JP2013529182A - 受精の予想及び促進 - Google Patents

Abstract

上首尾な妊娠の確率に関する女性の体外受精（ＩＶＦ）の結果、又は女性の受胎状態を、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）遺伝子のヌクレオチド分析又はＨＲＧのタンパク質分析に基づいて予想する。ＨＲＧのプロリンイソ型、又はそのアミノ酸フラグメントは、さらに、女性の妊娠の成功を増大させるのに用いることができる。

Description

本発明は、概ね受精に関し、特に受精の成功の確率を予想するための、及び上首尾な受精の確率を増大させるための技術に関する。

世界中で１２％を超える生殖人口が妊娠するのに困難を有し、不妊症に悩む女性の大多数は１５歳から４４歳の間である。不妊症はこれらの年齢の女性たちの間で最も一般的な医学的障害である。体外受精（ＩＶＦ）など、補助的な生殖技術がカップルの助けとなり得る。

ＩＶＦは、卵細胞が子宮外において体外で精子によって受精される過程である。ＩＶＦは補助的生殖技術の他の方法が失敗した場合の不妊における主要な処置である。この過程は、排卵の過程をホルモンによって制御し、女性の卵巣から卵子を取り出し、体液中又は培養培地中でこれらに精子を受精させて胚に成熟する接合体を形成させることを典型的に含んでいる。次いで、上首尾な妊娠を確立する目的で、形成した胚を患者の子宮に移植する。

妊娠率、即ち、ＩＶＦ後の妊娠に対する成功率はここ数年非常に上昇しているが、臨床試験によると、数回の試験の後には、先進国において最高７０％の平均妊娠率が可能であることが報告されている。この妊娠率をさらに増大させようと、この分野において多くの研究が費やされている。研究は今まで、いくつかの異なるホルモン物質が、例えば、胚着床率を改善し、流産率を下げることによって、妊娠率を増大させると考えられていることを示唆している。

別の技術が米国特許第６，６４９，３４４号に示されている。この特許文書は、哺乳動物における体外成熟（ＩＶＭ）及びその後のＩＶＦが可能である受精不可能な卵子の存在を示す予測マーカーに対するアッセイを開示している。このアッセイは、月経周期の間の様々な時間の血液試料中のインヒビンＡ又はエストラジオールの存在及び相対濃度の決定に基づくものである。

上首尾な妊娠を得る確率が高い、又は確率が低い患者の同定、特にＩＶＦを受けているカップルについての同定を可能にする技術、及び妊娠の確率を改善するための技術が依然として必要とされている。

目的は、上首尾な妊娠の確率が高い、又は低い対象の同定を可能にする技術を提供することである。

本発明の別の目的は、女性の上首尾な妊娠の確率を増大させるのに用いることができる技術を提供することである。

これら及び他の目的は、本明細書に開示する実施形態によって応じられる。

簡潔に述べると、一態様は、ＩＶＦの結果を予想する方法に関する。方法は、体液試料、組織試料、又は卵子試料などの、対象から得られた試料中のヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）のイソ型（単数若しくは複数）を決定することを含む。女性が妊娠する確率に関して対象に関与するＩＶＦの結果を、次いで、身体試料中に見出されるＨＲＧタンパク質のイソ型（単数又は複数）の決定に基づいて予想する。

別の一実施形態において、対象のＤＮＡを試料から抽出する。次いで、ＨＲＧのエキソン５の少なくとも一部分に対して一塩基多型遺伝子型解析を行う。ＩＶＦの結果を、遺伝子型解析からの結果に基づいて予想する。

より詳しくは、対象が、ＨＲＧ遺伝子のエキソン５におけるＳＮＰ多型についてＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であると決定された場合、上首尾な妊娠に関するＩＶＦの結果は非常に低いと予想される。Ｐｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体の対象はＩＶＦの上首尾な妊娠の確率が低いと予想され、Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体の対象はＩＶＦでの上首尾な妊娠の確率が比較的増大し、又はより高いと予想される。

他の態様は、女性の受胎状態を予想する方法に関する。方法は、次いで、女性から得られた身体試料中のＨＲＧのイソ型を決定すること、又は身体試料から抽出したＤＮＡに対してＨＲＧ遺伝子のエキソン５の少なくとも一部分に対してＳＮＰ遺伝子型解析を行うことを伴う。方法は、次いで、決定したＨＲＧイソ型（単数若しくは複数）に基づいて、又はＳＮＰ遺伝子型解析に基づいて、女性の受胎状態を予想する。

他の態様は、ＩＶＦを受けている女性の妊娠の成功を増大させることに関する。方法は、ＨＲＧのプロリンイソ型、又は全長のＨＲＧタンパク質のアミノ酸２０４位のプロリン残基を含むそのアミノ酸フラグメントを、体液に、又は体外で受精される、若しくは受精された卵子を含む培養培地に投与することを伴う。

ＨＲＧのプロリンイソ型、又は全長のＨＲＧタンパク質のアミノ酸２０４位のプロリン残基を含むそのアミノ酸フラグメントを、受胎促進薬として本明細書において用い、また膣用組成物において用いることもできる。

さらなる態様は、ＩＶＦを受けている女性など、女性の妊娠の成功を増大させる方法に関する。方法は、ＨＲＧのプロリンイソ型、又は全長のＨＲＧタンパク質のアミノ酸２０４位のプロリン残基を含むそのアミノ酸フラグメントを女性に投与することを含む。

本発明は、そのさらなる目的及び利点とともに、添付の図面と一緒に以下の記載を参照することによって最もよく理解され得る。

ＨＲＧの異なるイソ型がゲル中でどのように移動するかを示す、３人の異なる女性からの卵胞液に対するウエスタンブロットを示す図である。上／大きなバンドは対象の位置にプロリン／プロリンを有するイソ型に対応する。下／小さなバンドは対象の位置にセリン／セリンを有するタンパク質に対応するイソ型を示す。中央にローディングした試料は同じ位置にセリン／プロリンを有するヘテロ接合体の女性からのものである。プロリン／プロリンを有する女性は体外受精後に妊娠したが、他者は妊娠しなかった。 タンパク質レベルに対するＨＲＧの分析を含む、一実施形態によって体外受精の結果を予想する方法を示すフローチャートである。 遺伝子レベルに対するＨＲＧの分析を含む、別の一実施形態によって体外受精の結果を予想する方法を示すフローチャートである。 胚の免疫組織化学を示す図である。（Ａ〜Ｃ）６細胞胚（Ｄ〜Ｆ）胚盤胞。免疫組織化学を用いて、Ｄａｐｉ（青色）は全ての核の位置を示し、ＨＲＧの位置は赤色である。合わせた図はＤＡＰＩ及びＨＲＧと重複し、したがってＨＲＧあり及びなしの両方の核が胚盤胞において観察される。胚盤胞において、ＨＲＧは全ての細胞の細胞質及びいくつかの細胞の核において見られる。ＨＲＧは６細胞胚の核には見られない。 ＨＲＧが（Ａ）子宮内膜、（Ｂ）ファロピウス管、（Ｃ）子宮筋層、（Ｄ）胎盤において検出されたが、（Ｅ）陰性対照において検出されなかった、免疫組織学的染色を示す図である。略語は以下の通りである：ＳＴ＝間質細胞、ＬＥ＝内腔上皮、ＭＣ＝筋肉細胞、ＬＵ＝管腔、Ｖ＝血管。褐色の反応の出現は染色に陽性であることを示す。

本発明は概ね、受精能の予想及び受精の促進に関する。本発明の一態様は、体外受精（ＩＶＦ）、特にＩＶＦの間の胚の上首尾な着床を予想し、ＩＶＦでの上首尾な妊娠の確率を増大させるための技術に関する。他の態様は、女性の受胎状態を予想すること、及び妊娠の成功を増大させるための技術に関する。

本明細書に開示する実施形態は、受胎状態を予想し、ＩＶＦの成功を予想のために用いることができるプレディクターの発見に基づく。このプレディクターは、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）及びＨＲＧをコードする遺伝子である。

ＨＲＧは、フィブリノゲン、ヘパリン、及びトロンボスポンジンを含めた広範囲のリガンドに対して結合することが知られている豊富な多ドメインの血漿タンパク質である。ＨＲＧは、血管新生性及び抗血管新生性両方の性質を有する血管新生に関与する。ＨＲＧはトロンボスポンジンの抗血管新生効果を阻止することによって、且つ／又はプラスミノーゲン若しくはプラスミンに結合することによって、細胞の遊走及び浸潤の促進を助けることによって、前血管新生性であると考えられている。しかし、ＨＲＧの抗血管新生性の効果は、接着斑を標的とするシグナル伝達によって媒介され、それによって血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）誘導性の内皮細胞の運動性を中断することが示唆されている。別の抗血管新生性の性質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が細胞外マトリックスに対して、及び内皮細胞表面上に結合するのを防ぐことによって媒介されると考えられている。これは、それによって、血管新生性の成長因子が細胞外マトリックスから放出されるのを防ぎ、また抗血管新生シグナルを内皮細胞に送る。ＨＲＧは、繊維素溶解及び血液凝固、補体の活性化、並びに免疫複合体のクリアランスにも関与する。ＨＲＧは肝実質細胞中で生成され、血清中の遊離タンパク質として、及び血小板中の顆粒としての両方で輸送されることが示されている。

