CN108245527B - 通过miR-1181进行抗癌的方法和药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，公开了通过miR‑1181进行抗癌的方法和药物及其应用。具体地，本发明公开了抑制miR‑1181的功能和/或促进miR‑1181的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用，特别是在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物中的应用。本发明提供的miR‑1181的抑制剂能够充分抑制miR‑1181的功能并促进其靶基因的表达。这说明当将该抑制剂用于个体给药时，能够有效的预防和/或治疗miR‑1181高表达和/或其靶基因过低表达所引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用，一种miR-1181抑制剂，一种抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的方法，一种药物组合物，一种预防和/或治疗癌症的方法，和它们在抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达中的应用，以及它们在制备用于抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的药物中的应用。
背景技术
微RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为16-25nt的非编码RNA分子（www.mirbase.org），能通过与靶基因部分互补配对来识别并沉默靶基因的RNA表达和/或蛋白表达。成熟的微RNA装载到RNA诱导的沉默复合体（RISC）上后，通过碱基配对来与靶基因mRNA 3'-UTR中的互补序列相结合，从而引发mRNA的降解和/或抑制其蛋白质的翻译。微RNA 5'端的第二位到第八位的核苷酸被称为“核心序列”，这七个核苷酸与靶基因的互补配对是识别靶基因的关键，配对程度越高，结合和调节靶基因的可能性和能力越大。同时微RNA“核心序列”之外的其它序列与靶基因的互补配对也能增强其结合和调控靶基因的能力。正是由于微RNA是通过非完全配对来识别和调节靶基因的表达，才使得一个微RNA能在一个细胞内同时不同程度地调节多个靶基因。
越来越多的文献报道微RNA在癌症的发生、转移起重要的功能，而且抑制或过表达某些微RNA能够起到抗癌的作用。因此，十分有必要开发基于微RNA的抗癌药物。
发明内容
本发明的目的是为了开发新的基于微RNA的抗癌药物。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用。
第二方面，本发明还提供了一种miR-1181抑制剂，其中，所述miR-1181抑制剂为miR-1181的反义寡核苷酸、miR-1181的小干扰RNA和抑制miR-1181的启动子活性的核苷酸及其类似物。
第三方面，本发明还提供了一种抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的方法，该方法包括：将miR-1181抑制剂与表达miR-1181的靶细胞接触，其中，所述miR-1181抑制剂为上述miR-1181抑制剂。
第四方面，本发明还提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有上述miR-1181抑制剂以及药学上可接受的载体。
第五方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，其中，该方法包括：抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达；或者将上述miR-1181抑制剂和/或上述药物组合物给药至受试者。
第六方面，本发明还提供了上述miR-1181抑制剂、上述抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的方法、上述药物组合物、上述预防和/或治疗癌症的方法在抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达中的应用。
第七方面，本发明还提供了上述miR-1181抑制剂、上述药物组合物在制备用于抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的药物中的应用。
本发明通过将miR-1181抑制剂与过高表达miR-1181的靶细胞进行接触，能够充分抑制miR-1181的功能（包括抑制miR-1181与其靶基因的结合或者降低miR-1181的表达量，从而抑制miR-1181的功能）和/或促进其靶基因（AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703）中的至少两种的表达。这说明当将该抑制剂用于个体给药时，能够有效的预防和/或治疗miR-1181过高表达和/或其靶基因（AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703）中的至少两种异常表达所引起的疾病，例如，各种癌症或与其症状相似的疾病，特别是肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1显示的是miR-1181的反义寡核苷酸抑制/杀死肝癌细胞HuH-7的结果图；
