CN105219777A - 一种成纤维细胞特异性启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种成纤维细胞特异性启动子及其应用。本发明以来源于小鼠胚胎成纤维细胞的基因组DNA为模板，以基因FSP1为靶基因，克隆其5′端的启动子区域，其DNA序列如SEQ？ID？NO：1所示。并将其克隆到pMSC-GDLuc载体中，进而构建pmFSP1-GDLuc荧光报告基因载体。细胞功能研究表明，本发明所构建报告基因载体pmFSP1-GDLuc能够特异性地在成纤维细胞中高效表达，而在非成纤维细胞中仅有极少量的表达。因此，本发明成功克隆到成纤维细胞特异性启动子mFSP1，并成功构建了该启动子的荧光报告基因载体，为细胞重编程、细胞谱系追踪及条件性基因表达调控研究提供了有效的材料及研究工具。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种成纤维细胞特异性启动子及其应用。
背景技术
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及创伤的修复有着十分重要的作用。各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞的作用极为重要。
细胞重编程技术是近年发展起来的细胞治疗及组织修复与再生研究领域的热点与前沿。因成纤维细胞是各种组织器官中广泛存在的一种细胞类型，因其具有数量大、来源丰富的优势，成纤维细胞已经成功细胞重编程研究领域的重要细胞来源。最近有研究通过直接重编程的方法，采用心脏特异的转录因子和miRNA的不同组合形式，成功地将人和小鼠成纤维细胞转化为心肌样细胞，这些细胞具有与心肌相似的基因表达模式和肌节结构，甚至有少量可以跳动的细胞(IedaM,FuJD,Delgado-OlguinP,VedanthamV,HayashiY,BruneauBG,SrivastavaD.Directreprogrammingoffibroblastsintofunctionalcardiomyocytesbydefinedfactors.Cell,2010,142(3):375-86)。直接心肌细胞重编程可将心脏原位成纤维细胞转换成有功能的心肌细胞，成为心血管修复与再生领域的一个全新方法。
以丰富的成纤维细胞为靶细胞，利用细胞重编程技术进行原位重编程，将成纤维细胞重编程为不同种类的细胞类型，用于各种损伤组织器官的修复与再生，已经成为细胞治疗及再生医学研究领域极具潜力的新途径。因此，建立成纤维细胞特异性标记的转基因动物模型，以及建立专门用于成纤维细胞表型鉴定及细胞谱系追踪的报告基因载体系统，已经成为细胞重编程及再生医学领域的重要研究课题。然而，上述研究均需要有效的成纤维细胞特异性启动子及其报告基因载体系统。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种成纤维细胞特异性启动子。
本发明的另一目的在于提供上述成纤维细胞特异性启动子的应用。
本发明通过寻找一个更加有效的成纤维细胞特异性表达基因FSP1的启动子区域，克隆成纤维细胞特异性激活的启动子，并构建该启动子的荧光霉素报告基因载体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种成纤维细胞特异性启动子，来源于小鼠，由小鼠FSP1基因获得，命名为“mFSP1”或“启动子mFSP1”，其DNA序列如SEQIDNO：1所示，片段长度为2321bp。mFSP1或启动子mFSP1在FSP1基因中的具体位置：从-1079bp到+1242bp；其结构包含：TSS上游的1079bp，第一个外显子(非编码区)，第一个内含子，第二个外显子中起始密码子(ATG)的上游序列(图1)。
所述的成纤维细胞特异性启动子mFSP1的DNA序列如SEQIDNO：1所示：
atgtcttcttggcttacttttgtttttttctgatgggacacactgggccttgggaccgagtccttgttcctttatgctccttactactggaggtaggaggcttaccatggaaggcatggacccccaaagcggtgtcaggccctgtagaaatgcacacatttcaggagggtaggggtaacacgtgtcctatcagatgagactggagggtctctgtctctctctgtcccctgtcttgagatagaagtccttatcttggactttcaaggaggacaaggggctccttgggaggtacttctgaccagatgctgcaaggagagtatggttgtgggagcccaaagccaaacctccatctaaccttcactcaatccccgaatttgtaccctatccttagagattaatcctgactcccccttttacctatttcctctttaactctcttcttcaagctgaacattcaaccccgaatgctcctgtcattcctcaatatccttactccagcttccatccattcgaaaacctccaggccacactgccaccctaactccatcatggcctcctaggtatagctcctacttcatacctggggtggtcccaaggtccctcctgacttgctagcctctatcctgggtcttcctgattgtgacaagaagctgtttaggctggagggaagtgctgacattgtcccactggctggggtcacctccttcgttcctgggccacatatttccagggcagctccttatcccttgcccataacatctccatctcctttcctgtggcccacacctcatgtccaggttgcccgttctcaaagcttcctaaacttctggctgagctgtggctgcttggtggtgtccaccccatccaagtctctgccgtgcccactggagctcactcactacttgattgtgcctgctggggagggagcaggaagcctggttcccagactgggctggtcgagggtgctatgacatttactacatcaaccaacagcaagagcacagtatccatgttcccccatcctctgcatgggcagggcctggcagggtataaataggtcagattgttgggctctccccaaacctctctattcagcacttcctctctcttggtctggtgagttgtgttggtctgatagcactgctagcggcattagaggctgaggctagggtagaagaaaggggggctgctgggggaacagatgtctttaataaatccagatgagagattctgatgtggaggttcatgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtttttcacgagaatgaaaaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtgtataaatggctacatctgagctcccggaggttttgagatactgaggctggcttgcatgttgctatagtgtatattggtggtgcttgggagtcactgtcatgcataggatgctgactcgtgttgctgggtaatacaagacagtgtgtggacactcgggtacaggaagcaaagcgaaggcatcagtaggcctttttgttttacagtatttaaattacagtttttatttgtgtgtatgagcgtatgggttgggctggagcaaatgccaaggcgacattgtgggagccaaaggacaatttgtgtgggagtcaatctgttccttctagcatgtgggctgtggggatcaaactcaggccctggagcttggtggcaagcacctctacccactgagctatctctccagcaccctcctgcaggcattcgtgtttgtagtgtgtcttatttttaatagccctatgaacatatagcacctaggccaagaaagcctggcttccccaccctctcctcttgcatccctacctctgccacttcatcttactcctattaggcagctggggtttttccacttttttttgtctgcctctgggcaggcagccagcagccgcgcccaacgctgggagggagaagaatgggccagggcctggtgcttgtggttgagctgtgggagtgagtaagctgatggaaaactgctgttgttgaggccaggactgagaggcacagaaaggtgctggcatggatctccagagtttgaggggtaggctttgcaggtttcagagcccagagcacatgtgaccttcttgccatcaatgggtcccattcctctgatctccccagggggtgaggtccatctcttagagagttggctgggatagagcacttaaaatggggacagaatgagtgtgatttgggtcatgctcagcaacacatatccagttctcaacacactgttggcgtgggttggagaatgttacttttgtgtctcctgcccttaggtctcaacggttacc。
本发明所述启动子的克隆方法如下所述：
首先，设计并合成下列PCR引物，用于扩增包含FSP1基因的部分5′-UTR区域及部分编码区域的DNA片段，命名为mFSP1-p，大小为3229bp(-1079bp至+2150bp)(图1)。
所述PCR引物的DNA序列如下所示：
FSP1-F：5′-ATGTCTTCTTGGCTTACTTTTGTTT-3′；(SEQIDNO：3)
FSP1-R：5′-TCATCTGAGGAGTCTTCACTTCTTC-3′；(SEQIDNO：4)
然后，将上述PCR产物(3229bp)克隆到pEASY-Blunt载体中，经菌落PCR验证及测序验证后，构建pEASYB-mFSP1-p克隆载体。
所述的mFSP1-p的DNA序列如SEQIDNO：2所示：
atgtcttcttggcttacttttgtttttttctgatgggacacactgggccttgggaccgagtccttgttcctttatgctccttactactggaggtaggaggcttaccatggaaggcatggacccccaaagcggtgtcaggccctgtagaaatgcacacatttcaggagggtaggggtaacacgtgtcctatcagatgagactggagggtctctgtctctctctgtcccctgtcttgagatagaagtccttatcttggactttcaaggaggacaaggggctccttgggaggtacttctgaccagatgctgcaaggagagtatggttgtgggagcccaaagccaaacctccatctaaccttcactcaatccccgaatttgtaccctatccttagagattaatcctgactcccccttttacctatttcctctttaactctcttcttcaagctgaacattcaaccccgaatgctcctgtcattcctcaatatccttactccagcttccatccattcgaaaacctccaggccacactgccaccctaactccatcatggcctcctaggtatagctcctacttcatacctggggtggtcccaaggtccctcctgacttgctagcctctatcctgggtcttcctgattgtgacaagaagctgtttaggctggagggaagtgctgacattgtcccactggctggggtcacctccttcgttcctgggccacatatttccagggcagctccttatcccttgcccataacatctccatctcctttcctgtggcccacacctcatgtccaggttgcccgttctcaaagcttcctaaacttctggctgagctgtggctgcttggtggtgtccaccccatccaagtctctgccgtgcccactggagctcactcactacttgattgtgcctgctggggagggagcaggaagcctggttcccagactgggctggtcgagggtgctatgacatttactacatcaaccaacagcaagagcacagtatccatgttcccccatcctctgcatgggcagggcctggcagggtataaataggtcagattgttgggctctccccaaacctctctattcagcacttcctctctcttggtctggtgagttgtgttggtctgatagcactgctagcggcattagaggctgaggctagggtagaagaaaggggggctgctgggggaacagatgtctttaataaatccagatgagagattctgatgtggaggttcatgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtttttcacgagaatgaaaaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtgtataaatggctacatctgagctcccggaggttttgagatactgaggctggcttgcatgttgctatagtgtatattggtggtgcttgggagtcactgtcatgcataggatgctgactcgtgttgctgggtaatacaagacagtgtgtggacactcgggtacaggaagcaaagcgaaggcatcagtaggcctttttgttttacagtatttaaattacagtttttatttgtgtgtatgagcgtatgggttgggctggagcaaatgccaaggcgacattgtgggagccaaaggacaatttgtgtgggagtcaatctgttccttctagcatgtgggctgtggggatcaaactcaggccctggagcttggtggcaagcacctctacccactgagctatctctccagcaccctcctgcaggcattcgtgtttgtagtgtgtcttatttttaatagccctatgaacatatagcacctaggccaagaaagcctggcttccccaccctctcctcttgcatccctacctctgccacttcatcttactcctattaggcagctggggtttttccacttttttttgtctgcctctgggcaggcagccagcagccgcgcccaacgctgggagggagaagaatgggccagggcctggtgcttgtggttgagctgtgggagtgagtaagctgatggaaaactgctgttgttgaggccaggactgagaggcacagaaaggtgctggcatggatctccagagtttgaggggtaggctttgcaggtttcagagcccagagcacatgtgaccttcttgccatcaatgggtcccattcctctgatctccccagggggtgaggtccatctcttagagagttggctgggatagagcacttaaaatggggacagaatgagtgtgatttgggtcatgctcagcaacacatatccagttctcaacacactgttggcgtgggttggagaatgttacttttgtgtctcctgcccttaggtctcaacggttaccatggcaagacccttggaggaggccctggatgtaattgtgtccaccttccacaaatactcaggcaaagagggtgacaagttcaagctgaacaagacagagctcaaggagctactgaccagggagctgcctagcttcctgggggtaagtgggtcctgcctgtgtattgcacacgtgatgcatctgcaggaggaggctggggctggtaggcactagtcttgatgcagtacttagctatagctggcatatatccctgctctgggtgcttggtacggaaccacaatgaaccacctacttcacactagcccccagctgagacaggcttaggatgaagataactgaagaggcagaggaaaaccaaaacaaccacattaggcagtcagtgtctgaaaccacagcctagatcagggctgtctttccggagatgggcactagaaatcgagtttttatttgtgaagacatgatcgtggaggcacacaaatgcctgcagattatcctctcaataacaccttatattagttaacggatcactattatgacagtttcctattaagataattaaaacaagcacggggaagatgtggtcacatcctttcccagctatcccatgtgttcatcccatagtttagccccgaggctagcaaggagtgcttgcaaaccttcctgagctcctgactggaggcaaatatctggtttgagttggcttctaattgctcctcttctactgccagaaaaggacagatgaagctgcattccagaaggtgatgagcaacttggacagcaacagggacaatgaagttgacttccaggagtactgtgtcttcctgtcctgcattgccatgatgtgcaatgaattctttgagggctgcccagataaggagccccggaagaagtgaagactcctcagatga。