ＨＲＧ遺伝子は、ヒトにおける染色体３ｑ２７に局在する。ＨＲＧ遺伝子は、７個のエキソンと６個のイントロンを含んでいる。エキソン５は、当技術分野においてＣ／Ｔ ｒｓ９８９８と表され、プロリン（Ｐｒｏ）及びセリン（Ｓｅｒ）の多型を引き起こす一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでいる。この位置のセリンは、コンセンサスのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を導入する。Ｎ−グリコシル化部位の導入により、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に追加の炭水化物基の付加がもたらされる。グリコシル化の結果、分子量は、ＨＲＧのＳｅｒイソ型では、Ｐｒｏイソ型に比べてわずかに大きい。これは、対象からのＨＲＧの特定のイソ型はＨＲＧの分子量を分析することによって決定することができることを意味する。例えば、ウエスタンブロット分析を行う場合、それぞれ７５ｋＤａ（Ｐｒｏイソ型）及び７７ｋＤａ（Ｓｅｒイソ型）バンドとして現れる異なるＨＲＧイソ型間を区別することが可能である。

以下の配列（配列番号１及び配列番号２）は、ＨＲＧ遺伝子のエキソン５のヌクレオチド配列の一部分、及び対応するアミノ酸配列を示すものである。Ｃ／Ｔ ｒｓ９８９８多型は配列より明らかであり、関連した部位のプロリン（コドンＣＣＣを有する）又はセリン（コドンＴＣＣを有する）のいずれかをもたらす。
・・・ＧＴＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ［Ｃ／Ｔ］ＣＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＣ・・・
・・・Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ／Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ・・・

Ｈｅｒｍａｎｎらが著した文献において、ヒスチジンリッチ糖タンパク質のＰｒｏ１８６Ｓｅｒ多型は、ＥＣＴＩＭ ｓｔｕｄｙ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、１９９８年、７９巻（２）、３５９〜３６１頁において心筋梗塞に関係なく、ＨＲＧのこの多型は、関連するアミノ酸残基がＨＲＧタンパク質のアミノ酸番号１８６であることを示すＰｒｏ１８６Ｓｅｒと一般的に表される。しかし、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＮＣＢＩなどのタンパク質のデータベースは、多型に関連する位置として、代わりにＨＲＧのアミノ酸番号２０４、即ち、Ｐｒｏ２０４Ｓｅｒに言及している。このような違いの理由は、ＨＲＧタンパク質が、タンパク質から切断され得るシグナルペプチドを含んでいることである。シグナルペプチドを有するＨＲＧは、多型に関連する位置としてアミノ酸番号２０４を有し、シグナルペプチドのないＨＲＧにおける多型の位置はアミノ酸番号１８６である。しかし、これら全ての場合において、関連するＰｒｏ／Ｓｅｒアミノ酸及びＣＣＣ／ＴＣＣコドンは、それぞれ、上記に示した状況内に、又はＨＲＧタンパク質及びＨＲＧ遺伝子の遺伝子座に存在する。

ヒトの女性の妊娠の成功及び体外受精の成功と、ＨＲＧイソ型及びＨＲＧの上記に示した位置のＰｒｏ又はＳｅｒいずれかをコードするＨＲＧの遺伝子変異体との間には重要な関係が存在することを検証する研究が行われている。

以下において、Ｓｅｒイソ型の表現は、上記に提供するＨＲＧのアミノ酸配列の部分において示す位置のアミノ酸としてセリンを有するＨＲＧのイソ型を表すのに用いられ、Ｐｒｏイソ型は、この位置のアミノ酸番号として代わりにプロリンを有するＨＲＧイソ型を表す。

図２を参照すると、一態様はしたがって、上首尾又は上首尾でない妊娠の点から、女性の体外受精の成功を予想し、又は女性の体外受精の結果を予想する方法に関する。この方法は、ステップＳ１においてＩＶＦを受けているカップルにおける女性及び男性のうちの少なくとも１人からのＨＲＧタンパク質を含む身体試料を採取することを、任意選択によって含む。少なくとも検出できる量のＨＲＧを含むあらゆる身体試料を、この態様にしたがって用いることができる。これは、身体組織試料及び体液試料の両方とも用いることができることを意味する。体液試料は、典型的には身体組織試料よりも採取及び取扱いが容易であるので、一般的に好ましい。本態様にしたがって用いることができる、非限定的であるが好ましい体液試料は、卵胞液試料、血漿試料、及び血液試料である。

この態様によると、女性及び／又は男性から得た身体試料中に存在するＨＲＧのイソ型又はイソ型（複数）をステップＳ２において決定する。代替的に、又はＩＦＶを受けている女性及び女性の子宮内に着床させる少なくとも１個の胚を形成するために、体外で少なくとも１個の卵子を受精させる精子を提供している男性のうちの少なくとも１人から得た身体試料からのＨＲＧのイソ型を決定することに加えて、少なくとも１個の卵子のうちの卵子から得た試料をＨＲＧイソ型（単数又は複数）に関して調査することができる。このように、女性から身体試料を採取する代わりに、又は採取することに対する補足として、女性からの卵子の１個から得た試料を用いてもよく、又は得られる胚から試料を実際に得てもよい。卵子試料からのＨＲＧのイソ型の決定は、卵子が卵子の提供者に由来するものであり、少なくとも１個の受精卵（即ち、胚）が着床される女性に由来しない場合、特に適切である。

女性の体外受精の成功の推定、又は女性の体外受精の結果を、次いで、身体試料及び／又は卵子／胚試料中のＨＲＧのイソ型又はイソ型（複数）の決定に基づいて、ステップＳ３において予想する。体外受精の成功は、本明細書において、妊娠をもたらす体外受精としてみなされる。

試料を少なくとも女性又は卵子から採取する場合が好ましいが、女性又は卵子、及び男性の両方から採取するのが好ましい。或いは、試料を、ＩＶＦに関与し、体外で女性の卵子を受精するのに用いる精子を提供しているカップルの男性からのみ採取してもよい。

本明細書においてより詳しく論じる通り、Ｓｅｒイソ型についてホモ接合体である女性は、体外授精での上首尾の妊娠の確率が、非常に低く、ゼロに近い確率を有する。Ｓｅｒイソ型及びＰｒｏイソ型の両方を有する女性は、受胎及び妊娠をもたらす上首尾な体外受精のわずかに良好な確率を有するが、両者とも成功率は依然として低い。これは、Ｓｅｒイソ型を有する女性に比べて上首尾な体外受精の確率が著しく高い、Ｐｒｏイソ型についてホモ接合体である女性と比べるべきである。女性が妊娠するという点でＩＶＦの成功は、体外で卵子を受精させるのに用いられる精子を表す男性のＨＲＧイソ型にもよると予想されている。

本明細書でさらに論じる通り、胚もＨＲＧを生成し、胚からのＨＲＧは上首尾な妊娠の確率にとって重要であり得ると考えられている。上首尾な妊娠の確率はそれゆえ、胚のＨＲＧイソ型（単数又は複数）によるものであり、さらに卵子を提供する女性と精子を提供する男性との遺伝子的な構成によるものである。

好ましい一実施形態において、（身体）試料におけるイソ型の決定を、（身体）試料中のＨＲＧの分子量を推定することによって行う。２つのＨＲＧイソ型の間には、Ｓｅｒイソ型を有するＮ−グリコシル化部位の導入により、検出可能な分子量の違いが存在する。その結果、（体液）試料に適用することができ、ＨＲＧイソ型間（即ち、ウエスタンブロット分析から決定される分子量７５ｋＤａ対７７ｋＤａ）を識別することができる分子量を決定するあらゆる技術を、本実施形態にしたがって用いることができる。

簡単で、対費用効果が高く、迅速なこのような技術は、数時間以内の（身体）試料中のＨＲＧイソ型の決定を可能にするウエスタンブロットである。しかし、ウエスタンブロットは、用いることができる分子量決定技術の説明的な一例としてのみみなすべきである。

２つのＨＲＧイソ型は、分子量測定に基づいて、必ずしも決定し、同定しなくてもよい。代替の取組みにおいて、（身体）試料中の１つ又は両方のＨＲＧイソ型の存在を検出するのにＥＬＩＳＡ試験を用いることができる。次に、ＥＬＩＳＡ試験は、Ｓｅｒイソ型に対して特異的に結合するがＰｒｏイソ型に対して結合しない抗体、Ｐｒｏイソ型に対して特異的に結合するがＳｅｒイソ型に対して結合しない抗体、又は好ましくはＳｅｒイソ型に対して特異的に結合するがＰｒｏイソ型に結合しない抗体及びＰｒｏイソ型に対して特異的に結合するがＳｅｒイソ型に対して結合しない抗体に基づく。前二者の場合、単一のＥＬＩＳＡ試験だけを用いる必要がある。このように、ＥＬＩＳＡ試験がＳｅｒイソ型の存在を検証する場合、予想されるＩＶＦの成功は低く設定され、即ち、Ｓｅｒイソ型についてのホモ接合体又はヘテロ接合体いずれかに設定される。ＥＬＩＳＡ試験が抗体を用いてＳｅｒイソ型の存在を検出することができない場合、女性はＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であり、したがって、予想されるＩＶＦの成功は比較的高い。抗体が代わりにＰｒｏイソ型に対して特異的に結合し、ＥＬＩＳＡがいかなるＨＲＧの存在も検出しない場合、女性はＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であると決定され、したがってＩＶＦの成功に対して予想される確率は非常に低い。Ｐｒｏイソ型の検出は、女性が上首尾なＩＶＦの確率が高く（Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体）、又は上首尾なＩＶＦの確率が低いが非常に低くはない（Ｐｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体）ことを含意する。しかし、女性が、Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であるか、Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であるか、又はＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体であるかを検証するのに２つの異なるＥＬＩＳＡ試験を行うのが好ましい。

