CN106581676B - 癌症标志物、治疗癌症的药物组分及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于癌症诊断治疗用微RNA技术领域,具体涉及一种癌症标志物、治疗癌症的药物组分及用途,其含有miR‑4767的反义核苷酸miR‑4767 ASO,或者经过修饰或含有错配碱基。用于治疗癌症的药物组分作为下调靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、MOB1A、STK11、PHLDA3、BBC3和MAD2L2的表达水平的药物。本发明通过筛选核酸药库发现miR‑4767的反义核酸能够特异性杀死多种癌细胞,本发明还证明了修饰的miR‑4767的反义核酸(包括硫代修饰、LNA修饰等)能更好的杀死癌细胞,含错配碱基的miR‑4767的反义核酸也能部分抑制miR‑4767的功能。因此相信miR‑4767是治疗癌症的一个新的好靶点,且miR‑4767的抑制剂(包括他的反义核酸和干扰RNA)很可能能治疗和/或预防癌症,比如肝癌和肺癌,从而带来巨大的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于癌症诊断治疗用微RNA技术领域,具体涉及一种癌症标志物、治疗癌症的药物组分及用途。
背景技术
微RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为16-25nt的非编码RNA分子(www.mirbase.org),能通过与靶基因部分互补配对来识别并沉默靶基因的RNA 表达和/或蛋白表达。成熟的微RNA装载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)上后,通过碱基配对来与靶基因mRNA 3'-UTR中的互补序列相结合,从而引发mRNA的降解和/或抑制其蛋白质的翻译。微RNA 5'端的第二位到第八位的核苷酸被称为“核心序列”,这七个核苷酸与靶基因的互补配对是识别靶基因的关键,配对程度越高,结合和调节靶基因的可能性和能力越大。同时微RNA“核心序列”之外的其它序列与靶基因的互补配对也能增强其结合和调控靶基因的能力。正是由于微RNA是通过非完全配对来识别和调节靶基因的表达,才使得一个微RNA能在一个细胞内同时不同程度地调节多个靶基因。
越来越多的文献报道微RNA在癌症的发生、转移起重要的功能,而且抑制或过表达一些微RNA能够抗癌。因此,十分有必要开发基于微RNA的抗癌药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基于微RNA的抗癌药物。
为了实现上述目的,第一方面,本发明提供了抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用。
第二方面,本发明还提供了一种miR-4767抑制剂,其中,所述miR-4767抑制剂为miR-4767的反义寡核苷酸、miR-4767的小干扰RNA和抑制miR-4767的启动子活性的核苷酸及其类似物。
第三方面,本发明还提供了一种抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767 的靶基因的表达的方法,该方法包括:将miR-4767抑制剂与表达miR-4767的靶细胞接触,其中,所述miR-4767抑制剂为上述miR-4767抑制剂。
第四方面,本发明还提供了一种药物组合物,其中,该药物组合物含有上述 miR-4767抑制剂以及药学上可接受的载体。
第五方面,本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法,其中,该方法包括:抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达;或者将上述 miR-4767抑制剂和/或上述药物组合物给药至受试者。
第六方面,本发明还提供了上述miR-4767抑制剂、上述抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达的方法、上述药物组合物、上述预防和/ 或治疗癌症的方法在抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达中的应用。
第七方面,本发明还提供了上述miR-4767抑制剂、上述药物组合物在制备用于抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达的药物中的应用。
具体地,抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达在预防和 /或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用,或者在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物和/或食品中的应用;
所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种;