含有所述的成纤维细胞特异性启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
所述的重组载体为将所述成纤维细胞特异性启动子插入pMCS-GDLuc的KpnI和BamHI位点间得到的重组载体。
扩增所述成纤维细胞特异性启动子的引物对也是本发明保护的范围。
所述的引物对的DNA序列如下所示：
FSP1-luc-F：5′-atcgatgcggccgcATGTCTTCTTGGCTT ACTTT-3′；(ClaI：atcgat；NotI：gcggccgc)(SEQIDNO：5)
FSP1-luc-R：5′-actagtctagaccGGTAACCGTTGAGA Cctaag-3′；(SpeI：actagt；XbaI：tctaga；AgeI：accGGT)(SEQIDNO：6)
上述引物中大写字母及下划线DNA序列为与模板中FSP1启动子序列结合的区域；方框内的小写字母为与pMCS-GDLuc报告基因载体中重叠的DAN序列；单独的小写字母为添加的酶切位点序列。
本发明所述成纤维细胞特异性启动子的荧光霉素报告基因重组载体的构建方法如下所述：
首先，设计并合成下列PCR引物，以pEASYB-mFSP1-p载体为DAN模板，PCR扩增FSP1启动子区域，大小为2321bp。
所述PCR引物的DNA序列如下所示：
FSP1-luc-F：5′-atcgatgcggccgcATGTCTTCTTGGCTT ACTTT-3′；(ClaI：atcgat；NotI：gcggccgc)
FSP1-luc-R：5′-actagtctagaccGGTAACCGTTGAGA Cctaag-3′；(SpeI：actagt；XbaI：tctaga；AgeI：accGGT)
上述引物中大写字母及下划线DNA序列为与模板中FSP1启动子序列结合的区域；方框内的小写字母为与pMCS-GDLuc报告基因载体中重叠的DAN序列；单独的小写字母为添加的酶切位点序列。
然后，通过融合PCR技术，将所扩增的DNA片段与线性化的pMCS-GDLuc载体进行重组、连接，经转化、挑选单克隆、菌落PCR验证及测序验证后，构建报告基因重组载体pMCS-mFSP1-GDLuc，简称为pmFSP1-GDLuc。
所述的成纤维细胞特异性启动子在使目的基因在成纤维细胞中特异表达中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明以来源于小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)的基因组DNA为模板，以成纤维细胞特异性表达基因FSP1为靶基因，克隆其5′端的启动子区域，大小为2321bp(从-1079bp到+1242bp)，包含：TSS上游的1079bp，第一个外显子(非编码区)，第一个内含子，第二个外显子中起始密码子(ATG)的上游序列。并将其克隆到荧光霉素报告基因载体pMSC-GDLuc载体中，进而构建pmFSP1-GDLuc荧光报告基因载体。细胞功能研究表明，本发明所构建报告基因载体pmFSP1-GDLuc能够特异性地在成纤维细胞中高效表达，而在非成纤维细胞中仅有极少量的表达。因此，本发明成功克隆到成纤维细胞特异性启动子mFSP1(2321bp)，并成功构建了该启动子的荧光报告基因载体，为细胞重编程、细胞谱系追踪及条件性基因表达调控研究提供了有效的材料及研究工具。
附图说明
图1是本发明所述FSP1基因及其启动子序列。
图2是本发明所述pEASYB-mFSP1-p载体构建及其验证结果。其中，A为FSP1-F/FSP1-R引物扩增的mFSP1-p(3.2kb)的DNA片段的电泳图谱；B为1～6号克隆的菌落PCR电泳结果；C为pEASYB-mFSP1-p载体的正向及反向测序结果；D为pEASYB-mFSP1-p载体的图谱。
图3是本发明所述pmFSP1-GDLuc荧光报告基因载体构建及其验证结果。其中，A为FSP1-luc-F/FSP1-luc-R引物扩增的启动子mFSP1(2.3kb)的DNA片段的电泳图谱；B为1～3号克隆的菌落PCR电泳结果；C为pmFSP1-GDLuc载体的反向测序结果；D为pmFSP1-GDLuc载体的图谱。
图4是利用双荧光霉素载体系统验证pmFSP1-GDLuc载体的功能。其中，pTK-RedLuc载体为内参报告基因载体；pMCS-GDLuc为对照报告基因载体；pmFSP1-GDLuc为待检测的报告基因载体。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1FSP1基因启动子序列及部分编码序列的DNA片段克隆
(1)在NCBI数据库调出小鼠来源的FSP1基因序列(GeneID:20198)，并对基因结构进行分析，查找转录起始位点TSS、起始密码子、终止密码子、外显子及内含子区域(如图1所示)。
(2)利用PrimerPrimer5.0软件设计并合成下列PCR引物，以小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)(ATCC，美国)的基因组DNA(所述的基因组DNA是通过试剂盒EasyPureGenomicDNAKit(TransgenBiotech)提取得到)为模板，用KOD-Plus-Neo高保真酶PCR试剂盒(Toyobo)扩增目标DNA片段，命名为mFSP1-p(大小为3229bp，范围：-1079bp至+2150bp)。
所述PCR引物的DNA序列如下所示：
FSP1-F：5′-ATGTCTTCTTGGCTTACTTTTGTTT-3′；
FSP1-R：5′-TCATCTGAGGAGTCTTCACTTCTTC-3′；
其中，PCR反应体系如表1所示。
表1用于扩增3229bp片段的PCR反应体系
