JP2003532079A - マクロファージ抑制サイトカイン−１（ｍｉｃ−１）が関連する診断アッセイおよび治療方法 - Google Patents

マクロファージ抑制サイトカイン−１（ｍｉｃ−１）が関連する診断アッセイおよび治療方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、流産および／または早産、胎児異常、癌（例えば、前立腺癌）ならびに炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）のリスクを診断する方法を開示する。この診断方法は、身体サンプル中における異常なレベルのマクロファージ阻害サイトカイン-1(MIC-1)を測定するステップ、あるいはMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップを含む。さらに、本発明は、妊娠被験者における流産および／または早産のリスクを低減するための方法、ならびに炎症性疾患および／または癌を治療するための方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は医学的診断方法の分野に関する。特に本発明は、流産および／または
早産、胎児異常、癌（例えば、前立腺癌）ならびに炎症性疾患（例えば、慢性関
節リウマチ）のリスクを診断する方法を提供する。さらに、本発明は、妊娠して
いる被験者における流産および／または早産のリスクを低減するための方法を提
供する。
【０００２】発明の背景 トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)スーパーファミリーは、増殖、分
化および腫瘍形成等の様々な細胞過程を制御する多数の分子を含む。TGF-βスー
パーファミリーのメンバーは主要なファミリーグループに分類される。そのよう
なグループとしては、TGF-β、骨誘導因子(BMP)、増殖分化因子(GDF)、インヒビ
ン／アクチビン、ミューラー管抑制物質(MIS)、グリア細胞由来神経栄養因子(GD
NF)およびさらに最近ではマクロファージ抑制性サイトカイン-1(Bootcovら, 199
7)等が挙げられる。ヒトの妊娠におけるTGF-βスーパーファミリーの関与は、羊
水中のTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、アクチビンおよびインヒビンの検出、なら
びに胎盤絨毛部へのTGF-β1、アクチビンおよびインヒビンの局在化によって示
される(Grahamら, 1992 ; Petragliaら, 1993a ; Petragliaら, 1992 ; Minami
ら, 1992 ; LangおよびSearle, 1994 ; QuおよびThomas, 1992 ; Altmanら, 199
0; Canniggiaら, 1999; Wallaceら, 1997)。
【０００３】 TGF-βスーパーファミリーは、その生物学的重要性および治療可能性のため集
中して研究されている。その生物学的特性および機能は周知であり、また、広範
囲にわたって総説されている(例えば、Miyazonoら, 1993 ; Wahl, 1992 ; およ
びRobertsら, 1993を参照されたい)。それらは、マクロファージおよび繊維芽細
胞に対する強力な化学遊走因子であり、また、おそらく分化におけるその役割の
ため通常は細胞増殖を抑制する。炎症については、TGF-βは、繊維芽細胞、コラ
ーゲンおよびマトリックスタンパク質合成の強力な刺激因子であり、血管新生を
促進し、接着分子の発現をモジュレートし、リンパ細胞増殖、いくつかのリンホ
カインの産生およびNK細胞機能を抑制する。さらに、TGF-βタンパク質は慢性の
炎症過程およびメカニズムの病因に深く関係していることが示されている。
【０００４】 さらに、TGF-βスーパーファミリーは、妊娠中に多数の役割を果たすと考えら
れている。細胞と細胞との接着、細胞の移動および組織再構築を調節するTGF-β
イソ型の能力により、何人かの著者によりこれらの分子が妊娠初期における栄養
膜の侵入および着床を制御しうることを示唆している。その他の可能性ある役割
としては、胎児の成長の制御および母体の免疫系の抑制が挙げられる。胎盤の細
胞はTGF-βスーパーファミリー分子の主要な供給源であり、また、少なくともTG
F-β1、TGF-β3、アクチビンおよびインヒビンによって調節されている。例えば
、アクチビンはインヒビンの生成を抑制し、胎盤細胞によるプロゲステロン、ヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、およびゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)を促
進する(Petragliaら, 1989)。インヒビンは胎盤性hCG、GnRHおよびアクチビンに
よって誘導されるプロゲステロンの放出を抑制する(Petragliaら, 1989)一方、T
GF-β1は胎盤に誘導されるヒト胎盤性ラクトゲン（hPL）生成を抑制する。アク
チビンとTGF-β3は妊娠初期における外側に微絨毛を有する栄養膜の侵入を調節
するときに反対の効果を有することも示されている(Caniggiaら, 1997; Caniggi
aら, 1999)。これらの知見により、TGF-β1、TGF-β3、アクチビンおよびインヒ
ビンは自己分泌様式で胎盤の成長および分化を調節することが示唆される。さら
に、TGF-β1、アクチビンおよびインヒビンは、成長および分化を調節すること
が示されている胚における適所に存在する。特に、TGF-βスーパーファミリーメ
ンバーは、中胚葉誘導を促進するその能力が周知である。
【０００５】 TGF-βスーパーファミリータンパク質は胎児の生存を促進することも示唆され
ている。実験証拠によって、分娩時に、炎症誘発性サイトカインであるインター
ロイキン-1(IL-1)、IL-6および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)の羊水中濃度が上昇す
ることが示唆されている。さらに、子宮内感染を伴う炎症誘発性サイトカイン生
成は、胎児に対する拒絶反応または予定日前の分娩（早期分娩）に関連している
(Romeroら, 1992; Hillierら, 1993; Opsjonら, 1993)。TGF-β1およびインヒビ
ンは、それぞれマクロファージおよびリンパ細胞に由来する炎症誘発性サイトカ
インの生成を抑制する一方(BogdanおよびNathan, 1993; Petragliaら, 1991)、
アクチビンはマクロファージおよび羊膜に対して炎症誘発性作用を及ぼすことが
示されている(NusingおよびBarsig, 1997; Petragliaら, 1993b)。このことによ
り、TGF-β1およびインヒビンは、母体免疫系による炎症誘発性サイトカインの
生成を抑制することによって、胎児の生存を促進するといった示唆につながって
いる。
【０００６】 本願出願人らは、最近、TGF-βスーパーファミリーの異なるメンバーである、
マクロファージ阻害サイトカイン(MIC-1)をクローニングし、特性決定した(Boot
covら, 1997)。このマクロファージ阻害サイトカイン(MIC-1)の発現はマクロフ
ァージの活性化と関連する。妊娠におけるMIC-1の何らかの機能特性を判定する
ために、本願出願人らは、MIC-1の定量化のために高感度サンドイッチ型酵素結
合免疫吸着アッセイ(ELISA)を開発した。そして、このアッセイ法を使用するこ
とによりヒト母体血清MIC-1濃度と妊娠期間との経時的関係を調査し、さらに、
羊水および胎盤抽出物中のその濃度を測定した。さらに、本願出願人らは、胎盤
絨毛癌細胞系(BeWo)のサイトカイン合成能を評価することにより、MIC-1の起源
を詳細に示す実験を実施した。以下に示す結果は、子宮内における母体由来の炎
症誘発性サイトカインの産生を抑制することによってMIC-1は胎児生存率を上昇
させることができることを示すものである。したがって、母体血清、羊水および
胎盤抽出物サンプル中のMIC-1に関する定量的診断アッセイによって、異常なレ
ベルのMIC-1を有することを検出することにより、流産および／または早産のリ
スクがある妊娠女性を検出するという可能性を提供する。
【０００７】 さらに、本願出願人らは、いくつかのMIC-1対立遺伝子変異体が存在すること
を見出し、それら全てが９位、48位および202位にわずかなアミノ酸配列の相違
を示すことを見出した（国際特許公開WO 97/00958号参照、この全ての内容を参
照により本明細書に組み入れる、参照文献中MIC-1はCL13として引用されている
）。最も重要なアミノ酸位置はアミノ酸202位であり、なぜならば、この位置は
成熟形態のMIC-1（すなわち、リーダー配列が切断により除かれている）の６位
に相当するからである。同定された変異体のいくつかにおいては、通常202位に
存在するヒスチジン(Ｈ)残基（すなわち「H6」）がアスパラギン酸(Ｄ)と置換さ
れている。これは、604位のシトシン(Ｃ)がグアノシン(Ｇ)によって置換されて
いるような、MIC-1遺伝子内の一塩基置換によるものである。現在、本願出願人
らは、Asp202-MIC-1（すなわち「D6」）対立遺伝子変異体に対してヘテロ接合性
またはホモ接合性のいずれかである被験者が、炎症性疾患および／または癌に対
して素因および疾病経過が変化しうることを認識している。
【０００８】発明の開示 したがって、第１の態様として、本発明は、異常なレベルのMIC-1発現を特徴
とする疾患もしくは症状の診断方法または評価方法を提供する。該方法は、以下
のステップ： (i)試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するステ
ップ、および (ii)上記ステップにおいて測定した量と、正常被験者から採取した等価な身体サ
ンプル中に存在するMIC-1量またはMIC-1量の範囲を比較するステップ、 を含むものである。
【０００９】 比較したMIC-1量の相違が、疾患または病状に関係しうる異常なレベルのMIC-1
発現を試験被験者が有することを示しうるものである。例えば、本発明の好まし
い実施形態においては、身体サンプル、好ましくは妊娠試験被験者から採取した
血清、羊水または胎盤抽出物サンプル中の低下したMIC-1量を検出することによ
って、流産および／または早産のリスクが増大しうる状態（高リスク）の指標と
なりうる。
【００１０】 したがって、第２の態様として、本発明は、流産および／または早産のリスク
を診断する方法を提供する。該方法は、以下のステップ： (i)既知の妊娠期間にある妊娠試験被験者から採取した身体サンプル中に存在す
るMIC-1の量を測定するステップ、および (ii)上記ステップにおいて測定した量と、上記試験被験者の既知の妊娠期間と実
質的に等価な妊娠期間にある正常妊妊験被験者から採取した等価な身体サンプル
中に存在するMIC-1量またはMIC-1量の範囲を比較するステップ、 を含むものである。
【００１１】 上述したように、第２の態様の方法において使用する好ましい身体サンプルは
、血清、羊水または胎盤抽出物由来のサンプルである。しかしながら、全血、血
漿、尿および脳脊髄液由来のサンプルもまた適している。
【００１２】 正常妊娠被験者の身体サンプル中に存在するMIC-1量または量の範囲は、妊娠
期間が進むに連れて増大する。したがって、試験被験者由来のサンプルの測定し
たMIC-1量を、実質的に等価な妊娠期間にある正常妊娠被験者由来の等価なサン
プル中に存在するMIC-1量とを比較することは重要である。したがって、使用す
る身体サンプルが血清サンプルである場合には、第１トリメスターの試験被験者
からは４ng/mL以下、第２トリメスターの試験被験者からは８ng/mL以下、そして
、第３トリメスターの試験被験者からは12ng/mL以下の測定量が、低減したMIC-1
レベルと、その結果として流産および／または早産の高リスクの指標となる。使
用する身体サンプルが羊水サンプルである場合には、第２トリメスターの試験被
験者からは10ng/mL以下の測定量が、低減したMIC-1レベルと、その結果として流
産および／または早産の高リスクの指標となる。さらに、使用する身体サンプル
が胎盤抽出物である場合には、第３トリメスターの試験被験者由来の胎盤抽出物
サンプル中、約18ng/mL以下、より好ましくは約10ng/mL以下の測定量が、低減し
たMIC-1レベルと、その結果として流産および／または早産の高リスクの指標と
なる。
【００１３】 流産および／または早産のリスクの増大（高リスク）は、低減したMIC-1レベ
ルと関係する異常な妊娠および／または胎盤の発達の結果である可能性がある。
すなわち、異常な胎盤の発達が、低減したMIC-1レベルの検出によって判定され
る場合、これにより、出産の早期誘導の指標となりうる。なぜならば、胎盤が正
常に発達および成長しない場合、胎児は危険な状態にありうるからである。
【００１４】 妊娠女性において流産および／または早産のリスク評価を成功させることによ
り、予防的治療および適用しうる他の手段（例えば、休息、食事の改善等）を行
うことが可能となる。
【００１５】 さらに、本発明は、流産および／または早産のリスクを低減させるための治療
方法を意図するものであり、該方法はMIC-1の投与を含むことを特徴とする。
【００１６】 したがって、第３の態様において、本発明は、流産および／または早産のリス
クを低減させるための妊娠被験者の治療方法を提供し、該方法は、該被験者に対
し、有効量のMIC-1を、必要に応じて薬学上許容される担体および／または賦形
剤と混合させて投与することを含むものである。
【００１７】 好ましくは、投与した量によって、胎盤抽出物サンプル中に存在するMIC-1合
計量（すなわち、投与したMIC-1量プラス内因性MIC-1量）が15〜70ng/mL、より
好ましくは30〜50ng/mLの範囲に維持される。
【００１８】 MIC-1は、慣用される公知の経路のいずれかにより投与することができる。そ
のような投与経路としては、例えば、経口、経鼻、静脈内および筋肉内経路が挙
げられる。さらに、MIC-1は子宮に直接投与することもできる。本発明はさらに
、MIC-1投与のための周知の遺伝子治療技術の使用を意図するものである。その
ような使用としては、例えば、発現可能なMIC-1コードヌクレオチド配列を含む
組換えアデノウイルスもしくはアデノウイルス関連ベクターの使用、または適当
なプロモーター配列に機能的に連結されリポソーム内に投与される線状MIC-1コ
ードDNAの使用が挙げられる。
【００１９】 第３の態様における方法は、胎盤の成長を促進し、それにより異常な胎盤の発
達に伴う問題を克服することを可能とするだろう。
【００２０】 その他、本発明の好ましい実施形態において、妊娠試験被験者由来の身体サン
プル中のMIC-1量低下もしくは上昇の検出は、胎児異常のリスクが増加している
可能性がある状態（高リスク）を示唆しうる。
【００２１】 したがって第４の態様において、本発明は、胎児異常の診断方法を提供し、そ
の方法には、以下のステップ： (i)既知の妊娠期間にある妊娠試験被験者から採取した身体サンプル中に存在す
るMIC-1の量を測定するステップ、および (ii)上記の測定した量と、上記試験被験者の既知の妊娠期間と実質的に等価な妊
娠期間にある正常妊娠被験者から採取した等価な身体サンプル中に存在するMIC-
1の量または量の範囲とを比較するステップ、を含む。
【００２２】 本願出願人らはまた、癌に伴うMIC-1発現レベルの上昇を見出し、また試験被
験者の適切な身体サンプルからのMIC-1の量を調べることが、癌、特に前立腺癌
、乳癌、大腸癌、直腸癌または膀胱癌の診断（および進行のモニタリング）を可
能にしうることを見出した。例えば、正常あるいは前立腺特異的抗原（PSA; 前
立腺癌のマーカー）のレベルが上昇した50人の被験者由来の血清サンプルにおい
て、MIC-1とPSAの間に強い相関関係が観察され、また何人かの患者においては、
正常レベルの10倍以上高いMIC-1のレベルが測定された（図１参照）。このこと
は、MIC-1が腫瘍マーカーとして、および前立腺癌における進行度の尺度として
有用であることを強く示唆している。さらに、広範な種類の上皮細胞においてMI
C-1の発現が観察されることは、MIC-1が同様に乳癌、大腸癌、膀胱癌などの癌に
対して有用な腫瘍マーカーでありうることを示唆する。