miR-4767具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;
所述miR-4767的靶基因为GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、MOB1A、STK11、PHLDA3、 BBC3和MAD2L2中的至少两种。
一种miR-4767抑制剂,其特征在于,所述miR-4767抑制剂为miR-4767的反义寡核苷酸、miR-4767的小干扰RNA或抑制miR-4767的启动子活性的核苷酸及其类似物;
所述反义寡核苷酸包括反义DNA和反义RNA;
所述反义寡核苷酸与miR-4767互补,且具有12-30个核苷酸的长度,并且具有与miR-4767的5’端的1-8位核苷酸互补的序列。
所述反义寡核苷酸具有如下的核苷酸序列:
a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;
b)在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸且与miR-4767完全互补或部分互补的核苷酸序列;
所述反义寡核苷酸具有在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸且与miR-4767至少具有60%互补的核苷酸序列;
或所述反义寡核苷酸具有至少与miR-4767的5’端的1-8位核苷酸至多具有 2个核苷酸的错配的核苷酸序列;
或所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
或所述反义寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团,所述修饰的核苷酸基团为硫代修饰的核苷酸基团和/或锁核酸修饰的核苷酸基团;所述反义寡核苷酸具有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列,且其中5’端1-5位和18-23位的核苷酸基团被硫代修饰。
所述miR-4767抑制剂为miR-4767的小干扰RNA;
所述小干扰RNA含有至少一个修饰的核苷酸基团;
所述修饰的核苷酸基团为二甲氧基修饰的核苷酸基团和/或短肽修饰的核苷酸基团。
本发明通过将miR-4767抑制剂与过高表达miR-4767的靶细胞进行接触,能够充分抑制miR-4767的功能(包括抑制miR-4767与其靶基因的结合或者降低 miR-4767的表达量,从而抑制miR-4767的功能)和/或促进其靶基因(GRAMD4、 BRI3BP、TNFSF15、MOB1A、STK11、PHLDA3、BBC3和MAD2L2)中的至少两种的表达。这说明当将该抑制剂用于个体给药时,能够有效的预防和/或治疗miR-4767 过高表达和/或其靶基因(GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、MOB1A、STK11、PHLDA3、 BBC3和MAD2L2)中的至少两种过低表达所引起的疾病,例如,各种癌症或与其症状相似的疾病,特别是肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1:显示miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)能比PLK1的SiRNA更能杀死HuH-7肝癌细胞。
图2:显示miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)能比PLK1的SiRNA更能杀死HepG2肝癌细胞。
图3:显示miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)能比PLK1的SiRNA更能杀死HepG2肺癌细胞。
图4:显示miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)不影响正常人成纤维细胞的生长。
图5:显示miR-4767结合在靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、BBC3、 MOB1A、STK11和MAD2L2的UTR上的位点以及miR-4767通过这些位点对靶基因表达的抑制效果。
图6:显示miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)能抑制miR-4767的功能,并且含有错配碱基的miR-4767的反义核苷酸(mismatch miR-4767 ASO)也能部分抑制miR-4767的功能。
图7:显示硫代修饰的miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)杀死癌细胞HuH-7的效果更好。
具体实施方式
以下结合附图,以具体实施例对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
