CN108728529B

CN108728529B - Znf770基因在制备诊治子痫前期的产品中的应用

Info

Publication number: CN108728529B
Application number: CN201810586612.1A
Authority: CN
Inventors: 孙耀兰; 张冬梅
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: CN108728529A

Abstract

本发明公开了ZNF770作为子痫前期的诊治靶标。据此可将ZNF770用于开发诊断子痫前期的产品、开发治疗子痫前期的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为子痫前期药物的开发提供新的药物靶点。

Description

ZNF770基因在制备诊治子痫前期的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及ZNF770基因在制备诊治子痫前期的产品中的应用。

背景技术

子痫前期是产科领域中引起母儿病率及死亡率增高的主要疾病之一，有明显的遗传倾向，病理生理变化涉及到多系统、多器官的病变，病因和发病机制至今仍未完全阐明，始终为产科研究的焦点。而基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，异常的代谢过程或病理变化，不管是由单基因还是由多基因体系控制，本质上都是基因差异表达所致，所以能调节血压、体液量、胎盘生长、血栓形成、血管重铸、血管内皮功能、脂类代谢、免疫及线粒体功能等的基因都可能是子痫前期的易感基因(汪希鹏，林其德.妊娠期高血压综合征易感基因的研究.中华妇产科杂志，2001,(36)4：248-251)，这些基因的表达异常是子痫前期发生及发展的根本原因，近年来，随着基础实验方法的飞速发展，特别是人类基因组计划的全面完成，人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移，寻找差异表达基因已成为分子生物学的研究热点之一(Gabrielson E,Berg K,Anbazhagan R,etal.Functional genomics,gene arrays,and the future of pathology.Mod Pathol,2001,(14)12:1294-1299)，分离、克隆不同组织或同一组织不同发育阶段差异表达的基因，对于了解疾病的分子机理均具有十分重要的意义，子痫前期病因及发病机制的研究重点也已从最初的临床资料总结及组织细胞学观察逐渐转变为探索疾病的易感基因并研究其表达情况。虽然目前己经发现许多子痫前期相关基因，如血管紧张素原(AGT)基因(Ward K,Hata A,Jeunemaitre X,et al.A molecular variant of angiotensiongen associatedwith preeclampsia.Nature Genet,1993,4:59-61.)、凝血酶原基因〔Kupferminc MJ,Eldor A,Steinman N,et al.Increased frequency of genetic thrombophilia inwomen with complications of pregnancy.N Engl J Ned,1999,340:9-13〕、肿瘤坏死因子a(TNF a)基因〔Rinehart BK,Terrone DA,Lagoo-Deenadayalan S,et al.Expressionof the placental cytokines tumor necrosis factor alpha,interleukin 1beta,andinterlukin 10 is increased in preeclampsia.Am J Obstet Gynecol,1999,181(4):915-920.]等，但因其发生、发展涉及到多基因的表达异常，故仍需做更深入地研究。

胎盘作为妊娠期的特殊器官，承担了未成熟胎儿几乎所有器官的功能，并可分泌多种激素、酶、细胞因子、生长因子等物质，协调母体内分泌、免疫和代谢功能，对维持正常妊娠有重要作用。胎盘缺血学说是子痫前期病因学说之一，正常妊娠时胎盘滋养细胞沿螺旋小动脉逆行浸润，逐渐取代血管内皮，使血管腔扩大、血流增加，这一过程称之为血管重铸，深度可达子宫肌层的内1/3。而子痫前期胎盘滋养细胞浸润能力下降，浸入仅达蜕膜段，使子宫螺旋小动脉生理重铸障碍，致胎盘缺血缺氧；血管内皮损伤学说是目前公认的子痫前期发病的中心环节，子痫前期患者胎盘分泌的缩血管物质及细胞毒性因子如内皮素(ET)，AGT、血栓烷A2，TNF a等增加，而舒血管物质如前列环素、一氧化氮(NO)等减少，均可加重机体血管内皮细胞的损伤；且临床证实胎儿胎盘娩出后，子痫前期的病情才可缓解甚至消失，均表明胎盘与子痫前期的发生及发展密不可分。本实验应用此技术通过胎盘组织基因表达产物(mRNA)的差异了解基因的表达情况，可直接从基因水平发现并克隆子痫前期患者与正常孕妇胎盘组织差异表达基因。不仅可以检测己知基因的差异，还可发现与子痫前期相关的新基因，为子痫前期的遗传学和易感基因的研究提供新的思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测ZNF770基因表达差异来实现子痫前期诊断的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过抑制ZNF770基因表达来治疗子痫前期的方法。

