BR112012030668A2 - método para a terapia do câncer. - Google Patents

Abstract

AGENTE QUE AUMENTA A LOCALIZAÇÃO NUCLEAR DA PROTEÍNA COMMD1 EM UMA CÉLULA CANCEROSA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A TERAPIA DO CÂNCER, COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DO PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE COM CÂNCER E PEPTÍDEO COM A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO PARA O DOMÍNIO COMM. A presente invenção refere-se a um método para o tratamento do câncer por meio do aumento da localização nuclear da proteína COMMD1, a qual está associada com a diminuição ou bloqueio da proliferação da célula de câncer. A invenção também se refere ao uso de agentes que aumentam a localização nucelar da proteína COMMD1 na fabricação de um medicamento para a terapia do câncer. Os ditos agentes podem ser peptídeos ou proteínas, entre outros compostos. A invenção também se refere à otimização de um peptídeo, proveniente da sequência HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW e, dessa forma aumentar o efeito antitumoral do dito peptídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTE QUE AUMENTA A LOCALIZAÇÃO NUCLEAR DA PROTEÍNA COMMD1 EM UMA CÉLULA CANCEROSA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A TERAPIA DO CÂNCER, COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA PARA O “TRATAMENTO DO CÂNCER, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DO

PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE COM CÂNCER E PEPTÍDEO COM A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO PARA O DOMÍNIO COMM". Campo da Técnica A presente invenção se enquadra dentro do campo da biomedi- cina, em particular com a terapia do câncer, ao revelar um novo alvo tera- pêutico para o desenvolvimento de fármacos antitumorais. Os ditos fárma- cos, devido à sua maior seletividade e eficácia, contribuem para a melhora nos tratamentos atuais do paciente com câncer. É descrito um método para o tratamento do câncer por meio da expressão e acumulação nuclear da pro- teína COMMD1. Modificações químicas introduzidas na estrutura primária do peptídeo HARIKPTFRRLKWKYKGKFW aumentam a localização nuclear de COMMD1 e incrementam a atividade antitumoral do peptídeo in vitro e in vivo. Estado da Técnica Anterior Apesar dos grandes avanços na terapia do câncer, existe um grande interesse no desenvolvimento de novos agentes antitumorais com um novo modo de ação, devido ao desenvolvimento de resistência pelas células tumorais para os atuais fármacos anticancerígenos. Os peptídeos estão sendo de grande interesse como novos fármacos terapêuticos, devido ao seu papel como mediadores de importantes funções biológicas e suas propriedades intrínsecas singulares que os tornam agentes terapêuticos par- ticularmente atrativos. Os peptídeos exibem uma alta atividade biológica, associada com baixa toxicidade e alta especificidade. Os benefícios devidos a essas características incluem uma elevada especificidade de união ao branco desejado, minimizam as interações fármaco-fármaco e manifestam uma menor acumulação em tecidos reduzindo o risco de complicações devi- do a metabólitos intermediários (Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today,

1a/22 15:40-56). Na atualidade, existem terapias anticâncer que utilizam peptídeos e/ou pequenas moléculas, com seletividade de união a uma determinada proteína alvo, que tem uma função biológica importante no desenvolvimento do câncer.

Em um primeiro cenário, essas terapias podem estar destinadas ainibirdeterminada função de uma proteína, tal como, por exemplo: Inibido-

2/22 l res das proteínas de estresse térmico (conhecidas como HSPs, do inglês

' Heal Shock Proteins) (Subbarao et al., 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); Inhibidores da tirosina quinase (Garrido et al., 2007, Rev Med

Chil, 10:1327-1332) e como principal evento provocam a apoptose da célula de câncer.

Na maior parte das situações, essas proteínas são desviadas no processo maligno, se forem comparadas com o tecido normal.

Em um se-

gundo cenário, o fármaco se une a uma proteína alvo que pode ou não ser desviada no processo maligno em comparação ao tecido malha normal, e neste caso são afetadas as vias de sinalização que são ativadas no proces-

sode malignidade, por exemplo: Inibidores da replicação do ácido desoxirri- bonucleico (DNA), inibidores do ajuste dos microtúbulos e inibidores do fator . transcricional NFKB.

Enquanto que o primeiro cenário é altamente eficaz em determinadas malignidades hematopoiéticas, a maioria tem uma eficácia

Í limitada na complexidade dos tumores sólidos.

Por outro lado, o segundo cenário inclui alguns dos mais eficazes e ainda mais tóxicos fármacos da

: farmacopeia oncológica.

Por essa razão, é preciso avançar na busca de no- vos fármacos que sejam cada vez mais seletivos e eficazes, minimizando a sua toxicidade.

Neste sentido, a identificação de novos alvos terapêuticos e a compreensão de seu papel no desenvolvimento do câncer irá ajudar a i-

dentificarnovos mecanismos de resistência a fármacos e irá facilitar o dese-

nho de novos medicamentos que retenham uma maior atividade e possam ser combinados com aqueles já existentes, diminuindo a toxicidade dos mesmos e aumentando a qualidade de vida do paciente com câncer.

