CN115349015A - 用于调节睡眠的药剂和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的方法。该方法包括确定所述候选药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用。该药剂可用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的进展。还提供了一种非人生物体或其活体部件。能够改变ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或表达的药剂也可以用于所述系统和方法中。

Description

用于调节睡眠的药剂和方法
发明背景
睡眠是一种意识降低状态，在此状态下脑对内部刺激的反应比对外部刺激的反应相对更强。正常睡眠分为非快速眼动(NREM)睡眠和快速眼动(REM)睡眠。睡眠对于从昆虫、鱼类到哺乳动物的动物都很重要。睡眠不足会导致负面结果，比如记忆受损、代谢紊乱、甚至死亡等。控制睡眠和觉醒的分子机制和神经回路正在积极研究中。
果蝇用作睡眠基因研究的模型已有二十年之久。已发现多种基因可以在果蝇的几个脑部区域如扇形体(FSB)、蘑菇体和脑间部(PI)中调节睡眠。
在50年前鸟苷-5’-二磷酸盐，3’-二磷酸盐(四磷酸鸟苷，ppGpp)就与大肠杆菌中的基因调节相关。ppGpp的水平由RelA/SpoT同系物(RSH)家族调节。在细菌中，RelA是RSH之一，其包含ppGpp合成酶结构域(SYNTH)和失活的ppGpp水解酶结构域(HD)。在植物中也检测到了ppGpp。在细菌和植物中已发现了超过30个RSH成员。但是在动物中尚未检测到ppGpp。在果蝇中，发现了RSH家族的一个成员Mesh1，其仅包含ppGpp的水解酶结构域。
已知ppGpp是细菌对氨基酸饥饿的严格反应的关键参与者。然而，没有关于治疗睡眠障碍的报道。
发明内容
本公开提供了一种能够改变ppGpp的活性和/或水平以调节睡眠的药剂，以及一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药剂。本公开揭示了ppGpp与睡眠调节之间的关系。在本公开的系统和方法中可以使用能够改变ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或表达的药剂。
在一个方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的方法，该方法包括：提供候选药剂；确定所述候选药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用；如果所述候选药剂改变了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
在一些实施方式中，如果所述候选药剂增加了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为减少睡眠的药剂。
在一些实施方式中，如果所述候选药剂减少了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为促进睡眠的药剂。
在一些实施方式中，所述确定包括：确定所述候选药剂对所述ppGpp在神经元中的活性和/或水平的作用。
在一些实施方式中，所述神经元是脑间部神经元。
在一些实施方式中，所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
在一些实施方式中，其中所述方法是体外方法或离体方法。
在一些实施方式中，其中所述调节睡眠包括调节失眠、调节夜间发作的失眠和/或调节晨间早醒。
在一些实施方式中，其中所述调节睡眠包括调节发作性睡病、调节过度嗜睡、调节夜间发作的早睡和/或调节晨间晚醒。
在一些实施方式中，所述药剂基本不影响日间睡眠、睡眠回合次数及长度和/或昼夜节律。
在一些实施方式中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述药剂直接作用于能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶，和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶包括RelA。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的方法，该方法包括：提供候选药剂；确定所述候选药剂对mesh1的活性和/或水平的作用；如果所述候选药剂改变了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
在一些实施方式中，如果所述候选药剂增加了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为促进睡眠的药剂。
在一些实施方式中，如果所述候选药剂减少了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为减少睡眠的药剂。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，所述系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：能够反映ppGpp的活性和/或水平的物质；能够反映ppGpp水解酶的活性和/或水平的物质；和/或能够反映ppGpp合成酶的活性和/或水平的物质。
在一些实施方式中，所述物质能够反映编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述物质能够反映编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述物质包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp水解酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp水解酶的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶为Mesh1。
在一些实施方式中，所述物质包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp合成酶的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶为RelA。
在一些实施方式中，所述系统包括选择模块，所述选择模块能够根据从所述测试模块获得的结果选择所述调节睡眠的药剂。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了ppGpp水解酶的活性和/或水平，所述药剂被选择为促进睡眠的候选。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了ppGpp合成酶的活性和/或水平，所述药剂被选择为减少睡眠的候选。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果改变了ppGpp的活性和/或水平，所述药剂被选择为调节睡眠的候选。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，其中该系统包括能够确定所述药剂对mesh1的活性和/或水平的作用的物质。
在一些实施方式中，所述物质能够反映mesh1的水平。
在一些实施方式中，所述物质包括能够特异性地扩增mesh1核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂。
在一些实施方式中，所述系统包括选择模块，所述选择模块能够根据从所述测试模块获得的结果选择所述调节睡眠的药剂。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了mesh1的活性和/或水平，所述药剂被选择为用于促进睡眠的候选。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的方法，该方法包括：对需要其的受试者施用有效量的能够改变所述受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关，所述药剂能够降低所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述药剂包括编码ppGpp水解酶的核酸分子或其表达产物。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与睡眠过多相关。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒相关，所述药剂能够增加所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述药剂包括编码ppGpp合成酶的核酸分子或其表达产物。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。
在一些实施方式中，所述ppGpp的活性和/或水平的所述改变在神经元中出现。
在一些实施方式中，所述神经元是脑间部神经元。
在一些实施方式中，所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
在一些实施方式中，所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的方法，该方法包括：对需要其的受试者施用有效量的能够改变所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关，所述药剂能够增加所述受试者的Mesh1蛋白的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述药剂包括mesh1核酸分子或Mesh1蛋白质。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的核酸分子。
在一些实施方式中，所述ppGpp的活性和/或水平的所述改变在神经元中出现。
在一些实施方式中，所述神经元细胞是脑间部神经元。
在一些实施方式中，所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
在一些实施方式中，所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。
在另一方面，本公开提供了能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药物中的用途。
在一些实施方式中，所述药剂能够增强ppGpp的活性和/或增加ppGpp的水平。
在一些实施方式中，所述能够增加ppGpp的活性和/或水平的药剂能够增强编码ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或增加编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平，和/或抑制编码ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或降低编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述药剂能够增强ppGpp合成酶的活性和/或增加ppGpp合成酶的水平，和/或抑制ppGpp水解酶的活性和/或降低ppGpp水解酶的水平。
在一些实施方式中，所述药剂能够减少ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述能够减少ppGpp的活性和/或水平的药剂能够抑制编码ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或降低编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平，和/或增强编码ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或增加编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述能够减少ppGpp的活性和/或水平的药剂能够抑制ppGpp合成酶的活性和/或降低ppGpp合成酶的水平和/或增强ppGpp水解酶的活性和/或增加ppGpp水解酶的水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关，所述药剂能够降低所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括编码ppGpp水解酶的核酸分子或其表达产物。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与睡眠过多相关。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍与发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒相关，所述药剂能够增加所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括编码ppGpp合成酶的核酸分子或其表达产物。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶包括RelA。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药物中的用途。
在一些实施方式中，所述药剂能够增强Mesh1蛋白质的活性和/或增加Mesh1蛋白质的水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括核酸分子mesh1或其表达产物。
在一些实施方式中，所述核酸分子mesh1包括NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
在一些实施方式中，所述药剂能够抑制Mesh1蛋白质的活性和/或降低Mesh1蛋白质的水平。
在另一方面，本公开提供了能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂，其用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展。
在另一方面，本公开提供了能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂，其用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展。
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患有睡眠障碍和/或处于发展睡眠障碍的风险中的可能性的方法，该方法包括：评价所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对所述编码ppGpp水解酶和/或合成酶的核酸分子的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地扩增所述编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的药剂。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对所述ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地识别ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的药剂，和/或能够确定ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性的药剂。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶包括RelA。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患有睡眠障碍和/或处于患睡眠障碍的风险的可能性的方法，该方法包括：评价所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平包括mesh1的活性和/或水平，和/或所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对所述mesh1的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地扩增mesh1的引物，和/或能够特异性地识别所述mesh1的探针。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地识别Mesh1蛋白质的药剂，和/或能够确定Mesh1蛋白质的活性的药剂。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的系统，该系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：能够表明所述受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂能够表明编码ppGpp水解酶的核酸分子和/或编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp水解酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp水解酶的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶为Mesh1。
在一些实施方式中，所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp合成酶的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶为RelA。
在一些实施方式中，所述系统包括确定模块，所述确定模块能够根据从所述测试模块获得的结果来确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变的ppGpp的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变的ppGpp水解酶的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变的ppGpp合成酶的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的系统，所述系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：能够表明所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述药剂能够表明mesh1核酸分子的水平。
在一些实施方式中，所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述Mesh1蛋白质的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂。
在一些实施方式中，所述系统包括确定模块，所述确定模块能够根据从所述测试模块获得的结果来确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性。
在一些实施方式中，从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变的Mesh1蛋白质的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在另一方面，本公开提供了能够表明受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂在制备所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的指示剂中的用途。
在一些实施方式中，所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的所述药剂包括：能够特异性地扩增编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的探针。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的所述药剂包括：能够特异性地识别ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的药剂，和/或能够确定ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性的药剂。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶包括RelA。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在另一方面，本公开提供了能够表明受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂在制备受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的指示剂中的用途。
在一些实施方式中，所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平包括mesh1的活性和/或水平，和/或所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对mesh1的活性和/或水平的作用的药剂包括：能够特异性地扩增mesh1的引物，和/或能够特异性地识别mesh1的探针。
在一些实施方式中，能够确定所述药剂对所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平的作用的药剂包括能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂，和/或能够确定所述Mesh1蛋白质的活性的药剂。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在另一方面，本公开提供了一种非人生物体或其活体部件，其包含功能受损的ppGpp水解酶。
在一些实施方式中，所述非人生物体是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。