【００２３】 したがって、第５の態様において、本発明は、異常なレベルのMIC-1の発現を
特徴とする癌の診断方法または評価方法を提供するものであって、その方法は、
以下のステップ： (i)試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するステ
ップ、および (ii)上記の測定した量と、正常被験者から採取した等価な身体サンプル中に存在
するMIC-1の量または量の範囲とを比較するステップ、を含む。
【００２４】 好ましくは、第５の態様の方法で使用される身体サンプルは、血清、血漿、尿
、脳脊髄液、関節滑液、精液または組織生検のサンプルである。
【００２５】 さらに、本願出願人らは、ある種の身体サンプル中におけるMIC-1レベルの上
昇が慢性関節リウマチに関連していることを見出した。例えば、コルチコステロ
イドを高用量で静脈内に投与する処置後の被験者の組織生検を調べることによっ
て、浸潤細胞におけるMIC-1の発現が顕著に減少していることが示された（図２
参照）。
【００２６】 したがって、第６の態様において、本発明は、慢性関節リウマチの診断方法を
提供するものであって、その方法は： (i)試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するステ
ップ、および (ii)上記の測定した量と、正常被験者から採取した等価な身体サンプル中に存在
するMIC-1の量または量の範囲とを比較するステップ、を含む。
【００２７】 第６の態様の方法で使用される身体サンプルは、尿、脳脊髄液、精液または組
織生検サンプルを使用することができる。しかし、好ましくは、該身体サンプル
は血清、血漿もしくは関節滑液である。
【００２８】 身体サンプル中に存在するMIC-1の量は、例えば、MIC-1に対する抗体（モノク
ローナルもしくはポリクローナル）またはそのフラグメントを使用するイムノア
ッセイあるいは免疫組織化学（例えば、組織生検からの切片を用いて行う）によ
って容易に測定することができる。抗MIC-1抗体およびそのフラグメントは当業
者に公知の方法のいずれかにより作製することができる。
【００２９】 第７の態様において、本発明は、被験者の炎症を治療する方法を提供し、該方
法は、被験者に対し、有効量のMIC-1を、必要に応じて薬学上許容される担体お
よび／または賦形剤と混合させて、投与することを含むものである。
【００３０】 第８の態様において、本発明は、ヒト被験者における炎症性疾患および／また
は癌の診断方法または評価方法を提供し、該方法は、被験者から採取した適切な
サンプル中においてMIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応
する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステ
ップを含むものである。
【００３１】 第９の態様において、本発明は、ヒト被験者における炎症性疾患および／また
は癌への素因を評価する方法を提供し、該方法は、被験者から採取した適切なサ
ンプル中においてMIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応す
る位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステッ
プを含むものである。
【００３２】 好ましくは、第８および第９の態様における炎症性疾患は慢性関節リウマチで
ある。好ましくは、第８および第９の態様における癌は前立腺癌である。
【００３３】 慢性関節リウマチに関しては、MIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1
の202位に対応する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質の検出が
、慢性関節リウマチまたは慢性関節リウマチへの素因の指標となる。前立腺癌に
関しては、MIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置
にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質の検出が、前立腺癌の存在がな
いことまたは前立腺癌に対する素因が全くないかもしくはごくわずかである指標
となりうる。
【００３４】 MIC-1変異タンパク質の存在は、正常ヒトMIC-1すなわち「野生型」MIC-1もし
くはMIC-1の202位にヒスチジンを有する変異体と202位にアスパラギン酸を有す
る変異体とを識別しうる抗体またはそのフラグメントを使用するイムノアッセイ
によって容易に判定することができる。かかる抗体またはそのフラグメントは、
当技術分野において一般的に知られている方法のいずれかを使用して、MIC-1ま
たはAsp202-MIC-1に対して作製することができる。あるいは、免疫原性ペプチド
を使用して、もしくは必要に応じてウシ血清アルブミンのような担体タンパク質
と免疫原性ペプチドを結合させて使用することにより、好適な識別能を有する抗
体またはそのフラグメントを作製することができる。かかる免疫原性ペプチドは
、未成熟ヒト野生型MIC-1タンパク質の202位を含む範囲にエピトープを含み、ま
た、変異体タンパク質の場合には、未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位
置を含む範囲にエピトープを含む。例えば、Asp202-MIC-1に対して特異的に結合
する抗体は、以下のアミノ酸配列を含む免疫原性ペプチドを使用して作製するこ
とができる; Ala-Arg-Asn-Gly-Asp-Asp-Cys-Pro-Leu (配列番号７)。
【００３５】 好ましくは、202位または未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置にア
スパラギン酸を有するMIC-1タンパク質の存在は、かかるタンパク質と特異的に
結合する抗体を使用するイムノアッセイによって判定する。しかしながら、野生
型MIC-1および／または202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する
位置にヒスチジンを有する変異体に特異的な抗体またはそのフラグメントを使用
する場合、あらゆる検出可能な結合の不在または低減した結合レベルが、202位
または未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置にアスパラギン酸を有する
MIC-1変異体タンパク質の存在の決定因子としてみなすことができる。そのよう
なアッセイの場合、陽性対照は、サンプル中のMIC-1タンパク質の存在を確認す
るように実施するのが好ましい(例えば、野生型および変異体MIC-1タンパク質の
双方と結合する非特異的抗体またはそのフラグメントを用いたイムノアッセイに
より行う)。
【００３６】 第１および第２の態様の方法に使用する好ましい身体サンプルは、全血、血清
、血漿および尿から採取したサンプルである。組織生検もまた好適でありうる。
【００３７】 202位または未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置に通常ヒスチジン
を有するMIC-1タンパク質についてヘテロ接合性またはホモ接合性である被験者
は、反対に、慢性関節リウマチのような炎症性疾患に対しては素因の低減を示す
が、前立腺癌のような癌に対しては素因の増大を示すことが理解されるであろう
。
【００３８】 したがって、第１０の態様において、本発明は、ヒト被験者における炎症性疾
患および／または癌の診断方法または評価方法を提供し、該方法は、被験者から
採取した適切なサンプル中においてMIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-
1の202位に対応する位置にヒスチジンを有するMIC-1変異タンパク質の存在を判
定するステップを含むものである。
【００３９】 炎症性疾患および／または癌の評価には疾患経過の評価が含まれる。例えば、
MIC-1遺伝子型およびMIC-1レベルが癌の再発(例えば、外科的除去手術後の再発)
および死亡率の指標となることが見出された。すなわち、野生型MIC-1(および／
または202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置にヒスチジ
ンを有する変異体)についてホモ接合性である被験者は、ヘテロ接合性被験者ま
たはAsp202-MIC-1変異体についてホモ接合性である被験者よりも、通常、癌の再
発(すなわち、治療後の再発)までに長い期間を有しうる。さらに、野生型MIC-1(
および／または202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置に
ヒスチジンを有する変異体)についてホモ接合性である被験者であって、身体サ
ンプル(例えば、血清)中のMIC-1レベルが高い被験者は生存期間の減少を示すこ
とが判明した。同様に、慢性関節リウマチを罹患する被験者であって、Asp202-M
IC-1変異体についてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性である被験者は、野
生型MIC-1(および／または202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当
する位置にヒスチジンを有する変異体)についてホモ接合性である被験者よりも
疾患の程度が重篤であると経験的に考えられることが判明した。
【００４０】 第１１の態様において、本発明は、ヒト被験者における炎症性疾患および／ま
たは癌への素因を評価する方法を提供し、該方法は、被験者から採取した適切な
サンプル中においてMIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応
する位置にヒスチジンを有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップ
を含むものである。
【００４１】 さらに本発明は、ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌への素因を
診断または評価する方法に関し、該方法は、該被験者の遺伝子型を決定(すなわ
ち、MIC-1対立遺伝子構成を評価)するステップを含むものである。かかる方法は
、上記したような識別能を有する抗MIC-1抗体を含むイムノアッセイを利用する
ことができ、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)解析または対立遺伝子間の
一塩基の相違を検出する任意の他の技法(Current Protocols in Human Genetics
Supplement 21, Chapter 7によってそのような方法の概説のいくつかが示され
る）を使用するDNAレベルでの評価を含みうる。
【００４２】 したがって、さらなる態様において、本発明は、MIC-1に関してヒト被験者の
遺伝子型を決定する方法を提供し、該方法は、202位に(例えば、野生型MIC-1の
場合)もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置にヒスチジンを有
するMIC-1タンパク質に対して、または、202位にもしくは未成熟ヒト野生型MIC-
1の202位に相当する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質に対し
て、該被験者がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを判定するステップを
含むものである。
【００４３】 さらに別の態様において、本発明は、ヒト被験者における炎症性疾患および／
または癌を診断する方法、あるいは、炎症性疾患および／または癌への素因を評
価する方法を提供する。該方法は、MIC-1に関してヒト被験者の遺伝子型を決定
するステップを含むものであり、該ステップは、202位に(例えば、野生型MIC-1
の場合)もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に相当する位置にヒスチジンを
有するMIC-1タンパク質に対して、または、202位にもしくは未成熟ヒト野生型MI
C-1の202位に相当する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質に対
して、被験者がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを判定することを含む
ものである。
【００４４】 ホモ接合性D6/D6遺伝子型(すなわちこの場合、両方のMIC-1対立遺伝子が未成
熟ヒト野生型 MIC-1の202位に相当する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変異
タンパク質をコードしている)であると決定された被験者およびヘテロ接合性H6/
D6遺伝子型であると決定された被験者は、炎症性疾患を罹患するか、もしくは炎
症性疾患への素因を示すことが予想されうる。さらに、かかる被験者は、前立腺
癌には罹患しないか、および/または、前立腺への素因を全くもしくはわずかに
しか示さないことが予想されうる。反対に、ホモ接合性H6/H6遺伝子型であると
決定された被験者は、前立腺癌への素因の増大を示すことが予想されうる。
【００４５】 変異体MIC-1対立遺伝子は、試験被験者から採取した任意の好適なサンプル（
例えば、頬細胞サンプル）から単離されたDNAまたはRNAを使用して得られたポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)産物の配列決定または制限酵素切断解析によって簡便に
調べることができる。あるいは、標的とする野生型MIC-1配列または変異MIC-1配
列からのみPCR産物が産生されることを確実にするために、MIC-1コード配列の可
変領域を標的とするプライマーを使用する高ストリンジェンシー条件下でPCRを
行うことができる。
【００４６】 ヒトMIC-1(すなわち、「野生型」)および変異体Asp202-MIC-1のDNA配列および
アミノ酸配列を図３に示す。
【００４７】 本明細書中で使用する場合、「未成熟ヒト野生型MIC-1」とは、図３において
「MIC-1/H6」として示されるアミノ酸配列を有するMIC-1タンパク質を意味する
。また、「野生型MIC-1」とは、上記タンパク質の成熟形態（すなわち、切断に
よりリーダー配列が除去されている）を意味する。
【００４８】 明細書中を通じて使用する「含む」（comprise、comprisesおよびcomprising
）という語は、さらなるステップ、成分、もしくは特性、またはステップ群、成
分群、もしくは特性群を含みまたは含むことなく、上記のステップ、成分、もし
くは特性、またはステップ群、成分群、もしくは特性群を含むことを意味するこ
とを意図するものである。
【００４９】 本願明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物質等の全ては、単に本
発明の内容を提供するものである。これらの事項のいずれかまたは全てが、本願
の各特許請求の範囲における、優先日前にオーストラリアに存在していた本発明
に関連する分野における従来技術にもとづく一般的知識または共通した一般的知
識の部分を構成するものであるとみなされるものではない。
【００５０】 以下の非制限的実施例および添付の図面を参照することにより本発明を以下に
説明する。
【００５１】実施例１：妊娠女性におけるMIC-1発現の評価 方法： 血清および羊水サンプル： 血清サンプルを正常な単生児妊娠の健常妊娠女性22人から採取した。試験した
いずれの女性も薬物を摂取していなかった。各事例において、妊娠期間は初期妊
娠超音波走査により決定した。その後、全ての女性が満期（37〜41週）で健常な
正常に成長した乳児を正常な経膣分娩により分娩した。血清サンプルは、妊娠10
〜14週の間に６人の女性から、妊娠の26〜30週および37〜40週の間に８人の女性
から採取した。この時期は各トリメスターの最後に相当する。各トリメスターに
対応するサンプルをプールした後、MIC-1レベルを測定した。また４人の女性か
らは妊娠30週から分娩までほぼ毎週に連続母体血清サンプルを採取した。またこ