ＥＬＩＳＡ試験において用いられる２つの異なるＨＲＧイソ型に対するモノクローナル抗体は、例えば、当技術分野においてよく知られている技術にしたがって製造することができる。簡潔に述べると、モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を所望の抗原で免疫化したマウスからの脾臓細胞と融合することによって作成されるのが典型的である。しかし、最近の進歩によりウサギＢ細胞の使用が可能になっている。

当技術分野において知られている抗体を生成するための他の技術も代替的に用いることができる。

実際、特定のＨＲＧイソ型の存在を検証するためにタンパク質診断において用いることができるあらゆる分析を、本発明にしたがって用いることができる。

（身体）試料中のＨＲＧイソ型を決定するための分子量決定方法を利用する場合、方法は、好ましくは、ＨＲＧの７５ｋＤａ及び７７ｋＤａイソ型の少なくとも１つの存在を決定することを伴う。以下において、７５ｋＤａイソ型は、ウエスタンブロットによって決定して分子量７５ｋＤａを有し、Ｐｒｏイソ型に対応するＨＲＧイソ型を表す。同様に、７７ｋＤａイソ型は、ウエスタンブロットによって決定して分子量７７ｋＤａを有し、Ｓｅｒイソ型に対応するＨＲＧイソ型を表す。

次いで、ＩＶＦの成功の予想を、７５ｋＤａイソ型の存在、７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて、又は７５ｋＤａ及び７７ｋＤａイソ型両方の存在に基づいて行う。（身体）試料がＨＲＧの７７ｋＤａイソ型を含むことが決定したら、予想はＩＶＦの成功が低いことを予想することを伴う。さらに、（身体）試料が７５ｋＤａ及び７７ｋＤａイソ型の両方を含む場合、ＩＶＦの成功の確率は低いと決定され、（身体）試料が７７ｋＤａイソ型のみを含む場合、ＩＶＦの成功の確率は非常に低いと予想される。ＨＲＧの７５ｋＤａイソ型のみのそれぞれの（身体）試料を有する対象は、ＩＶＦ成功の確率が比較的高いと予想される。

ＩＶＦの成功に関して本明細書で用いられる、発現が低い、非常に低い、及び高いという表現は、女性の３つの異なるカテゴリー、即ち、Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体、Ｐｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体、及びＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体について、成功の確率がどのようであるかを規定する相対的な語として与えられるにすぎない。実験結果は２つの異なる試験において行われている。これら両方の試験において、Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体の女性は誰もＩＶＦから妊娠せず、それによってＩＶＦ成功の確率は非常に低いとみなされる。２つの試験においてＩＶＦを受けているＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体の女性の１７％及び３３％が妊娠し、Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体の女性の５７％及び７０％が妊娠した。

成功の確率が低いということはＩＶＦから妊娠する確率が平均より低いことをそれによってほのめかしており、成功の確率が高いということは、ヒト集団の平均よりも妊娠の確率が高いことをそれによって含意する。

ＩＶＦの成功の予想は、必ずしもタンパク質レベルに対するＨＲＧイソ型分析に基づいて行われなくてもよい。明らかに対照的に、ＤＮＡベースで分析を行う代わりにＳＮＰ遺伝子型解析をそれによって用いることができる。

図３を参照すると、別の一態様は、それによって、ステップＳ１１においてＩＶＦを受けている女性及び／又は男性の対象から任意選択によって身体試料を採取することによって、女性のＩＶＦの成功を予想し、又は女性に対するＩＶＦの結果を予想する方法に関する。身体試料は、身体組織試料、又は体液試料であってよい。実際に、対象のＤＮＡを含む対象からのあらゆる身体試料を本方法において用いることができる。身体試料は、血漿試料又は血液試料など、体液の試料が好ましい。或いは、又は更に、体外で受精させた１個又は複数の卵子から得た試料を用いることができる。

対象のＤＮＡを、当技術分野においてよく知られている技術を用いて（身体）試料から、ステップＳ１１において抽出する。（身体）試料からＤＮＡを抽出する非限定的な例は、Ｑｉａｇｅｎが提供するＤＮＡ抽出キットを用いることである。

次いで、ＳＮＰ遺伝子型解析を、ステップ１２において、ステップＳ１１において抽出したＤＮＡを用いて、ＨＲＧのエキソン５の少なくとも一部分に対して行う。ＳＮＰ遺伝子型解析は、特に、ＨＲＧ遺伝子のエキソン５に存在するＣ／Ｔ ｒｓ９８９８多型に関してＨＲＧの特定のヌクレオチド配列を検証する。

ＩＶＦを受けている女性に対する、ＩＶＦの成功及びＩＶＦの結果、即ち、妊娠する確率を、ステップＳ１３におけるＳＮＰ遺伝子型解析に基づいて予想する。

図２に関連して上記で論じ、タンパク質レベルに対して行った方法と同様に、上記に開示したヌクレオチドベースの分析を、女性、男性、又はＩＶＦに関してカップルとなった女性及び男性の両方に対して行うことができる。更に、又は或いは、ヌクレオチドベースの分析を、卵子、又は受精後に得られた胚について行うことができる。

当技術分野においてよく知られている通り、ＳＮＰ遺伝子型解析は、特定の遺伝子座の単一の塩基対の変異を決定することができる技術に関する。対象が、ＨＲＧの関連する位置でプロリン又はセリンについてヘテロ接合体であるか、又はホモ接合体であるかを決定するために、様々な技術を用いてＳＮＰ遺伝子型解析を行うことができる。用いることができる非限定的な技術は以下のものを含むことができる。

動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）及び分子ビーコンは、特異的に構築された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブによって、ＳＮＰ検出において用いられる。分子ビーコンが野生型対立遺伝子に適合するようにデザインされ（．．．ＡＡＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣ．．．）、別のものが対立遺伝子の変異体に適合するようにデザインされる場合（．．．ＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣ．．．）、この２つを個体の遺伝子型を同定するのに用いることができる。アッセイの間に第１のプローブのフルオロフォアの波長のみが検出された場合、対象は野生型についてホモ接合体である。第２のプローブの波長のみが検出された場合、対象は変異体の対立遺伝子についてホモ接合体である。最後に、両方の波長が検出された場合、対象はＳｅｒ／Ｐｒｏヘテロ接合体である。

用いることができるさらなる技術には、小型のチップ上にプローブが配列されているＳＮＰマイクロアレイが含まれる。

制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＰＣＲベースの方法、例えば、テトラ−プライマーＡＲＭＳ−ＰＣＲ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）ベースの方法、プライマー伸長法、ＳＮＰ遺伝子型解析のためのＴａｑｍａｎアッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイを含めた、酵素ベースの方法も用いることができる。さらなる技術には、一本鎖立体配座多型、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、高分解能融解分析、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって販売されているＳＮＰｌｅｘが含まれる。

ＳＮＰ遺伝子型解析は、対象のＨＲＧ対立遺伝子を決定するために行われる。これは、対象が、ヌクレオチドシトシン（Ｃ）との対立遺伝子を有してプロリンをコードするコドンＣＣＣを形成するか、又はＣの代わりにヌクレオチドチミン（Ｔ）との対立遺伝子を有してプロリンの代わりにセリンをコードするコドンＴＣＣを形成するかを検証するために、ＳＮＰ遺伝子型解析を行うことを意味する。上記で徹底的に論じた通り、Ｔ対立遺伝子についてホモ接合体である女性は、上首尾なＩＶＦの確率は非常に低く、Ｃ／Ｔへテロ接合体の女性は上首尾なＩＶＦの確率は低く、Ｃ／Ｃホモ接合体の女性は上首尾なＩＶＦの確率は比較的高い。

ＨＲＧのエキソン５、又はＨＲＧ遺伝子における関連の対立遺伝子の遺伝子座を含むエキソン５の少なくとも部分の配列決定を行うことも可能である。次いで、決定したヌクレオチド配列を用いて、対象がＴ対立遺伝子についてホモ接合体であるか、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合体であるか、又はヘテロ接合体であるか、即ち、染色体３の１つに対する遺伝子座上にＴ対立遺伝子を含み、他の染色体３の遺伝子座上にＣ対立遺伝子を含むか否かを結論づける。

ＨＲＧは、ＩＶＦにおける妊娠の結果のマーカー又はプレディクターだけではない。本明細書に提示する実験データは、ＨＲＧを、一般的な女性の受胎状態を予想するために用いるマーカー又はプレディクターとして用いることができることを更に支持している。次いで、方法は、一態様において、女性から得た身体試料中のＨＲＧのイソ型を決定することを伴う。身体試料は、先に論じたあらゆる身体試料であってよい。女性の受胎状態を、次いで、決定したＨＲＧイソ型に基づいて予想する。次いで、ＨＲＧイソ型を利用して、女性に流産の確率の増大をもたらす受胎状態の異常又は障害を有する危険性があるか否かを予想することができる。例えば、ＨＲＧの７７ｋＤａイソ型のみの存在は、妊娠初期において、反復性の流産又は反復性の妊娠損失（ＲＰＬ）とも呼ばれる習慣性流産を有する群においてより一般的である。次いで、受胎状態の予想を、上記に記載した身体試料中のＨＲＧの７５ｋＤａ及び／又は７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて行うのが好ましい。特に、女性から得た身体試料中のＨＲＧの７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて、好ましくは、ＨＲＧの７７ｋＤａイソ型が存在するがＨＲＧの７５ｋＤａイソ型が非存在であることに基づいて、習慣性流産の危険性の増大を有するなど、女性が受胎状態の異常又は障害を有することを予想する。同様に、身体試料中のＨＲＧの７７ｋＤａイソ型が非存在であるがＨＲＧの７５ｋＤａイソ型が存在することに基づいて、女性が正常の受胎状態を有することを予想する。

