JP2021520220A - p21遺伝子の発現を活性化させる方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、センスオリゴヌクレオチド鎖及びアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖により構成される、ヒトp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる小分子活性化RNAを提供する。その前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、ヒトp21遺伝子プロモーター標的遺伝子配列のうちの長さが16‐35ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと、75%以上の相同性を有する。そのうち、ヒトp21遺伝子の標的配列が配列番号5、6、7、8、9、10、11、12に示される配列からなる組により選ばれる。
Description
本発明は、分子生物学の分野に関し、具体的には、標的遺伝子プロモーター配列を利用する二本鎖小分子RNAによる遺伝子発現のアップレギュレートに関する。
二本鎖小核酸分子は、化学合成されたオリゴリボヌクレオチド(例えば、小分子活性化RNA(saRNA))と天然に存在するオリゴリボヌクレオチド(例えば、マイクロリボヌクレオチド(miRNA))とを含み、タンパク質コード遺伝子の調節配列(例えば、プロモーター配列)を配列特異的にターゲッティングすることにより、転写及びエピジェネリックレベルで遺伝子の発現レベルをアップレギュレート可能であることが証明され、このような現象は、RNAの活性化と言われている(RNAa)(Li,Okino et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:17337-17342; Janowski,Younger et al.(2007) Nat Chem Biol 3:166-173; Place,Li et al.(2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:1608-1613; Huang,Place et al.(2012) Nucleic Acids Res 40:1695-1707; Li (2017) Adv Exp Med Biol 983:1-20)。研究によれば、RNAの活性化は、カエノラブディティス・エレガンスからヒトへの進化的保存の内因性分子メカニズムである(Huang,Qin et al.(2010) PloS One 5:e8848; Seth,Shirayama et al.(2013) Dev Cell 27:656-663;Turner,Jiao et al.(2014) Cell Cycle 13:772-781)。
どのようにヒト細胞の内因性遺伝子又はタンパク質の発現を安全かつ選択的に増強するかは、依然として遺伝子治療の分野の大きな課題である。従来のウィルス型遺伝子治療システムは、その固有の欠陥を有しており、宿主ゲノムを変化させたり、免疫反応を起こせたりするなどの副作用がある。RNA活性化は、ゲノムを変化せずに内因性遺伝子の発現を活性化させることができるという利点を有し、一種の代表的な内因性遺伝子の発現を活性化させる新しい策略であり、疾病治療において巨大な応用価値を有する。
p21WAF1/CIP1(CDKN1Aとも言われ、以下、p21という)遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤であり、重要な腫瘍抑制遺伝子である(Harper, Adami et al. (1993) Cell 75:805‐816; Fang, Igarashi et al. (1999) Oncogene 18:2789‐2797)。研究によれば、異所性ベクターによるp21の過剰発現又は内因性p21の活性化による転写は、腫瘍細胞や体内腫瘍の成長を効率よく抑制できる(Harper,Adami et al. (1993) Cell 75:805-816; Eastham,Hall et al. (1995) Cancer Res 55:5151-5155; Wu,Bellas et al. (1998) J Exp Med 187:1671-1679; Harrington,Spitzweg et al. (2001) J Urol 166:1220-1233)。そのため、p21遺伝子を標的として活性化させる方法は、例えば癌などの多くの疾病の治療に幅広く応用される可能性がある。
本発明は、その1本の鎖が配列番号5、6、7、8、9、10、11および12からなる群から選択される核酸配列のうちの長さが16〜35ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと少なくとも75%の相同性又は相補性を有し、標的ヒトp21遺伝子プロモーター配列によりp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる、ことを特徴とする小分子活性化RNAを提供する。
本発明の実施例において、前記ヒトp21遺伝子の標的遺伝子が配列番号5〜12に示される配列からなる組により選ばれる。そのうち、前記ヒトp21遺伝子プロモーター配列がそれぞれ転写開始部位(transcription start site, TSS)より上流の-893〜-801 bp(配列番号5)、-717〜-632 bp(配列番号6)、-585〜-551 bp(配列番号7)、-554〜-504 bp(配列番号8)、-514〜-485 bp(配列番号9)、-442〜-405 bp(配列番号10)、-352〜-313 bp(配列番号11)、-325〜-260 bp(配列番号12)にある。
一実施例において、前記小分子活性化RNAは、二本鎖核酸構造が形成される相補領域を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を備える。そのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖が、ヒトp21遺伝子プロモーター配列のうちの長さが16〜35ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、99%以上或いは100%の相同性を有する。
一実施例において、前記に示されるように、前記センス鎖及びアンチセンス鎖が異なる二本の核酸鎖にある。前記センス鎖及びアンチセンス鎖が同一の核酸鎖にあり、ヘアピン型一本鎖核酸分子である。そのうち、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補領域には、二本鎖核酸構造が形成されている。
具体的な一実施例において、前記小分子活性化RNAにおける少なくとも1本の鎖は長さが0〜6ヌクレオチドである3'突出末端を有する。前記小分子活性化RNAにおける2本の鎖は共に長さが2〜3ヌクレオチドである3'突出末端を有する。
一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖は長さが16〜35ヌクレオチドである。例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は35ヌクレオチドである。
具体的な一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖が、配列番号13〜30、35〜46、59〜62、67〜74、77〜80、85〜96、103〜108、111〜118、121〜132、139〜140、147〜180、185〜186、189〜190、195〜198、201〜202、209〜212、215〜218、225〜240、243〜246、249〜258、261〜262、265〜270、275〜280、283〜300、303〜308、317〜320、323〜324、329〜348、351〜352、357〜358、361〜366、371〜392、399〜400、405〜412、415〜416、419〜424、429〜432、439〜442、447〜450、453〜458、463〜468に示される配列と少なくとも75%、例えば、80%、85%、90%、95%、99%、100%の相同性を有する。
