KR102543554B1 - 기억 유연성이 향상된 마우스 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 의 발현 억제를 통해 기억 유연성(memory flexibility)이 향상된 Ccny 녹아웃(knockout, KO) 마우스 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 이전에 학습한 정보의 수정 또는 제거와 관련된 작업에서 시냅스 가소성에 대한 CCNY의 역할을 밝히고, 기억 유연성과 관련된 뇌질환의 원인 이해를 도우며, 궁극적으로 기억 유연성 저하를 포함하는 뇌질환을 치료하기 위한 요법 및 진단에 응용될 수 있다.

Description

기억 유연성이 향상된 마우스 및 이의 용도{Mice displaying an improved memory flexibility and uses thereof}

본 발명은 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 의 발현 억제를 통해 기억 유연성(memory flexibility)이 향상된 Ccny 녹아웃(knockout, KO) 마우스 및 이의 용도에 관한 것이다.

해마 기반 기억 형성은 시냅스 효능의 변화(가소성)를 요구하는 것으로 알려져 있다(Bliss TV, Collingridge GL, 1993). 해마 기반 시냅스 가소성의 주요 종류에는 시냅스 장기강화(long-term potentiation, LTP)와 시냅스 장기억제(long-term depression, LTD)가 있다(Bear MF, Malenka RC, 1994). 자극에 의한 시냅스 효능의 증가인 장기강화 및 시냅스 효능의 감소인 장기억제는 뇌의 학습 및 기억의 기초가 된다.

한편, 세포분열을 조절하는 필수 핵심 단백질로 알려진 사이클린(Cyclin)의 일종인 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY)는 세포분열과 관련된 암생물학 분야에서 2010년부터 그 기능이 미미하게 보고되고 있는, 상대적으로 신규 단백질이다. CCNY는 단일 신경세포에서 시냅스 제거 및 형성을 동시에 조절하여 시냅스 리모델링에 관여한다는 것이 학계에 보고된 바 있으며, 장기강화를 발현하는데 중요한 기억을 매개하는 수용체인 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체의 후-시냅스로의 전달을 저해함으로써 장기강화를 억제하는, 신경계에서 기억 조절분자로서 역할을 한다는 것이 알려져 있다(한국등록특허 제10-2062728호).

그러나, 장기억제 및 이와 밀접한 기억 유연성(memory flexibility) (Nicholls RE et al., 2008) 과 CCNY와의 관련성은 아직까지 알려진 바 없다.

기억 유연성은 과거의 기억을 수정 및 제거하고 새로운 기억을 형성하여 변화하는 환경에 적응할 수 있게 하는 능력을 의미하며, 기억력과 구별되는 개념으로, 기억력에 비해 환경 적응성과 밀접되나 다소 연구된 바가 적어 기억 유연성과 관련된 유전자, 단백질이 확인된 바가 상대적으로 적다.

최근 기억 유연성을 증진시키는 것에 대한 요구가 있는 바, 기억 유연성의 저하나 증가를 판단할 수 있는 새로운 동물 모델이 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 CCNY 단백질과 기억유연성과의 관계를 입증함으로써, 새로운 동물모델을 제시하고, 나아가 CCNY를 억제시 기억 유연성을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되어 기억 유연성이 향상된 모델 마우스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기억 유연성이 향상된 모델 마우스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된, 기억 유연성 저하제 스크리닝용 모델 마우스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기억 유연성 저하제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CCNY 억제제를 유효성분으로 포함하는 기억 유연성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되어 기억 유연성이 향상된 모델 마우스를 제공한다.

본 발명에서 용어, "기억 유연성(memory flexibility)"은 단서 및 문맥의 변화에도 불구하고 과거의 기억을 수정 및 제거하고 새로운 기억을 형성하여 변화하는 환경에 적을 할 수 있게 하는 능력을 의미한다. 기억 유연성은 동등하지 않을 것 같은 미래의 다양한 상황에 따라 불필요해진 과거 경험을 수정 및 제거하여 새로운 상황에 필요한 기억을 더 잘 형성 할 수 있게 해준다(Jean-Nicolas Audet, Louis Lefebvre, 2017). 기억 유연성은 시냅스 장기억제와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Nicholls RE et al., 2008).

본 발명에서 용어, "장기억제(long-term depression, LTD)"란 시냅스 효능의 변화(가소성)를 요구하는 해마 기반 기억 형성(Bliss TV, Collingridge GL, 1993) 에 있어서, 시냅스 효능의 감소에 해당하는 시냅스 가소성을 의미한다. 해마 기반 시냅스 가소성의 주요 종류에는 시냅스 효능의 증가에 해당하는 시냅스 장기강화와 시냅스 효능의 감소에 해당하는 시냅스 장기억제가 있으며(Bear MF, Malenka RC, 1994), 상기 두 가지의 시냅스 가소성은 뇌의 학습 및 기억의 기초가 된다.