の４人の女性は全て正常な単生児妊娠で健常であり、また妊娠満期に正常経膣分
娩により正常な健常乳児を分娩した。さらに、10人の女性から、妊娠15〜17週に
胎児染色体分析のために羊水穿刺検査を行って、羊水を採取した。全事例におい
て、染色体分析の適応は高齢の母体（＞37歳）であった。羊水も同様にプールし
た後にMIC-1レベルを測定した。
【００５２】胎盤抽出物： 100〜150mgの胎盤組織（生理食塩水で４〜５回洗浄し、液体窒素で凍結して-8
0℃で保存した）を１mのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中でホモジネートした
。ホモジネートを10,000rpmで30秒間遠心し、上清をチューブに移した。総タン
パク質をBCA総タンパク質アッセイ（Pierce）を用いて製造業者の指示に従って
測定した。０〜1000μg/mlの範囲のBSA溶液を標準溶液として使用した。
【００５３】BeWo細胞培養： ヒト絨毛癌栄養膜細胞系（BeWo）はATCC（Rockville, MD）から購入した。96
ウエルの組織培養プレートに、4.5g/l D-グルコース、110mg/lピルビン酸ナトリ
ウム、0.584g/l L-グルタミン、４mg/l塩酸ピリドキシンおよび１×Nutridoma-S
R（Boehringer Mannheim, Germany）を含むダルベッコの改変イーグル培地（DME
M；Gibco BRL）250μl中に１ウエル当たり5000個の上記細胞を接種し、５％二酸
化炭素の存在下で37℃にて１〜５日間培養した。この時点で、培養プレートを10
00rpmで10分間遠心し、上清を取り出し、MIC-1の定量まで-20℃で保存した。
【００５４】MIC-1 mRNA合成の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析： 96ウエルプレート中のBeWo単細胞層から、Tri-Pure試薬（Roche）を用いて製
造業者により指示される方法で総RNAを単離した。１μg RNA、poly (T)15プライ
マーおよび50ユニットのExpand逆転写酵素（Roche）を用いて製造業者が推奨す
る条件を用いて、総反応量20μlで逆転写（RT）を行った。RT反応のアリコート
５μlをPfuポリメラーゼ（Promega）および下記のプライマーを用いてPCR反応で
増幅した： MSB-1（5'-AGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCAACCAGAGC-3'；配列番号５）および MSB-5（5'-GGCTAACAAGTCATCATAGGTCTGGAGCGACAC-3'；配列番号６） これらはMIC-1の１つのイントロンと隣接するものである。PCR条件は次のとおり
とした：最初の変性ステップを95℃にて１分間、続いて、95℃にて30秒、60℃に
て30秒、72℃にて２分間を35サイクル行った。RNAを除いたRT反応を陰性対照と
して用い、MIC-1 pre-pro-MIC/FLAGコード配列（Bootcovら、1997）を有するプ
ラスミドを陽性対照として実験に含めた。PCR産物は0.8％ (w/v) アガロースゲ
ル上で分離させた。
【００５５】MIC-1抗体の作製： ヒツジ抗MIC-1ポリクローナル抗体（PAb）233B3は、国際特許公報WO 97/00958
号に記載の方法に従って合成した組換えヒトMIC-1（rhMIC-1）を完全フロイント
アジュバントと共に用いて免疫感作することにより作製した。追加免疫は６ヶ月
の期間にわたって行い、最終免疫（注射）後10日目にヒツジから採血した。IgG
画分に富む正常ヒツジ血清および233B3は、カプリル酸沈降とそれに続く硫安沈
降により調製した。IgG富化233B3画分を233Pと称した。
【００５６】 マウス抗MIC-1モノクローナル抗体（MAb）分泌ハイブリドーマは、rhMIC-1で
免疫したマウスから作製した。ハイブリドーマを、20％FCS（CSL, Melbourne）
を添加した、4.5g/l D-グルコース、110mg/l ピルビン酸ナトリウム、0.584g/l
L-グルタミン、４mg/l塩酸ピリドキシンを含むDMEM（Gibco BRL）中で培養した
。MAbを回収するために、ハイブリドーマを、Nutridoma-SR（Boehringer Mannhe
im）を添加した新鮮なDMEM-hiグルコースに７日間移した。培養上清を2000rpmで
10分間遠心し、細胞破砕物を除去し、使用まで凍結した。PAbおよびMAb調製物の
感受性は直接ELISA法により確認した。
【００５７】直接ELISA法： Maxisorp ELISA 96ウエルプレート（Nunc）は、被覆用バッファー（蒸留水中0
.1M 炭酸塩、pH 9.4-9.8）中の18 ng/ml rhMIC-1または20 ng/ml rhTGF-β1（R
& D Systems）のいずれかで40℃にて24時間かけて被覆（100μl/ウエル）した。
次にプレートを300μlの洗浄バッファー（0.05％ (v/v) Tween-20 (Sigma)を含
有するPBS）で３回洗浄し、非特異的結合を、PBS中１％(w/v) BSA（Boehringer
Mannheim）250μlで37℃にて２時間ブロッキングした。抗体希釈液（１％(w/v)
BSAおよび0.05％(v/v) Tween-20を含有するPBS）で500,000倍希釈した抗MIC-1 M
AbおよびヒツジPAb 233B3-Pを含有するハイブリドーマ血清不含培地；マウスミ
エローマ細胞系SP2/0で調整した培養培地；DMEM＋Nutridoma；抗体希釈液で500,
000倍希釈したイムノグロブリンG富化正常ヒツジ血清；DMEM＋Nutridoma中の200
ng/ml マウスIgG1（R & D Systems）；または抗体希釈液単独、をプレートに添
加し（100μl/ウエル）、37℃にて１時間インキュベートした。プレートを３回
洗浄した後、抗体希釈液で10,000倍希釈したビオチン化ロバ抗ヒツジIgG（Jacks
on Immunoresearch）またはビオチン化ヤギ抗マウスIgG（Jackson Immunoresear
ch）を100μl/ウエルで添加して、37℃にて１時間インキュベートした。プレー
トを３回洗浄し、抗体希釈液で2000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコン
ジュゲートストレプトアビジン（Genzyme）を100μl/ウエルでプレートに添加し
、37℃にて30分間インキュベートした。プレートを４回洗浄した後、100μl/ウ
エルのペルオキシダーゼ基質（0.014％ H2O2, pH5.0（Sigma）を含む0.05M リン
酸-クエン酸バッファー中の１mg/ml o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド（S
igma））を添加した。呈色反応を５〜15分間にわたり行い、100μl/ウエルの4N
H2SO4を添加して呈色反応を終結させた。吸光度はマイクロプレートリーダー（P
asteur Diagnostics）において490nmにて測定した。
【００５８】MIC-1サンドイッチELISA法： MIC-1サンドイッチELISA法は、抗原捕捉に抗MIC-1マウスMAb、検出にヒツジPA
b 233-Pを用いて行った。両抗体の最適濃度は経験に基づいて決定して以下の全
試験に使用した。96ウエルのMaxisorp ELISAプレートを、被覆用バッファーで５
倍希釈した抗MIC-1 MAb上清（最終イムノグロブリン濃度は約20ng/mlとした）で
40℃にて24時間かけて被覆した。続いてプレートを300μlの洗浄バッファーで３
回洗浄し、非特異的結合を250μlの１％(w/v) BSAのPBS溶液で37℃にて２時間か
けてブロッキングした。次に抗体希釈液で希釈したrhMIC-1標準、組織培養上清
、母体血清、胎盤抽出物または羊水をプレートに添加し（100μl/ウエル）、37
℃にて１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、抗体希釈液で50
00倍希釈したヒツジPAb 233-Pを100μl/ウェルで添加し、37℃で１時間インキュ
ベートした。続いてプレートを３回洗浄し、抗体希釈液で5000倍希釈したビオチ
ン化ロバ抗ヒツジIgGを100μl/ウエルで添加し、37℃にて１時間インキュベート
した。その後、直接ELISA法を行うためにプレートを発色させた。サンプル中のh
MIC-1濃度は、rhMIC-1標準曲線との比較により決定した。この標準曲線における
rhMIC-1レベルは総タンパク質含量に基づいて決定しているため、絶対量の点で
は明らかな誤りとなる。しかしながら、本実施例全体にわたって同じ標準を用い
たために、本実施例において評価した相対値には差が生じなかった。全サンプル
を少なくとも２つの試験（occasion）において３連でアッセイした。結果は、平
均値±SDとして表す。MIC-1サンドイッチアッセイの感度は、500 pg/mlまでの量
のTGF-β1およびインヒビンＡ（いずれもTGF-βスーパーファミリーに属する）
を用いて試験することにより評価した。
【００５９】免疫沈降法： 免疫沈降法は、プロテインＡセファロースに吸着させた抗MIC-1 MAbを含む0.2
mlのハイブリドーマ用血清不含培地を用いて行った。血清および培地サンプル
（１ml）を上記抗体と共に40℃にて一晩インキュベートした後、１％(v/v) Trit
on X-100を含有するPBSで５回洗浄した。結合したタンパク質は、非還元ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）-サンプルバッファーを用いて溶出し、SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（Laemmli, 1970）とそれに続くヒツジポリ
クローナル抗体233-Pを用いたイムノブロット分析により分析した。イムノブロ
ット分析は、ポリクローナル抗体233-Pを7000倍希釈して１次抗体として使用し
、ロバ抗ヒツジIgG-ビオチンを5000倍希釈して２次抗体として使用した以外は、
本質的にBootcovら(1997)により記載された手法に従って行った。
【００６０】結果： 抗MIC-1 PAbおよびMAbの感受性： ヒツジPAb 233-Pおよびマウス MAbがrhMIC-1に結合する能力は、直接ELISA法
により調べた。抗体希釈液で500,000倍希釈したMAbおよびヒツジPAb 233-Pを含
む未希釈組織培養上清はいずれも1.8 ngの固定化rhMIC-1と強く結合したことが
わかった（図４）。マウスミエローマ細胞系SP2/0で調整した培養培地、未調整
培養培地、マウスIgG1、イムノグロブリン富化正常ヒツジ血清、または抗体希釈
液単独はいずれもrhMIC-1とは反応しなかった。非被覆ウエルに対する最小のバ
ックグラウンド結合は、試験した全サンプルで観察された。抗MIC-1 MAbまたは
ポリクローナル抗体233-Pを固定化rhTGF-β1と共にインキュベートした場合には
いずれにおいても反応は検出されなかった。
【００６１】MIC-1サンドイッチELISA法： 10〜500 pg/ml の範囲でrhMIC-1を精密に定量することが可能な、抗MIC-1 MAb
およびPAb 233-Pを用いるサンドイッチELISA法を確立した（図５）。ヒト血清お
よび培養培地中に存在する因子がこのサイトカインの測定に及ぼす影響を調べる
ために、500 pg/mlのrhMIC-1を10％(v/v)正常ヒト血清または10％(v/v) DMEM＋N
utridomaのいずれかを含有する抗体希釈液に添加した後、定量した。サンドイッ
チELISA法は補正値（correct value）５％以内で正確であることがわかった。試
験毎の変動は５％未満であった。TGF-β1およびインヒビンＡを用いるサンドイ
ッチELISA法においては、これらの構造的に関連したサイトカインとの交差反応
は観察されなかった。
【００６２】妊娠期間中の段階的な妊娠母体血清のMIC-1レベルの増大 プールした血清サンプルを抗体希釈液で１：５〜１：20に希釈した後、サンド
イッチELISA法によりMIC-1を定量した。プールした正常ヒト血清は、約0.36（±
0.04）ng/mlのMIC-1を含有していることを確認した（図６Ａ）。プールした母体
血清においては、MIC-1濃度が妊娠期間の間に顕著に増大することが認められた
。第１トリメスターに対応する母体血清サンプルは約6.3（±0.02）ng/mlのMIC-
1を含有し、第２トリメスターには12.24（±0.54）にまで上昇し、第３トリメス
ターには15.3（±1.31）ng/mlでピークを示した。
【００６３】 免疫沈降法を利用して、妊娠期間におけるプールした母体血清サンプル中のMI
C-1の存在を確認した。MIC-1は、抗MIC-1 MAbを用いた免疫沈降法、続いてPAb 2
33B3-Pを用いたイムノブロット分析により可視化した。ジスルフィド結合した成
熟MIC-1ペプチドに対応する１バンド（約25kDa）を第２および第３トリメスター
の妊娠血清サンプルにおいてみとめることができる（図６Ｂ、レーン３〜４）。
最大MIC-1レベルは、第３トリメスターのサンプルにおいてみとめられた。イム
ノブロット分析の感度が低いために、正常血清または第１トリメスターに相当す
るサンプルにおいては類似したバンドは観察されなかった（図６Ｂ、レーン１〜
２）。
【００６４】 母体血清MIC-1濃度もまた４人の妊娠女性からの連続サンプルにおいて調べた
。妊娠30週において、４人の女性由来の血清全てが約４ng/mlのMIC-1を含有して
いた（図７）。母体血清MIC-1レベルは妊娠30週から分娩まで増大することがみ
とめられた。MHおよびJBと称する検体は、妊娠の最終週においてMIC-1母体血清
レベルがわずかに低減していた。
【００６５】MIC-1は羊水中で検出可能である： 母体血清の他、染色体分析を目的として第２トリメスターに10人の女性から採
取した羊水をプールし、サンドイッチELISA法によりMIC-1レベルを定量した。プ
ールした羊水サンプルは約13.68（±0.16）ng/mlのMIC-1を含有することが確認
された（図６Ａ）。プールした羊水の免疫沈降法およびウエスタンブロット分析
によって、ジスルフィド結合した成熟MIC-1ペプチドに相当する約25kDaのバンド
が明らかとなった（図６Ｂ、レーン５）。
【００６６】MIC-1はヒト胎盤抽出物中で検出可能である： 胎盤が妊娠女性の血清中の循環MIC-1の主な由来源であるかどうかを試験する
ために、MIC-1の存在について５つのヒト胎盤抽出物をサンドイッチELISA法によ
り調べた。全５つのサンプルは5.04〜54ng/mlの濃度範囲でMIC-1陽性であること
がわかった（図８）。重要なことは、早産から唯一得られたPL2と称するサンプ
ルの含有するMIC-1レベルが他のサンプルよりもはるかに低かったことである。
【００６７】BeWo培養細胞はMIC-1 RNAを構成的に発現し、成熟MIC-1を分泌する： 高レベルのMIC-1は胎盤抽出物中で検出されたが、胎盤栄養膜細胞系であるBeW
oもまたこのサイトカインを産生する可能性があると考えられた。従って、休止
状態のBeWo細胞で調整した組織培養培地は、サンドイッチELISA法により分泌MIC
-1の存在について試験を行った。BeWo細胞の24時間培養に使用した培地は約21.6
（±2.95）ng/mlのMIC-1を含有していることが確認された（図９Ａ）。５日間の
インキュベーション後の培養培地中のMIC-1濃度は約117（±7.2）ng/mlまで増大
した。非刺激BeWo細胞のMIC-1分泌能もまた免疫沈降法およびウエスタンブロッ
ト分析により調べた。高レベルで分泌された成熟MIC-1は、約25kDaのバンドとし
て示されるが、これが５日間にわたりBeWo細胞で調整した培地において観察され
た（図９Ｂ）。55kDaおよび12.5kDaの位置に移動した他のバンドが観察されたが
、これはそれぞれMIC-1が不完全にプロセシングされた半二量体（hemidimer）お
よび単量体を表すと考えられる。BeWo細胞に暴露されなかった培養培地は、サン
ドイッチELISA法または免疫沈降法で試験した場合に検出可能なMIC-1を含有して
いなかった。