在一些实施方式中，所述非人生物体或其活体部件不包含任何功能性ppGpp水解酶。
在一些实施方式中，所述非人生物体或其活体部件的功能受损的ppGpp水解酶是纯合的。
在一些实施方式中，所述非人生物体与对应的野生型非人生物体相比具有减少的睡眠潜伏期。
在一些实施方式中，所述生物体的ppGpp水解酶基因被敲低或敲除。
在一些实施方式中，通过RNAi敲低所述生物体的ppGpp水解酶基因。
在一些实施方式中，通过M1KOGal4敲低所述生物体的ppGpp水解酶基因。
在一些实施方式中，所述生物体的ppGpp水解酶基因的全部三个外显子被缺失。
在一些实施方式中，ppGpp水解酶是Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种来自非人生物体或其活体部件的细胞、细胞系或原代细胞培养。
在另一方面，本公开提供了一种来自非人生物体或其活体部件的组织。
在一些实施方式中，该组织来自神经组织。
在一些实施方式中，该组织来自包含神经元细胞的神经组织。
在一些实施方式中，所述神经元细胞是脑间部神经元。
在一些实施方式中，所述神经元细胞不包含表达Dh44的神经元。
在另一方面，本公开提供了一种筛选可以用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展的物质、装置和/或组合物的方法，包括将候选物质、装置和/或组合物施用于非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织，并且确定所述候选物质、装置和/或组合物对以下一项或多项的作用：所述非人生物体的睡眠潜伏期；以及ppGpp的活性、量和/或释放。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在一些实施方式中，所述确定包括：确定所述候选物质、装置和/或组合物对神经元中的ppGpp的活性和/或水平的作用。
在一些实施方式中，所述神经元细胞是脑间部神经元。
在一些实施方式中，所述神经元细胞不包含表达Dh44的神经元。
在一些实施方式中，该方法是体外方法或离体方法。
在一些实施方式中，所述候选物质和/或组合物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述候选物质、装置和/或组合物直接作用于ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶包括RelA蛋白质。
在一些实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种筛选可以用于诊断和/或监控睡眠障碍的方法，包括：确定物质的疾病值，其中所述疾病值是从本公开的非人生物体或其或部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织获得的样本中的所述物质的存在和/或水平；确定所述物质的野生型值，其中所述野生型值是从对应的野生型非人生物体或其对应活体部件、细胞或组织获得的样本中的所述物质的存在和/或水平；并且当所述疾病值不同于所述野生型值时将所述物质鉴定为生物标志物。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在一些实施方式中，所述疾病值大于所述野生型值，并且所述生物标志物是表明减少睡眠的生物标志物。
在一些实施方式中，所述疾病值小于所述野生型值，并且所述生物标志物是表明促进睡眠的生物标志物。
在另一方面，本公开提供了非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织在制备筛选可以用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统中的用途。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
在一些实施方式中，所述物质、装置、组合物和/或生物标志物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方式中，所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶，和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
在一些实施方式中，所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
在一些实施方式中，能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的所述药剂包括所述Mesh1蛋白质和/或mesh1。
在另一方面，本公开提供了非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织，其用于筛选可以用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物。
在一些实施方式中，所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
在一些实施方式中，所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
在一些实施方式中，所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
通过以下详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员来说将容易变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的示例性实施方式。如将要实现的，本公开能够实现其他和不同的实施方式，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述应被视为说明性的，而不是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用被具体和单独地指示为并入的程度相同。
附图说明
本发明的新特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考阐述采用发明原理的示例性实施方式的以下详细描述和附图(以及本文中的“图”(“figure”和“FIG.”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：
图1说明了用于生成M1KO(A)、M1KOGal4果蝇(B)和M1KIflp(C)的图表。
图2A说明了与野生型果蝇相比，M1KO果蝇中的ppGpp增加。
图2B说明了向MIKO突变果蝇提取物中添加Mesh1蛋白质减少了ppGpp的量。
图3A说明了通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量Mesh1 RNA，其中，Log10(RQ)为果蝇中Mesh1 mRNA中相对量的对数形式。柱子分别表示：(1)M1KO/+，(2)mesh1-ins，(3)M1KO，(4)M1KOGal4/M1KO，(5)M1KOGal4/M1KO和UAS-Mesh1/+，(6)M1KO/M1KO和UAS-Mesh1/+，(7)M1KOGal4/+，UAS-Mesh1/+，(8)M1KOGal4/+和UAS-Mesh1/UAS-Mesh1，(9)M1KOGal4/+。
图3B说明了来自大肠杆菌、果蝇和智人的RSH蛋白质中的ppGpp合成酶结构域(SD)和水解酶结构域(HD)的图表。
图3C说明了ppGpp的体外测量。
图3D说明了ppGpp水平的体内测量。多个柱分别表示(1)M1KO/+，(2)M1KO，(3)M1KOGal4/+，(4)M1KOGal4/M1KO和UAS-Mesh1/+，(5)M1KOGal4/+和UAS-Mesh1/+，(6)M1KOGal4/M1KO和UAS-Mesh1E66A/+，(7)M1KOGal4/+和UAS-Mesh1E66A/+。
图4说明了1765只P元素插入系的睡眠潜伏期(A和D)和总睡眠(B)的筛选结果，其为mesh1基因中的插入(mesh1-ins)(C)。
图5A说明了M1KO果蝇的睡眠和觉醒概况。
图5B至5D说明了夜间(B)、日间(C)或总计(D)的睡眠水平的统计学分析。
图5E至5F说明了夜间(E)或日间(F)的睡眠潜伏期的统计学分析。
图5G至5H说明了傍晚(G，ZTO-3)和黎明(H，ZT9-12)时的总计觉醒次数的统计学分析。
图6A说明了LD条件下的睡眠分析。
图6B说明了DD条件下的睡眠和觉醒次数概况。
图6C至6I说明了DD条件下的睡眠分析。推定夜晚时的睡眠水平(C)、推定白昼时的睡眠水平(D)的、总睡眠水平(E)、傍晚时觉醒次数(H)、黎明时觉醒次数(I)、推定夜晚时的睡眠潜伏期(F)、假定白昼时的睡眠潜伏期(G)。
图6J至6K说明了野生型和M1KO果蝇的周期长度(J)和节律强度Qp(K)。
图6L至6M说明了野生型果蝇(L)和M1KO果蝇(M)在LD和DD条件下的昼夜概况。
图7A说明了夜晚时睡眠潜伏期的分析。
图7B说明了傍晚时觉醒次数的统计学分析。
图7C说明了黎明时觉醒次数的统计学分析。
图8A说明了脑(左)和VNC(右)中受M1KOGal4驱使表达mCD8-GFP的神经元。
图8B说明了脑(左)和VNC(右)中受M1KOGal4驱使表达red-stinger的核。
图8C说明了脑(左)和VNC(右)中由M1KOGal4＞UAS-denmark揭示的树突。
图8D说明了脑(左)和VNC(右)中由M1KOGal4＞UAS-Syt.eGFP揭示的突触末梢。
图8E说明了由M1KOGa14揭示的神经元图解总结，其中，A：前部部分。P：后部部分。
图9A至9C说明了M1KIflp和PI-Ga14相交系的UAS-FRT-stop-FRT-mCD8-GFP表达模式。
图9D说明了使用抗Dilp2抗体在M1KOGal4＞UAS-mCD8-GFP果蝇中的免疫染色图像。
图10A说明了当RelA在具有(tub-Ga14)的所有细胞、神经元(elav-Gal4)、神经胶质细胞(repo-Gal4)或mesh1阳性细胞(mesh1Gal4)中表达时的睡眠潜伏期的统计学分析。
图10B说明了当RelA在所有细胞(10)、神经元(6)、神经胶质细胞(8)或mesh1阳性细胞(4)表达时的傍晚时觉醒次数的统计学分析。
图10C说明了当Mesh1在所有细胞、神经元、神经胶质细胞或mesh1阳性细胞中过表达时的睡眠潜伏期的统计学分析。
图10D说明了当Mesh1在所有细胞、神经元、神经胶质细胞或mesh1阳性细胞中过表达时的觉醒次数的统计学分析。
图11A说明了使用102只驱动RelA表达的CCT-Ga14系进行的睡眠潜伏期的小规模筛查。
图11B至11G说明了由CCT Gal4系中的每一只驱动的mCD8-GFP：Capa-R(B)、OA2(C)、CCHa2-R(D)、CG13229(E)、LkR(F)和Trh(G)。
图12A说明了在不同亚组的PI神经元中具有RelA表达的睡眠潜伏期的统计学分析。
图12B说明了在不同亚组的PI神经元中具有RelA表达觉醒次数的统计学分析。
图12C说明了在不同PI亚组中具有Mesh1过表达的睡眠潜伏期的统计学分析。
图12D说明了在不同PI亚组中具有Mesh1过表达的觉醒次数的统计学分析。
图12E说明了图12C和图12D中多系的代表性睡眠概况。
图13A说明了M1KO中的SISL。
图13B说明了图13A中的SISL的统计学分析。
图13C说明了使用Mesh1和Mesh1E66A救援实验的SISL的统计学分析。
图13D说明了在所有细胞、神经元、神经胶质细胞或mesh1阳性细胞中具有Re1A表达的SISL的统计学分析。
图13E说明了在不同PI亚组中表达RelA的SISL的统计学分析。
图14A至14D说明了夜间或日间(B，D)的SISL中的睡眠潜伏期(A，C)。A和B为在饥饿之前，而C和D为在饥饿期间。
图15A至15K说明了SISL中的挽救系的睡眠概况。
图16A说明了在神经元或其他细胞中具有Mesh1过表达的SISL的统计学分析。
图16B说明了在不同PI亚组中具有Mesh1过表达的SISL的统计学分析。
图16C说明了图16A中的SISL的代表性睡眠概况。
图16D说明了图16B中的SISL的代表性睡眠概况。
图17A至17D说明了睡眠剥夺测定的结果。
具体实施方式
尽管在本文中已显示和描述了发明的各种实施方式，对本领域技术人员来说显而易见的是，此类实施方式仅通过示例的方式提供。在不背离发明的情况下，本领域技术人员可以做出许多变化、改变和替换。应理解，可以采用本文描述的发明实施方式的各种替代方案。
如本文使用的，术语“ppGpp”通常指“鸟苷-5’-二磷酸盐，3’-二磷酸盐”或“四磷酸鸟苷”。ppGpp水平通常由RelA/SpoT同系物(RSH)家族调节。如本文使用的，“RelA”通常指在细菌中发现的ppGpp合成酶。术语“ppGpp的合成酶”或“ppGpp合成酶”可以指任何能够增加ppGpp产生的酶，比如RelA蛋白质或其同系物等。例如，ppGpp合成酶可以为RelA蛋白质，由relA(Eco基因：EG10835，NCBI GenBank的基因ID：947244)编码，该relA包含如NCBIGenBank中的NC_000913.3(2,911,417..2,913,651，补体)所示的核酸序列。RelA蛋白质可以包含如NCBI登录号NP_417264.1所示的氨基酸序列。术语“ppGpp的水解酶”或“ppGpp水解酶”通常指任何能够减少ppGpp产生的酶，比如SpoT同系物等(例如，Mesh1蛋白质)。例如，ppGpp水解酶可以为由mesh1(也称为CG19900，Q9VAM9)编码的Mesh1蛋白质。Mesh1蛋白质可以具有NCBI登录号NP_651682.1所示的氨基酸序列。mesh1可以具有NCBI GenBank的基因ID：43456，并且包含NCBI GenBank的NT_033777.3(29201756..29202525，补体)所示的核酸序列。
多核苷酸序列或多肽序列为另一序列的“同系物”、“同源物”是指多核苷酸或多肽在另一对象物种中执行基本相同的功能并且享有基本序列同一性，其程度为它们在本领域中被识别为同一蛋白质的不同形式，区别主要在于发现它们的物种。因此，例如，真核生物中的Mesh1和原核生物中的Mesh1全都被认为是彼此的同系物或同源物。如果在进行最佳比对(具有允许的间隙)时，两个多核苷酸序列或多肽序列享有至少约50％序列同一性，或者如果这些序列享有确定的功能基序时，则认为它们具有基本同一性。在替代性实施方式中，如果最佳比对序列在指定区域上享有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，则可以认为它们为基本相同的(即具有基本同一性)。
术语“同一性”和“相同”是指两个肽或两个多核苷酸分子之间的序列相似性。同一性可以通过比较比对序列中的每个位置来确定。氨基酸序列或核酸序列之间的同一性是序列共享位置处(即，指定区域上)相同或匹配的氨基酸或核苷酸的数量的函数。为确定核苷酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技能范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，比如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文使用的，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，通常指其分子由许多个构成核酸分子一部分的核苷酸单元组成的聚合物。该术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)生成的DNA或RNA类似物及其杂合体。
如本文使用的，术语核酸的“表达产物”通常指得自核酸表达的生化材料。表达产物可以在核酸(比如cDNA、mRNA等)、前体、肽、多肽、蛋白质和/或其片段的扩增、复制、转录、剪辑、加工、翻译或修饰产生的表达中产生。
如本文使用的，术语“调节睡眠”通常指将睡眠的时间和持续时间调节到正常水平。调节睡眠可以包括促进睡眠和/或减少睡眠。如本文使用的，术语“促进睡眠”通常指增加睡眠水平和/或促进入睡，这可通过缩短睡眠潜伏期、减少睡眠期间唤醒次数和时间以及在睡眠开始后平缓过渡到慢波睡眠(其被视为深度睡眠)以增加睡眠时间来获得。例如，促进睡眠可以包括增加日间睡眠、增加夜间睡眠、增加总睡眠、减少睡眠潜伏期(例如，减少入睡时间)、增加睡眠水平。如本文使用的，术语“减少睡眠”通常指减少睡眠水平和/或促进醒来。例如，减少睡眠可以包括减少日间睡眠、减少夜间睡眠、减少总睡眠、增加睡眠潜伏期(例如，增加入睡时间)、减少睡眠水平。
如本文使用的，术语“昼夜节律”通常指包括植物、动物、真菌和蓝细菌在内的生物的生理过程的大致24小时周期。在一些情况下，昼夜节律可以为内源产生的。在其他情况下，昼夜节律可以通过比如阳光和温度等外部信号调节。昼夜节律可以通过在持续黑暗中的运动活动来分析。
如本文使用的，术语“基本不影响”通常指在药剂处理之后表型上与野生型没有显著差异。
如本文使用的，术语“睡眠障碍”通常指将受益于使用本发明药剂治疗的任何状况，包括可通过有效量的本文描述的药剂治疗的任何睡眠疾病或障碍。睡眠障碍可以包括，例如，原发性失眠、原发性睡眠过度、发作性睡病、昼夜节律睡眠障碍(例如，时区改变(飞行时差)综合征、倒班睡眠障碍、不规律睡眠/觉醒模式、睡眠相位后移综合征、睡眠阶段提前综合征、非24小时睡眠/觉醒障碍、未明确昼夜节律睡眠障碍)、睡眠呼吸暂停综合征(例如，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征)、异常睡眠症(例如，梦魇症、夜惊症、梦游症、梦语、睡眠瘫痪症、REM睡眠行为障碍、磨牙症、夜间遗尿症)、与睡眠障碍相关的疾病(例如，抑郁、焦虑症、恐慌症、痴呆、帕金森病、哮喘、消化性渍疡)、物质依赖性睡眠障碍(例如，安眠药、镇痛药、酒精、抗焦虑药、咖啡因及其他刺激剂)、因睡眠缺乏所致的精神障碍(例如，幻觉、抑郁、焦虑症、注意力强度下降、日间嗜睡)。
本公开的“睡眠障碍”可以包括与睡眠不足和/或睡眠过多相关的睡眠障碍。如本文使用的，术语“睡眠不足”通常指未获得正常脑功能所需睡眠的状态。睡眠不足导致日间瞌睡和注意力下降，严重的睡眠剥夺还导致比如幻觉等精神病症状，如果这种状态持续则可能发生死亡。此外，睡眠剥夺是睡眠障碍的诱因之一和睡眠障碍的症状之一。例如，睡眠不足可以包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。如本文使用的，术语“睡眠过多”通常指睡眠过多以及日间睡眠过多的状态。其通常伴有睡眠质量差。例如，睡眠过多可以包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
如本文使用的，术语“失眠”通常指人们难以入睡的睡眠障碍。如本文使用的，术语“睡眠丧失”通常指不具有充足睡眠的睡眠障碍。如本文使用的，术语“发作性睡病”通常指特征在于过度瞌睡、睡眠瘫痪症、幻觉和在一些情况下猝倒发作的睡眠障碍如本文使用的，术语“异常睡眠症”通常指涉及在入睡、睡眠、睡眠阶段之间或者从睡眠唤醒期间发生的异常运动、行为、情绪、感知和梦的睡眠障碍。如本文使用的，术语“剥夺”通常指不具有充足睡眠的状态。本领域的睡眠剥夺技术包括轻柔处理、单平台、多平台、改性多平台和钟摆。例如，睡眠剥夺可通过整晚随机摇晃的方式进行，其中计算反弹率来评价睡眠剥夺程度。
如本文使用的，术语药剂的“有效量”通常指在单独使用或与其他药剂联用时促进疾病消退的任何药剂量，这种消退通过疾病症状(比如睡眠障碍等)的严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或者预防因疾病折磨所致的损伤或失能来证实。该术语还可以指在单独施用或与另一种药剂联合施用于处于发展睡眠障碍风险中或苦于睡眠障碍复发风险中的受试者时抑制睡眠障碍的发展或复发的药剂量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价药剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力，比如在临床试验期间的人类受试者中，在预测人类疗效的动物模型中，或者通过在体外实验中测定药剂活性等。对于任何特定受试者的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病或障碍，疾病或障碍的严重性，具体组分的活性，施用途径，清除率，治疗持续时间，受试者的年龄、体重、性别、饮食和总体健康状况，以及其他相关因素。
如本文使用的，术语“治疗(treatment或treating)”是指治愈性(curative)疗法和预防性(prophylactic和preventative)疗法。连续治疗或施用是指在一天或多天治疗中在没有中断的情况下至少每天治疗一次。间断治疗或施用或者以间断方式治疗或施用是指本质上不是连续的而是周期性的治疗。根据本发明方法的治疗可以导致疾病或状况的完全缓解或治愈，或者导致疾病或状况的一种或多种症状的部分改善，并且可以是暂时或永久的显著影响。
如本文使用的，术语“预防(prevention或preventing)”表示减轻所述障碍的症状。特别地，所述术语涵盖向受试者施用本公开的药剂的治疗积极作用的完整范围，包括其睡眠障碍(例如睡眠不足或睡眠过多)的减少、减轻或缓解。术语“预防”包括预防或延缓疾病的发展、预防或延缓症状的发展和/或降低将会发展或预期会发展的此类症状的严重性。这些还包括改善现有症状、预防额外症状以及改善或预防症状的根本原因。
如本文使用的，术语“特异性地识别”通常指与蛋白质特异性地相互作用和/或结合。因此，可以通过本领域已知的方法和本文公开和描述的方法通过实验来确定特异性。此类方法包括但不限于western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA-测试和肽扫描。
如本文使用的，术语“特异性地扩增”通常指特征性地扩增一种核酸分子而不是另一种。能够特异性地扩增核酸序列的药剂可以与核酸分子互补或基本互补。“互补”通常指能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对。
如本文使用的，术语“引物”通常指能够在模板依赖性过程中引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是长度为10至20个碱基对的寡核苷酸，但也可以采用更长的序列。引物以双链或单链形式提供。
术语“干扰RNA(RNAi)”在本文中用于指会导致特定mRNA催化降解的双链RNA，因此可以用于抑制/降低特定基因的表达。