상기 장기강화 및 장기억제는 시냅스 효능의 증감에 있어 서로 반대되는 기전으로 당업계에서 장기강화 및 장기억제는 명확하게 구분하여 사용하는 개념이다. 구체적으로, 기억력은 시냅스 가소성 중에서 장기강화와 관련이 있고, 기억유연성은 장기억제와의 연관성이 추가적으로 요구되며, i) NMDAR-의존적 장기억제의 저해(Russell E. Nicholls et al., 2008), ii) PI3Kγ의 결실(Jae-Ick Kim et al., 2011), 또는 iii) 생체 내 β-카테닌(Fergil Mills et al., 2014)과 기억 유연성 간의 관련성을 확인한 연구에서 각 변화가 기억력에서는 영향이 없지만 기억 유연성에서는 영향을 나타내는 것을 확인한 바 있다.

본 발명에서 용어, “사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY)”는 세린/트레오닌 키나제(serine/threonine kinases) 그룹인 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinases, CDKs)를 활성화시킴으로써 세포 증식에서 세포주기를 조절하는 단백질 군인 사이클린(Cyclin)의 일종으로, 배 발달 중인 세포, 비-뉴런 및 증식 중인 세포에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 CCNY는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 혼용하여 사용될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에서의 CCNY는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니다. CCNY와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 CCNY에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 발명의 CCNY는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드', ‘특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드’라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, ‘서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드’는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 ‘서열번호 1의 아미노산 서열로 포함하는 폴리펩티드’에 속할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 상기 CCNY 유전자, 즉, CCNY를 코딩하는 유전자는 그 예로 Ccny일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다. 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CCNY를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건(stringent condition) 하에 하이브리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CCNY를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건(stringent condition)”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.

본 출원에서 용어, "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당해 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 용어, “녹아웃(knockout, KO)”은 발현을 억제시키고자 하는 표적 유전자를 DNA 상에서 직접 결실 또는 저해함으로써 표적 유전자의 발현을 100% 억제하는 것을 의미하며, 녹아웃은 제거된 유전자를 일컫거나 유전자가 제거된 유기체를 명명하기도 한다. 상기 녹아웃을 수행하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 상동 재조합(Homologous Recombination), 부위 특정 핵산가수분해효소(Nuclease), 아연 집게 핵산분해효소(Zinc-finger nucleases), 탈렌(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs), 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 유전자는 Ccny일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 Ccny 녹아웃 마우스의 기억 유연성이 야생형(wild-type, WT) 한배 새끼(littermates)에서의 기억 유연성보다 증가됨을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명의 일실시예에서, Ccny 녹아웃 마우스가 WT 한배 새끼에 비해 공간 기억 능력이 향상되었고(도 3), 이전에 저장된 공간 기억의 소멸 또는 약화가 용이하였으며(도 4), 해마 의존적 기억 유연성을 더 잘 조절하는 것을 확인하였다(도 5).

본 발명의 다른 양태는 i) CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA) 및 Cas9 단백질의 혼합물을 세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 단계; 및 ii) 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주입된 배아를 배지에서 배양한 후 대리모 마우스로 배아를 옮기는 단계;를 포함하는, 기억 유연성이 향상된 모델 마우스의 제조방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

상기 단계 i)은 마우스 유래 수정란을 배지에서 배양한 후, sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물을 1(one)-세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 i)에서 CCNY의 N-말단 영역은 CCNY를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열에서 140 내지 170번째 위치에 상응하는 염기를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, Ccny 녹아웃 마우스에서 결실된 표적 부위는 제 1 엑손의 마지막 15-bp(회색 배경에서 소문자)와 제 1 인트론의 첫 16-bp(회색 배경에서 대문자)에 걸쳐있는 스플라이스 접합부위 31-bp의 삭제는 조기 정지 코돈(TAG)으로 이어져 Ccny 녹아웃 마우스에서 CCNY 단백질 발현의 조기 종결(*)을 초래하였다(도 1A).

상기 단계 ii)는 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주사된 배아를 배지에서 배양한 뒤 대리모 마우스로 옮겨 임신 기간을 거친 후 출산하여 Ccny가 녹아웃된 마우스, 즉, 기억 유연성이 향상된 모델 마우스를 수득하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태는 Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된, 기억 유연성 저하제 스크리닝용 모델 마우스를 제공한다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된 모델 마우스는 기억 유연성 저하제를 스크리닝하는 용도를 가질 수 있다.