第一方面,本发明提供了抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用,特别是在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物和/或食品中的应用。
在本发明中,术语“抑制miR-4767的功能”是指抑制miR-4767与其靶基因的结合或者降低miR-4767的表达量。
在本发明中,所述癌症可以为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
在优选的情况下,miR-4767具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在本发明中,所述miR-4767的靶基因可以为GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、 PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种。
第二方面,本发明还提供了miR-4767抑制剂,该miR-4767抑制剂可以抑制 miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达,其包括但不限于以下几种:
1)小分子化合物
miR-4767抑制剂包括但不局限于自然存在或人工合成的小分子化合物,这类小分子化合物直接作用于miR-4767而使得被miR-4767调节的靶基因的表达量升高,通常是分子量大于50且小于2500道尔顿的有机化合物。这类候选化合物拥有与蛋白质,特别是氢键相互作用的功能基团,且通常包含至少一种胺,羰基,羟基或羧基基团。这些小分子miR-4767抑制剂可以通过合适的筛选方法或其它方法被发现。
2)反义寡核苷酸
所述反义寡核苷酸能通过与miR-4767的直接结合来抑制miR-4767的功能,进而促进miR-4767的靶基因的表达,所述反义寡核苷酸包括反义RNA和反义DNA。优选的,所述反义寡核苷酸与miR-4767互补,具有12-30个核苷酸的长度,并且具有至少与miR-4767的5’端的1-8位核苷酸互补的序列。
本领域公知的是,微RNA能通过与靶基因部分互补配对来识别并沉默靶基因的表达和/或翻译,同理的,miR-4767也能够通过结合与其部分互补的核苷酸序列而竞争性抑制其自身的功能,从而上调miR--6069的靶基因的表达。因此,本发明中,术语“互补”不仅包括完全互补,还包括部分互补(或非完全互补)。另外,60%互补是指以miR-4767的序列为基准,与其中的60%的碱基互补。
因此,所述反义寡核苷酸具有如下的核苷酸序列:
a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;
b)在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸且与miR-4767完全互补或部分互补的核苷酸序列。
当在非完全互补的情况下,也即,当所述反义寡核苷酸为通过在SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸得到的核苷酸序列的情况下,在互补核苷酸区域内,所述反义寡核苷酸优选该与miR-4767至少具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的互补。更为优选的,在miR-4767 的5’端的1-8位的核苷酸区域内,所述反义寡核苷酸至多具有2个核苷酸的错配。
如上所述的,在所述反义寡核苷酸与miR-4767非完全互补的情况下,进一步优选的,与SEQ ID NO:2相比,在长度上将至多有10个、9个、8个、7个、 6个、5个、3个、2个或1个核苷酸的差别。
在一种优选的情况下,与miR-4767非完全互补的反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:5所述的核苷酸序列。
另外,本发明还包括对所述反义寡核苷酸进行一些常规的修饰以改善所述反义寡核苷酸的稳定性和活性,这些均属于本发明的范围。
在本发明中,所述反义寡核苷酸含有核苷酸基团(或核苷酸残基)作为基本结构单元,所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基,优选情况下,所述反义寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰的核苷酸基团不会导致所述反义寡核苷酸抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达的功能丧失。
在本发明中,所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和/或核糖基团被修饰的核苷酸基团。例如,磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰,包括硫代修饰、硼烷化修饰等。如下式所示分别用硫和硼烷置换磷酸基团中的氧。磷酸基团被修饰能够稳定核酸的结构,保持碱基配对的高特异性和高亲和力。优选地,硫代修饰的核苷酸基团是指其中所有的磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子的核苷酸基团。