具体的な一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖配列が、配列番号13〜30、35〜46、59〜62、67〜74、77〜80、85〜96、103〜108、111〜118、121〜132、139〜140、147〜180、185〜186、189〜190、195〜198、201〜202、209〜212、215〜218、225〜240、243〜246、249〜258、261〜262、265〜270、275〜280、283〜300、303〜308、317〜320、323〜324、329〜348、351〜352、357〜358、361〜366、371〜392、399〜400、405〜412、415〜416、419〜424、429〜432、439〜442、447〜450、453〜458、463〜468のヌクレオチド配列のいずれに示される。
本発明は、1)標的遺伝子プロモーター配列を鋳型とし、19個の塩基を含む配列を標的部位として選定するステップと、2)ステップ1)で取得した標的部位配列と75%以上の相同性を有するRNA配列を合成して、センスオリゴヌクレオチド鎖を取得するステップと、3)配列をステップ2)で取得したセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補させるステップと、4)RNAアニール緩衝液にてステップ2)で取得したセンスオリゴヌクレオチド鎖とステップ3)で取得したアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を同じモル数で混合しながら加熱したのち、室温まで自然冷却させることにより、二本鎖の小分子活性化RNAを取得した(そのうち、ヒトp21遺伝子プロモーター配列が配列番号5、6、7、8、9、10、11、12に示される配列からなる組により選ばれる)ステップと、を備えることを特徴とする、前記何れか1項に記載の小分子活性化RNAの製造方法をさらに提供する。
一実施例において、前記小分子活性化RNAにおける少なくとも1個のヌクレオチドが化学修飾を有するヌクレオチドであり、前記化学修飾は、
(1)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列のヌクレオチドを繋げるホスホジエステル結合に対する修飾と、
(2)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列におけるリボースの2'‐OHに対する修飾と、
(3)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列における塩基に対する修飾と、
(4)前記小活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも1個のヌクレオチドがロックド核酸であること、などの少なくとも1つから選ばれる。
一実施例において、前記小分子活性化RNAにおける少なくとも1個のヌクレオチドが化学修飾を有するヌクレオチドであり、前記化学修飾は、
(1)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列のヌクレオチドを繋げるホスホジエステル結合に対する修飾と、
(2)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列におけるリボースの2'‐OHに対する修飾と、
(3)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列における塩基に対する修飾と、
(4)前記小活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも1個のヌクレオチドがロックド核酸であること、などの少なくとも1つから選ばれる。
一実施例において、前記p21遺伝子の発現を少なくとも10%、例えば、15%、20%、30%、40%、50%、80%、100%、200%以上活性化又はアップレギュレーションさせる。
本発明は、小分子活性化RNAの、細胞におけるp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤の製造における使用をさらに提供する。前記小分子活性化RNAは、前記細胞に直接導入されるもの、或いは、当該小分子活性化RNAをコードするヌクレオチド配列が細胞に導入された後に細胞に発生されたものである。前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞である。当該ヒト細胞が単離したヒト細胞株のものであってもよく、人体に存在するものであってもよい。
一実施例において、前記人体がp21タンパク質の発現の不足による腫瘍に罹る患者であり、腫瘍への治療を図るために前記小活性化核酸分子が有効量で投与される。前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌が好ましい。
また、本発明は、分離したp21遺伝子小分子活性化RNA標的部位をさらに提供する。そのうち、前記標的部位は、配列番号5〜12から選ばれる配列のいずれにおける連続的な16〜35ヌクレオチド配列である。
さらに、本発明は、細胞におけるヒトp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる方法を開示した。そのうち、前記方法は、受検者又は細胞に前記何れか1項に記載の小分子活性化RNAを投与する方法を含む。前記小分子活性化RNAは、細胞に直接導入されるものであってもよく、当該小分子活性化RNAをコードするヌクレオチド配列が細胞に導入された後に細胞に発生されたものであってもよい。前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞であり、さらに好ましくはヒトの膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌細胞である。
本発明は、前記に示される小分子活性化RNA及び薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに開示した。そのうち、薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである。
本発明は、前記に示される小分子活性化RNA又は前記に示される組成物の、p21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる薬物の製造における使用、を開示した。当該応用は、抗腫瘍又は良性増殖性病変の薬物の製造における使用が好ましい。前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌がより好ましい。
以下、具体的な説明によって本発明をさらに説明する。
なお、特に断らない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における一般的な技術者が通常理解できる意味と同じ意味を有する。
本願において、単数形となる「1個(a)」、「この(this)」は、特に明記しない限り、その複数形も含む。
なお、特に断らない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における一般的な技術者が通常理解できる意味と同じ意味を有する。
本願において、単数形となる「1個(a)」、「この(this)」は、特に明記しない限り、その複数形も含む。
定義
本明細書で使用される「相補」という用語は、2本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドユニット同士の水素結合により形成される。相補的オリゴヌクレオチド鎖は、Watson‐Crick方式で塩基対合してもよく(例えば、A‐T、A‐U、C‐G)、又は、二本鎖体の形成を許可するいずれの方式(例えば、Hoogsteen型又は逆Hoogsteen型塩基対合)で塩基対合してもよい。「100%対合」又は「完全相補」とは、100%の相補性を有し、すなわち、2本の鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合していることを意味する。
本明細書で使用される「相補」という用語は、2本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドユニット同士の水素結合により形成される。相補的オリゴヌクレオチド鎖は、Watson‐Crick方式で塩基対合してもよく(例えば、A‐T、A‐U、C‐G)、又は、二本鎖体の形成を許可するいずれの方式(例えば、Hoogsteen型又は逆Hoogsteen型塩基対合)で塩基対合してもよい。「100%対合」又は「完全相補」とは、100%の相補性を有し、すなわち、2本の鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合していることを意味する。
