KR20210120034A - 사람 세포내 부착 분자 1(icam-1)에 대한 안티센스 약물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 세포내에서 부착 분자 ICAM-1의 발현을 억제하는 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터 또는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포 및 상기 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약제학적 조성물 뿐만 아니라, 특히 사람에서 염증 질환 또는 상태의 치료시 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사람 세포내 부착 분자(intercellular adhesion molecule) ICAM-1의 발현을 억제하는 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포 및 상기 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약제학적 조성물 뿐만 아니라, 특히 사람에서 염증 질환 또는 상태의 치료시, 이의 용도에 관한 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드(asON)는 전형적으로 16 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이 범위의 합성 단일-가닥 핵산(single-stranded nucleic acid)이다. 이는 서열-특이적인 양식으로 왓슨-크릭 상호작용(Watson-Crick interaction)을 통해 단일 가닥 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합하므로, 주로 전사-후 수준에서 표적 유전자 발현을 억제함으로써, 유전자 방현을 방해하는 주요 도구를 나타낸다.
1978년도에 asON에 대한 최초 보고(참고: Zamecnik, P.C., Stephenson, M.L., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S A., Vol. 75, pp. 280-284 (1978)) 이래로, (i) 표적 세포 및 표적 환경에서 연장된 반감기, (ii) 표적 mRNA와의 복합체의 안정성을 증가시킴에 의한 생물학적 효능, (iii) 표적 세포 및 조직으로의 개선된 전달, 및 (iv) 예를 들면, 감소된 비-특이적인 독성 및 면역-자극과 같은 바람직하지 않은 부작용을 포함하는 다수의 특성에 의해 효능을 개선시키는 매우 다양한 화학적 변형이 개발되었다. 이로써, 올리고뉴클레오타이드의 모든 모이어티(moiety)(즉, 당 모이어티, 핵염기, 및 뉴클레오타이드간 포스페이트 골격)는 화학적 변형의 대상이 되어 왔다.
과거 수십년에 걸쳐 asON에 대한 3 내지 거의 4개의 소위 "화학 세대"가 개발되었다(참고: Deleavey, G.F., Damha, M.J., Chemistry & Biology, Vol. 19, pp. 937-954 (2012); Khvorova, A., Watts, J.K., Nat. Biotechnol., Vol. 35, pp. 238-248 (2017)). 일반적으로, asON의 보다 진전된 세대는 asON의 상기 언급한 대표적인 특징의 점전적인 개선에 의해 특징화된다. 화학적으로 변형된 asON의 관련 세트에 의한 안티센스 효과의 정도의 비교는 LNA(록킹(locking)된 핵산) > 포스포로티오에이트-변형된 골격 > 2'-OMe-변형된 당(참고: 도 1 및 표 1 뿐만 아니라 문헌: Grunweller, A. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 31, pp. 3185-3193 (2003))인, 효능의 순서를 명확하게 나타낸다.
asON의 고 효능에 대한 두번째로 중요한 전제조건은 표적 RNA의 국소 구조 및 이의 접근성(accessibility)과 관련되어 있다(참고: Bo, X. et al., BMC Bioinformatics 7:122, (2006); Schubert, S. et al., J. Mol. Biol. Vol. 348, pp. 883-893 (2005); Sczakiel, G., Kretschmer-Kazemi Far, R., Curr. Opin. Mol. Ther., Vol. 4, pp. 149-153 (2002)). 이러한 요인은 국소 표적 부위가 정의되면 변화될 수 없다. 따라서, 주어진 양호한 국소 표적 부위의 경우, 효능은 선택된 안티센스 분자의 특성에 의해, 즉, 이의 화학을 변형시킴에 의해서만 개선시킬 수 있다.