如本文使用的，术语“Dilp2”通常指果蝇胰岛素样肽2(请参见Crocker，A.，Shahidullah，M.，Levitan，I.B.&Sehgal，“A.Identification of a neural circuit thatunderlies the effects of octopamine on sleep：wake behavior”Neuron 65，670-681，Yurgel，M.E.等人，“A single pair of leucokinin neurons are modulated by feedingstate and regulate sleep-metabolism interactions”PLoS Biol 17，e2006409，和Semaniuk，U.V.等人，“Insulin-Like Peptides Regulate Feeding Preference andMetabolism in Drosophila”，Front Physiol9，1083)。
如本文使用，术语“SIFa”通常指神经肽SIFamide，请参见(Martelli，C.等人，“SIFamide Translates Hunger Signals into Appetitive and Feeding Behavior inDrosophila”，Cell Rep 20，464-478，和Park，S.，Sonn，J.Y.，Oh，Y.，Lim，C.&Choe，J.，“SIFamide and SIFamide receptor defines a novel neuropeptide signaling topromote sleep in Drosophila”，Mol Cells 37，295-301。)
术语“Rya-R”通常指RYamide受体，请参见(Collin，C.等人，“Identification ofthe Drosophila and Tribolium receptors for the recently discovered insectRYamide neuropeptides”，Biochem Biophys Res Commun 412，578-583和Ohno，H.等人，“Luqin-like RYamide peptides regulate food-evoked responses in C.elegans”，Elife 6)。
术语“Dh44”通常指促肾上腺皮质激素释放因子样利尿激素44。(请参见Cannell，E.等人，“The corticotropin-releasing factor-like diuretic hormone 44(DH44)andkinin neuropeptides modulate desiccation and starvation tolerance inDrosophila melanogaster”，Peptides 80，96-107和Chen，Y.D.&Dahanukar，A.，“DH44neurons：gut-brain amino acid sensors”，Cell Res 28，1048-1049。)
本公开的发明首次通过化学分析揭示了ppGpp在果蝇中的存在。敲除ppGpp降解酶显示了与敲入ppGpp合成酶相同的睡眠表型，证实了ppGpp以及ppGpp降解酶和/或ppGpp合成酶在调节睡眠中起生理作用。
在一个方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的方法。在本公开中，该方法包括：提供候选药剂；确定所述候选药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用；如果所述候选药剂改变了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
另一方面，选择用于调节睡眠的药剂的方法可以包括提供候选药剂；确定所述候选药剂对mesh1的活性和/或水平的作用；如果所述候选药剂改变了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
能够改变PPGPP或mesh1的活性和/或水平的药剂
在本公开中，能够改变ppGpp或mesh1的活性和/或水平的药剂可以为蛋白质或其片段、小分子、抗体、寡核苷酸或者甚至多核苷酸。事实证明，最有用的药物化合物将是在结构上与已知的改变ppGpp或mesh1的活性和/或水平的药剂相关的化合物。使用先导化合物帮助开发改进的化合物被称为“合理药物设计”，并且不仅包括与已知药剂的比较，还包括与目标分子结构相关的预测。
合理药物设计的目标是产生生理活性多肽或目标化合物的结构类似物。通过创建此类类似物，有可能制造出比天然分子活性更高或更稳定、具有不同的改变易感性或者可能影响多种其他分子功能的药物。在一种方法中，人们将生成目标分子或其片段的三维结构。这可以通过x射线晶体学、计算机建模或两种方法的组合来完成。
另一方面，人们可以简单地从各种商业来源获取据信符合有用药物基本标准的小分子文库。筛选此类文库可以是筛选大量相关(和不相干)化合物活性的快速有效的方式。组合方法还通过创建以有活性但其他方面不理想的化合物为模型的第二代、第三代和第四代化合物来促进潜在药物的快速演化。
候选药剂可以包含从比如动物、细菌、真菌、植物来源(包括叶子和树皮)等天然来源分离的化合物，并且可以将海洋样品作为候选测定潜在能够改变ppGpp或mesh1的活性和/或水平的药剂的存在。应理解药剂可以衍生自或合成自化学组合物或人造化合物。因此，应理解通过本发明鉴定的候选药剂可以为肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、小分子抑制剂或任何其他可以通过合理药物设计从已知抑制剂或刺激剂开始设计的化合物。
其他合适的调节剂包括反义分子、核酶、小干扰RNA和抗体(包括单链抗体或编码其的表达构建物)，其中的每一种对于给定目标分子为特异性的。
根据本公开，调节睡眠的药剂可以为在涉及睡眠调节的已知途径上游、下游或直接对该途径发挥作用的药剂。无论本选择方法鉴定的组合物类型如何，该组合物的作用是睡眠调节。
在一些实施方式中，能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂可以包含小分子。在一些实施方式中，该药剂可以包含能够在某些化学或生化条件下产生ppGpp或转变为ppGpp的小分子。例如，该药剂可以包含ppGpp、GDP、pppGpp(五磷酸鸟苷)。
在一些实施方式中，能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂可以包含蛋白质(比如酶、抗体、细胞因子等)。在一些情况下，该药剂可以包含能够改变ppGpp合成酶和/或ppGpp水解酶的活性和/或水平的蛋白质。例如，该药剂可以包含Mesh1蛋白质。又例如，该药剂可以包含RelA蛋白质。
在一些实施方式中，能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂可以包含多核苷酸。在一些情况下，该药剂可以包含编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。例如，该药剂可以包含编码Mesh1蛋白质的核酸分子。又例如，该药剂可以包含编码Re1A蛋白质的核酸分子。在一些实施方式中，该药剂可以包含编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的基因。在一些实施方式中，该药剂可以包含由核酸分子转录的RNA。
在一些实施方式中，所述药剂可以直接作用于能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。在一些实施方式中，所述药剂可以直接作用于ppGpp水凝胶和/或ppGpp合成酶。
体内或离体方法
在本公开中，一种快速、廉价并且易于运行的测定是体外测定。此类测定可以快速大量运行，从而增加短时间内可获得的信息量。可以使用多个容器来运行测定，包括试管、板、盘子和其他表面(比如浸量尺或珠子)。无细胞测定的一个示例为结合测定。候选药剂与目标(例如，ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶)体外结合的能力可以为对生物体的相关生物作用的证据。目标(例如，ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶)可以为在溶液中游离的，固定到载体上，在细胞中或细胞表面上表达。可以标记目标或化合物，从而允许确定表达。通常，目标将是经标记的物种。
在本公开中可以利用各种细胞和细胞系，包括特地为本公开目的进行工程化的细胞。在一些实施方式中，可以使用产生ppGpp的细胞、细胞系、原代细胞培养物或组织来检测候选药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用。首先，将所述候选药剂与细胞或组织接触。用于本筛选测定的细胞的特别有用的示例为神经元来源的果蝇细胞。然而，也可以使用包括来自哺乳动物甚至人类的那些细胞在内的其他细胞。
取决于方法，可能需要培养。可以使用多种不同的生理测定中的任何一种来检验细胞以评价作用，比如磷酸化水平、酶活性(在酶的情况下)、结合性质(在受体情况下)或电生理电流(在离子通道的情况下)。替代性地，可以进行分子分析，例如，观察蛋白质表达、mRNA表达(包括全细胞或polyA NA的不同展示)以及与编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的基因的表达水平或活性相关的其他参数。
在一些实施方式中，细胞可以用药剂温育，用包含候选药剂的载体转染。在一个实施方式中，该组织和/或细胞可以在体外或离体培养，随后，可以将候选药剂应用于所培养的组织和/或细胞，在培养合适时间(例如，数小时、数日、数周或数月)之后，可以提取ppGpp，并且可以确定ppGpp的量。
通过化学或生化方法测量化合物对本领域技术人员来说是公知的。在一些实施方式中，ppGpp的量可以通过以下方法确定：色谱、分光光度法、光谱、质谱、电泳、晶体学、电化学分析等。例如，通过超高效液相色谱和质谱(UPLC-MS)检测量和/或水平。
在另外的实施方式中，ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或表达可以在温育之后确定。蛋白质(比如ppGpp水解酶或ppGpp合成酶等)可以用本领域已知的方法定量测定，这些方法包括但不限于免疫组织化学、PCR、RT-PCR、原位杂交、southern印迹、western印迹、northern印迹、分光光度法、基因芯片、流式细胞术(FACS)、蛋白质芯片、DNA测序和ELISA。测量活性也可以包括测定酶功能或结合功能。
在本公开中，可以通过本领域公知的方法来检测编码蛋白质(比如ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶等)的核酸分子的表达，这些方法比如免疫荧光法、免疫组织化学和共焦成像。通过将目标与可检测物质偶联可以促进检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形花序酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。用于免疫组织化学的抗体的示例可以为GFP、denmark、nc82、red-stinger。
在另一实施方式中，编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或表达可以在温育之后确定。在此方面考虑了多种不同的测定法，包括但不限于荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、PFGE分析、Southern或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、RNAse保护测定、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、斑点杂交分析、变性梯度凝胶电泳、RFLP和PCRTM-SSCP。测量还可以包括选自由以下组成的组的技术：定量RT-PCR Northern印迹、ELISA或Westem印迹。测量核酸分子的活性和/或表达可以包括测量所述核酸分子的mRNA水平、测量所述核酸分子的mRNA周转率、测量所述核酸分子的蛋白质水平。
在一些情况下，该方法可以使用比如神经元细胞、脑区域或包含或对应于ppGpp水平的其他组织等的组织和/或细胞进行。在一些情况下，细胞可以为神经元，例如，人类神经元、果蝇神经元。在一些情况下，细胞可以为神经元。神经元可以为携带电脉冲的细胞，其可以包括细胞本体(也称为胞体或细胞体)、树突和轴突。神经元可以包括蕈状体(MB)神经元、扇形体(FB)神经元、腹外侧神经元和脑间部(PI)神经元。在一些情况下，细胞可以为脑间部(PI)神经元。在一些情况下，细胞可以为脊椎动物下丘脑-垂体系统的神经元。
在一些情况下，神经元可以包括表达c767的神经元、表达Dilp2的神经元、表达SIFa的神经元和表达Rya-R的神经元。在一些情况下，神经元可以不包括任何表达Dh44的神经元。
该方法还可以包括测量未用所述候选化合物处理的相似细胞中所述ppGpp的表达水平或活性，即，阴性对照。该方法还可以进一步包括用已知的睡眠调节组合物来治疗所述细胞，即，阳性对照。该方法还可以包括评估所述候选药剂对完整生物体的作用。
体内方法
本公开还包括体内方法，该方法可以涉及使用各种动物，特别是包括果蝇以及哺乳动物和人。具体方法也可以使用非人转基因动物，其已经经过工程化以具有特定缺陷或携带外源基因，可用于测量候选药剂到达和影响生物体内不同细胞的能力。在一些实施方式中，果蝇可以为优选的转基因模型，这可归因于它们的大小、容易处理以及关于它们生理学和基因构成的信息。然而，其他动物也可能是合适的，包括小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、沙鼠、土拨鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴子(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂的测定可以使用原子这些物种中任何一种的动物模型来进行。
在此类方法中，将一种或多种候选药剂施用于生物体，与未用候选药剂治疗的类似动物相比，候选药物改变一种或多种特性的能力鉴定了该候选药物对ppGpp的活性和/或水平的作用。
用测试化合物治疗生物体可以涉及将该化合物以合适的形式施用于生物体。本领域技术人员已知的任何动物模型可用于本发明的方法中。施用可以通过能用于临床或非临床目的的任何途径进行，包括但不限于口服、经鼻、瘤内甚至局部。替代性地，施用可以通过气管内滴注、支气管炎滴注、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、吸入或静脉内注射进行。确定化合物体内有效性可以涉及多种不同标准。此外，与体外或离体测定相比，可以在动物体内以更有意义的方式进行毒性和剂量反应的测量。
行为测定
各种测定法可用于评价果蝇的睡眠表型，在实施例中公开了其中的一些。此类测定设计用于测量睡眠潜伏期、睡眠时间、睡眠回合、昼夜节律、觉醒次数和饥饿诱导的睡眠丧失(SISL)。
调节睡眠
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，该系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：能够反映ppGpp的活性和/或水平的物质；能够反映ppGpp水解酶的活性和/或水平的物质；和/或能够反映ppGpp合成酶的活性和/或水平的物质。
在本公开的一些实施方式中，改变ppGpp的活性和/或水平可以包括改变ppGpp合成酶和/或ppGpp水解酶的活性和/或表达。在其他实施方式中，改变ppGpp的活性和/或水平可以包括改变编码ppGpp合成酶的核酸分子和/或ppGpp水解酶的活性和/或表达。
在一些实施方式中，增加所述ppGpp的活性和/或水平可以包括增加ppGpp合成酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或表达。在其他实施方式中，增加所述ppGpp的活性和/或水平可以包括减少ppGpp水解酶和/或ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或表达。在一些实施方式中，减少所述ppGpp的活性和/或水平可以包括减少ppGpp合成酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或表达。在其他实施方式中，减少所述ppGpp的活性和/或水平可以包括增加ppGpp水解酶和/或ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或表达。
在一些实施方式中，所述调节睡眠包括减少睡眠。在一些实施方式中，所述调节睡眠包括调节失眠、调节调节夜间发作的失眠和/或调节晨间早醒。在一些实施方式中，如果所述候选药剂增加了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为减少睡眠的药剂。在一些实施方式中，所述调节睡眠包括促进睡眠。在一些实施方式中，所述调节睡眠包括调节发作性睡病、调节过度嗜睡、调节夜间发作的早睡和/或调节晨间晚醒。在一些实施方式中，如果所述候选药剂减少了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为促进睡眠的药剂。
在一些实施方式中，所述药剂基本不影响日间睡眠、睡眠回合次数及长度和/或昼夜节律。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，该系统可以包括测试模块，其中所述测试模块可以包括能够反映ppGpp的活性和/或水平的物质。
在一些实施方式中，所述测试模块可以包括能够反映ppGpp水解酶的活性和/或水平的物质。在一些情况下，所述物质可以能够反映编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。在一些情况下，所述物质可以包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp水解酶的所述核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp水解酶的药剂(比如ppGpp水解酶的抗体和/或配体和/或其片段。)。例如，所述ppGpp水解酶可以为Mesh1蛋白质。
在一些实施方式中，所述测试模块可以包括能够反映ppGpp合成酶的活性和/或水平的物质。在一些情况下，所述物质可以能够反映编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。在一些情况下，所述物质可以包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp合成酶的所述核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp合成酶的药剂(比如ppGpp合成酶的抗体和/或配体和/或其片段。)。例如，所述ppGpp水解酶可以为RelA蛋白质。
自然地，本公开还包括能够扩增编码ppGpp合成酶和/或ppGpp水解酶的核酸分子的序列的药剂(比如多核苷酸等)。例如，编码ppGpp合成酶和/或ppGpp水解酶的核酸分子或者其功能性或非功能性片段。该药剂可以是较短的寡核苷酸。尽管较短的寡聚物更容易制备并且增加体内可及性，但许多其他因素也参与确定扩增特异性。考虑了将使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个碱基对的示例性寡核苷酸，尽管还考虑了其他方案。还考虑了编码250、500、1000、1500、2000、2500、3000或5000个碱基或更多碱基的更长的多核苷酸。此类多核苷酸将可以用作例如探针或者用作扩增反应中的引物。
在一些实施方式中，引物可以为引物对。此外，本公开可以包括能够特异性地识别编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的探针。该探针可以能够与ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子序列或其片段结合，而不是另外的核苷酸序列结合。该探针可以具有可检测的信号。
在本公开中，所述系统可以包括选择模块，所述选择模块可以根据从所述测试模块获得的结果来选择所述调节睡眠的药剂。
在一些情况下，如果从所述测试模块获得的所述药剂增加了ppGpp的活性和/或水平，则所述药剂可以被选择为用于减少睡眠的候选物；如果从所述测试模块获得的所述药剂减少了ppGpp的活性和/或水平，则所述药剂可以被选择为用于促进睡眠的候选。在其他情况下，如果从所述测试模块获得的所述药剂增加了ppGpp水解酶的活性和/或水平，则所述药剂被选择为用于促进睡眠的候选物；如果从所述测试模块获得的所述药剂减少了ppGpp水解酶的活性和/或水平，则所述药剂被选择为减少睡眠的候选。在其他情况下，如果从所述测试模块获得的所述药剂增加了ppGpp合成酶的活性和/或水平，则所述药剂被选择为用于减少睡眠的候选物；如果从所述测试模块获得的所述药剂减少了ppGpp合成酶的活性和/或水平，则所述药剂被选择为用于促进睡眠的候选。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，该系统可以包括测试模块，其中所述测试模块可以包括能够反映mesh1的活性和/或水平的物质。在一些实施方式中，所述物质可以包括能够特异性地扩增mesh1核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂。
在一些实施方式中，所述系统可以包括选择模块，所述选择模块可以根据从所述测试模块获得的结果来选择所述调节睡眠的药剂。在一些情况下，如果从所述测试模块获得的所述药剂增加了mesh1基因和/或Mesh1蛋白质的活性和/或表达，则所述药剂可以被选择为用于促进睡眠的候选物；如果从所述测试模块获得的所述药剂减少了mesh1基因和/或Mesh1蛋白质的活性和/或表达，则所述药剂可以被选择为减少睡眠的候选。
睡眠障碍
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展的方法。所述方法可以包括对需要其的受试者施用有效量的本公开的能够在所述受试者中改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。
在一些情况下，该药剂可以包含编码ppGpp水解酶的核酸分子。例如，该药剂可以包含编码所述Mesh1蛋白质的核酸分子。在一些情况下，该药剂可以包含其表达产物，例如，由所述核酸分子转录的RNA、ppGpp水解酶蛋白质或多肽。例如，该药剂可以包含Mesh1蛋白质或其片段。例如，该核酸分子可以包括NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