完全相補又は100%対合は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域における第1オリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドユニットが第2オリゴヌクレオチド鎖と「ミスマッチ」無しに水素結合を形成できることを意味する。不完全相補とは、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合することができないことを意味する。例えば、二本鎖領域の長さが20ヌクレオチドである2本のオリゴヌクレオチド鎖に対しては、各鎖における2つの塩基対のみが互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は10%の相補性を有する。同じ実施例では、各鎖における18個の塩基対が互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は90%の相補性を有する。基本的相補性とは、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%以上の相補性を意味する。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語とは、ヌクレオチドのポリマーをいい、DNA、RNA、又はDNA/RNAハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子、規則的や不規則的に交互するデオキシリボース部分及びリボース部分を含むオリゴヌクレオチド鎖、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾及び天然又は非天然に存在する骨格を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、2個以上の修飾され又は修飾されていないリボヌクレオチド及び/又はその類似体を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」及び「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、50個以下の塩基を有する短鎖のヌクレオチドの総称である(ヌクレオチドがデオキシリボ核酸DNA又はリボ核酸RNAを含む)。本発明において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、17〜30ヌクレオチドのいずれかの長さであってもよい。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、1本のポリペプチド鎖のコード又は1本の機能RNAの転写に必要な全てのヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、宿主細胞に対して内因性、あるいは完全又は部分的に組換えられた遺伝子であってもよい(例えば、コーディングプロモーターを導入した外因性オリゴヌクレオチド及びコード配列、又は内因性コード配列に隣接する異種プロモーターを宿主細胞に導入したもの)。例えば、「遺伝子」は、エクソン及びイントロンで構成される核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンとの間のオープンリーディングフレームにおけるエクソンに含まれる配列であり、本発明では、「遺伝子」は、他の遺伝子がコード配列又は非コード配列を含むか否かを問わず、例えばプロモーター、エンハンサー等のような遺伝子制御配列及び本分野で知られている他の遺伝子の転写、発現又は活性を制御する他の全ての配列を含むことができる。1つの場合、例えば、「遺伝子」は、例えばプロモーターやエンハンサー等の制御配列を含む機能性核酸の説明に用いることができる。組換え遺伝子の発現は、一種又は多種の異種制御配列により制御することができる。
本明細書で用いられる「標的遺伝子」は、生体内に天然に存在する核酸配列、組換え遺伝子、ウイルス又は細菌配列、染色体又は染色体外及び/又は細胞及び/又はその染色質を一時的又は安定的にトランスフェクション又は混入したものである。標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってもよいし、非タンパク質コード遺伝子であってもよい(例えば、マイクロRNA遺伝子、長鎖非コードRNA遺伝子)。標的遺伝子は、通常、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性(相同性とも言われる)を有する小分子活性化RNAを設計することにより、標的遺伝子に対するアップレギュレートを実現することができ、標的遺伝子の発現のアップレギュレーションとして表現される。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を意味し、本発明において「標的遺伝子プロモーター配列と相補する」における標的遺伝子プロモーター配列とは、当該配列のコード鎖(非鋳型鎖とも言われる)、すなわち、当該遺伝子コード配列と同一の核酸配列である。「標的配列」は、標的遺伝子プロモーター配列のうちの小分子活性化RNAのセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同又は相補的な配列フラグメントを意味する。
本明細書で使用される「センス鎖」及び「センスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化RNAのセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化RNAの二本鎖体のうちの標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖と同一性を有する第1リボ核酸鎖を意味する。
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化RNAのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化RNAの二本鎖体のうちのセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補的な第2リボ核酸鎖を意味する。
本明細書で使用される「コード鎖」は、標的遺伝子における転写が不可能な1本のDNA鎖を指し、該鎖のヌクレオチド配列は、転写により生成されたRNAの配列と一致する(RNAではUでDNAにおけるTを置換した)。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列のコード鎖は、標的遺伝子DNAコード鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「鋳型鎖」とは、標的遺伝子の二本鎖DNAのうちコード鎖に相補的な他本の鎖であって、鋳型としてRNAに転写可能な鎖を意味し、当該鎖は、転写したRNA塩基と相補的なものである(A-U,G-C)。転写過程において、RNAポリメラーゼは、鋳型鎖に結合し、鋳型鎖の3'−>5'方向に沿って移動し、5'−>3'方向に従ってRNAの合成を触媒する。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖DNA配列の鋳型鎖は、標的遺伝子DNA鋳型鎖と同一のDNA鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードしない核酸配列を意味し、タンパク質コード又はRNAコード核酸配列と位置的に関連付けることによりそれらの転写に対して調節作用を果たす。通常、真核プロモーターは、100〜5,000個の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」を限定する趣旨ではない。プロモーター配列は、一般的にタンパク質コード又はRNAコード配列の5'末端に位置するが、エキソン及びイントロン配列に存在する場合もある。
本明細書で使用される「転写開始部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖に転写開始を標識するためのヌクレオチドを意味する。転写開始部位は、プロモータ領域の鋳型鎖に出現することができる。1つの遺伝子は、1つ以上の転写開始部位を有することができる。
本明細書で使用される「同一性」又は「相同性」という用語は、小分子活性化RNAのうちの1本のオリゴヌクレオチド鎖(センス鎖又はアンチセンス鎖)が標的遺伝子のプロモータ配列のある領域のコード鎖又は鋳型鎖と少なくとも75%の類似性を有することを意味する。
本明細書で使用される「突出」、「overhang」、「垂下」は、互いに置き換えることができ、オリゴヌクレオチド鎖の末端(5'又は3')における塩基対合しないヌクレオチドであり、二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの1本の鎖からはみ出した他の鎖で産生されるものである。二本鎖体の3'及び/又は5'末端からはみ出した一本鎖領域は、「突出」と称される。
