KR102437918B1

KR102437918B1 - 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된 마우스 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102437918B1
Application number: KR1020200066521A
Authority: KR
Inventors: 박미경; 서지연
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2022-08-30
Also published as: KR20210149459A; KR102437918B9

Abstract

본 발명은 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된 Ccny 녹아웃(knockout, KO) 마우스 및 이의 이용에 관한 것이다.

Description

카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된 마우스 및 이의 용도{Mice displaying an enhanced susceptibility to kainic acid-induced epilepsy and uses thereof}

발작(Seizure)은 뇌의 뉴런 집단의 비정상적으로 과도하게 활성화되어 행동, 움직임(제어 불가능한 흔들림), 감각 또는 의식 상태에서 일시적인 이상을 일으키는 임상적 징후이다. 전세계 사람들의 최대 10 %가 일생 동안 한번은 유발된(provoked) 또는 이유 없는 자발적(unprovoked) 발작을 경험할 수 있다. 이와 대조적으로, 뇌전증(간질, epilepsy)은 전세계 인구의 약 1 %에 영향을 미치는, 재발성 및 이유 없는 자발적 발작을 동반하는 중추 신경계의 신경계 질환이다.

E/I 균형이라고도 하는 흥분과 억제(excitation and inhibition)의 균형은 뇌의 생리학적 기능을 위한 신경망 활동을 유지하는데 기본적이고 필수적이다. E/I 불균형은 뉴런의 동기화된 파열(burst)을 나타내는 뇌전증을 포함한 여러 신경계 질환에 연루되어 있다. 뇌전증에서 흥분성의 향상은 흥분성 시냅스의 향상 및/또는 억제성 시냅스의 억제로 인해 발생한다.

포유류 중추 신경계의 1 차 억제성 신경 전달 물질인 감마-아미노부티르산(Gamma-aminobutyric acid, GABA)은 뇌전증 치료의 중심에 위치해 왔으며, 뇌전증의 약리학적 해결책은 일반적으로 GABA적 중간 뉴런(interneurons)의 조절과 관련이 있다. 예를 들어, 벤조디아제핀(benzodiazepine) 및 바르비투레이트(barbiturate)는 GABAA 수용체에 결합함으로써 GABA 매개 억제를 강화시키는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 비가바트린(vigabatrin)은 GABA의 붕괴를 차단함으로써 신경 회로의 억제 구동을 향상시키고, 티아가빈(tiagabine)은 뉴런 및 신경교세포(glia)로의 재흡수를 억제함으로써 시냅스 GABA의 수준을 증가시킨다. GABA-매개 억제 신경망의 표적화에 더하여, 흥분성 신경망의 조절은 또한 뇌전증을 치료하는 또 다른 효과적인 방법일 수 있다.

한편, 사이클린(Cyclins)은 세린/트레오닌 키나제(serine/threonine kinases) 그룹인 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinases, CDKs)를 활성화시킴으로써 세포 증식에서 세포주기를 조절하는 단백질 군에 속한다. 진정후생동물(eumetazoa)에서 사이클린의 고도로 보존된 구성원인 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY)는 효모 2(two)-하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)에 의해 CDK14의 상호 작용 파트너로 발견되었다. 초파리에서 CCNY는 배 발생에서 변태에 이르기까지 여러 발달 단계에 필요하며, 이의 결손 돌연변이는 번데기 발달에 결함이 생기므로 치명적이다. 손톱개구리속(Xenopus)에서 CCNY는 Wnt 신호 전달 경로의 활성화와 Wnt-의존성 복배(anteroposterior)의 배아 패터닝(patterning)에 필수적이다. 또한, CCNY는 유방 줄기/전구 세포의 자가 재생에 기여했으며, CCNY의 과발현은 신경교종(glioma) 및 다양한 유형의 암 세포의 증식에 관련되어 있을 뿐만 아니라, 비-뉴런 및 증식 중인 세포에서 CCNY는 중요한 기능을 시사한다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 Ccny 녹아웃(knockout, KO) 마우스가 야생형 한배 새끼(littermates)보다 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되고 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된, 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증 모델 마우스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 i) CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA) 및 Cas9 단백질의 혼합물을 세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 단계; 및 ii) 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주입된 배아를 배지에서 배양한 후 대리모 마우스로 배아를 옮기는 단계;를 포함하는, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 카이닉산을 투여하여 뇌전증을 유발한 상기 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스에 뇌전증의 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; b) 상기 단계 a)의 후보물질 투여 후, 상기 뇌전증 모델 마우스의 뇌전증 증상을 측정하는 단계; 및 c) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 뇌전증 증상의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 뇌전증 예방제 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되고 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된, 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증 모델 마우스를 제공한다.

본 발명에서 용어, "뇌전증(간질, epilepsy)"은 재발성 및 이유 없는 자발적 발작을 동반하는 중추 신경계의 신경계 질환으로, 뇌 내 신경망의 흥분과 억제(excitation and inhibition, E/I)의 불균형이 원인으로 알려져 있다. 뇌전증에서 흥분성의 향상은 흥분성 시냅스의 향상 및/또는 억제성 시냅스의 손상으로 인해 발생한다. 상기 뇌전증은 간질이라고 명명되었었던 질환으로, 간질과 동일한 질환을 일컫는다. 본 발명에 있어서, 상기 뇌전증은 카이닉산(kainic acid)에 의해 유발 또는 유도된 뇌전증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "카이닉산(kainic acid)"은 카이닌산 또는 카이네이트로도 명명되며 일부 해초에서 자연적으로 발생하는 산이다. 카이닉산은 중추 신경계의 주요 흥분성 신경 전달 물질인 글루타메이트에 대한 수용체를 활성화시켜 작용하는 강력한 신경 흥분성 아미노산 작용제이다.