【００６８】 RT-PCRを使用して非刺激BeWo細胞におけるMIC-1転写産物の存在を調べた。総R
NAを24時間培養したBeWo細胞から抽出し、上述のようにRT-PCRを行った。0.4kbp
の単一産物が観察され、これはMIC-1転写産物がBeWo細胞に存在することを示し
ている（図９Ｃ）。BeWoまたはプラスミドDNAの不在下では産物が検出されなか
った。
【００６９】考察： 実施例１の結果は、MIC-1が母体血清中に大量に存在し、そのレベルは妊娠の
進行に伴って実質的に上昇することを示している。
【００７０】 妊娠期間の母体血清においてMIC-1レベルの上昇が起こるが、これは発育中の
胎児がこのサイトカインに暴露されていることを必ずしも意味するものではない
。しかしながら、羊水中でMIC-1が検出されたということは、胎児への暴露につ
いての直接的な証拠を示している。羊水中のMIC-1レベルは第２および第３トリ
メスターの母体血清中に存在するレベルと匹敵しており、これは正常ヒト血清中
に存在するレベルよりもはるかに過剰である。妊娠期間に胎児が大量の羊水を摂
取し、また胎児の薄い上皮から羊水を吸収する可能性もある。従って上記知見は
、発育中の胎児が高濃度のMIC-1に暴露されていることを示す強力な証拠となる
。
【００７１】 母体血清MIC-1および羊水MIC-1が胎児または母胎を由来源としているかどうか
を調べるために、ヒト胎盤抽出物中のMIC-1を測定し、これにより、その抽出物
が大量のMIC-1タンパク質を含有することが確証された。興味深いことに、５つ
の胎盤抽出物のうち４つに存在するMIC-1量（＞18 ng/ml）は、プールされた母
体血清および羊水中で検出されたものよりも高かった。免疫組織化学およびin s
ituハイブリダイゼーションを利用することによりMIC-1転写産物およびMIC-1タ
ンパク質が、合胞体栄養細胞層に多量に存在する構造体である胎盤の終末絨毛（
terminal villi）に存在することが確証されている（Paralkarら、1998）。従っ
て、このことはBeWoヒト栄養膜細胞系がこのサイトカインを合成し分泌する可能
性を示す根拠となる。BeWo細胞はMIC-1転写産物を構成的に発現し、休止状態で
多量のMIC-1を分泌する。このような知見は、胎盤内の栄養膜細胞が母体血清お
よび羊水中に存在するMIC-1の主な由来源となることを示唆している。しかしな
がら、MIC-1転写産物およびMIC-1タンパク質がラットの18日胚における発生中の
上皮に局在化するということ（Paralkarら、1998）は、この胚もまた観察された
MIC-1レベルに寄与している可能性があることを示唆している。
【００７２】 妊娠期間におけるMIC-1の正確な役割は未知である。しかしながら、上述した
結果および他に報告されている実験結果に基づいた場合、MIC-1は妊娠期間中の
免疫調節的な役割を果たしていると考えられる。例えば、rhMIC-1がLPS活性化マ
クロファージからの炎症性サイトカインの放出を抑制することが既に報告されて
いる（Bootcovら、1997）。さらに、MIC-1は、正常ヒト非付着性Ｔ細胞が枯渇し
た骨髄細胞からの赤血球および顆粒球/マクロファージ細胞系統の形成を抑制す
ることが知られている（Hromasら、1997）。これらの知見は、MIC-1が炎症の広
範なインヒビターであり、単球/マクロファージ系統の発達およびそれらの前炎
症媒介物質の産生能力の両者を抑制することを示している。
【００７３】 炎症誘発性サイトカイン産生に伴う子宮内炎症は、胎児に対する生体拒絶また
は未熟児分娩と関連している（Romeroら、1992；Hillierら、1993；Opsjonら、1
993）。この点に関して、本発明者は、胎盤および羊水中に存在するMIC-1が子宮
内の炎症誘発性サイトカインの産生を抑制することにより妊娠を維持するために
作用していると考えている。正常妊娠と比較して早産分娩に由来する胎盤抽出物
が含有するMIC-1濃度が低下していたという本実施例の知見は、上記考察を強く
支持するものである。
【００７４】実施例２：イムノアッセイによるMIC-1変異体の検出および遺伝子型決定 MIC-1のクローニング過程において、このTGF-βスーパーファミリーのサイト
カインには少なくとも２種類の対立遺伝子が存在することがわかった。その後の
ヒトを対象とした実験においては、２つの対立遺伝子が一般的な集団においてみ
とめられることが確認された。これらの対立遺伝子は、成熟正常、すなわち「野
生型」MIC-1のアミノ酸配列の６位におけるヒスチジン（H6）が６位におけるア
スパラギン酸（D6）に変化する点突然変異において異なっている。これは、弱塩
基性の芳香族アミノ酸から強酸性の非環式アミノ酸への非保存的置換であること
を示している。
【００７５】方法および結果： 抗MIC-1抗体の作製： 抗MIC-1モノクローナル抗体（Mab）を分泌するハイブリドーマは、国際特許公
報WO 97/00958号に記載の方法に従って酵母（Pichia pastoris）で産生させた組
換えヒトMIC-1（rhMIC-1）で免疫したマウスから作製した。ハイブリドーマを、
20％FCS（CSL, Melbourne）を添加した、4.5g/l D-グルコース、110mg/l ピルビ
ン酸ナトリウム、0.584g/l L-グルタミン、４mg/l塩酸ピリドキシンを含むDMEM
（Gibco BRL）中で培養した。MAbを回収するために、ハイブリドーマを、Nutrid
oma-SR（Boehringer Mannheim）を添加した新鮮なDMEM-hiグルコースに７日間移
した。培養上清を2000rpmで10分間遠心し、細胞破砕物を除去し、使用まで凍結
した。
【００７６】 回収したMabに対して、多数かつ種々のMIC-1関連物、MIC-1突然変異体及びMIC
-1キメラを用いたウエスタンブロット分析によりエピトープマッピング試験を行
った。Mabは全てMIC-1のマウス相同体またはhTGF-β1のいずれとも交差反応せず
、Mabエピトープは全てコンホメーションに依存的であった。種々の抗原との区
別可能な交差反応パターンが各Mabについて観察され、このことは、MIC-1表面上
には少なくとも５つの免疫原性領域が存在することを示唆している。このMabの
うちの２種（13C4H3および26G6H6）をそれらの高親和性（それぞれED50の範囲は
1.3〜2.5×10-9Mである）に基づいてさらなる試験のために選択した。
【００７７】 Mab 13C4H3は、Asp202-MIC-1の対応するエピトープの親和性よりもはるかに高
い親和性を有する成熟ヒト野生型MIC-1（すなわち６位がヒスチジン）のアミノ
末端（1-13位）に結合することが見出され、それにより、ヒト野生型MIC-1とAsp202 -MIC-1とを区別することが可能となる。Mab 13C4H3はマウス-ヒトMIC-1キメ
ラ（ヒト配列と異なるアミノ末端（1-13）のアミノ酸は全てヒトMIC-1の対応す
るアミノ酸と置き換えられている）を認識することはできなかったため、アミノ
末端以外にもヒトとマウスのタンパク質の差異をもたらす他の残基が関与してい
る可能性があると結論付けた。
【００７８】 Mab 26G6H6は、MIC-1のいわゆる「フィンガー」の先端部分に近接するエピト
ープ（成熟ヒト野生型MIC-1の24-37位、56-68位および91-98位の領域内のアミノ
酸を含む）に対して反応することが見出された。Mab 26G6H6は６位にヒスチジン
またはアスパラギン酸を有するMIC-1タンパク質を区別することができなかった
。
【００７９】 従って、上記の抗体は、イムノアッセイにおいて結合したMIC-1レベルを測定
することによってヘテロ接合性個体とホモ接合性個体を検出することが可能であ
る。すなわち、Mab 13C4H3を用いた場合には、H6/H6ホモ接合体では最大結合が
観察され、D6/D6ホモ接合体では結合なし（ゼロ）が観察されると予想されるが
、中間（例えば50％）レベルの結合は、H6/D6ヘテロ接合体であると予測されう
る。
【００８０】 上記抗MIC-1抗体のエピトープ結合特異性は、Fairlieら、2001に詳細に記載さ
れている。
【００８１】26G6H6を用いた総MIC-1の測定： ELISAプレート（Maxisorb, Nunc）を、多く蒸発することを防ぐよう注意しな
がら重炭酸バッファーpH 9.4-9.8中１：500の26G6H6 80μlを用いて４℃にて24
時間かけて被覆し、MIC-1濃度測定値に応じてサンプルをサンプルバッファー（
１％ w/v BSA（Progen）および0.05％ v/v Tween（Sigma）を含むPBS（pH7.2）
）で３〜100倍希釈した。MIC-1の「標準」は、サンプルバッファーで１μg/ml r
hMIC-1（１％ BSA w/v、３mM HCl中）を1000倍希釈した後、８倍希釈（1000 pg/
ml〜7.8 pg/ml）して調製した。
【００８２】 アッセイを以下のとおり行った： 被覆プレートを洗浄バッファー（PBS中0.05％ v/v Tween）を用いて300μl/ウ
エルで３回洗浄した。ブロッキングは、250μlの１％ BSA w/vと共に21℃にて１
時間インキュベートすることにより行った。続いてブロッキングバッファーを除
き、その間に洗浄を行わずに100μl/ウエルの標準またはサンプルを21℃にて１
時間かけて添加した。次に、検出抗体である233-Pをサンプルバッファーで25000
倍（v/v）希釈し、添加（100μl/ウエル）し、４℃にて16時間インキュベートし
た。サンプルバッファーで5000倍（v/v）希釈したロバ抗ヒツジビオチン化IgG（
Jackson's Laboratories）を21℃にて１時間かけて1OOμl/ウエルで添加した後
、サンプルバッファーで2000倍（v/v）希釈したストレプトアビジン-HRPコンジ
ュゲート（Genzyme）と共に（100μl/ウエル）、21℃にて30分間インキュベート
した。製造業者が推奨するバッファー中0.4 mg/mlのOPD（Sigma）を100μl/ウエ
ルで、7.8pg/mlの標準とゼロの標準とに明らかな差がみとめられるまでインキュ
ベートした。1000pg/mlの標準は少なくとも１より大きいODをしめすことになる
。最後に、100μl/ウエルの2N H2S04を用いて反応を停止させた。
【００８３】 プレートは490nmで読みとることができ、標準曲線を２つの結合部位の双曲線
を用いて作成した。サンプルの値はこの曲線から外挿してもとめた。
【００８４】 検出抗体233-Pの添加前からOPDの添加までの各ステップの後にはプレートを30
0μl/ウエルの洗浄バッファーで洗浄した。
【００８５】抗MIC-1 PAbおよびMabの感受性および特異性： ヒツジPAb 233-PおよびマウスMAb 13C4H3のrhMIC-1に対する結合能を直接ELIS
A法により調べた。抗体希釈液で500000倍希釈したMAb 13C4H3およびヒツジPAb 2
33-Pを含む未希釈組織培養上清の両者が1.8ngの固定化rhMIC-1と強く結合するこ
とがわかった。rhMIC-1と、マウスミエローマ細胞系SP2/0で調整した培養培地、
未調整培養培地、マウスIgG1、イムノグロブリン富化正常ヒツジ血清または抗体
希釈液との間に反応は観察されなかった。非被覆ウエルに対する結合の最小バッ
クグラウンド値は試験した全サンプルについて観察された。13C4H3または233-P
を固定化rhTGF-β1と共にインキュベートした場合にはいずれにおいても反応は
検出されなかった。
【００８６】 抗体の特異性は、精製rhMIC-1とMAb 13C4H4および26G6H6を用いた免疫沈降法
と、その後の種々のMIC-1特異的抗体を用いたイムノブロット分析により調べた
。MIC-1抗体は全て25kDのMIC-1二量体を特異的に認識した。さらに、抗体のブロ
ッキングは、精製rhMIC-1と共に抗体をプレインキュベートすることにより行い
、その後ウエスタンブロット分析を行った。この結果、抗体とMIC-1特異的25kD
バンドとの相互作用が大幅に低減し、このことは抗体Mab 13C4H4、26G6H6および
233-Pの特異性を確証している。更に、試験した上記抗体はTGF-βスーパーファ
ミリーの他のメンバーであるインヒビンを認識しなかった。典型的なアッセイ標
準曲線を図１０に示す。誤差を示すバー（error bar）は１つの標準偏差を示す
。
【００８７】13C4H4を用いたMIC-1遺伝子型の判定： 多数のMIC-1エピトープに対して検出抗体233-Pの親和性が高いほど、13C4H4と
比較してH6対立遺伝子とD6対立遺伝子との間に検出されるMIC-1の差は大きくな
る。この差は、H6エピトープおよびD6エピトープの13C4H4に対する親和性の差異
の関数である。233-Pの存在は、長い時間にわたるインキュベーションにおいて
、捕捉抗体13C4H4と結合するD6を次第に低下させる。これらの未結合となった分
子は、13C4H4結合部位に対し特異的なポリクローナル抗体のより高い親和性成分
と次第に結合することになる。これらの分子は測定されるMIC-1から排除された
ことになる。
【００８８】 他の作用もまた観察される。すなわち、捕捉抗体との結合から排除されたMIC-
1の各分子は、多数の233-P抗体を排除する。これにより、233-Pがポリクローナ
ルであるためMIC-1分子の多くの部分と結合する。結果としては、MIC-1と233-P
との免疫複合体がアッセイから排除されるということである。233-P抗体はバッ
クグラウンド値の主な寄与因子であるため、観察されるMIC-1濃度の差はさらに
増大する。ホモ接合性D6/D6遺伝子型の場合には、バックグラウンド染色は、広
範な濃度差にわたってゼロ以下の読み取り値が得られる点まで低減する。H6対立
遺伝子の場合には、ポリクローナル抗体との結合から遊離するMIC-1の比率は非
常に低く、観察されるMIC-1濃度とはさらに大きく異なっている。
【００８９】 特定のサンプルにおけるMIC-1濃度およびMIC-1対立遺伝子を判定するために行
った２つのサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイはそれぞれ26G6H6および13C4
H4を捕捉抗体として使用している。分析サンプルは、組織培養物（組織培養培地
もしくは細胞抽出物）、ヒト血清または血漿、あるいは、液相状態のまたは任意
の処理により液相状態に処理された任意のヒトサンプルに由来するものとしうる
。
【００９０】 アッセイには、重炭酸バッファーpH9.4-9.8中の13C4H4（１：500）80μlを用
いて４℃にて24時間かけて被覆したELISAプレート（Maxisorb, Nunc）を用いた
（多くの蒸発を防ぐために注意を払う必要がある）。13C4H4アッセイ濃度で判定
したMIC-1測定値に応じて、サンプルをサンプルバッファー（PBS, pH7.2中１％
w/v BSA（Progen）、0.05％ v/v Tween（Sigma））で３〜100倍に希釈した。サ
ンプル濃度は50〜150pg/mlとなるようにする必要がある。MIC-1標準（１％ BSA
w/v, ３mM HCL中の１μg/ml組換えMIC-1）をサンプルバッファーで1000倍希釈し
、その後８倍希釈を行った（1000pg/ml〜7.8pg/ml）。
【００９１】 アッセイは以下のとおり行った： 被覆プレートを洗浄バッファー（PBS中0.05％ v/v Tween）を用いて300μl/ウ
エルで３回洗浄した。ブロッキングは、250μlの１％ BSA w/vと共に21℃にて１
時間インキュベートすることにより行った。続いてブロッキングバッファーを除
き、その間に洗浄を行わずに100μl/ウエルの標準またはサンプルを21℃にて１
時間かけて添加した。検出抗体である233-Pはサンプルバッファーで10000倍（v/
v）希釈してから添加し（100μl/ウエル）、４℃にて16時間インキュベートした
。サンプルバッファーで5000倍（v/v）希釈したロバ抗ヒツジビオチン化IgG（Ja
ckson's Laboratories）を添加し（100μl/ウエル）、21℃にて１時間インキュ
ベートした後、サンプルバッファーで2000倍（v/v）希釈したストレプトアビジ
ン-HRPコンジュゲート（Genzyme）と共に（100μl/ウエル）、21℃にて30分間イ
ンキュベートした。7.8pg/mlの標準とゼロの標準との間に明らかな差がみとめら
れるまで、製造業者が推奨するバッファー中0.4mg/mlのOPD（Sigma）を100μl/