전형적으로, asON의 생물학적 효능은 적절한 세포 시스템에서 시험된다. 사람 표적 유전자의 경우에, 시험은 적절한 사람 세포주로 시작한다. 일반적으로, 50% 표적 억제(IC50 값)를 유발하는 억제제의 용량을 사용하여 효능을 비교한다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드-계 약물/억제제의 경우에, 용량-반응 관계는 불규칙할 수 있다. 이는 때때로 100%의 표적 유전자 억제가 달성될 수 없거나 억제가 용량 의존적이 아님을 의미한다. 따라서, 보다 많은 매개변수를 바람직하게 사용함으로써 asON의 생물학적 효과를 특성화한다. 따라서, 주어진 표적에 대한 asON의 사용에 관한 억제 연구는 흔히 (i) "표적 억제의 최대 달성가능한 정도", (ii) 최대 표적 억제의 1/2의 농도(IC50 값), (iii) 주어진 asON 농도(예컨대, 100 nM)에서 표적 억제의 정도, 및 (iv) 전반적인 용량-반응 관계에 의해 특성화된다. 표적 억제의 이러한 중요한 매개변수는 흔히 비-합리적인 양식으로 변한다. 이러한 이유로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 대조군 올리고뉴클레오타이드의 작용의 총괄적인 설명이 일반적으로 고려된다.
asON에 대해 특히 관심있는 표적은 예컨대, 사람에서 염증 공정을 예방 또는 치료하기 위해, 사람 세포내 부착 분자 1(ICAM-1; CD54)에 대한 유전자의 mRNA를 나타낸다. ICAM-1은 건강한 세포내에서 기본적인 유전자 발현을 이미 나타내며, 이는 흔히 염증에서 자극된 발현의 약 40 내지 50%이다. 사람에서 염증을 예방 또는 억제하기 위하여 ICAM-1을 억제하는 경우, 이는 바람직하지 않은 부작용을 이끌 수 있으므로, 건강한 기본 발현 수준 이하로 떨어지지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. ICAM-1 억제제 안티센스 핵산은 독성 또는 비특이적인 면역자극성 효과로 인하여 부작용을 유발하지 않을 수 있으며 생산하기에 가장 비용-효과적일 수 있다.
ICM-1에 대한 asON의 큰 다양성이 지금까지 기술되었다(참조: 예컨대, Chiang, M-Y. et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, pp. 18162-18171 (1991); Patzel, V. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 27, pp. 4328-4334 (1999)). 그러나, 이러한 asON는 상이한 결점, 예를 들면, 비-최적화된 억제 효과(예컨대, 기본 발현 수준 하에 불량한 효능 또는 억제), 독성, 비특이적인 면역자극 효과(예를 들면, CpG 모티프(motif)로 인하여), 및 대규모의 생산 비용을 겪고 있다.
따라서, 본 발명의 기초를 이루는 기술적 문제는 ICAM-1의 유전자 발현을 기본 발현 수준에 근접하게 억제하기 위한 수단 및 사람 세포에 대해 낮은 독성 및 비특이적인 면역자극 효과를 가지고 낮은 생산 비용으로 접근가능한 수단을 제공하는 것이다.
상기 기술 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 특성화된 구현예에 의해 달성된다.
특히, 제1 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특히 표적 분자로서 ICAM-1의 특이적인 mRNA 서열에 관한 것이며 바람직하게는 ICAM-1 mRNA(HSICAM01:J03132)의 1841 내지 1860번 위치에 결합할 수 있다.
이와 관련하여, 본원에 사용된 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 유리하게는 자극된 ICAM-1 발현을 억제할 수 있고 동시에 바람직하게는 사람에서 기본 ICAM-1 발현의 수준을 (유의적으로) 억제할 수 없다. 특히, 자극된 ICAM-1 발현을, 실험 조건 하에서 IL-1β-자극된 범위의 유전자 발현을 30% 내지 35% 이상 남기는 효능을 가지지 않는, 이미 공지된 asON 표적화 ICAM-1에서와 같이 보다 큰 정도로 억제시키는 것이 가능하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 바람직하게는 ICAM-1 유전자 발현의 IL-1β-자극된 범위를, 효능의 주요 개선에 대해 일반적으로 이미 공지되어 있지 않거나 심지어 보다 낮은 효능에 대해 공지되어 있는, 제1세대/제2세대의 화학적 변형의 특이적인 경우에서 조차 40% 이하 및 -10% 이상 하향-조절(down-regulate)시키는 것이 가능하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 사람에서 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 질환 또는 상태는 ICAM-1의 과발현과 관련되어 있다. 바람직하게는, 질환 또는 상태는 급성 또는 만성 염증 질환 또는 상태, 바이러스 감염, 전이, 피부의 염증, 조혈 줄기 세포의 가동화(mobilization), 비염(coryza), 궤양성 결장염(ulcerative colitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 기관 거부 반응(organ rejection reaction), 동종이계 골수 이식에 대한 이식체-대-숙주 반응(graft-versus-host reaction), 건선, 천식, 및 신경피부염(neurodermatitis)으로부터 선택된다. 바람직하게는, 질환 또는 상태는 사람에서 구강의 염증 질환 또는 상태이다. 