본 발명에 있어서, 상기 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스는 Ccny 녹아웃 마우스에 카이닉산이 25 내지 30 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여되어 뇌전증이 유발된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서, 25 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여된 카이닉산은 발작 거동을 유발하지 않았거나 뇌전증 중증 단계 1(도 5D; 도 3F)에 해당하는 매우 경미한 발작을 유발했으며, 67 %의 발병률(도 5A, C, D) 및 0 %의 사망률을 나타내었다(도 5A, B, D). 또한, 카이닉산을 35, 40 또는 45 mg/kg의 투여량으로 투여하면 뇌전증 중증 단계 6(도 5A, B, D; 도 3F)에 상응하는 사망률을 유발하기 시작하며, 3 가지 용량 모두에서 100 %의 발병률(도 5C, D)과 35, 40 및 45 mg/kg 용량에서 각각 33 %, 67 % 및 100 %의 사망률을 나타내었다(도 5A, B, D).

이에, 상기의 결과를 고려하였을 때 모든 동물이 30 mg/kg 용량에서 1 단계 이상에 해당하는 뇌전증 증상을 나타내고 사망은 초래하지 않기 때문에 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성 연구에서 카이닉산의 용량을 30 mg/kg 투여하는 것으로 결정하였다.

본 발명에서 용어, "사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY)"는 세린/트레오닌 키나제(serine/threonine kinases) 그룹인 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinases, CDKs)를 활성화시킴으로써 세포 증식에서 세포주기를 조절하는 단백질 군인 사이클린(Cyclin)의 일종으로, 배 발달 중인 세포, 비-뉴런 및 증식 중인 세포에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 CCNY는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 혼용하여 사용될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에서의 CCNY는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니다. CCNY와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 CCNY에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 발명의 CCNY는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 포함하는 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 상기 CCNY 유전자, 즉, CCNY를 코딩하는 유전자는 그 예로 Ccny일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다. 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CCNY를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건(stringent condition) 하에 하이브리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CCNY를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.

본 출원에서 용어, "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당해 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)으로 결정될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 뇌전증 및 발작 관련 유전자가 Ccny의 발현 수준에 의해 영향을 받는 것을 확인하였다. CCNY 과발현 또는 CCNY 녹다운으로 인해 차별적으로 발현되는 유전자(differentially expressed genes, DEGs) 분석 결과, 뇌전증 및 발작 관련 질병과 관련된 15 개의 DEGs(도 2A~C) 중 7 개의 DEGs는 CCNY 과발현(Itpa, Tbc1d24, Kcnj10 및 Piga) 또는 CCNY 녹다운(Samd12, Epm2a 및 Nhlrc1) 어느 한쪽에 의해 상향 조절되었다(도 2A). 또한, Slc25a22는 CCNY 과발현 및 CCNY 녹다운 모두에 의해 상향 조절되었다. 초기 소아 뇌전증 뇌질환(Early infantile epileptic encephalopathy)은 Itpa, Tbc1d24 및 Slc25a22와 같은 DEGs와 관련이 있다. 초기 소아 뇌전증 뇌질환 외에, Tbc1d24는 소아 근막 뇌전증(infantile myoclonic epilepsy)에서 악성 이주 부분 발작(malignant migrating partial seizures)과 관련이 있으며, Slc25a22는 초기 근 병성 뇌병증(early myoclonic encephalopathy)과도 관련이 있다. Kcnj10 및 Piga는 다른 신경계 및 감각계 질환 하위 그룹에 속하는 발작-센서 감각 장애-부족-정신 지연-전해질 불균형(seizures-sensorineural deafness-ataxia-mental retardation-electrolyte imbalance, SESAME) 및 지질/당지질 대사(lipid/glycolipid metabolism) 하위 그룹의 선천성 질환 및 대사 그룹의 선천성 장애에 속하는 다중 선천성 기형-저칼륨증-발작 증후군 장애(multiple congenital anomalies-hypotonia-seizures syndrome)와 각각 관련이 있다. Samd12는 가족성 성인 근시 뇌전증(familial adult myoclonic epilepsy)과 관련이 있으며, Epm2a와 Nhlrc1는 모두 진행성 근시 뇌전증(progressive myoclonic epilepsy) 및 Lafora 질환과 관련이 있다(도 2A).

또한, 뇌전증 및 발작 관련 질병과 관련된 15 개 DEGs 중(도 2A~C), 5개 DEGs(Slc6a1, Chrna4, Reln, Grin2a 및 Slc35a3)는 CCNY 녹다운에 의해서 하향 조절되고, 2개 DEGs(Gabrd 및 Gal)은 CCNY 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 하향 조절되었다(도 2A). Slc6a1, Chrna4 및 Reln은 각각 근막성 뇌전증(myoclonic-atonic epilepsy), 야행성 전두엽 뇌전증(nocturnal frontal lobe epilepsy) 및 가족성 뇌전증 측두엽(familial epilepsy temporal lobe, ETL)과 각각 관련이 있으며, Grin2a는 랜도-클레프너 증후군(Landau-Kleffner syndrome), 롤랜딕 뇌전증(Rolandic epilepsy), 정신 지체(mental retardation) 및 언어 능력 운동 장애(speech dyspraxia)와 관련이 있다. Reln 이외에 Gal은 가족성 ETL 과도 관련되어 있다. 또한 Gabrd는 열성 발작(febrile seizures), 특발성 전신성 뇌전증(idiopathic generalized epilepsies) 및 청소년 근시 뇌전증(Juvenile myoclonic epilepsy)과 관련이 있다. 또한, Slc35a3는 근골격계 하위 군 및 선천성 기형 그룹의 선천성 기형에 속하는 관절 경화(arthrogryposis), 정신 지체 및 발작과 관련이 있다(도 2A).

CCNY 과발현에 의해 상향 조절되고 CCNY 녹다운에 의해 하향 조절되는 Kcnj10은 15 개의 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 CCNY 수준에 의해 양방향으로 조절되는 유일한 DEG이다(도 2A~C). 특히, 15 개 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 12개 DEGs가 CCNY 녹다운에 의해 조절되는 것으로 확인되었고, 15 개의 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 7개 DEGs가 CCNY 과발현에 의해 조절되는 것으로 확인되었으며, 이는 CCNY 녹다운이 CCNY 과발현과 비교하여 뇌전증과 관련된 DEG의 더 큰 폴드 변화를 유도함을 시사하였으며, 이는 폴드 변화 분석에 의해 확인되었다(도 2B, C).

상기 결과들은 CCNY 녹다운이 뇌전증 및 발작과 관련이 있음을 시사하였다.