本態様によるＨＲＧイソ型（単数又は複数）の決定を、先に記載したＩＶＦを受けている女性の妊娠の結果を予想するのと同じ方法において行うことができる。

女性の受胎状態の予想は、必ずしもＨＲＧのイソ型に基づいて行われなくてもよいが、代わりに女性から得た身体試料のＤＮＡを抽出することによって行うことができる。次いで、先に論じたＳＮＰ遺伝子型解析を、抽出したＤＮＡ上のＨＲＧ遺伝子のエキソン５の少なくとも一部分で行い、女性の受胎状態をＳＮＰ遺伝子型解析に基づいて予想する。

一実施形態において、エキソン５の少なくとも一部分のヌクレオチド配列がＣ／Ｔ ｒｓ９８９８多型のＴ対立遺伝子を有し、特にＴ対立遺伝子についてホモ接合体である場合、女性は、習慣性流産の危険性の増大を有するなど、受胎状態の異常又は障害を有すると予想される。同様に、エキソン５の少なくとも一部分のヌクレオチド配列がＣ対立遺伝子を有し、好ましくはＣ／Ｔ ｒｓ９８９８多型のＣ対立遺伝子についてホモ接合体である場合、女性は、好ましくは、正常の受胎状態を有すると予想される。

身体試料のＤＮＡの抽出、及びＳＮＰ遺伝子型解析の実施は、本明細書の先に記載した通りに行うことができる。

本明細書に提示する実験データは、ＨＲＧのＰｒｏイソ型の存在は、ＩＶＦによる上首尾な妊娠にとって不可欠であり、又は少なくとも非常に重要であると思われる。したがって、一態様は、ＩＶＦを受けている女性の妊娠の成功を増大させる方法に関する。次いで、方法は、ＨＲＧのＰｒｏイソ型又はそのアミノ酸フラグメント（ペプチド）を、１個又は複数の胚を得るために体外受精されている卵子又は卵子（複数）を含む培養培地に投与することを伴う。本明細書にさらに記載するアミノ酸フラグメントは、全長のＨＲＧタンパク質におけるアミノ酸番号２０４のプロリン残基を含んでいる。これは、培養培地へのＰｒｏイソ型の添加によって、体外授精の前、間、又は後に、卵子がそれによってＨＲＧのＰｒｏイソ型又はＰｒｏ含有アミノ酸フラグメントに曝露されることを意味する。好ましい一実施形態において、ＨＲＧのＰｒｏイソ型又はアミノ酸フラグメントを、卵子の体外受精の前及び／又は間に体液又は培養培地に添加するのが好ましい。この態様の特定の一実施形態において、それに卵子が由来する少なくとも１人の女性、及び精子を提供している男性が、Ｐｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体、又はＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であることが確認される。

ＨＲＧのＰｒｏイソ型、又はアミノ酸番号２０４のアミノ酸Ｐｒｏを含むＨＲＧタンパク質のフラグメントに対応するペプチドは、本発明の一実施形態において、受胎促進物質として用いられる。ペプチドが少なくとも１０個のアミノ酸を含んでいるのが好ましく、少なくとも１４個のアミノ酸を含んでいるのが好ましい。ＨＲＧの１４個のアミノ酸フラグメントを構成する、好ましいこのようなペプチド又はＰｒｏ含有アミノ酸フラグメントの一実施形態は、Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号９）である。このペプチド配列において、ＨＲＧにおけるアミノ酸番号２０４のプロリンに対応する関連のプロリン残基を太字で印す。

さらなる実施形態において、ペプチドは好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、例えば、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、又はより好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸を含んでいる。ペプチドは、好ましくは、ＨＲＧタンパク質のフラグメントと同じアミノ酸配列を有し、２０４位にアミノ酸Ｐｒｏを含んでいる。プロリン残基がペプチドの中央にあるのが好ましい。ペプチドは、必ずしもＨＲＧタンパク質の対応する部分に１００％の相同性を有していなくてよい。本実施形態は、ＨＲＧタンパク質に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有するペプチドも含んでいる。しかし、ペプチドは、１個又は数個の他のアミノ酸がＨＲＧタンパク質のアミノ酸配列と異なることがあっても、好ましくはペプチド配列の中央付近にプロリンを含んでいる。

アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号７）を有するペプチドは試験されており、本実施形態にしたがって受胎促進薬として用いられ得る。

一態様は、受胎促進薬の製造において用いるための、上記で規定したペプチドを含む分子に関する。分子は、好ましくは、配列番号９若しくは配列番号７において規定したペプチドであり、又は配列番号９若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでいる。特定の一実施形態において、分子は、上記で言及したシグナルペプチドを含むＨＲＧのプロリンイソ型、又はシグナルペプチドのないＨＲＧのプロリンイソ型のいずれかの、ＨＲＧのプロリンイソ型である。

さらなる関連の一態様は、上記で言及した分子を女性に投与することを含む、女性の妊娠の成功を増大し、又は受精能を促進する方法である。方法が、配列番号９若しくは配列番号７において規定した、又は配列番号９若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含む分子を女性に投与することを含むのが好ましい。特定の一実施形態において、分子はＨＲＧのプロリンイソ型である（シグナルペプチド有、又はなしのいずれか）。

女性がＩＦＶを受けている場合は女性の子宮内に胚を着床させる前、間、及び／又は後に、分子を投与することができる。特定の一実施形態において、女性の子宮内に受精した接合体を着床させる少なくとも前に、女性に分子を投与するように意図するのが好ましい。投与が、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子を、胚の着床前に女性の子宮内膜中に注射することによって行われるのが好ましい。代替の、又は更なる投与部位は、頸部によって子宮腔中であってよい。この態様は、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子の、卵子／胚を含む培地への投与と組み合わせることもできる。

特定の一実施形態において、Ｐｒｏイソ型などの分子の投与は、上記に記載した通り、女性及び体外で女性の少なくとも１個の卵子を受精させるために精子を提供している男性のうちの少なくとも１人が、ＨＲＧのセリンイソ型に対して、ヘテロ接合体又は好ましくはホモ接合体である場合、特に有効である。

分子、即ち、ペプチド又はＨＲＧのＰｒｏイソ型が、ペプチド又はＨＲＧのＰｒｏイソ型、及び薬学的に許容される担体又は膣内投与に適用できる賦形剤の少なくとも１つを含む膣用組成物として提供されるのが好ましい。

膣用の錠剤、硬及び軟ゼラチンカプセル剤、クリーム剤、ゲル剤、坐剤、膣坐剤、泡沫剤、軟膏剤、フィルム剤、タンポン、膣リング、洗浄剤、及び液剤を含めた数種の製剤が、一般に、膣内投与に利用可能である。製剤は、膣用カプセル剤、錠剤、若しくは挿入剤、膣用ゲル若しくはクリーム剤の形態であるか、膣用溶液の形態であることが有利である。

適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤の例は、Ｇａｒｇら、膣用製剤のための医薬品賦形剤大要（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｖａｇｉｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２００１年、１４〜２４頁において列挙された賦形剤から選択することができる。

ＨＲＧを生成するための胚をスクリーニングすることもまた、又は代替として可能であってよい。胚によって生成される特定のイソ型（単数又は複数）を、次いで、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子が、胚を含む体液若しくは培養培地中に投与し、且つ／又は胚を着床させる女性に投与するべきかを規定する。このように、胚が、ＨＲＧのＳｅｒイソ型を単独で生成するか、Ｐｒｏイソ型と一緒に生成するかのいずれかの場合、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子の、培養培地及び／又は女性に対する投与を開始しなければならない。

これらの態様において用いられるＨＲＧのＰｒｏイソ型が、ヒトＨＲＧのＰｒｏイソ型であるのが好ましく、組換えヒトＨＲＧのＰｒｏイソ型であるのがより好ましい。

培地に加えられ、又は女性に投与される、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子の濃度は、ヒト女性集団における天然のＨＲＧの濃度範囲であると選択することができる。この濃度範囲は、当技術分野においてよく知られている技術を用いて、当業者が無作為的に決定することができる。

更なる一態様は、医薬又は薬物として、治療において用いるための、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子にも関する。特定の一態様は、特に体外受精を受けている女性の、特に女性及び／又は精子を提供している男性がＨＲＧのＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体又はＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体である場合、女性の妊娠の成功の増大において用いるための、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子に関する。更なる特定の一実施形態は、このような女性の妊娠の成功を増大させるための薬物を製造するための、ＨＲＧのＰｒｏイソ型などの分子の使用に関する。

受精能／不妊におけるＨＲＧの重要性を分析するために、Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ａｋａｄｅｍｉｓｋａ ｓｊｕｋｈｕｓｅｔ、Ｕｐｐｓａｌａに通所していた女性２４人に、試験に加入するよう求めた。卵巣及び血漿から卵胞液を収集し、凍結させた。ウエスタンブロットを行い、本発明者らは、分子量７５ｋＤａ及び７７ｋＤａに対応する全長のＨＲＧの２つのイソ型を見出した。分析した試料から、４人の女性が、ゲル上の分子量７７ｋＤａに１本のバンドのみを有するＳｅｒ／Ｓｅｒのホモ接合体キャリアであると思われた。６人の女性が、ゲル上に２本のバンド（プロリン／セリン）を有するヘテロ接合体キャリアであり、１４人の女性は少量のタンパク質を有するにすぎず、彼女たちはプロリン／プロリンについてのホモ接合体であることを示していた。