A pro-

teina COMMD1, previamente conhecida como MURR1 (van de Sluis et al,

2002, Human Molecular Genetic, 11:165-173) pertence a uma nova família de proteínas, conhecidas por suas siglas COMMD (do inglês Copper Meta-

bolism gene MURR1 Domain, abreviado por COMMD). As dez proteínas membros da família são altamente conservadas em organismos pluricelula-

res e expressas de maneira onipresente, mas as funções biológicas da mai-

oriade seus membros são desconhecidas.

A principal característica dessa família é a presença do domínio COMM (do inglês Copper Metabolism Murr1 Domain), conservado e único, compreendido entre os resíduos de aminoáci-

dos 110-190 do extremo C-terminal (Burstein et al., 2005, The Journal of Bio- : logical Chemistry, 280:22222-22232). A COMMD1 foi implicada em diversos processos biológicos tais como: controle do metabolismo do cobre (Tao et al., 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596); regulação do transporte intracelular de sódio (Biasio et al., 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434); inibição do fator trascricional NFKB (Maine et al., 2007, The EMBO Journal, 26:436-447); inibição da expressão de genes re- gulados pelo fator induzido por hipoxia HIF-1a (van de Sluis et al., 2007, Mo- lecular and Cellular Biology, 27:4142-4156).

A COMMD1 apresenta uma interação física com a subunidade ' Re1A(p65) do fator transcricional NFKB, com a subunidade catalítica-alfa do . fator HIF-1a, e com Delta ENaC nos canais epiteliais de sódio. Em todos os casos essa interação conduz à degradação dessas proteínas "clientes" atra- ã vés de um mecanismo que envolve a onipresença e a degradação via prote- asoma. Foi demonstrado que o domínio COMM está envolvido nas intera- ! ções proteina-proteína, tanto para proteínas "clientes" de COMMD1 quanto para interações entre os membros da família. Existe a proposta de estrutura tridimensional para a região do extremo N-terminal de COMMD1, mas não existe ainda uma estrutura terciária para o domínio COMM (Sommerhalter et al, 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715- 721).

A expressão basal de COMMD1 é controlada na célula por meio de um processo de onipresença e degradação proteasomal, através de uma série de resíduos de leucina, com a localização no domínio COMM (Maine et al., 2009, Biochemical Journal, 417:601-609). Recentemente, foi descrito que aCOMMD1 apresenta um mecanismo constitutivo de transporte citoplasma- núcleo através de sinais de exportação nuclear (do inglês Nuclear Export Signals, abreviado como NES) que também fica localizada em seu domínio COMM. Foi relatado que uma quebra nas sequências de leucina e/ou agen- tes que inibem a degradação proteasomal produz um aumento da expressão de COMMD1 na célula. Além disso, a quebra das sequências NES em COMMD!1 incrementam a repressão da atividade transcricional dos fatores NFKB e HIF-10 (Muller et al., 2009, Traffic, 10:514-527).

A célula neoplásica desviada superexpressa diferentes proteínas : antiapoptóticas tais como, por exemplo, a proteína inibidora da apoptose XIAP e a proteína clusterina (CLU), a qual acelera a progressão do câncer da próstata a andrógino independente. Ambas as proteínas favorecem a o- —nipresença e degradação proteasomal de COMMD1, facilitando a ativação de NFKB e a sobrevivência da célula tumoral. Foi relatado que os inibidores de proteasoma tais como, por exemplo, o MG 132 (Shirley et al., 2005, Neo- plasia, 7: 11 04-1111; Zhou et al., 2009, Cancer Research, 21 :333-339), apresentam um efeito antitumoral por inibir o mecanismo de onipresença e degradação proteasomal. Compostos que se unem ao XIAP induzem a a- : poptose, por bloquearem o efeito inibidor dessa proteína sobre a ativação de caspasa-3 e caspasa-9 (Vogler et al., Cancer Research, 2009, 69:2425- 2434). É proposto que o ácido ribonucleico (ARN) de interferência (ARNIi) Y* projetado para inibir a função de CLU tem um efeito antitumoral, por estabili- zarum inibidor citoplasmático do fator NFKB conhecido como |I-KB (Zoubeidi ' et al., 2010, Molecular Cancer Research, 8: 19-30).

No pedido de patente internacional WO 07/095867, a essência da invenção está relacionada com peptídeos provenientes da região 32-51 da proteína LALF (do inglês, Limulus anti-lipopolisaccharide factor), naqueles em que foram realizadas substituições de aminoácidos que garantem a dis- sociação da capacidade de união ao lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, e têm efeito antitumoral e imunomodulador. Um desses peptídeos é o reno- mado peptídeo L2. Além disso, em outra invenção (Pedido de patente inter- nacional PCT/CU2008/000006) é revelada a capacidade de penetração em células dos peptídeos acima mencionados. No entanto, nas ditas invenções não é revelado nem sugerido o mecanismo de ação dos mesmos.