本明細書で使用される「遺伝子活性化」又は「活性化遺伝子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子転写レベル、mRNAレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、染色質状態又は形態、翻訳レベル、又はそれらの細胞又は生物システムにおける活性又は状態を測定することにより、ある核酸の転写、翻訳又は発現、あるいは活性の増加を測定することを意味する。これらの活動又は状態は、直接的又は間接的に測定することができる。また、「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」は、このような活性化のメカニズムによらず、核酸配列に相関する活性が増加したことを意味し、例えば、調節配列として調節作用を発揮したり、RNAに転写されたり、タンパク質に翻訳されてタンパク質の発現を増加したりする。
本明細書で使用される「小分子活性化RNA」、「saRNA」、「小活性化核酸分子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子発現を促進できるリボ核酸分子であり、標的遺伝子の非コード核酸配列(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)と配列同一性を有するリボヌクレオチド配列を含む第1リボ核酸鎖(アンチセンス鎖やアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい)、及び第1鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む第2リボ核酸鎖(センス鎖、センスストランドやセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい)からなる。そのうち、前記第1鎖と第2鎖により二本鎖体が形成される。小分子活性化RNAは、合成され又はベクターで発現されるとともに二本鎖領域のヘアピン構造を形成できる一本鎖RNA分子で構成されてもよい。そのうち、第1領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有する核酸配列を含み、第2領域に含まれる核酸配列は、第1領域と相補的なものである。小分子活性化RNA分子の二本鎖体領域の長さは、通常は約10個〜約50個の塩基対、約12個〜約48個の塩基対、約14個〜約46個の塩基対、約16個〜約44個の塩基対、約18個〜約42個の塩基対、約20個〜約40個の塩基対、約22個及び約38個の塩基対、約24個及び約36個の塩基対、約26個及び約34個の塩基対、約28個及び約32個の塩基対であり、通常、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個の塩基対である。また、「saRNA」、「小分子活性化RNA」、「小活性化核酸分子」には、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含まれ、修飾されたヌクレオチド又はその類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。
本明細書で使用される「ホットスポット」という用語は、長さが少なくとも30 bpである遺伝子プロモーター領域を意味する。これらの領域では、機能性小活性化核酸分子標的の凝集が現われ、即ち、これらのホットスポット領域を標的とする小活性化核酸分子の少なくとも60%は、標的遺伝子mRNAの発現が1.5倍以上になるまで誘導することができる。
本明細書で使用される「p21」という用語は、p21WAF1/CIP1遺伝子を意味し、CDKN1A遺伝子とも呼ばれ、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤であり、一種の重要な腫瘍抑制遺伝子でもあり、「標的遺伝子」とも呼ばれる。p21を過剰発現し、又は内因性p21の転写を活性化することにより、腫瘍細胞及び生体内腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。
本明細書で使用される「合成」とは、オリゴヌクレオチドの合成方式を意味し、例えば化学合成、人体外転写、ベクター表現などのRNAを合成可能な任意の方式が含まれる。本発明に提供される小活性化核酸分子の製造方法は、配列設計と配列合成を含む。前記小活性化核酸分子配列の合成は、化学合成の方法を採用してもよく、核酸合成を専門事業とするバイオテクノロジー会社に依頼してもよい。一般的に、前記化学合成の方法は、(1)オリゴリボヌクレオチドの合成ステップ、(2)脱保護ステップ、(3)精製分離ステップ、(4)脱塩及びアニールステップ、を備える。例えば、本発明にかかる二本鎖RNA分子、例えばsaRNAの化学合成の具体的なステップは下記の通りである。
(1)オリゴリボヌクレオチドの合成
自動DNA/RNA合成機(例えば、Applied Biosystems EXPEDITE8909)にて1ミクロモルRNAの合成を設置するとともに、1サイクルのカップリングタイムを10‐15分に設置する。固相連結の5'‐O‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、1回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、n回目(19≧n≧2)のサイクルでn‐1回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
自動DNA/RNA合成機(例えば、Applied Biosystems EXPEDITE8909)にて1ミクロモルRNAの合成を設置するとともに、1サイクルのカップリングタイムを10‐15分に設置する。固相連結の5'‐O‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、1回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、n回目(19≧n≧2)のサイクルでn‐1回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
(2)脱保護
saRNAに連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール/アンモニア水溶液(体積比1:3)を1mL入れた後に、栓をした状態で25‐70℃のインキュベータに置き、2‐30時間インキュベーションする。saRNAの固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を2回溶出して(1回1mL)ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で1‐12時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液(1M)を1mL入れて、室温で4‐12時間静置し、更にN-ブタノールを2mL入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、saRNA一本鎖の粗生成物を得た。
saRNAに連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール/アンモニア水溶液(体積比1:3)を1mL入れた後に、栓をした状態で25‐70℃のインキュベータに置き、2‐30時間インキュベーションする。saRNAの固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を2回溶出して(1回1mL)ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で1‐12時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液(1M)を1mL入れて、室温で4‐12時間静置し、更にN-ブタノールを2mL入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、saRNA一本鎖の粗生成物を得た。
(3)精製分離
取得したsaRNAの粗生成物を1モル/mL濃度の2mL酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフ逆相C18カラムにて分離して、精製したsaRNA一本鎖生成物を得た。