본 발명에서 용어, "녹다운(Knockdown)"은 유전자의 발현 또는 번역을 억제 또는 방지하는 것을 의미한다. 상기 녹다운은 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자인 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 등을 세포에 삽입하여 이들이 발현을 억제시키고자 하는 표적 유전자의 mRNA와 결합하여 이중 가닥 RNA를 형성하도록 함으로써 다이서 복합체, 아르고나우트(Argonaut) 및 슬라이서 복합체 등에 의한 분해를 유도하는 RNAi 과정에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 통상적으로 녹다운은 유전자의 발현 또는 번역을 100% 억제하는 것이 아닌, 70-80% 내외로 하향 조절하는 것일 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 유전자는 Ccny일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 Ccny 녹아웃 마우스가 뇌전증, 특히 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 야생형 한배 새끼(littermates)보다 증가됨을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명의 일실시예에서, Ccny 녹아웃 마우스는 카이닉산 주사 후 야생형 마우스(19 %)와 비교하여 증가된 사망률(43 %)을 나타내었다(도 3G, H). 더욱이, 대부분의 Ccny 녹아웃(100 %) 및 야생형 한배 새끼(91 %)는 어느 정도의 뇌전증 증상을 보였지만(도 3G, I), Ccny 녹아웃 마우스는 야생형 한배 새끼에 비해 주사 후 더 심한 뇌전증 증상을 겪었다(도 3J). 뇌전증 중증 단계 6, 사망을 나타낸 마우스를 배제하였을 때, Ccny 녹아웃 마우스는 야생형 한배 새끼와 비교하여 카이닉산-유발 뇌전증에 여전히 더 취약함을 확인하였다(도 3K).

본 발명에서 용어, "녹아웃(knockout, KO)"은 발현을 억제시키고자 하는 표적 유전자를 DNA 상에서 직접 결실 또는 저해함으로써 표적 유전자의 발현을 100% 억제하는 것을 의미하며, 녹아웃은 제거된 유전자를 일컫거나 유전자가 제거된 유기체를 명명하기도 한다. 상기 녹아웃을 수행하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 상동 재조합(Homologous Recombination), 부위 특정 핵산가수분해효소(Nuclease), 아연 집게 핵산분해효소(Zinc-finger nucleases), 탈렌(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs), 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 유전자는 Ccny일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "민감성(susceptibility)"은 발병을 막을 수 있는 능력이 없어 질병에 취약한, 즉, 질병이 발생될 우려가 있는 상태를 의미한다. 민감성이 높아질수록 질병 발생율은 높아지며 민감성이 낮아질수록 질병 발생율은 낮아진다. 즉, 본 발명에서 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가 또는 높아진다는 것은 카이닉산-유발 뇌전증의 발생율이 높아진다는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 i) CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA) 및 Cas9 단백질의 혼합물을 세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 단계; 및 ii) 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주입된 배아를 배지에서 배양한 후 대리모 마우스로 배아를 옮기는 단계;를 포함하는, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스의 제조방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

상기 단계 i)은 마우스 유래 수정란을 배지에서 배양한 후, sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물을 1(one)-세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 i)에서 CCNY의 N-말단 영역은 CCNY를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열에서 140 내지 170번째 위치에 상응하는 염기를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, Ccny 녹아웃 마우스에서 결실된 표적 부위는 제 1 엑손의 마지막 15-bp(회색 배경에서 소문자)와 제 1 인트론의 첫 16-bp(회색 배경에서 대문자)에 걸쳐있는 스플라이스 접합부위 31-bp의 삭제는 조기 정지 코돈(TAG)으로 이어져 Ccny 녹아웃 마우스에서 CCNY 단백질 발현의 조기 종결(*)을 초래하였다(도 3A; 도 4A). 본 발명에 따른 Ccny 녹아웃 마우스는 다양한 뇌 영역에서 RNA 수준(도 3C)뿐만 아니라 게놈 DNA 수준(도 3A, B) 둘 다에서 야생형보다 31-bp 짧아진 단편을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 ii)는 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주사된 배아를 배지에서 배양한 뒤 대리모 마우스로 옮겨 임신 기간을 거친 후 출산하여 Ccny가 녹아웃된 마우스, 즉, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스를 수득하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 하나의 양태는 a) 카이닉산을 투여하여 뇌전증을 유발한 상기 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스에 뇌전증의 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; b) 상기 단계 a)의 후보물질 투여 후, 상기 뇌전증 모델 마우스의 뇌전증 증상을 측정하는 단계; 및 c) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 뇌전증 증상의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 뇌전증 예방제 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