Na atualidade, existe um grande número de terapias dirigidas ao tratamento do câncer (quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, etc.), muitas das quais se encontram em fase de ensaios clínicos. No entanto, ainda per- sistem desvantagens associadas a essas terapias, tais como: pouca seletivi- dade, toxicidade e desenvolvimento de resistência ao fármaco. Outro aspec- to importante a ser levado em consideração neste campo é a seleção de biomarcadores, úteis como diagnóstico e/ou previsores da eficácia de um : fármaco.

Portanto, ainda existe a necessidade de investigar e descobrir no- vas moléculas que sejam úteis no tratamento e/ou diagnóstico do câncer, e o desenho de fármacos cada vez mais seletivos e eficazes com menor toxici- dade Explicação da Invenção A presente invenção resolve o problema acima mencionado, ao descrever um método para o tratamento do câncer por meio do aumento da localização nuclear da proteína COMMD1. O dito incremento provoca a di- minuição ou bloqueio da proliferação da célula de câncer.

Na presente invenção é revelado, pela primeira vez, que o pep- : tídeo L2 (cuja sequência é HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID No. 1) e COMMD1 interagem em células de câncer, e que a localização nuclear de : COMMD1 é associada com a morte da célula cancerígena.

Desse modo, a presente invenção proporciona um uso da proteina COMMD1 na identifica- Ú ção de compostos com atividade antitumoral que facilitam a acumulação e localização nuclear de COMMD1. Os dados apresentados na presente invenção demonstram que o peptídeo antitumoral L2 interage com COMMD!, especificamente na regi- ão compreendida entre os aminoácidos 110-190 da mesma.

Além disso, o peptídeo L2 produz a acumulação nuclear de COMMD1. Do mesmo modo, pela primeira vez é relatado na presente invenção que a expressão da prote- ína COMMD1 contendo sequências de localização nuclear (do inglês Nucle- ar Localization Sequence, abreviado como NLS) é suficiente para induzir a —morteda célula cancerígena.

Portanto, a presente invenção demonstra o uso de COMMD1, pela primeira vez, como alvo terapêutico no tratamento do câncer.

Além disso, o peptídeo L552 (SEQ ID No. 3) é otimizado , a par- tir da sequência do peptídeo L2 (SEQ ID No. 1), para provocar uma acumu- lação de COMMD1 no núcleo, e aumentar o efeito antitumoral in vitro e in vivo do dito peptídeo.

O peptídeo L552 (SEQ ID No. 3), descrito na presente invenção, que foi otimizado para facilitar a localização nuclear de COMMD1,

apresenta a seguinte sequência: : ACc-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW SEQ ID No. 3 A otimização é baseada na realização de modificações quími- cas, por meio de substituições de aminoácidos naturais por aminoácidos não naturais (Daminoácidos) em posições específicas (que são representadas em letras minúsculas e em negrito na sequência incluída acima) e a prote- ção do extremo N-terminal por meio da acetilação (indicada como Ac- na sequência incluída acima). Essas modificações, realizadas na sequência do peptídeo L2 (SEQ ID No. 1), e que dão lugar ao peptídeo L552 (SEQ ID No. 3), garantem uma maior acumulação de COMMD1 no núcleo e um aumento É na atividade antitumoral do peptídeo L552, com respeito ao peptídeo original L2. Portanto, o peptídeo L552 é uma nova classe de moléculas que intera- gem com COMMDI, facilitando a sua localização nuclear e produzindo a " inibição da proliferação da célula de câncer.

Um outro objeto ainda da presente invenção é o uso de agentes ' que incrementam a localização nuclear da proteina COMMD1 na fabricação de um medicamento para a terapia do câncer.

Entre os agentes ou compos- tos que facilitam a acumulação nuclear de COMMD1 podem ser incluídos, por exemplo: proteínas (incluindo anticorpos), muteínas, peptídeos, polinu- cleotídeos, aptâmeros, ácidos nucleicos, e pequenas moléculas orgânicas.

Os ditos compostos podem ser isolados de fontes naturais, elaborados de forma sintética ou recombinante, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma realização particular, o agente que incrementa a localização nuclear da proteina COMMD1 é o peptídeo L552 (SEQ ID No. 3). No contexto da pre- sente invenção, têm o mesmo significado aumentar ou incrementar a locali- zação nuclear de COMMD1 e acumular a proteína COMMD1 no núcleo da célula.

Em outra realização particular, o agente que incrementa a localização nuclear da proteina COMMD1 pode ser do tipo ácido nucleico, tal como um vetor de expressão em células de mamíferos que contém uma sequência de —DNA que codifica para a proteina COMMD1 contendo NLS.

Esse tipo de ve- tor pode ser empregado como terapia de genes.

Além disso, faz parte da invenção uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer que compreende um agente que incrementa a 1 localização nuclear da proteina COMMD1. Em uma realização da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz do agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 (determinada por sua concentração inibidora 50 (Clso)) e excipientes ou veículos farma- ceuticamente aceitáveis.

A composição pode ser administrada por via paren- teral, ou por via tópica.