| 基因组DNA(200ng/μL) | 0.5μL |
| FSP1-F(10μM) | 1.5μL |
| FSP1-R(10μM) | 1.5μL |
| KOD-Plus-Neo(1.0U/μL) | 1μL |
| 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo | 5μL |
| dNTPs(2mM) | 5μL |
| MgSO4(25mM) | 3μL |
| DDW | 32.5μL |
| Total Volume | 50μL |
将上述反应体系混匀，按照如下条件进行退火反应：94℃预变性2min，98℃10s，58℃退火30s，68℃延伸1min10s；共35个循环；最后于68℃延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检查。
(3)将上述PCR产物进行电泳分析，结果显示所扩增的DNA片段与预期大小(3229bp)一致，如图2A所示。经电泳分离后，利用凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收目的大小片段。
(4)将上述回收的目标片段与pEASY-Blunt克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)进行连接反应。
表2PCR片段与pEASY-Blunt载体连接反应体系
| pEASY-Blunt克隆载体 | 1μL |
| PCR扩增产物 | 1μL |
| DDW | 3μL |
| Total Volume | 5μL |
将上述反应体系轻轻混合，于25℃反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，用于转化。
(5)将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，涂布于含有氨苄青霉素(浓度100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，重组质粒经过菌落PCR验证。结果显示，所挑选的6个克隆均能扩增出目标大小的片段(图2B)。
(6)分别利用M13-F及M13-R对阳性重组质粒进行测序(北京六合华大基因科技有限公司)，测序正确的重组质粒命名为pEASYB-mFSP1-p(图2C-D)。
实施例2pmFSP1-GDLuc报告基因载体构建
(1)以pEASYB-mFSP1-p载体为模板，设计并合成融合PCR引物(FSP1-luc-F/FSP1-luc-R)，用KOD-Plus-Neo高保真酶PCR试剂盒(Toyobo)扩增FSP1启动子区域(大小为2321bp，范围：-1079bp至+1242bp)。
所述融合PCR引物的DNA序列如下所示：
FSP1-luc-F：5′-atcgatgcggccgcATGTCTTCTTGGCTT ACTTT-3′；(ClaI：atcgat；NotI：gcggccgc)
FSP1-luc-R：5′-actagtctagaccGGTAACCGTTGAGA CCTAAG-3′；(SpeI：actagt；XbaI：tctaga；AgeI：accGGT)
上述引物中大写字母及下划线DNA序列为与模板中FSP1启动子序列结合的区域；方框内的小写字母为与pMCS-GDLuc报告基因载体中重叠的DAN序列；单独的小写字母为添加的酶切位点序列。
(2)将上述融合PCR产物进行电泳分析，结果显示所扩增的DNA片段与预期大小(2321bp)一致，如图3A所示。经电泳分离后，利用凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收目的大小片段。
(3)将pMCS-GDLuc报告基因载体(ThermoFisher，USA)用KpnI及BamHI进行双酶切，切胶回收线性化载体片段。同时，利用pEASY-UniSeamlessCloningandAssembly重组酶试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)将上述纯化回收的融合PCR片段与线性化的pMCS-GDLuc载体进行重组连接。
表3融合PCR产物与pMCS-GDLuc载体重组连接反应体系
| 2x Assembly Mix | 5μL |
| 线性化pMCS-GDLuc载体(100ng/μL) | 0.5μL |
| 融合PCR扩增产物(50ng/μL) | 0.5μL |
| DDW | 4μL |
| Total Volume | 10μL |
将上述反应体系轻轻混合，于50℃反应15分钟。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒，将重组产物直接用于转化。
(4)将上述重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，涂布于含有氨苄青霉素(浓度100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，重组质粒经过菌落PCR验证。结果显示，所挑选的3个克隆均能扩增出目标大小的片段(图3B)。
(5)利用GDLuc-R反向测序引物(5′-TCTTCATCTTGGGCGTGC-3′)对阳性重组质粒进行测序(北京六合华大基因科技有限公司)，测序正确的重组质粒命名为pMCS-mFSP1-GDLuc，简称为pmFSP1-GDLuc(图3C-D)。
实施例3pmFSP1-GDLuc报告基因载体功能验证
(1)实验分组：
转染人胚肾上皮细胞(293T细胞)：对照组(pMCS-GDLuc+pTK-RedLuc)；实验组(pmFSP1-GDLuc+pTK-RedLuc)。
转染3T3细胞：对照组(pMCS-GDLuc+pTK-RedLuc)；实验组(pmFSP1-GDLuc+pTK-RedLuc)。