바람직하게는, 예방 또는 치료될 구강의 염증 질환 또는 상태는 잇몸의 만성 염증, 예컨대, 치주 질환 또는 상태, 보다 바람직하게는 치은염, 만성 치주염, 공격적 치주염(aggressive periodontitis), 치주염 및 임플란트 주위염(peri-implantitis) 또는 전신 질환의 만연으로서 무코시비티스(mukosivitis), 궤사 궤양 잇몸염(necrotizing ulcerative gingivitis), 궤사 궤양 치주염(necrotizing ulcerative periodontitis), 치주조직의 농양(abscesses of the periodontium), 및 복합 치주-내과 병변(combined periodontic-endodontic lesion)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치주 질환 또는 상태이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 뉴클레오타이드의 천연의, 반-합성의, 합성의 또는 (화학적으로) 변형된, 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 적합한 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 염기, 당, 및/또는 포스페이트 그룹을 지닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 제조, 단리 및/또는 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성 또는 효소적 방법 및 후속적인 정제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 상기 요약된 화학의 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 갭머 올리고뉴클레오타이드(gapmer oligonucleotide)이다.
본원에서 용어 "갭머 올리고뉴클레오타이드"는 예컨대, 2'-O-메틸 RNA 올리고뉴클레오타이드 서열에 의해 상이한 화학 조성의 단일 가닥 분절에 의해 하나의 말단 또는 말단 둘 다에서 플랭킹된 중심의 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 말단 올리고뉴클레오타이드 서열은 각각 바람직하게는 2 내지 7개, 보다 바람직하게는 4개의 올리고뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 바람직하게는, 갭머 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 인식 아암(arm) 및 핵산 코어를 포함함으로써 특이적인 RNAse H 절단을 유발하는 제2세대 RNA/DNA 갭머 올리고뉴클레오타이드이다.
본원에서, 용어 "서열 번호: 1에 따른 뉴클레오타이드 서열의 단편"은 서열 번호: 1의 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 15개, 또는 18개의 뉴클레오타이드를 갖는 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오타이드 서열의 생물학적으로 활성인 단편을 의미하는데, 즉, 상기 단편은 서열 번호: 1의 10, 12, 15, 또는 18개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 구체적인 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 단편으로 이루어지는데, 즉, 상기 올리고뉴클레오타이드는 10, 12, 15, 또는 18개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 단편을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 적어도 10, 12, 15, 또는 18개의 뉴클레오타이드, 및 최소 50개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 40개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 35개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 30개 이하의 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 25개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는다. 용어 "생물학적으로 활성인"은 표적 분자로서 ICAM-1의 특이적인 RNA 서열에 결합하여 자극된 유전자 발현을 억제하고 바람직하게는 ICAM-1의 기본 유전자 발현을 (유의적으로) 억제하지 않는 이러한 단편의 능력을 지칭한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 1에 따른 전체 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는데, 즉, 상기 올리고뉴클레오타이드는 20개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 20 내지 50개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20 내지 35개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 ICAM-1 유전자 발현의 자극된 범위, 바람직하게는 IL-1β-자극된 범위를 하향-조절할 수 있다. ICAM-1 유전자 발현의 자극된 범위, 바람직하게는 IL-1β-자극된 범위는 바람직하게는 100% 자극된, 바람직하게는 IL-1β-자극된, ICAM-1 유전자 발현을 기반으로, 40% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 8.0% 이하, 보다 바람직하게는 6.0% 이하, 보다 바람직하게는 5.0% 이하, 및 가장 바람직하게는 4.0% 이하로 하향-조절된다. 더욱이, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 사람에서 기본 ICAM-1 발현의 수준을 동시에 (유의적으로) 억제할 수 없다. 따라서, ICAM-1 유전자 발현의 자극된 범위, 바람직하게는 IL-1β-자극된 범위는 바람직하게는 100% 자극된, 바람직하게는 IL-1β-자극된, ICAM-1 유전자 발현을 기반으로, -10% 이하, 보다 바람직하게는 -5.0% 이상, 보다 바람직하게는 -3.0% 이상, 보다 바람직하게는 -1.0% 이상, 및 가장 바람직하게는 0.0% 이상으로 하향-조절된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 설명 및 정의는 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 세포내로 핵산의 수송을 위한 임의의 벡터에 관한 것이다. 