A administração de uma composição farmacêutica que compre- ende um agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 se constitui em um método para o tratamento ou a prevenção de um tumor sólido em um indivíduo, em que o método compreende a administração do agente que facilita a localização nuclear de COMMD1 em uma quantidade eficaz, para diminuir ou bloquear o crescimento da célula tumoral.

É Em uma realização da invenção, o agente que incrementa a lo- calização nuclear da proteína COMMD1 pode ser administrado a pacientes : com leucemias, especificamente a leucemia mielocítica, bloqueando a proli- feração da célula de câncer, inclusive na presença de estímulos inflamató- rios.

Na presente invenção é demonstrado que o peptídeo L552 pode ser empregado em combinação com a quimioterapia padrão para produzir um efeito sinérgico e reduzir a dose dos citostáticos tais como, por exemplo, cisplatina e 5-Fluorouracila (5-FU). Portanto, ainda um outro objeto da presente invenção é uma combinação farmacêutica para o tratamento do câncer que compreende um ou vários agentes que incrementam a localização nuclear da proteína COMMD1, e um ou vários fármacos específicos para a quimioterapia padrão do câncer.

Em uma materialização da invenção, o dito agente é o peptídeo L552 e o fármaco específico para a quimioterapia padrão é selecionado en- tre cisplatina e 5-FU.

Na dita combinação farmacêutica os agentes e fárma- cos que fazem parte da mesma podem ser administrados de forma simultà- nea, separada ou sequencial no curso de um mesmo tratamento.

Por outro lado, a relação entre a inflamação e o câncer é atual-

mente um fato aceito. Na atualidade, é catalogado o microambiente inflama- ] tório como um traço do tumor, que é classificado dentro das seis caracteris- ticas mais importantes do câncer, descritas por Hanahan e Weinbergs (Per- wez et al., 2007, Int J Cancer, 121 :2373-2380).

Os dados apresentados na presente invenção indicam que o peptídeo L552 é eficaz no bloqueio do crescimento da célula de câncer na presença de um estímulo inflamatório. Da mesma maneira, a expressão da proteina GFP-NCOMMD1 que contém NLS facilita o mesmo efeito na célula de câncer. Mais especificamente, os resultados demonstram que o peptídeo L552 facilita a morte da célula de câncer na presença de estímulos inflama- tórios tais como o LPS e o fator de necrose tumoral (do inglês Tumor Necro- se Factor a, abreviado como TNF-a). Da mesma forma, os dados experi- mentais in vivo demonstram a eficácia do peptíideo em um modelo de murino ' de tumor do cólon, no qual ratos foram estimulados com um estímulo infla- —matório por injeção deLPS.

: É por isso que a invenção também provê um método para a ini- bição do desenvolvimento de tumores associados à inflamação e sua metás- tase, o qual compreende a administração do peptídeo L552 a um indivíduo que necessita do mesmo. Dentro dos tumores associados à inflamação e sua metástase encontram-se, por exemplo, os seguintes tipos de câncer: coloretal, esôfago, pulmão, próstata, mama, pâncreas e fígado.

Do mesmo modo, a administração do peptídeo L552 pode ser empregada, de maneira profilática, para prevenir o desenvolvimento de cân- cer associado à inflamação crônica tal como, por exemplo, na enfermidade de Crohn, na colite ulcerativa, na pancreatite, na cirrose, etc. Portanto, ainda um outro objeto da presente invenção é um método para a prevenção do câncer associado à inflamação crônica que é caracterizado por compreender a administração do peptídeo L552 ou de uma composição que compreende o dito peptídeo a um indivíduo que necessita do mesmo.

Quanto à dose e ao esquema de tratamento a seguir com as composições que compreendem o peptídeo L552, como agente que incre- menta a localização nuclear de COMMD1, um elemento versado na técnica pode facilmente determinar a dose e o esquema de tratamento (profilático ou : terapêutico). As quantidades eficazes podem variar dependendo da potência relativa das composições individuais, e pode ser calculada com base no pe- so molecular do peptídeo e em Cls9 in vitro ou em estudos animais. Por e- —xemplo, quando se tem o peso molecular do composto (estrutura química) e uma dose experimental eficaz (Clso) é possível calcular rotineiramente uma dose em mg/Kg do peso. Em geral as doses são de 0,2-4 mg/Kg do peso. O peptídeo ou a composição que contém o mesmo pode ser administrada uma Vez ou várias vezes, semanalmente ou ainda por vários meses.

A invenção também se refere ao uso de COMMD1 como novo marcador prognóstico para o paciente com câncer, por meio da determina- ção da presença ou ausência de localização nuclear de COMMD1 em uma amostra.

Z Similarmente, o peptídeo L552 proporciona um agente ativo para otratamento de enfermidades onde as proteinas COMMD têm um papel ou À intervêm na progressão da enfermidade. Isto é possível, por exemplo, nas enfermidades em que a quantidade de algum membro da família COMMD é aumentada ou diminuída e/ou é aumentada ou diminuída a sua atividade, e isto causa a enfermidade. A capacidade do peptídeo L552 de se unir ao do- —“mínio COMM, compreendido entre os resíduos de aminoácidos 110-190 do extremo C-terminal das proteinas COMMD, sustenta essa atividade terapêu- tica do mesmo.