이를 위해, 본 발명의 다른 양태는 a) Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된 모델 마우스에 기억 유연성 저하제 후보물질을 투여하는 단계; b) 상기 단계 a)의 후보물질 투여 후, 상기 모델 마우스의 기억 유연성을 측정하는 단계; 및 c) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 기억 유연성의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 기억 유연성 저하제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 a)에서 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 b)에서 기억 유연성 평가에 사용되는 방법은 당업계에서 사용되는 방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM) 작업, 반전 학습(reversal learning) 및 지연된 장소 불일치 T-미로 작업(Delayed nonmatch to place T-maze task)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법일 수 있다.

상기 단계 c)는 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질을 투여한 모델 마우스에서 기억 유연성의 감소를 확인함으로써 기억 유연성의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기억 유연성의 감소는 단계 b)의 기억 유연성 평가에 따라 측정된 결과를 분석하여 결정되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 하나의 양태는 CCNY 억제제를 유효성분으로 함유하는 기억 유연성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 기억 유연성 증진용 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 CCNY 억제제는 CCNY의 발현 억제제일 수 있다. 구체적으로 CCNY의 발현 억제제는 CCNY 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열을 갖는, CCNY 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(안티센스 핵산), 및 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)[작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 마이크로 RNA(miRNA)] 및 이들을 전사하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 CCNY 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열을 갖는 CCNY RNAi 또는 이를 전사하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이를 구체적으로 살펴보면 하기와 같다.

1) 안티센스 뉴클레오티드

CCNY을 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 핵산 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 CCNY을 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 CCNY 코딩가닥 또는 단지 그들의 일부 (예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 CCNY mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, CCNY mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부 (예: 번역 개시부)에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다.

2) RNA 간섭 (RNAi)

RNA 간섭(RNAi)은 CCNY 유전자에 대응하는 두 가닥 사슬 RNA(dsRNA)를 세포 또는 유기체에 도입함으로써 대응하는 mRNA의 분해가 일어나는 전사 후 유전자 사일런싱 메카니즘(post-transcriptional gene silencing mechanism)이다. 상기 RNAi 효과에 의해 유전자 발현이 복귀되기 전에 다중 세포 분열이 지속되므로 RNAi는 RNA 레벨에서 목표로 하는 '녹아웃(knockout)' 또는 '녹다운(knockdown)'을 만드는 매우 강력한 방법이다. 유전자 사일런싱에서의 RNAi 기술은 표준 분자 생물학 방법을 이용한다. 불활성화시킬 표적 유전자의 서열에 대응하는 dsRNA는 표준 방법, 예를 들면 T7 RNA 중합효소를 이용한 주형 DNA의 양 가닥 동시 전사에 의해 생성할 수 있다. RNAi에 사용되는 dsRNA의 생성 키트는 상업적으로 판매되는 제품을 사용할 수 있다. dsRNA 또는 dsRNA를 제조하도록 처리된 플라스미드의 트랜스펙션 방법은 공지의 기술이다. 상기 RNAi에는 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 마이크로 RNA(miRNA) 등이 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 CCNY RNAi는 siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 CCNY RNAi는 당업계에서 사용되는 방법으로 제조되는 것이라면 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 기억 유연성을 증진 및/또는 기억 유연성 저하를 개선하는 용도를 갖는다. 증진 및/또는 개선적 용도에 있어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 질환 또는 증상을 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여되어 의심 및 발명 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 질환을 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병 또는 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환 또는 증상의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 조성물은 기억 유연성 저하의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고 투여 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 0.001 내지 1,000 mg/kg의 농도, 구체적으로는 0.05 내지 1,000 mg/kg의 농도, 보다 구체적으로는 1 내지 100 mg/kg의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 “개체”는 기억 유연성 저하를 진단하거나 발병 위험을 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 기억 유연성 저하가 발병될 수 있는 동물이라면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명은 이전에 학습한 정보의 수정 또는 제거와 관련된 작업에서 CCNY의 역할을 밝히고, 기억 유연성과 관련된 뇌질환의 원인 이해를 도우며, 궁극적으로 기억 유연성 저하를 포함하는 뇌질환을 치료하기 위한 요법 및 진단에 응용될 수 있다.

