CN108642168B - 基于spast基因的类风湿性关节炎和骨关节炎的诊断与治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类风湿性关节炎和/或骨关节炎的诊断标志物，该诊断标志物是SPAST基因或SPAST蛋白，通过检测SPAST基因的表达水平来实现诊断的目的。本发明研究证明与正常人相比类风湿性关节炎和/或骨关节炎患者SPAST基因的mRNA表达水平显著上调。根据SPAST基因与类风湿性关节炎和/或骨关节炎之间存在的相关性，可以制备诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的试剂盒，该试剂盒可在临床上广泛应用。另外，本发明还公开了SPAST基因或SPAST蛋白作在治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎方面的应用。

Description

基于SPAST基因的类风湿性关节炎和骨关节炎的诊断与治疗
技术领域
本发明涉及分子诊断、治疗领域，更具体地，本发明涉及以检测SPAST异常为手段的诊断方法；及抑制SPAST基因或蛋白质的治疗剂。
背景技术
类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，以多关节受累为特征，可进展出现关节破坏和畸形，常累及外周关节。病因不清，关节外器官受累如肺间质病变和干燥综合征等也很常见。恰当的早期治疗可以改善关节症状和功能，降低死亡率，减少并发症。
一篇2010年的系统回顾研究发现，北美和北欧的类风湿关节炎发病率估计在0.5％～1.1％。发展中国家的发病率相对更低(0.1％～0.5％)。类风湿关节炎在女性更常见(男女发病率1：3)。任何年龄均可发病，一项回顾队列研究称中位发病年龄为55.6岁；英国每年新诊断类风湿关节炎病例数约为20，000。由此推算，每位全科医生每2年可接诊1例新发病患者。
来自英国、欧洲、美国的研究均发现全科医师存在类风湿关节炎诊断延迟。英国国家审计署2009年报告，确诊为类风湿关节炎之前，患者去其全科医师处就诊平均达4次之多，有18％的患者甚至需就诊8次才能确诊。在初级医疗中，早期类风湿关节炎的诊断与其他骨骼肌肉问题一样困难：临床特征表现不易辨识，炎症标志如血沉和C反应蛋白又没有特征性意义，而特异性标志阴性如类风湿因子(31％患者出现血清阴性)和抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP，33％患者血清阴性)又常见血清阴性表现。
类风湿关节炎导致的残疾可使28％的患者在一年内失去工作能力。从症状发生开始，在3个月内的「窗口期」开始治疗，可以延缓疾病进展。而延迟治疗则增加影像学关节破坏和致死的风险。而且，在3～6个月后再开始治疗更易出现单药治疗失败并导致耐药。
类风湿性关节炎就是关节疾病里面的一种类风湿性关节炎，会出现关节肿痛的一些症状。但是还有很多的疾病和类风湿性关节炎的症状是非常相似的，特别容易让人产生误导，如骨关节炎。
骨关节炎是冲为退行性关节炎或者是骨质增生，影响到了人体关节的一种疾病，主要的原因就是关节长时间的负重而导致的关节表面的软骨受到了损伤周围的骨性组织增生，当骨性关节炎出现在手指上的时候，就有可能会被误诊为类风湿性关节炎。
所以寻找一种可以在早期有效区别诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的方法是亟待解决的问题，以免因误诊误治延误病情，保证患者得到正确的治疗。
近年来，在分子层面研究用于诊断类风湿性关节炎或骨关节炎的标志物不断涌现，如以下所列申请号的专利：201310596649.X，201580058686.2，201380044584.6，201310483384.2，200610070393.9，201510725004.0，201510627048.X，201510724747.6，201510548635.X，201510548624.1，201510549564.5，201510725755.2。还未见有任何关于区别诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的分子标志物，申请人在这样的背景下开展了本研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测SPAST基因表达差异来实现诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过抑制SPAST基因表达来治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的方法。
本发明的目的之三在于提供一种用于筛选类风湿性关节炎和/或骨关节炎治疗药物的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测SPAST的试剂在制备类风湿性关节炎和/或骨关节炎诊断工具中的应用。
进一步，所述检测SPAST的试剂包括检测SPAST基因表达量的试剂。
更进一步，所述检测SPAST的试剂包括能够定量SPAST基因mRNA的试剂，和/或能够定量SPAST蛋白的试剂。
本发明的定量SPAST基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量SPAST基因mRNA的试剂可以是SPAST基因或转录本的特异性引物，也可以是SPAST基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
上面所述的SPAST基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增SPAST基因的引物。在本发明的的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量SPAST蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量SPAST蛋白的试剂包括特异性结合SPAST蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量SPAST蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的SPAST蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对SPAST蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
本发明的用于检测SPAST基因表达量检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
所述的样品可以是(但不限于)：外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、胃壁细胞或胃液。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本发明还提供了一种用于诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具，所述工具能够检测SPAST基因表达量。
进一步，所述工具包括能够定量SPAST基因mRNA的试剂，和/或能够定量SPAST蛋白的试剂。
通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。
进一步，所述能够定量SPAST基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增SPAST基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述用于诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SPAST基因的异常与类风湿性关节炎和/或骨关节炎相关也属于使用了本发明的SPAST的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测类风湿性关节炎和/或骨关节炎的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于SPAST基因或转录本的检测来判断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的试剂均包含在本发明范围内。
本发明还提供了一种诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中SPAST基因表达水平；
(3)将测得的SPAST基因表达水平与受试者的疾病相关性关联起来。
(4)与正常对照相比，SPAST基因表达水平在统计学上升高，表明受试者被判断患有类风湿性关节炎和/或骨关节炎、或患有类风湿性关节炎和/或骨关节炎的风险高。
本发明还提供了一种类风湿性关节炎和/或骨关节炎的治疗方法，所述方法包括抑制SPAST基因或SPAST蛋白。
进一步，所述方法包括抑制SPAST基因的表达，或抑制SPAST基因的表达或抑制SPAST蛋白的活性。
本发明还提供了一种类风湿性关节炎和/或骨关节炎药物的筛选方法，可以通过在对骨细胞添加测试药物后或在对模型动物施用测试药物后的某个时期测量SPAST基因或者SPAST蛋白的表达水平来测定药物效果。更具体地说，当SPAST基因或者SPAST蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物。