图2显示的是miR-1181的反义寡核苷酸抑制/杀死肝癌细胞HepG2的结果图；
图3显示的是miR-1181的反义寡核苷酸抑制/杀死肺癌细胞A549的结果图；
图4显示的是miR-1181的反义寡核苷酸对正常的人成纤维细胞的生长影响结果图；
图5显示的是miR-1181的反义寡核苷酸和错配的miR-1181的反义寡核苷酸对miR-1181功能的抑制作用的结果图；
图6显示的是硫代修饰的miR-1181的反义寡核苷酸抑制/杀死肝癌细胞HuH-7的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用，特别是在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物中的应用。
在本发明中，术语“抑制miR-1181的功能”是指抑制miR-1181与其靶基因的结合或者降低miR-1181的表达量。
在本发明中，所述癌症可以为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
在优选的情况下，miR-1181具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述miR-1181的靶基因可以为AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种。
优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC6和HDAC4中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种。
第二方面，本发明还提供了miR-1181抑制剂，该miR-1181抑制剂可以抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达，其包括但不限于以下几种：
1）小分子化合物
miR-1181抑制剂包括但不局限于自然存在或人工合成的小分子化合物，这类小分子化合物直接作用于miR-1181而使得被miR-1181调节的靶基因的表达量升高，通常是分子量大于50且小于2500道尔顿的有机化合物。这类候选化合物拥有与蛋白质，特别是氢键相互作用的功能基团，且通常包含至少一种胺，羰基，羟基或羧基基团。这些小分子miR-1181抑制剂可以通过合适的筛选方法或其它方法被发现。
2）反义寡核苷酸
所述反义寡核苷酸能通过与miR-1181的直接结合来抑制miR-1181的功能，进而促进miR-1181的靶基因的表达，所述反义寡核苷酸包括反义RNA和反义DNA。优选的，所述反义寡核苷酸与miR-1181互补，具有12-30个核苷酸的长度，并且具有至少与miR-1181的5’端1-8位核苷酸互补的序列。
本领域公知的是，微RNA能通过与靶基因部分互补配对来识别并沉默靶基因的表达和/或翻译，同理的，miR-1181也能够通过结合与其部分互补的核苷酸序列而竞争性抑制其自身的功能，从而上调miR-881的靶基因的表达。因此，本发明中，术语“互补”不仅包括完全互补，还包括部分互补（或非完全互补）。另外，60%互补是指以miR-1181的序列为基准，与其中的60%的碱基互补。
因此，所述反义寡核苷酸具有如下的核苷酸序列：
a）SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
b）在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸且与miR-1181完全互补或部分互补的核苷酸序列。
当在非完全互补的情况下，也即，当所述反义寡核苷酸为通过在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中经缺失、取代或添加一个或几个核苷酸得到的核苷酸序列的情况下，在互补核苷酸区域内，所述反义寡核苷酸优选该与miR-1181至少具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的互补。更为优选的，在miR-1181的5’端1-8位的核苷酸区域内，所述反义寡核苷酸至多具有2个核苷酸的错配。
如上所述的，在所述反义寡核苷酸与miR-1181非完全互补的情况下，进一步优选的，与SEQ ID NO：2相比，在长度上将至多有10个、9个、8个、7个、6个、5个、3个、2个或1个核苷酸的差别。
在一种优选的情况下，与miR-1181非完全互补的反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。
另外，本发明还包括对所述反义寡核苷酸进行一些常规的修饰以改善所述反义寡核苷酸的稳定性和活性，这些均属于本发明的范围。
在本发明中，所述反义寡核苷酸含有核苷酸基团（或核苷酸残基）作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，优选情况下，所述反义寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰的核苷酸基团不会导致所述反义寡核苷酸抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的功能丧失。