상기 단계 a)는 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스에 뇌전증의 예방 또는 치료제 후보물질을 경구 또는 비경구 투여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 a)의 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스는 Ccny 녹아웃 마우스에 30 mg/kg의 용량으로 카이닉산을 복강 내 투여하여 카이닉산-유발 뇌전증을 발생시킨 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 단계 a)에서 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 b)는 뇌전증 모델 마우스의 뇌전증 증상을 뇌전증 발작 중증도 평가에 따라 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 뇌전증 발작 중증도 평가에 사용된 기준은 도 3F에 요약된 Racine(R.J. Racine, Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 32(3) (1972) 281-94.) 및 Klenerman et al(P. Klenerman et al, Mortality in patients with epilepsy: a study of patients in long term residential care, J Neurol Neurosurg Psychiatry 56(2) (1993) 149-52.)의 이전 연구에서 참고할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 c)는 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질을 투여한 뇌전증 모델 마우스에서 뇌전증 증상의 감소를 확인함으로써 뇌전증 증상의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 뇌전증 증상의 감소는 단계 b)의 뇌전증 발작 중증도 평가에 따라 측정된 결과를 분석하여 결정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 Ccny 녹아웃 마우스는 뇌전증, 특히 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 야생형 한배 새끼(littermates)보다 증가된 바, 신규 뇌전증 모델 마우스로 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, 뇌전증 모델 마우스의 제조, 및 이를 이용한 뇌전증 예방제 또는 치료제 후보물질의 스크리닝에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 (A) 본 연구에 사용된 RNA-시퀀싱(RNA-seq) 데이터를 어떻게 획득하고 접근했는지를 보여주는 전체 계획, (B) CCNY 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 상향 및 하향 조절된 차등 발현 유전자(DEG)와 관련된 인간 질병의 수를 나타낸 그래프, (C) CCNY-WT 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 상향 조절되거나 하향 조절되는 DEGs로부터 얻은 인간 질병 분석을 나타내는 도넛 형 차트, (D) 뇌전증, 신경 퇴행성 질환, 안과 질환, 귀 질환 및 기타 신경계 및 감각계 질환을 포함하는 CCNY에 의해 조절되는 질환을 나타낸 도이다.
도 2는 (A) CCNY-WT 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 상향 조절 또는 하향 조절된 유전자를 질병 검색 도구인 KEGG 맵퍼에 의해 분석한 결과, CCNY 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 조절되는 뇌전증 또는 발작 관련 질병과 관련된 DEGs(B, C)의 히트맵(B) 및 log2(폴드 변화)(C)와 CCNY 과발현 또는 CCNY 녹다운에 의해 조절되는 신경 퇴행성 질환과 관련된 DEGs(D, E)의 히트맵(D) 및 log2(폴드 변화)(E)를 나타낸 도이다.
도 3은 (A) Ccny 유전자의 제 1 엑손 및 제 1 인트론에 걸친 31-bp 결실 영역을 보여주는 개략도, (B) 야생형(WT), 이형 접합체(Hetz) 및 Ccny KO(Mut) 마우스의 PCR 유전형 분석, (C) Ccny KO(녹아웃) 마우스에서 Ccny 유전자의 31-bp 결실을 입증하는 역전사 PCR(RT-PCR). 밴드 크기는 야생형의 경우 172bp이고 Ccny 녹아웃 마우스의 경우 141bp. OB, 후각 전구; TH, 시상; HC, 해마; MB, 중뇌; CB, 소뇌; CTX, 피질, (D) Ccny 녹아웃 마우스의 뇌, 비장, 폐, 심장 및 신장을 비롯한 몇몇 기관에서의 CCNY 단백질 발현 분석 결과, (E) Ccny 녹아웃 마우스에서 CCNY 단백질 발현의 완전한 손실, CTX, 피질; ST, 선조체; HC, 해마; TH, 시상; SN, 기질성 니그라; CB, 소뇌, (F) 뇌전증의 중증도 분류에 사용되는 기준, (G) 카이닉산(30 mg/kg)-유발 뇌전증 행동 연구에 사용 된 각 유전자형에서의 총 마우스 수(총), (H) 카이닉산을 30 mg/kg의 용량으로 주사 한 후 야생형 및 Ccny 녹아웃마우스에서 관찰된 사망률, (I) 카이닉산을 30 mg/kg의 용량으로 주사 한 후 야생형 및 Ccny 녹아웃 마우스에서 관찰된 뇌전증 발생률, (J) 야생형 및 Ccny 녹아웃 마우스에서 관찰된 뇌전증 행동(데이터는 뇌전증 심각도 단계의 평균 ± SEM을 나타낸다.), (K) 야생형 및 Ccny 녹아웃 마우스에서 관찰된 뇌전증 중증도(데이터는 뇌전증 심각도 단계의 평균 ± SEM을 나타낸다.)를 나타낸 도이다.
도 4는 (A) Ccny 녹아웃 마우스에서의 DNA(상단) 및 단백질(하단) 서열, (B) 마우스 CCNY의 전체 cDNA(상단; 유전자 수탁번호, NM_026484.4) 및 단백질 서열(하단)을 (A)와의 비교를 위하여 나타내었다.
도 5는 (A) 25 내지 45 mg/kg 범위의 용량으로 카이닉산을 복강 내 주사하여 야생형 마우스에 수행한 뇌전증의 동물 모델을 확립하기 위한 파일럿 실험 결과. Total: 각 투여량에 대해 실험한 총 마우스 수, Seizure: 1 내지 6 단계에 해당하는 뇌전증의 행동양상을 보이는 마우스의 수, Death: 6 단계에 대해 정의된 뇌전증 행동양상을 나타내는 마우스의 수, (B) 카이닉산의 각 투여량에서 관찰되는 동물 모델의 사망률, (C) 카이닉산의 각 투여량에서 관찰되는 뇌전증 발생률, (D) 지시된 용량의 카이닉산을 투여한 후 야생형 마우스에서 150 분 동안 모니터링한 뇌전증 중증도(데이터는 뇌전증 심각도 단계의 평균 ± SEM을 나타낸다.)를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. CCNY와 신경계 장애와의 관련성 검정

CCNY가 신경계 장애와 관련이 있는 지의 여부를 조사하기 위해, EGFP, CCNY-WT-EGFP 또는 CCNY-shRNA-EGFP를 발현하는 렌티 바이러스로 감염된 일차 배양된 해마 뉴런을 수확한 다음 RNA-seq 분석에 이용하였다. 구체적으로, 해마 일차 뉴런 배양물을 E18 Sprague-Dawley 랫트 배아로부터 제조하고 시험관 내에서 10-21 일 동안 B27(Gibco)가 포함된 신경 기저(Neurobasal) 배지(Gibco)에서 유지시켰다. HEK 293T 세포를 10 % 소태아 혈청(fetal bovine serum, Gibco)이 보충된 DMEM(Gibco)에서 배양하였다. EGFP, CCNY-WT-EGFP 또는 CCNY-shRNA-EGFP를 발현하는 렌티 바이러스는 이전 연구(I.S. Joe et al, Cyclin Y-mediated transcript profiling reveals several important functional pathways regulated by Cyclin Y in hippocampal neurons, PLoS One 12(2) (2017) e0172547.)에 설명된 대로 제작하였다. 구체적으로, CCNY-WT 또는 CCNY-shRNA를 보유하는 렌티 바이러스 벡터 FUGW, FUGW, 패키징 벡터 △8.9 및 VSVG 외피 당단백질 벡터를 X-tremeGENE HP DNA 형질 감염 시약(Roche)을 사용하여 HEK 293T 세포에 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 36~48 시간 뒤, 렌티 바이러스를 함유하는 상층액을 수거한 다음 배양된 해마 뉴런을 감염시키기 위해 상층액을 해마 뉴런에 처리하였다. 상층액은 분액(aliquoted) 후 -80 ℃에서 보관하였다.