Breve Descrição das Figuras Figura 1. Ilustra a interação física entre o peptídeo L2 e a proteí- —naCOMMDI utilizando a técnica de dois híbridos de levedura. Como contro- les negativos foi utilizado o emparelhamento da cepa de levedura AH109 transformada com o vetor vazio pGBKT7 e cada construção dos fragmentos de COMMD1 transformados na cepa Y187. Para a identificação da interação foi realizado o emparelhamento da cepa AH109 transformada com o vetor que contém a sequência de L2 e cada construção dos fragmentos de COMMD1 transformada na cepa Y187. Como controle positivo foi utilizado o emparelhamento pCL 1 que contém o fator de transcrição GALA4. Tal como se observa, a interação ocorre com os plasmídios que contêm a sequência : completa do gene para COMMD1 e a construção que contém os aminoáci- dos 110-190 da proteina COMMD1.

Figura 2. (A) llustra a validação da interação do peptídeo L2 com COMMDI pela técnica de imunoprecipitação (pulldown) em células SW948. No experimento são adicionados 100 ug de proteínas totais (PT) e a proteí- na COMMD1 recombinante obtida em Escherichia coli (COMMD1 rn), PM (pa- trão de peso molecular). (B) Ilustra a localização subcelular de COMMD1 em células SW948 tratadas com o peptídeo L2. Expressão de COMMD1 em nú- cleo (N), expressão de COMMD1 em citoplasma (C), células não tratadas (NT). Controle por Beta Actina da fração citoplasmática, controle por hnRPN da fração nuclear.

Figura 3. (A) Ilustra a maior acumulação nuclear de COMMD1 f pelo peptídeo otimizado L552. (B) É mostrada a interação entre L552 e a proteina COMMD1 em diferentes linhagens de tumores, em experimentos de ! imunoprecipitação (pulldown). Não é detectada nenhuma interação com a proteína cullina7 (CUL7). É mostrada a presença da Beta Actina no extrato de proteínas totais nas diferentes linhagens celulares.

Figura 4. Efeito antiproliferativo dos peptídeos em células tumo- rais de diferentes origens histológicas, Lá (linfócitos humanos isolados de sangue periférico).

Figura 5. Efeito antitumoral do peptídeo L552 no modelo de tu- mor TC-1. (A) São mostradas as curvas de inibição do crescimento da mas- sa tumoral. (B) É mostrada a porcentagem acumulativa de sobrevida dos diferentes grupos experimentais.

Figura 6. Ilustra que a expressão da proteina COMMD1 conten- do sequências de localização nuclear é suficiente para induzir a morte celu- lar. É mostrada a porcentagem de células não viáveis tingidas com brometo de etídio às 72 horas, como resultado da transfecção das construções que contêm a proteína verde fluorescente (do inglês Green Fluorescenf Profein, abreviado como GFP) como controle negativo, GFP-COMMD1 e a constru- ção de localização nuclear GFP-N-COMMD1.

Figura 7. (A) É mostrada a quimiossensibilidade a 5-FU em célu- : las de carcinoma do cólon HT-29 transfectadas com a construção GFP- NCOMMD1. São indicados os valores de Clso. (B) É ilustrado o efeito de um ambiente inflamatório por adição de LPS e TNF-a em relação a Clso.

Figura 8. Ilustra o efeito do peptídeo L552 sobre a proliferação da célula de câncer na presença de diferentes estímulos inflamatórios. De- terminação de Cls, em células de leucemia mielocítica humana (THP-1)(A) e carcinoma de cólon de murino (CT-26) (B), tratadas com LPS e TNF-a. Figura 9. Efeito antitumoral do peptídeo L552 em um modelo de câncer de cólon em ratos BALB/c submetidos a um estímulo inflamatório por i injeção de LPS. (A) É mostrada a porcentagem acumulativa de sobrevida dos diferentes grupos experimentais. (B) É mostrada a média do volume da massa tumoral para cada grupo experimental.

É Exposição detalhada de modos de realização / Exemplos de realização Exemplo 1. Interação física entre o peptídeo L2 e COMMD1.

õ Para identificar as interações peptídeo antitumoral L2-proteínas foi utilizado o sistema de dois híbridos de levedura. Para a clonagem das sequências correspondentes ao peptídeo foram projetados os seguintes oli- gonucleotídeos:

LF CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGG

GTAAGTTCTGGTAA L2R:

GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTT

GATTCTAGCGTG que correspondem à sequência peptídica L2: HARIKPTFRRLKWKYKGKFW Para a clonagem dessas sequências no vetor pPGBKT7 Ncol- BamHI, nos extremos dos oligonucleotídeos foram adicionadas sequências complementares a esses sítios. O plasmídio recombinante pPGBKL2-1, que contém a sequência do peptídeo L2 foi verificado por análise de restrição e sequência. O plasmídio foi transformado na cepa de levedura AH109, pelo método de acetato de lítio e semeado no meio SD-Trp. Foi verificado que não era capaz de se autoativar ao ser semeado em placas de SD-Trp-His. | Para a seleção das interações foi utilizada uma biblioteca proveniente de DNA complementar de fígado humano transformada na cepa Y187. Para a formação dos diploides e a seleção das interações, 5 x 10º células de AH109 que contêm o plasmídio pGBKL2-1 foram crescidas com 5 x 10º células de Y187 que contêm a biblioteca de DNA de fígado humano, durante 4 horas no meio sólido YPDA a 30ºC.