在本发明中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和/或核糖基团被修饰的核苷酸基团。例如，磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代修饰、硼烷化修饰等，如分别用硫和硼烷置换磷酸基团中的氧。磷酸基团被修饰能够稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。优选地，硫代修饰的核苷酸基团是指其中所有的磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子的核苷酸基团。
核糖基团的修饰是指对核糖基团中2’-羟基（2’-OH）的修饰。在核糖基团的2’-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加了核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2’-羟基的修饰包括2’-氟修饰（2’-fluro modification）、2’-甲氧基修饰（2’-OME）、2’-甲氧乙基修饰（2’-MOE）、2’-2,4-二硝基苯酚修饰（2’-DNP modification）、锁核酸修饰（LNA modification）、2’-氨基修饰（2’-Amino modification）、2’-脱氧修饰（2’-Deoxy modification）等。
在优选的情况下，所述反义寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团，所述修饰的核苷酸基团为硫代修饰的核苷酸基团和/或锁核酸修饰的核苷酸基团；更优选地，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，且其中5’端1-5位和17-21位的核苷酸基团中的磷酸基团被硫代修饰。
本发明需要指出的是，具有如上的特性的完全或非完全互补的RNA也在本发明的保护范围内。综合考虑在细胞内的稳定性，本发明优选所述反义寡核苷酸为DNA。
3）RNAi试剂
本领域公知的是，RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi试剂可以是小干扰RNA分子，通常是一条理论上可以形成小发夹（smallhairpin）结构的单链脱氧寡核苷酸（shRNA），其长度一般不会超过100个核苷酸，典型的不会超过75个核苷酸；或者是一条15-30bp的双链脱氧寡核苷酸（siRNA），最典型的是20-23bp。
在一些应用中，RNAi试剂也可以是编码shRNA或者siRNA的模板DNA。这些模板DNA可能存在于载体，比如质粒载体或病毒载体等载体中；也可以不存在与载体中，只是一段编码shRNA或者siRNA的模板DNA加一个控制其转录的常见启动子序列片段。
在本发明中，所述miR-1181抑制剂为miR-1181的小干扰RNA；优选地，所述小干扰RNA含有至少一个修饰的核苷酸基团（修饰方式可以参照反义寡核苷酸部分）；更优选地所述修饰的核苷酸基团为二甲氧基修饰的核苷酸基团和/或短肽修饰的核苷酸基团。
4）抑制启动子活性的核苷酸及其类似物
本发明所述的miR-1181抑制剂还可以包括抑制miR-1181的启动子活性的核苷酸及其类似物。具体地，所述抑制miR-1181的启动子活性的核苷酸及其类似物能够与miR-1181的启动子相结合，并抑制其启动子活性，例如，吗啉基（morpholino）修饰的核苷酸及其类似物。
第三方面，本发明还提供了一种抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的方法，该方法包括：将miR-1181抑制剂与表达miR-1181的靶细胞接触，其中，所述miR-1181抑制剂的具体类型可以如上所述，为了避免不必要的重复，在此不再详细赘述。
优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种；
优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC6和HDAC4中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种。
在本发明中，当所述miR-1181抑制剂为上述反义寡核苷酸时，由于所述反义寡核苷酸能够与miR-1181互补（完全互补或部分互补），因此，当所述反义寡核苷酸在体内或体外与表达miR-1181的靶细胞接触时，所述反义寡核苷酸能够与miR-1181进行互补配对，并抑制miR-1181与其靶基因的结合（也即，抑制miR-1181的活性），从而打破了miR-1181对其靶基因的沉默。
在本发明中，所述方法包括将有效量的和miR-1181互补的反义寡核苷酸引入到表达miR-1181的靶细胞中。其中，所述“有效量”根据表达miR-1181的靶细胞的不同而有所不同，并且呈现出一定的剂量效应，本领域技术人员根据常规的实验手段以及所达到的预期目的能够容易的确定针对表达miR-1181的靶细胞的有效量。