RNA-seq로는 생물공학 정보 유전자 발현 옴니버스(Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, GEO)에 수탁번호 GSE84850(I.S. Joe, et al, Cyclin Y-mediated transcript profiling reveals several important functional pathways regulated by Cyclin Y in hippocampal neurons, PLoS One 12(2) (2017) e0172547.)로 기탁한 CCNY에 의해 조절되는 전사체 RNA-seq 데이터(도 1A)를 사용하였다.

유전자 발현 수준은 백만 조각 당 전사체의 킬로베이스 당 조각(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped, FPKM)으로 계산되었다. 폴드 변화(fold change, FC)는 CCNY-EGFP 과발현 또는 CCNY shRNA-매개 녹다운(knockdown) 샘플의 FPKM 값에서 EGFP 대조군의 FPKM 값을 빼서 계산하였다. CCNY 과발현 및 CCNY 녹다운에 대해 각각 |log₂FC| ≥ 0.3 및 |log₂FC| ≥ 0.33을 설정하여 차별적으로 발현되는 유전자(differentially expressed genes, DEGs)를 선택하였다. 이들 기준에 기초하여, CCNY 과발현에 의해 상향 조절된 442 개의 DEGs 및 하향 조절된 375 개의 DEGs, 또한 CCNY 녹다운에 의해 상향 조절된 529 개의 DEGs 및 하향 조절된 671 개의 DEGs가 질병 분석에 사용되었다.

랫트 DEG의 Entrez ID는 주석, 시각화 및 통합 발견(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID) 생물 정보 자원 v6.8(https://david.ncifcrf.gov)의 유전자 ID 변환 도구를 사용하여 인간 상동 유전자로 변환되었다. 그리고 인간 질병 검색에 더 전문화된 분석 도구인 인간 유전자 분석을 위한 교토 유전자 백과 사전(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG) 맵퍼(https://www.genome.jp/kegg/tool/map_pathway1.html)를 활용하였다.

KEGG 맵퍼 검색 결과는 조회 수에 따라 정렬되었으며 KEGG 질병 데이터베이스(https://www.kegg.jp/kegg-bin)의 '인간 질병' 계층 구조에서 분류 기준에 따라 수동으로 분류되었다(https://www.kegg.jp/kegg-bin/get_htext?br08402.keg). DEG에 대한 히트맵(Heatmap)은 GraphPad Prism 8.3.1(GraphPad Software)을 사용하여 제작되었다.

그 결과, 인간 질병 분석을 통해 CCNY 과발현에 의해 각각 상향 및 하향 조절된 DEG에서 103 및 91 종의 질병이 확인되었고, CCNY 녹다운에 의해 각각 상향 및 하향 조절된 DEG에서 각각 105 및 174 종의 질병이 발견되었다(도 1B). 이들은 인간 질병의 주요 범주에서 15 가지 질병 그룹에 속하고(도 1C), 15 가지 질병군 중에서 선천성 기형, 신경계 질환, 선천성 대사 장애 및 암을 포함한 4 가지 질병군이 도 1B에서 확인된 질병 수의 약 60 ~ 70 %를 차지하였다. 특히, 신경계 질환 그룹은 CCNY 과발현에 의해 각각 상향 및 하향 조절된 DEG와 관련된 것으로 확인된 질환의 15.5 % 및 15.4 %를 차지하였고, CCNY 녹다운에 의해 각각 상향 및 하향 조절된 DEG와 관련된 것으로 확인된 질환의 18.1 % 및 17.8 %를 차지하였다(도 1C).

신경계 질환 그룹은 뇌전증, 신경 퇴행성 질환, 눈 질환, 귀 질환 및 기타 신경계 및 감각계 질환을 포함하여 총 5 개의 하위 그룹을 포함하며, 신경계 질환 그룹에 속하는 질병의 총 수는 뇌전증 그룹 26.25 %, 신경 퇴행성 질병 그룹 20.0 %, 안과 질환 그룹 25.0 %, 귀 질환 7.5 %, 다른 신경계 및 감각계 질환 21.25 %로 구성되어 있다(도 1D). 뇌전증 소집단은 4 가지 다른 상태(CCNY 과발현에서 상향 조절된 DEGs에 의해 확인된 질병, CCNY 과발현에서 하향 조절된 DEGs에 의해 식별된 질병, CCNY 녹다운에서 상향 조절된 DEGs에 의해 확인된 질병 및 CCNY 녹다운에서 하향 조절된 DEGs에 의해 식별된 질병)에서 25.0 ~ 28.6 %의 신경계 질환 그룹에 대해 다소 유사한 점유율을 나타내는 것으로 확인된 반면, 다른 하위 그룹은 신경계 질환 그룹에 대해 다양한 비율을 차지하는 것으로 나타났다(도 1D).

실시예 2. CCNY와 뇌전증, 발작 관련 질병 및 신경 퇴행성 질환과 관련된 DEG의 발현 프로파일 간의 관련성 검정

2-1. 뇌전증 및 발작 관련 질병과 관련된 DEG

뇌전증 및 발작 관련 질병과 관련된 15 개의 DEGs(도 2A~C) 중 7 개의 DEGs는 CCNY 과발현(Itpa, Tbc1d24, Kcnj10 및 Piga) 또는 CCNY 녹다운(Samd12, Epm2a 및 Nhlrc1) 어느 한쪽에 의해 상향 조절되었다(도 2A). Slc25a22는 CCNY 과발현 및 CCNY 녹다운 모두에 의해 상향 조절되었다. 초기 영아 뇌전증 뇌병증(Early infantile epileptic encephalopathy)은 Itpa, Tbc1d24 및 Slc25a22와 같은 DEGs와 관련이 있다. 초기 영아 뇌전증 뇌병증 외에, Tbc1d24는 유아기 및 영아 근시 뇌전증(infantile myoclonic epilepsy)에서 악성 이주 부분 발작(malignant migrating partial seizures)과 관련이 있으며, Slc25a22는 초기 근 병성 뇌병증(early myoclonic encephalopathy)과도 관련이 있다. Kcnj10 및 Piga는 다른 신경계 및 감각계 질환 하위 그룹에 속하는 발작-센서 감각 장애-부족-정신 지연-전해질 불균형(seizures-sensorineural deafness-ataxia-mental retardation-electrolyte imbalance, SESAME) 및 지질/당지질 대사(lipid/glycolipid metabolism) 하위 그룹의 선천성 질환 및 대사 그룹의 선천성 장애에 속하는 다중 선천성 기형-저칼륨증-발작 증후군 장애(multiple congenital anomalies-hypotonia-seizures syndrome)과 각각 관련이 있다. Samd12는 가족성 성인 근시 뇌전증(familial adult myoclonic epilepsy)과 관련이 있으며, Epm2a와 Nhlrc1는 모두 진행성 근시 뇌전증(progressive myoclonic epilepsy) 및 Lafora 질환과 관련이 있다(도 2A).