試験は、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｕｐｐｓａｌａによって認可されており、試験に加入した各患者からインフォームドコンセントを得た。参加した患者に支払いはなされなかった。試験患者は全て、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ，Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ウプサラ、スウェーデンに含まれていた。

十分に制御された血管新生は、適切な胚の着床、胚形成、及び妊娠の発達にとって決定的である。メスの生殖器官及び初期胚における血管新生調節物質の存在及び分布のモニタリングは、受精能、胚形成、及び妊娠の分子的局面を広く理解するのに重要である。ＨＲＧは血管新生に関与する糖タンパク質である。メスの生殖器官又は胚におけるＨＲＧの存在は、以前には研究されていなかった。卵胞液、培養培地、及び胚は、ＩＶＦを受けている患者から入手した。生殖器内部及び胎盤からの生検は外科手術時に収集した。ＨＲＧの存在は免疫組織化学及びウエスタンブロットによって調査した。ＰＣＲを用いて、組織中の、又は胚によるＨＲＧ発現を決定した。本発明者らは、卵胞液、メスの生殖器官、及び胎盤における、並びに胚におけるＨＲＧを同定した。さらに、ＨＲＧの発現は胚盤胞において観察した。このように、ＨＧＦの血管新生性の性質は受精能に影響を及ぼすと思われる。

卵胞液、培養培地、及び胚の収集
卵胞液、培養培地、及び胚を、ＩＶＦのために制御された卵巣の過剰刺激を受けているカップルから収集した。血漿試料を、卵母細胞の収集と同じ日に採取した。卵母細胞の収集時、卵胞液を５０ｍｌ遠心管（Ｆａｌｃｏｎ、ＮＪ、米国）中に収集し、各患者から別々にプールした。血液のコンタミネーションを避けるよう、注意を払った。試料を−２０℃で一時的に凍結し、−７０℃のフリーザーに毎週移動した。

胚の培養に用いた培地（ＣＣＭ、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、スウェーデン）を、試料４本中にプールした。試料３本は、それぞれ５日目、６日目、又は７日目まで培養した胚からの培地を含んでいた。これらの試料には、発生が遅い胚でさえも増殖した培地が含まれていた。第４の試料は、もっぱら胚盤胞からプールした培地であった。各試料において、６組から１０組のカップルに由来する胚から培地をプールした。培地を１週間、−２０℃で凍結した。

ヒト着床前胚は、２日目又は３日目には胚移植又は凍結保存に十分な量ではなかったが、ルーチンのプロトコールにしたがって培地中（Ｇ−１（商標）ＰＬＵＳ／Ｇ−２（商標）ＰＬＵＳ、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、スウェーデン）で培養した。これらを、２細胞期から胚盤胞の孵化までの様々な段階で回収し、免疫組織化学に用いた。

子宮からのファロピウス管、子宮内膜、胎盤、及び子宮筋層からの生検の収集
腹腔鏡による不妊手術時、掻爬術によって収集したファロピウス管及び子宮内膜の生検を、健常メス志願者から集めた。用いたファロピウス管は、卵胞中、排卵後、及び月経周期の黄体期におけるものであった。子宮内膜試料は、排卵６日後に採取した。子宮筋層の生検及び胎盤の試料は、正常な、健常の妊娠時に行われた帝王切開直後に収集した。組織試料を生理学的食塩水溶液（ＮａＣｌ９ｍｇ／ｍｌ）中ですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中で最高２４時間固定し、ルーチン手順にしたがってパラフィンワックス中に包埋するまで数週間７０％エタノール中に貯蔵した。

卵胞液のウエスタンブロット
試料を、４〜１２％勾配のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥ（ＮＰ０３２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、米国）を用いて分離し、還元条件に対して市販の還元剤（ＮＰ０００４、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、米国）を加えた。分離したタンパク質試料を、低バックグラウンドの蛍光に対して最適化したＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬメンブレン（ＩＰＦＬ０００１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ、米国）に移し、ブロッキングバッファー（９２７−４００００、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）とインキュベートした。ウエスタンブロットを、ＨＲＧのＨｉｓ／Ｐｒｏドメインに対する抗ＨＲＧ抗体（ＨＲＧ−０１１９、Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で行った。免疫反応性の部位を、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外画像化システム（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ）を用いて、蛍光標識した抗ウサギＩＲＤｙｅ８００抗体（６１１−７３２−１２７／Ｒｏｃｋｌａｎｄ、米国）によって検出した。

分子量７５ｋＤａ及び７７ｋＤａを有するバンドに対応する、全長のＨＲＧの２つのイソ型を、ウエスタンブロット分析において検出した、図１を参照されたい。女性２４人からの卵胞液試料中、４人が単一（Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体）の７７ｋＤａのバンドを有し、６人が二重（Ｐｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体）のバンドを有し、１４人が単一（Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体）の７５ｋＤａバンドを有した。この集団の合計のＳｅｒ対立遺伝子の頻度は、したがって０．２９である。

ＩＶＦを受けている女性２４人中、９人が妊娠した。Ｓｅｒ対立遺伝子の頻度は、これら妊婦の中で著しく低かった。女性１人だけがＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体であり、他の８人の妊婦はＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であった。これは、Ｓｅｒ対立遺伝子の頻度が０．０６にすぎないことを含意する。さらに、単一のＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体女性の妊娠は、胎児が致死的な奇形を有していたため中止された。

ＩＶＦ処置をし、妊娠しなかった女性１５人中４人はＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であり、６人がＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体であり、５人だけがＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であった。これによりＳｅｒ対立遺伝子の頻度は０．４３となる。妊娠した群と妊娠しなかった群との間の差は著しい。また、Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体及びＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体の群と、Ｐｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体の群との間の差も著しい。

以下の表１は、ＩＶＦを受けている女性２４人からの卵胞液からのＨＲＧにおける遺伝的変異に対するウエスタンブロットデータの概要である。

培養培地及び血漿に対するＥＬＩＳＡ
ＰＶＣ製マイクロタイタープレートのウエルを、重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中ポリクローナルＨＲＧ捕捉抗体（Ｈ００００３２７３−Ｂ０１Ｐ、ＡｂＮｏｖａ、米国）で３７℃で１時間コーティングし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）を用いて洗浄ステップを２回続けた。５％ＢＳＡを含むブロッキングバッファーを３７℃で１時間加え、ＴＢＳを用いて洗浄ステップを更に２回続けた。試料を、３７℃で４５分間インキュベートし、次いで４回洗浄した。検出用に、第２の抗体（ＨＲＧ−０１１９、Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を３７℃で１時間加え、次いで、洗浄ステップを４回続けた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＡ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベートを行い、洗浄し、次いで、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中ストレプトアビジンコンジュゲートしたＨＲＰを加えた。ＨＲＧのレベルを、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン）含有基質及び停止溶液（２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を加えた後、光学密度４５０ｎｍで分析した。各試験は純粋ＨＲＧでの検量線を含んでいた。

ＥＬＩＳＡを培養培地に対して行って、ＨＲＧがヒト胚によって分泌されるか否かを分析した。この培養培地は胚盤胞を増殖させるのに用いた。各試料中にＨＲＧが検出された、表２を参照されたい。胚の培養に用いなかった培地は陰性対照として用い、検出できるレベルのＨＲＧを含んでいなかった。

胚の免疫組織化学染色
胚を培養培地から速やかに移し、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）３ｍｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で簡単に洗浄し、次いで、室温で１５分間、ＰＢＳ中２．５％パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、胚を、３０分間、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳ／ＰＶＰバッファー中透過処理した。その後、胚を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳブロッキングバッファー中に１５分間配置した。１次抗体（ＨＲＧ−０１１９、Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）をブロッキングバッファー中に加えた。胚を４℃で一夜インキュベートし、次いで、ブロッキングバッファー中３回各１５分間洗浄してあらゆる非結合の１次抗体を除去した。２次抗体である、ヤギ抗ウサギにコンジュゲートしたＡｌｅｘａ５６８（Ａ１１０７９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）をブロッキングバッファー中で希釈し、室温の暗所で６０分間、胚に適用した。陰性対照には、ブロッキングバッファー中の１次抗体又は２次抗体を省略した。インキュベート後、胚を、一連の２５％、５０％、７５％、及び１００％ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（ＤＡＰＩ有）によって簡単に洗浄し、次いで、スライドガラス上、カバーガラス下のアンチフェード（ａｎｔｉｆａｄｅ）媒体中に搭載した。染色された胚が、蛍光レンズ及び好適なフィルタを装備した共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で見られた。

免疫組織化学的染色を、着床前胚におけるＨＲＧの存在、局在、及び強度を試験するために行った、図４を参照されたい。ＨＲＧは、４細胞期から胚盤胞孵化期を通した発生の全段階に存在した。ＨＲＧは、発生段階に関係なく、全ての着床前胚における全細胞における細胞質中に検出された。しかし、ＨＲＧに対する染色では、卵割初期の胚の数個の核において同定されたにすぎなかったが（４〜８細胞期の胚の２５％）、後期には、ＨＲＧは核中により一般的であった（胚盤胞の９４％）。どの胚も全ての細胞の核中にＨＲＧを表さなかった、以下の表３を参照されたい。試験時、ＨＲＧは自己蛍光性であったが、その内在性のシグナルはバックグラウンドの蛍光より強力であることが発見され、明らかに区別できる差があったことを意味していた。