특히, 상기 용어는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터(cosmid vector), 및 인공 염색체를 포함하고, 여기서 플라스미드 벡터가 특히 바람직하다. 대표적인 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 더욱이, 용어 " 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터"는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 상보성인 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 이는 전사 후 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생성한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 설명 및 정의는 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다. 대표적인 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 이는 예를 들면, 적합한 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 설명 및 정의는 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "의약"은 약제학적으로 활성인 양의 적어도 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 약제학적 조성물은 사람에게 의약을 전달하기에 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 특수한 제한을 나타내지 않으며 예를 들면, 경구 적용, 피부 적용, 국소 적용, 국소 적용의 다른 형태(예컨대, 전달 장치의 사용)를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 조직, 특히 예를 들면, 점막 조직내에서 올리고뉴클레오타이드를 방출할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 속의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 약제학적 조성물 속의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 1.0 pM 내지 10 M, 바람직하게는 0.10 μM 내지 5.0 M, 보다 바람직하게는 1.0 μM 내지 500 mM, 보다 바람직하게는 10 μM 내지 500 μM, 심지어 보다 바람직하게는 50 μM 내지 200 μM일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다. 상술한 설명 및 정의는 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 적합한 완충제 및/또는 적합한 분산가능하고/하거나 적합한 효소를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 ICAM-1의 발현을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 상기 설명 및 정의는 본 발명의 양태에 동일하게 적용된다. 바람직한 구현예에서, 시험관내에서 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 벡터를 사람 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는, ICAM-1의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 설명 및 정의는 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다. 바람직한 구현예에서, 방법은 시험관내에서 수행된다.
본 발명은 다음의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
N = 2'-데옥시 뉴클레오시드;
mN = 2'-O-메틸 뉴클레오시드;
5mC = 2'-데옥시-5-메틸-사이티딘;
m(5mC) = 2'-O-메틸 5-메틸-사이티딘;
모든 뉴클레오타이드내 포스페이트는 모노포스포로티오에이트-변형된다.
다음의 서열 번호: 2 내지 12에서, 다음의 약어가 적용된다:
L = LNA-변형된 뉴클레오타이드(LNA, 로킹된 핵산);
F = 2'-플루오로-변형된 리보스;
M = 2'-O-메틸-변형된 리보스;
* = 포스포로티오에이트-변형된 뉴클레오타이드내 포스페이트;
도면은 다음을 나타낸다:
도 1: 그륀벨러(Grunweller) 등의 문헌(참고: Grunweller, A. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 31, pp. 3185-3193 (2003)으로부터 유도된 변형된 asON의 성능의 순서: LNA > 포스포로티오에이트 > O-메틸 갭머. 당해 세트에서, siRNA는 가장 강력한 억제제이다. 당해 순서는 용량-반응 관계에 의해 나타난다. 원래의 문헌으로부터 변형된 asON에 대한 약어는 명확성을 위해 본원에서 완전하게 기술된다.
본 발명을 이에 한정되지 않는 다음의 실시예에서 추가로 나타낼 것이다.
도 1: 그륀벨러(Grunweller) 등의 문헌(참고: Grunweller, A. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 31, pp. 3185-3193 (2003)으로부터 유도된 변형된 asON의 성능의 순서: LNA > 포스포로티오에이트 > O-메틸 갭머. 당해 세트에서, siRNA는 가장 강력한 억제제이다. 당해 순서는 용량-반응 관계에 의해 나타난다. 원래의 문헌으로부터 변형된 asON에 대한 약어는 명확성을 위해 본원에서 완전하게 기술된다.
본 발명을 이에 한정되지 않는 다음의 실시예에서 추가로 나타낼 것이다.