核糖基团的修饰是指对核糖基团中2’-羟基(2’-OH)的修饰。在核糖基团的2’-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后,使核糖核酸酶不易切割核酸,由此增加了核酸的稳定性,使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2’-羟基的修饰包括2’-氟修饰(2′-fluro modification)、2’- 甲氧基修饰(2’-OME)、2’-甲氧乙基修饰(2’-MOE)、2’-2,4-二硝基苯酚修饰(2’-DNP modification)、锁核酸修饰(LNA modification)、2’-氨基修饰 (2′-Amino modification)、2’-脱氧修饰(2’-Deoxy modification)等。
在优选的情况下,所述反义寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团,所述修饰的核苷酸基团为硫代修饰的核苷酸基团和/或锁核酸修饰的核苷酸基团;更优选地,所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,且其中5’端1-5位和17-21位的核苷酸基团中的磷酸基团被硫代修饰。
本发明需要指出的是,具有如上的特性的完全或非完全互补的RNA也在本发明的保护范围内。综合考虑在细胞内的稳定性,本发明优选所述反义寡核苷酸为 DNA。
3)RNAi试剂
本领域公知的是,RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi试剂可以是小干扰RNA分子,通常是一条理论上可以形成小发夹(smallhairpin)结构的单链脱氧寡核苷酸(shRNA),其长度一般不会超过100个核苷酸,典型的不会超过75个核苷酸;或者是一条15-30bp的双链脱氧寡核苷酸 (siRNA),最典型的是20-23bp。
在一些应用中,RNAi试剂也可以是编码shRNA或者siRNA的模板DNA。这些模板DNA可能存在于载体,比如质粒载体或病毒载体等载体中;也可以不存在与载体中,只是一段编码shRNA或者siRNA的模板DNA加一个控制其转录的常见启动子序列片段。
在本发明中,所述miR-4767抑制剂为miR-4767的小干扰RNA;优选地,所述小干扰RNA含有至少一个修饰的核苷酸基团(修饰方式可以参照反义寡核苷酸部分);更优选地所述修饰的核苷酸基团为二甲氧基修饰的核苷酸基团和/或短肽修饰的核苷酸基团。
4)抑制启动子活性的核苷酸及其类似物
本发明所述的miR-4767抑制剂还可以包括抑制miR-4767的启动子活性的核苷酸及其类似物。具体地,所述抑制miR-4767的启动子活性的核苷酸及其类似物能够与miR-4767的启动子相结合,并抑制其启动子活性,例如,吗啉基 (morpholino)修饰的核苷酸及其类似物。
第三方面,本发明还提供了一种抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767 的靶基因的表达的方法,该方法包括:将miR-4767抑制剂与表达miR-4767的靶细胞接触,其中,所述miR-4767抑制剂的具体类型可以如上所述,为了避免不必要的重复,在此不再详细赘述。优选地,所述miR-4767的靶基因为GRAMD4、 BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种。
在本发明中,当所述miR-4767抑制剂为上述反义寡核苷酸时,由于所述反义寡核苷酸能够与miR-4767互补(完全互补或部分互补),因此,当所述反义寡核苷酸在体内或体外与表达miR-4767的靶细胞接触时,所述反义寡核苷酸能够与miR-4767进行互补配对,并抑制miR-4767与其靶基因的结合(也即,抑制 miR-4767的活性),从而打破了miR-4767对其靶基因的沉默。
在本发明中,所述方法包括将有效量的和miR-4767互补的反义寡核苷酸引入到表达miR-4767的靶细胞中。其中,所述“有效量”根据表达miR-4767的靶细胞的不同而有所不同,并且呈现出一定的剂量效应,本领域技术人员根据常规的实验手段以及所达到的预期目的能够容易的确定针对表达miR-4767的靶细胞的有效量。
当所述接触为体内接触时,可以通过常规的核酸给药的方式将本发明的反义寡核苷酸给药至个体中。例如,可以使用如下的方式进行所述反义寡核苷酸的给药:所述反义寡核苷酸可以通过病毒感染、微注射、或者囊泡融合的方式进行给药,或者也可以通过射流注射的方式用于所述反义寡核苷酸的肌肉给药。另外,也可以将所述反义寡核苷酸涂覆到金微粒上,然后通过粒子轰击设备或“基因枪”等公知方式进行经皮给药。这些均为本领域常规的技术手段,本发明在此不再一一赘述。