Às placas do meio YPDA foram adicionados 10 ml! de água estéril em sua superfície, e as células foram resuspensas cuida- dosamente com espátulas e transferidas a 15 placas do meio mínimo SD- Trp-Leu-His-Ade e desenvolvidas a 30ºC por 7 dias.

As 74 colônias resultan- À tes foram transferidas ao meio líquido SD-Trp-Leu em placas de 96 cavida- des profundas.

Depois de observar o crescimento no meio líquido, foi reali- zada a purificação do DNA de leveduras.

Cada um dos DNAs foi transforma- : do individualmente na cepa de E. coli DH1OB, e seus DNAs purificados e . 15 conservados a -20ºC.

Foi realizada a transformação de cada um dos clones individuais na cepa de levedura Y 187 e foi verificada a interação por meio de desemparelhamento com a cepa de AH109 transformada com os plasmídios PGBKT7 e pGBKL2-1. O DNA foi sequenciado dos clones positivos.

Uma análise das sequências pelo programa BLAST (Altschul et al., 1990. J Mol Biol, 215:403-410) revelou que um dos clones (L2-21) corresponde com a sequência do gene que codifica para os aminoácidos 6-190 da proteína COMMDA1, e que este clone é capaz de interagir com o plasmídio que con- tém a sequência do peptídeo L-2. Para identificar especificamente a região da proteina COMMD1 responsável pela interação foram feitas deleções à construção do plasmídio pPGBKL2-1, sendo gerados os clones pGBKL2 (6- 110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190). Tal como pode ser apreciado na Figura 1, a interação se mantém apenas no plasmídio PGBKL2 (110-190) que contém o domínio COMM responsável pelas intera- ções descritas para as proteínas da família COMMD.

Esse resultado ilustra queopeptídeoL2 é unido especificamente à região compreendida entre os aminoácidos 110-190. Exemplo 2. Experimentos de imunoprecipitação com o peptídeo L2 e acumu-

lação nuclear de COMMD1. Os experimentos foram divididos em dois blocos: (A) O peptídeo sintético L2 (SEQ ID No. 1), sintetizado ao usar um procedimento em fase sólida, foi biotinilado e utilizado como "ceva" unida a uma resina de estreptavidina sefarosa.

Como "presa" foi utilizado um ex- trato de proteínas da linhagem tumoral SW948 (carcinoma de cólon huma- no). Esses experimentos são conhecidos como "pulldown" (do inglês). O ex- trato de proteína foi obtido a partir de 2 x 10” células utilizando um tampão de extração (Tritón X-100 0,5%; 25 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM NacCI; 1 mMMEDTA; 10% glicerol; 1 mM Ditiotreitol (DTT), e um inibidor de proteases.

O peptídeo biotinilado (300 ug) foi incubado com 50 ul de resina estreptavi- í: dina sefarosa (G Healthcare), durante uma hora e foram realizadas lavagens com tampão de fosfato salino (PBS 1X) mais DTT 1 mM.

Em seguida, foram incubados 500 ug de proteínas totais com 50 ul de resina contendo o peptí- deo biotinilado, à temperatura ambiente durante 5 horas.

Em seguida, a re- Ô sina foi lavada extensivamente com PBS 1X e DTT 1 mM.

As proteínas que permanecem unidas à resina são aquelas que interagem com o peptídeo, e são resuspensas em 25 ul de tampão para eletroforese (Tris HCl 62,5 mM; pH 6,9; 0,1 M DTT, Dodecilosulfato de sódio (SDS) 20%, glicerol 10% e —bromofenol azul 0,01%). Para detectar a proteína de interesse foi realizada uma eletroforese em gel de acrilamida (7,5%), seguida pela imunodetecção por "Western blot". Para detectar a proteina COMMDA!, foi utilizado um anti- corpo monoclonal anti-COMMD1 (Sigma, clone 2A12). Foi utilizado um extrato de proteínas totais (100 ug) e a proteína recombinante COMMD1 obtida em E. coli.

Os resultados apresentados na Figura 2A demonstram que o peptídeo L2 concentra a proteina COMMD1 no experimento de "pulldown" quando comparado com o extrato de proteínas totais.

Isto é indicativo da interação entre L2 e COMMD1. (B) As células SWS948 (3 x 10º células) foram incubadas durante 5 horasa37ºCe5% de CO, com o peptídeo L2 (50 uM). Em seguida, foi realizado o fracionamento celular das proteínas citosólicas e nucleares, tal como relatado (Vancurova et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276:

19746-19752). A detecção de COMMDA1 foi feita por "Western blot", utilizan- : do um anticorpo anti-COMMD1. A Figura 2B demonstra a localização nucle- ar de COMMD1 em células SW948 tratadas com o peptídeo L2. Para contro- lar o fracionamento celular foi utilizada a Beta Actina como controle da fra- ção citoplasmática e a ribonucleoproteína humana (hnRNP) como controle da fração nuclear.

