CN113774085A

CN113774085A - 一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用

Info

Publication number: CN113774085A
Application number: CN202110963044.4A
Authority: CN
Inventors: 赖良学; 刘洋; 邹庆剑; 周继曾; 周小青; 杨洋; 李川; 刘玉; 程令印; 郑雨龄
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113774085B

Abstract

本发明提供了一种单碱基编辑工具TaC9‑ABE及其应用。所述单碱基编辑工具TaC9‑ABE包括：表达TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶的第一载体；表达SgRNA和nSpCas9蛋白的第二载体。所述单碱基编辑工具TaC9‑ABE是一种双组份基因编辑器，具有高效、安全的特点。相比于传统的ABE7.10系统，该双组份编辑器TaC9‑ABE的编辑效率与其相似甚至更高。该双组份编辑器中的单组分在靶向位点完全没有编辑活性，且双组份同时转染时预测的脱靶区域也没有发现编辑现象，说明该双组份编辑器增加了靶向位点的识别特异性，减少了Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶问题。

Description

一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用。

背景技术

靶向人类基因组的核苷酸编辑在科学研究和临床治疗中具有很高的应用价值。目前，应用最广泛的基因编辑方法是CRISPR/Cas9技术，它可以在包括哺乳动物等在内的多种生物细胞中进行基因组编辑，但由于产生双链断裂(DSB)会通过易错的非同源末端连接(NHEJ)引起随机插入缺失，同时目标的同源性定向修复(HDR)在靶位点效率较低，因此在临床应用方面CRISPR/Cas9技术存在一定的问题。

同时，随着人类基因组计划的开展，通过大数据分析已经证实与疾病相关的基因变异约80％属于点突变，而转换突变(从一个嘌呤-嘧啶碱基对变成另一嘌呤-嘧啶碱基对)约占已知致病性点突变的60％。

研究证明与催化受损的Cas9蛋白融合的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶可高效实现靶向C-to-T(BE3)或A-to-G(ABE7.10)单碱基转换，不产生DSB且不依赖模板供体DNA。这种转换通过CRISPR/Cas9碱基编辑器，RNA引导的Cas蛋白与单链DNA(ssDNA)脱氨酶融合来实现。DNA中的A-T到G-C转换需要将腺苷脱氨为肌苷，而肌苷被细胞机制识别为鸟苷。在DNA没有脱氨基酶的情况下，大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶(TadA)与Cas9融合，并进化成ABE7.10，它能催化脱氧腺苷的靶向脱氨。ABE7.10编码两个TadA的副本，一个N端野生型(WT)TadA连接到进化的TadA(TadA*)，它的C端连接到一个“缺口酶”(即切割双链DNA(dsDNA)的一条链)版本的嗜热链球菌Cas9(nSpCas9)。

ABE对研究和校正致病等位基因特别有用，因为原则上将A-T碱基对转换为G-C碱基可纠正近一半的致病点突变，因此，单碱基编辑技术被人们寄予了厚望，相继成为脊髓性肌营养不良、地中海贫血、血友病等罕见病基因治疗的热门工具之一。

然而，随着研究的深入进行，研究人员发现单碱基编辑工具的脱靶效应明显。2019年3月通过全基因组测序分析，研究人员分别在小鼠和水稻上证实，除了传统的Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶风险之外，CBE系统还存在Cas9非依赖型的DNA脱靶风险，而ABE系统的Cas9非依赖型的DNA脱靶效应相对较低。

2019年4月，J.Keith Joung团队的研究论文显示：CBE和ABE单碱基编辑不仅会导致DNA突变，还会导致大量RNA编辑。(参见Grünewald J,Zhou R,Garcia SP,Iyer S,LareauCA,Aryee MJ,Joung JK.Transcriptome-wide off-target RNA editing induced byCRISPR-guided DNA base editors.Nature.May；569(7756):433-437(2019).)。