CCNY 과발현에 의해 상향 조절되고 CCNY 녹다운에 의해 하향 조절되는 Kcnj10은 15 개의 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 CCNY 수준에 의해 양방향으로 조절되는 유일한 DEG이다(도 2A~C). 특히, 15 개 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 12개 DEGs가 CCNY 녹다운에 의해 조절되는 것으로 확인되었고, 15 개의 뇌전증 및 발작 관련 DEGs 중 7개 DEGs가 CCNY 과발현에 의해 조절되는 것으로 확인되었다. 이는 CCNY 녹다운이 CCNY 과발현과 비교하여 뇌전증과 관련된 DEG의 더 큰 폴드 변화를 유도함을 시사하였으며, 이는 폴드 변화 분석에 의해 확인되었다(도 2B, C).

2-2. 신경 퇴행성 질환과 관련된 DEG

신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 확인된 총 18 개의 DEGs 중(도 2A, D, E), 2 개의 DEGs(Prph 및 Pik3r5)는 CCNY 과발현에 의해 상향 조절되었고, 5 개 DEGs(Sod1, Pdyn, Hars1, Fgd4, 그리고 Toe1)는 CCNY 녹다운에 의해 상향 조절되었다(도 2A). 또한, CCNY 과발현에 의해 1개의 DEG(Folr1)만이 하향 조절되었고, 10개의 DEGs(Psen1, Nr4a2, Dab1, Elovl5, Cacna1g, Ndrg1, Ttr, Vrk1, Slc52a2 및 Slc5a7)는 CCNY 녹다운에 의해 하향 조절되었다(도 2A). 18개의 DEGs 중 CCNY 과발현 및 CCNY 녹다운 둘 모두에 의해 영향을 받는 유전자는 없었다. Prph 및 Sod1은 근 위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 관련이 있으며, Pik3r5, Folr1, Nr4a2, Ttr, Slc52a2 및 Slc5a7은 안구실행증(ocular apraxia)을 동반한 운동실조(ataxia), 뇌 엽산 수송 결핍으로 인한 신경퇴화, 파킨슨 병, 가족성 아밀로이드증(amyloidosis), 비알레토-반 라에레 증후군(Vialetto-Van Laere syndrome) 및 원위 유전적 운동 신경병증(distal hereditary motor neuropathies)과 각각 관련이 있다(도 2A).

뇌전증 관련 DEG의 경우와 유사하게, 18 개의 신경 퇴행성 질환 관련 DEGs 중 15 개가 CCNY 녹다운에 의해 조절되는 것으로 확인되었으며, 18 개 DEGs 중 3 개 DEGs만이 CCNY 과발현에 의해 조절되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 또한 신경 퇴행성 질환과 관련된 DEG가 CCNY 과발현과 비교하여 CCNY 녹다운에서 더 큰 폴드 변화를 나타내는 경향이 있음을 시사하며, 이 또한 폴드 변화 분석에 의해 확인되었다(도 2D, E).

실시예 3. Ccny KO(녹아웃) 마우스 제작

3-1. Ccny 녹아웃 마우스 제작

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 Ccny 녹아웃 마우스를 제작하였다. 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA)는 CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 ZiFiT 프로그램(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)을 사용하여 설계되었다. 각 sgRNA의 2개의 상보적인 올리고(oligos)는 sgRNA의 합성을 위해 설계된 벡터인 pT7-gRNA 벡터에서 어닐링 및 클로닝되었다. Ccny 및 짧은 RNA 정제를 위한 sgRNA의 시험관내 전사를 제조사의 지시에 따라 MEGAshortscript T7 키트(Ambion)를 사용하여 수행하였다.

C57BL/6J 마우스 유래 수정란을 사용하여 미세주사를 수행하였다. 배아를 M2 배지에서 수확하고 KSOM 배지에서 2-3 시간 동안 배양하였다. sgRNA(40 ng/㎕) 및 Cas9 단백질(80 ng/㎕)(Toolgen)의 혼합물을 1(one)-세포 단계 배아의 세포질에 주입하였다. 대리모 마우스(pseudo-pregnant female mice)(ICR 균주)로 배아를 옮기기 전에 미세주사된 배아를 배양 배지에서 2~3 시간 동안 배양하였다. 자손의 발가락 또는 꼬리로부터의 게놈 DNA를 추출하고 유전자 프라이머 세트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 이종이합체(heteroduplex) 형성을 촉진하기 위해 PCR 앰플리콘(amplicons)을 변성시키고 천천히 어닐링하였다. 재어닐링은 95 ℃에서 5 분의 변성 단계를 거친 후 초당 -2 ℃씩 감소시켜 85 ℃까지 온도를 내리고, 다시 초당 -0.1 ℃씩 감소시켜 25 ℃까지 온도를 내리면서 수행되었다. 재어닐링 된 앰플리콘을 5 단위(units)의 T7 엔도뉴클레아제 I(New England BioLabs)로 37 ℃에서 30 분 동안 처리한 다음, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 표적 외 효과(off-target effects)를 확인하기 위해, 1 또는 2 개의 염기-미스매치(mismatch)를 갖는 잠재적 표적 외 부위를 포함하는 게놈 영역을 PCR 증폭시키고 T7E1 어세이 또는 시퀀싱 분석을 수행하였다. Ccny 녹아웃에 대한 PCR 유전자형 분석법의 경우, Ccny 유전자에 대한 프라이머 세트는 다음과 같이 설계되었다: Forward 5'-ACACGGACCTCAGCCGTGAGGA-3'(서열번호 3), Reverse 5'-TCCACCATTCCCTGCCAGTCCA-3'(서열번호 4), Internal Reverse 5'-CGCTCACCGTCGATGTTTT CCC-3'(서열번호 5). WT의 경우 172- 및 72-염기쌍(bp), 이종접합체의 경우 172-, 141- 및 72-bp, 돌연변이 마우스의 경우 141-bp의 PCR 단편이 증폭되었다.