本发明的目的之三在于提供一种用于筛选子痫前期治疗药物的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于治疗子痫前期的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测ZNF770的试剂在制备诊断子痫前期的工具中的应用。

进一步，所述检测ZNF770的试剂包括检测ZNF770基因表达量的试剂。

更进一步，所述检测ZNF770的试剂包括能够定量ZNF770基因mRNA的试剂，和/或能够定量ZNF770蛋白的试剂。

本发明的定量ZNF770基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

所述能够定量ZNF770基因mRNA的试剂可以是ZNF770基因或转录本的特异性引物，也可以是ZNF770基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。

上面所述的ZNF770基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增ZNF770基因的引物。在本发明的的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的定量ZNF770蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量ZNF770蛋白的试剂包括特异性结合ZNF770蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量ZNF770蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ZNF770蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ZNF770蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

本发明的用于检测ZNF770基因表达量检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。

所述的样品可以是(但不限于)：组织、外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、尿液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

本发明还提供了一种用于诊断子痫前期的工具，所述工具能够检测ZNF770基因表达量。

进一步，所述工具包括能够定量ZNF770基因mRNA的试剂，和/或能够定量ZNF770蛋白的试剂。

通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。

进一步，所述能够定量ZNF770基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增ZNF770基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述用于诊断子痫前期的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ZNF770基因的异常与子痫前期的发生相关也属于使用了本发明的ZNF770的新用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测ZNF770基因表达的方法的说明书等。

本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于ZNF770基因或转录本的检测来诊断子痫前期的试剂均包含在本发明范围内。

本发明还提供了一种诊断子痫前期的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中ZNF770基因表达水平；

(3)将测得的ZNF770基因表达水平与受试者的疾病相关性关联起来。

(4)与正常对照相比，ZNF770基因表达水平在统计学上升高，表明受试者被判断患有子痫前期、或者判断受试者患有子痫前期的风险高。

本发明还提供了一种子痫前期的治疗方法，所述方法包括抑制ZNF770基因表达、或抑制ZNF770基因表达产物的活性。

本发明还提供了一种治疗子痫前期的候选药物的筛选方法，可以通过在对模型细胞添加测试药物后的某个时期测量ZNF770基因或者ZNF770蛋白的表达水平来测定候选药物改善预后的效果。更具体地说，当ZNF770基因或者ZNF770蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善子痫前期的治疗药物。

本发明还提供了一种治疗子痫前期的药物，所述药物包含抑制ZNF770的试剂。

本发明的抑制ZNF770的试剂不受限制，只要所述试剂能够抑制ZNF770或涉及ZNF770上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗子痫前期有效的药物即可。

本发明还提供了ZNF770基因或其表达产物在制备治疗子痫前期的药物中的应用。

进一步，所述药物包括针对ZNF770基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明的“ZNF770基因”(Chromosome 15,NC_000015.10(34978341..34988296,complement))序列可以NCBI数据库中进行查询。

在本发明的上下文中，“子痫前期诊断”包括判断受试者是否已经患有子痫前期、判断受试者是否存在患有子痫前期的风险、或者判断子痫前期患者复发。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现并证实ZNF770基因表达与子痫前期发生的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为子痫前期的诊断与治疗提供了新的途径。

附图说明

图1显示利用QPCR检测ZNF770基因在子痫前期患者胎盘组织与正常胎盘组织中的差异表达的统计图；

图2显示利用Western blot实验检测ZNF770蛋白在子痫前期患者胎盘组织与正常胎盘组织中的差异表达的统计图；

图3显示利用Western blot实验检测ZNF770基因表达抑制率的统计图；

图4显示利用CCK-8法检测ZNF770基因表达对细胞增殖能力影响的结果图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选子痫前期患者的胎盘组织中异常表达基因

1、组织收集

收集医院妇产科分娩的子痫前期的患者的胎盘组织共5例，选择同时期血压正常因社会因素或骨盆异常而手术终止妊娠的晚期妊娠孕妇的胎盘组织5例为正常对照组，两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，并根据孕早期B超数据严格核实孕周，计算妊娠天数，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。子痫前期的诊断和分度标准参照第七版全国高等医学院校教材妇产科学(乐杰主编)。

剖宫产术中胎盘娩出后保持无菌状态，立即于胎盘母面避开钙化处剪取胎盘组织大小约0.5cm x 0.5cm x 0.5cm，以无菌生理盐水反复清洗尽量去除血液，直至清洗液呈清亮后沥干生理盐水，将组织尽快剪碎，置于无菌冻存管内放入液氮罐冻存。