当所述接触为体内接触时，可以通过常规的核酸给药的方式将本发明的反义寡核苷酸给药至个体中。例如，可以使用如下的方式进行所述反义寡核苷酸的给药：所述反义寡核苷酸可以通过病毒感染、微注射、或者囊泡融合的方式进行给药，或者也可以通过射流注射的方式用于所述反义寡核苷酸的肌肉给药。另外，也可以将所述反义寡核苷酸涂覆到金微粒上，然后通过粒子轰击设备或“基因枪”等公知方式进行经皮给药。这些均为本领域常规的技术手段，本发明在此不再一一赘述。
再者，还可以以表达载体的方式将所述反义寡核苷酸引入到表达miR-1181的靶细胞中。这类表达载体具有位于邻近启动子序列的便捷性限制位点以便于所述反义寡核苷酸的插入。其中，位于所述表达载体中的转录盒可以包括转录起始区、靶基因或其片段和转录终止区。所述载体例如可以为但并不限于，质粒，病毒等等，本领域技术人员可以根据实际情况自行进行选择。
此外，所述反义寡核苷酸还可以通过呼吸道喷雾给药的方式从而被引入到表达miR-1181的靶细胞中，例如通过制备成喷雾制剂的方式给药。
另外，所述反义寡核苷酸还可以通过口服给药的方式从而被引入到表达miR-1181的靶细胞中，例如通过制备成口服制剂的方式给药。
当所述接触为体外接触时，可以通过将所述反义寡核苷酸或含有所述反义寡核苷酸的载体（例如，含有所述反义寡核苷酸的药物）直接加入到培养有表达miR-1181的靶细胞的基质中进行接触，并在常规的细胞培养条件下对导入有所述反义寡核苷酸的表达miR-1181的靶细胞进行培养。
在本发明中，当所述miR-1181抑制剂为上述RNAi试剂时，所述方法包括将有效量的miR-1181的小干扰RNA引入到表达miR-1181的靶细胞中。所述RNAi试剂与表达miR-1181的靶细胞的接触也可以为体内接触或是体外接触。所述RNAi试剂的有效量和给药方法可以参照如上对反义寡核苷酸的描述进行，为了避免不必要的重复，本发明在此不再详细赘述。
第四方面，本发明还提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有上述miR-1181抑制剂以及药学上可接受的载体。
在本发明的药物组合物中，作为活性成分的如上所述的miR-1181抑制剂的含量可以在较大的范围内变化，例如，可以为0.0001-99.99重量%，优选为0.01-99重量%，更优选为1-70重量%，进一步优选为5-30重量%。
在本发明中，所述药物组合物可以制备为本领域常规的各种剂型，本发明对此并没有特别的限制，例如，可以配制成固体，半固体，液体或气体形式的，例如，片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉末、颗粒、软膏、栓剂、注射剂、吸入剂、气溶胶等等，本发明在此不再一一列举。
因此，根据药物剂型的不同也可以进行多种形式的给药，例如但不限于，口服给药、经颊给药、直肠给药、胃肠外给药、腹膜内给药、呼吸道吸入给药、皮内给药、经皮给药。
其中，所述药学上可接受的载体可以根据剂型的不同而进行不同的选择，这些均是本领域技术人员所公知的。例如但不限于，所述药学上可接受的载体可以为淀粉、胶质、乳糖、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠、海藻酸等等。
另外，还可以加入常规的添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
另外，所述药学上可接受的载体还可以包括能够提高所述反义寡核苷酸靶向特定器官或组织或细胞的靶向试剂，所述靶向试剂例如可以为靶向肽，还可以包括能够携带所述反义寡核苷酸更容易进入表达miR-1181的靶细胞的穿膜试剂，例如穿膜肽，脂质体，微囊泡和膜脂蛋白等。
在本发明中，所述药物组合物中还可以添加有调味剂，例如，薄荷、冬青油等等。另外，还可以在所述药物组合物中添加着色剂以使所制备的剂型在外观上具有一定的吸引力，或者与其他产品进行区别。
在本发明中，所述反义寡核苷酸还可以与其他能够起到类似作用的常规药物进行联合以制备成联合药物组合物。
第五方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括：抑制（受试者）miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达；或者将上述miR-1181抑制剂和/或上述药物组合物给药至受试者。
在本发明中，所述给药的有效量、方式和剂型如上所述，在此不再赘述。
在优选的情况下，所述受试者为肝癌受试者、肺癌受试者和皮肤癌受试者中的至少一者；更优选地，所述受试者的体内表达miR-1181和/或miR-1181的靶基因；进一步优选地，在所述受试者的体内，miR-1181过高表达和/或miR-1181的靶基因表达异常（包括过高或过低）。
在优选的情况下，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种；
优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC6和HDAC4中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种。