Exemplo 3. Otimização do peptídeo L552 para a acumulação nuclear de COMMD1. Tendo como premissa que o peptídeo L2 e a proteina COMMD1 interagem e isto se associa com a localização nuclear de COMMD1, foram projetados diferentes peptídeos a partir de L2 (SEQ ID No. 1), com o objetivo de potencializar a acumulação nuclear de COMMO1 nas variantes peptídi- cas. " Os peptídeos da invenção foram sintetizados ao usar um proce- dimento em fase sólida.

O peptídeo cru é extraído com uma solução de áci- do acético a 30%, liofilizado e em seguira é purificado por meio de cromato- grafia de fase reversa RP-HPLC.

A massa molecular dos peptídeos purifica- dos é verificada por meio de espectrometria de massa.

O preparado resul- tante é não antigênico, não pirogênico e farmaceuticamente aceitável para a sua administração em animais e humanos.

As substituições foram realizadas pontualmente, ao introduzir aminoácidos de configuração D em posições pontuais na sequência do peptídeo original L2, cuja sequência é HARIKPT- FRRLKWKYKGKFW (SEQ ID No. 1), tal como é mostrado na Tabela 1. Em um caso, também foi bloqueado o extremo N-terminal por meio de acetila- ção

Tabela 1. Sequência dos peptídeos utilizados na invenção : Peptí- Sequência de aminoácidos SEQ Características dio ID No. - L2 HARIKPTFRRLKWKYKGKFW 1 Peptídeo previamente descrito no pedido de patente WO 07/095867 L551 | HARIKDTFRRIKWKYKGKFW 2 Peptídeo com D- aminoácidos nas posi- ções P-6 e VL-11 L552 Ac- 3 Peptídeo com D- HARIKpTFRRIKWKYKGKFW aminoácidos nas posi- : ções P-6 e L-11, e aceti- lado L553 | HARIKPTFRRLKWKYKgKFW 4 Peptídeo com D- aminoácidos nas posi- : ções K-14 e V G-17 L554 | HArlKpTFRRLKWKYKGKFW Peptídeo com D- ? aminoácidos nas posi- ções R-3 e V P-6 Nota: os aminoácidos em negrito e letras minúsculas significam mudanças por D-aminoácidos.

Neste experimento o objetivo consistia em identificar um peptí- deo que deve produzir a maior acumulação nuclear de COMMO1. As células SW948 (3 x 10º células) foram incubadas durante 5 horas a 37ºC e 5% de CO, com os peptídeos L2, LS51, L552, L553 E L554 (50 uM). Em seguida, foi realizado o fracionamento celular das proteínas citosólicas e nucleares tal como relatado por Vancurova et al., tal como no Exemplo 2. A detecção de COMMO1 foi realizada por meio de "Western blot", ao utilizar um anticorpo anti-COMMO1. A Figura 3A demonstra a localização nuclear de COMMO1 em células SW948 tratadas com os peptídeos acima mencionados.

Os resul- tados indicam que o peptídeo L552 produziu a maior acumulação em núcleo de COMMD1. Além disso, é demonstrada a interação entre o peptídeo L552 eCOMMDI1 por meio de experimentos de imunodetecção (pulldown) em di- ferentes linhagens de tumor, Figura 3B.

Com esses experimentos é validada a interação entre o peptídeo L552 e a proteina COMMD1. : Do mesmo modo, a interação está relacionada com a facilitação da acumulação nuclear de COMMD1. Exemplo 4. Ilustra o incremento do efeito antiproliferativo do peptídeo L552 emlinhagens celulares de tumor.

Para este ensaio as células tumorais de origem humana H-82 (células pequenas de câncer de pulmão), H-125 (células não pequenas de câncer de pulmão), MCF-7 (adenocarcinoma da mama), MDA-MB231 (ade- nocarcinoma da mama positivo para o receptor do fator de crescimento epi- dérmico), LS174T (adenocarcinoma coloretal) e HT-29 (adenocarcinoma : coloretal resistente à quimioterapia), foram semeadas em placas de 96 cavi- . dades (Custar) a uma densidade de 1 x 10º células/m! no meio RPM! 1640 (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, À os peptídeos foram adicionados ao meio de cultura em um traço de dose entre9uMe 300 uM.

A incubação foi realizada em um intervalo de 48 horas na presença de CO, a 5% e ao término da mesma foi revelada com 3-(4,5- dimetiltiazol-2-i1)2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT) (Gray MJ et al., 2008, Natl Cancer Inst, 100: 109-20). Finalmente, foi feita a leitura da placa a uma absorbância de 492 NM.

Cada ponto foi realizado em duplicata, e os experi- mentos foram levados a cabo pelo menos duas vezes de maneira indepen- dente.