2、组织RNA提取

采用购自北京全式金生物技术有限公司的RNA提取试剂盒(Trans Zol ^TM Up PlusRNA Kit)提取组织样本RNA。具体步骤如下：

(1)将超低温冷冻的样品称量后，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨直至研磨成粉末状，将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，每50-100mg样品加入1mlTrans Zol ^TM Up用匀浆仪进行匀浆处理，或用枪反复吹吸混匀，室温静置5分钟。

(2)每使用1ml Trans Zol ^TM Up，加0.2ml氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育3分钟。

(3)10000×g 4℃离心15分钟。此时样品分成三层，无色水相(上层)，中间层，粉红色有机相(下层)。RNA在无色水相中，吸取无色水相层500μl液体。

(4)转移吸取的500μl无色的水相于新的离心管中，加入500μl的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。

(5)将700μl得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000×g室温离心30秒，弃掉流出液。

(6)加入500μl CB9，室温12000×g室温离心30秒，弃掉流出液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)加入500μl WB9(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，室温12000×g室温离心30秒，弃掉流出液

(9)重复步骤(8)一次。

(10)室温12000×g室温离心2分钟，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。

(11)将离心柱放入RNase-free Tube(试剂盒已配)中，加30μl RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1分钟。

(12)室温12000×g室温离心1分钟，洗脱RNA。

(13)将RNA置于-80℃冰箱保存。

3、提取好的RNA浓度与纯度的测定

使用美国Nano Drop公司的ND-1000仪器检测RNA的浓度与纯度。

使用紫外分光光度仪Nano Drop 1000，双击电脑屏幕上的Nano Drop图标，进入系统菜单；选择核酸测量选项后按照系统提示，在加样孔中加入2μl双蒸水；点击确定，以初始化系统；在加样孔加入2μl双蒸水，选择RNA项，点击Blank以测量系统背景。用后擦镜纸擦净双蒸水后点入待测RNA样品，点击Measure。读取数值并记录，RNA浓度(ng/μl)，此时务必需要注意A值260/280，如果数值介于1.8-2.0之间，说明RNA样品质量较好。将每个样本的RNA浓度标记完全后冻存于-70℃冰箱。

4、提取好的RNA完整性测定

琼脂糖凝胶检测RNA样本操作步骤：

1)电泳槽，制胶用具的清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)，水冲洗后用，3％H₂O₂灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1％(V/V)DEPC水冲洗，晾干备用。

2)制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有45ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10×TAE电泳缓冲液及终浓度为0.5μg/ml的溴化乙啶。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

3)加样：样本与6×电泳缓冲液混合后，加样于凝胶点样孔内。

4)电泳：打开电泳仪，稳压80V电泳。

5)电泳结束后(约30分钟)，紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照保存。

完整性测定通过琼脂糖凝胶电泳检测，如果可清晰看到28s rRNA、18s r RNA、5srRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。说明提取的总RNA完整性较好，RNA质量符合要求。

4、高通量转录组测序

(1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

(2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

(3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，与正常孕妇相比，子痫前期患者胎盘组织中高表达的基因为458个，低表达的基因为579个，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2大样本验证差异表达基因在转录水平上的表达

1、组织收集

按照实施例1的标准收集子痫前期患者的胎盘组织35例，正常孕妇的胎盘组织40例。

2、组织RNA提取与鉴定

步骤同实施例1。

3、引物的设计与制备

qRT-PCR检测ZNF770基因表达的引物序列以及qRT-PCR扩增内参GAPDH的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成，并经UCSC数据库的检索，将其序列信息录入NCBI软件设计引物，并在基因库内的blast进行确认正确无误。

ZNF770基因引物：

上游引物：5’-TCAATGTATGGAGTGTAT-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物5’-TGACCAGTATGAATAAGT-3’(SEQ ID NO.2)，

GAPDH基因引物：

上游引物：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCA-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’(SEQ ID NO.4)。

6、实时荧光定量cDNA逆转录检测步骤

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

7、PCR

(1)应用Bio-RAD实时荧光定量PCR仪器，按表1配制反应体系。

表1 PCR反应体系

组分	终浓度	体积
			cDNA		2.0μl
无RNA酶水		7.0μl
			上游引物(10μM)	0.2μM	0.4μl
下游引物(10μM)	0.2μM	0.4μl
			GoTaq○RqPCR Master Mix，2×	1×	10μl
CXR 100×	1×	0.2μl
			总体积		20μl