第六方面，本发明还提供了上述miR-1181抑制剂、上述抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的方法、上述药物组合物、上述预防和/或治疗癌症的方法在抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达中的应用；特别是在预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病中的应用；优选地，所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种；更优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种；进一步优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC6和HDAC4中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种。
第七方面，本发明还提供了上述miR-1181抑制剂、上述药物组合物在制备用于抑制miR-1181的功能和/或促进miR-1181的靶基因的表达的药物中的应用；特别是在制备用于预防和/或治疗癌症及与其症状相似的疾病的药物中的应用；优选地，所述癌症为肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种；更优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种；进一步优选地，所述miR-1181的靶基因为AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC6和HDAC4中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种。
在本发明中，所述治疗是指受试者与由miR-1181引起的疾病或状态相关的症状的改善或完全消失，其中，广泛的意义上的改善是指降低或升高至少一个参数。具体到本申请，例如，可以为miR1181的靶基因AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种的表达升高。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的miR-1181的反义寡核苷酸对癌症细胞的体外调节作用
委托英维骏杰（Invitrogen）公司人工化学合成miR-1181的反义寡核苷酸（miR-1181 ASO，如SEQ ID NO：2所示）和委托吉玛公司合成Polo样激酶1（PKL1）的siRNA（正义链：如SEQ ID NO：4所示，反义链：如SEQ ID NO：5所示）。
（1）miR-1181的反义寡核苷酸对肝癌细胞的作用
使用定量PCR法检测肝癌细胞HuH-7（购自ATCC）和HepG2（购自ATCC）中miR-1181的表达情况。使用Trizol抽提HuH-7细胞、HepG2细胞和正常的原代人肝细胞的总RNA，然后取1ug的RNA用Catch-All miRNA&mRNA 定量PCR试剂盒（昆山彭济凯丰生物科技有限公司）反转录成cDNA，然后按说明书进行定量PCR检测。结果表明，与正常的原代人肝细胞（对照）相比，miR-1181在HuH-7和HepG2细胞中表达较高。
将肝癌细胞HuH-7和HepG2分别接种在384孔培养板里，培养在50µL含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。用Lipofectamine 2000(Invitrogen)分别转染1µM的miR-1181 ASO，或40nM的PKL1的siRNA（阳性对照组），或随机序列（阴性对照组，如SEQ ID NO：6所示），另有一组为只加转染试剂的对照孔（转染试剂组）。转染72小时后用4%的多聚甲醛（PFA）固定细胞，并使用DAPI染细胞核后进行细胞计数。结果如图1和图2所示，其中，数据以平均值±标准差表示，n=3，***P<0.001，**P<0.01。
由图1和2可以看出，与阴性对照组相比，PKL1的siRNA（阳性对照）和miR-1181 ASO均可以使HuH-7和HepG2细胞的个数明显减少；并且，与PKL1的siRNA相比，miR-1181 ASO使HuH-7和HepG2细胞的个数减少得更多。
（2）miR-1181的反义寡核苷酸对肺癌细胞的作用
按照如上步骤（1）的方法进行，所不同的是，使用肺癌细胞A549（购自ATCC）代替步骤（1）中使用的肝癌细胞HuH-7和HepG2。
定量PCR结果表明，与正常的原代人肺细胞（对照）相比，miR-1181在A549细胞中表达较高。
细胞计数的结果（如图3所示）表明，与阴性对照组相比，PKL1的siRNA（阳性对照）和miR-1181 ASO均可以使A549细胞的个数明显减少；并且，与PKL1的siRNA相比，miR-1181ASO使A549细胞的个数减少得更多。
（3）miR-1181的反义寡核苷酸对黑色素瘤细胞的作用
按照如上步骤（1）的方法进行，所不同的是，使用黑色素瘤细胞SK-MEL-28（购自ATCC）代替步骤（1）中使用的肝癌细胞HuH-7和HepG2。
定量PCR结果表明，与正常的原代人皮肤细胞（对照）相比，miR-1181在SK-MEL-28细胞中的表达较高。