2019年5月8日，David R.Liu团队研究证明当前的ABE在细胞RNA中产生低但可检测水平的广泛的腺苷-肌苷编辑。使用结构指导原则设计脱氨酶结构域中的突变，开发了新的ABE变体，在三种哺乳动物细胞系中保留了它们有效编辑DNA的能力，并且显示出显著降低的RNA编辑活性，较低的脱靶DNA编辑活性和减少的插入缺失副产物(通过在TadA中引入E59A或E59Q突变以及在TadA*中引入V106W突变，使细胞RNA编辑显著减少)。通过解耦DNA和RNA编辑活性，这些ABE变体通过降低RNA和DNA脱靶编辑活性来提高腺嘌呤碱基编辑的特异性(参见Rees H A,Wilson C,Doman J L,et al.Analysis and minimization ofcellular RNA editing by DNA adenine base editors[J].Science Advances,5(5):eaax5717.(2019).)；但是值得注意的是，该突变体并未将RNA脱靶降低至对照组的水平，同时DNA的编辑的效率也有所下降。

2019年5月，J.Keith Joung组发表在BioRxiv上的文章也指出，将rAPOBEC1替换成单链DNA脱氨酶AID而不需要做任何的点突变，就可以避免在RNA水平上的脱靶。目前对优化的CBE系统的on-target检测，数量还偏少，需要今后进一步增加样本量来验证其普适性(参见Grünewald J,Zhou R,Iyer S,Lareau GA,Garcia SP,Aryee MJ,Joung JK.CRISPRadenine and cytosine base editors with reduced RNA off-targetactivities.BioRxiv.May(2019).)。

2019年6月，杨辉研究组通过精巧的实验设计证明了RNA脱靶主要是由于融合在Cas9上的脱氨酶导致，属于Cas9非依赖型的脱靶，因此对单碱基编辑的脱氨酶进行了突变优化，通过破坏其RNA结合活性，最终获得能够完全消除RNA脱靶并且维持DNA编辑活性的高保真单碱基编辑工具。其中，研究人员开发的ABE(F148A)突变体还能够缩小编辑窗口，实现更加精准的DNA编辑。改进的BE3单碱基编辑工具效率更高，还新开发了ABE单碱基编辑工具，是基因编辑领域的重要发现(参见Zhou C,Sun Y,Yan R,Liu Y,Zuo E,Gu C,Han L,WeiY,Hu X,Zeng R,Li Y,Zhou H,Guo F,Yang H.Off-target RNA mutation induced by DNAbase editing and its elimination by mutagenesis.Nature.Jul；571(7764):275-278(2019).)。

虽然目前的研究已经从不同方向基本解决单碱基编辑技术中Cas9非依赖型的DNA和RNA脱靶问题，但基于sgRNA序列错配结合(mismatch tolerance)导致的DNA脱靶问题仍没有较好的解决措施，当前只能通过网站筛选的方式，选择相对较特异的序列，但由于PAM区和单碱基编辑范围的限制，靶向位点的选择空间还是非常局限。同时，不同序列的编辑效率有一定的差异，前人基于脱氨酶的突变筛选存在效率降低，靶向范围缩小的问题，想要同时达到安全和高效的目标还有一定的困难。

综上所述，虽然已经通过优化脱氨酶基本解决了Cas9非依赖的DNA脱靶和RNA脱靶问题，但由于基因组的复杂性，出现与靶向sgRNA高度同源甚至相同的序列的可能性非常高，由此产生的DNA脱靶问题很有可能产生细胞毒性，对单碱基编辑工具在临床的应用造成阻碍。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用。所述单碱基编辑工具TaC9-ABE是一种双组份基因编辑器，相比于传统的ABE7.10单碱基编辑器，其增加了靶向位点的识别特异性，减少了Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶问题，为临床应用奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种单碱基编辑工具TaC9-ABE，所述单碱基编辑工具TaC9-ABE包括：表达TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶(ecTadA(WT))和突变型腺苷脱氨酶(ecTadA*)的第一载体和表达SgRNA和nSpCas9蛋白的第二载体。

本发明提供的单碱基编辑工具TaC9-ABE，包含第一载体和第二载体，其第一载体上携带野生型腺苷脱氨酶、突变型腺苷脱氨酶和TALE识别蛋白。所述TaC9-ABE系统为一种双组份基因编辑器，与传统的ABE7.10单碱基编辑器相比，在已测试的基因上与双组份编辑器TaC9-ABE编辑效率相似甚至更高。

同时，双组份系统间接增加了靶向序列的长度，单个组分即使产生非靶点结合也不能发挥碱基编辑作用，增加了靶向位点的识别特异性，减少了Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶问题，最大程度符合安全和高效的要求；并且该单碱基编辑工具TaC9-ABE在胚胎水平也有较高的编辑活性。