在一些实施方式中，该药剂可以包含编码ppGpp合成酶的核酸分子。例如，该药剂可以包含编码所述RelA蛋白质的核酸分子。在一些情况下，该药剂可以包含其表达产物，例如，从所述核酸分子转录的RNA、ppGpp合成酶蛋白质或肽。例如，该药剂可以包含RelA蛋白质或其片段。例如，该核酸分子可以包括NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的方法，该方法包括：对需要其的受试者施用有效量的能够改变所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
所述药剂可以包含小分子、蛋白质和/或多核苷酸。在一些情况下，该药剂可以包含mesh1核酸分子，能够特异性地扩增所述mesh1核酸分子的引物。在一些情况下，该药剂可以包含其表达产物，例如，从所述核酸分子转录的RNA、Mesh1蛋白质或其片段。例如，该核酸分子可以包括NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
药物
在另一方面，本公开提供了能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药物中的用途。
在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强ppGpp的活性和/或增加ppGpp的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强编码ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或增加编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制编码ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或降低编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强ppGpp合成酶的活性和/或增加ppGpp合成酶的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制ppGpp水解酶的活性和/或降低ppGpp水解酶的水平。
在一些实施方式中，所述药剂可以包含编码ppGpp合成酶的核酸分子或其表达产物。在一些实施方式中，所述核酸分子可以包含NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。例如，所述ppGpp合成酶可以包括RelA蛋白质。
在一些实施方式中，所述药剂可以包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。在一些实施方式中，所述睡眠障碍可以与睡眠不足相关。在一些实施方式中，所述睡眠障碍可以与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关，所述药剂可以能够降低所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制ppGpp的活性和/或降低ppGpp的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制编码ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或降低编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强编码ppGpp水解酶的核酸分子的活性和/或增加编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制ppGpp合成酶的活性和/或减少ppGpp合成酶的水平。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强ppGpp水解酶的活性和/或增加ppGpp水解酶的水平。
在一些实施方式中，所述药剂可以包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。在一些实施方式中，所述药剂可以包含编码ppGpp水解酶的核酸分子或其表达产物。在一些实施方式中，所述核酸分子可以包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。例如，所述ppGpp水解酶可以包括Mesh1蛋白质。
在另一方面，本公开提供了能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药物中的用途。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强Mesh1蛋白质的活性和/或增加Mesh1蛋白质的表达。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增强核酸分子mesh1的活性和/或增加核酸分子mesh1的表达。在一些实施方式中，所述药剂可以包含核酸分子mesh1或其表达产物(例如，RNA或蛋白质)。例如，所述药剂可以包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制Mesh1蛋白质的活性和/或降低Mesh1蛋白质的表达。在一些实施方式中，所述药剂可以能够抑制核酸分子mesh1的活性和/或表达。
本领域技术人员知晓如何根据本发明施用该药剂。例如，体内基因递送可以依赖于病毒或非病毒载体。比较相对摄取效率的非病毒配制剂。
在许多临床情况下，建议使用不同疗法的组合。因此，设想除了本公开的药剂之外，人们将还希望向患者提供更“传统的”药物睡眠调节疗法。
在考虑临床应用时，将有必要以适合预期应用的形式制备药物。通常，这将需要制备基本无热原及可能对人或动物有害的其他杂质的药物。
人们通常将希望采用合适的盐和缓冲液以使递送介质稳定并且允许被目标细胞摄取。当将重组细胞导入受试者体内时也将采用缓冲液。本公开的水性组合物包含有效量的药剂，其溶解或分散在药学上可接受的载剂或水性介质中。短语“药学上或药理学上可接受”是指当施用于动物或人时不会产生不利的、变态反应性的或其他不良的反应的分子实体和组合物。如本文使用的，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是公知的。
本发明的活性组合物可以包括经典的药物配制物。根据本公开的这些组合物的施用可以经由任何常规途径进行，只要经由该途径可达目标组织即可。这可以包括口服和经鼻施用、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、血管内或静脉内注射。
在另一方面，本公开还提供了用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展的能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。在一些实施方式中，所述药剂可以能够减少ppGpp的活性和/或水平，所述药剂可以用于治疗、预防与睡眠不足相关的睡眠障碍或减缓与睡眠不足相关的睡眠障碍的发展。在一些实施方式中，所述药剂可以能够增加ppGpp的活性和/或水平，所述药剂可以用于治疗、预防与睡眠过多相关的睡眠障碍或减缓与睡眠过多相关的睡眠障碍的发展。
在另一方面，本公开还提供了用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。在一些实施方式中，所述药剂可以能够改变mesh1核酸分子的活性和/或表达，所述药剂可以用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展。
在另一方面，本公开还提供了用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的能够改变RelA蛋白质的活性和/或水平的药剂。在一些实施方式中，所述药剂可以能够改变relA核酸分子的活性和/或表达，所述药剂可以用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展。
确定睡眠障碍的可能性
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的方法。该方法可以包括评估所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
在本公开中，能够评估编码ppGpp水解酶和/或合成酶的所述核酸分子的所述活性和/或表达的物质包括：能够特异性地扩增编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的所述核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的所述核酸分子的药剂。
在一些实施方式中，能够确定所述ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的所述活性和/或水平的物质包括：能够特异性地识别ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的药剂，和/或能够确定ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性的药剂。
该方法可以包括本公开中描述的离体、体内和/或体外方法。与对照(比如野生型等)相比，如果所述受试者的ppGpp的活性和/或水平有所改变，则该受试者可能患睡眠障碍和/或有风险患睡眠障碍。如本文使用的，术语“有风险患睡眠障碍”通常指患睡眠障碍的风险高于对照的风险。在一些实施方式中，所述ppGpp合成酶可以包括RelA蛋白质。在其他实施方式中，所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
在一些实施方式中，该方法可以包括将所述物质应用于所述受试者，随后可以测定ppGpp的活性和/或水平。如果ppGpp的活性和/或水平增加，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性可能很高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠不足相关的睡眠障碍(例如，失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒)。如果ppGpp的活性和/或水平降低，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠过多相关的睡眠障碍(例如，发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒)。
如果与对照相比ppGpp水解酶的活性和/或水平降低，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性可能很高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠不足相关的睡眠障碍(例如，失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒)。如果与对照相比ppGpp水解酶的活性和/或水平增加，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性可能很高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠过多相关的睡眠障碍(例如，发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒)。
如果ppGpp合成酶的活性和/或水平制剂增加，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性可能很高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠不足相关的睡眠障碍(例如，失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒)。如果ppGpp合成酶的活性和/或水平降低，则所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高，其中所述睡眠障碍可以为与睡眠过多相关的睡眠障碍(例如，发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒)。
在另一方面，本公开提供了一种用于确定受试者患有睡眠障碍和/或处于患睡眠障碍的风险的可能性的方法，其可以包括评价所述受试者的Mesh1的活性和/或水平。在一些实施方式中，所述Mesh1的活性和/或水平可以包括mesh1核酸分子的活性和/或表达，和/或Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
非人模型
在另一方面，本公开提供了包含功能受损的ppGpp水解酶的非人生物体或其活体部件。非人生物体可以为昆虫，比如蜈蚣(Strigamia maritima)、肩突硬蜱(Ixodesscapularis)、家蚕(Bombyx mori)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)、家蝇(Muscadomestica)、刺舌蝇(Glossina morsitans)和/或果蝇(Drosophila)物种等。在一些实施方式中，非人生物体可以为果蝇(Drosophila)物种，比如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑翅果蝇(Drosophila suzukii)、拟果蝇(Drosophila simulans)、Drosophila erecta、Drosophila sechellia、Drosophila yakuba、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura pseudoobscura)、Drosophila persimilis、Drosophila willistoni、Drosophila virilis、Drosophilamojavensis、Drosophila grimshawi。在一些实施方式中，非人生物体为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、拟果蝇(Drosophila simulans)、西方蜜蜂(Apismellifera)。
在一些实施方式中，非人生物体或其活体部件可以不包含任何功能性ppGpp水解酶。本公开的非人生物体可以通过将不具有编码ppGpp水解酶的基因的异源核酸序列导入例如非人生物体的受精卵、未受精卵、精子、原生殖细胞、卵原细胞、卵母细胞、精原细胞、精母细胞和/或精细胞来产生，例如，在受精卵胚胎发育的初始阶段(例如，在8细胞阶段之前)。可以通过基因转移方法导入异源核酸序列，这些方法比如磷酸钙共沉淀、电穿孔、脂质转染、凝集、显微注射、基因枪(粒子枪)和/或DEAE-葡聚糖方法。也可以将异源核酸序列导入果蝇的体细胞、组织和/或器官中(例如，通过基因转移方法)，随后可以进一步培养和/或维护工程化体细胞、组织和/或器官。工程化细胞也可以通过细胞融合方法与胚胎或另一细胞(比如来自非人生物体种系的细胞等)融合以产生本公开的非人生物体。
在本公开用于生成动物模型的方法中，也可以使用核酸酶药剂以帮助修饰目标基因座。此类核酸酶药剂可以促进供体核酸分子与目标基因组基因座之间的同源重组。在一些实施方式中，核酸酶药剂可以包括核酸内切酶药剂。
如本文使用的，术语“核酸酶药剂的识别位点”通常指核酸酶药剂可在该处诱导切口或双链断裂的DNA序列。核酸酶药剂的识别位点对于细胞可以是内源的(或者天然的)，或者识别位点对于细胞可以是外源的。在一些实施方式中，识别位点对于细胞可以是外源的，因此不是天然存在于细胞的基因组中。在进一步的实施方式中，外源或内源识别位点可以仅在宿主细胞的基因组中存在一次。在具体实施方式中，可以鉴定仅在基因组中出现一次的内源或天然位点。随后可以使用此类位点设计将在该内源识别位点处产生切口或双链断裂的核酸酶药剂。
识别位点的长度可变，并且包括例如长度为至少4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个核苷酸的识别位点。在一个实施方式中，核酸酶药剂的每个单体可以识别具有至少9个核苷酸的识别位点。在其他实施方式中，识别位点的长度可以为约9至约12个核苷酸，长度为约12至约15个核苷酸，长度为约15至约18个核苷酸，或长度为约18至约21个核苷酸，以及此类子范围的任何组合(例如，9至18个核苷酸)。识别位点可以为回文的，即，一条链上的序列与互补链上相反方向上读取的序列相同。要意识到的是，给定的核酸酶药剂可以与识别位点结合并且切割该结合位点，或者替代性地，核酸酶药剂可以与不同于识别位点的序列结合。此外，术语识别位点可以包括核酸酶药剂结合位点和切口/切割位点二者，无论该切口/切割位点是位于核酸酶药剂结合位点之内还是之外。在另一变体中，核酸酶药剂切割可以发生在彼此刚好相对的核苷酸位置处以产生平端切割，或者在其他情况下，切口可以交错以产生单链突出部分，也称为“粘性端”，其可为5’突出部分或3’突出部分。
在本公开的方法中可以使用任何诱导切口或双链断裂进入所需识别位点中的核酸酶药剂。可以采用天然存在的或天然的核酸酶药剂，只要该核酸酶药剂在所需识别位点中诱导切口或双链断裂。替代性地，可以采用修饰的或工程化的核酸酶药剂。“工程化核酸酶药剂”包括从其天然形式工程化(修饰或衍生)为在所需识别位点中特异性地识别和诱导切口或双链断裂的核酸酶。因此，工程化核酸酶药剂可以衍生自天然的、天然存在的核酸酶药剂，或其可以为人工创建或合成的。核酸酶药剂的修饰可以少至蛋白切割药剂中的一个氨基酸或核酸切割药剂中的一个核苷酸。在一些实施方式中，工程化核酸酶可以包含在识别位点中的切口或双链断裂，其中该识别位点不是已被天然的(非工程化的或非修饰的)核酸酶药剂识别的序列。在识别位点或其他DNA中产生切口或双链断裂在本文中可以被称为“切割(cutting或cleaving)”该识别位点或其他DNA。
在一些实施方式中，核酸酶药剂可以为类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。TAL效应物核酸酶是一类序列特异性核酸酶，其可以用于在原核或真核生物体的基因组中的特定目标序列处制造双链断裂。TAL效应物核酸酶可以通过将天然或工程化类转录激活因子(TAL)效应物或其功能部分与核酸内切酶(比如，例如，FokI等)的催化结构域融合来创建。独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域允许设计潜在地具有任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，可以对TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域进行工程化以识别特定的DNA目标位点，因此用于在所需的目标序列处制造双链断裂。参见，WO2010/079430；Morbitzer等人，(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1：428-432；Christian等人，Genetics(2010)186：757-761；Li等人，(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi：10.1093/nar/gkq704；和Miller等人，(2011)Nature Biotechnology 29：143至148；以上所有文献通过引用在此并入。
在一些实施方式中，核酸酶药剂可以为锌指核酸酶(ZFN)。例如，ZFN的每个单体可以包含3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域，其中每个基于锌指的DNA结合结构域可以与3bp的亚位点结合。在其他实施方式中，ZFN可以为包含可操作地连接到独立核酸酶的基于锌指的DNA结合结构域的嵌合蛋白质。在一些实施方式中，独立的核酸内切酶可以为FokI核酸内切酶。在一些实施方式中，核酸酶药剂可以包括第一ZFN和第二ZFN，其中第一ZFN和第二ZFN中的每一个可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一ZFN和第二ZFN识别目标DNA链的每条链中被约6bp至约40bp的切割位点或约5bp至约6bp的切割位点分隔的两个连续的目标DNA序列，其中FokI核酸酶二聚并且制造双链断裂。参见，例如，US20060246567；US20080182332；US20020081614；US20030021776；WO/2002/057308A2；US20130123484；US20100291048；和WO/2011/017293A2，其中每篇文献通过引用在此并入。
在一些实施方式中，核酸酶药剂可以为大范围核酸酶。根据保守序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，这些家族是LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、H-N-H家族和His-Cysbox家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HEase因其长识别位点和耐受其DNA底物中的一些序列多样性而值得注意。大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的，参见，例如，Guhan和Muniyappa(2003)Crit.Rev Biochem Mol Biol 38：199-248；Lucas等人，(2001)Nucleic Acids Res29：960-9；Jurica and Stoddard，(1999)Cell Mol LifeSci 55：1304-26；Stoddard，(2006)Q Rev Biophys 38：49-95；和Moure等人，(2002)NatStruct Biol 9：764。
在一些实施方式中，本公开方法中采用的核酸酶药剂可以采用CRISPR/Cas系统。此类系统可以采用例如Cas9核酸酶，在某些情况下，其可以针对要在其中表达的所需细胞类型进行密码子优化。系统还可以采用融合的crRNA-tracrRNA构建物，其与密码子优化的Cas9一起发挥作用。这种单一RNA通常可以被称为小向导RNA或sgRNA。简言之，可以将包含靶向序列的短DNA片段插入到sgRNA表达质粒中。sgRNA表达质粒可以包括靶向序列(在一些实施方式中为约20个核苷酸)、一定形式的tracrRNA序列(支架)以及在细胞中有活性的合适启动子以及在真核细胞(比如果蝇细胞等)中正确加工的必要元件。随后可以将sgRNA表达盒和Cas9表达盒导入细胞中。参见，例如，Mali P等人，(2013)Science 2013Feb.15；339(6121)：823-6；Jinek M等人，Science 2012Aug.17；337(6096)：816-21；Hwang W Y等人，Nat Biotechnol 2013March；31(3)：227-9；Jiang W等人，Nat Biotechnol 2013March；31(3)：233-9；和，Cong L等人，Science 2013Feb.15；339(6121)：819-23，其中每篇文献通过引用在此并入。