实验共分为上述4组，所有组别的细胞数量及转染条件一致。
(2)具体转染方法：将2×104个293T细胞及3T3细胞(ATCC，美国)分别接种于96孔板，用DMEM(10％的血清、无抗生素)培养基培养24小时，待细胞长到70％～80％融合，去除原有培养基。将10ng的内参载体pTK-RedLuc、100ng荧光报告基因载体pMCS-GDLuc或pmFSP1-GDLuc(pMCS-GDLuc作为阴性对照载体)与1μL的LipoFiterTM脂质体转染试剂(汉恒生物)混合于50μL的Medium(Gibco)中，共同添加到含有100μL新鲜DMEM完全培养基的96孔板中，放入37℃的培养箱中继续培养48h。
(3)荧光报告基因检测：细胞转染48小时后，用PierceTMGaussia-FireflyLuciferaseDualAssayKit(ThermoFisher)及多功能酶标仪，分别检测细胞上清(Gaussia-DuraLuciderase，GDLuc)(460±20nm)及细胞裂解液(RedFireflyLuciferase，RedLuc)(620±20nm)中荧光霉素的活性。结果表明，pMCS-GDLuc无论在293T细胞中还是在3T3细胞中均不能有效表达荧光霉素报告基因(GDLuc)，虽然pmFSP1-GDLuc荧光霉素报告基因载体在293T细胞中有一定量的基础表达，但其表达水平显著低于在3T3成纤维细胞中的表达水平(1203±850RLUversus8501±1084RLU，p<0.01)(图4)。因此，本发明所克隆的启动子mFSP1(2.3kb)能够特异性地在成纤维细胞中激活靶基因的表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种成纤维细胞特异性启动子mFSP1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.含有权利要求1所述的成纤维细胞特异性启动子mFSP1的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：
所述的重组载体为将权利要求1所述成纤维细胞特异性启动子mFSP1插入pMCS-GDLuc的KpnI和BamHI位点间得到的重组载体。
4.扩增权利要求1所述的成纤维细胞特异性启动子mFSP1的引物对，其特征在于：所述的引物对的DNA序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。
5.权利要求1所述的成纤维细胞特异性启动子mFSP1在使目的基因在成纤维细胞中特异表达中的应用。
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| CN201510762262.6A Pending CN105219777A (zh) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | 一种成纤维细胞特异性启动子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105219777A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996037104A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for inhibiting fibrogenesis |
| CN102711799A (zh) * | 2009-11-10 | 2012-10-03 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于创伤治疗的组合物和方法 |
| EP2638163A1 (en) * | 2010-11-12 | 2013-09-18 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
-
2015
- 2015-11-09 CN CN201510762262.6A patent/CN105219777A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996037104A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for inhibiting fibrogenesis |
| CN102711799A (zh) * | 2009-11-10 | 2012-10-03 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于创伤治疗的组合物和方法 |
| EP2638163A1 (en) * | 2010-11-12 | 2013-09-18 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FRANK STRUTZ等: "Identification and Characterization of a Fibroblast Marker: FSP1", 《THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY》 * |
| HIROKAZU OKADA等: "Identification of a novel cis-acting element for fibroblast-specific transcription of the FSP1 gene", 《THE AMERICAN PHYSIOLOGICAL SOCIETY》 * |
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