再者,还可以以表达载体的方式将所述反义寡核苷酸引入到表达miR-4767 的靶细胞中。这类表达载体具有位于邻近启动子序列的便捷性限制位点以便于所述反义寡核苷酸的插入。其中,位于所述表达载体中的转录盒可以包括转录起始区、靶基因或其片段和转录终止区。所述载体例如可以为但并不限于,质粒,病毒等等,本领域技术人员可以根据实际情况自行进行选择。
此外,所述反义寡核苷酸还可以通过呼吸道喷雾给药的方式从而被引入到表达miR-4767的靶细胞中,例如通过制备成喷雾制剂的方式给药。
另外,所述反义寡核苷酸还可以通过口服给药的方式从而被引入到表达 miR-4767的靶细胞中,例如通过制备成口服制剂的方式给药,或是通过将所述反义寡核苷酸与食品混合的方式进行口服给药。
当所述接触为体外接触时,可以通过将所述反义寡核苷酸或含有所述反义寡核苷酸的载体(例如,含有所述反义寡核苷酸的药物)直接加入到培养有表达 miR-4767的靶细胞的基质中进行接触,并在常规的细胞培养条件下对导入有所述反义寡核苷酸的表达miR-4767的靶细胞进行培养。
在本发明中,当所述miR-4767抑制剂为上述RNAi试剂时,所述方法包括将有效量的miR-4767的小干扰RNA引入到表达miR-4767的靶细胞中。所述RNAi 试剂与表达miR-4767的靶细胞的接触也可以为体内接触或是体外接触。所述 RNAi试剂的有效量和给药方法可以参照如上对反义寡核苷酸的描述进行,为了避免不必要的重复,本发明在此不再详细赘述。
第四方面,本发明还提供了一种药物组合物,其中,该药物组合物含有上述 miR-4767抑制剂以及药学上可接受的载体。
在本发明的药物组合物中,作为活性成分的如上所述的miR-4767抑制剂的含量可以在较大的范围内变化,例如,可以为0.001-99.99重量%,优选为0.01-99 重量%,更优选为1-70重量%,进一步优选为5-30重量%。
在本发明中,所述药物组合物可以制备为本领域常规的各种剂型,本发明对此并没有特别的限制,例如,可以配制成固体,半固体,液体或气体形式的,例如,片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉末、颗粒、软膏、栓剂、注射剂、吸入剂、气溶胶等等,本发明在此不再一一列举。
因此,根据药物剂型的不同也可以进行多种形式的给药,例如但不限于,口服给药、经颊给药、直肠给药、胃肠外给药、腹膜内给药、呼吸道吸入给药、皮内给药、经皮给药。
其中,所述药学上可接受的载体可以根据剂型的不同而进行不同的选择,这些均是本领域技术人员所公知的。例如但不限于,所述药学上可接受的载体可以为淀粉、胶质、乳糖、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠、海藻酸等等。
另外,还可以加入常规的添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
另外,所述药学上可接受的载体还可以包括能够提高所述反义寡核苷酸靶向特定器官或组织或细胞的靶向试剂,所述靶向试剂例如可以为靶向肽,还可以包括能够携带所述反义寡核苷酸更容易进入表达miR-4767的靶细胞的穿膜试剂,例如穿膜肽,脂质体,微囊泡和膜脂蛋白等。
在本发明中,所述药物组合物中还可以添加有调味剂,例如,薄荷、冬青油等等。另外,还可以在所述药物组合物中添加着色剂以使所制备的剂型在外观上具有一定的吸引力,或者与其他产品进行区别。
在本发明中,所述反义寡核苷酸还可以与其他能够起到类似作用的常规药物进行联合以制备成联合药物组合物。
第五方面,本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法,该方法包括:抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达;或者将上述 miR-4767抑制剂和/或上述药物组合物给药至受试者。
在本发明中,所述给药的有效量、方式和剂型如上所述,在此不再赘述。
在优选的情况下,所述受试者为肝癌受试者、肺癌受试者和皮肤癌受试者中的至少一者;更优选地,所述受试者的体内表达miR-4767和/或miR-4767的靶基因;进一步优选地,在所述受试者的体内,miR-4767过高表达和/或miR-4767 的靶基因过低表达;更进一步优选地,所述miR-4767的靶基因为GRAMD4、BRI3BP、 TNFSF15、PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种。
第六方面,本发明还提供了上述miR-4767抑制剂、上述抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达的方法、上述药物组合物、上述预防和/ 或治疗癌症的方法在抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达中的应用;特别是在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用;优选地,所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种;更优选地,所述miR-4767 的靶基因为GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2 中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种。