在一些实施方式中，所述生物体中编码ppGpp水解酶的基因通过RNAi敲低。可以将双链RNA(dsRNA)导入细胞中(例如，使用短寡聚双链感染RNA(siRNA)或可由其转录siRNA的DNA质粒)。在实践方法中，将有效量的RNAi药剂施用于非人生物体以便以所需方式调节目标基因的表达，例如，以实现所需的目标细胞基因表达的降低。本公开中采用的RNAi药剂为小核糖核酸分子，即，寡核糖核苷酸，其存在于双链体中，例如，彼此杂交的两个不同的寡核糖核苷酸或者呈现小发夹形成以产生双链体结构的单一核糖寡核苷酸。在一些实施方式中，其中RNA药剂为彼此杂交的两个不同核糖核酸的双链体结构时，例如，siRNA。在一些情况下，将siRNA导入胞质(例如神经元细胞)中。在一些实施方式中，siRNA可以来源于细胞内部。在其他实施方式中，siRNA可以外源地导入到细胞中。
可以使用任何方便的方案将RNAi药剂施用于非人生物体，其中所采用的方案通常为核酸施用方案，其中多种不同的此类方案是本领域已知的。
在另一方面，本公开提供了一种来自非人生物体或其活体部件的组织。在一些实施方式中，该组织来自神经组织。在一些实施方式中，该组织来自包含PI细胞的神经组织。
在一些实施方式中，非人生物体或活体部分可以用于选择调节睡眠的药剂的方法。在一些实施方式中，该方法可以包括将药剂施用于非人生物体或活体部分并且检测ppGpp的活性和/或水平。在一些实施方式中，非人生物体或活体部分可以用于筛选可用于诊断和/或监控睡眠障碍的生物标志物。在一些实施方式中，非人生物体或活体部分可以用于制备筛选可用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统。
筛选方法
在另一方面，本公开提供了一种筛选可用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的进展的物质、装置和/或组合物的方法，包括将候选物质、装置和/或组合物应用于根据本公开的非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织，并且确定所述候选物质、装置和/或组合物对以下各项中的一种或多种的作用：所述非人生物体的睡眠表型；ppGpp的活性、量和/或释放。
在一些实施方式中，该方法可以包括将所述候选物质、装置和/或组合物应用于非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织。如果所述非人生物体的睡眠表型有所改变，则该候选物质、装置和/或组合物可以为可用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的进展的物质、装置和/或组合物。在其他实施方式中，如果非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织的ppGpp的量和/或释放有所改变，则该候选物质、装置和/或组合物可以为可用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的进展的物质、装置和/或组合物。
本公开还提供了一种筛选可用于诊断和/或监控睡眠障碍的生物标志物的方法，其可以包括：确定物质的疾病值，其中所述疾病值是所述物质在从非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织获得的样品中的存在和/或水平；确定所述物质的野生型值，其中所述野生型值是所述物质在从相应的野生型非人生物体或其相应的活体部件、相应的细胞或相应的组织获得的样品中的存在和/或水平；和当所述疾病值不同于所述野生型值时将所述物质鉴定为生物标志物。
该方法可以包括将物质应用于从非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织获得的样品。随后可以确定值。该值可以包括小分子(例如，ppGpp)的活性和/或水平，蛋白质(例如，ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶)的活性和/或表达，核酸分子(例如，编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的基因)的活性和/或表达、神经系统的特征、认知的状态、信号通道的激活和/或抑制、睡眠表型(例如，睡眠潜伏期、睡眠水平、睡眠回合次数、觉醒次数)以及任何其他能够直接或间接检测的指标。
用于诊断和/或监控睡眠障碍的从所述非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织获得的所述值可以为疾病值。用于诊断和/或监控睡眠障碍的从所述非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织获得的所述值可以为野生型值。如果所述疾病值不同于所述野生型值，则可以将所述物质鉴定为可用于诊断和/或监控睡眠障碍的生物标志物。
在一些实施方式中，该方法可以为体外方法或离体方法。例如，可以在睡眠障碍(例如，睡眠不足和/或睡眠过多)之前或之后从根据本公开的非人生物体或其活体部件获取样品(例如，细胞、组织或其他含DNA或RNA的样品、含蛋白质的样品和/或含代谢物的样品)。随后，可以综合测定衍生自样品的基因转录产物(转录组)、基因翻译产物(蛋白质组)或代谢物(代谢组)并且可以鉴定在睡眠障碍之前和之后有改变的物质。
如果疾病值大于所述野生型值，则所述生物标志物可以为表明减少睡眠的生物标志物。如果所述疾病值小于所述野生型值，则所述生物标志物可以为表明促进睡眠的生物标志物。在一些实施方式中，疾病值可以为ppGpp的活性和/或水平。在其他实施方式中，疾病值可以为ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
在本公开的方法中，可以使用比如DNA微阵列等核酸微阵列来分析基因转录产物(例如，转录组)。可以使用凝胶电泳(比如二维凝胶电泳)或质谱(比如飞行时间质谱/电喷雾电离质谱、毛细管HPLC/MS和LC/MS/MS)来分析基因翻译产物(例如，蛋白质组)。可以使用NMR、毛细管电泳、LC/MS和/或LC/MS/MS来分析代谢物(代谢组)。
当物质的存在/量显示在睡眠障碍之前和之后有显著差异时，此类物质可以被视为睡眠障碍的生物标志物，随后可将其用于睡眠障碍的早期诊断(特别是临床前诊断)。可以使用特定药剂或检测方法来进一步检测鉴定出的生物标志物。例如，当生物标志物是蛋白质或肽时，可以用免疫测定法使用特定抗体对其进行检测。当生物标志物是核酸分子(比如转录产物)时，可以用Northern印迹使用特定探针或用RT-PCR使用特定引物对其进行检测。
本公开的非人生物体或其活体部件、细胞、细胞系或原代细胞培养或组织可以用于制备筛选可用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统。
在另一方面，本公开提供了一种选择用于调节睡眠的药剂的系统。在一些实施方式中，该系统可以包括提供用于出售包含本公开药剂的组合物的分销网络以及向患者或医生提供使用该药剂调节受试者睡眠的说明书材料。
在一些实施方式中，该系统可以包括确定待施用以调节受试者睡眠的本公开药剂的合适配制剂和剂量，对如上所述鉴定的配制剂在动物中的功效和毒性进行治疗分析；以及提供用于出售如上所述被鉴定为具有可接受的治疗概况的配制剂的分销网络。
该系统还可以包括药剂盒。在一些实施方式中，药剂盒可以包含合适包装的本公开的药剂以及说明书、临床研究分析、副作用等。药剂盒还可以包含比如科学文献参考、包装插页材料、临床试验数据和/或表明或确认组合物的活性和/或优点的此类类似信息和/或给药方案、施用、副作用、药物相互作用或对医疗提供者有用的其他信息的信息。该系统还可以包含另一种药剂。在一些情况下，本公开的药剂在药剂盒内的单独容器中提供。
在一些情况下，系统可以被提供、出售和/或交易给相关人员，包括医疗提供者、医生、护士、要及时、药物开发者、药物生产者等。在其他情况下，系统可以被直接出售给消费者。
实施例
以下实施例阐述用于向本领域技术人员提供完整的公开和说明如何制作和使用本发明，并非旨在限制发明人视为其发明的范围，也并非旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保所用数字的准确性(例如数量、温度等)，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份，分子量为中均分子了，温度以摄氏度计，压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如：bp，碱基对；kb，千碱基；pl，微微升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹腔内；s.c.，皮下；诸如此类。
材料和方法
果蝇库存和饲养条件
所有果蝇在标准玉米粉上、在25℃和60％湿度下、在12小时：12小时LD周期下饲养(除非另有说明)。在行为测定之前，将库存在实验室中与同源的Canton S wt系背景回交7代。
从布鲁明顿库存中心(Bloomington Stock Center)订购的系包括：47887(R19G10-Gal4)、30848(c767-Gal4)、51987(Dh44-Ga14)、nos-phiC31、37516(Dilp2-Ga14)、5137(UAS-mCD8-GFP)。SIFa-Gal4从J.Veenstra博士(波尔多大学)处获得。P元素插入系从UHeberlein博士(加州大学旧金山分校)处获得，CCT-Ga14文库是先前在实验室中产生的集合(参考Deng，B.等人，参考“Chemoconnectomics：Mapping Chemical Transmission inDrosophila”。Neuron 101，876-893e874，doi：10.1016/j.neuron.2019.01.045(2019))。isoCS和w1118是野生型和白眼野生型系。
药剂和质粒
用Phanta-Max超保真DNA聚合酶(Vazyme)进行PCR。用带有加载染料的2x Taq PCRStarMix(GenStar)进行基因分型PCR。限制性酶KpnI-HF、SacII、NotI-HF、XbaI、XhoI、BamHI-HF、DpnI、EcoRI-HF和XbaI来自新英格兰生物实验室(New England BioLabs)。使用RNAprep pure Tissue Kit(TIANGEN)从果蝇提取总RNA。用PrimeScriptTM II 1st StrandcDNA合成药剂盒(Takara)进行cDNA克隆的逆转录，用NEBui1der HiFi DNA Assemb1yMaster Mix进行Gibson组装。用Trans-5α(TransGen)进行克隆转化，用Transetta(TransGen)进行表达转化。BL21(TransGen)用作细菌基因模板。使用PrimeScript RTMaster Mix kit(Takara)进行定量PCR(qPCR)分析的逆转录。使用TransStart Top GreenqPCR SuperMix kit(TransGen)进行qPCR。
pACU2为购买的(Addgene#31223)。所用的质粒包括：pBSK、pET28a+。如Deng，B.等人(参考“Chemoconnectomics：Mapping Chemical Transmission in Drosophila”.Neuron101，876-893e874，doi：10.1016/j.neuron.2019.01.045(2019))所述，生成STOP-attP-3Px3-RFP、T2A-Gal4-3Px3-RFP和T2A-flp-3Px3-RFP模板。
实施例1：分子克隆和遗传修饰果蝇的产生
所有KO和KI系的产生均基于使用同源重组的CRISPR-Cas9系统，如Ren，X.等人在“Optimized gene editing technology for Drosophila melanogaster using germline-specific Cas9”，Proc Natl Acad Sci U S A 110，19012-19017，doi：10.1073/pnas.1318481110(2013)中所述。使用U6b载体进行sgRNA110的转录，靶向载体的构建基于Deng，B等人描述的先前程序。
通过使用CRISPR-Cas9将其起始密码子后的大部分编码序列替换为2A-attP产生了mesh1敲除(KO)系(M1KO)，通过将其起始密码子后的CDS替换为2A肽和酵母转录因子Gal4的框内融合产生了M1KOGa14(图1A和图1B)。
为生成KO系，将两种U6b-sgRNA质粒和一种靶向载体的混合物注入果蝇胚胎中。为生成U6b-sgRNA，在网站(https：//www.flyrnai.org/crispr)上选择两种sgRNA，并且将其设计为没有PAM序列的引物对(M1KOSgRNA-1F：SEQ ID NO.1，M1KOSgRNA-1R：SEQ ID NO.2，M1KOSgRNA-2F：SEQ ID NO.3和M1KOSgRNA-2R：SEQ ID No.4)。其他引物对(U6b-laczrv：SEQID NO.5和U6b-引物1：SEQ ID NO.6)被设计在在U6b载体主链上，以使其能产生包含U6b的两部分(M1KO sgRNA-F和U6b-laczrv的较短片段，M1KO sgRNA-R和U6b-引物1的较长片段)的PCR产物，它们在两端共享重叠序列。通过PCR产物的Gibson组装构建U6b-sgRNA质粒。为生成靶向载体，除了起始密码子之外，基因Mesh1整个CDS侧翼上的两个片段(2kbps)被克隆为5’Arm(使用引物M1KO5F：SEQ ID NO.7和M1KO5R：SEQ ID NO.8的PCR)和3’Arm(使用引物M1KO3F：SEQ ID NO.9和M1KO3R：SEQ ID NO.10的PCR)。用KpnI和SacII消化载体pBSK，将PCR产物通过Gibson组装导入消化后的pBSK。将新的限制性位点(NotI和XhoI)导入两臂之间用于进一步使用。为生成M1KO的靶向载体，用引物attP2M1KOF(SEQ ID NO.33)和attP2M1KOR(SEQ ID NO.34)克隆片段STOP-attP-3Px3-RFP，并通过Gibson组装将其插入NotI和XhoI之间；对于M1KOGal4，在相同位置插入T2A-Gal4-3Px3-RFP。将U6b-sgRNA与靶向载体的混合物注入nano-Cas9或vasa-Cas9(参考Ren，X.et al，“Optimized gene editing technologyfor Drosophila melanogaster using germ line-specific Cas9”，Proc Natl Acad SciU S A 110，19012-19017，doi：10.1073/pnas.1318481110(2013))的胚胎中。在与w1118果蝇杂交之后收集RFP+眼睛的F1个体。
为生成KI系M1KIflp，执行类似的程序。对于U6b-sgRNA，较短片段的引物为使用U6b-laczrv的M1KISgRNA-1F(SEQ ID NO.11)或M1KISgRNA-2F(SEQ ID NO.12)，而较长片段的引物为使用U6b-引物1的M1KIsgRNA-1R(SEQ ID NO.13)或M1KIsgRNA-2R(SEQ IDNO.14)。对于靶向载体，5’Arm的PCR使用M1KI5F(SEQ ID NO.15)和M1KI5R(SEQ ID NO.16)进行，3’Arm的PCR使用M1KI3F(SEQ ID NO.17)和M1KI3R(SEQ ID NO.18)进行。在Mesh1 CDS最末端附近选择两侧为两臂的位点，从而移除终止密码子并用引物flp2M1KIF(SEQ IDNO.19)和flp2M1KIR(SEQ ID NO.20)使CDS与T2A-flp-3Px3-RFP融合。
基于载体pACU2111产生转基因UAS系。通过从总RNA逆转录产生果蝇cDNA。通过使用cDNA作为模板，将Mesh1 CDS用引物(M1CDSF：SEQ ID NO.21和M1CDSR：SEQ ID NO.22)扩增，并将其插入到消化后的pBSK中(通过EcoRI和KpnI)。用引物M1E66AF(SEQ ID NO.23)和M1E66AR(SEQ ID NO.24)在该质粒上产生Mesh1E66A的点突变。Mesh1 CDS和Mesh1E66A二者均用引物M1ACU2F(SEQ ID NO.25)和M1ACU2R(SEQ ID NO.26)扩增。用引物RAACU2F(SEQ IDNO.27)和RAACU2R(SEQ ID NO.28)从BL21细菌克隆RelA序列。以上所有均通过Gibson组装插入到消化后的pACU2中(EcoRI与XbaI)。在胚胎注射期间，通过nos-phiC31将pACU2构建物插入到attP2中。
所有果蝇库存均通过PCR和qPCR确认，引物在附表S1中示出。
实施例2：分子克隆和诱导表达
pET28a+用于Mesh1和RelA蛋白质的细菌表达。Mesh1 CDS和Mesh1E66A使用引物M1ET28F(SEQ ID NO.29)和M1ET28R(SEQ ID NO.30)产生。使用引物RAET28F(SEQ IDNO.31)和RAET28R(SEQ ID No.32)从BL21克隆RelA。以上所有通过Gibson组装插入到pET28a+中。将用以上构建物转化的感受态细胞扩增以用于诱导表达。为诱导表达，将菌落接种到1ml含有卡那霉素的Luria肉汤(LB)培养基中，并且于37℃温育2小时。将800μl转移到含有800ml卡那霉素+LB培养基的烧瓶中，并于37℃、220rpm温育约3小时，直到OD600为0.5至0.6。将800μl 1M异丙基β-D-1硫代半乳糖苷(IPTG)添加到烧瓶中。对于RelA，诱导于37℃进行3小时；对于Mesh1和Mesh1E66A，于16℃进行16小时。离心收获细菌，然后通过超声处理溶菌(功率：30％，溶菌2秒，等待2秒，30个周期)并离心。使上清液通过镍柱，随后用10ml结合缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4，0.5M NaCl，5mM咪唑)洗涤两次，并用5ml洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱。每一步都在10％SDS-PAGE上监控以检查蛋白质表达。洗脱的蛋白质在Millipore Amicon Ultra-15上富集，并且再悬浮在1ml蛋白质存储缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，0.3％CHAPS，1mM DTT)中。
实施例3：ppGpp的提取和测量
为测量果蝇中的内源ppGpp，从2000只果蝇制备提取物。为从果蝇中提取ppGpp，向每250只果蝇中添加3ml甲酸。在研磨15秒之后，将1ml 30％三氯乙酸添加到沉淀蛋白质中。重复以上程序以便从2000只果蝇收集提取物。将上清液冻干过夜，将粉末用200μl水再悬浮。
为测量ppGpp的水平，根据先前方法的修改形式，在UPLC-MS中使用C18柱(参考Ihara，Y.，Ohta，H.&Masuda，S.，“A highly sensitive quantification method for theaccumulation of alarmone ppGpp in Arabidopsis thaliana using UPLC-ESI-qMS/MS”J Plant Res 128，511-518，doi：10.1007/s10265-015-0711-1(2015))。流动相包含：缓冲液A(8mM N，N-二甲基己胺，160μl乙酸，500ml水)和缓冲液B(乙腈)。UPLC程序为：在0min，A∶B＝100％∶0％；在10min，A∶B＝40％∶60％，线性增加。ppGpp的m/z应当为601.95，使用ATP(506.00)进行归一化。
结果显示，通过超高效液相色谱和质谱(UPLC-MS)在野生型(wt)果蝇中检测到了ppGpp，M1KO果蝇中的ppGpp相对于野生型果蝇中的ppGpp有所增加(图2A至2B和图3D)。如实施例1所述，使用CRISPR-Cas9生成mesh1敲除(KO)系(M1KO)以用2A-attP替代其起始密码子之后的大部分编码序列(图3A)，这与mesh1仅编码水解酶结构域的事实相符(图3B)。
如实施例2中所述在大肠杆菌中表达果蝇Mesh1蛋白质并纯化。在使用ppGpp的体外水解测定中，Mesh1的量减少(图3C)。在图3C中，空白是反应缓冲液、GDP和ATP的混合物。标准ppGpp是商业样品。RelA+GDP是将纯化的RelA添加到反应缓冲液、GDP和ATP的混合物中。Mesh1+ppGpp是标准ppGpp加上纯化的Mesh1。Mesh1E66A+ppGpp是是标准ppGpp加上在大肠杆菌中表达并纯化的突变蛋白质Mesh1E66A。将Mesh1蛋白质添加到MIKO突变果蝇提取物中也减少了ppGpp的量(图2B)。
实施例4：行为测定
为分析12小时：12小时LD周期下的基线睡眠，将每种基因型约48只果蝇装载到玻璃管中进行视频跟踪(fps＝1)，通过先前描述的内部软件进行分析(参考Dai，X.等人，“D-Serine made by serine racemase in Drosophila intestine plays a physiologicalrole in sleep”，Nat Commun 10，1986，doi：10.1038/s41467-019-09544-9(2019)，Qian，Y.等人，“Sleep homeostasis regulated by 5HT2b receptor in a small subset ofneurons in the dorsal fan-shaped body of drosophila”，Elife 6，doi：10.7554/eLife.26519(2017)，和Deng，B.等人，“Chemoconnectomics：Mapping ChemicalTransmission in Drosophila”，Neuron 101，876-893e874，doi：10.1016/j.neuron.2019.01.045(2019))。连续不动＞5min被确定为一个睡眠回合(参考Hendricks，J.C.等人，“Rest in Drosophila is a sleep-like state”，Neuron 25，129-138(2000)，和Shaw，J.&Brody，S.，“Circadian rhythms in Neurospora：a new measurement，thereset zone”，J Biol Rhythms 15，225-240，doi：10.1177/074873040001500304(2000))。傍晚时的睡眠潜伏期被定义为从熄灯到出现第一个睡眠回合的时间。