물질 및 방법
올리고뉴클레오타이드
모든 올리고뉴클레오타이드를 시판 공급업자로부터 수득하였다. 품질 제어는 UV 흡수 측정 및 겔 전기영동에 의한 통합성 점검을 포함한다. 모든 올리고뉴클레오타이드의 수율 및 순도를 UV 흡수 분광법으로 측정하고 통합성은 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔에 이은 염료(Stains)-All(SIGMA-ALDRICH, 독일 다이센호펜 소재)로 염색하여 제어하였다.
세포주 및 세포 배양
사람 세포주 ECV304를 사용하여 내인성 표적 유전자 세포간 부착 분자 1 (ICAM-1; CD54, 분화의 군집(Cluster of Differentiation) 54)의 발현에 있어서 올리고뉴클레오타이드의 영향을 측정하였다. DSMZ-미생물 및 세포 배양물의 독일 기탁기관(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(독일 브라운슈바이크 소재)에 따른 DNA 핑거프린팅(fingerprinting)은 ECV304가 ICAM-1을 유도가능한 방식으로 발현하는 사람 뇨 방광 암종 세포주 T-24의 유도체임을 나타낸다(참고: Dirks, W.G. et al. In Vitro Cell Dev. Biol., Vol. 35, pp. 558-559, (1999)).
ECV304 세포를 25 mM 헤페스(Hepes) pH 7.4로 완충시키고 0.68 mM L-글루타민 및 10% FCS(태아 소 혈청, Invitrogen, 독일 칼스루헤 소재)가 보충된 배지 199(SIGMA-ALDRICH, 독일 다이센호펜 소재) 속에 유지시켰다. 세포를 트립신처리 1주 후 2 내지 3회 통상적으로 분할하였다. ICAM-1(CD54)의 자극을 위해 200 U/ml 인터류킨 1β(IL-1β; PromoCell, 독일 하이델베르크 소재)를 배지에 가하고 세포를 밤새 항온처리하였다(16 내지 18시간).
사람 ECV-304 세포내에서 ICAM-1 유전자 발현의 IL-1β-유도된 상태의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제 특성
asON을 사용항 세포의 형질감염
올리고뉴클레오타이드 처리 15시간 전에 ECV304 세포를 12-웰 배양 플레이트에 1.5x105개 세포/웰의 밀도로 씨딩(seeding)하였다. 이후에, 세포를 예비-가온시킨(37℃) 혈청-감소된 Opti-MEM I 배지(Invitrogen, 독일 칼르루헤 소재)로 1회 세척하였다. asON를 세포에 전달하기 위해, 2회 형질감염 프로토콜을 사용하였다: (1) 양이온성 지질 DOTMA/DOPE(리포펙틴(Lipofectin); Invitrogen/Thermo Fisher, 미국 록포드 소재)를 사용한 형질감염을 웰 당 0.1 μM asON 또는 siRNA 및 5 μg/ml의 리포펙틴을 함유하는 1 ml의 Opti-MEM I 배지를 사용하여 수행하였다. (2) 리포펙타민 2000(Invitrogen/Thermo Fisher, 미국 록포드 소재)을 사용하여, asON의 형질감염을 웰 당 0.1 μM asON 및 10 μg/ml의 리포펙타민 2000을 함유하는 0.4 ml의 Opti-MEM I 배지를 사용하여 수행하였다. 세포를 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 후속적으로, 형질감염 배지를 10% FCS를 함유하는 배지 199로 대체하였다. 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리한 후, 배지를 10% FCS 및 200 U/ml IL-1β를 함유하는 배지 199로 다시 치환하여 ICAM-1 발현을 자극하였다. 면역형광성 분석을 위해, IL-1β로 자극한 후 세포를 배양 디쉬로부터 PBS(인산염 완충된 염수) 중 100 μl의 0.25% 트립신/0.02% EDTA로 5분 동안 37℃에서 16 내지 18시간 동안 트립신처리함으로써 배양물로부터 제거하였다. IL-1 β 및 대조군 asON 또는 siRNA로 처리한 세포의 ICAM-1-특이적인 유전자 발현은 100%로 설정하는 반면, 대조군 asON 또는 siRNA 만으로 처리한 세포의 유전자 발현은 기본 발현 수준으로 정의하였다.