本发明还提供了一种治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的的药物，所述药物包含SPAST和/或其表达产物的抑制剂。
本发明还提供了SPAST和/或其表达产物在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。
进一步，所述药物包括SPAST和/或其表达产物的抑制剂。
本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。
本发明的所述抑制剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制SPAST或涉及SPAST上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎有效的药物即可。
进一步，所述抑制剂包括针对SPAST基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向分子化合物，抑制型靶向分子化合物的实例如针对SPAST蛋白的抗体。
本发明的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明的“SPAST基因”(Chromosome 2,NC_000002.12(32063551..32157637))序列可以NCBI数据库中进行查询。
在本发明的上下文中，“类风湿性关节炎和/或骨关节炎诊断”包括判断受试者是否已经发生类风湿性关节炎和/或骨关节炎、判断受试者是否存在患有类风湿性关节炎和/或骨关节炎的风险、判断类风湿性关节炎和/或骨关节炎患者是否已经复发。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实SPAST基因表达与类风湿性关节炎和/或骨关节炎的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为类风湿性关节炎和/或骨关节炎的诊断与治疗提供了新的途径。
本发明发现了一种既可以诊断类风湿关节炎又可以诊断骨关节炎的分子标志物，该分子标志物不仅可以区分正常人和关节炎患者，还可以有效区分类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者。
本发明发现了一种既可以治疗类风湿关节炎又可以治疗骨关节炎的药物。一药多用，扩大药物适应症，减少经济负担。
本发明开发出了适合于进行类风湿性关节炎和/或骨关节炎检测的试剂或试剂盒，检测灵敏度和特异性良好。
附图说明
图1显示利用QPCR在转录水平上检测SPAST基因差异表达情况的统计图；
图2显示利用Western blot在蛋白水平上检测SPAST基因差异表达情况的统计图；
图3显示利用QPCR在转录水平上检测干扰SPAST基因表达情况的统计图；其中，A：骨关节炎成纤维样滑膜细胞；B：类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞；
图4显示利用Western blot在蛋白水平上检测干扰SPAST基因表达情况的统计图；A：骨关节炎成纤维样滑膜细胞；B：类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选骨关节炎滑膜组织、类风湿性关节炎滑膜组织和正常滑膜组织中的差异表达基因
5例类风湿关节炎患者的滑膜组织来自于医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的类风湿关节炎患者，所有病例的诊断符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎分类标准，其中女性3例，男性2例，平均年龄(55±8)岁，平均病程(12±7)年。5例骨关节炎患者滑膜组织来自于医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的骨关节炎患者，所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准，其中女性2例，男性3例，平均年龄(63±5)岁，平均病程(12±8)年。6例正常滑膜组织来自于外伤手术病人关节滑膜组织。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
1、组织RNA的提取(利用Norgen RNA提取试剂盒)
1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体滑膜组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；
2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
3)加入300μLLysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；
4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；
5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；
6)加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；
7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；
8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；
RNA吸附：
9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；
10)弃下层，重置收集管于柱上；
11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；
12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；
13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
DNase处理：
14)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；
15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
16)室温放置15min；
RNA洗涤：
17)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；
18)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管；
RNA洗脱：
19)把柱子放入1.7mL Elution管中；
20)加入30μl Elution Buffer；
21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min。
2、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
3、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
4、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
5、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
6、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
7、Illumina x-ten上机测序
Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。
8、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；
(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。
9、结果
用以上标准筛选得到在正常人和骨关节炎患者之间、正常人和类风湿性关节炎患者之间、类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者之间均存在表达差异的基因共367个。
实施例2差异表达基因的大样本验证
基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择SPAST基因进行验证，其在类风湿性关节炎和骨关节炎患者中表达均上调，且与骨关节患者相比，在类风湿性关节炎患者中上调幅度更大。
一、在转录水平上检测SPAST基因的差异表达
1、按照实施例1的方式收集类风湿性关节炎滑膜组织100名，骨关节炎滑膜组织100例，正常滑膜组织100例。
2、按照实施例1的方式进行RNA的提取和质量检测
3、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