作为本发明优选的技术方案，所述第一载体上所述野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶位于所述TALE识别蛋白的N端。

优选地，所述野生型腺苷脱氨酶位于所述突变型腺苷脱氨酶的N端。

作为本发明优选的技术方案，所述突变型腺苷脱氨酶与TALE识别蛋白通过linker相连。

优选地，所述第一载体按顺序依次包括：编码野生型腺苷脱氨酶的核苷酸序列、编码突变型腺苷脱氨酶的核苷酸序列、linker以及编码TALE识别蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述linker为柔性linker。

优选地，所述柔性linker的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为1～5的任意整数，例如可以是1、2、3、4或5。

本发明中，通过改变TaC9-ABE的linker长度，例如所述linker为1×(GGGGS)、3×(GGGGS)或5×(GGGGS)，对HEK293T细胞系进行共转染后分选，测序检测编辑效率，根据所得结果可知，linker长度的变化能够改变腺苷脱氨酶的空间位置，但是对于本发明而言，linker的长度对碱基编辑的效率几乎没有影响。

作为本发明优选的技术方案，所述TALE识别蛋白的结合位点与sgRNA位点的距离为4～14bp，例如可以是4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp或14bp等，优选为6～12bp，进一步优选为6bp或10bp。

本发明中，通过改变TALEN组分和nSpCas9的距离在编辑范围内可以改变不同位点的编辑效率，这在一定范围内增加了该基因编辑器的可操作性。

作为本发明优选的技术方案，所述野生型腺苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：

SEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD

优选地，所述突变型腺苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD

第二方面，本发明还提供一种核苷酸片段，所述核苷酸片段包含编码TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶的核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如第一方面所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE中的第一载体或如第二方面所述的核苷酸片段。

第四方面，如第一方面所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE、如第二方面所述的核苷酸片段或如第三方面所述的重组宿主细胞在基因编辑中的应用。

优选地，所述基因编辑为将碱基A转换为碱基G的单碱基编辑。

第五方面，如第一方面所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE、如第二方面所述的核苷酸片段或如第三方面所述的重组宿主细胞在制备治疗基因突变相关疾病的药物中的应用。

优选地，所述基因突变相关疾病包括脊髓性肌营养不良、地中海贫血或血友病中的任意一种。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供一种单碱基编辑工具TaC9-ABE，所述单碱基编辑工具TaC9-ABE包括表达TALE识别蛋白、ecTadA(WT)和ecTadA*的第一载体和表达SgRNA和nSpCas9蛋白的第二载体；相比于其他方式组合的基因编辑系统，该双组份编辑器TaC9-ABE的编辑效率明显更高，相比于ABE7.10系统，该双组份编辑器TaC9-ABE的编辑效率与其相似甚至更高；同时，该双组份编辑器TaC9-ABE可通过改变TALE组分和nSpCas9的距离，在编辑范围内改变不同位点的编辑效率，增加了该方法的可操作性；此外，TaC9-ABE在胚胎水平也有较高的编辑活性；说明本发明提供的单碱基编辑工具TaC9-ABE效率高，应用范围广；

(2)所述单碱基编辑工具TaC9-ABE，在293T细胞系中单独转染腺苷脱氨酶TALE组分和nSpCas9组分时，在靶向位点完全没有编辑活性，说明单一组分无法完成A到G的编辑，而双组份同时转染时预测的脱靶区域也没有发现编辑现象，说明双组份系统增加了靶向位点的识别特异性，减少了Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶问题；同时，高通量测序结果显示在多个预测的易脱靶位点的TaC9-ABE脱靶频率要显著低于ABE7.10，而与WT的水平接近一致，说明本发明提供的单碱基编辑工具TaC9-ABE具有较高的安全性。