ウエルでインキュベートした。1000pg/mlの標準は、少なくとも１より大きいOD
を示すはずである。100μl/ウエルの2N H2SO4を用いて反応を停止させた。
【００９２】 プレートは490nmで読みとることができ、標準曲線を２つの結合部位の双曲線
モデルを用いて作成した。サンプルの値はこの曲線から外挿してもとめた。
【００９３】 検出抗体233-Pの添加前からOPDの添加までの各ステップの後にはプレートを30
0μl/ウエルの洗浄バッファーで洗浄した。
【００９４】考察： MIC-1対立遺伝子を判定するために、13C4H6アッセイから得られたMIC-1濃度の
測定値を26G6H6アッセイで測定した総MIC-1濃度で割った。それぞれの対立遺伝
子に対するカットオフ比率は、両方のアッセイにおいて使用したホモ接合性H6/H
6およびD、ならびにヘテロ接合性（HD）対照により判定した。検定データを以下
に示すように入れた。
【００９５】 ０（ゼロ）未満の比率はホモ接合性D6/D6遺伝子型を、０〜0.6はヘテロ接合性
を、そして0.7以上の比率はホモ接合性H6/H6を示す。１を超える比率があること
に留意されたい。アッセイの動特性のために、ホモ接合性D6/D6タンパク質に関
しては、濃度が高い場合にはODが０をはるかに下回ることもある。
【００９６】 38人の健常で通院可能な研究者から得られたデータは、表の形式で以下に示す
。DNA配列決定により調べたところ、これらのうち18人がMIC-1遺伝子型を有して
いた。18人の被験者のDNA配列とELISA法により判定した遺伝子型は100％一致し
ていた。さらに95サンプルを分析したが、このサンプルは、48人の20〜69歳の男
性と47人の17〜71歳の女性を含む健常な血液ドナーから得られたものである。ホ
モ接合性D6/D6遺伝子型を有する被験者が５人、ヘテロ接合性遺伝子型が45人、
ホモ接合性H6/H6遺伝子型が45人いた。
【００９７】実施例３：MIC-1遺伝子型を判定するためのレシオメトリックPCR RFLPアッセイ 制限断片長多型（RFLP）アッセイは長年にわたりDNA突然変異分析の主な手法
として利用されている。これらのアッセイの中には、より感度が高く簡便な集約
型ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイに取って代わられたものもある。突然
変異検出アッセイのその他のものとしては、２つの方法を組み合わせて異なるDN
A多型を検出するものがある。MIC-1の場合には、H6-D6対立遺伝子の点突然変異
の領域は約90％がGCであるGCリッチ領域である。このことにより、競合的PCRな
どの対立遺伝子または遺伝子型の相違を検出する手法を利用することが非常に困
難となっている。従って、PCR増幅したDNAセグメントのRFLP分析を利用する必要
がある。
【００９８】 RFLPアッセイは、DNA配列の相違によりもたらされるDNA制限酵素部位の相違に
依存するものである。これらの部位は、通常は固有のものであり、そのため制限
酵素消化物を分子量により分離した際に可視化されるバンドのパターンが区別可
能な相違を示す。典型的には、このアッセイはアガロースゲルDNA電気泳動を用
いて行われる。MIC-1の対立遺伝子の相違する部分の領域内には、ＣからＧへの
点突然変異によりもたらされる有用な固有の制限部位はない。このため、臭化エ
チジウム検出を用いるDNAアガロースゲル電気泳動の特性を利用するRFLPアッセ
イに新規な改変を加える必要がある。高アガロース濃度（例えば３％）を利用す
ることにより、小さな分子量のDNAバンドについての解像能が向上する。UV光を
照射した場合には、臭化エチジウム染色の差異がDNA濃度の差異と比例する。
【００９９】 PCRプライマー（5p, 5'GCCGCCGCCGTCGCAGTCGGA3'（配列番号８）；3p, 5'CAGG
CGGTGCAGGCTCGTCTTGAT3'（配列番号９））は、消化した際にD6対立遺伝子におけ
る共通のAVRII部位が主要産物（147bp）となるような産物を与えるように設計し
た。H6対立遺伝子の場合には、また別のAVRII部位によって102bpの主要産物がも
たらされ、これはDNAアガロースゲル電気泳動の検出限界に近い。残る断片は、
アガロースゲル上では可視化するのが困難なより小さな45bpの産物である（図１
１の制限地図を参照されたい）。
【０１００】方法： ゲノムDNAを用いたPCR： pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）の標準マスターミックスは、製造業者の
推奨に従って、１反応当たり20μlの容量で10 pM 5pプライマーおよび3pプライ
マーの各々１μlを含むように調製した。各被験者からのゲノムDNA 100ngを鋳型
として使用した。
【０１０１】 PCR： 変性 94℃にて１分 アニーリング 65℃にて１分 伸長 72℃にて２分 MJ Research PTC-200 Peltierサーマルサイクラーにおいて40サイクル行った
。製造業者の説明書に従い、AVA II（New England Biolabs）を用いて３℃にて
一晩かけてPCR産物を消化した。
【０１０２】 ３％アガロース ゲル、0.02％ w/v 臭化エチジウム、80Ｖで、別々のバンドが
観察されるまで泳動を行った。その後、対照（DD、HD、HH）に従って遺伝子型を
決定した。
【０１０３】結果および考察： 図１２に示すように、ホモ接合性D6/D6対立遺伝子の場合には、147塩基対の産
物のみが可視化される。ヘテロ接合体では２つの産物（147bpおよび102bp）が３
：１の比で現れ、ホモ接合性H6/H6では等量の147bp断片および102bp断片が現れ
る。ホモ接合性H6/H6とヘテロ接合性対立遺伝子との間での消化産物の比の大き
な違いは裸眼で容易に観察することができ、特殊な分析を必要とするものではな
い。147bp産物と102bp産物にはわずかな強度の違いが観察される。これは、臭化
エチジウムのインターカレーションの量の差異によるものである。この作用はさ
らに、異なる比の小さなDNA消化産物に対する染色強度の差異を増強する。大き
なDNA断片の場合には、この作用はそれほど顕著なものではない。
【０１０４】 配列決定法により、健常な通院可能な研究者38人のうち18人がMIC-1遺伝子型
を有していると判定された。上記PCRから得られた産物はアガロースゲルから精
製し、Perkins-Elmer ABI prism DNAシーケンサーを用いて製造業者が推奨する
プロトコールに従って配列決定を行った。各被験者において、5pプライマーおよ
び3pプライマーをそれぞれ用いて、フォーワード方向およびリバース方向の配列
決定を行った。
【０１０５】 ELISA、レシオメトリックPCR RFLPおよびDNA配列決定法から得られた結果を表
にまとめた（表１）。DNA配列決定を行った18人の被験者については、これらの
方法において結果が100％一致した。さらに21人の被験者は、ELISA法により遺伝
子型を判定し、種々の遺伝子型のMIC-1の濃度範囲について13/26の比の範囲であ
ると判定した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】実施例４：慢性関節リウマチ（RA）患者由来のサンプルを用いて行ったELISAア
ッセイ 以下の方法に従って、RAを罹患する集団から無作為抽出した21個体、および従
来の治療に応答を示さなかった非常に重篤なRAを患う９個体に由来する血清サン
プルにおいてELISAアッセイを行った。結果は以下の表２に示す。
【０１０８】方法： MIC-1サンドイッチELISA法： MIC-1サンドイッチELISA法は、抗原捕捉に抗MIC-1マウスMab（13C4H3および26
G6H6）、そして検出に標識ヒツジポリクローナル抗体（PAb 233-P）を使用して
行った。抗体の最適濃度は経験に基づいて決定して以下の全試験に使用した。96
ウエルのMaxisorp ELISAプレートを、被覆用バッファーで５倍希釈した抗MIC-1
MAb上清（最終イムノグロブリン濃度は約20ng/mlとした）で40℃にて24時間かけ
て被覆した。続いてプレートを300μlの洗浄バッファーで３回洗浄し、非特異的
結合を250μlの１％(w/v) BSAのPBS溶液で37℃にて２時間かけてブロッキングし
た。次にrhMIC-1標準、組織培養上清、および血清をプレートに添加し（100μl/
ウエル）、37℃にて１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、抗
体希釈液で5000倍希釈したヒツジPAb 233B3-Pを100μl/ウェルで添加し、37℃で
１時間インキュベートした。続いてプレートを３回洗浄し、抗体希釈液で5000倍
希釈したビオチン化ロバ抗ヒツジIgGを100μl/ウエルで添加し、37℃にて１時間
インキュベートした。その後、直接ELISA法を行うためにプレートを発色させた
。サンプル中のhMIC-1濃度は、rhMIC-1標準曲線との比較により決定した。
【０１０９】
【表２】 慢性関節リウマチ 数 少なくとも１のD6対立遺伝子を有する(数)/割合％ 無作為選択RA 21 (１)/５％ 重篤なRA ＊ ９ (４)/44％ ＊試験的治療（例えば骨髄移植）が必要な程度に重篤なRA
【０１１０】 この結果は、D6/D6ホモ接合型およびH6/D6ヘテロ接合型の個体は重篤な慢性関
節リウマチ（RA）に対する素因が高いことを示唆している。
【０１１１】実施例５：前立腺癌患者由来のサンプルを用いて行ったELISAアッセイ ELISAアッセイは、前立腺癌患者（前立腺特異的抗原（PSA）が平均レベルを超
える28個体とPSAレベルが正常範囲内の41個体）から採取した血清サンプルを用
いて、RAに関する実施例４に記載の方法と同様に行った。結果は以下の表３に示
す。
【０１１２】
【表３】 前立腺癌 数 少なくとも１のD6対立遺伝子を有する(数)/割合％ PSA＜11 41 (16)/39％ PSA＞11 28 (０)/０％
【０１１３】 PSAレベルが高かったサンプルのうち、D6/D6ホモ接合体またはH6/D6ヘテロ接
合体を示す個体はなかった。この結果は、D6/D6遺伝子型およびH6/D6遺伝子型が
前立腺癌の発症に対し防御的である可能性があること、そしてこの腫瘍は他の遺
伝子型とより高頻度に関連していることを示している。
【０１１４】実施例６：MIC-1および胎児性癌抗原（CEA） 胎児性癌抗原は、大腸癌により産生されるタンパク質の１種であり、腫瘍容積
の尺度として一般的に使用されている。このため、CEAは種々の治療に対する応
答の尺度としても有用なものとなっている。本発明者は、転移性CRCを患う10人
の患者に由来する血清を分析し、そのMIC-1血清レベルを測定した。CEA血清レベ
ルは、慣用されている標準的な研究室における分析法により測定した。MIC-1とC
EA血清レベルとの間には有意な正の相関がみられた（図１３）。試験した数が小
さかった点を考慮すると、これは非常に重要な知見であると考えられる。
【０１１５】実施例７：MIC-1および大腸癌 上皮性悪性腫瘍は最も一般的な癌のグループであり、そのため科学的、医学的
および経済的に非常に重要である。TGF-β1サイトカインは中でも顕著に上皮細
胞に重要な調節的影響を与える。該サイトカインは、上皮増殖、細胞運動および
付着を調節し、また血管形成および免疫調節活性のあることが示されている。TG
F-β1経路の複数の異常が、乳房、大腸および前立腺の悪性腫瘍に関して記載さ
れている。このような異常としては、それらの分泌、受容体発現および受容体後
の経路における異常がある。前立腺の場合には、in vitroおよびin vivo細胞系
、ならびに動物試験において、TGF-β1は、p53依存的および非依存的経路を介し
て細胞周期の「チェックポイント」およびその後のアポトーシスにおいて機能し
ていることが示されている。TGF-β1は、正常な前立腺により発現される負の調
節を担う増殖因子であると示されているが、前立腺癌の全過程にわたって、その
経路の脱調節の結果としてTGF-β1分泌が上昇しうる。血小板を枯渇させた血清
中で測定したTGF-β1の血清レベルの増大は、生存率の低減と、疾患のより迅速
な進行と関連している。MIC-1は、元々はマクロファージ活性化と関連した高発
現に基づいて同定された、TGF-β1スーパーファミリーから分岐したメンバーで
ある。MIC-1は、TGF-β1と同様に、正常前立腺において発現され、p53依存的お
よび非依存的に細胞機能に関与している。一方、TGF-β1とは異なり、循環血管
成分により産生されるものではないため、血清または血漿中で容易に測定するこ
とが可能である。本実施例は、MIC-1の大腸癌（CRC）における局所的発現と、こ
のサイトカインの血液中への全身性の放出の両方を示す証拠を提供する。得られ
た結果はまた、血清MIC-1レベルと遺伝子型との相関を、臨床学的ステージおよ
びCRCの進行と共に示しており、このことは、このサイトカインの測定が臨床的
および治療的用途となることを示している。
【０１１６】方法 組織サンプル： St Vincent's Hospital（Sydney）において大腸または直腸の腺癌を外科手術
により切除した224人の一連の個体が本研究に登録した。手術前に放射線療法ま
たは化学療法をうけた個体はのぞいた。炎症性腸疾患を罹患するか、または家族
性腺腫様ポリープ（FAP）もしくは遺伝的非結腸ポリポーシス（HNPCC）の既往症
がある個体ものぞき、さらには原発性腫瘍を完全には切除できなかった個体もの
ぞいた。
【０１１７】 全ての腫瘍からの新鮮で代表的な組織サンプル（500mg）およびそれに対応す
る正常大腸粘膜を直ちに70℃にて凍結した。男性141人および女性86人（32〜93
歳、平均66.6±12.4歳）から合計224の新鮮な腫瘍検体をアッセイした。これら
の腫瘍のうち19検体はTNMステージＩであり、22検体はステージIIであり、111検
体はステージIIIであり、72検体はステージIVであった。大腸癌および他の悪性
腫瘍の家族歴は個体またはその親族にインタビューして調べた。癌の推測される
全ての原因および不確定な死因を、死亡証明書およびカルテを入手するかまたは
主治医と接触することにより確認した。家族歴を利用することにより、HNPCCに
ついてアムステルダムの診断基準または改変診断基準のいずれかを満たす家系を
調べた。
【０１１８】腫瘍の組織病理学的分析： 解剖病理科（St Vincent's Hospital）内の組織病理学担当者により、全ての
腫瘍について独立して腫瘍の組織病理型、ステージおよびサイズを判定した。ミ
スマッチ修復状態を知らない状態で、腫瘍のグレード、ムチン産生の程度、腫瘍
成長パターン、ならびにクローン病様炎症性浸潤、上皮細胞間リンパ球または腫
瘍周囲リンパ球の存在をその見込みについて判定した。10％未満の細胞が腺を形
成していた腫瘍を高いグレードに分類し（ほとんど区別できない）、50％を超え
る細胞外ムチンを含む腫瘍はムチン性と分類した。
【０１１９】 腫瘍成長パターンは、既に公開されている基準に基づいて浸潤性または膨張性
のいずれかと判断した。腫瘍周囲のリンパ系反応の程度およびクローン病様のリ
ンパ系反応の程度は、Jassら（1996）の方法に従って分類した。上皮細胞間リン
パ球は、光学顕微鏡により、ヘマトキシリンおよびエオシン切片上でリンパ球の
形態を有した細胞が完全に腫瘍上皮内にあるようにみられるものとして同定した
。これらは、10高倍率視野当たり30個を超える細胞が存在した場合には顕著に存
在すると分類した。
【０１２０】 腫瘍体積は、式Ｖ＝ｐ（Ｌ＋Ｔ）／４）２×Ｄ（式中、Ｖ＝体積（ml）、Ｌ＝
縦の寸法（cm）、Ｔ＝周囲の寸法（cm）、Ｄ＝腫瘍の奥行き（cm））を用いて、
報告されている腫瘍寸法から評価した。
【０１２１】p53およびK-rasの体細胞変化の分析： K-ras遺伝子のコドン12における第１および第２塩基の突然変異は、既に記載
されているようにREMS-PCRを用いて検出した。腫瘍細胞内のp53の蓄積を同定す
るために、腫瘍組織のパラフィン包埋切片に対し、マウス抗ヒトp53抗体DO7（DA
KO）を用いたp53の免疫組織化学分析を行った。間質細胞および正常上皮の染色
がなく、腫瘍細胞のうち20％を超えるものが中程度から高程度の強度の核染色を
示した場合に、その腫瘍はp53タンパク質の蓄積を示すとみなした。
【０１２２】 さらに、実施例１に記載のMIC-1 ELISA法を用いてサンプルを分析し、MIC-1レ