第七方面,本发明还提供了上述miR-4767抑制剂、上述药物组合物在制备用于抑制miR-4767的功能和/或促进miR-4767的靶基因的表达的药物中的应用;特别是在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物中的应用;优选地,所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种;更优选地,所述miR6069 的靶基因为GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2 的至少两种。
在本发明中,所述治疗是指受试者与由miR-4767引起的疾病或状态相关的症状的改善或完全消失,其中,广泛的意义上的改善是指降低或升高至少一个参数。具体到本申请,例如,可以为miR-4767的靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、 PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种的表达升高。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1筛选发现hsa-miR-4767(>hsa-miR-4767MIMAT0019919
5’CGCGGGCGCUCCUGGCCGCCGCC3’)的反义核酸(hsa-miR-4767 ASO, 5’GGCGGCGGCCAGGAGCGCCCGCG3’)能杀死癌细胞,诸如肝癌、肺癌等,并且不影响人正常成纤维细胞的生长。
委托英维骏杰(Invitrogen)公司人工化学合成miR-4767的反义寡核苷酸 (miR-4767 ASO,如SEQ ID NO:2所示)和委托吉玛公司合成Polo样激酶1(PKL1) 的siRNA(正义链:如SEQ ID NO:4所示,反义链:如SEQ ID NO:5所示)。
(1)肝癌细胞HuH-7(购自ATCC)和HepG2(购自ATCC)接种在384孔培养板里,培养在50μl含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。用Lipofectamine 2000(Invitrogen) 转染1μM的hsa-miR-4767 ASO(5’GGCGGCGGCCAGGAGCGCCCGCG 3’),或40nM的PKL1的SiRNA(sense strand: 5’AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU3’
Anti-sense:5’UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU3’,抑制PLK1能促使癌细胞凋亡【1】),或阴性对照的随机序列,另有一组为只加转染试剂的对照孔。转染72小时后用4%的多聚甲醛(PFA)固定细胞,并使用DAPI染细胞核后进行细胞计数。结果如图1和图2所示,其中,数据以平均值±标准差表示,n=3,***P<0.001,**P<0.01。与阴性对照组和转染试剂组相比,PKL1的SiRNA能显著杀死癌细胞;而hsa-miR-4767 ASO杀癌细胞的效果比PKL1的SiRNA更好。***P<0.001。并且定量RT-PCR检测发现hsa-miR-4767在HuH-7和HepG2 癌细胞中高表达。参考文献1.Zhao,C.L.,et al.,Downregulation of PLK1 by RNAi attenuates thetumorigenicity of esophageal squamous cell carcinoma cells via promotingapoptosis and inhibiting angiogenesis.Neoplasma.62(5):p.748-55.
(2)用同样的试验方法测试了hsa-miR-4767 ASO是否能杀死肺癌细胞 A549,结果表明转染1μM的hsa-miR-4767 ASO也能显著杀死肝癌细胞A549(如图3)。
(3)miR-4767的反义寡核苷酸对黑色素瘤细胞有同样的抑制作用按照如上步骤(1)的方法进行,所不同的是,使用黑色素瘤细胞 SK-MEL-28(购自ATCC)代替步骤(1)中使用的肝癌细胞HuH-7和 HepG2。
细胞计数的结果表明,与阴性对照组相比,PKL1的siRNA(阳性对照)和miR-4767ASO均可以使SK-MEL-28细胞的个数明显减少;并且,与PKL1的siRNA相比,miR-4767 ASO使SK-MEL-28细胞的个数减少得更多。
(4)用同样的试验方法测试了hsa-miR-4767 ASO是否影响正常的人成纤维细胞。结果表明转染1μM的hsa-miR-4767 ASO对正常的人成纤维细胞的生长没有影响(如图4)。
实施例2发现miR-4767的靶基因在HepG2肝癌细胞中下调