Ccny 녹아웃 마우스에서 결실된 표적 부위는 제 1 엑손의 마지막 15-bp 및 제 1 인트론의 첫 16-bp를 포함하는 31-bp 스플라이스 접합부였으며(도 3A; 도 4A), 이에 CCNY 번역의 조기 종료를 유도하는 조기 정지 코돈(TAG)이 발생하였다(도 4A).

또한, Ccny 녹아웃 마우스의 뇌, 뇌의 하위 영역, 비장, 폐, 심장 및 생쥐의 신장을 포함한 여러 기관을 빠르게 분리하고 빙냉 용해 완충액(ice-cold lysis buffer)(mM : 50 Tris-HCl, 150 NaCl, 5 EDTA, 1 % Triton X-100, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail), 1 PMSF, PhosphoSTOP, pH 7.4)에서 균질기(Dounce glass tissue grinder homogenizer, Wheaton Industries)를 이용하여 균질화한 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 4 ℃에서 1,000g로 10 분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집하고, 브래드 포드 분석법(Bio-Rad Protein Assay Kit, Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이어서, 샘플을 역전사 PCR(RT-PCR) 또는 면역 블롯 분석에 의해 분석하였다.

RT-PCR의 경우, 조직 균질액으로부터의 총 RNA는 제조사의 지시에 따라 RNAiso Plus(TaKaRa, Japan)를 사용하여 추출하였다. 보체 DNA(Complementary DNAs, cDNA)는 PrimeScript II 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit, TaKaRa, Japan)를 사용하여 RNA로부터 역전사되었다. 이어서, 1 μg의 cDNA, 10 pmole의 각 Ccny 유전자-특이적 프라이머 및 Phusion DNA 중합효소 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

면역 블롯 분석의 경우, 동일량의 단백질을 5X SDS 샘플 완충액(250mM Tris-HCl, pH 6.8, 10 % SDS, 25 % β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 0.05 % 브로모페놀 블루(bromophenol blue))에서 변성시키고 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 막으로 옮긴 후, 항-CCNY(Proteintech group, OriGene, Sigma), 항-GAPDH(Invitrogen) 또는 항-β-tubulin(Abcam)을 사용한 면역 블롯 분석에 적용하였다. 면역 블롯상의 단백질 밴드를 화학 발광 방법(chemiluminescence method, Millipore) 및 영상화 시스템(imaging documentation system, ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare 또는 Fusion Solo S, Vilber)에 의해 시각화하였다.

그 결과, Ccny 녹아웃 마우스는 다양한 뇌 영역에서 RNA 수준(도 3C)뿐만 아니라 게놈 DNA 수준(도 3A, B) 둘 다에서 야생형보다 31-bp 짧아진 단편을 갖는 것으로 검출되었다.

또한, Ccny 녹아웃 마우스에서 CCNY 단백질의 완전한 결핍은 몇몇 기관(도 3D) 및 다수의 뇌 영역(도 3E)에서 확인되었다.

3-2. 카이닉산에 의한 뇌전증이 유도된 Ccny 녹아웃 마우스

Ccny 녹아웃 마우스에 카이닉산의 복강 내 주사에 의해 인간의 뇌전증을 모방한 발작 상태가 유도되었다. 이전 연구(E. Cho, et al, Neuroprotection by urokinase plasminogen activator in the hippocampus, Neurobiol Dis 46(1) (2012) 215-24.)에 근거하여, 3 개월된 암컷 C57BL/6J 생쥐에 카이닉산을 25 ~ 45 mg/kg 범위의 농도로 주사하고, 각 단계에 대해 정의된 특정 특성 행동에 따라 경증에서 중증의 상태로 6 단계로 분류된 뇌전증 발작 중증도를 평가하기 위해 120 분 동안 동물 행동을 모니터링하였다. 발작 유사 행동의 분류에 사용된 기준은 도 3F에 요약된 Racine(R.J. Racine, Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 32(3) (1972) 281-94.) 및 Klenerman et al(P. Klenerman et al, Mortality in patients with epilepsy: a study of patients in long term residential care, J Neurol Neurosurg Psychiatry 56(2) (1993) 149-52.)의 이전 연구에서 채택되었다. 동물 행동은 비디오 카메라로 기록하고, 뇌전증 발작 중증도의 행동 스코어링은 유전자형에 대해 모르는 실험자에 의해 수행하였다.

그 결과, 25 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여된 카이닉산은 발작 거동을 유발하지 않았거나 뇌전증 중증 단계 1(도 5D; 도 3F)에 해당하는 매우 경미한 발작을 유발했으며, 67 %의 발병률(도 5A, C, D) 및 0 %의 사망률을 나타내었다(도 5A, B, D). 또한, 카이닉산을 35, 40 또는 45 mg/kg의 투여량으로 투여하면 뇌전증 중증 단계 6(도 5A, B, D; 도 3F)에 상응하는 사망률을 유발하기 시작하며, 3 가지 용량 모두에서 100 %의 발병률(도 5C, D)과 35, 40 및 45 mg/kg 용량에서 각각 33 %, 67 % 및 100 %의 사망률을 나타내었다(도 5A, B, D). 위의 결과로부터 모든 동물이 30 mg/kg 용량에서 1 단계 이상에 해당하는 뇌전증 증상을 나타내고 사망은 초래하지 않기 때문에 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 민감성 연구에서 카이닉산의 용량을 30 mg/kg로 결정하였다.