ICAM-1-특이적인 표적 단백질의 정량화: 면역형광성 염색 및 유동 세포분석법
세포를 인산염-완충된 염수(PBS, pH 7.4)로 세척하고 피코에리트린(PE)-접합된 CD54 모노클로날 항체(클론 LB-2) 또는 동형-동일한 PE 대조군(둘 다, Becton Dickinson, 독일 하이델베르크 소재)과 함께 1% BSA(소 혈청 알부민)를 함유하는 50 μl의 PBS 속에서 4℃로 30분 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 세포를 PBS로 세척하고 1% 파라포름알데하이드(pH 7.4)를 함유하는 PBS 속에서 현탁시켰다. 세포를 Becton Dickinson FACSCalibur 및 CellQuest Pro 소프트웨어(Becton Dickinson, 독일 하이델베르크 소재)를 사용하여 분석하였다. 죽은 세포를 게이팅 아웃(gating out)한 후, 평균(PE)-형광성 강도를 측정하고 ICAM-1 유전자 발현의 억제를 100%로 설정된 IL-1β-유도된 상태에 대해 표준화하였다. 기본적인 유전자 발현 수준은 대략 35%이었다.
ICAM-1-특이적인 표적 RNA의 정량화: 정량적 RT-PCR
총 RNA를 RNase-유리된 DNase I(Qiagen, 독일 힐덴 소재)을 사용한 처리를 포함하는 RNeasy 미니 키트(mini kit)를 사용하여 형질감염된 세포로부터 추출하였다. RNA의 수율 및 순도를 분광광도법으로 측정하였다. cDNA의 합성을 무작위 헥사머 프라이머 및 Superscript II RNase H-리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 사용하여 제조업자의 명세(Invitrogen/Thermo Fisher, 미국 록포드 소재)에 따라 수행하였다. 정량적 PCR을 GeneAmp 5700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems/Thermo Fisher, 미국 록포드 소재) 및 SYBR 녹색 PCR 코어 시약(Eurogentec, 벨기에 세라잉 소재)을 사용하여 수행하였다. ICAM-1 cDNA을 전방 프라이머(forward primer) 5'-GCCACTTCTTCTGTAAGTCTGTGGG-3' 및 역방 프라이머(reverse primer) 5'-CTACCGGCCCTGGGACG-3'로 증폭시켜 300 bp의 단편을 생성하였다. 샘플을 사람 GAPDH(전방 프라이머, 5'-AACAGCGACACCCACTCCTC-3' 및 역방 프라이머, 5'-GGAGGGGAGATTCAGTGTGGT-3')를 암호화하는 cDNA에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 표준화함으로써 258 bp의 생성물을 수득하였다. 표준 곡선은 2.5x103 내지 2.5x107개 카피의 정제된 플라스미드 pP5, ICAM-1 프라이머 세트 및 플라스미드 pCR-GAPDH로 생성시킨 앰플리콘(amplicon)을 수반하는 pEGFP-C1의 유도체, GAPDH 앰플리콘 서열을 지닌 pCR 2.1의 유도체의 증폭 후 수득하였다.
상기 실험의 결과는 하기 표 2에 요약한다.
1)ON, 올리고뉴클레오타이드.
2) 음성 값은 ECV304 세포에서 유도되지 않은 상태 이하의 ICAM-1 억제와 관련되어 있다. 이러한 가장 강력한 LNA-변형된 분자는 ICAM-1 발현을 기본 수준 이하로 억제하며, 이는 상기 요약한 바와 같이 바람직하지 않다. 단지 상기 기본 수준 이상의 유도된 상태, 즉, ICAM-1 발현의 증가된 수준 만이 만성 염증과 관련된 것으로 여겨진다.
3) RNA의 수준에서 유전자 발현은 단백질 수준과 비교가능하다(참고: Kretschmer-Kazemi Far, R., Sczakiel, G., Nucl. Acids Res., Vol. 31, pp. 4417-4424, (2003)).
nd, 측정될 수 없음
---, 측정가능한 표적 억제가 없음
또한, 다음의 표 3은 표 2에 제공된 서열 번호: 1 내지 9의 올리고뉴클레오타이드에 대한 데이타를 요약하며 예컨대, 독성 및 면역자극성 잠재력 뿐만 아니라 생산 비용과 관련하여 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 추가의 특성을 제공한다.
1) ON, 올리고뉴클레오타이드.
2) ++, IC50 < 5 nM; +, IC50 < 20 nM; -, IC50 > 20 nM.