도 1은 (A) Ccny 녹아웃 마우스에서의 DNA(상단) 및 단백질(하단) 서열, (B) 마우스 CCNY의 전체 cDNA(상단; 유전자 수탁번호, NM_026484.4) 및 단백질 서열(하단)을 (A)와의 비교를 위하여 나타내었다.
도 2는 Ccny 유전자의 제 1 엑손 및 제 1 인트론에 걸친 31-bp 결실 영역을 보여주는 개략도이다.
도 3은 (A) 도 3의 오리지널 및 도 4의 반전 학습 테스트를 포함한 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM) 작업에 대한 개략도이다. (B) 1일 ~ 5일 동안 진행된 오리지널 교육 세션에서 플랫폼까지 도달하는 데 걸리는 시간 및 플랫폼이 제거된 6일째에 진행된 프로브 세션 (회색 음영 영역)에서 플랫폼이 있었던 플랫폼 영역에 도달하는데 걸리는 시간을 분석한 학습곡선. * P <0.05, *** P <0.0005, 표시된 대로 Student 's unpaired t test. 두 코호트의 데이터. (C) 플랫폼 제거 후 수행 된 6 일째의 프로브 테스트 중 사분면에서 소요된 시간을 나타내었다. TQ, 목표 사분면; LQ, TQ에 왼쪽 사분면; RQ, TQ에 대한 오른쪽 사분면; OQ, TQ와 반대되는 사분면. * P <0.05, ** P <0.005, 표시된대로 Student 's unpaired t test.
도 4는 (A) Ccny 녹아웃 마우스가 해마의 장기억제를 조절하는지를 fEPSP 슬로프로 확인한 결과. (B) 반전 학습 훈련 세션인 R-Day 1 ~ 3 동안 오리지널 교육세션 대비 반전된 위치에 놓인 플랫폼까지 도달하는 데 걸리는 시간 및 반전 위치에 놓인 플랫폼이 제거된 R-Day 4에서의 반전 학습 프로브 테스트 (회색 음영 영역)에서 플랫폼이 있었던 플랫폼 영역에 도달하는데 걸리는 시간을 분석한 반전 학습곡선. 데이터는 평균 ± SEM. * P <0.05, ** P <0.005, 표시된대로 Student 's unpaired t test. 두 코호트의 데이터. (C) 플랫폼 제거 후 수행 된 R-Day 4의 반전 학습 프로브 테스트 동안 사분면에서 보낸 시간을 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM. PQ, 이전 목표 사분면; TQ, 목표 사분면; LQ, TQ에 왼쪽 사분면; RQ, TQ에 오른쪽 사분면. *P <0.05, **P <0.005, 표시된 대로 Student 's unpaired t test. (D) 플랫폼 제거 후 수행 된 R-Day 4의 반전 학습 프로브 테스트에서, 오리지널 교육 세션 동안 플랫폼이 놓여 있었던 사분면에 출입한 횟수를 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM. * P <0.05, Student 's unpaired t test.
도 5는 (A) WT(wild-type) 및 Ccny 녹아웃 마우스를 대상으로 기억 유연성을 테스트하는, "지연된 장소 불일치 T-미로 (delayed nonmatch to place T-maze)" 작업을 수행하여, 기억 유연성이 있어야 할 수 있는 "올바른 선택(correct choice)" 비율을 분석하였다. 데이터는 올바른 선택 비율의 평균 ± SEM. *P <0.05 (in Day), Student 's unpaired t test. ##P <0.005, 반복 측정 양방향 ANOVA, 유전자형의 효과, F (1, 29) = 9.874. (B) WT 및 Ccny 녹아웃마우스가 올바른 선택을 하기 위해 취해진 이동 거리이다. 데이터는 평균 ± 이동 거리의 SEM. *P <0.05, **P <0.005 (in Day), Student 's unpaired t test. ###P <0.0005, 반복 측정 양방향 ANOVA, 유전자형의 효과, F (1, 29) = 8.177. (C) WT 및 Ccny 녹아웃마우스가 올바른 선택을 하는데 걸린 시간이다. 데이터는 평균 ± 여행 시간의 SEM. *P <0.05, Student's paired t test. n.s., 통계적 중요성 없음, 반복 측정 양방향 ANOVA, 유전자형의 효과 F (1, 29) = 2.067.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 녹다운 (knockdown)

1-1. Ccny 녹아웃 마우스 제작

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 Ccny 녹아웃 마우스를 제작하였다. 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA)는 CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 ZiFiT 프로그램(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)을 사용하여 설계되었다. 각 sgRNA의 2개의 상보적인 올리고(oligos)는 sgRNA의 합성을 위해 설계된 벡터인 pT7-gRNA 벡터에서 어닐링 및 클로닝되었다. Ccny 및 짧은 RNA 정제를 위한 sgRNA의 시험관내 전사를 제조사의 지시에 따라 MEGAshortscript T7 키트(Ambion)를 사용하여 수행하였다.