用TargetScan算法预测miR-4767的靶基因,并筛选出与细胞凋亡、抑制肿瘤相关的基因。HepG2肝癌细胞和正常的肝癌细胞用Trizol裂解(Invitrogen),然后按说明书提取出总RNA。用无核酸酶的水溶解RNA,然后用生物分析仪 (bioanalyzer)检测RNA的完整性,用Qubit3测定RNA的浓度。之后用TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit(Illumina/USA)构建cDNA库,并在Hiseq 2500 测序仪(Illumina)上测序。经分析得到在HepG2细胞中表达下调的一组基因,与 miR-4767的靶基因比对发现有八个促凋亡的基因或抑癌基因下调,见表1。
表1:HepG2肝癌细胞中下调的抗癌的miR-4767的靶基因
实施例3 miR-4767直接结合靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、 BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2的UTR上的结合位点来负调节靶基因的表达水平
分别将靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、PHLDA3、BBC3、MOB1A、 STK11和MAD2L2的含有miR-4767结合位点的非翻译区(UTR)的序列(见表 3)直接合成装载到pGL3-SV40载体的火荧光素酶(Fire luciferase)基因3'下游的XbaI位点上,得到各个靶基因的miR-4767感受载体(委托苏州泓迅生物科技有限公司进行)。如果miR-4767能结合到克隆的靶基因的UTR序列上,那么 miR-4767感受载体中火荧光素酶的表达就受miR-4767的负调节。
将人胚肾细胞HEK-293T培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。以每孔10万个细胞的接种量将HEK-293T 细胞接种至24孔细胞培养板中,培养体积为500μl。第二天用脂质体2000 (Invitrogen)按照说明书将如下表2的配置试剂共转染至KEK-293细胞中,36 小时后用双荧光素酶分析试验(Promega)测量从miR-4767感受载体中表达的荧光素酶的活力。每次设置三个重复孔,实验重复三次。
其中,各组别中,miR-4767感受载体的转入量以每孔计:miR-4767感受载体500ng,miR-4767(Pengekiphen,Kunshan)1pmole,control RNA(吉玛公司合成,SEQ ID NO:7:5’-CGUGACACGUUCGGAGAA-3’)1pmole。
表2各组别配置试剂
结果显示:miR-4767能结合在靶基因GRAMD4、BRI3BP、TNFSF15、 PHLDA3、BBC3、MOB1A、STK11和MAD2L2的UTR上的结合位点来抑制靶基因的表达水平,见图5。***P<0.001。**P<0.01。
表3克隆的各基因含miR-4767结合位点的UTR序列
基因 | 克隆的UTR序列(含miR-4767结合位点)5’-3’ |
GRAMD4 | CATTTGTGGAGGGAGCGCCCGCA |
BRI3BP | CCTGACCTCGTGATCCGCCCGCC |
TNFSF15 | CCTGACCTCGTGATCCGCCCGCC |
PHLDA3 | TAGCTGGGATTCAGGCGCCCGCC |
BBC3 | GGGTGGGGACTGAGCCGCCCGCC |
MOB1A | CCTTACCTCGCAATCCGCCCGCC |
STK11 | TCTTCCTGCCGGTTCCGCCCGCC |
MAD2L2 | CCTCTGTGTGTGGATCGCCCGCC |
实施例4 miR-4767的反义核苷酸(miR-4767 ASO)能抑制miR-4767的功能,并且错配的miR-4767的反义核苷酸(mismatch miR-4767 ASO)也能部分抑制 miR-4767的功能。
将人胚肾细胞HEK-293T培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。以每孔10万个细胞的接种量将HEK-293T 细胞接种至24孔细胞培养板中,培养体积为500μL。第二天用脂质体2000 (Invitrogen)按照说明书将如下表4的配置试剂共转染至HEK-293T细胞中, 36小时后用双荧光素酶分析试验(Promega)测量从miR-4767感受载体中表达的荧光素酶的活力。每次设置三个重复孔,实验重复三次。
其中,各组别中,miR-4767感受载体和核苷酸的转入量以每孔计:miR-4767 感受载体(PPM1F UTR)500ng,miR-4767(如SEQ ID NO:1所示,由昆山彭济凯丰生物科技有限公司合成)1pmol,对照核苷酸(control RNA,SEQ ID NO: 7所示;Con DNA,与control RNA序列一致仅仅将U替换为T)1pmol,miR-4767 ASO 1pmol,错配的miR-4767 ASO(如SEQ ID NO:5所示)1pmol。