取得したsaRNAの粗生成物を1モル/mL濃度の2mL酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフ逆相C18カラムにて分離して、精製したsaRNA一本鎖生成物を得た。
(4)脱塩及びアニール
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で1‐2mLの緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5‐8.0,50 mM NaCl)に混ぜる。この溶液を95℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、saRNAが含む溶液を得た。
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で1‐2mLの緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5‐8.0,50 mM NaCl)に混ぜる。この溶液を95℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、saRNAが含む溶液を得た。
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
細胞株RT4、KU‐7、T24、J82、TCCSUP及びHT‐1197が改良されたMcCoy's 5A培地(Gibco)に培養された。細胞株5637、PC3及びBel‐7402がRPMI1640培地(Gibco)に培養された。UM‐UC‐3細胞株が基礎培地(Gibco)に培養された。全ての培地は、10%の子ウシ血清(Sigma-Aldrich)及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を含有する。細胞を5% CO2、37℃の条件下で培養した。メーカーの説明に従い、RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, Ca)を用いて10 nM(特に断らない限り)濃度で実験中に設計された二本鎖RNA分子をトランスフェクションした。
細胞培養及びトランスフェクション
細胞株RT4、KU‐7、T24、J82、TCCSUP及びHT‐1197が改良されたMcCoy's 5A培地(Gibco)に培養された。細胞株5637、PC3及びBel‐7402がRPMI1640培地(Gibco)に培養された。UM‐UC‐3細胞株が基礎培地(Gibco)に培養された。全ての培地は、10%の子ウシ血清(Sigma-Aldrich)及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を含有する。細胞を5% CO2、37℃の条件下で培養した。メーカーの説明に従い、RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, Ca)を用いて10 nM(特に断らない限り)濃度で実験中に設計された二本鎖RNA分子をトランスフェクションした。
RNA分離及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
細胞を2‐3×105個の細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種し、オリゴヌクレオチド二本鎖体をリバーストランスフェクションした。RNeasy Plus Miniキット(Qiagen)を用いて、その説明書に従って細胞総RNAを抽出した。gDNA Eraser(Takara,Shlga,Japan)を含むPrimeScript RTキットを用いてRNA(1μg)をcDNAに逆転写した。qPCRは、ABI 7500 Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems)及びSYBR Premix Ex Taq II(Takara,Shlga,Japan)試薬を用い、95℃で3秒間、60℃で30秒間である反応条件で40サイクル増幅した。GAPDHを内部参照とする。全てのプライマー配列を表1に示す。
表1.qRT-PCR分析のプライマー配列
細胞を2‐3×105個の細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種し、オリゴヌクレオチド二本鎖体をリバーストランスフェクションした。RNeasy Plus Miniキット(Qiagen)を用いて、その説明書に従って細胞総RNAを抽出した。gDNA Eraser(Takara,Shlga,Japan)を含むPrimeScript RTキットを用いてRNA(1μg)をcDNAに逆転写した。qPCRは、ABI 7500 Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems)及びSYBR Premix Ex Taq II(Takara,Shlga,Japan)試薬を用い、95℃で3秒間、60℃で30秒間である反応条件で40サイクル増幅した。GAPDHを内部参照とする。全てのプライマー配列を表1に示す。
表1.qRT-PCR分析のプライマー配列
細胞増殖測定
細胞を2‐4×103個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに敷き、一晩培養して、オリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションした。3日間トランスフェクションした後、CCK8(Dojindo)を用い、その説明書に従って細胞増殖の検出を行った。実験手順を簡単に説明すると、10μL CCK8溶液を各ウェルに入れ、37℃で1時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて450nm箇所での吸光度を測定した。
細胞を2‐4×103個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに敷き、一晩培養して、オリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションした。3日間トランスフェクションした後、CCK8(Dojindo)を用い、その説明書に従って細胞増殖の検出を行った。実験手順を簡単に説明すると、10μL CCK8溶液を各ウェルに入れ、37℃で1時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて450nm箇所での吸光度を測定した。
QuantiGene 2.0分析
細胞を96ウェルプレートに敷いてオリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションし、72時間トランスフェクションした後、QuantiGene 2.0キット(AffyMetrix)を用いて目標遺伝子mRNAレベルを定量的に検出した。QuantiGene 2.0キットは、交雑技術に基づく方法であり、遺伝子特異的プローブを用いてmRNAレベルを直接定量するものである。実験手順を簡単に説明すると、分解液を添加してトランスフェクション後の細胞を分解させ、細胞分解物をCDKN1A(p21)及びHPRT1(ハウスキーピング遺伝子)プローブを内包する捕捉ウェルプレートに入れ、55℃で一晩交雑した。交雑信号を増強するために、100μL相当の緩衝液(QuantiGene 2.0キットから提供)に2.0 PReAMP、2.0 AMP及び2.0 Lable Probeと順番に交雑した。全ての交雑はいずれも50‐55℃で1時間振盪する。最後に、洗浄した後、2.0 Substrateを加えて室温で5分間インキュベートした。その後、Infinite 200 PROプレートリーダー(Tecan、スイス)を用いて光信号を検出した。
細胞を96ウェルプレートに敷いてオリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションし、72時間トランスフェクションした後、QuantiGene 2.0キット(AffyMetrix)を用いて目標遺伝子mRNAレベルを定量的に検出した。QuantiGene 2.0キットは、交雑技術に基づく方法であり、遺伝子特異的プローブを用いてmRNAレベルを直接定量するものである。実験手順を簡単に説明すると、分解液を添加してトランスフェクション後の細胞を分解させ、細胞分解物をCDKN1A(p21)及びHPRT1(ハウスキーピング遺伝子)プローブを内包する捕捉ウェルプレートに入れ、55℃で一晩交雑した。交雑信号を増強するために、100μL相当の緩衝液(QuantiGene 2.0キットから提供)に2.0 PReAMP、2.0 AMP及び2.0 Lable Probeと順番に交雑した。全ての交雑はいずれも50‐55℃で1時間振盪する。最後に、洗浄した後、2.0 Substrateを加えて室温で5分間インキュベートした。その後、Infinite 200 PROプレートリーダー(Tecan、スイス)を用いて光信号を検出した。