综上所述，本发明提供的单碱基编辑工具TaC9-ABE为双组份编辑器，其编辑效率高、特异性高且脱靶频率低，是一种高效、安全的单碱基基因编辑工具。

附图说明

图1为本发明提供的单碱基编辑工具TaC9-ABE的工作原理示意图。

图2为实施例1中构建的质粒的结构示意图。

图3为实施例2中的实验流程示意图。

图4为实施例2中采用各质粒或者质粒组合编辑后碱基A到碱基G转换的转换率对比图。

图5为实施例2中在HEK2基因座的碱基A到碱基G转换的转换率对比图。

图6A为实施例3中TaC9-ABE系统在AAVS1基因座处具有不同目标距离的TALE和SgRNA的碱基编辑效率对比图。

图6B为实施例3中TaC9-ABE系统在EMX1基因座处具有不同目标距离的TALE和SgRNA的碱基编辑效率对比图。

图6C为实施例3中TaC9-ABE系统在HEK2基因座处具有不同目标距离的TALE和SgRNA的碱基编辑效率对比图。

图7为实施例4中TALE与腺苷脱氨酶之间的不同接头长度对应的编辑效率对比图；其中，+6和+11代表TALE和sgRNA靶点之间长度6bp和11bp；1×(GGGGS)、3×(GGGGS)、5×(GGGGS)分别是编码1、3、5个连续GGGGS蛋白的接头序列。

图8A为实施例5中使用TaC9-ABE系统处理HEK293T、Hela和U2-OS细胞后得到的Sanger测序谱图。

图8B为实施例5中TaC9-ABE系统在HEK293T、Hela和U2-OS细胞系中的编辑效率比较图。

图8C为实施例5中TaC9-ABE系统在HEK293T、Hela和U2-OS细胞中6个基因位点的靶向编辑效率对比图。

图9A为实施例6中兔胚胎内源性OTC和DMD位点的代表性Sanger测序色谱图，其中I图为OTC位点，II图为DMD位点。

图9B为实施例6中TaC9-ABE和ABE7.10系统在兔OTC和DMD位点的碱基编辑效率对比图，其中I图为OTC位点，II图为DMD位点。

图10A为实施例7中TaC9-ABE和ABE7.10在不同基因座上的目标编辑频率对比图。

图10B为实施例7中TaC9-ABE和ABE7.10在不同基因座上的脱靶编辑频率对比图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

本发明中通过如下技术手段得到筛选得到所述单碱基编辑工具TaC9-ABE，并对其功能进行细胞水平和动物水平的验证。

1、携带腺苷脱氨酶组分的组合型TALE和nCas9质粒设计与载体构建。将腺苷脱氨酶分为两个组分ecTadA(WT)和ecTadA*分别与TALE和nCas9融合形成新的质粒。

2、检测不同组合类型对编辑效率的影响。将不同组合的质粒载体通过脂质体共转染进HEK293T细胞，通过流式细胞术分选得到同时表达荧光蛋白EGFP和mCherry的细胞，裂解后用作模板进行PCR，扩增出基因组上的靶向编辑序列，测序后通过软件EditR计算靶位点AAVS1上A-G的编辑效率。

3、测试双组份识别位点之间距离的长短对编辑效率的影响。设置TALE识别区和sgRNA识别区的距离从+4bp到+14bp的梯度，分别转染HEK293T细胞，测序验证不同距离下的编辑范围和效率，确定最佳的编辑距离。

4、测试linker长度对编辑效率的影响。通过改变TaC9-ABE的linker长度，对HEK293T细胞系进行共转染后分选，测序检测编辑效率。

5、测试单碱基编辑系统在不同细胞系的有效性。之前实验中都是对HEK293T细胞系进行编辑，接着，将该系统转染不同的人类细胞系如U2-OS、Hela，靶向不同基因位点，测序计算其单碱基编辑效果，证明该系统的适应性。

6、胚胎水平体外验证TaC9-ABE的编辑效率。选择兔子基因DMD，OTC设计靶向单碱基编辑位点，将质粒载体体外转录后显微注射到原核期前后的兔受精卵中，待发育到囊胚后收集胚胎进行测序，检测编辑情况。

7、高通量测序证明TaC9-ABE能克服DNA依赖性脱靶，证明其高特异性。通过Cas-OFFinder网站对靶位点的易错配位点进行筛选，对可能脱靶的位点进行PCR扩增，高通量测序，检测是否存在脱靶编辑。