C57BL/6J 마우스 유래 수정란을 사용하여 미세주사를 수행하였다. 배아를 M2 배지에서 수확하고 KSOM 배지에서 2-3 시간 동안 배양하였다. sgRNA(40 ng/㎕) 및 Cas9 단백질(80 ng/㎕)(Toolgen)의 혼합물을 1(one)-세포 단계 배아의 세포질에 주입하였다. 대리모 마우스(pseudo-pregnant female mice)(ICR 균주)로 배아를 옮기기 전에 미세주사된 배아를 배양 배지에서 2~3 시간 동안 배양하였다. 자손의 발가락 또는 꼬리로부터의 게놈 DNA를 추출하고 유전자 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 이종이합체(heteroduplex) 형성을 촉진하기 위해 PCR 앰플리콘(amplicons)을 변성시키고 천천히 어닐링하였다. 재어닐링은 95 ℃에서 5 분의 변성 단계를 거친 후 초당 -2 ℃씩 감소시켜 85 ℃까지 온도를 내리고, 다시 초당 -0.1 ℃씩 감소시켜 25 ℃까지 온도를 내리면서 수행되었다. 재어닐링 된 앰플리콘을 5 단위(units)의 T7 엔도뉴클레아제 I(New England BioLabs)로 37 ℃에서 30 분 동안 처리한 다음, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 표적 외 효과(off-target effects)를 확인하기 위해, 1 또는 2 개의 염기-미스매치(mismatch)를 갖는 잠재적 표적 외 부위를 포함하는 게놈 영역을 PCR 증폭시키고 T7E1 어세이 또는 시퀀싱 분석을 수행하였다.

Ccny 녹아웃 마우스에서 결실된 표적 부위는 제 1 엑손의 마지막 15-bp 및 제 1 인트론의 첫 16-bp를 포함하는 31-bp 스플라이스 접합부였으며(도 1A; 도 2), 이에 CCNY 번역의 조기 종료를 유도하는 조기 정지 코돈(TAG)이 발생하였다(도 1A).

실시예 2. 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM) 작업 및 반전 학습(reversal learning) 과 장기억제

2-1. 해마 의존적 공간 학습 능력

Ccny 녹아웃 마우스를 주변 공간 단서를 갖춘 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM)에 투입하여 CCNY가 해마 의존적 공간(spatial) 학습 및 기억을 조절하는지의 여부를 조사하였다(도 3).

구체적으로, 모리스 수중 미로를 제작하기 위해 직경 120cm의 둥근 수영장에 수돗물을 채우고 플랫폼(직경 10cm, 수면 아래 1.5cm)을 수영장의 표적 사분면에 배치하였다. 흰색 무독성 페인트를 물에 첨가하여 물을 불투명하게 만들어 플랫폼을 숨겼다. 수온은 21-23 ℃로 유지되고 실험 내내 모니터링되었다. 생쥐가 볼 수 있도록 다양한 모양의 여러 시각적 신호가 수영장 주변에 배치되었다. 오리지널 학습(original learning) 훈련 세션을 위해 생쥐(수컷, 8-10 주령)를 90 초 동안 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 수영하고 탐색하게 하였다. 90 초 이내에 숨겨진 플랫폼을 발견하면 15 초 동안 플랫폼에 머무르도록 허용된 후 구조되었다. 90 초 이내에 숨겨진 플랫폼을 발견하지 못하면 실험자의 손에 의해 플랫폼으로 부드럽게 안내되고 15 초 동안 플랫폼에 머무르게 한 후 구조되었다. 각 마우스는 연속 5 일 동안 하루에 4 번 훈련을 받았다. 표적 사분면의 수면 아래에 숨겨진 플랫폼에 도달하는데 걸린 시간을 측정하고 분석했다. 6 일째의 프로브 테스트를 위해 플랫폼을 제거하고 훈련된 마우스를 90 초 동안 탐색하도록 하였다. 플랫폼 영역에 도달하는데 걸린 시간과 각 사분면에 머문 시간을 측정하고 분석하였다. 반전 학습(reversal learning)의 경우, 오리지널 학습의 프로브 테스트 완료 24 시간 후 플랫폼을 오리지널 학습 시에 놓여 있었던 표적 사분면과 반대되는 사분면으로 이동하였다. 마우스는 3 일 동안 반전 훈련을 받았으며, 4 일째에는 반전 프로브 테스트를 수행하였다. 훈련 세션 동안 플랫폼에 도달하는데 걸린 시간 및 프로브 테스트 동안 플랫폼 영역에 도달하는데 걸린 시간을 측정하고 분석하였다. 동물 행동 실험의 측정 및 분석은 EthoVision XT 13 소프트웨어(Noldus)를 사용하였다.

그 결과, 플랫폼에 도달하는 데 걸린 시간은 5일 간의 연속 훈련 기간 동안 4 일 및 5 일째에서 WT 한배 새끼(littermates)보다 Ccny 녹아웃에서 상당히 단축되었고(도 3B), 이 결과는 Ccny 녹아웃 마우스가 향상된 학습 능력을 지님을 시사한다. 또한 플랫폼이 제거된 6 일째의 프로브 테스트에서 플랫폼 영역에 도달하는 데 걸린 시간이 Ccny 녹아웃 마우스에서 크게 감소하였으며(도 3B), 표적 사분면에서 머문 시간도 Ccny 녹아웃 마우스가 WT 한배 새끼에 비해 증가하였다(도 3C). 이는 Ccny 녹아웃 마우스가 WT 한배 새끼에 비해 공간 기억 능력이 향상되었음을 나타낸다.