統計分析
結果は、平均値±標準偏差として表される。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software)を用いて一元配置分散分析を行い、その後Tukey's t検定を行って統計分析を行った。統計学的有意性の基準は、*P<0.05、**P<0.01、及び***P<0.001と設定した。
結果は、平均値±標準偏差として表される。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software)を用いて一元配置分散分析を行い、その後Tukey's t検定を行って統計分析を行った。統計学的有意性の基準は、*P<0.05、**P<0.01、及び***P<0.001と設定した。
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。また、実施例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲又は内容を何ら制限するものではないと解釈されるべきである。
実施例1:p21遺伝子プロモーター領域を標的とする機能性小分子活性化RNA(saRNA)の選別
p21遺伝子の発現を活性化できる機能性小分子活性化RNAを選別するために、p21遺伝子の1 kbプロモーター配列をUCSC Genomeデータベースから検索して得た(図1)。転写開始部位(TSS)の上流の-1kb箇所からサイズが19 bpの標的部位を選定し、1 bpずつ移動するようにTSS部位へ移動して、合計982個の標的配列を得た。標的配列に対して、GC含有量が65%超え又は35%未満であり、かつ、5個以上の連続する同一のヌクレオチドを含む標的配列を排除するようにフィルタ処理を行った。フィルタリング後、残りの439個の標的配列は候補として選別プロセスに入る。これらの候補配列により、対応する二本鎖RNA分子を化学合成する。そのうち、当該実験で使用される二本鎖RNA分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さが共に21ヌクレオチドであり、前記二本鎖RNA分子、例えば二本鎖saRNAの第1リボ核酸鎖(センス鎖)の5'領域の19ヌクレオチドがプロモーター標的配列と100%の同一性を有し、その3'末端がdTdT突出を含む。第2リボ核酸鎖の5'領域の19ヌクレオチドが第1リボ核酸鎖の3'領域配列の19ヌクレオチドと完全相補となっており、その3'末端がdTdT突出を含む。
p21遺伝子の発現を活性化できる機能性小分子活性化RNAを選別するために、p21遺伝子の1 kbプロモーター配列をUCSC Genomeデータベースから検索して得た(図1)。転写開始部位(TSS)の上流の-1kb箇所からサイズが19 bpの標的部位を選定し、1 bpずつ移動するようにTSS部位へ移動して、合計982個の標的配列を得た。標的配列に対して、GC含有量が65%超え又は35%未満であり、かつ、5個以上の連続する同一のヌクレオチドを含む標的配列を排除するようにフィルタ処理を行った。フィルタリング後、残りの439個の標的配列は候補として選別プロセスに入る。これらの候補配列により、対応する二本鎖RNA分子を化学合成する。そのうち、当該実験で使用される二本鎖RNA分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さが共に21ヌクレオチドであり、前記二本鎖RNA分子、例えば二本鎖saRNAの第1リボ核酸鎖(センス鎖)の5'領域の19ヌクレオチドがプロモーター標的配列と100%の同一性を有し、その3'末端がdTdT突出を含む。第2リボ核酸鎖の5'領域の19ヌクレオチドが第1リボ核酸鎖の3'領域配列の19ヌクレオチドと完全相補となっており、その3'末端がdTdT突出を含む。
前記二本鎖RNA分子を10 nMの最終濃度でPC3前立腺癌細胞にトランスフェクションし、72時間後、QuantiGene 2.0キットを用いてp21遺伝子mRNAレベルを検出した。ブランク対照処理されたp21 mRNAレベルに対する各二本鎖RNA分子の倍数変化を算出して図2に示す。該研究において、全ての二本鎖RNA分子によるp21遺伝子mRNAの倍数変化は、0.66(抑制)から8.12(誘導)までの範囲を含む(図2B)。361個(82.2%)の二本鎖RNA分子は、p21の発現を1.01〜8.12倍誘導し、74個(16.9%)の二本鎖RNA分子は、抑制作用(0.99〜0.66倍)を示し、4個の二本鎖RNA分子(0.9%)は、p21遺伝子mRNAレベルに対して影響を与えない(1.0倍)。
選別された439個の二本鎖RNA分子のうち、132個の二本鎖RNA分子(30.1%)がp21 mRNAを少なくとも2倍まで誘導でき、229個(52.4%)の二本鎖RNA分子がp21 mRNAを少なくとも1.5倍まで誘導できる。これらのp21 mRNAの発現を10%以上誘導できる二本鎖RNA分子はsaRNAであり、即ち、機能を有するsaRNAである。これらの機能を有するsaRNAは、p21プロモーター領域全体にわたって分散される。しかし、8個の遊離した領域には、機能性小分子活性化RNAの凝集が見られ、これらの領域は「ホットスポット」と呼ばれる。ホットスポット領域の定義は、1つの領域内に少なくとも10個の小分子活性化RNAが含まれ、そのうち、少なくとも60%の小分子活性化RNAは、p21 mRNA発現を1.5倍以上に達するように誘導することができる(図2(A)及び図3)。ホットスポット1〜8の標的配列及び対応する小分子活性化RNA配列をそれぞれ表2及び表3に示す。
これらのホットスポットでは、ホットスポット領域1と対応する標的配列は、p21プロモーター配列の-893 bp〜-801 bpであり、その配列が、配列番号93に示すものであり、この領域には44個の機能を有するsaRNAが確認され(表3及び図3(A))、それぞれは、RAG-834、RAG-845、RAG-892、RAG-846、RAG-821、RAG-884、RAG-864、RAG-843、RAG-854、RAG-844、RAG-887、RAG-838、RAG-858、RAG-835、RAG-876、RAG-870、RAG-853、RAG-881、RAG-828、RAG-872、RAG-841、RAG-831、RAG-829、RAG-820、RAG-822、RAG-868、RAG-849、RAG-862、RAG-865、RAG-893、RAG-848、RAG-824、RAG-866、RAG-840、RAG-875、RAG-880、RAG-871、RAG-888、RAG-885、RAG-894、RAG-833、RAG-825、RAG-889、RAG-823である。
ホットスポット領域2(表3、図3(B))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の-717〜-632 bpであり、その配列が、配列番号94に示すものであり、この領域には31個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-693、RAG-692、RAG-688、RAG-696、RAG-694、RAG-687、RAG-691、RAG-690、RAG-689、RAG-682、RAG-686、RAG-662、RAG-695、RAG-654、RAG-658、RAG-685、RAG-704、RAG-714、RAG-705、RAG-661、RAG-656、RAG-698、RAG-697、RAG-657、RAG-715、RAG-652、RAG-651、RAG-650、RAG-716、RAG-717、RAG-711である。
ホットスポット3(表3、図3(C))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐585 bp〜‐551 bpであり、その配列が、配列番号95に示すものであり、この領域には、9個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-580、RAG-577、RAG-569、RAG-576、RAG-570、RAG-574、RAG-585、RAG-579、RAG-584である。