胚に対するＰＣＲ
以下の修飾を有するＣＴ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ ＩＮＣ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）に対するＴａｑｍａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｃｅｌｌｓを用いて８個の胚盤胞に対するＰＣＲを行った：増幅前ステップ及び増幅ステップを、組織に対するものと同じ増幅配列を用いて行った（以下を参照されたい）。増幅ステップにおいてＳＹＢＲグリーンを用いた。蛍光データを全ての伸長ステップ時に測定することによって獲得し、蛍光強度対サイクル数のプロットとして表した。サイクルの閾値（Ｃｔ）を用いてＨＲＧの存在を決定した。

ＨＲＧが胚によって生成されるか否かを試験するために、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。ＨＲＧに対するＣＴの平均値は３５．８５±１．８９であり、ＧＡＰＤＨに対して２６．２６±０．７６であり、これはＨＲＧ ｍＲＮＡに対する検出限界に近い。

組織の免疫組織化学的染色
パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した組織の切片（５μｍ）（ファロピウス管、子宮内膜、胎盤、又は子宮筋層）をキシレン中で脱パラフィンし、段階的なエタノール（９９．５％、１×３分、９５％２×３分、７０％２×３分）によって脱水し、脱イオン水中、その後ＴＢＳ、ｐＨ７．４中洗浄した。これらのスライドをクエン酸バッファー中でインキュベートし、６５０Ｗのマイクロウエーブオーブン中１０分間加熱した。非特異的な結合を、ＴＢＳ中５％ＢＳＡで１時間インキュベートすることによってブロックした。次いで、切片を、アフィニティー精製したウサギ抗ＨＲＧ抗体（ＨＲＧ−０１１９、Ｌｅｎａ Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）と、加湿チャンバー中４℃で一夜インキュベートした。切片を０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳバッファー中洗浄した。ビオチン化抗ウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を、室温で１時間加えた。切片を洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）を加えた。すすいだ後、切片を、液体ＤＡＢ基質キット（ＤＡＫＯ、スウェーデン）を用いてクロモゲン溶液に曝露し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。褐色の反応生成物の出現が光学顕微鏡によって観察された。陰性対照染色を、１次抗体又は２次抗体いずれかを省略することによって行った。非特異的な染色は検出されなかった。

メス生殖器官中のＨＲＧの存在を、免疫組織化学染色によって決定した。ＨＲＧは、殆んどの細胞型においてヒト子宮内膜からの生検において（図５Ａを参照されたい）、及びファロピウス管において（図５Ｂを参照されたい）検出された。ＨＲＧはさらに、子宮筋細胞において（図５Ｃを参照されたい）、並びに胎盤組織における内皮、間質、及びトロポブラストにおいて（図５Ｄを参照されたい）見出された。

ＲＮＡの調製及びｃＤＮＡの合成
子宮内膜、ファロピウス管、子宮筋層、及び胎盤の生検からの試料を、リアルタイムＰＣＲ分析に用いた。リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ用の凍結試料を溶解バッファー中ホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの濃度及び純度を、Ａｇｕｉｌｌｅｎｔ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）を用いて測定した。この試験に含まれた全ての試料に対して＜７のＲＩＮ値が得られた。子宮内膜組織試料からのｃＤＮＡの合成を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を用いて行った。１反応あたり組織試料からの全ＲＮＡ２マイクログラムを、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。逆転写は製造元の指示にしたがって行った。

リアルタイムＰＣＲ
Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。増幅を検出するのにＳＹＢＲグリーンを用いた。反応混合物は、ｃＤＮＡ４ｎｇに相当する、１×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスのＲＴ反応混合物４μＬからなっており、プライマー濃度は２５０ｎＭであった。最終の反応体積は１５μＬであった。ｃＤＮＡを５０℃で２分間加熱し、９５℃で１０分間変性させた。この後に９５℃で１５秒間の変性、及び６５℃で１分間のプライマーのアニーリング／伸長の組合せが４５サイクル続いた。全ての伸長ステップ時に取った測定値によって蛍光データを獲得し、蛍光強度対サイクル数のプロットとして表した。各試料を２回ずつ測定し、標的の遺伝子を、内部対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化した。ＨＲＧに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ５’−ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＴＡ ＧＴＣ（配列番号３）及び３’−ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＧ（配列番号４）であり、ＧＡＰＤＨに対して５’−ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ Ｃ（配列番号５）及び３’−ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ（配列番号６）であった。増幅した生成物のサイズは、ＨＲＧでは９１６ｂｐ、ＧＡＰＤＨでは８０ｂｐであった。

ＰＣＲを行って、ＨＲＧがメス生殖器官及び胎盤において発現されるか否かを決定した。ファロピウス管、子宮内膜、胎盤、又は子宮筋層からの組織中にＨＲＧの発現は検出されなかった。肝臓のｍＲＮＡを陽性対照として用いて、上首尾であった。

本発明者らは、ＨＲＧが着床前胚中に存在し、胚が発生すると核中により頻繁に検出されることを免疫組織化学によって示している。さらに、本発明者らのＥＬＩＳＡ及びＰＣＲのデータは、胚がＨＲＧを生成し、分泌することを指摘している。本発明者らは、ＨＲＧが、胚が成長している培地中に、卵胞液中に、メスの生殖器官を通して、及び胎盤中に存在することも見出した。

卵胞液中に見出されるＨＲＧは、卵胞及び卵母細胞の発達における血管新生のプロセスを反映し得る。ヘパリン結合性の血管新生因子であるＦＧＦ及びＶＥＧＦは、排卵前卵胞によって生成されることが知られている。ＦＧＦ及びＶＥＧＦは、卵胞における血管新生のバランスの主要な調節因子であると仮定されている。ＨＲＧは、血管新生因子、抗血管新生因子、及びヘパリンと直接的及び間接的に相互作用し、卵胞の発達においておそらく重要であり得る。卵胞液中のＶＥＧＦが高レベルであることは、卵母細胞の質が劣ることに関連する。ＨＲＧがＶＥＧＦ又は他の血管新生因子に結合する場合、卵胞液中にＨＲＧが存在することは卵母細胞の発達においてやはり重要であり得る。

卵胞液中にＨＲＧを見出したことの他に、本発明者らは、免疫組織化学を用いることによって、ＨＲＧが胚中に見出されることを示している。ＨＲＧは、発達段階にかかわらず、全ての胚における全細胞質中に検出された。しかし、ＨＲＧは、４〜８細胞期の間の胚中よりも、胚の遺伝子が活性化される時期である胚盤胞の核中により一般的に見出された。更に、ＨＲＧは、同じ胚の全ての核中には決して見出されず、ある細胞によってのみＨＲＧがあり得ることを示唆している。ＨＲＧは、胚盤胞に比べて卵割初期の胚においておそらく異なる機能を有する。検出できるレベルのＨＲＧは、胚を培養するのに用いなかった培地中には存在しなかったので、免疫組織化学を用いて核中に見られたタンパク質は胚によって生成されたと示唆することができる。

これは、胚がＨＲＧを生成することを示す最初の試験である。このように、本発明者らは、ＨＲＧが、胚盤胞を増殖させた毎日交換される培養培地中の、胚盤胞におけるいくつかの細胞の核中に位置し、それが胚盤胞中のｍＲＮＡであることを示していることから、胚に対するＣＴ値が低いにもかかわらず胚はＨＲＧを生成すると、本発明者らは結論付ける。胚によって分泌される血管新生因子は、子宮内膜に対して着床に備えるようシグナルを送ることが示唆されている。胚によるＨＲＧの発現が胚と子宮内膜との間のこの複雑な情報伝達に関与するか否かを決定するために更なる研究が必要とされる。ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンは、十分に機能性である胎盤の発達に関連している。本発明者らが観察していることがこのプロセスの開始に関連する可能性があり得る。これは、ＨＲＧが、胎盤中のＨＲＧのレベルが不十分である結果として早期発症の子癇前症の病理に関与することを示す本発明者らの初期の結果によって支持されるものでもあり、Ｋａｒｅｈｅｄら、早発性子癇前症におけるフィブリノゲン及びヒスチジンリッチ糖タンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）、Ａｃｔａ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｓｃａｎｄ、８９巻（１）、１３１〜１３９頁を参照されたい。

本発明者らは、ＨＲＧが、ファロピウス管、子宮内膜、子宮筋層などのメス生殖器官の構造中に存在し、胎盤中にも存在することを示している。ＨＲＧは血漿中に存在するので、生殖器官に浸透することがあり、したがってこれらの組織中にＨＲＧが存在することは単なる偶然である可能性がある。しかし、他の血管新生因子が生殖器官内に存在し、受精及び着床において重要な役割を果たすことが知られているので、ＨＲＧが同様の役割を有すると考えてもよい。ファロピウス管分泌物中に存在する数々の異なる血管新生因子は卵母細胞の受精を助ける上で重要である。ＨＲＧは血管新生の制御において不可欠であることが知られているので、ファロピウス管及び子宮内膜中のＨＲＧの存在は、胚の成熟及び輸送に、並びに子宮内膜の着床の準備に必要とされ得る。