(2)采用下列qPCR反应参数进行：95℃预变性10min，随后，95℃变性15s，57℃退火、延伸1min，共40循环；然后，进行荧光信号的采集及产物溶解曲线的制作，每个样本3个重复，取其平均值。采用2^-△△Ct相对定量法分析ZNF770的表达水平，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值。计算方法为：ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)子痫前期患者胎盘组织实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)正常孕妇胎盘组织对照组，2^-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，实验数据分析由Bio-RAD分析软件完成。

5、统计学分析采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析，应用配对T检验判断子痫前期胎盘组织与正常孕妇胎盘组织样本中ZNF770的表达是否存在统计学意义上的差异。统计检验都为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

6、结果

与正常孕妇胎盘组织相比，35例子痫前期患者中32例患者的胎盘组织中ZNF770基因表达显著升高，差异具有统计学意义。统计结果如图1所示，与正常孕妇胎盘组织相比，子痫前期患者胎盘组织中ZNF770基因显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施例2大样本验证差异表达基因在蛋白水平上的表达

1、提取实施例2中组织的总蛋白

按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

2、电泳

以β-actin为内参。50μg总蛋白经SDS-PAGE分后，电转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×TBST室温轻摇封闭1h；分别加入ZNF770单抗和β-actin单抗，4℃过夜；1×TBST洗膜4次，加入二抗，室温孵育1h；1×TBST洗膜4次后，置于Super Signal化学发光试剂中反应2min，暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影。

3、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将ZNF770蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

与正常孕妇胎盘组织相比，35例子痫前期患者中32例患者的胎盘组织中ZNF770蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义。统计结果如图2所示，与正常孕妇胎盘组织相比，子痫前期患者胎盘组织中ZNF770蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施例3干扰ZNF770基因表达

1、干扰RNA设计合成

根据ZNF770基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。上海吉玛制药技术有限公司同时提供与ZNF770基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA-NC)。

siRNA-ZNF770：

正义链为5’-AAUAUUGCAAACAUAUGGCCU-3’(SEQ ID NO.5)；

反义链为5’-GCCAUAUGUUUGCAAUAUUUG-3’(SEQ ID NO.6)，

2、胎盘滋养层细胞的培养

JEG-3细胞用含有双抗和10％胎牛血清的DMEM高塘培养基置于37℃，5％CO₂的培养箱内培养，每隔24h换1次培养液，48h传代1次。取对数生长期的细胞进行后续实验。

3、细胞转染

采用脂质体Lipofectamine2000为转染试剂。实验分2组：阴性对照组(转染siRNA-NC)；实验组(转染siRNA-ZNF770)。取对数生长期的JEG-3细胞，接种于6孔细胞培养板。24h后细胞培养板覆盖率约为70％-80％。转染方式参照Lipofectamine2000说明书进行。

4、Western blot实验检测siRNA-ZNF770的干扰效率

1)蛋白样品制备

倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。每瓶细胞加3m1 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2-7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。按lml裂解液加10μ1PMSF(100mM)，摇匀置于冰上。每瓶细胞加400μ1含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至l.5m1离心管中于-20℃保存。

2)电泳

按照实施例2的步骤进行。

5、结果

如图3所示，与阴性对照组(转染siRNA-NC)相比，实验组(转染siRNA-ZNF770)细胞中ZNF770蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 ZNF770基因的表达对胎盘滋养层细胞增殖的影响

细胞增殖的检测采用CCK-8法

(1)按照实施例3的方法进行转染；

(2)转染24h后的JEG-3细胞，吸弃培养基，以0.25％胰蛋白酶消化细胞，以结晶紫染液计数细胞，以含0.5％FBS的DMEM/F12低血清培养基重悬细胞并调整细胞浓度为2x10⁴/ml；

(3)无菌条件下向新的96孔培养板中每孔加入细胞悬液100μl，即2x 10³个细胞，37℃，5％CO₂静置20h；

(4)分别向各孔中加入10μl CCK溶液，培养2h；

(5)450nm波长，紫外分光光度计测量各实验组吸光值。

结果：

结果如图4所示，与阴性对照组(转染siRNA-NC)相比，实验组(转染siRNA-ZNF770)细胞增殖受到抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> ZNF770基因在制备诊治子痫前期的产品中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaatgtatg gagtgtat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaccagtat gaataagt 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggagccaaa agggtca 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtccttcc acgataccaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauauugcaa acauauggcc u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccauauguu ugcaauauuu g 21

Claims

1.检测ZNF770基因mRNA或蛋白表达水平的试剂在制备子痫前期的诊断工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ZNF770基因mRNA表达水平的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增ZNF770基因的引物；所述检测ZNF770蛋白表达水平的试剂包括特异性结合ZNF770蛋白的抗体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。