实施例1 TaC9-ABE质粒设计与构建

(1)设计双组份质粒

本实施例中利用SgRNA和TALE系统进行位点特异识别，nCas9打开双链并进行单链切割后修复，以及腺苷脱氨酶将A转化为G的功能的组合进行单碱基基因组编辑。

如图1所示，腺苷脱氨酶设计在TALE识别区的N端，在特定识别蛋白结合位于靶向位点下游的目标序列的同时带领腺苷脱氨酶靠近靶向编辑位点，而SgRNA与nCas9形成的核糖蛋白复合物结合到靶向位点打开DNA双螺旋，方便单链碱基编辑蛋白腺苷脱氨酶行使功能，在双组份基因编辑工具的组合下完成SgRNA靶向范围4-8位内的碱基A转换为G。

实验过程中所涉及的质粒载体如图2所示，包括：

ABE-TALE质粒：EF1α-sp6-NLS-ecTadA(wt)-ecTadA*-linker-Tale-T2A-EGFP

TALE-ABE质粒：EF1α-sp6-NLS-Tale-linker-ecTadA(wt)-ecTadA*-T2A-EGFP

TALE-TadA(wt)质粒：EF1α-sp6-NLS-Tale-linker-ecTadA(wt)-T2A-EGFP

TALE-TadA*质粒：EF1α-sp6-NLS-Tale-linker-ecTadA*-T2A-EGFP

ABE7.10质粒：CMV-T7-ecTadA(wt)-ecTadA*-linker-nCas9-NLS-T2A-EGFP

TadA(wt)-nCas9质粒：CMV-T7-ecTadA(wt)-linker-nCas9-NLS-T2A-Cherry

TadA*-nCas9质粒：CMV-T7-ecTadA*-linker-nCas9-NLS-T2A-Cherry

nCas9质粒：CMV-T7-nCas9-NLS-T2A-Cherry

U6-SgRNA质粒：U6-gRNA。

其中，ecTadAwt表示ecTadA野生型，ecTadA*表示突变型，TALE识别蛋白和腺苷脱氨酶组分由EF1α启动表达并通过表达绿色荧光蛋白EGFP进行阳性筛选。

为了测试不同空间位置对编辑效果的影响，将腺苷脱氨酶组分别放在TALE蛋白的C端或N端；其中，ABE-TALE表示腺苷脱氨酶组分TadAwt*(表示ecTadA(wt)和ecTadA*)位于TALE识别蛋白的N端，同理，TALE-ABE表示TadAwt*位于TALE识别蛋白的C端。

nCas9部分由CMV起始表达，主要通过红色荧光蛋白mCherry进行阳性筛选，为了得到更高的编辑效率将ecTadA野生型和突变型组分设计在nCas9的N端，同时配合位于TALE的C端脱氨酶对应部分。

(2)设计gRNA和TALE识别序列

依据spCas9的PAM区原则在人类基因组上寻找可用的sgRNA位点，在适当的距离内参考TALEN构建原则选取TALE识别序列。

本实施例中使用的序列如下：

Site1-AAVS1(SEQ ID NO.3)，序列为

SgRNA序列gacaaaagatcccgctctcgtgg(SEQ ID NO.4，与大写部分的序列反向互补)，靶向4-9位的A；

Tale识别序列首先是选择与SgRNA序列相隔+6bp的序列，即gcactacttgtcctcggt(SEQ ID NO.5，斜体加粗部分)和+11bp的序列，即acttgtcctcggttctt(SEQ ID NO.6，下划线部分)的识别区。

Site2-HEK2(SEQ ID NO.7)，序列为

SgRNA序列gtagaaaaagtatagactgcagg(SEQ ID NO.8，与大写部分的序列反向互补)，靶向3-9位的A；

Tale识别序列首先是选择与SgRNA序列相隔+6bp的序列，即tataggagaacaagaac(SEQ ID NO.9，斜体加粗部分)和+10bp的序列，即ggagaacaagaacaaa(SEQ ID NO.10，下划线部分)的识别区。

Site3-EMX1(SEQ ID NO.11)，序列为

SgRNA序列ggaagaaaaggaagaaaattagg(SEQ ID NO.12，大写部分)，靶向3-9位的A，Tale识别序列首先是选择与SgRNA序列相隔+6bp的序列，即ctgcttatctttatc(SEQ IDNO.13，与斜体加粗部分反向互补)和+10bp的序列，即ttatctttatcccttgg(SEQ ID NO.14，与下划线部分反向互补)的识别区。