4、QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增SPAST基因的正向序列5’-AACTGCTACTCGTAAGAA-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-CAGAGAAGGAAGAATAACAA-3’(SEQ ID NO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中SPAST基因mRNA水平显著上调；与骨关节炎滑膜组织相比，类风湿性关节炎滑膜组织中SPAST基因mRNA水平显著上调，差异均具有统计学意义(*P<0.05)。将正常滑膜组织均值的95％可信区间的上界作为诊断实验的cut-off值，在此条件下，用SPAST诊断正常与骨关节炎的灵敏度为90％，特异度为93％，结果如表1所示；用SPAST诊断正常人与类风湿性关节炎患者的灵敏度为92％，特异度为91％，结果如表2所示。将骨关节炎滑膜组织均值的95％可信区间的上界作为诊断实验的cut-off值，在此条件下，用SPAST诊断骨关节炎与类风湿性关节炎的灵敏度为89％，特异度为95％，结果如表3所示。
表1正常人与骨关节炎患者区分
Figure BDA0001617855150000131
表2正常人与类风湿性关节炎患者区分
Figure BDA0001617855150000132
Figure BDA0001617855150000141
表3骨关节炎患者与类风湿性关节炎患者区分
Figure BDA0001617855150000142
二、在蛋白水平上检测SPAST基因的差异表达
1、组织蛋白提取
(1)先称取50mg组织，用液氮充分研磨；
(2)每份样品中加入500μl混合工作液(RIPA裂解液：PMSF＝100:1)充分震荡；
(3)离心机13000rpm/min离心10分钟，后取上清液分装于-80℃保存。
2、Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
3、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将SPAST蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图2所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中SPAST蛋白含量显著上降；与骨关节炎滑膜组织相比，类风湿性关节炎滑膜组织中SPAST蛋白显著上降，差异均具有统计学意义(*P<0.05)。
实施例3 SPAST基因表达质粒构建
1、干扰RNA设计合成
根据SPAST基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。上海吉玛制药技术有限公司同时提供与SPAST基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA-NC)。
siRNA-SPAST：
正义链为5’-UCAAUACCUUUCUUAUACCAU-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-GGUAUAAGAAAGGUAUUGAAG-3’(SEQ ID NO.6)，
2、滑膜组织细胞体外培养
将无菌获取的类风湿性关节炎和骨关节炎的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm x 1mm x 1mm的组织块，加入胶原酶II(0.5mg/ml)37℃、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE标记的小鼠抗人CD11b进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性的细胞为成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocytes，FLS)用于本研究。
3、转染
将制备的成纤维样滑膜细胞分为两组，分别为对照组(转染siRNA-NC)、和干扰SPAST表达组(转染siRNA-SPAST)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。
4、QPCR检测
4.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
4.2逆转录和QPCR步骤同实施例2。
4.3结果
如图3所示，与转染siRNA-NC的细胞相比，转染siRNA-SPAST的细胞中SPAST的mRNA水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
5、Western检测
5.1细胞总蛋白的提取
取对数期生长良好的成纤维样滑膜细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
5.2Western blot检测
步骤同实施例2。
5.3结果
如图4所示，与转染siRNA-NC的细胞相比，转染siRNA-SPAST的细胞中SPAST的蛋白水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4抑制SPAST基因表达对成纤维样滑膜细胞增殖的影响
1、步骤
以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，转染48h之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，SPAST基因干扰组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如表4和表5显示，与转染siRNA-NC的细胞相比，转染siRNA-SPAST细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表4骨关节炎成纤维样滑膜细胞测定OD值
Figure BDA0001617855150000161
Figure BDA0001617855150000171
表5类风湿性关节炎滑膜细胞测定OD值
实验组 OD值(光密度)
siRNA-NC 0.1601±0.008
siRNA-SPAST 0.0598±0.005
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 基于SPAST基因的类风湿性关节炎和骨关节炎的诊断与治疗
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aactgctact cgtaagaa 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagagaagga agaataacaa 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttccaat atgattcca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatttccatt gatgacaag 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucaauaccuu ucuuauacca u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gguauaagaa agguauugaa g 21

Claims (8)

1.检测SPAST的试剂在制备诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SPAST的试剂包括检测SPAST基因表达量的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测SPAST的试剂包括能够定量SPAST基因mRNA的试剂，和/或能够定量SPAST蛋白的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量SPAST基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增SPAST基因的引物；所述能够定量SPAST蛋白的试剂包括特异性结合SPAST蛋白的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
7.抑制SPAST基因表达的试剂在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。
8.SPAST基因表达产物在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Evaluating the effect of spastin splice mutations by quantitative allele‐specific expression assay;S. Klimpe等;《European Journal of Neurology》;20111231;摘要,99-105 *
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遗传性痉挛性截瘫新突变的全基因组外显子测序分析;井忠翠等;《青岛大学医学院学报》;20170831;379-385 *

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