为分析昼夜节律，记录12小时：12小时LD周期下的活动达7天，随后通过ActogramJ进行计算(参考Schmid，B.，Helfrich-Forster，C.&Yoshii，T.，“A new ImageJ plug-in″ActogramJ″for chronobiological analyses”，J Biol Rhythms 26，464-467，doi：10.1177/0748730411414264(2011))。通过卡方周期图计算周期，并用Qp评价节律性。
为分析觉醒次数，将视频跟踪数据转化为模拟跨梁(cross-beam)数据。在模拟中，将每个管子的中线设为虚拟梁。将短暂觉醒定义为每分钟1次跨越，觉醒次数为每30分钟内此类事件的总和。傍晚觉醒次数为ZT0-3时的短暂觉醒的总和，黎明觉醒次数为ZT9-12时的短暂觉醒的总和。
为分析睡眠剥夺，通过整晚随机摇晃来剥夺睡眠。将记录管固定在硅胶支架上，随后将其水平放置到固定盒中。在伺服电机(TowerProTM MG995)控制下将盒子顺时针或逆时针旋转并与塑料塞碰撞以摇晃果蝇。以2至5分钟的随机间隔摇晃果蝇。每次摇晃持续18秒，包括9次连续旋转盒子。每30分钟的反弹率计算为：(剥夺后睡眠持续时间-剥夺前等效时间的睡眠持续时间)/(睡眠丧失)。累积反弹率计算为：自从停止剥夺之后的反弹率的总和。
为测试饥饿诱导的睡眠丧失(SISL)，记录前三天的睡眠(第三天定义为基线)，在第三天光照阶段结束时将果蝇快速转移到1％琼脂上，然后进行24小时的饥饿期间睡眠记录。SISL比定义为(饥饿睡眠-基线睡眠)/基线睡眠。
实施例5：M1KO突变果蝇的睡眠表型。
通过实施例4的行为测定来分析睡眠表型。
对1765只P元素插入系果蝇进行筛选以寻找影响睡眠潜伏期的突变(图4A)。发现mesh1基因中的插入(mesh1-ins)(图4C)具有显著较长的睡眠潜伏期(图4A和4D)和较少的总睡眠(图4B)。
实施例1中产生的M1KO空mesh1突变体用于研究mesh1在睡眠中的功能(图5A)。在12小时光照和12小时黑暗(LD)的范例中，M1KO果蝇显示夜间睡眠减少(图5B)、总睡眠减少(图5D)及夜间睡眠潜伏期增加(图5E)，但日间睡眠水平(图5C)或日间睡眠潜伏期(图5F)没有变化。夜间或日间期间的睡眠回合次数及长度在wt和M1KO果蝇之间没有显著区别(图6A)。昼夜节律在wt和M1KO果蝇之间没有显著区别(图6J-6M)。这些结果表明，Mesh1基因主要参与调节睡眠潜伏期。
从图5G到5H，夜间睡眠开始(傍晚)时的觉醒次数和邻近夜间睡眠结束(黎明)时的觉醒次数在M1KO突变体中显著增加。
在持续黑暗(DD)条件下，观察到相同的睡眠水平(图6B、6D和6E)、潜伏期(图6F和6G)和觉醒(图6H和6I)表型。W1KO果蝇中的推定日间睡眠水平在DD条件(图6D)下有所降低，但在LD条件(图5C)下则没有。
实施例6：mesh1中挽救M1KO突变体睡眠表型的酶活性的要求
通过将mesh1的起始密码子之后的CDS用实施例1中的2A肽与酵母转录因子Gal4的框内融合替换来产生mesh1KO系(M1KOGal4)。为检验mesh1基因是否通过其对ppGpp水平的调节来在睡眠中发挥作用，在体内和体外两种情况下比较了wt Mesh1蛋白质的活性与Mesh1 E66A突变蛋白质的活性。
在细菌中表达的Mesh1E66A不能在体外水解ppGpp(图3C)。与M1KO突变体中类似，果蝇中的ppGpp水平在M1KOGal4也有所增加(图3D)。当wt mesh1基因在M1KOGal4驱动子控制下在果蝇中表达时，ppGpp水平降低至野生型果蝇的水平(图3D)。相比之下，mesh1E66A的表达不能降低M1KOGal4果蝇中的ppGpp水平(图3D)。这些结果表明，wt Mesh1蛋白质能在体外或体内水解ppGpp，但Mesh1 E66A突变蛋白质不能。
M1KOGal4/M1KO果蝇与M1KO/M1KO在表型上相似，具有较长的睡眠潜伏期(图7A)和更多的觉醒次数(图7C)。在MlKOGal4/M1KO背景下，由M1KOGal4驱动的UAS-mesh1的表达挽救了所有这些表型(图7A、7B和7C)。相比之下，UAS-mesh1E66A不能挽救M1KOGal4/M1KO果蝇的睡眠表型(图7A、7B和7C)。
总之，细菌表达的Mesh1和Mesh1E66A蛋白质的体外结果和基因挽救实验的体内结果有力地支持ppGpp调节睡眠。
实施例7：免疫组织化学和成像
为准备用于成像的果蝇，将每种基因型5只果蝇在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中解剖。将解剖的组织转移到400μl 2％PFA的试管中，并且固定55min。将组织用400μl脑洗涤缓冲液(含有1％TritonX-100、3％m/V NaCl的PBS)洗涤3次，随后转移到400 1封闭缓冲液(含有2％TritonX-100、10％正常山羊血清的PBS)中，随后于4℃温育过夜。将组织转移到稀释缓冲而言(0.25％TritonX-100，1％NGS，1x PBS)中，并添加一抗，该一抗含有1：1000鸡抗GFP(Abcam)和1∶40小鼠抗nc82(DSHB)。将组织于4℃染色过夜，随后用400μl脑洗涤缓冲液洗涤3次。将样品转移到包含二抗(其含有1∶200 Alexa Fluor山羊抗鸡488(Invitrogen)和1∶200 Alexa Fluor山羊抗小鼠633(Invitrogen))的新鲜稀释缓冲液中，随后用400μl脑洗涤缓冲液洗涤3次。
为准备进行成像，将样品置于由载玻片上的纸圈片限制的一滴Focus Clear(CellExplorer Labs，FC-101)中。在Zeiss LSM 710共焦显微镜上观察样品。
实施例8：mesh1在果蝇中的表达模式
为检验实施例7中描述的mesh1基因的表达模式，将M1KOGal4与以下四个UAS系中的每一个杂交：针对神经元概览的UAS-mCD8-GFP(参考Lee，T.&Luo，L.，″Mosaic analysiswith a repressible cell marker for studies of gene function in neuronalmorphogenesis″.Neuron 22，451-461，doi：10.1016/s0896-6273(00)80701-1(1999))，针对核的UAS-redStinger(参考Barolo，S.，Castro，B.&Posakony，J.W.，“New Drosophilatransgenic reporters：insulated P-element vectors expressing fast-maturingRFP”，Biotechniques 36，436-440，442，doi：10.2144/04363ST03(2004))，针对树突的UAS-denmark(参考Nicolai，L.J.等人，“Genetically encoded dendritic marker shedslight on neuronal connectivity in Drosophila”，Proc Natl Acad Sci U S A 107，20553-20558，doi：10.1073/pnas.1010198107(2010))和针对轴突末端的UAS-syt.eGFP(参考Zhang，Y.Q.，Rodesch，C.K.&Broadie，K.，“Living synaptic vesicle marker：synaptotagmin-GFP”，Genesis 34，142-145，doi：10.1002/gene.10144(2002))。
在脑和腹神经索中的神经元中发现了mesh1(图8A和8E)。在脑中，在PI和食管下神经节(SOG)中检测到了表达mesh1的神经元(图8A和8B)。SOG中的PI及其轴突末端中表达mesh1的神经元(图8A、8C和8D)让人联想起PI中产生胰岛素的细胞(IPC)。用针对果蝇胰岛素样肽2(Dilp2)的抗体进行免疫染色证实了mesh1在IPC神经元中的表达在PI中呈阳性(图9B和9D)。
实施例9：ppGpp在神经元中发挥作用
为测试ppGpp是否在特定细胞中发挥作用，通过使用ppGpp合成酶和水解酶，增加或减少不同细胞群中的ppGpp水平。
大肠杆菌RelA基因编码ppGpp的合成酶。图3C显示，来自大肠杆菌的RelA在体外增加ppGpp。在具有由tub-Gal4驱动以在所有细胞中表达的UAS-RelA的果蝇(参考O′Donnell，K.H.，Chen，C.T.&Wensink，P.C.，“Insulating DNA directs ubiquitous transcriptionof the Drosophila melanogaster alpha 1-tubulin gene”，Mol Cell Biol 14，6398-6408，doi：10.1128/mcb.14.9.6398(1994))或者由elav-Gal4驱动以在神经元中表达的果蝇中(参考Robinow，S.&White，K.，″Characterization and spatial distribution ofthe ELAV protein during Drosophila melanogaster development″.J Neurobiol 22，443-461，doi：10.1002/neu.480220503(1991))，睡眠潜伏期(图10A)和觉醒次数增加(图8B)。相比之下，由repo-Gal4驱动以在神经胶质细胞中表达的UAS-RelA(参考Halter，D.A.等人，“The homeobox gene repo is required for the differentiation andmaintenance of glia function in the embryonic nervous system of Drosophilamelanogaster”，Development 121，317-332(1995))不影响睡眠(图10A和10B)。这些结果表明，睡眠的ppGpp调节不涉及神经胶质细胞，而是专门涉及神经元。此外，当M1KOGal4用于驱动UAS-RelA表达时，睡眠潜伏期(图10A)和觉醒次数(图10B)二者均显著增加，表明mesh1阳性神经元中的ppGpp水平足以调节睡眠。
为降低果蝇细胞中的ppGpp水平，使用了UAS-mesh1。由tub-Gal4驱动的在所有细胞中的UAS-mesh1过表达或者由elav-Gal4驱动的UAS-mesh1在神经元中的过表达显著减少了睡眠潜伏期(图10C)和觉醒次数(图10D)。相比之下，由repo-Gal4驱动的在神经胶质细胞中的UAS-mesh1过表达不影响睡眠潜伏期或觉醒次数(图10C和10D)。当UAS-mesh1由Mesh1Gal4驱动时，睡眠潜伏期和觉醒次数减少(图10C和10D)。
总之，通过RelA和Mesh1增加或减少ppGpp水平的数据表明，ppGpp在神经元中发挥作用调节睡眠，但在神经胶质细胞中则没有。
实施例10：参与ppGpp调节睡眠的PI神经元的解剖
实施例6和实施例9的结果显示，ppGpp调节睡眠需要神经元，特别是表达mesh1的神经元。生成用于化学连接组(CCT)的Gal4文库，其含有所有已知的神经递质、调节剂、神经肽及其受体。通过将每个Gal4系与UAS-RelA杂交来进行CCT筛选。由Trh、Capa-R、CCHa2-R、LkR、OA2和CG13229的Gal4系驱动的RelA表达影响睡眠(图11A)。要注意的是，所有这些系均驱动了PI中的表达(图11B至11G)。
为进一步剖析PI神经元对于ppGpp调节睡眠中的功能性参与，对已知驱动PI神经元中的表达的五个Gal4系进行测试：一系针对PI(c767)，三系针对神经肽Dh44、Dilp2和SIFa，一系针对受体R19G10(RYamide受体)。我们将这些PI驱动者中的每一个与敲入果蝇系杂交，其中翻转酶基因与mesh1基因C末端框内融合(M1KIflp)(图9A)，将其与UAS-FRT-stop-FRT-mCD8-GFP重组作为报告基因。证实了mesh1基因在这些特定PI神经元中的表达(图9B、9C和9D)。
将这些PI驱动者中的每一个与UAS-RelA杂交以增加特定神经元中的ppGpp水平。表达Dilp2、SIFa、R19G10或c767的神经元中的RelA表达(图12A和12B)增加了睡眠潜伏期(图12A)和觉醒(图12B)(请参见Cavanaugh，D.J.等人，“Identification of a circadianoutput circuit for rest：activity rhythms in Drosophila”，Cell 157，689-701和Donlea，J.M.，Ramanan，N.&Shaw，P.J.，“Use-dependent plasticity in clock neuronsregulates sleep need in Drosophila”，Science 324，105-108)。然而，Dh44神经元中的RelA表达不能影响睡眠(图12A和12B)。
将这些PI驱动者中的每一个与UAS-Mesh1杂交以降低特定神经元中的ppGpp水平。Mesh1在Dilp2神经元中的过表达减少了睡眠潜伏期和觉醒(图12C-12E)。Dilp2、SIFa、R19G10或c767阳性的神经元中的Mesh1表达减少了睡眠潜伏期和觉醒(图12C和12D)。然而，Dh44神经元中的Mesh1表达不能影响睡眠(图12C和12D)。
总之，RelA和Mesh1表达的实验提供了一致的结果，表明PI中特定亚组的神经元参与ppGpp调节睡眠。
实施例11：ppGpp在睡眠剥夺中的作用
在野生型、M1KO和挽救系中进行睡眠剥夺测定。如图17所示，野生型在通过摇晃进行的12小时剥夺之后显示明显的睡眠反弹(图17A，图17B中的黑线，以及图17C中的左侧柱)。相比之下，M1KO显著消除了这种反弹。使用t-测试在C中进行比较(**表示p＜0.01)。
随后我们将相同的剥夺方法应用于挽救系，如图17D所示：与其亲本对照(第4柱、第7柱)相比，M1KOGal4/M1KO>UAS-Mesh1/+(第6柱)将此类反弹缺陷挽救到野生型水平(柱8)；同时，与其亲本对照相比(第4柱、第10柱)，M1KOGal4/M1KO>UAS-Mesh1E66A/+(第9柱)未能将此类反弹缺陷挽救至野生型对照(第11柱)。所有统计数据均使用双向ANOVA在D中进行(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)。
实施例12：ppGpp在饥饿诱导的睡眠丧失中的作用
为调查ppGpp是否在饥饿诱导的睡眠丧失(SISL)中起作用，在使果蝇饥饿24小时之前，记录喂养果蝇的基线睡眠。将饥饿期间的睡眠与饥饿前的睡眠进行比较(图13A)。
当在M1KO中缺失mesh1基因时，M1KO果蝇的夜间SISL显著多于wt果蝇的夜间SISL，但日间SISL在wt和M1KO突变果蝇之间相似(图13A和13B)。尽管饥饿期间的夜间睡眠潜伏期仍然在M1KO中更高(图14A和14B)，但在夜间或日间期间在饥饿后没有任何潜伏期变化(图14C和14D)。M1KOGal4敲入突变体类似于M1KO果蝇，具有加重的SISL(图13C和图15A-15K)。UAS-mesh1而非UAS-mesh1E66A可以挽救mesh1敲除果蝇的SISL表型，表明Mesh1参与SISL需要ppGpp水解活性。与Mesh1的SISL增强作用(图16A)相反，细菌性ppGpp合成酶RelA的表达造成SISL夸大(图13D)，表明涉及了ppGpp水平，而不是RelA或Mesh1的任何其他意料不到的活动。
RelA的一般表达或神经元表达增加了SISL，但RelA的神经胶质细胞表达则没有(图13D、16A和16C)。Mesh1的一般过表达或神经元过表达减少了SISL，但Mesh1的神经胶质细胞过表达则没有(图16A和16C)。
由c767、Dilp2、SIFamide或R19G10的Gal4系驱动的RelA表达增强了SISL(图13E)。由c767、Dilp2、SIFamide或R19G10的Gal4系驱动的Mesh1过表达减少了SISL(图16B、16D)。相比之下，表达Dh44的神经元不参与ppGpp调节SISL，因为无论是Dh44神经元中的RelA表达还是Mesh1过表达都不影响SISL(图13E、16B和16D)。
因此，ppGpp调节睡眠潜伏期和觉醒所需的相同神经元也参与其对SISL的调节。
虽然在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方式仅通过示例的方式提供。这并不意味着发明受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了发明，但是本文实施方式的描述和图示并不意味着以限制意义进行解释。在不背离发明的情况下，本领域技术人员现在将进行许多变化、改变和替换。此外，应理解，发明的所有方面不限于本文所述的取决于各种条件和变量的特定描述、构造或相对比例。应理解，在实施发明时可以采用本文所述的发明实施方式的各种替代方案。因此，预期发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等效物。以下权利要求旨在定义发明的范围，并由此涵盖这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。
序列表
<110> 北京大学
<120> 用于调节睡眠的药剂和方法
<130> 0122-PA-022CN
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KOSgRNA-1F
<400> 1
ttcgttcaca tagggggttt cctggtttta gagctagaaa tagcaagt 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KOSgRNA-1R
<400> 2
aaaccaggaa accccctatg tgaacgaagt attgaggaaa acatacct 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KOSgRNA-2F
<400> 3
ttcgtgcaag tcaacacacc gacagtttta gagctagaaa tagcaagt 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KOSgRNA-2R
<400> 4
aaactgtcgg tgtgttgact tgcacgaagt attgaggaaa acatacct 48
<210> 5
<211> 18
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<213> Artificial Sequence
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<400> 5
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<212> DNA
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<223> U6b-primer1
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<220>
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<220>
<223> M1KO3F
<400> 9
ccgcatatat atggcgcgcc gatcaaaaac caacaaatta c 41
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KO3R
<400> 10
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 11
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<210> 12
<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
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aaactttgta aacgatcaaa aacccgaagt attgaggaaa acatacct 48
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<220>
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<400> 13
ttcgaagaac aataaaaatt gaacgtttta gagctagaaa tagcaagt 48
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KIsgRNA-2R
<400> 14
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<212> DNA
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<220>
<223> M1KI5F
<400> 15
tatagggcga attgggtacc caacactggt tgcgttgac 39
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<211> 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1KI5R
<400> 16
cgccatatat atgcggccgc gccgcgttgg cggaag 36
<210> 17
<211> 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ccgcatatat atggcgcgcc tcaattttta ttgttcttgt aaaag 45
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<213> Artificial Sequence