3) 2'-OMe는 RNA 내에 천연적으로 존재하는 화학적 RNA 변형이다. 포스포로티오에이트 화학은 정맥내 전달되는 경우, 고 농도에서 독성일 수 있지만, 예컨대, 국소적으로는 그렇지 않을 수 있다.
4) 모든 사이토신이 변형되므로(5mC = 2'-데옥시-5-메틸-사이티딘), 면역 자극 없음.
5) 2'-불소화된 CpG 모티프의 면역-자극성 효능은 명확하지 않게 남아있다.
6) 포스포로티오에이트 골격과 함께 LNA 변형은 세포-의존성 독성을 나타내었다.
7) 2'-F 변형은 독성인 것으로 고려된다. 생체내 물질대사는 예컨대, HF를 생산할 수 있다.
모든 올리고뉴클레오타이드를 폴리아크릴아미드 겔-전기영동 및 UV 흡수 측정에 의해 순도 및 양에 대해 특성화하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드를 상술한 바와 같이, 사람 ECV-304 세포내에서 ICAM-1 발현을 억제하는 이의 효능에 대해 시험하였다.
asON에 의한 ICAM-1 유전자 발현의 IL-1β-유도된 상태의 억제를 ICAM-1 단백질 및 표적 mRNA의 수준에서 측정하였다. 그러나, 판독 유형 둘 다는 일관적으로 거동한다(Kretschmer-Kazemi-Far, R. et al., Oligonucleotides, Vol. 15, pp. 223-233 (2005); Kretschmer-Kazemi Far, R.,.Sczakiel, G., Nucl. Acids Res., Vol. 31, pp. 4417-4424, (2003)). IL-1β-자극된 수준을 100%로 설정한 경우 개개 실험에 따라, 각각 단백질 수준에서 30% 내지 40%의 범위 및 mRNA 수준에서 15% 내지 20% 범위의 유전자 발현의 기본적인 수준이 존재한다.
중요한 억제 특성은 표 2에 요약한다. 제1 및 제2세대 asON과 관련한 선행 분야에서의 일반적인 지식과는 대조적으로, 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 높은 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 매개변수의 설정 중에서 이는 낮은 IC50 값에 의해 가장 잘 반영된다. 특히, 동일한 국소 표적 부위를 표적화하는 화학적으로 변형된 asON은 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(IC50: 4 nM)와 비교하여 서열 번호: 8의 대조군의 IC50 값(41 nM)에 의해 반영된 강력하지 않은 1차수 크기이었다(Patzel, V. et al. Patzel,V., Nucl. Acids Res., Vol. 27, pp. 4328-4334 (1999))(표 2).
표 3은 서열 번호: 1 내지 9의 올리고뉴클레오타이드의 추가의 특성을 제공한다. 상응하는 데이타는 CMas1840(서열 번호: 1)이 지시된 ICAM-1 mRNA의 국소 표적 부위의 경우, 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 효능, 단순성, 독성 및 면역자극성 효능, 및 비용의 측면에서 가장 양호한 올리고뉴클레오타이드임을 입증한다.
더욱이, 상기 데이타는 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호: 10의 미스-매치 대조군(miss-match control)에 의한 및 서열 번호: 12의 스크램블드 대조군(scrambled control)에 의한 표적 억제의 결여로 뒷받침되는, 예측된 "안티센스 메카니즘"에 따라 작동함을 나타낸다(참고: 표 2).