흥분성 시냅스 전달에서 CCNY의 억제 역할뿐만 아니라 뇌전증과 관련된 CCNY-조절 DEG에서 더 큰 폴드 변화를 보여주는 RNA-seq 데이터의 결과로부터 예상한 바와 같이, Ccny 녹아웃 마우스는 30 mg/kg의 용량으로 카이닉산 주사 후 야생형 마우스(19 %)와 비교하여 증가된 사망률(43 %)을 나타내었다(도 3G, H). 더욱이, 대부분의 Ccny 녹아웃(100 %) 및 한배 새끼 야생형 마우스(91 %)는 어느 정도의 뇌전증 증상을 보였지만(도 3G, I), Ccny 녹아웃 마우스는 야생형 한배 새끼에 비해 주사 후 더 심한 뇌전증 증상을 겪었다(도 3J). 뇌전증 중증 단계 6, 사망을 나타낸 마우스를 배제하였을 때, Ccny 녹아웃 마우스는 야생형 한배 새끼와 비교하여 카이닉산-유발 뇌전증에 여전히 더 취약하였고(도 3K), 이는 CCNY가 카이닉산-유발 뇌전증에 대한 신경 보호 효과를 나타낸다는 것을 시사하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Mice displaying an enhanced susceptibility to kainic acid-induced epilepsy and uses thereof <130> KPA200512-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CCNY <400> 1 Met Gly Asn Thr Thr Ser Cys Cys Val Ser Ser Ser Pro Lys Leu Arg 1 5 10 15 Arg Asn Ala His Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Pro Asp Thr Asp Leu 20 25 30 Ser Arg Glu Asp Thr Gly Cys Asn Leu Gln His Ile Ser Asp Arg Glu 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Leu Asn Met Glu Phe Asn Pro Ser Asp His Pro Arg 50 55 60 Ala Ser Thr Ile Phe Leu Ser Lys Ser Gln Thr Asp Val Arg Glu Lys 65 70 75 80 Arg Lys Ser Leu Phe Ile Asn His His Pro Pro Gly Gln Thr Ser Arg 85 90 95 Lys Tyr Ser Ser Cys Ser Thr Ile Phe Leu Asp Asp Ser Thr Val Ser 100 105 110 Gln Pro Asn Leu Lys Tyr Thr Ile Lys Cys Val Ala Leu Ala Ile Tyr 115 120 125 Tyr His Ile Lys Asn Arg Asp Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu Asp Ile 130 135 140 Phe Asp Glu Asn Leu His Pro Leu Ser Lys Ser Glu Val Pro Pro Asp 145 150 155 160 Tyr Asp Lys His Asn Pro Glu Gln Lys Gln Ile Tyr Arg Phe Val Arg 165 170 175 Thr Leu Phe Ser Ala Ala Gln Leu Thr Ala Glu Cys Ala Ile Val Thr 180 185 190 Leu Val Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Thr Tyr Ala Glu Ile Asp Ile Cys 195 200 205 Pro Ala Asn Trp Lys Arg Ile Val Leu Gly Ala Ile Leu Leu Ala Ser 210 215 220 Lys Val Trp Asp Asp Gln Ala Val Trp Asn Val Asp Tyr Cys Gln Ile 225 230 235 240 Leu Lys Asp Ile Thr Val Glu Asp Met Asn Glu Leu Glu Arg Gln Phe 245 250 255 Leu Glu Leu Leu Gln Phe Asn Ile Asn Val Pro Ser Ser Val Tyr Ala 260 265 270 Lys Tyr Tyr Phe Asp Leu Arg Ser Leu Ala Glu Ala Asn Asn Leu Ser 275 280 285 Phe Pro Leu Glu Pro Leu Ser Arg Glu Arg Ala His Lys Leu Glu Ala 290 295 300 Ile Ser Arg Leu Cys Glu Asp Lys Tyr Lys Asp Leu Arg Lys Pro Met 305 310 315 320 Arg Lys Arg Ser Ala Ser Ala Asp Asn Leu Ile Leu Pro Arg Trp Ser 325 330 335 Pro Ala Ile Ile Ser 340 <210> 2 <211> 283 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CCNY <400> 2 atggggaaca caacttcgtg ctgcgtgtcg tccagcccca agctccggag gaatgcgcac 60 tcgcggctgg agtcctaccg cccggacacg gacctcagcc gtgaggacac tggctgcaat 120 ctgcagcaca tcagcgaccg ggaaaacatc gacggtgagc ggcgccggcc tgggcctcgg 180 cctatccctc tcctccctgc aggactcgga gccttgctgc tccgctgccc cgggctggac 240 tggcagggaa tggtggaaat tttgctagcc acggccgggg agg 283 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward <400> 3 acacggacct cagccgtgag ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse <400> 4 tccaccattc cctgccagtc ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal Reverse <400> 5 cgctcaccgt cgatgttttc cc 22

Claims

사이클린 Y(Cyclin Y, CCNY) 유전자가 녹아웃(knockout, KO)되고 카이닉산(kainic acid)-유발 뇌전증에 대한 민감성이 증가된, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스.
제1항에 있어서, 상기 뇌전증 모델 마우스는 카이닉산이 25 내지 30 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여되어 뇌전증이 유발된 것인, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스.
i) CCNY의 N-말단 영역을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(Single guide RNA, sgRNA) 및 Cas9 단백질의 혼합물을 세포 단계 배아의 세포질에 주입하는 단계; 및
ii) 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질의 혼합물이 주입된 배아를 배지에서 배양한 후 대리모 마우스로 배아를 옮기는 단계;를 포함하는, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 CCNY의 N-말단 영역을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기서열에서 140 내지 170번째 위치에 상응하는 염기를 포함하는 것인, 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스의 제조방법.
a) 카이닉산을 투여하여 뇌전증을 유발한 제1항의 카이닉산-유발 뇌전증 모델 마우스에 뇌전증의 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 후보물질 투여 후, 상기 뇌전증 모델 마우스의 뇌전증 증상을 측정하는 단계; 및
c) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 뇌전증 증상의 감소를 유발한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 뇌전증 예방제 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제5항에 있어서, 상기 단계 a)의 카이닉산은 25 내지 30 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여된 것인, 스크리닝 방법.
제5항에 있어서, 상기 단계 a)의 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 스크리닝 방법.