ベルおよび遺伝子型を判定した。分散分析、パラメトリックおよびノンパラメト
リック相関、カプラン−マイヤー分析、ならびに単純なロジスティック回帰を利
用して、MIC-1血清レベルおよび遺伝子型を上記概説したようにまとめた以前の
データと比較した。
【０１２３】結果： MIC-1レベルは、健常血液ドナーから採取した200の正常血清サンプルの分析か
ら決定した正常範囲に基づいて正常群および異常群に層別化した。MIC-1レベル
が1050pg/mlを超えた場合にはそれを異常と分類した。統計解析は、血清および
上述したように層別化したレベルの両方を用いて行った。パラメトリック検定を
用いた場合には血清レベルの対数を用いた。
【０１２４】 被験者のMIC-1血清レベルが高くなるほど、腫瘍のTNMグレードが高くなった。
分散分析を利用したところ（ANOVA）、グレード１とグレード４との間、および
グレード２とグレード４との間に有意差がみとめられた（ｐ＜0.05）。TNM腫瘍
グレードは、低グレード（TNMグレード１〜２）と高グレード（TNMグレード３〜
４）の２つの群に層別化した。これらの群が有意に異なるかどうかを調べるため
に、これらの群が等しいという仮説で分散Ｆ検定の等値を利用してデータを分析
した。その結果これらの群は異なっていた（ｐ＜0.0001：Ｆ＝21.01）。この分
散における相違は、高いMIC-1が腫瘍グレードの高さと有意に連関していること
を示している。
【０１２５】 ANOVAを用いて分析したところ、高く異常なMIC-1レベルを示す個体は転移性疾
患を有する可能性が高かった（ｐ＜0.04）（図１４）。
【０１２６】 癌により死亡した個体の部分集団を分析したところ、ホモ接合性H6/H6 MIC-1
遺伝子型と疾患を患わない生存期間の延長との間に有意な連関があった。また、
ヘテロ接合性H6/D6とホモ接合性D6/D6はそれぞれ疾患を患わない生存期間が短か
った（ｐ＜0.02：対数順位（マンテル−コクス）（図１５）。これは遺伝子量の
影響を示している。全個体を分析した場合には、MIC-1遺伝子型と診断から再発
までの時間との間に類似した関連性がみとめられた。CRCで死亡した被験者に存
在するものと同じ遺伝子量の影響が集団全体に存在する。
【０１２７】 ホモ接合性H6/H6群は疾患を患わない生存期間が長いため、本発明者は、この
部分集団内においてMIC-1の正常レベルと異常レベルとを比較して分析した。ホ
モ接合性H6/H6 MIC-1が異常に高いレベルの個体は、疾患の診断および初期治療
から再発までの時間が短かった（ｐ＜0.03）（図１６）。ヘテロ接合性H6/D6 MI
C-1遺伝子型またはホモ接合性D6/D6 MIC-1遺伝子型を示す被験者に関しては、血
清MIC-1レベルの正常レベルと異常レベルとの間に、疾患を患わない生存期間に
ついて統計学的に有意な差はなかった。このことは、腫瘍の挙動に対してMIC-1
遺伝子型が機能的に影響を及ぼしていることを示している。
【０１２８】 診断からCRCが原因の死亡までの時間に及ぼすMIC-1遺伝子型の影響について全
個体を分析した場合、わずかな影響がみとめられた。ホモ接合性D6/D6およびヘ
テロ接合性H6/D6は、ホモ接合性H6/H6と比較して全体的に生存に関して有利であ
った。遺伝子量の影響をみとめることはできたが、統計学的有意差には達しなか
った。少数のホモ接合性D6/D6被験者しか存在しなかったため、それらを除外し
た。残った個体をデュークスのステージに従って層別化した。全ての群において
ヘテロ接合性H6/D6 MIC-1遺伝子型は生存の有利性が高かった。これは、デュー
クスのステージＤ群において有意性に達した（ｐ＜0.05）（図１７）。このこと
は、よりMIC-1レベルが高くなるデュークスのステージＤにおいては全体の腫瘍
体積がより大きくなるため、より大きな影響があることに起因すると考えられる
。
【０１２９】 また、相関ｚ検定を利用したところ、MIC-1と年齢との間に高い有意な相関が
あった（ｐ＝0.0006：Ｚ＝3.5）（図１８）。このような傾向は正常集団におい
てはみとめられなかった。
【０１３０】 MIC-1レベルと、性別、p53表現型、erb2、mlh1 mlh2または腫瘍体積との間に
有意な関係はみとめられなかった。さらに、遺伝子型と比較した場合のMIC-1レ
ベルの有意な相違はなかった。
【０１３１】考察： MIC-1レベルは、腫瘍のTNMステージ、デュークスのステージ、および転移の存
在と相関している。このことは、腫瘍体積が大きくなるほどMIC-1レベルが高く
なることを示している。腫瘍体積の測定値は、原発腫瘍の体積であって、必ずし
も全腫瘍量を有効に表すものではなかった。遺伝子型の影響を考慮した場合、パ
ラドックスがあるように思われる。ホモ接合性H6/H6遺伝子型は、疾患を患わな
い生存時間の延長と関連すると同時に、全体の生存期間が短いこととも関連する
。これらの観察結果は、以下の理論により説明することができると考えられる。
ホモ接合性H6/H6 MIC-1は腫瘍増殖を遅滞させるが、免疫系を阻害する点で負の
効果も有する。初期の腫瘍抑制の期間の後、腫瘍は抵抗性を有し、さらに増大し
た高レベルのMIC-1を産生する。この時点で、免疫系に対する高レベルのMIC-1の
有害な影響が明らかに生じ、死亡へのより迅速な進行の一因となる。対照的に、
ヘテロ接合性H6/D6およびホモ接合性D6/D6 MIC-1は腫瘍増殖を遅滞させないが、
正の影響として免疫系を抑制することもない。従って、疾患がより早く再発して
も、免疫抑制は小さい。その結果、腫瘍の制御がより良好であり、そのため全体
の生存期間が長くなる。
【０１３２】 このことは、前立腺癌におけるTGF-β1の場合とも類似していると考えられる
。前立腺腫瘍が成長するに従って、最初はTGF-β1の増殖の負の影響に対し応答
するが、最後にはシグナル伝達経路の種々の変化によりこの腫瘍に対する影響は
失われる。これらの変化によって、より迅速な疾患の進行に伴ってTGF-β1の産
生およびそれに付随する免疫抑制が増大する。
【０１３３】 TGF-β1レベルの上昇は前立腺癌における全体の生存期間の低減と関連してい
る。TGF-β1は、前立腺癌に対する細胞性免疫をその用量と関連して低減するこ
とが証明されている。MIC-1は最初にマクロファージ活性化について選択された
サブトラクションクローニングライブラリーから単離され、このことはMIC-1が
細胞性免疫に対する影響を有している可能性があることを示している。Ｄ対立遺
伝子の存在は生存の高い有利性と関連している。生存の有利性は、ＨおよびＤ対
立遺伝子が介在する細胞性免疫機能の示差的な変化により媒介されると考えられ
る。ホモ接合性 H6/H6 MIC-1遺伝子型が存在する場合には、MIC-1血清レベルが
上昇するにつれ、他のMIC-1遺伝子型のその血清レベルの変化と同等の変化より
も大きく免疫が抑制される。Ｄ対立遺伝子の場合には、免疫抑制が低く、これに
より細胞性免疫が腫瘍を抑制した状態に維持することになり、生存の有利性をも
たらす可能性がある。この影響がデュークスのステージＤにおいてのみ有意であ
るという理由は２つある。第１に、各群の数が小さいことである。第２に、デュ
ークスのステージＤにおけるMIC-1血清レベルが高いほどより大きな影響がある
ということである。これらの２つの要因が、統計的有意差には達しないが疾患の
初期段階にみられるパターンに寄与している。これはTGF-β1の状況と類似して
いる。２つのTGF-β1遺伝子のうち一方に機能障害がある動物の場合には、新生
物の発生頻度が高くなる。
【０１３４】 MIC-1の場合には、その機能における遺伝子型の相違のもととなる２つの変異
型対立遺伝子があり、作用機構に関する疑問が生じる。MIC-1分子における点突
然変異は、TGF-β1スーパーファミリーの受容体結合部位であることが知られて
いない領域内にある。TGF-β1と類似した状況は、本発明者が記載しているよう
に、従来は受容体の異常によるものと、受容体後の経路の異常によるものである
と考えられている。MIC-1の場合には、Ｄ突然変異はプロペプチドから成熟ペプ
チドとなる切断部位に近接している。対立遺伝子間の機能的相違を説明する他の
ものとしては、細胞プロセシングによる干渉とおそらくMIC-1の分泌がある。
【０１３５】 臨床的には、MIC-1レベルおよび遺伝子型を用いて、再発および死亡への進行
の可能性に関して患者を層別化することができる。治療に関して、Ｄ対立遺伝子
を有する患者はホモ接合性H6/H6 MIC-1による利点があるが、この利点はMIC-1投
与の免疫抑制作用により平衡化されると考えられる。この平衡化は、その標的化
送達により克服されうる。
【０１３６】実施例８：慢性関節リウマチにおけるMIC-1レベルの変化 本発明者はまた、慢性関節リウマチ（RA）を患う個体の２つの群に着目した。
１つは、既に治療をうけておりまた疾患が拡大している、RAを患う患者20人から
なる無作為選択群である。これらの個体は、１gの静脈内投与メチルプレドニゾ
ロン（抗炎症剤）で治療を受けていた。これらの個体を、治療前、ならびに治療
後４時間および24時間において評価した。標準的な研究室における手法を用いて
、上記の時点において血清Ｃ反応性タンパク質（CRP）を測定した。
【０１３７】 第２の群は、重篤な進行中のRAのために自己幹細胞移植をうけた23人の個体か
ら構成された。これらの個体は、５種の疾患改善薬による治療を既に行ったが、
治癒していなかった。幹細胞は顆粒球-コロニー刺激因子を用いた前処置の後に
回収した。続いて個体を高用量のシクロホスファミド（化学療法剤）を用いて治
療した。次に、自己由来の既に回収済みの幹細胞を注入した。これにより脊髄機
能が有効に「レスキュー」された。血液サンプルは、治療の６日前および治療の
1.5ヶ月後において採取した。CRPおよび腫瘍壊死因子（TNF）の血清レベルを測
定した。
【０１３８】 全ての個体について、標準的な方法により関節膨張スコアおよび関節圧痛スコ
アを測定し、健康評価アンケート（HAQ）を行った。これらの測定値は、各時点
についてもとめた。
【０１３９】 血清サンプルは、本発明の標準ELISA法により各時点でMIC-1遺伝子型および血
清レベルについて分析した。これらの結果は、上記の変数、および100人の正常
血液ドナーからなる正常集団のMIC-1血清レベルと比較した。
【０１４０】結果： 対応のあるｔ検定を利用したところ、RA患者（ｎ＝43）におけるMIC-1血清レ
ベルは、正常集団（ｎ＝100）と比較して有意に高かった（RA 平均＝893pg/ml
、SD=614：正常 平均=406pg/ml、SD=253、ｐ＜0.0001）（図２０）。
【０１４１】 移植集団においては、移植後1.5ヶ月のMIC-1血清レベルが移植前の血清レベル
よりも高かった（対応のあるｔ検定解析を用いた；ｐ＝0.021）。また、移植後1
.5ヶ月において関節膨潤および圧痛スコアならびにHAQもまた有意に低下した（
ｐ＜0.003）ことは注目に値する。CRPおよびTNF血清レベルには有意な変化はな
かった（対応のあるｔ検定）。移植前と移植後1.5ヶ月におけるMIC-1レベルの変
化の程度は、1.5ヶ月の時点における関節スコアの変化と正相関していた（ｐ＝0
.006；相関Ｚ検定）。移植後の異常に高いMIC-1血清レベル（＞1050pg/ml）はTN
Fレベルの変化と負の相関を示す（ｐ＜0.03；マン−ホイットニーｕ検定）。移
植前のMIC-1血清レベルは移植後のTNF血清レベルと関連しているが、有意性には
至っていない（ｐ＝0.058；ケンドールの相関検定）。その他には有意な関係は
なかった。
【０１４２】 まとめると、上述した傾向は、MIC-1血清レベルが移植後1.5ヶ月における滑膜
性関節機能障害の予測因子であることを示す可能性がある。このデータはまた、
MIC-1血清レベルおよびこのレベルの変化が、TNF血清レベルに関連している可能
性も示している。TNFは、RAの病理発生に寄与していることが知られるサイトカ
インである。また他にTNFは、再形成する骨髄からのサイトカイン分泌の上昇を
示す。
【０１４３】 無作為選択RA集団において、MIC-1血清レベルと年齢との間に関連性があった
が、これは相関Ｚ検定を用いて有意性（ｐ＝0.064）には達しなかった。
【０１４４】 移植群においては、ホモ接合性H6/H6遺伝子型を示す個体は、TNF血清レベルが
高く、また移植後の関節膨潤スコアが高かった（ｐ＜0.05；ANOVA）。これはま
た移植前のTNFレベルとも一致するが、統計学的有意性にはわずかに至らなかっ
た（ｐ＝0.058；ANOVA）。
【０１４５】 無作為選択RA群においては、HD遺伝子型はびらん性疾患を有する可能性が２倍
高かった（ｐ＜0.02）（図２１）。これらのHD遺伝子型の個体はまた、治療前な
らびに治療後４および24時間の時点で、Ｃ反応性タンパク質（CRP）レベルが有
意に低かった（ｐ＜0.02；マン−ホイットニーｕ検定）。びらん性疾患を患う個
体はまた３つの時点全てにおいてCRPレベルが低かった（ｐ＜0.05；マン−ホイ
ットニーｕ検定）(図２２および２３)。このことは、MIC-1の遺伝子型が、RAの
発症を判定するための機能的役割を果たすことを示唆している。
【０１４６】考察： MIC-1遺伝子型とびらん性疾患との間には明らかに関連性がある。MIC-1遺伝子
型はまたRA患者におけるCRP血清レベルの変動と関連している。CRPはRAにおける
炎症活性の主要な測定対象の１つである。さらに、正常群と比較してRA患者にお
いてはMIC-1血清レベルが有意に上昇している。MIC-1血清レベルの変化は、TNF
血清レベルの変化と関連していると考えられる。またこれらの変化はMIC-1遺伝
子型依存的である。TNFは、RAの病理発生において主に機能している別のサイト
カインである。これらの相関を組み合わせて分析すると、MIC-1がRAの病理発生
においてある役割を果たしている可能性があり、個体の所定のMIC-1遺伝子型に
より疾患過程を予測しうることがわかる。
【０１４７】参照文献 当業者であれば、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することな
く、具体的な実施形態に示す本発明に多数の変更および／または改変を行いうる
ことは理解できるであろう。従って本発明の実施形態は、全ての点で例示を目的
としたものであり限定されないものと考えられる。
【０１４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、前立腺特異的抗原（PSA）レベルの上昇した50人の被験者由来の血清M
IC-1レベルとPSAレベルとの関係を表すグラフを示す。
【図２】 図２は、慢性関節リウマチを罹患する14人の無作為選択した被験者の血清MIC-
1レベルを表すグラフを示す。
【図３】 図３は、ヒトMIC-1および変異体Asp202-MIC-1のアミノ酸配列(A)およびDNA配
列(B)を示す。
【図４】 図４は、ヒツジとマウスの抗MIC-1抗血清の感受性を表すグラフを示す。プレ
ートは、1.8ng rhMIC-1、2ng rhTGF-β1、あるいはコーティングバッファー単独
でコーティングした。抗MIC-1マウスモノクローナル抗体(MAb)を含有する培養上
清、マウスミエローマ細胞系SP2/0によって調整した培養培地、未調整培養培地(
DMEM+Nutridoma)、および抗体希釈液(Ab dil)を希釈せずに評価し、IgG を富化
した正常ヒツジ血清およびヒツジポリクローナル抗体233-PをAb dilで500, 000
倍希釈した。マウスIgG1は20 ng/mlで評価した。
【図５】 図５は、捕捉のための抗MIC-1 MAbおよび検出のためのヒツジポリクローナル
抗体233B3-Pを利用するサンドイッチ型ELISA法によって作成された組換えヒトMI
C-1標準曲線を示す。
【図６】 図６は、女性の妊娠期における母体の血清および羊水中にMIC-1が存在するこ
とを示す実験結果を示す。 図６Ａは、サンドイッチ型ELISA法によって測定した、プールされた正常ヒト
血清(normal human serum: NHS)、プールされた各妊娠期における母体血清、お
よびプールされた羊水(amniotic fluid: AF)中のMIC-1濃度の概算値を示すグラ
フである。 図６Ｂは、プールされた正常ヒト血清（レーン１）、プールされた各妊娠期に
おける母体血清（レーン２〜４）、およびプールされた羊水(レーン５)における