ホットスポット4(表3、図3(D))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐554 bp〜‐505 bpであり、その配列が配列番号96に示すものであり、この領域には、17個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-524、RAG-553、RAG-537、RAG-526、RAG-554、RAG-523、RAG-534、RAG-543、RAG-525、RAG-535、RAG-546、RAG-545、RAG-542、RAG-531、RAG-522、RAG-529、RAG-552である。
ホットスポット5(表3、図3(E))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐514 bp〜‐485 bpであり、その配列が、配列番号97に示すものであり、この領域には、9個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-503、RAG-504、RAG-505、RAG-506、RAG-507、RAG-508、RAG-509、RAG-510、RAG-511、RAG-512、RAG-513、RAG-514である。
ホットスポット6(表3、図3(F))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐442 bp〜‐405 bpであり、その配列が、配列番号98に示すものであり、この領域には、12個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-427、RAG-430、RAG-431、RAG-423、RAG-425、RAG-433、RAG-435、RAG-434、RAG-439、RAG-426、RAG-428、RAG-442である。
ホットスポット7(表3、図3(G))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐352 bp〜‐313 bpであり、その配列が、配列番号99に示すものであり、この領域には、13個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-335、RAG-351、RAG-352、RAG-331、RAG-344、RAG-342、RAG-341、RAG-333、RAG-345、RAG-346、RAG-336、RAG-332、RAG-343である。
ホットスポット8(表3、図3(H))に対応する標的配列は、p21プロモーター配列の‐325 bp〜‐260 bpであり、その配列が、配列番号100に示すものであり、この領域には、18個の機能を有するsaRNAが確認され、それぞれは、RAG-294、RAG-285、RAG-286、RAG-292、RAG-291、RAG-284、RAG-279、RAG-280、RAG-325、RAG-293、RAG-322、RAG-321、RAG-281、RAG-289、RAG-278、RAG-283、RAG-282、RAG-295である。
QuantiGene 2.0の検出結果を検証するために、439個の二本鎖RNA分子を、p21 mRNA発現の活性化活性に基づいて4つの群(bin)に分け、各群から5つの二本鎖RNA分子をランダムに選び、それぞれをPC3細胞に10 nMの濃度でトランスフェクションした。72時間後、細胞総RNAを抽出して逆転写した後、RT‐qPCR法を用いてp21遺伝子のmRNAレベルを分析した。2種類の方法で得られたp21遺伝子のmRNAの発現レベルは、顕著な相関性を示す(R2=0.82)(図4)。QuantiGene 2.0法で得られた全ての機能性saRNAは、いずれもRT‐qPCR方法により真の機能性小分子活性化RNAであると検証され、そのうちのいくつかの機能性saRNAは、RT‐qPCR分析においてより強いp21 mRNAの発現誘導力を示す(表4)。
以上のように、上記データからは、p21プロモーター領域における多数の特定部位は、saRNA標的配列としてp21発現を誘導することができ、そのうちの一部の領域はより高い感受性を持ち、それと対応するsaRNAがp21発現を活性化させる可能性がより大きいことが示された。
実施例2:saRNAによるp21遺伝子mRNAの発現の誘導及び癌細胞の増殖の抑制
p21 saRNAによるp21遺伝子mRNA発現の誘導作用及び癌細胞増殖の抑制作用をさらに評価するために、QuantiGene 2.0によって選別したsaRNA(RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688)を癌細胞株KU‐7(膀胱癌)、HCT116(結腸癌)及びHepG2(肝細胞癌)にトランスフェクションした。その結果、上記の全ての細胞株において、saRNAは、いずれもp21遺伝子のmRNA発現レベルを少なくとも2倍に誘導するとともに細胞増殖を抑制することができ、saRNAを介するp21の誘導による効果が示された。具体的には、RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれKU7細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を14.0、36.9、31.9倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が71.7%、60.7%、67.4%であった(図5)。RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれHCT116細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を2.3、3.5及び2.4倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が45.3%、22.5%、38.5%であった(図6)。RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれHepG2細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を2.2、3.3及び2.0倍を誘導し、相対ブランク処理による活着率が76.7%、64.9%、79.9%であった(図7)。
p21 saRNAによるp21遺伝子mRNA発現の誘導作用及び癌細胞増殖の抑制作用をさらに評価するために、QuantiGene 2.0によって選別したsaRNA(RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688)を癌細胞株KU‐7(膀胱癌)、HCT116(結腸癌)及びHepG2(肝細胞癌)にトランスフェクションした。その結果、上記の全ての細胞株において、saRNAは、いずれもp21遺伝子のmRNA発現レベルを少なくとも2倍に誘導するとともに細胞増殖を抑制することができ、saRNAを介するp21の誘導による効果が示された。具体的には、RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれKU7細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を14.0、36.9、31.9倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が71.7%、60.7%、67.4%であった(図5)。RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれHCT116細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を2.3、3.5及び2.4倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が45.3%、22.5%、38.5%であった(図6)。RAG1‐431、RAG1‐553、RAG1‐688をそれぞれHepG2細胞にトランスフェクションし、それぞれがp21 mRNA発現を2.2、3.3及び2.0倍を誘導し、相対ブランク処理による活着率が76.7%、64.9%、79.9%であった(図7)。
関連参照
本明細書に引用された各特許文献及び科学文献の全ての開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に引用された各特許文献及び科学文献の全ての開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
等価
本発明は、その基本的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実施することができる。したがって、上記の実施例は、例示的なものであって、本発明を限定するものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記の明細書ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