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<400> 18
gggaacaaaa gctggagctc tgcaaaagag ttcgc 35
<210> 19
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<223> flp2M1KIF
<400> 19
agatcttccg ccaacgcggc gaaggccgag gctctc 36
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<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flp2M1KIR
<400> 20
acaagaacaa taaaaattga ggcgcgccat aacttcgtat aatgtatgct atacgaag 58
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1CDSF
<400> 21
tagggcgaat tgggtaccat ggccacatat ccatc 35
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1CDSR
<400> 22
gaacaaaagc tggagctctt acaaaaggcc gcg 33
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> M1E66AF
<400> 23
gtcgtggcgg atacggacgc atctttcgag gatg 34
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1E66AR
<400> 24
cgtatccgcc acgacatcgt gcagaagtgc agc 33
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<211> 42
<212> DNA
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<223> M1ACU2F
<400> 25
cagttcaatt acagctcgaa ttcatggcca catatccatc tg 42
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ttgccgactg gcttagtcta gattacaaaa ggccgcg 37
<210> 27
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAACU2F
<400> 27
cagttcaatt acagctcgaa ttcatggttg cggtaagaag 40
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAACU2R
<400> 28
ttgccgactg gcttagtcta gactaactcc cgtgcaac 38
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1ET28F
<400> 29
tgggtcgcgg atccgaattc atggccacat atccatctgc 40
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1ET28R
<400> 30
tggtggtggt ggtgctcgag ttacaaaagg ccgcgttg 38
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAET28F
<400> 31
aaatgggtcg cggatccatg gttgcggtaa gaag 34
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAET28R
<400> 32
cgacggagct cgaattccta actcccgtgc aac 33
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> attP2M1KOF
<400> 33
caatggccac atatccatct gcggccgcgt agtgccccaa ctggggtaac 50
<210> 34
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> attP2M1KOR
<400> 34
taatttgttg gtttttgatc ggcgcgccat aacttcgtat aatgtatgct atacgaag 58

Claims (206)

1.一种选择用于调节睡眠的药剂的方法，所述方法包括：
提供候选药剂；
确定所述候选药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用；和
如果所述候选药剂改变了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中如果所述候选药剂增加了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为减少睡眠的药剂。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中如果所述候选药剂减少了所述ppGpp的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为促进睡眠的药剂。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述确定包括确定所述候选药剂对所述ppGpp在神经元中的活性和/或水平的作用。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述神经元是脑间部神经元。
6.如权利要求4至5中任一项所述的方法，其中所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法或离体方法。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述调节睡眠包括调节失眠、调节夜间发作的失眠和/或调节晨间早醒。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述调节睡眠包括调节发作性睡病、调节过度嗜睡、调节夜间发作的早睡和/或调节晨间晚醒。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述药剂基本不影响日间睡眠、睡眠回合次数及长度和/或昼夜节律。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述药剂直接作用于能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶，和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述ppGpp合成酶包括RelA。
15.如权利要求13至14中任一项所述的方法，其中所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述药剂包括SEQ ID NO：1-22和25-34中任一个所示的核酸序列。
17.一种选择用于调节睡眠的药剂的方法，所述方法包括：
提供候选药剂；
确定所述候选药剂对mesh1的活性和/或水平的作用；和
如果所述候选药剂改变了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为调节睡眠的药剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中如果所述候选药剂增加了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为促进睡眠的药剂。
19.如权利要求17至18中任一项所述的方法，其中如果所述候选药剂减少了所述mesh1的活性和/或水平，则选择所述候选药剂作为减少睡眠的药剂。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述确定包括确定所述候选药剂对所述mesh1在神经元中的活性和/或水平的作用。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述神经元是脑间部神经元。
22.如权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
23.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法或离体方法。
24.如权利要求12至23中任一项所述的方法，其中所述调节睡眠包括调节失眠、调节夜间发作的失眠和/或调节晨间早醒。
25.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述调节睡眠包括调节发作性睡病、调节过度嗜睡、调节夜间发作的早睡和/或调节晨间晚醒。
26.如权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述药剂基本不影响日间睡眠、睡眠回合次数及长度和/或昼夜节律。
27.如权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
28.如权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述药剂包括SEQ ID NO：1-22、25-26、29-30和33-34中任一个所示的核酸序列。
29.一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，其中所述系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：
能够反映ppGpp的活性和/或水平的物质；
能够反映ppGpp水解酶的活性和/或水平的物质；和/或
能够反映ppGpp合成酶的活性和/或水平的物质。
30.如权利要求29所述的系统，其中所述物质能够反映编码ppGpp水解酶的核酸分子的水平。
31.如权利要求29至30中任一项所述的系统，其中所述物质能够反映编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。
32.如权利要求29至31中任一项所述的系统，其中所述物质包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp水解酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp水解酶的药剂。
33.如权利要求29至32中任一项所述的系统，其中所述ppGpp水解酶为Mesh1。
34.如权利要求29至33中任一项所述的系统，其中所述物质包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp合成酶的药剂。
35.如权利要求29至34中任一项所述的系统，其中所述ppGpp合成酶为RelA。
36.如权利要求29至35中任一项所述的系统，其中所述系统包括选择模块，并且所述选择模块能够根据从所述测试模块获得的结果选择所述调节睡眠的药剂。
37.如权利要求36所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了ppGpp水解酶的活性和/或水平，所述药剂被选择为用于促进睡眠的候选。
38.如权利要求36至37中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了ppGpp合成酶的活性和/或水平，所述药剂被选择为减少睡眠的候选。
39.如权利要求36至38中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果改变了ppGpp的活性和/或水平，所述药剂被选择为调节睡眠的候选。
40.一种选择用于调节睡眠的药剂的系统，其中所述系统包括能够确定所述药剂对mesh1的活性和/或水平的作用的物质。
41.如权利要求40所述的系统，其中所述物质能够反映mesh1的水平。
42.如权利要求40至41中任一项所述的系统，其中所述物质包括能够特异性地扩增mesh1核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂。
43.如权利要求40至42中任一项所述的系统，其中所述系统包括选择模块，并且所述选择模块能够根据从所述测试模块获得的结果选择所述调节睡眠的药剂。
44.如权利要求43所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果增加了mesh1的活性和/或水平，所述药剂被选择为促进睡眠的候选。
45.一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的方法，所述方法包括：
对需要其的受试者施用有效量的能够改变所述受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
47.如权利要求45至46中任一项所述的方法，其中所述睡眠障碍与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关。
48.如权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述药剂能够降低所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
49.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
50.如权利要求45至49中任一项所述的方法，其中所述药剂包括编码ppGpp水解酶的核酸分子或其表达产物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
52.如权利要求45所述的方法，其中所述睡眠障碍与睡眠过多相关。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述睡眠障碍与发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒相关。
54.如权利要求52至53中任一项所述的方法，其中所述药剂能够增加所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
55.如权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
56.如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述药剂包括编码ppGpp合成酶的核酸分子或其表达产物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。
58.如权利要求45至57中任一项所述的方法，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括SEQ ID NO：1-22和25-34中任一个所示的核酸序列。
59.如权利要求45至58中任一项所述的方法，其中所述ppGpp的活性和/或水平的所述改变在神经元中出现。
60.如权利要求45至59中任一项所述的方法，其中所述神经元是脑间部神经元。
61.如权利要求45至60中任一项所述的方法，其中所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
62.如权利要求45至61中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。
63.一种用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的方法，所述方法包括：
对需要其的受试者施用有效量的能够改变所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
65.如权利要求63至64中任一项所述的方法，其中所述睡眠障碍与失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒相关，所述药剂能够增加所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
66.如权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
67.如权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述药剂包括mesh1核酸分子或Mesh1蛋白质。
68.如权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述药剂包括NCBI GenBank的基因ID：43456所示的核酸分子。
69.如权利要求63至68中任一项所述的方法，其中所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平的所述改变在神经元中出现。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述神经元是脑间部神经元。
71.如权利要求69至70中任一项所述的方法，其中所述神经元不包含任何表达Dh44的神经元。
72.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。
73.如权利要求69至72中任一项所述的方法，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括SEQ ID NO：1-22、25-26、29-30和33-34中任一个所示的核酸序列。
74.能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍进展的药物中的用途。
75.如权利要求74所述的用途，其中所述药剂能够增加ppGpp的活性和/或水平。
76.如权利要求74所述的用途，其中所述药剂能够减少ppGpp的活性和/或水平。
77.如权利要求74至76中任一项所述的用途，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂能够改变编码ppGpp合成酶和/或ppGpp水解酶的核酸分子的水平。
78.如权利要求74至77中任一项所述的用途，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
79.如权利要求74至78中任一项所述的用途，其中所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
80.如权利要求79所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒，所述药剂能够降低所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
81.如权利要求74至80中任一项所述的用途，其中所述药剂包括编码ppGpp水解酶的核酸分子或其表达产物。
82.如权利要求81所述的用途，其中所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
83.如权利要求81至82中任一项所述的用途，其中所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：43456所示的序列。
84.如权利要求74至78所述的用途，其中所述睡眠障碍与睡眠过多相关。
85.如权利要求84所述的用途，其中所述睡眠障碍与发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒相关，所述药剂能够增加所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
86.如权利要求84至85中任一项所述的用途，其中所述药剂包括编码ppGpp合成酶的核酸分子或其表达产物。
87.如权利要求86所述的用途，其中所述ppGpp合成酶包括RelA蛋白质。
88.如权利要求86至87中任一项所述的用途，其中所述核酸分子包含NCBI GenBank的基因ID：947244所示的序列。
89.如权利要求74至88中任一项所述的用途，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括SEQ ID NO：1-22和25-34中任一个所示核酸序列。
90.能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂在制备用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的药物中的用途。
91.如权利要求90所述的用途，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
92.如权利要求90至91中任一项所述的用途，其中所述药剂能够增强Mesh1蛋白质的活性和/或增加Mesh1蛋白质的水平。
93.如权利要求90至92中任一项所述的用途，其中所述睡眠障碍与睡眠不足相关。
94.如权利要求93所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
95.如权利要求90至94中任一项所述的用途，其中所述药剂能够增加受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
96.如权利要求90至95中任一项所述的用途，所述药剂能够增加所述受试者的编码所述Mesh1蛋白质的核酸分子的活性和/或水平。
97.如权利要求90至95中任一项所述的用途，其中所述药剂包括核酸分子mesh1或其表达产物。
98.如权利要求90至96中任一项所述的用途，其中所述核酸分子mesh1包括NCBIGenBank的基因ID：43456所示的序列。
99.如权利要求90至92中任一项所述的用途，其中所述睡眠障碍与睡眠过多相关。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述睡眠障碍与发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒相关。
101.如权利要求98至99中任一项所述的用途，所述药剂能够降低所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