2-2. 장기억제(long-term depression, LTD)

WT 한배 새끼 및 Ccny 녹아웃 (C57BL/6, 수컷) 마우스는 할로탄(halothane)으로 마취되었고, 마취 깊이는 페달 철회 반사(pedal withdrawal reflex)를 사용하여 모니터링되었다. 충분한 마취 깊이에 도달하였을 때 참수 후 뇌를 빠르게 분리하고 해마를 해부하였다. 해마 슬라이스(300 또는 400 μm)는 234 mM 수크로스, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 24 mM NaHCO₃, 11 mM 글루코스, 0.5 mM CaCl₂, 10 mM MgSO₄를 포함하는 95 % O₂ 및 5 % CO₂로 포화된 얼음처럼 차가운 절단 완충액에서 비브라톰(vibratome, Leica, VT1000S)을 사용하여 준비하였다. 해마 절편을 35℃에서 1 시간 동안 회복시키고, 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 10 mM 글루코스, 6.5 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂를 포함하는 95 % O₂ 및 5 % CO₂로 포화된 회수 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, aCSF) 용액에서, 실험 시작까지 실온으로 유지하였다.

Ccny 녹아웃 마우스에서 준비된 급성 해마 슬라이스(acute hippocampal slice)를 잠긴 기록 챔버에 놓고 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 10 mM 글루코스, 1.3 mM MgSO₄, 2.5 mM CaCl₂을 포함하는 95 % O₂ 및 5 % CO₂로 포화된 기록 aCSF 용액으로 실험 전반에 걸쳐 30℃에서 지속적으로 관류하였다. 해마 슬라이스는 CCD 카메라(Hamamatsu, C3077)가 장착된 현미경(Olympus, BX51WI)으로 시각화되었다. fEPSP는 2-접촉 클러스터 전극(2-contact cluster electrode, FHC, CE2C55)을 사용하여 0.033Hz에서 Schaffer collateral(SC) 구심성(afferent)을 자극함으로써 유발되었으며, 유발된 fEPSP는 표준 aCSF로 채워진 유리 피펫을 사용하여 CA1의 계층 방사체 층(stratum radiatum layer)에서 리코딩되었다. 기준선을 기록하기 위해 자극 강도는 격리 장치(ISO-Flex, AMPI)를 사용하여 최대 fEPSP 진폭의 40-60 %를 불러일으키도록 조정되었다. 최소 20 분 동안 안정된 기준선이 확보되면 단일 펄스 저주파 자극(900 펄스, 1Hz)을 사용하여 SC를 자극하여 장기억제를 유도하였다. 장기억제 유도 후 60 분 동안 fEPSP 기울기의 후속 변화를 모니터링하였다. 모든 데이터는 Digidata 1550 디지타이저 (Molecular Devices)로 10kHz로 디지털화 된 MultiClamp 700B 증폭기 (Molecular Devices)로 수집되었다. Igor Pro(WaveMetrics) 및 pClamp10 소프트웨어(Molecular Devices)는 데이터 수집 및 분석에 사용되었다.

그 결과, Ccny 녹아웃 마우스는 해마의 장기억제(long-term depression, LTD)를 조절하는 것을 확인하였다(도 4A).

2-3. 기억 유연성(memory flexibility)

장기억제가 행동 및 기억 유연성과 관련되어 있음이 알려져 있고(Nicholls RE et al., 2008), 실시예 2-2에서 Ccny 녹아웃 마우스는 해마의 장기억제(long-term depression, LTD)를 조절하는 것으로 나타났다(도 4A). Ccny 녹아웃 마우스에서 WT에 비해 장기억제가 약화되어 있기는 하지만 여전히 장기억제가 발현되고 있다(도 4A). 이에, CCNY가 기억 유연성에 역할을 하는지를 조사하였다.