MIC-1の免疫沈降およびウエスタンブロット分析である。
【図７】 図７は、４名の妊娠女性における母体血清MIC-1濃度を妊娠30週から出産まで
サンドイッチ型ELISA法によって測定することにより示したグラフである。
【図８】 図８は、サンドイッチ型ELISA法によって測定した、５つの異なるヒト胎盤抽
出物中におけるMIC-1濃度の測定結果を示すグラフである。
【図９】 図９は、ヒト栄養膜細胞系統BeWoによるMIC-1の発現および分泌を評価するた
めに実施した実験の結果を示す。 図９Ａは、サンドイッチ型ELISA法によって測定した、培養１日後および５日
後におけるBeWo細胞によるMIC-1分泌を示す。 図９Ｂは、BeWo細胞によって分泌されたMIC-1の免疫沈降およびウエスタンブ
ロット分析を示す。レーン１：無調整培養培地；レーン２：BeWo細胞によって５
日間調整した培養培地。 図９Ｃは、未刺激のBeWo細胞によるMIC-1発現の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖
反応(RT-PCR)解析を示す図である。レーン１：24時間培養したBeWo細胞からの全
RNAに関するRT-PCR；レーン２：陰性対照(RNAを含まず)；レーン３：陽性PCR対
照。
【図１０】 図１０は、サンドイッチ型ELISA法によるMIC-1の典型的標準曲線を示す(rhMIC
-1、7.8〜1000 pg/ml、すなわち、８回２倍希釈した)。
【図１１】 図１１は、野生型 MIC-1およびAsp202-MIC-1 DNA配列におけるAvaIIに対する
制限酵素切断部位を示す。
【図１２】 図１２は、示された遺伝子型で標識している６名の被験者のゲノムPCRの消化
産物を示す。また、これらはDNA配列決定法により確認した。３％アガロースゲ
ル上で臭化エチジウムと一緒に電気泳動を行った。45塩基対のPCR産物が、矢印
で示したホモ接合体H6中に見られる。
【図１３】 図１３は、転移性結腸直腸癌を罹患する10名の患者におけるMIC-1レベルとCEA
レベルとを比較したグラフを示す。
【図１４】 図１４は、転移性結腸直腸癌と非転移性結腸直腸癌におけるMIC-1レベルを比
較したグラフを示す。誤差を示す棒は標準誤差を示す。
【図１５】 図１５は、結腸直腸癌で死亡した患者の診断から再発までの時間についてカプ
ラン−メイヤープロットを示す。測定した時間は月数で表す。
【図１６】 図１６は、ホモ接合性のH6/H6患者における診断から再発までの時間について
カプラン−メイヤープロットを示す。測定した時間は月数で表す。
【図１７】 図１７は、デュークスのステージＤのCRCにおける診断から再発までの時間に
ついてカプラン−メイヤープロットを示す。測定した時間は月数で表す。
【図１８】 図１８は、年齢に関するMIC-1の単純回帰プロットを示す。
【図１９】 図１９は、233-Pを用いたMIC-1の免疫組織化学を示す。A. 前立腺癌; B. 腸癌
; C. 乳癌; D. リウマチ滑液。矢印はMIC-1を染色した領域を表す。右側のパネ
ルは、IgGを富化した正常ヒツジ血清で染色したそれぞれの対照である。
【図２０】 図２０は、MIC-1をサンドイッチ型ELISA法によって測定した時の、RA患者のMI
C-1レベルと正常被験者のMIC-1レベルとを比較したグラフを示す。
【図２１】 図２１は、２つの最も一般的な遺伝子型であるホモ接合型(H6/H6)およびヘテ
ロ接合型(H6/D6)の中で、びらん性（黒色）RAと非びらん性（白色）RAとの割合
を示すグラフを示す。
【図２２】 図２２は、びらん性RAの有無で比較したCRPのグラフを示す。
【図２３】 図２３は、ホモ接合型(H6/H6)(HH)およびヘテロ接合型(H6/D6)(HD)遺伝子型を
比較したCRPを示すグラフを示す。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年３月８日（２００２．３．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラウン，デービッド，アレクサンダー オーストラリア国 エヌエスダブリュ 2026，ボンディ ビーチ，ビーチ ロード 86，フラット ６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 CA04 EA02 FA02 FA08 HA11 HA17 4B063 QA12 QA19 QQ03 QQ43 QR62 QS25 QS34 4C084 AA02 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 DA01 DA05 NA14 ZA811 ZB012 ZB111

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 異常なレベルのMIC-1の発現を特徴とする疾患もしくは症状
    の診断または評価方法であって、以下のステップ： (i) 試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するス
    テップ；および (ii)上記(i)における測定量と、正常被験者から採取した等価な身体サンプル中
    に存在するMIC-1の量または量の範囲を比較するステップ； を含む上記方法。
  2. 【請求項２】 上記身体サンプルが、全血、血清、血漿および尿から選択さ
    れる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 流産のリスクおよび／または早産の診断方法であって、以下
    のステップ： (i) 既知の妊娠期にある妊娠試験被験者から採取した身体サンプル中に存在する
    MIC-1の量を測定するステップ；および (ii)上記(i)における測定量と、上記試験被験者の既知の妊娠期と実質的に等価
    な妊娠期にある正常妊娠被験者から採取した等価な身体サンプル中に存在するMI
    C-1の量または量の範囲を比較するステップ； を含む上記方法。
  4. 【請求項４】 上記身体サンプルが、全血、血清、血漿、羊水、胎盤抽出物
    、尿および脳脊髄液から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 上記身体サンプルが、血清、羊水、および胎盤抽出物から選
    択される、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 上記身体サンプルが血清由来のサンプルである、請求項３〜
    ５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記試験被験者が妊娠期の第１トリメスターにあり、該試験
    被験者の血清中に存在するMIC-1の測定量が４ng/mL以下であることが流産および
    ／または早産の高リスクの指標となる、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 上記試験被験者が妊娠期の第２トリメスターにあり、該試験
    被験者の血清中に存在するMIC-1の測定量が８ng/mL以下であることが流産および
    ／または早産の高リスクの指標となる、請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 上記試験被験者が妊娠期の第３トリメスターにあり、該試験
    被験者の血清中に存在するMIC-1の測定量が12ng/mL以下であることが流産および
    ／または早産の高リスクの指標となる、請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 上記身体サンプルが羊水由来のサンプルである、請求項３
    〜５のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 上記試験被験者が妊娠期の第２トリメスターにあり、該試
    験被験者の羊水サンプル中に存在するMIC-1の測定量が10ng/mL以下であることが
    流産および／または早産の高リスクの指標となる、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 上記身体サンプルが胎盤抽出物由来のサンプルである、請
    求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 上記試験被験者が妊娠期の第３トリメスターにあり、該試
    験被験者の胎盤抽出物サンプル中に存在するMIC-1の測定量が約18ng/mL以下であ
    ることが流産および／または早産の高リスクの指標となる、請求項１２に記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 上記試験被験者が妊娠期の第３トリメスターにあり、該試
    験被験者の胎盤抽出物サンプル中に存在するMIC-1の測定量が約10ng/mL以下であ
    ることが流産および／または早産の高リスクの指標となる、請求項１２に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 流産および／または早産のリスクを低減させるための妊娠
    被験者の治療方法であって、該被験者に対し、有効量のMIC-1を、必要に応じて
    薬学上許容される担体および／または賦形剤と混合させて、投与すること、を含
    む上記方法。
  16. 【請求項１６】 上記有効量のMIC-1は、投与されたMIC-1と被験者の胎盤組
    織中に存在する内因性MIC-1との合計量が15〜70ng/mLの範囲に維持される量であ
    る、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 上記有効量のMIC-1は、投与されたMIC-1と被験者の胎盤組
    織中に存在する内因性MIC-1との合計量が30〜50ng/mLの範囲に維持される量であ
    る、請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 流産および／または早産のリスクを低減させるための妊娠
    被験者を治療する方法であって、発現可能なMIC-1コードヌクレオチド配列を含
    む組換えアデノウイルスベクターもしくは組換えアデノウイルス関連ベクターを
    該被験者に投与するステップ；あるいは、適切なプロモーター配列に機能的に連
    結された線状MIC-1コードDNAを含むリポソームを該被験者に投与するステップ、
    を含む上記方法。
  19. 【請求項１９】 胎児異常の診断方法であって、以下のステップ： (i) 既知の妊娠期にある妊娠試験被験者から採取した身体サンプル中に存在する
    MIC-1の量を測定するステップ；および (ii)上記(i)における測定量と、上記試験被験者の既知の妊娠期と実質的に等価
    な妊娠期にある正常妊娠被験者から採取した等価な身体サンプル中に存在するMI
    C-1の量または量の範囲を比較するステップ； を含む上記方法。
  20. 【請求項２０】 異常なレベルのMIC-1の発現を特徴とする癌の診断方法ま
    たは評価方法であって、以下のステップ: (i) 試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するス
    テップ；および (ii)上記(i)における測定量と、正常被験者から採取した等価な身体サンプル中
    に存在するMIC-1の量または量の範囲を比較するステップ； を含む上記方法。
  21. 【請求項２１】 上記身体サンプルが、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、
    精液または組織生検から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 上記癌が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、直腸癌または膀胱癌
    である、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 慢性関節リウマチの診断方法であって、以下のステップ：
    (i) 試験被験者から採取した身体サンプル中に存在するMIC-1の量を測定するス
    テップ；および (ii)上記(i)における測定量と、正常被験者から採取した等価な身体サンプル中
    に存在するMIC-1の量または量の範囲を比較するステップ； を含む上記方法。
  24. 【請求項２４】 上記身体サンプルが、血清、血漿および滑液から選択され
    る、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 身体サンプル中に存在するMIC-1の量を、MIC-1に対する抗
    体またはそのフラグメントを使用するイムノアッセイまたは免疫組織化学によっ
    て測定する、請求項１〜１４または１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 被験者の炎症を治療する方法であって、該被験者に対し、
    有効量のMIC-1を、必要に応じて薬学上許容される担体および／または賦形剤と
    混合させて、投与すること、を含む上記方法。
  27. 【請求項２７】 ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌の診断方
    法または評価方法であって、被験者から採取した適切なサンプル中においてMIC-
    1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にアスパラギン
    酸を有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップを含む上記方法。
  28. 【請求項２８】 ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌への素因
    を評価する方法であって、被験者から採取した適切なサンプル中においてMIC-1
    の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にアスパラギン
    酸を有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップを含む上記方法。
  29. 【請求項２９】 ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌の診断方
    法または評価方法であって、被験者から採取した適切なサンプル中においてMIC-
    1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にヒスチジンを
    有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップを含む上記方法。
  30. 【請求項３０】 ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌への素因
    を評価する方法であって、被験者から採取した適切なサンプル中においてMIC-1
    の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にヒスチジンを
    有するMIC-1変異タンパク質の存在を判定するステップを含んでなる上記方法。
  31. 【請求項３１】 上記炎症性疾患が慢性関節リウマチである、請求項２７〜
    ３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 上記癌が前立腺癌である、請求項２７〜３０のいずれか１
    項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 上記サンプル中のMIC-1変異タンパク質の存在を、ヒト野
    生型MIC-1および/もしくは202位にヒスチジンを有する変異体または202位にアス
    パラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質と特異的に結合する抗体、あるいはそ
    のフラグメントを使用するイムノアッセイによって判定する、請求項２７〜３２
