CN106244588B - 激活肺癌细胞中RUNX3表达的saRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可激活肺癌细胞中抑癌基因RUNX3表达的双链小激活RNA（saRNA）及其应用。该saRNA分子的功效具有特异性高、专一性强的优点，在高效激活被异常沉默的RUNX3基因表达的同时，不上调其它基因的表达，也不对正常细胞产生毒副作用。该saRNA可有力抑制肺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和肿瘤干细胞自我更新能力，可以用于制备安全可靠、高效的抗肺癌药物。

Description

激活肺癌细胞中RUNX3表达的saRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种激活肺癌细胞中抑癌基因RUNX3表达的双链saRNA分子及其应用。
背景技术
肺癌是名副其实的“超级杀手”，其发病率和死亡率均居各种癌症的首位。该病早期常无明显症状，相当多的患者就诊时已处于中晚期并伴有转移，丧失了手术机会，此时的治疗以化疗为主。但是中晚期肺癌总体对化疗很不敏感，并且化疗药物具有强烈的毒副作用，对机体内的大量正常细胞，如肝细胞、肾小管上皮细胞、骨髓造血干细胞等造成巨大的毒性。研发新的肺癌治疗方法和治疗药物是全球科研及临床工作者所面临的重大课题。
近年的研究日益显示：一些在正常细胞中本应高表达的抑癌基因，在肺癌细胞中发生转录沉默，这些抑癌基因的转录沉默是肺癌发生发展的一个重要原因。重新激活肺癌细胞中被沉默的抑癌基因的转录活动，就可以有力的抑制癌细胞的恶性行为，逆转肿瘤的发生发展。这是一种安全可靠的治疗肺癌的新思路。
RUNX3是一种重要的抑癌基因，最初被命名为急性髓性白血病 2 基因，以后又被称作多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因、核心结合因子 3基因。该基因编码的蛋白，一方面作为 Wnt 信号通路的负调控因子，与 TCF4-β-catenin 形成复合体，阻止其与 c-MYC、cyclinD1 等靶基因的启动子区结合而抑制这些原癌基因的转录；另一方面作为TGF信号通路的正调控因子，与SMAD3/SMAD4协同作用上调p21 和BIM等抑癌基因的表达。在肺癌的发生发展过程中，RUNX3的转录常被沉默，导致癌细胞的无限增殖，使其获得迁移、侵袭、耐药、抗凋亡等一系列恶性行为。
与基因启动子区序列同源的双链小RNA 能特异性的作用于该基因的启动子，激活该基因的转录活动，从而有效上调其表达，这类双链小RNA被称为小激活RNA (saRNA)。
本发明针对肺癌细胞中被异常沉默的抑癌基因RUNX3，首次设计合成了作用于其启动子区-385 bp至 -361 bp 的saRNA，有效激活了肺癌细胞中RUNX3 的表达。
发明内容
本发明公开了一种可激活肺癌细胞中抑癌基因RUNX3表达的双链saRNA分子及其在研究领域和医药领域中的应用。
本发明公开的saRNA为一种新的RNA序列，将该saRNA转染肺癌细胞，可以有力抑制肺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和肿瘤干细胞自我更新能力。该saRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC- 3’
反义链5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC- 3’；
或
正义链：5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt -3’
反义链：5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt -3’。
本发明提出了一种saRNA重组质粒，该saRNA重组质粒包含前面所述的任意一种双链saRNA分子的序列。利用这样的重组质粒转染肺癌细胞，能够有效的激活RUNX3基因的表达，抑制肺癌细胞增殖，从而能够有效的治疗肺癌。
本发明提出了一种激活RUNX3转录的试剂盒，所述试剂盒包含前面所述的任意一种双链saRNA分子或saRNA重组质粒。利用本发明的试剂盒能够有效的激活肺癌细胞中RUNX3基因的表达。
本发明提出了一种抗肺癌药物，该药物含有有效量的saRNA分子或saRNA重组质粒，该抗肺癌药物可以采用常规方法制备成相应制剂，可通过皮下、肌肉、静脉和局部等途径给药。
本发明具有特异性高、专一性强的优点，能够高效的激活肺癌细胞中被沉默的抑癌基因RUNX3的表达，在激活RUNX3表达的同时，不上调其它基因的表达，对正常细胞无毒害作用，是一种安全可靠、高效的抗肺癌手段。
附图说明
图1是化学合成的saRNA转染人肺癌细胞SK-MES-1、H460、H446和A549后，实时荧光定量PCR检测RUNX3 mRNA表达量的结果。图中：纵坐标表示相对于未处理组的RUNX3 mRNA相对表达量；横坐标表示未处理组、阴性对照组（NC），转染30 nmol/L、60 nmol/L、90 nmol/L和120 nmol/L saRNA组。
图2是WesternBlot检测saRNA转染SK-MES-1、H460和H446细胞后，RUNX3蛋白的表达量，NC指阴性对照组，saRNA指转染90 nmol/L saRNA组。
图3是化学合成的saRNA转染人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446后，MTT法检测saRNA对肺癌细胞增殖能力的影响。图中：纵坐标表示相对于阴性对照组的相对增殖率；横坐标表示转染saRNA的浓度。
图4是90 nmol/L saRNA转染人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446后，对肺癌细胞克隆形成能力的影响。图 5 是90 nmol/L saRNA转染人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446后，对肺癌细胞悬浮成球能力的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：saRNA激活RUNX3 基因的转录。
步骤一、试剂及其试剂准备，以下实施例中，所使用的仪器：
荧光定量PCR仪（ABI 7500）；PCR仪（Biometra, T1 Thermobycler）；细胞培养箱（Thermo）等。
材料和试剂：RNAiMate (genepharma)，RPMI 1640培养基(Gibco)，Trizol (天根)，反转录试剂盒 (DRR014A PrimeScript™, TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）24孔培养板（Nunc）等。
PCR引物：
RUNX3正向引物：5' -CAGCACCACAAGCCACTTCA- 3'
RUNX3反向引物：5' -GGTCGGAGAATGGGTTCAGTT- 3'
GAPDH正向引物：5' -TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA- 3'
GAPDH反向引物：5' -GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT- 3'。