实施例2检测不同组合类型对编辑效率的影响。

为了比较脱氨酶组分连接TALE和nCas9的不同组合方式和空间位置对编辑效果的影响，本实施例中转染不同组合的质粒对AAVS1位点测试。

具体操作步骤如图3所示，包括：

将质粒用脂质体转染试剂转染到密度约70％-80％的HEK 293T细胞中，转染12h换液，培养三天后进行流式分选；

收集同时表达绿色荧光蛋白EGFP和红色荧光蛋白cherry的细胞，以分选细胞的基因组为模板对靶向位点进行PCR扩增并测序，计算编辑位点的单碱基编辑效率。

如图4所示，ABE7.10实现了最多约75％的A到G转换；表达单个组件，例如nCas9、TadAwt-nCas9、TALE、TadAwt*-TALE、TALE-TadAwt*、TALE-TadAwt和TALE-TadA*在目标位点上没有检测到基因编辑；由于TadA*单体即有单碱基编辑活性，可以看到TadA*-nCas9有18％的A到G转换。

对于双组分组，TadAwt-nCas9、nCas9分别与TALE-TadA*组合，只有在距离为10bp时编辑效率为20％；TadA*-nCas9与TALE-TadAwt组合效率更高(分别为20％和60％)，但不符合单组分没有编辑活性的安全原则；

同时，当nCas9与TadAwt*-TALE结合时，A到G的转换效率达到了80％，与ABE7.10相当，达到了高效和安全的要求，因此，本发明中将这个组合命名为TaC9-ABE，所述TaC9-ABE为一种高效安全的单碱基基因编辑工具。

另外，本实施例中在HEK2位点进行测试也进一步证明了只有当nCas9与TadAwt*-TALE(带有6bp或10bp间隔区)配对时，碱基编辑效率才接近甚至高于ABE7.10(图5)。

而空间距离不同导致的编辑效率差异也说明间隔距离对脱氨酶的空间位置的调节会影响碱基编辑活性，识别序列存在最佳的间隔距离。

实施例3测试双组份识别位点之间距离的长短对编辑效率的影响

本实施例中，在不同基因位点对双组份的距离做了优化测试。

从图6A可以看出，AAVS1位点在测试的编辑距离+4bp到+14bp中，高效的编辑范围大概在+6bp到+12bp之间，其中在距离为+6bp时A6位的编辑效率最高可达87％，其次是+10bp时的A5效率约88％。

距离较远如+10bp，+11bp，+12bp时，A5编辑效率较高，距离较近如+6bp，+8bp时，A6编辑效率较高；分析其原因主要是因为A5较靠近TALE蛋白一侧，在距离较远时脱氨酶靠近A5，导致编辑效率高于A6位点。相似的，在距离最远+14bp时，只有A4被编辑，而距离最近+4bp时只有A9被编辑，这也证明了上述结论。

此外，在距离为+6bp时有效编辑窗口(>20％)缩小至A5到A7(～3nt)。而在较长的距离(9bp到11bp)碱基编辑窗口较大，A4到A9(～6nt)。

奇怪的是，当间隔长度为7bp时，并没有检测到基因编辑，推测可能的原因是由于TALE不符合设计规则(上游碱基应为T或C)，未能结合其目标DNA。

为了验证这一猜测，本实施例中接着测试了另外两个基因EMX1和HEK2，结果与AAVS1位点相似。

EMX1中距离7bp的编辑效果与6bp相似，有效编辑窗口为A5到A7(～3nt)(图6B)。它还表明，间隔距离越长编辑窗口越宽，当距离过长时，例如HEK2的12bp，不再有基因编辑效果(图6C)，说明可以根据需要设置合理的间隔长度来改变编辑窗口。

综上，在双组份系统的后续应用中，优先选择+6bp作为间隔距离。

实施例4测试linker长度对编辑效率的影响

本实施例中尝试通过改变腺苷脱氨酶与DNA识别区之间的linker类型和长度提高单碱基编辑能力。

采用柔性linker，GGGGS(SEQ ID NO.15)，并设计成不同长度，测试在不同的距离下靶向A的编辑能力。

如图7所示，在linker分别为1×(GGGGS)、3×(GGGGS)和5×(GGGGS)的条件下，编辑效率最高是linker为1×(GGGGS)时，距离+11bp下的A5，效率约88％，第二是距离+6bp下的A6，效率约87％，说明linker为GS1时可以达到较高的编辑效果。+6bp距离下主要的碱基编辑(>30％)位点是A5和A6，而+11bp下为A4到A9。