    のいずれか１項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 上記サンプルが、全血、血清、血漿、尿または組織生検か
    ら選択される、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 MIC-1に関してヒト被験者の遺伝子型を決定する方法であ
    って、MIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にヒ
    スチジンを有するMIC-1タンパク質に対して、または、MIC-1の202位もしくは未
    成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にアスパラギン酸を有するMIC-1変
    異タンパク質に対して、該被験者がホモ接合型またはヘテロ接合型であるかどう
    かを判定することを含む上記方法。
  36. 【請求項３６】 ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌の診断方
    法または評価方法、あるいは、ヒト被験者における炎症性疾患および／または癌
    への素因を評価する方法であって、MIC-1に関してヒト被験者の遺伝子型を決定
    するステップを含み、該ステップは、MIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MI
    C-1の202位に対応する位置にヒスチジンを有するMIC-1タンパク質に対して、ま
    たは、MIC-1の202位もしくは未成熟ヒト野生型MIC-1の202位に対応する位置にア
    スパラギン酸を有するMIC-1変異タンパク質に対して該被験者がホモ接合型また
    はヘテロ接合型であるかどうかを判定することを含むものである、上記方法。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011190262A (ja) * 2004-04-13 2011-09-29 St Vincent's Hospital Sydney Ltd 食欲を調節する方法
JP2013174614A (ja) * 2007-10-22 2013-09-05 St Vincent's Hospital Sydney Ltd 予後判定の方法
JP2015518468A (ja) * 2012-03-27 2015-07-02 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコー 代謝障害を治療するための組成物および方法
WO2017150314A1 (ja) 2016-02-29 2017-09-08 公立大学法人横浜市立大学 去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法及び検出試薬
WO2019044602A1 (ja) 2017-08-30 2019-03-07 東ソー株式会社 癌を検出する方法及び検出試薬
US10323075B2 (en) 2013-01-30 2019-06-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US10562965B2 (en) 2014-10-31 2020-02-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US10610568B2 (en) 2013-01-30 2020-04-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US11358995B2 (en) 2014-07-30 2022-06-14 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100475642B1 (ko) * 2001-12-29 2005-03-10 한국생명공학연구원 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트
US7157235B2 (en) 2002-06-17 2007-01-02 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
US7919084B2 (en) 2002-06-17 2011-04-05 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
US20040253207A1 (en) * 2002-11-08 2004-12-16 Barnes-Jewish Hospital Methods and compositions for prostate epithelial cell differentiation
WO2005017192A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
KR100679666B1 (ko) * 2004-01-20 2007-02-07 한국생명공학연구원 인간 대식세포 억제 사이토카인-1 특이적 단일클론항체,이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 위암 진단키트
AU2005232335B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-03 St Vincent's Hospital Sydney Limited Method for modulating appetite
US20070237713A1 (en) 2006-04-04 2007-10-11 Fan Rong A PCan065 Antibody Compositions and Methods of Use
WO2008015254A2 (en) 2006-08-04 2008-02-07 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for assessing the risk of cardiac interventions based on gdf-15
CA2715080C (en) 2007-09-28 2021-09-28 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
EP2350669B9 (en) 2008-10-31 2014-06-11 St Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of prognosis in chronic kidney disease
GB0902737D0 (en) 2009-02-19 2009-04-01 Univ Gent GDF15 as a differential marker for spondyloarthropathy
GB0902793D0 (en) 2009-02-20 2009-04-08 Univ Gent GDF15 as molecular tool to monitor and enhance phenotypic stability of articular chondrocytes
US9212221B2 (en) * 2010-03-03 2015-12-15 Detroit R & D, Inc. Form-specific antibodies for NAG-1 (MIC-1, GDF-15), H6D and other TGF-β subfamily and heart disease and cancer diagnoses
US20130058931A1 (en) 2010-03-11 2013-03-07 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of predicting and decreasing the risk of pregnancy loss
WO2012012717A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting prenatal or pregnancy-related diseases or conditions
EA038645B1 (ru) 2012-12-21 2021-09-28 Авео Фармасьютикалз, Инк. Антитела к gdf15
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
IL261666B2 (en) 2016-03-31 2024-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Related proteins and methods of using them
WO2018187767A1 (en) * 2017-04-06 2018-10-11 The Regents Of The University Of California Predicting, diagnosing, and treating nausea and vomiting of pregnancy
WO2019139543A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 Nanyang Technological University Superhydrophobic platform for sensing urine metabolites and toxins

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000958A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 St. Vincent's Hospital Sydney Limited NOVEL TGF-β LIKE CYTOKINE
WO1999006445A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-15
JP2002543841A (ja) * 1999-05-17 2002-12-24 バイオファーム ゲゼルシャフト ツア バイオテクノロジシェン エントヴィックルング ウント ツム フェルトリーブ フォン ファルマカ エムベーハー ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規のメンバーであるＧＤＦ―１５の神経保護特性
JP2003506086A (ja) * 1999-08-06 2003-02-18 ハイゲン アーゲー ＴＧＦ−βファミリーの単量体タンパク質

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US59431A (en) * 1866-11-06 Improved door-fastener
US6180602B1 (en) * 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
WO1994003599A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
JPH07250688A (ja) 1994-01-28 1995-10-03 Sagami Chem Res Center ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ
JPH07258293A (ja) 1994-03-23 1995-10-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な蛋白質ならびにその製造方法
US5994102A (en) * 1994-12-15 1999-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US6521227B1 (en) * 1999-11-18 2003-02-18 Peter L. Hudson Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
AU1830195A (en) 1994-12-15 1996-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Prostatic growth factor
AU1276899A (en) 1997-10-23 1999-05-10 Fibrogen, Inc. Type ix collagen antibody and related uses
US6465181B2 (en) * 1999-03-25 2002-10-15 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000958A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 St. Vincent's Hospital Sydney Limited NOVEL TGF-β LIKE CYTOKINE
WO1999006445A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-15
JP2002543841A (ja) * 1999-05-17 2002-12-24 バイオファーム ゲゼルシャフト ツア バイオテクノロジシェン エントヴィックルング ウント ツム フェルトリーブ フォン ファルマカ エムベーハー ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規のメンバーであるＧＤＦ―１５の神経保護特性
JP2003506086A (ja) * 1999-08-06 2003-02-18 ハイゲン アーゲー ＴＧＦ−βファミリーの単量体タンパク質

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011190262A (ja) * 2004-04-13 2011-09-29 St Vincent's Hospital Sydney Ltd 食欲を調節する方法
JP2014051511A (ja) * 2004-04-13 2014-03-20 St Vincent's Hospital Sydney Ltd 食欲を調節する方法
JP2013174614A (ja) * 2007-10-22 2013-09-05 St Vincent's Hospital Sydney Ltd 予後判定の方法
JP2015518468A (ja) * 2012-03-27 2015-07-02 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコー 代謝障害を治療するための組成物および方法
US10869909B2 (en) 2012-03-27 2020-12-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US10195250B2 (en) 2012-03-27 2019-02-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US10610568B2 (en) 2013-01-30 2020-04-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US10323075B2 (en) 2013-01-30 2019-06-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
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US10562965B2 (en) 2014-10-31 2020-02-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US11530260B2 (en) 2014-10-31 2022-12-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
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