CN101988099A - 一种runx3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种RUNX3基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。中国的胃癌发病率以西北最高东北及内蒙古次之华东及沿海又次之中南及西南最低每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年还有2万以上新的胃癌病人产生出来，胃癌确实是一种严重威胁人民身体健康的疾病。

RUNX3是抑癌基因，序列号NM-0010316804340bp mRNAcds：440…..1729bp，在染色体1p36″位点上。RUNX3基因的表达降低或缺失是造成胃肠道癌的元凶，同时RUNX3基因的表达降低与肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等发病密切相关。有人通过筛查肝细胞癌(HCC)RUNX3遗传学和表遗传学异常，拟明确RUNX3基因在HCC发病过程中的作用。采用聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性、杂合缺失(LOH)分析、测序以及DNA甲基化特异化的PCR技术对90例HCC RUNC3基因突变、LOH及甲基化状念进行检测，对RUNX3基因缺失、甲基化结果与各临床病理参数的关系进行分析。结果未发现突变病例；但发现3个单核苷酸多念性分别存在于外显子1和4；LOH分析表明30.6％(11/36)的病例存在LOH；54.4％(49/90)的病例存在RUNX3基因高甲基化；RUNX3LOH与HCC门静脉癌栓、肝内转移和微血管受侵差异有显著性(x2值分别为4.729、4.581、4.581，P值均＜0.05)。结论HCC RUNX3基因存在高频率的LOH和高甲基化；RUNX3基因的异常可能存在HCC发病过程中起重要作用。同样研究人员为探讨Runx3抑癌基因与胃癌的发生发展的关系及其在胃癌中沉默机制，该基因表达降低或缺失是其基因沉默的主要机制，为胃癌等恶性肿瘤的诊疗提供新的策略和方案。Runx3基因是一个肿瘤抑制基因，其功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展有关。自2002年日本学者Li等首先报道Runx3有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用以来，Runx3与胃癌发生、发展的相关研究已成为胃癌研究领域的热点。Runx3来自Runt结构域转录因子，是转录因子Runx家族成员之一，Runt区域转录因子也称PEBP2/CBF，是TGF-β超家族信号重要的靶目标，在哺乳动物生长过程中扮演重要角色。该基因家族在哺乳动物有3个成员Runx1、Runx2、Runx3，它们的产物都是由α和β亚单位构成的异二聚体，具有不同生物学功能，Runx1与造血功能有关，Runx2是重要的骨生成调节因子，Runx3对脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生调控和T细胞的分化起重要作用。Runx3基因位于人染色体的1p36″.1，基因全长约67kb，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1290bp的开放阅读框，内含子1跨越了整条基因全长的一半。两个启动子区域均含数个分离的转录起始点，其中Runx3 mRNA主要来自于P2启动子的转录。两个启动子的GC含量不同，P2启动子GC含量高。在外显子2相当于启动子P2的位置和外显子6的起始部位有两个大CpG岛。人类Runx3蛋白是α、β两个亚单位构成的异二聚体，包含415个氨基酸残基，α亚单位含有一个RD保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128个氨基酸组成，介导Runx蛋白与DNA结合以及蛋白质之间的相互作用。α亚单位介导RD与靶DNA结合，β亚单能增强RD与靶DNA的结合力。Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸，对基因的转录调控起重要作用。有人研究发现敲除Runx3的小鼠胃黏膜明显增厚，Runx3-/-小鼠培养细胞对TGF-β诱导的生长抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃组织中半胱天冬酶3无活性。Fukamachi等研究发现Runx3缺失时胃黏膜细胞处于低分化状态。这些观察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生长调控因子，是胃上皮细胞中重要的致凋亡因素。癌中Runx3表达情况研究发现，胃癌中Runx3的表达明显下调或缺失。Li等应用RT-PCR、Southernblot和原位杂交方法对15株胃癌细胞系和46例胃癌组织标本的Runx3mRNA表达进行检测，结果发现47％的胃癌细胞系中Runx3零或低表达；60.9％的胃癌组织中Runx3零表达或低表达，Runx3的表达率与胃癌临床分期呈负相关。所以认为Runx3基因与胃癌的发生、发展有着极其密切的关系，并且随着胃癌分期的增高表达进一步降低。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种RUNX3基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种RUNX3基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用推广。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测胃癌发生动态过程，以及用于胃癌预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测RUNX3异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性胃癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床胃癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施胃癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治胃癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中胃癌病人RUNX3基因表达图片。

图2是正常人RUNX3基因表达图片。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液         100μl/管  1管/盒    无色透明液体

保护液         100μl/管  1管/盒    无色透明液体

预杂交液       1300μl/管 2管/盒    无色透明液体

正义杂交液     10μl/管   1管/盒    无色透明液体

反义杂交液     10μl/管   1管/盒    无色透明液体

封闭液         1000μl/管 1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μl/管    1管/盒    无色透明液体

显色剂A        175μl/管  1管/盒    黄色液体

显色剂B        320μl/管  1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x    90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x   80ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x  20m/瓶     3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液         90ml/瓶    1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本   6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O  360g

KCl  2g

KH₂PO₄      2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl     几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris  121.1g

NaCl  87.66g

HCl  60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种RUNX3基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的RUNX3基因表达量，用来确定胃癌的预后。临床研究表明，RUNX3基因在胃癌中低表达，因为RUNX3基因在正常人高表达，RUNX3基因的低表达说明胃癌，RUNX3基因的表达程度与胃癌的预后有关，属负相关，表达愈低预后愈差。从而获得胃癌的诊断信息。如上所述，当检测RUNX3基因表达时，可预测受试者为胃癌情况。

本发明实施例采样为：胃癌病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症转移病人RUNX3基因不表达，细胞无染色；正常对照组RUNX3基因有过度表达，细胞染色。具体结果请见图1，图2。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4340

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

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ctgatcctgg agaggcaggg atagtaaata aattgctctt cctaccccat cccccatccc    3900

ctgacaaaaa gtgacggcag ccgtactgag tctgtaaggc ccaaagtggg tacagacagc    3960

ctgggctggt aaaagtaggt ccttatttac aaggctgcgt taaagttgta ctaggcaaac    4020

acactgatgt aggaagcacg aggaaaggaa gacgttttga tatagtgtta ctgtgagcct    4080

gtcagtagtg ggtaccaatc ttttgtgaca tattgtcatg ctgaggtgtg acacctgctg    4140

cactcatctg atgtaaaacc atcccagagc tggcgagagg atggagctgg gtggaaactg    4200

ctttgcacta tcgtttgctt ggtgtttgtt tttaacgcac aacttgcttg tacagtaaac    4260

tgtcttctgt actatttaac tgtaaaatgg aattttgact gatttgttac aataatataa    4320

ctctgagatg tgtggaagga                                                4340

Claims (10)

1.一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测胃癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种RUNX3基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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