오리지널 학습 및 기억 작업에 이어, 숨겨진 플랫폼을 새로운 위치(예: 이전에 기억된 사분면과 반대되는 사분면)로 이동하여 수행된 공간 반전 학습 작업에서, 훈련 기간 중 3 일째에 Ccny 녹아웃 마우스는 플랫폼에 도달하는 데 걸린 시간이 통계적으로 유의하게 단축되었다(도 4B). 4 일째의 반전 기억 프로브 테스트에서 Ccny 녹아웃 마우스는 WT 한배 새끼에 비해 플랫폼 영역에 도달하는 데 걸린 시간이 크게 감소했으며(도 4B), 표적 사분면에 머문 시간도 유의하게 증가하였다(도 4C). 즉, 기억 유연성(즉, 새로운 학습 및 기억 능력)은 WT 마우스보다 Ccny 녹아웃 에서 훨씬 더 우수하였다. 또한, 반전 학습 프로브 테스트 동안, Ccny 녹아웃 마우스는 WT 한배 새끼에 비해 오리지널 학습 시 표적 사분면이었던 사분면에 머문 시간이 유의하게 감소했으며(도 4C), 반전 학습 프로브 테스트 동안 오리지널 학습 시 표적 사분면이었던 사분면에 출입하는 빈도도 WT 한배 새끼보다 유의하게 낮았다(도 4D). 이는 Ccny 녹아웃 마우스에서 이전에 저장된 공간 기억의 소멸 또는 약화가 용이함을 시사한다.

실시예 3. 지연된 장소 불일치 T-미로 작업(Delayed nonmatch to place T-maze task)

모리스 수중 미로 반전 학습 외에, 해마 의존적 기억 유연성을 테스트 하는 또 다른 행동실험인 "지연된 장소 불일치 T-미로" 작업을 수행함으로써 CCNY의 기억 유연성 조절에 대해 더 조사하였다.

구체적으로, 이전 연구에서 설명한 프로토콜(Kellendonk et al., 2006; Mills et al., 2014)을 수정하여, "지연된 장소 불일치 T-미로" 행동실험을 수행하였다. 마우스(수컷, 생후 8-9 주령)는 그룹으로 사육하고 당일 과제를 완료한 후 하루에 한 번 2 시간 동안만 먹이를 급여하여 먹이가 부족하도록 하였으며, 우리와 T-미로 장치 안에서 연유 보상을 먹을 수 있게 하여 보상에 익숙해지게 하였다. 마우스를 2 일 동안 길들인 다음 T-미로의 양쪽 팔에 연유 보상을 배치한 후 모든 문을 열고 3일 연속 습관화하였다. 습관화는 매일 6 시간 간격으로 두 번, 10 분씩 시행하는 것으로 구성하였다. 마우스는 다음에 학습 세션으로 테스트 되었는데, 학습 세션은 하루에 4 회 시행하였다. 각 시행은 "강제 실행(forced run)"과 "선택 실행(choice run)"을 포함 하였으며, 각 실행 사이에 5 초 간격을 두었다. 세션이 시작될 때 T-미로의 오른 팔과 왼팔 모두에 보상을 배치했다. 강제 실행에서는 무작위로 선택한 팔 하나가 차단되고 마우스가 시작 점에 배치되었다. 한쪽 팔이 막혔기 때문에 마우스가 다른 쪽 팔에 들어가도록 "강제(forced)"되었다. 마우스가 보상을 받은 후, 마우스를 픽업하여 5 초 동안 다시 환승 케이지에 넣었다(즉, 5 초 지연). 선택 실행에서는 두 팔이 모두 열려 있었고 마우스가 둘 중 한 팔에 대해 자유롭게 "선택(choice)"할 수 있도록 하였다. 꼬리가 한쪽 팔의 입구를 통과하면 마우스가 선택을 변경할 수 없도록 문을 닫았다. 마우스가 강제 실행 중에 마우스가 방문하지 않아 보상이 여전히 남아있는 반대쪽 팔을 선택하면 올바른 선택(correct choice)이 이루어진 것으로 간주하였으며, 마우스가 강제 실행에서 방문한 동일한 팔을 선택하면 아무런 보상 없이 10 초 동안 팔에 가두었다. 이전 시행과의 간섭을 방지하기 위해 시행 간 간격이 최소 20분이 되게 해주었다. 생쥐의 체중은 초기 길들이기 기간과 비교하여 실험 내내 약 80 %로 유지되었다.

모리스 수중 미로 반전 학습은 새로운 공간 위치를 학습하고 기억하기 위한 인지 유연성이 필요하고, "지연된 장소 불일치 T-미로"에서 보상의 위치는 각 시행에서 오른쪽 팔과 왼쪽 팔 사이를 번갈아 가며 나타나며, 따라서 이 작업 또한 올바른 선택을 하기 위한 인지적 유연성이 필요하다. 모리스 수중 미로 과제에서 강화된 반전학습을 보인 Ccny 녹아웃 마우스는 지연된 장소 불일치 T-미로 작업에서도 향상된 학습 유연성을 보였다(도 5A). 이와 일치하게, 지연된 장소 불일치 T-미로 작업에서 올바른 선택을 하기 위해 취해진 이동 거리(도 5B) 및 이동 시간(도 5C) 모두 Ccny 녹아웃 마우스가 WT 한배 새끼에 비해 더 짧았다.