细胞计数的结果表明，与阴性对照组相比，PKL1的siRNA（阳性对照）和miR-1181ASO均可以使SK-MEL-28细胞的个数明显减少；并且，与PKL1的siRNA相比，miR-1181 ASO使SK-MEL-28细胞的个数减少得更多。
（4）miR-1181的反义寡核苷酸对正常的人成纤维细胞的作用
按照如上步骤（1）的方法进行，所不同的是，使用正常的人成纤维细胞HS27（购自ATCC）代替步骤（1）中使用的肝癌细胞HuH-7和HepG2。
细胞计数的结果（如图4所示）表明，与阴性对照组相比，miR-1181 ASO对正常的人成纤维细胞的生长无明显影响。
实施例2
本实施例用于说明miR-1181的靶基因在肝癌细胞中下调
使用TargetScan算法预测miR-1181的靶基因，并筛选出10个与细胞凋亡、生长抑制或组蛋白脱乙酰化相关的基因，如表1所示。HepG2肝癌细胞和正常的原代人肝细胞用Trizol裂解（Invitrogen），然后按说明书提取出总RNA。用无核酸酶的水溶解RNA，然后用生物分析仪（bioanalyzer）检测RNA的完整性，用Qubit3测定RNA的浓度。之后用TruSeqStranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina/USA)构建cDNA库，并在Hiseq 2500 测序仪(Illumina)上测序。经分析得到在HepG2细胞中表达下调的一组基因，并且发现10个miR-1181的靶基因中的9个是下调的，结果如表1所示。
表1
| miR-1181的靶基因 | AXIN1 | DMAP1 | H1FX | HDAC6 | PPM1F | PPP1R15A | REPIN1 | RRP1 | HDAC4 | ZNF703 |
| 在HepG2中下调 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 否 | 是 |
实施例3
本实施例用于说明miR-1181通过直接结合靶基因的UTR上的结合位点以负调节靶基因的表达
分别将靶基因AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC4和HDAC6的含有miR-1181结合位点的非翻译区（UTR）的序列（分别如SEQ ID NO：7-12所示）直接合成装载至pGL3-SV40载体的火荧光素酶（Fire luciferase）基因3'下游的xbaI位点上，得到上述各靶基因的miR-1181感受载体（委托苏州泓迅生物科技有限公司进行）。
将人胚肾细胞HEK-293T（购自ATCC）培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。以每孔10万个细胞的接种量将HEK-293T细胞接种至24孔细胞培养板中，培养体积为500µL。第二天用脂质体2000（Invitrogen）按照说明书将如下表2的配置试剂共转染至HEK-293T细胞中，36小时后用双荧光素酶分析试验（Promega）测量从miR-1181感受载体中表达的荧光素酶的活力。每次设置三个重复孔，实验重复三次。
其中，各组别中，miR-1181感受载体的转入量以每孔计：miR-1181感受载体500ng，miR-1181（SEQ ID NO：1，由昆山彭济凯丰生物科技有限公司合成）1pmol，对照RNA（ConRNA，吉玛公司合成，SEQ ID NO：13） 1pmol。
表2
实验结果表明miR-1181通过结合在靶基因AXIN1、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、HDAC4和HDAC6的UTR上的结合位点来抑制靶基因的表达水平。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的miR-1181的反义寡核苷酸和错配的miR-1181的反义寡核苷酸能够抑制miR-1181的功能
将人胚肾细胞HEK-293T培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。细胞培养箱恒定保持37℃和5%的CO2。以每孔10万个细胞的接种量将HEK-293T细胞接种至24孔细胞培养板中，培养体积为500µL。第二天用脂质体2000（Invitrogen）按照说明书将如下表3的配置试剂共转染至HEK-293T细胞中，36小时后用双荧光素酶分析试验（Promega）测量从miR-1181感受载体中表达的荧光素酶的活力。每次设置三个重复孔，实验重复三次。
其中，各组别中，miR-1181感受载体的转入量以每孔计：miR-1181感受载体（AXIN1UTR）500ng，miR-1181（如SEQ ID NO：1所示，由昆山彭济凯丰生物科技有限公司合成）1pmol，对照核苷酸（Con RNA，SEQ ID NO：13所示，和Con DNA，如SEQ ID NO：14所示） 1pmol，miR-1181 ASO 1pmol，错配的miR-1181 ASO（如SEQ ID NO：3所示） 1pmol。
