトキシ修飾を採用することを特徴とする請求項１－１８のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
20. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、以下の組み合わせの１つまたは複数の基と複合することを特徴とする請求項１－１９のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ：脂質、脂肪酸、蛍光基、リガンド、糖類、高分子化合物、ポリペプチド、抗体、及びコレステロール。
21. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の一つ又は二つは、どちらも、６個、５個、４個、３個、２個、１個又は０個ヌクレオチドの突出を有し、前記の突出は、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖又は前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端又は３’末端、又は５’末端と３’末端に位置することを特徴とする請求項１－２０のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
22. 前記の突出は、ｄＴｄＴ又はｄＴｄＴｄＴであり、又は標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一又は相補するヌクレオチド、又は標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一でも相補もしないヌクレオチドであることを特徴とする請求項１－２１のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
23. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の長さは、それぞれに、１７－３０個のヌクレオチドであり、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖が形成する塩基を相補する二重鎖領域は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個のヌクレオチド長さであることを特徴とする請求項１－２２のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
24. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖３’又は５’領域の、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’又は３’領域に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在し、または、前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’末端又は５’末端の、標的遺伝子に対応するヌクレオチドには、１～３個のヌクレオチドのミスマッチが存在し、または、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の３’又は５’末端の、標的遺伝子に対応するヌクレオチドには、１－３個のヌクレオチドのミスマッチが存在することを特徴とする請求項１－２３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
25. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｃ、とＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄの四種類のパターンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１－２４のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
26. 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｉ、とＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊの十種類のパターンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１－２５のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
27. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｃ、とＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄの四種類のパターンからなる群から選ばれ、かつ前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ａ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｂ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｃ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｄ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｅ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｆ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｈ、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｉ、とＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｊの十種類のパターンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１－２６のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
28. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－Ｓ６Ｄに示されるパターンであり、且る前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の化学修飾は、ＲＡＧ１－ＳＳ－ＡＳ２Ｇに示されるパターンであることを特徴とする請求項１－２７のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
29. 前記の標的遺伝子は、ヒトｐ２１^WAF1/CIP1遺伝子（Ｐ２１遺伝子）を含むことを特徴とする請求項１－２８のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
30. 前記の低分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的することを特徴とする請求項２９に記載される低分子活性化ＲＮＡ。
31. 前記の低分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１４、１５、１６からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２９－３０のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
32. 前記の低分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１１、１２、１３、１８、１９からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２９－３１のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
33. 前記のセンスオリゴヌクレオチド鎖と前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列は、
    １） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    ２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    ３） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    ４） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    ５） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    ６） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    ７） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    ８） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    ９） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    １０） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    １１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    １２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    １３） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    １４） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    １５） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    １６） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    １７） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    １８） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    １９） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    ２０） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    ２１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    ２２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    ２３） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    ２４） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    ２５） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    ２６） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    ２７） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    ２８） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    ２９） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    ３０） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    ３１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    ３２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    ３３） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；と
    ３４） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
    からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２９－３２のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ。
34. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡをコードするフラグメントを含むことを特徴とする核酸分子。
35. 前記の核酸分子は、発現ベクターであることを特徴とする請求項３４に記載される核酸分子。
36. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子を含むことを特徴とする細胞。
37. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、と任意の、薬学に許容される担体を含むことを特徴とする医薬品組成物。
38. 前記の薬学に許容される担体は、脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＬＮＰ）を含むことを特徴とする請求項３７に記載される医薬品組成物。
39. 前記の脂質ナノ粒子の組分は、ＤＬＩＮ－ＫＣ２－ＤＭＡ及び／又はＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含むことを特徴とする請求項３８に記載される医薬品組成物。
40. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、及び低分子医薬品を含むことを特徴とする組み合わせ医薬組成物。
41. 前記の低分子医薬品は、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）又はバルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）から選ばれることを特徴とする請求項４０に記載される組み合わせ医薬組成物。
42. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、又は請求項３６に記載される細胞、又は請求項３７－３９のいずれか一つに記載される医薬品組成物、及び／又は請求項４０－４１のいずれか一つに記載される組み合わせ医薬組成物を含むことを特徴とする製剤。
43. 請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、又は請求項３６に記載される細胞、又は請求項３７－３９のいずれか一つに記載される医薬品組成物、請求項４０－４１のいずれか一つに記載される組み合わせ医薬組成物、及び／又は請求項４２に記載される製剤を含むことを特徴とするキット。
44. 免疫刺激活性を有する医薬品の調製における請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、又は請求項３６に記載される細胞、又は請求項３７－３９のいずれか一つに記載される医薬品組成物、請求項４０－４１のいずれか一つに記載される組み合わせ医薬組成物、及び／又は請求項４２に記載される製剤の使用。
45. 細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする医薬品又は製剤の調製における請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、又は請求項３６に記載される細胞、又は請求項３７－３９のいずれか一つに記載される医薬品組成物、請求項４０－４１のいずれか一つに記載される組み合わせ医薬組成物、及び／又は請求項４２に記載される製剤の使用。
46. 悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製であることを特徴とする請求項４５に記載される使用。
47. 膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、または結腸直腸がんを予防、治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製であることを特徴とする請求項４５－４６に記載される使用。
48. 必要がある個体に、請求項１－３３のいずれか一つに記載される低分子活性化ＲＮＡ、又は請求項３４－３５のいずれか一つに記載される核酸分子、又は請求項３６に記載される細胞、又は請求項３７－３９のいずれか一つに記載される医薬品組成物、請求項４０－４１のいずれか一つに記載される組み合わせ医薬組成物、及び／又は請求項４２に記載される製剤を投与することを含むことを特徴とする悪性腫瘍又は良性増殖病変を予防、治療又は緩和する方法。
49. 前記の悪性腫瘍は、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がんと結腸直腸がんから選ばれることを特徴とする請求項４８に記載される方法。