ウエスタンブロット試験からの結果を検証するために、ＨＲＧ遺伝子におけるＳｅｒ／Ｐｒｏ多型（ｒｓ９８９８）のＳＮＰ遺伝子型解析を、ＩＶＦを受けている更なる３７人の女性からの血漿試料に対して行った。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ
ゲノムＤＮＡを、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＳｗｅｄｅｎでＩＶＦ処置を受けている３７人の女性から採取した血液試料から調製した。女性を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙを用いて、ＨＲＧエキソン５におけるＣ／Ｔ ｒｓ９８９８に対して遺伝子型解析した。簡潔に述べると、ＰＣＲ反応を、９６ウエルプレート中、各反応に対して全体積２５μｌにおいて行った。各反応は、１×ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＣＲバッファー、ＲＯＸ受動的基準色素、ｄＮＴＰ、及びＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ）、１×ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ（対象の多型の配列を増幅するための配列特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマー、即ち、ＨＲＧエキソン５、対立遺伝子１の配列を検出するためのＶＩＣ（登録商標）色素、及び対立遺伝子２の配列を検出するためのＦＡＭ（商標）で標識されているＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ）、並びにゲノムＤＮＡ１０ｎｇから構成されていた。サイクル条件は、９５℃１０分間で開始し、その後、９２℃で１５秒、及び６０℃で１分を４０サイクルであった。リアルタイムの蛍光検出を行った。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各ウエルからのシグナルに基づいた蛍光（Ｒｎ）の値をプロットした。プロットした蛍光シグナルは、どの対立遺伝子が各試料中に存在したかを示していた。

ＩＶＦ処置１回又は２回後、１９人の女性が妊娠したが、３７人中１８人は妊娠しなかった。妊娠した女性１９人中５人がＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体であり、１４人がＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であった。ウエスタンブロット試験からの結果と一致して、Ｓｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体の女性は一人も妊娠しなかった。非妊娠の女性１８人中２人がＳｅｒ／Ｓｅｒホモ接合体であり、１０人がＰｒｏ／Ｓｅｒヘテロ接合体であり、６人がＰｒｏ／Ｐｒｏホモ接合体であった。ＨＲＧタンパク質中の、Ｐｒｏの代わりにＳｅｒのキャリアに関する群間の差は統計学的に有意である。

以下の表４は、ＩＶＦを受けている女性３７人からのＤＮＡ試料からのＨＲＧ ｒｓ９８９８のＳＮＰ分析からの結果を概要するものである。

遊走及び増殖
増殖及び遊走（走化性）のアッセイを用いることによって、ＨＲＧ及びＨＲＧペプチドの重要性を分析した。用いたペプチドは、タンパク質における２０４位をカバーする３５個のアミノ酸を含む全長のＨＲＧのフラグメントに対応しており、この特定の位置における天然ＨＲＧのプロリンはセリンに変更されている。アミノ酸配列は：ＲＧＧＥＧＴＧＹＦＶＤＦＳＶＲＮＣＰＲＨＨＦＰＲＨＰＮＶＦＧＦＣＲＡＤ（配列番号７、本明細書においてＨＲＧＰｒｏと命名）、及びＲＧＧＥＧＴＧＹＦＶＤＦＳＶＲＮＣＳＲＨＨＦＰＲＨＰＮＶＦＧＦＣＲＡＤ（配列番号８、本明細書においてＨＲＧＳｅｒと命名）であり、ペプチドは、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ、Ｌｕｎｄ、スウェーデンから生成及び購入したものである。

走化性アッセイ
アッセイを、１００μｇ／ｍｌの１型コラーゲン溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ１００、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）でコーティングしたミクロポアニトロセルロースフィルター（厚さ８μｍ、孔８μｍ）を用いて改変ボイデンチャンバー中で行った。細胞（Ｇ１０及びＨＥＥＣ細胞）をトリプシン処理し、０．２５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む無血清培養培地中５．５×１０^５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞懸濁液を上チャンバーに配置し、０．２５％ＦＣＳ及びＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ、ＨＲＧ又はＨＲＧＰｒｏ又はＨＲＧＳｅｒペプチドを含む無血清培地を下チャンバー中のフィルタの下に配置した。陽性対照として、１０％ＦＣＳを含む培地を下チャンバーに加えた。３７℃で４〜６時間後、培地を除去し、フィルタに粘着している細胞を純粋メタノール中で固定し、ギムザ染色で染色した。フィルタを通して遊走した細胞を計数した。

ＨＲＧ、ＨＲＧＰｒｏ、及びＨＲＧＳｅｒの、Ｇ１０細胞及びＨＥＥ細胞の遊走に対する効果を、ボイデンチャンバーを用いることによって試験した。ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）はＧ１０細胞の遊走を誘発し、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）はＨＥＥ細胞の遊走を誘発した。ＨＲＧ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＨＲＧＰｒｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）がＧ１０細胞及びＨＥＥ細胞のＶＥＧＦ誘発性の遊走を阻害する傾向が検出された。ＨＲＧＳｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＶＥＧＦ誘発性の内皮細胞の遊走を有意に（ｐ＜０．０５）阻害した。

細胞増殖アッセイ
１０％ＦＣＳを補った培養培地中の細胞（Ｇ１０及びＨＥＥＣ）を２４ウエルディッシュ中に接種した。２時間後、培地を飢餓培地（０．２５％ＦＣＳを含む培養培地）に交換し、インキュベートを更なる２４時間継続した。２日目及び４日目に培地を再び交換し（飢餓培地）、同時に、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ、ＨＲＧ又はＨＲＧＰｒｏ又はＳｅｒ含有ペプチドを加えた。対照として、細胞を、１０％ＦＣＳを補った基本培養培地中で培養した。５日後、細胞数を記録した。

Ｇ１０細胞（ブタ大動脈内皮細胞）を、０．２５％ＦＣＳを補った培養培地（ハムＦ１２）を含む飢餓培地中で培養した。ＨＲＧ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、飢餓培地中の培養に比べて、Ｇ１０細胞の増殖を著しく阻害した（２４％の低減）。プロリン含有ペプチドであるＨＲＧＰｒｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びセリン含有ペプチドであるＨＲＧＳｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）は両方とも増殖を阻害し、それぞれ２９％及び３５％低減した。ＨＲＧ、ＨＲＧＰｒｏ、及びＨＲＧＳｅｒでの処置の効果は全て、飢餓培地中の培養に比べてｐ＜０．０５で有意であった。ＨＲＧＰｒｏと比べてＨＲＧの効果は有意ではなかったが、ＨＲＧ又はＨＲＧＰｒｏの処置と比べてＨＲＧＳｅｒの効果はｐ＜０．０５で有意であった。

ヒト子宮内膜内皮（ＨＥＥ）細胞を、０．２５％ＦＣＥを補った飢餓培地含有培養培地（３Ｈ）中で培養した。ＨＲＧ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた場合、ＨＥＥ細胞の数は、飢餓培地中の培養に比べて６％増大し、ＨＲＧＰｒｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）では数は１３％増大し、ＨＲＧＳｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の処置では細胞数は８６％増大した。ＨＲＧ、ＨＲＧＰｒｏ、及びＨＲＧＳｅｒの効果は、飢餓培地中の培養に比べて有意（ｐ＜０．０５）であったが、ＨＲＧ又はＨＲＧＰｒｏでの処置の間に有意差はなかった。

本発明者らは、ＨＲＧ、ＨＲＧＰｒｏ、及びＨＲＧＳｅｒは、内皮細胞の増殖及び遊走に影響を及ぼすと結論付ける。ＨＲＧＰｒｏの効果は、全長の天然ＨＲＧと同じパターンにしたがうと思われ、ＨＲＧＳｅｒの効果は異なる。種間（ヒトとブタ）に差はあるが、どの種類の組織から内皮細胞が調製されているかが更に重要であり、子宮内膜の内皮細胞の増殖に対する効果は、他の出所の内皮細胞と比べて独特であると思われる。子宮内膜の受容性及び内皮細胞の機能は、胚の上首尾な着床に重要であり、本発明者らの結果は、子宮内膜の内皮細胞はＨＲＧ及びその誘導体又はフラグメントに対して感受性であり、これは受精能に対して更に関係がある。内皮細胞の遊走及び増殖は、血管新生、血液凝固、免疫の制御などの生理学的経路が十分に機能する必要のある、胚の着床の前、間、及び後に協調する必要がある根源的なメカニズムの部分である。

このように、ペプチドＨＲＧＰｒｏは、基本的に、全長のタンパク質ＨＲＧとして、遊走及び増殖に対して同じ効果があった。しかし、２０４位のアミノ酸にプロリンの代わりにセリンを有するペプチドＨＲＧＳｅｒは著しく異なる効果を有した。

したがって、アミノ酸番号２０４位にプロリン残基を含むＨＲＧのアミノ酸フラグメントは、全長のタンパク質ＨＲＧと同様の治療効果を達成するのに用いることができると結論付けられる。

習慣性流産
反復性の流産の症例対照研究を行った。合計７３０人の女性が、簡単な健康診査の後に含まれた。妊娠、流産、及び子供の数、並びに喫煙習慣、現在の健康上の問題、及び薬物療法を記録した。静脈血試料を収集し、バフィーコートを準備した。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を用いてＤＮＡを抽出し、次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて、ＨＲＧにおけるＣ／Ｔ ｒｓ９８９８ ＳＮＰについて試料を遺伝子型解析した。

ＳＮＰ分析は、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ含有遺伝子型が反復性流産を有する女性のコホート全体の１４％の女性において検出され、Ｓｅｒ／Ｐｒｏ遺伝子型が４４％において検出され、Ｐｒｏ／Ｐｒｏ遺伝子型が４２％において検出されたことを示していた。妊娠１２週以前に反復性流産を有した女性においてＳｅｒ／Ｓｅｒ含有遺伝子型は２２％に見られ、妊娠１２週以後に反復性流産を有した女性において１１％に見られた。

Ｓｅｒ／Ｓｅｒ遺伝子型を保有する女性は、妊娠後期に流産を有する女性に比べて妊娠早期における反復性流産を有する群において著しくより一般的であることから、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ遺伝子型は、それゆえ、着床／胎盤形成の制御において重要である。