本発明は、その基本的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実施することができる。したがって、上記の実施例は、例示的なものであって、本発明を限定するものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記の明細書ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
Claims (23)
- 小分子活性化RNAのその1本の鎖が配列番号5、6、7、8、9、10、11および12からなる群から選択される核酸配列における長さ16〜35ヌクレオチドである任意の連続的フラグメントと少なくとも75%の相同性又は相補性を有し、小分子活性化RNAがヒトp21遺伝子プロモーターの配列を標的とすることによりp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる、小分子活性化RNA。
- 前記小分子活性化RNAがセンス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖を含み、前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が二本鎖核酸構造が形成される相補領域を含み、前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖が、ヒトp21プロモーターの配列のうちの長さ16〜35ヌクレオチドである任意の連続的フラグメントと75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、99%以上或いは100%の相同性を有する、請求項1に記載の小分子活性化RNA。
- 前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が異なる二本の核酸鎖にある、請求項2に記載の小分子活性化RNA。
- 前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が同一の核酸鎖にあり、ヘアピン型一本鎖核酸分子を形成し、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補領域は、二本鎖核酸構造を形成する、請求項2に記載の小分子活性化RNA。
- 前記小分子活性化RNAの少なくとも1本の鎖は長さ0〜6ヌクレオチドの3'突出を有する、請求項3に記載の小分子活性化RNA。
- 前記小分子活性化RNAの2本の鎖は共に長さ2〜3ヌクレオチドの3'突出を有する、請求項5に記載の小分子活性化RNA。
- 前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖の長さ16〜35ヌクレオチドである、請求項2〜6の何れか1項に記載の小分子活性化RNA。
- 前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖が、配列番号13〜30、35〜46、59〜62、67〜74、77〜80、85〜96、103〜108、111〜118、121〜132、139〜140、147〜180、185〜186、189〜190、195〜198、201〜202、209〜212、215〜218、225〜240、243〜246、249〜258、261〜262、265〜270、275〜280、283〜300、303〜308、317〜320、323〜324、329〜348、351〜352、357〜358、361〜366、371〜392、399〜400、405〜412、415〜416、419〜424、429〜432、439〜442、447〜450、453〜458、463〜468からなる群から選択される核酸配列と少なくとも75%の相同性を有する、請求項1に記載の小分子活性化RNA。
- 前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖の配列が、配列番号13〜30、35〜46、59〜62、67〜74、77〜80、85〜96、103〜108、111〜118、121〜132、139〜140、147〜180、185〜186、189〜190、195〜198、201〜202、209〜212、215〜218、225〜240、243〜246、249〜258、261〜262、265〜270、275〜280、283〜300、303〜308、317〜320、323〜324、329〜348、351〜352、357〜358、361〜366、371〜392、399〜400、405〜412、415〜416、419〜424、429〜432、439〜442、447〜450、453〜458、463〜468からなる群から選択される、請求項8に記載の小分子活性化RNA。
- 前記小分子活性化RNAの少なくとも1個のヌクレオチドが化学修飾を有するヌクレオチドであり、前記化学修飾は、
(1)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列のヌクレオチドを繋げるホスホジエステル結合に対する修飾、
(2)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列におけるリボースの2'‐OHに対する修飾、
(3)前記小分子活性化RNAのヌクレオチド配列における塩基に対する修飾、又は
(4)前記小活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも1個のヌクレオチドがロックド核酸であること
の少なくとも1つから選択される、請求項1〜9の何れか1項に記載の小分子活性化RNA。 - 前記p21遺伝子の発現を少なくとも10%活性化又はアップレギュレーションさせる、請求項1〜10の何れか1項に記載の小分子活性化RNA。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の小分子活性化RNAの、細胞におけるp21遺伝子の表現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤の製造における使用。
- 前記小分子活性化RNAは、前記細胞に直接導入される、請求項12に記載の使用。
- 前記細胞が、哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞である、請求項13に記載の使用。
- 前記細胞が人体に存在する、請求項14に記載の使用。
- 前記人体がp21タンパク質の発現の不足による腫瘍に罹る患者であり、腫瘍への治療を図るために前記小活性化核酸分子が有効量で投与され、前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌が好ましい、請求項15に記載の使用。
- 標的部位は、配列番号5〜12からなる群から選択される任意の連続的な16〜35ヌクレオチド配列である、単離されたp21遺伝子小分子活性化RNA標的部位。
- 前記細胞に請求項1〜11の何れか1項に記載の小分子活性化RNAを投与する方法を含む、細胞におけるp21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる方法。
- 前記小分子活性化RNAは前記細胞に直接導入される、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞であり、さらに好ましくはヒトの膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌細胞である、請求項18又は19に記載の方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の小分子活性化RNA及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである、ことを特長とする、請求項21に記載の組成物。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の小分子活性化RNAの、又は請求項21又は22に記載の組成物の、p21遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる製剤の製造における使用、好ましくは腫瘍又は良性増殖性病変を治療するための製剤の製造における使用であり、より好ましくは前記腫瘍が膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌である、使用。
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