102.如权利要求98至99中任一项所述的用途，所述药剂能够降低所述受试者的编码所述Mesh1蛋白质的核酸分子的活性和/或水平。
103.如权利要求90至100中任一项所述的所述用途，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括SEQ ID NO：1-22、25-26、29-30和33-34中任一个所示的核酸序列。
104.一种能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂，用于治疗、预防睡眠障碍或减缓睡眠障碍的发展。
105.一种能够改变Mesh1的活性和/或水平的药剂，用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展。
106.一种能够改变RelA的活性和/或水平的药剂，用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展。
107.一种用于确定受试者患有睡眠障碍和/或处于发展睡眠障碍的风险中的可能性的方法，所述方法包括：
评价所述受试者的ppGpp的活性和/或水平。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
109.如权利要求107至108中任一项所述的方法，其中能够评估所述编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的所述活性和/或水平的物质包括：能够特异性地扩增所述编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的引物。
110.如权利要求107至109中任一项所述的方法，其中能够确定所述ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的所述活性和/或水平的物质包括能够特异性地识别ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的药剂，和/或能够确定ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性的药剂。
111.如权利要求107至110中任一项所述的方法，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
113.如权利要求111至112中任一项所述的方法，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
114.如权利要求107至113中任一项所述的方法，其中所述ppGpp合成酶包括RelA蛋白质。
115.如权利要求107至114中任一项所述的方法，其中所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
116.一种用于确定受试者患有睡眠障碍和/或处于患睡眠障碍的风险的可能性的方法，所述方法包括：
评价受试者的Mesh1的活性和/或水平。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述Mesh1的活性和/或水平包括mesh1核酸分子的活性和/或水平，和/或所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
118.如权利要求116至117中任一项所述的方法，其中能够确定所述药剂对所述mesh1的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地扩增mesh1的引物，和/或能够特异性地识别所述mesh1的探针。
119.如权利要求116至118中任一项所述的方法，其中能够确定所述药剂对所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平的作用的物质包括：能够特异性地识别Mesh1蛋白质的药剂，和/或能够确定Mesh1蛋白质的活性的药剂。
120.如权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
121.如权利要求116至120中任一项所述的方法，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
122.如权利要求116至121中任一项所述的方法，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
123.一种用于确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的系统，所述系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：
能够表明所述受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂。
124.如权利要求123所述的系统，其中所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
125.如权利要求123至124中任一项所述的系统，其中所述药剂能够表明编码ppGpp水解酶的核酸分子和/或编码ppGpp合成酶的核酸分子的水平。
126.如权利要求123至125中任一项所述的系统，其中所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp水解酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp水解酶的药剂。
127.如权利要求124至126中任一项所述的系统，其中所述ppGpp水解酶是Mesh1蛋白质。
128.如权利要求123至127中任一项所述的系统，其中所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述ppGpp合成酶的药剂。
129.如权利要求124至128中任一项所述的系统，其中所述ppGpp合成酶是RelA蛋白质。
130.如权利要求123至129中任一项所述的系统，其中所述系统包括确定模块，并且所述确定模块能够根据从所述测试模块获得的结果来确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性。
131.如权利要求123至130中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变了ppGpp的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
132.如权利要求123至131中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变了ppGpp水解酶的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
133.利要求123至132中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变了ppGpp合成酶的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
134.一种用于确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的系统，所述系统包括测试模块，其中所述测试模块包括：
能够表明所述受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
135.如权利要求134所述的系统，其中所述药剂能够表明mesh1核酸分子的水平。
136.如权利要求134至135中任一项所述的系统，其中所述药剂包括能够特异性地扩增编码所述Mesh1蛋白质的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂。
137.如权利要求134至136中任一项所述的系统，其中所述系统包括确定模块，并且所述确定模块能够根据从所述测试模块获得的结果来确定受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性。
138.如权利要求134至137中任一项所述的系统，其中从所述测试模块获得的所述药剂结果表明改变了Mesh1蛋白质的活性和/或水平，所述受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性高。
139.如权利要求134至138中任一项所述的系统，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
140.如权利要求134至139中任一项所述的系统，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
141.如权利要求134至140中任一项所述的系统，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
142.能够表明受试者的ppGpp的活性和/或水平的药剂在制备受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的指示剂中的用途。
143.如权利要求142所述的用途，其中所述ppGpp的活性和/或水平包括编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的活性和/或水平，和/或ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性和/或水平。
144.如权利要求142至143中任一项所述的用途，其中能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
145.如权利要求144所述的用途，其中能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的所述药剂包括：能够特异性地扩增编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的引物，和/或能够特异性地识别编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子的探针。
146.如权利要求143至145中任一项所述的用途，其中能够确定所述药剂对ppGpp的活性和/或水平的作用的所述药剂包括：能够特异性地识别ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的药剂，和/或能够确定ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的活性的药剂。
147.如权利要求143至146中任一项所述的用途，其中所述ppGpp合成酶包括RelA。
148.如权利要求143至147中任一项所述的用途，其中所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
149.如权利要求142至148中任一项所述的用途，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
150.如权利要求149所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
151.如权利要求149至150中任一项所述的用途，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
152.能够表明受试者的Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂在制备受试者患睡眠障碍和/或有患睡眠障碍的风险的可能性的指示剂中的用途。
153.如权利要求152所述的用途，其中所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平包括mesh1的活性和/或水平和/或所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
154.如权利要求152至153中任一项所述的用途，其中能够确定所述药剂对mesh1的活性和/或水平的作用的药剂包括：能够特异性地扩增mesh1的引物，和/或能够特异性地识别mesh1的探针。
155.如权利要求152至154中任一项所述的用途，其中能够确定所述药剂对所述Mesh1蛋白质的活性和/或水平的作用的药剂包括：能够特异性地识别所述Mesh1蛋白质的药剂，和/或能够确定所述Mesh1蛋白质的活性的药剂。
156.如权利要求152至155中任一项所述的用途，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
157.如权利要求152至156中任一项所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
158.如权利要求152至157中任一项所述的用途，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
159.一种非人生物体或其活体部件，其包括功能受损的ppGpp水解酶。
160.如权利要求159所述的非人生物体或其活体部件，其中所述非人生物体是黑腹果蝇。
161.如权利要求159至160中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其不包含任何功能性ppGpp水解酶。
162.如权利要求159至161中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其功能受损的ppGpp水解酶是纯合的。
163.如权利要求159至162中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中与相应的野生型非人生物体相比，所述非人生物体具有减少的睡眠潜伏期。
164.如权利要求159至163中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中所述生物体的ppGpp水解酶基因被敲低或敲除。
165.如权利要求159至164中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中所述生物体的ppGpp水解酶基因通过RNAi被敲低。
166.如权利要求159至165中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中所述生物体的ppGpp水解酶基因通过M1KOGal4被敲低。
167.如权利要求159至166中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中所述生物体的ppGpp水解酶基因的所有三个外显子缺失。
168.如权利要求159至167中任一项所述的非人生物体或其活体部件，其中所述ppGpp水解酶是Mesh1蛋白质。
169.一种衍生自如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件的细胞、细胞系或原代细胞培养。
170.一种衍生自如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件的组织。
171.如权利要求170所述的组织，其中所述组织衍生自神经组织。
172.如权利要求170至171中任一项所述的组织，其中所述组织来自包含神经元细胞的神经组织。
173.如权利要求172所述的组织，其中所述神经元细胞是脑间部神经元。
174.如权利要求172至173中任一项所述的组织，其中所述神经元细胞不包含表达Dh44的神经元。
175.一种筛选可用于治疗、预防睡眠障碍和/或减缓睡眠障碍的发展的物质、装置和/或组合物的方法，包括将候选物质、装置和/或组合物施用于如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件、如权利要求169所述的细胞、细胞系或原代细胞培养或如权利要求170至174中任一项所述的组织，并且确定所述候选物质、装置和/或组合物对以下一项或多项的作用：
所述非人生物体的睡眠潜伏期；和
ppGpp的活性、量和/或释放。
176.如权利要求175所述的方法，包括将所述候选物质、装置和/或组合物的作用施用于Mesh1蛋白质的活性和/或水平。
177.如权利要求175至176中任一项所述的方法，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
178.如权利要求175至177中任一项所述的方法，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
179.如权利要求175至178中任一项所述的方法，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
180.如权利要求175至179中任一项所述的方法，其中所述确定包括：确定所述候选物质、装置和/或组合物对ppGpp在神经元中的活性和/或水平的作用。
181.如权利要求180所述的方法，其中所述神经元细胞是脑间部神经元。
182.如权利要求179至181中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞不包含表达Dh44的神经元。
183.如权利要求175至182中任一项所述的方法，其是体外方法或离体方法。
184.如权利要求175至183中任一项所述的方法，其中所述候选物质和/或组合物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
185.如权利要求175至184中任一项所述的方法，其中所述候选物质、装置和/或组合物直接作用于ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶，和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述ppGpp合成酶包括RelA蛋白质。
187.如权利要求185至186中任一项所述的方法，其中所述ppGpp水解酶包括Mesh1蛋白质。
188.一种筛选可用于睡眠障碍的诊断和/或监控的生物标志物的方法，包括：
确定物质的疾病值，其中所述疾病值是所述物质在由如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件、如权利要求169所述的细胞、细胞系或原代细胞培养或者如权利要求170至174中任一项所述的组织获得的样品中的存在和/或水平；
确定所述物质的野生型值，其中所述野生型值是所述物质在由相应的野生型非人生物体或其相应的活体部件、细胞或组织中的存在和/或水平；
当所述疾病值与所述野生型值不同时，将所述物质鉴定为所述生物标志物。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
190.如权利要求188至189中任一项所述的方法，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
191.如权利要求188至190中任一项所述的方法，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
192.如权利要求188至191中任一项所述的方法，其中所述疾病值大于所述野生型值，并且所述生物标志物是表明减少睡眠的生物标志物。
193.如权利要求188至192中任一项所述的方法，其中所述疾病值小于所述野生型值，并且所述生物标志物是表明促进睡眠的生物标志物。
194.如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件、如权利要求169所述的细胞、细胞系或原代细胞培养或者如权利要求170至174中任一项所述的组织在制备筛选可用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统中的用途。
195.如权利要求194所述的用途，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
196.如权利要求194至195中任一项所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
197.如权利要求194至196中任一项所述的用途，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
198.如权利要求194至197中任一项所述的用途，其中所述物质、装置、组合物和/或生物标志物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
199.如权利要求194至198中任一项所述的用途，其中所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂。
200.如权利要求194至199中任一项所述的用途，其中所述能够改变ppGpp的活性和/或水平的药剂包括ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶，和/或编码ppGpp水解酶和/或ppGpp合成酶的核酸分子。
201.如权利要求194至200中任一项所述的用途，其中所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂。
202.如权利要求194至201中任一项所述的用途，其中所述能够改变Mesh1蛋白质的活性和/或水平的药剂包括所述Mesh1蛋白质和/或mesh1。
203.如权利要求159至168中任一项所述的非人生物体或其活体部件、如权利要求169所述的细胞、细胞系或原代细胞培养或者如权利要求170至174中任一项所述的组织，用于筛选可用于睡眠障碍的治疗、诊断、预防、监控和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物。
204.如权利要求203所述的用途，其中所述睡眠障碍包括与睡眠不足相关的睡眠障碍和/或与睡眠过多相关的睡眠障碍。
205.如权利要求203至204中任一项所述的用途，其中所述与睡眠不足相关的睡眠障碍包括失眠、夜间发作的失眠和/或晨间早醒。
206.如权利要求203至205中任一项所述的用途，其中所述与睡眠过多相关的睡眠障碍包括发作性睡病、过度嗜睡、夜间发作的早睡和/或晨间晚醒。
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WO2021164770A1 (en) 2021-08-26

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