结果如图5所示。通过图5可以看出，miR-1181 ASO能够完全抑制miR-1181的功能，但随机对照的核苷酸不能抑制miR-1181的功能。而且含有错配碱基的miR-1181 ASO（mutmiR-1181 ASO，如SEQ ID NO：3所示）也能够部分抑制miR-1181的功能。*** P<0.001，** P<0.01。
表3
| 组别 | 共转组合 |
| AXIN1 UTR +ConRNA+ConDNA | miR-1181感受载体(AXIN1 UTR) +Con RNA +Con DNA |
| AXIN1 UTR +miR-1181 | miR-1181感受载体(AXIN1 UTR) + miR-1181 |
| AXIN1 UTR +miR-1181+ConDNA | miR-1181感受载体(AXIN1 UTR) + miR-1181 +Con DNA |
| AXIN1 UTR +miR-1181+miR-1181 ASO | miR-1181感受载体(AXIN1 UTR) + miR-1181 + miR-1181 ASO |
| AXIN1 UTR +miR-1181+错配的miR-1181 ASO | miR-1181感受载体(AXIN1 UTR) + miR-1181 +错配的miR-1181 ASO |
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的硫代修饰的miR-1181的反义寡核苷酸对癌症细胞的体外调节作用
按照实施例1的方法进行，所不同的是，使用5’端的1-2位和19-20位被硫代修饰的miR-1181的反义寡核苷酸（如SEQ ID NO：2所示）代替实施例1中使用的未经修饰的miR-1181的反义寡核苷酸（miR-1181 ASO，如SEQ ID NO：2所示）。
细胞计数的结果（如图6所示）表明，与未经修饰的miR-1181ASO相比，硫代修饰的miR-1181 ASO使肝癌细胞HuH-7的个数减少的更多。
通过以上实施例1-5的结果可知，本发明通过将miR-1181的抑制剂（如miR-1181ASO、错配的miR-1181 ASO、硫代修饰的miR-1181 ASO）与高表达miR-1181的靶细胞（如肝癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞等）进行接触，能够充分抑制miR-1181的功能并促进其靶基因（AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703）的表达。这说明当将该抑制剂用于个体给药时，能够有效的预防和/或治疗miR-1181高表达和/或其靶基因（AXIN1、DMAP1、H1FX、HDAC6、PPM1F、PPP1R15A、REPIN1、RRP1、HDAC4和ZNF703中的至少两种）表达异常所引起的疾病，例如，各种癌症或与其症状相似的疾病，特别是肝癌、肺癌和皮肤癌中的至少一种。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆山彭济凯丰生物科技有限公司
<120> 通过miR-1181进行抗癌的方法和药物及其应用
<130> I42784PCG
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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attgcttctc aagcatcctt gcg 23
Claims (1)
1.miR-1181抑制剂和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用；所述癌症为肝癌、肺癌和黑色素瘤中的至少一种；
其中，所述miR-1181抑制剂为miR-1181的反义寡核苷酸；
所述反义寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
或所述反义寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，且其中5’端1-5位和17-21位的核苷酸基团含硫代修饰；
或所述反义寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述药物组合物含有所述miR-1181抑制剂以及药学上可接受的载体。
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2016
- 2016-12-29 CN CN201611247206.XA patent/CN108245527B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN103476947A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-25 | 格路福生物制药公司 | 寡聚体的增强的生物分布 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108245527A (zh) | 2018-07-06 |
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Legal Events
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