结果表明:miR-4767 ASO能够完全抑制miR-4767的功能,但随机对照的核苷酸(Control DNA,ConDNA)不能抑制miR-4767的功能。而且含有错配碱基的miR-4767 ASO(mismatch miR-4767 ASO,序列:5’GGCCGCGGCCAGGAGCGCCGCCG 3’)也能部分抑制miR-4767的功能,见图 6。***P<0.001。**P<0.01。
表4各组别配置试剂
实施例5硫代修饰的miR-4767 ASO更能杀死肝癌细胞HuH-7 试验步骤如实施例1中描述,肝癌细胞HuH-7分别被转染1μM的阴性对照随机核酸,或者1μM的miR-4767 ASO,或者1μM的硫代修饰的miR-4767 ASO(5’ GsGsCGGCGGCCAGGAGCGCCCGsCsG 3’)。结果显示硫代修饰的miR-4767 ASO比没有修饰的miR-4767 ASO更能杀死癌细胞,如图7。***P<0.001。**P<0.01。
总结
本发明通过筛选核酸药库发现miR-4767的反义核酸能够特异性杀死多种癌细胞,并证明其机制是通过抑制miR-4767的功能,提高在癌细胞中低表达的miR-4767的靶基因的表达来实现的。诸如能提高促凋亡基因GRAMD4、BRI3BP、 TNFSF15、PHLDA3和BBC3和抑癌基因MOB1A、STK11和MAD2L2等靶基因的表达水平,继而抑制癌细胞的生长和促进癌细胞的凋亡。本发明还证明了修饰的miR-4767的反义核酸(包括硫代修饰、LNA修饰等)能更好的杀死癌细胞,含错配碱基的miR-4767的反义核酸也能部分抑制miR-4767的功能。因此相信 miR-4767是治疗癌症的一个新的好靶点,且miR-4767的抑制剂(包括他的反义核酸和干扰RNA)很可能能治疗癌症,比如肝癌、肺癌和黑色素瘤,从而带来巨大的社会和经济效益。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 昆山彭济凯丰生物科技有限公司
<120> 一种治疗癌症的药物组分及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> has-miR-4767
<400> 1
cgcgggcgcu ccuggccgcc gcc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> miR-4767 ASO
<400> 2
ggcggcggcc aggagcgccc gcg 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> PKL1的SiRNA正义链
<400> 3
agaucacccu ccuuaaauau u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> PKL1的SiRNA反义链
<400> 4
uauuuaagga gggugaucuu u 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 含有错配碱基的miR-4767 ASO
<400> 5
ggccgcggcc aggagcgccg ccg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 硫代修饰的miR-4767 ASO
<400> 6
gsgscggcggcc aggagcgccc gscsg 23
<210> 7
<211> 18
<212> RNA
<213> 对照RNA
<400> 7
cgugacacgu ucggagaa 18
Claims (4)
1.一种miR-4767抑制剂,其特征在于,所述miR-4767抑制剂为miR-4767的反义寡核苷酸;
所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;或所述反义寡核苷酸具有SEQID NO:6所示的核苷酸序列。
2.一种药物组合物,其特征在于,该药物组合物含有权利要求1所述的miR-4767抑制剂以及药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的miR-4767抑制剂和/或权利要求2所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用;所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
4.SEQ ID NO:2所示的miR-4767抑制剂或由SEQ ID NO:2所示的miR-4767抑制剂与药学上可接受的载体组成的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用;所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
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