上記に記載した実施形態は、本発明の少数の説明的な例と理解されたい。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱せずに、本実施形態に対して様々な改変、組合せ、及び変更を行うことができることが理解されよう。特に、様々な実施形態における様々な部分の解決を、技術的に可能である場合には、他の形状と組み合わせることができる。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。

Ｓｅｒ／Ｓｅｒ遺伝子型を保有する女性は、妊娠後期に流産を有する女性に比べて妊娠早期における反復性流産を有する群において著しくより一般的であることから、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ遺伝子型は、それゆえ、着床／胎盤形成の制御において重要である。
配列番号７のペプチドによる胚に対する影響試験
Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ、Ａｋａｄｅｍｉｓｋａ ｓｊｕｋｈｕｓｅｔ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンに高品質の凍結胚を保存していたカップルに胚の提供を求めた。胚を慎重に形態学的に検査し、使用前にスコア化 ^* した。
実験には、全部で２２の胚が使用され、１１を実験に１１を対照（通常、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ−５（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ、 Ｖａｓｔｒａ Ｆｒｏｌｕｎｄａ、スウェーデン））と呼ばれる培養培地を添加）に使用した。
胚はＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ｕｎｉｓｅｎｓｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｅｃｈ Ａ／Ｓ、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）で培養し、胚を慎重に形態学的に検査し、スコア化 ^* した。
^* （スコア化は細胞数、核を有する細胞の数、分裂度、細胞間での大きさの違い、及び細胞分裂の対称性、非対象性に基づく）
結果
ＨＲＧペプチドを添加した培養培地で成長した胚の胚スコア ^* に基づくデータによると、６／１１が最高スコアを示し、４／１１が中間スコアを示し、及び１／１１が生存できなかった。対照群の対応データは、４／１１が最高スコアを示し、４／１１が中間スコアを示し、３／１１が生存できなかった。

Claims (31)

1. 体外受精を受けている女性の妊娠の結果を予想する方法であって、
   前記女性、及び前記女性の子宮内に着床させる少なくとも１個の胚を形成するために、体外で少なくとも１個の卵子を受精させる精子を提供している男性のうちの少なくとも１人から得た身体試料中又は前記少なくとも１個の卵子のうちの卵子から得た試料中のヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのイソ型を決定すること、並びに
   ＨＲＧの前記決定されたイソ型に基づいて前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の結果を予想すること、
   を含む、上記方法。
2. 妊娠の結果を予想することが、前記身体試料又は前記卵子から得た前記試料中の、ＨＲＧの７５ｋＤａイソ型の存在に基づいて、ＨＲＧの７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて、又はＨＲＧの前記７５ｋＤａ及び前記７７ｋＤａ両方のイソ型の存在に基づいて、前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の結果を予想することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 妊娠の結果を予想することが、前記身体試料中又は前記卵子から得た前記試料中の、ＨＲＧの前記７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が低いことを予想することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 妊娠の結果を予想することが、前記身体試料中又は前記卵子から得た前記試料中の、ＨＲＧの前記７５ｋＤａイソ型及び前記７７ｋＤａイソ型両方の存在に基づいて前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が低いことを予想すること、並び前記身体試料中又は前記卵子から得た前記試料中の、ＨＲＧの前記７７ｋＤａイソ型のみの存在に基づいて前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が非常に低いことを予想することを含む、請求項２又は３に記載の方法。
5. 女性の受胎状態を予想する方法であって、
   前記女性から得た身体試料中の、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのイソ型を決定することと、
   ＨＲＧの前記決定されたイソ型に基づいて前記女性の受胎状態を予想することと、
   を含む、上記方法。
6. 受胎状態を予想することが、前記身体試料中の、ＨＲＧの７５ｋＤａイソ型の存在に基づいて、ＨＲＧの７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて、又はＨＲＧの前記７５ｋＤａ及び前記７７ｋＤａイソ型両方の存在に基づいて、前記女性の受胎状態を予想することを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記女性の受胎状態を予想することが、前記身体試料中のＨＲＧの前記７７ｋＤａイソ型の存在に基づいて前記女性が受胎状態の異常／障害を有することを予想すること、並びに前記身体試料中のＨＲＧの前記７７ｋＤａイソ型が非存在であるがＨＲＧの前記７５ｋＤａイソ型が存在することに基づいて前記女性が正常の受胎状態を有することを予想することを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記イソ型を決定することが、前記身体試料中のＨＲＧの分子量を推定することを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
9. 前記分子量を推定することが、ウエスタンブロットでのＨＲＧの前記分子量を推定することを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記イソ型を決定することが、ＨＲＧにおけるアミノ酸番号２０４としてプロリンを有するＨＲＧのイソ型、及びＨＲＧにおけるアミノ酸番号２０４としてセリンを有するＨＲＧのイソ型のうちの少なくとも１つの存在を決定することを含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
11. 体外受精を受けている女性の妊娠の結果を予想する方法であって、
    前記女性、及び前記女性の子宮内に着床させる少なくとも１個の胚を形成するために、体外で少なくとも１個の卵子を受精させる精子を提供している男性のうちの少なくとも１人から得た身体試料のＤＮＡ、又は前記少なくとも１個の卵子のうちの卵子から得た試料中のＤＮＡを抽出すること、
    前記抽出したＤＮＡについて、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧ、遺伝子のエキソン５の少なくとも一部分の一塩基多形、ＳＮＰ、遺伝子型解析を行うこと、並びに
    前記ＳＮＰ遺伝子型解析に基づいて前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の結果を予想すること、
    を含む上記方法。
12. 妊娠の結果を予想することが、前記エキソン５の少なくとも一部分のヌクレオチド配列がＣ／Ｔ ｒｓ９８９８多型のＴ対立遺伝子を有する場合に、前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が低いことを予想することを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 妊娠の結果を予想することが、前記女性及び前記男性のうちの少なくとも１人が前記Ｃ／Ｔ ｒｓ９８９８多型の前記Ｔ対立遺伝子についてヘテロ接合体であると決定される場合に、前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が低いことを予想すること、及び前記女性及び前記男性のうちの少なくとも１人が前記Ｃ／Ｔ ｒｓ９８９８多型の前記Ｔ対立遺伝子についてホモ接合体であると決定される場合に、前記体外受精を受けている前記女性の妊娠の成功が非常に低いことを予想することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 女性の受胎状態を予想する方法であって、
    前記女性から得た身体試料のＤＮＡを抽出すること、
    前記抽出したＤＮＡについてヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧ、遺伝子のエキソン５の少なくとも一部分の一塩基多形、ＳＮＰ、遺伝子型解析を行うこと、及び
    前記ＳＮＰ遺伝子型解析に基づいて前記女性の受胎状態を予想すること、
    を含む上記方法。
15. 受胎状態を予想することが、前記エキソン５の少なくとも一部分のヌクレオチド配列がＣ／Ｔ ｒｓ９８９８多型のＴ対立遺伝子を有する場合に、前記女性の受胎状態の異常／障害を予想することを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＳＮＰ遺伝子型解析を行うことが、Ｃ／Ｔ ｒｓ９８９８多型を含む前記ＨＲＧ遺伝子の前記エキソン５の少なくとも一部分のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
17. 前記身体試料が体液試料である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
18. 前記体液試料が、卵胞液試料、血漿試料、又は血液試料である、請求項１７に記載の方法。
19. 体外受精を受けている女性の妊娠の成功を増大させる方法であって、
    前記女性の子宮内に着床させる少なくとも１個の胚を形成するための、体外における前記少なくとも１個の卵子の、男性からの精子による受精の前、間、又は後に、配列番号９によって規定されるアミノ酸配列を含む分子を、前記女性からの少なくとも１個の卵子を含む培養培地に投与することを含む上記方法。
20. 前記分子を投与することが、配列番号７によって規定されるアミノ酸配列、好ましくはヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのプロリンイソ型を含む分子を前記培養培地に投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記女性及び前記男性のうちの少なくとも１人がＨＲＧのセリンイソ型についてヘテロ接合体又はホモ接合体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
22. 受胎促進薬の製造において用いるための、配列番号９によって規定されるアミノ酸配列を含む分子。
23. 前記分子が、配列番号７によって規定されるアミノ酸配列、好ましくはヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのプロリンイソ型を含む、請求項２２に記載の分子。
24. 配列番号９によって規定されるアミノ酸配列を含む分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む膣用組成物。
25. 前記分子が、配列番号７によって規定されるアミノ酸配列、好ましくはヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのプロリンイソ型を含む、請求項２４に記載の膣用組成物。
26. 女性の妊娠の成功を増大させる方法であって、配列番号９によって規定されるアミノ酸配列を含む分子を前記女性に投与することを含む上記方法。
27. 前記分子を投与することが、配列番号７によって規定されるアミノ酸配列を含む分子、好ましくはヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＨＲＧのプロリンイソ型を前記女性に投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記女性が体外受精を受けており、前記分子を投与することが、前記女性の子宮内への胚の着床の前、間、及び／又は後に前記女性に前記分子を投与することを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
29. 前記女性、及び前記胚を形成するために体外で前記女性の少なくとも１個の卵子を受精させるために精子を提供している男性のうちの少なくとも１人が、ＨＲＧのセリンイソ型についてヘテロ接合体又はホモ接合体である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記分子を投与することが、前記女性の子宮内膜中に前記分子を注射することを含む、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。
31. 前記分子を投与することが、前記女性の子宮の腔中に前記分子を注射することを含む、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。

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