这些结果也表明了双组份系统之间的距离和linker长度的变化能通过改变腺苷脱氨酶的空间位置影响单碱基编辑的作用效果，而接头的长度在一定范围内对碱基编辑的效率影响较小。

实施例5测试单碱基编辑系统在不同细胞系的有效性

本实施例为了证明TaC9-ABE在不同细胞系和不同基因中应用的普遍性，测试了单碱基编辑系统在Hela、U2-OS和HEK293T细胞中对EMX1位点的编辑效率。

如图8A所示，A6和A7仅在44bp靶向区域(15bp TALE位点、23bp sgRNA位点和6bp间隔距离)中转化为G。

如图8B所示，三种不同细胞系之间的碱基编辑效率没有显著差异；

然后，本实施例中还测试了人类基因组中另外6个基因上TaC9-ABE的编辑效率，6个基因的位点如下：

VEGFA(>chromosome:GRCh38:6:43772246，SEQ ID NO.16)：

AGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGG

DYRK1A#1(>chromosome:GRCh38:21:37512075，SEQ ID NO.17)：

GTTCCCATCACCATCACCACCACCACCACCATCACCACCACCATGG

DYRK1A#2(>chromosome:GRCh38:21:37477443，SEQ ID NO.18)：

CAGGGGCATGCACCCCCTCTATACACACACCCCAGGAGTGCTGTGG

Nanog#1(>chromosome:GRCh38:15:35084264，SEQ ID NO.19)：

GGAAGCTGCTGGGGAAGGCCTTAATGTAATACAGCAGACCACTAGG

Nanog#2(>chromosome:GRCh38:15:35084149，SEQ ID NO.20)：

GAAGATGAGTGAAACTGATATTACTCAATTTCAGTCTGGACACTGG

POU5F1(OCT4)(>chromosome:GRCh38:6:31132146，SEQ ID NO.21)：

GTGTCCCAGGCTTCTTTATTTAAGAAAAAAGTGATACATGATGTGG；

所得基因编辑效率如图8C所示，其反应的结果与上述实验结果保持一致。

实施例6胚胎水平验证TaC9-ABE的编辑效率

为了验证TaC9-ABE在体内的编辑能力，本实施例中应用该工具在兔胚胎中对基因OTC和DMD位点进行测试。

图9A为兔胚胎内源性OTC和DMD位点的代表性Sanger测序色谱图，其中I图为OTC位点，II图为DMD位点，TaC9-ABE的编辑窗口有所变窄，编辑位点仅限于OTC中的A6(导致密码子GAT到GGT)和DMD中的A5和A7(导致ACA到GCG)。

TaC9-ABE和ABE7.10系统在兔OTC和DMD位点的碱基编辑效率比较结果如图9B所示，其中I图为OTC位点，II图为DMD位点，相比之下，ABE7.10的编辑窗口在OTC中扩展到A9(密码子TTA到TTG)。

胚胎编辑高效和编辑窗口的缩小有利于TaC9-ABE在基因治疗和动物疾病模型构建方面的应用。

实施例7高通量测序验证TaC9-ABE的高特异性

为了验证TaC9-ABE是否能够克服DNA依赖性脱靶，本实施例在HEK293T细胞中对7个位点进行高通量测序，包括EMX1、VEGFA、POU5F1、DYRK1A#1、DYRK1A#2、AAVS1和HEK2。

用TaC9-ABE或ABE7.10编辑的HEK293T细胞分离的基因组DNA扩增靶位点及其相应的最可能的脱靶位点，其中最可能的脱靶位点个数如下表1所示：

表1

高通量测序分析靶向和脱靶效率的结果如图10A和图10B所示，对于靶向位点，TaC9-ABE在所有7个位点中都显示出与ABE7.10相同甚至更高的碱基编辑效率，而在所有41个位点都没有导致任何可检测的基因组脱靶修饰-潜在的脱靶位点。

相比之下，在ABE7.10编辑的7个位点中有5个观察到Cas9依赖性脱靶(EMX1的8个潜在C9DOT中有1个，VEGFA的4个C9DOT中有3个，POU5F1的5个C9DOT中有4个，DYRK1A#1的11个C9DOT中的10个，DYRK1A#2ABE的6个C9DOT中的2个)。而令人惊讶的是，ABE7.10在一半编辑过的脱靶位点上表现出极高的活性。