상기 결과에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 화학적 변형이 효능의 주요 개선에 대해 알려져 있지 않거나 심지어 선행 분야에서 보다 낮은 효능에 대해 알려져 있는 제1세대(포스포로티오에이트) 및 제2세대 asON의 화학적 변형에 속한다 해도, 본 발명에 따른 서열 번호: 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능, 단순성, 독성 및 면역자극성 효능, 및 비용의 측면에서 제2.5세대 및 제3세대 화학을 능가한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Universitaet zu Luebeck
<120> Antisense drug against the human intercellular adhesion molecule
1 (ICAM-1)
<130> IP20214024DE
<150> EP 19 153 666.3
<151> 2019-01-25
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapmer oliguncleotide with a central single stranded DNA
oligonucleotide sequence flanked on both ends by single stranded
2'-O-methyl RNA oligonucleotide sequences and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-methyladenosine, um, 2'-O-methyl-5-methylcytidine,
2'-O-methyladenosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2'-deoxy-5-methylcytidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 2'-deoxy-5-methylcytidine, 2'-deoxy-5-methylcytidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> 2'-O-methyladenosine, gm, um, gm
<400> 1
ancagatgcg tggcctannn 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> central oligonucleotide sequence with monophosphorothioate
internucleotide linkages flanked on both ends by locked nucleic
acids
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> locked nucleic acid modified nucleotides
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(16)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates between
nucleotides 4 to 16
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> locked nucleic acid modified nucleotides
<400> 2
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide with 2'-fluoro-modified riboses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-fluoro-modified riboses
<400> 3
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapmer oliguncleotide with a central single stranded
oligonucleotide sequence flanked on both ends by single stranded
2'-fluoro-modified oligonucleotide sequences and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-fluoro-modified riboses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> 2'-fluoro-modified riboses
<400> 4
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide with 2'-O-methyl-modified riboses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-methyl-modified riboses
<400> 5
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide having 2'-O-methyl-modified riboses and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-methyl-modified riboses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<400> 6
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapmer oliguncleotide with a central single stranded
oligonucleotide sequence flanked on both ends by single stranded
2'-O-methyl-modified oligonucleotide sequences and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-methyl-modified riboses
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> 2'-O-methyl-modified riboses
<400> 7
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide having phosphorothioate-modified internucleotide
phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<400> 8
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapmer oliguncleotide with a central single stranded DNA
oligonucleotide sequence flanked on both ends by single stranded
2'-O-methyl RNA oligonucleotide sequences and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-methyladenosine, um, cm, 2'-O-methyladenosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> 2'-O-methyladenosine, gm, um, gm
<400> 9
annagatgcg tggcctannn 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapmer oliguncleotide with a central single stranded
oligonucleotide sequence flanked on both ends by single stranded
2'-O-methyl-modified oligonucleotide sequences and having
phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-methyladenosine, tm, cm, 2'-O-methyladenosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(20)
<223> 2'-O-methyladenosine, gm, tm, gm
<400> 10
annagattcg gggcctannn 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> unmodified DNA
<400> 11
atcagatgcg tggcctagtg 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide having phosphorothioate-modified internucleotide
phosphates
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> phosphorothioate-modified internucleotide phosphates
<400> 12
ggtcagacca gtgagttc 18
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for ICAM-1 cDNA
<400> 13
gccacttctt ctgtaagtct gtggg 25
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for ICAM-1 cDNA
<400> 14
ctaccggccc tgggacg 17
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for cDNA encoding human GAPDH
<400> 15
aacagcgaca cccactcctc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for cDNA encoding human GAPDH
<400> 16
ggaggggaga ttcagtgtgg t 21
Claims (15)
- 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 사람에서 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 질환 또는 상태가 ICAM-1의 과발현과 관련된, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제2항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 급성 또는 만성 염증 질환 또는 상태, 바이러스 감염, 전이, 피부의 염증, 조혈 줄기 세포의 가동화(mobilization), 비염(coryza), 궤양성 결장염(ulcerative colitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 기관 거부 반응(organ rejection reaction), 동종이계 골수 이식에 대한 이식체-대-숙주 반응(graft-versus-host reaction), 건선, 천식, 및 신경피부염(neurodermatitis)으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 10 내지 50개의 염기 길이를 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 ICAM-1의 특이적인 핵산 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제6항에 있어서, ICAM-1 유전자 발현의 자극된 범위가 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 100% 자극된 ICAM-1 유전자 발현을 기반으로, 40% 이하 및 -10% 이상으로 하향-조절(down-regulate)되는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제8항에 따른 벡터 또는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
- 약제학적으로 허용되는 양의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트(kit).
- ICAM-1의 발현을 감소시키기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 제8항에 따른 벡터를 사람 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는, ICAM-1의 발현을 감소시키는 방법.
- 용도 또는 방법이 시험관내(in vitro)에서 수행되는, 제12항에 따른 용도 또는 제13항에 따른 방법.
- ICAM-1의 발현이 100% 자극된 ICAM-1 유전자 발현을 기반으로, 40% 이하 및 -10% 이상으로 감소된, 제12항 또는 제14항에 따른 용도 또는 제13항 또는 제14항에 따른 방법.
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