步骤二、化学合成saRNA
根据RUNX3启动子转录起始位点上游 385 bp至 361 bp的序列，设计saRNA:
正义链：5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt- 3'
反义链：5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt- 3'
将该序列在人类基因组数据库中比对，确定没有与它相同的其它序列。
步骤三、荧光定量PCR检测RUNX3 mRNA表达水平。
S31、细胞培养：人肺癌细胞SK-MES-1、H460、H446和A549培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。
S32、细胞铺板并转染：将四种癌细胞以3.5×104个/孔接种到24孔培养板中，每种细胞均设置未处理组、阴性对照组、30 nmol/L saRNA组、60 nmol/L saRNA组、90 nmol/LsaRNA组和120 nmol/L saRNA组。37℃、5％CO2培养箱培养过夜，无双抗无血清的培养基中，按siRNA-MateTM说明书中的步骤，将合成的saRNA按相应的剂量转染四种癌细胞。
S33、转染48 h 后收集细胞，Trizol提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT 反转录试剂盒进行反转录。荧光定量PCR检测样本中RUNX3 mRNA表达水平，以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次，反应体系20 μL，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 sec，60℃退火30 sec，循环40次。
S34、结果分析：saRNA能够有效激活肺癌细胞中RUNX3基因的转录，具有一定的浓度依赖性。
实施例2：saRNA激活RUNX3蛋白表达的情况。
将人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446分别以1.5×105个/孔接种到6孔细胞培养板中。在37℃、5％CO2培养箱细胞培养24 h，按siRNA-MateTM说明书中的步骤转染，设阴性对照组和90 nmol/L saRNA组，转染48小时后，吸除培养基，用PBS洗两遍，加入100 μL细胞裂解液，在冰浴上裂解10 分钟，用细胞刮将细胞刮下，转移至1.5 ml离心管中，10000 rpm离心5分钟后，取上清液测定蛋白浓度。每组取20 μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行RUNX3一抗及羊抗兔二抗孵育，然后进行化学发光反应，显影。
结果分析：saRNA有效激活肺癌细胞中RUNX3蛋白的表达（图 2）。
实施例3： saRNA对肺癌细胞增殖能力的影响。
将人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446以5×103个/孔分别接种到96孔细胞培养板中。在37℃、5％CO2培养箱细胞培养24小时，按siRNA-MateTM说明书中的步骤转染saRNA，设阴性对照组、30 nmol/L saRNA组、60 nmol/L saRNA组、90 nmol/L saRNA组和120 nmol/LsaRNA组，转染48小时后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37℃继续孵育4 h，吸除培养基，加入200 μL DMSO，490 nm波长测定吸光值。
结果分析： saRNA能够显著抑制肺癌细胞的增殖，并呈现浓度依赖性（图 3）。
实施例4：saRNA对肺癌细胞克隆形成能力的影响。
将三种癌细胞以3.5×104个/孔接种到24孔培养板中，按siRNA-MateTM说明书中的步骤，将合成的saRNA转染细胞，每种细胞均设阴性对照组和90 nmol/L saRNA组。于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。转染后24 h，收集细胞，以1000 个/孔的密度接种于6孔板，轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃、5％CO2培养箱培养培养1周。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1:3醋酸/甲醇3 mL，固定15分钟。结晶紫染液染10分钟，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜(低倍镜)下计大于40个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率，克隆形成率= (克隆数/接种细胞数)×100%。
结果分析： saRNA能够显著抑制肺癌细胞的克隆形成能力（图 4）。
实施例5：saRNA对肺癌细胞悬浮成球能力的影响。
使用90 nmol/L 的saRNA和阴性对照序列转染人肺癌细胞SK-MES-1、H460和H446，无血清培养液（1:1 DMEM/F12 medium，添加B-27和 N-2）中制成单细胞悬液，以1000个/孔的密度接种于超低吸附6孔板中，7天后，计数所形成的肿瘤球，并计算成球细胞比例。
结果分析： saRNA有力降低了成球细胞的比例（图 5），说明该saRNA能够抑制肺癌细胞中干细胞亚群的自我更新能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 内蒙古医科大学附属人民医院
<120> 激活肺癌细胞中RUNX3表达的saRNA及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gcccgcgggg cuccuagccc gccc
<210> 2
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gcccgcgggg cuccuagccc gccctt

Claims (4)

1.一种激活肺癌细胞中RUNX3基因表达的双链saRNA分子，包括以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC- 3'
反义链5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC- 3'；
或
正义链：5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt- 3'
反义链：5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt- 3'。
2.一种saRNA重组质粒，该重组质粒包含权利要求1所述的任意一种saRNA分子的序列。
3.一种RUNX3基因激活试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1-2所述的任意一种saRNA分子或saRNA重组质粒。
4.一种抗肺癌药物，其特征在于，该药物包含有效量的权利要求1-2所述的任意一种saRNA分子或saRNA重组质粒。
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