至于依赖于TALE的脱靶(TALE-dependent off-target editing)，TaC9-ABE在8个TALE的所有26个脱靶位点上没有导致任何可检测的基因组脱靶修饰(表2)。

表2

总之，本发明中提供了一种新的碱基编辑系统TaC9-ABE，它能够完全消除依赖于Cas9的脱靶，而不会降低靶向效率。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用

<130> 20210818

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile

35 40 45

Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp

165

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile

35 40 45

Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp

165

<210> 3

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggccatgatg gtcttgatct cttgacctca tgatccgccc gcctcggcct gtaatcctgc 60

tgggatgacg agcgtaagcc accatgccca gctgggtttt atttattttg gtttttttcc 120

tgacccctta actagaaata agctccacga gagcgggatc ttttgtcttc tgtgcactac 180

ttgtcctcgg ttcttagaac agaacctgag agaacctgat cgcaaatatt tttggaatga 240

atgaatgaat gggttcacca gggcaccatg ggaaactgag tccgcaacct agaagccatg 300

aaagacagtc cacttccaag cttcc 325

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacaaaagat cccgctctcg tgg 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcactacttg tcctcggt 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acttgtcctc ggttctt 17

<210> 7

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggtgattat ggttacacag cgttatgaat atactaaaga ccattaaatt atatacttaa 60

aatgattgta ttatgtggta tatgaattat aattcaatag aatagtagta aaaaaacagg 120

tgatggaaag catttgcctg cagtctatac tttttctact cctggtatag gagaacaaga 180

acaaagaagt cactcagatt gttttaattg cctttgtact aaggagaaaa ataagaccta 240

tgtcaggcac a 251

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtagaaaaag tatagactgc agg 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tataggagaa caagaac 17

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggagaacaag aacaaa 16

<210> 11

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttaacttgct gcagaggaaa cgacaagaga ataggtccta agaggagtga aaatagagga 60

aactggccaa gggataaaga taagcagagc tatggaagaa aaggaagaaa attagggaat 120

tactggagag gaagctgaca gaaaggggcg ctgggagagg aaaaggtgag ggaggacgaa 180

aacggaactc ctatcaccca gcgcattcca gcaccccctc cccctccccc gg 232

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaagaaaag gaagaaaatt agg 23

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctgcttatct ttatc 15

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttatctttat cccttgg 17

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agccggagga gggggaggag gaagaagaga aggaagagga gagggg 46

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gttcccatca ccatcaccac caccaccacc atcaccacca ccatgg 46

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caggggcatg caccccctct atacacacac cccaggagtg ctgtgg 46

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc actagg 46

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaagatgagt gaaactgata ttactcaatt tcagtctgga cactgg 46

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtgtcccagg cttctttatt taagaaaaaa gtgatacatg atgtgg 46

Claims

1.一种单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述单碱基编辑工具TaC9-ABE包括：

表达TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶的第一载体；

表达SgRNA和nSpCas9蛋白的第二载体。

2.根据权利要求1所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述第一载体上所述野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶位于所述TALE识别蛋白的N端；

3.根据权利要求1或2所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述突变型腺苷脱氨酶与TALE识别蛋白通过linker相连；

4.根据权利要求3所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述linker为柔性linker；

优选地，所述柔性linker的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为1～5中的任意整数。

5.根据权利要求1～4任一项所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述TALE识别蛋白的结合位点与sgRNA位点的距离为4～14bp，优选为6～12bp，进一步优选为6bp或10bp。

6.根据权利要求1～5任一项所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE，其特征在于，所述野生型腺苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

7.一种核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段包含编码TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶的核苷酸序列。

8.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含如权利要求1～5任一项所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE中的第一载体或如权利要求7中所述的核苷酸片段。

9.如权利要求1～6任一项所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE、如权利要求7所述的核苷酸片段或如权利要求8所述的重组宿主细胞在基因编辑中的应用；

10.如权利要求1～6任一项所述的单碱基编辑工具TaC9-ABE、如权利要求7所述的核苷酸片段或如权利要求8所述的重组宿主细胞在制备治疗基因突变相关疾病的药物中的应用；