상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따라 마우스에서 CCNY 발현을 억제시킬 경우 기억 유연성이 증진된 마우스를 제작할 수 있으며, CCNY 발현을 억제는 궁극적으로 기억 유연성 저하를 포함하는 뇌질환을 치료하기 위한 요법 및 진단에 응용될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Mice displaying an improved memory flexibility and uses thereof <130> KPA201223-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CCNY <400> 1 Met Gly Asn Thr Thr Ser Cys Cys Val Ser Ser Ser Pro Lys Leu Arg 1 5 10 15 Arg Asn Ala His Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Pro Asp Thr Asp Leu 20 25 30 Ser Arg Glu Asp Thr Gly Cys Asn Leu Gln His Ile Ser Asp Arg Glu 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Leu Asn Met Glu Phe Asn Pro Ser Asp His Pro Arg 50 55 60 Ala Ser Thr Ile Phe Leu Ser Lys Ser Gln Thr Asp Val Arg Glu Lys 65 70 75 80 Arg Lys Ser Leu Phe Ile Asn His His Pro Pro Gly Gln Thr Ser Arg 85 90 95 Lys Tyr Ser Ser Cys Ser Thr Ile Phe Leu Asp Asp Ser Thr Val Ser 100 105 110 Gln Pro Asn Leu Lys Tyr Thr Ile Lys Cys Val Ala Leu Ala Ile Tyr 115 120 125 Tyr His Ile Lys Asn Arg Asp Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu Asp Ile 130 135 140 Phe Asp Glu Asn Leu His Pro Leu Ser Lys Ser Glu Val Pro Pro Asp 145 150 155 160 Tyr Asp Lys His Asn Pro Glu Gln Lys Gln Ile Tyr Arg Phe Val Arg 165 170 175 Thr Leu Phe Ser Ala Ala Gln Leu Thr Ala Glu Cys Ala Ile Val Thr 180 185 190 Leu Val Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Thr Tyr Ala Glu Ile Asp Ile Cys 195 200 205 Pro Ala Asn Trp Lys Arg Ile Val Leu Gly Ala Ile Leu Leu Ala Ser 210 215 220 Lys Val Trp Asp Asp Gln Ala Val Trp Asn Val Asp Tyr Cys Gln Ile 225 230 235 240 Leu Lys Asp Ile Thr Val Glu Asp Met Asn Glu Leu Glu Arg Gln Phe 245 250 255 Leu Glu Leu Leu Gln Phe Asn Ile Asn Val Pro Ser Ser Val Tyr Ala 260 265 270 Lys Tyr Tyr Phe Asp Leu Arg Ser Leu Ala Glu Ala Asn Asn Leu Ser 275 280 285 Phe Pro Leu Glu Pro Leu Ser Arg Glu Arg Ala His Lys Leu Glu Ala 290 295 300 Ile Ser Arg Leu Cys Glu Asp Lys Tyr Lys Asp Leu Arg Lys Pro Met 305 310 315 320 Arg Lys Arg Ser Ala Ser Ala Asp Asn Leu Ile Leu Pro Arg Trp Ser 325 330 335 Pro Ala Ile Ile Ser 340 <210> 2 <211> 283 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ccny <400> 2 atggggaaca caacttcgtg ctgcgtgtcg tccagcccca agctccggag gaatgcgcac 60 tcgcggctgg agtcctaccg cccggacacg gacctcagcc gtgaggacac tggctgcaat 120 ctgcagcaca tcagcgaccg ggaaaacatc gacggtgagc ggcgccggcc tgggcctcgg 180 cctatccctc tcctccctgc aggactcgga gccttgctgc tccgctgccc cgggctggac 240 tggcagggaa tggtggaaat tttgctagcc acggccgggg agg 283

Claims (6)

1. 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되어 기억 유연성이 향상된, 모델 마우스.
   
2. i) CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA) 및 Cas9 단백질의 혼합물을 세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 단계; 및
   ii) 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주입된 배아를 배지에서 배양한 후 대리모 마우스로 배아를 옮기는 단계;를 포함하는, Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된 모델 마우스의 제조방법.
   
3. Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된, 기억 유연성 저하제 스크리닝용 모델 마우스.
   
4. a) Ccny 유전자가 녹아웃되고 기억 유연성이 향상된 모델 마우스에 기억 유연성 저하제 후보물질을 투여하는 단계;
   b) 상기 단계 a)의 후보물질 투여 후, 상기 모델 마우스의 기억 유연성을 측정하는 단계; 및
   c) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 기억 유연성의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 기억 유연성 저하제 후보물질의 스크리닝 방법.
   
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