Os valores de Cl5o foram obtidos a partir das respectivas curvas de proliferação celular.

Os resultados são apresentados na Figura 4. Os resul- tados demonstram que a acetilação no extremo N-terminal e a substituição por D-aminoácidos, em posições específicas, garantem um incremento no efeito antiproliferativo do peptídeo L552. No entanto, nenhum efeito foi ob- servado em linfócitos humanos isolados de sangue periférico (Lô humanos). Esse resultado demonstra que o peptídeo L552, objeto da presente inven- ção, incrementa o seu efeito citotóxico seletivo sobre células tumorais sem provocar aumento da toxicidade em células sadias.

Os resultados apresen- tados demonstram que o peptídeo L552 foi otimizado para interagir com a proteina COMMD1, facilitar a sua maior acumulação em núcleo e aumentar o efeito antiproliferativo seletivo sobre as células de câncer.

Exemplo 5. Efeito antitumoral do peptídeo L552 em um modelo de murino de : tumor TC-1. Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BU6 fêmeas e com i- dades entre 8 e 10 semanas de vida (n = 10 animais por grupo experimen- tal. Para a implantação do tumor neste modelo, foram usadas as células TC-1 derivadas de células epiteliais do puimão de C57BU6 malignizadas, as quais foram resuspensas em solução salina (PBS). Uma quantidade de 5 x 10º células em um volume de 200 ul foi inoculada nos ratos por via subcutã- nea na pata posterior direita. Foram administradas 5 doses dos peptídeos (L2,L552 e L551) com intervalos de 2 dias, por via subcutânea no flanco À direito, uma vez que os tumores atingiram 100 mm? de volume. Nesse en- e saio foi avaliada uma dose de 0,2 mg de peptídeo por Kg de peso (4 : ugírato). Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral dos peptí- deos de interesse foi a sobrevida dos animais e a massa tumoral, tal como se pode observar na Figura 5A e na Figura 5B. O peptídeo L552 foi mais | eficaz quanto à capacidade de inibir a progressão do tumor e aumentar a sobrevida dos ratos com respeito ao peptídeo L2 e L551. Estes resultados evidenciam que as modificações introduzidas no peptídeo da presente in- venção (L552) aumentam a eficácia antitumoral em um modelo de tumor sólido. A análise estatística para determinar diferenças significativas entre os grupos foi feita pelo método de Lag Rank. Os resultados evidenciam que o peptídeo L552 aumenta significativamente (t < 0,05) a sobrevida dos animais em comparação aos outros peptídeos ensaiados. Esses resultados demons- tram que substituições por D-aminoácidos, em posições específicas, e blo- —queiodo extremo N-terminal por acetilação, incrementam significativamente a capacidade antitumoral do peptídeo.

Exemplo 6. Ilustra que a expressão da proteína COMMD1 contendo sequên- cias de localização nuclear é suficiente para induzir a morte da célula. Para confirmar o papel da localização nuclear de COMMO1 na i- nibição da proliferação celular, foram gerados os plasmídios recombinantes PGFP-COMMO1, que expressam COMMD1 fundida a GFP, e pGFP- NCOMMD1, que contém adicionalmente a sequência peptídica de localiza-

ção nuclear PKKKRKV.

Para a clonagem de pGFP-COMMD1 foi realizada a ' reação em cadeia de Polimerase ao usar os oligonucleotídeos: CF: TICTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA CR: CGCTOGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT Para a amplificação do gene que codifica para COMMD1 com a introdução do NLS foram utilizados os oligonucleotídeos: NF: TECAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC CR: CGCTCEGAGACATCTTCAGTT AGGCTGGCTGATCAGTGT.

Os clones recombinantes foram analisados por restrição e se- quênciade DNA.

Ambas as construções e o controle pEGFP foram transfec- Ú tados de forma independente nas linhagens celulares HT-29 E HEK293 de ' forma transiente utilizando Polietilenimina (Sigma, USA) (Boussif, O et al., : 1995, Proc Natl Acad Sci, 92: 7297-7301), em placas de 24 cavidades em : duplicata.

Às 72 horas uma das cavidades foi utilizada para avaliar a expres- —sãodas proteinas recombinantes ao utilizar um microscópio de fluorescência : Axiovert 40 (Zeiss, Alemanha) e uma objetiva APlan 10X.

À cavidade restan- te foi eliminado o meio de cultura e foi realizado um tingimento com uma mescla de Laranja de Acridina/Brometo de Etídio (AO/BE) a uma concentra- ção de 5 ug/ml em PBS, para a identificação da apoptose (Rible D, et al., 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15), e foram observadas no microscópio Axiovert 40 e na objetiva APIan 40X.

Com esse tipo de tingimento, AO atravessa a membrana das cé- lulas vivas e tinge de verde os núcleos e de laranja o citoplasma, enquanto que B só penetra as células com perda da integridade das membranas e tingeo DNA nuclear de vermelho.

A fluorescência de BE é dominante em relação à fluorescência de AO.

O tingimento de AO/EB mostra as células viáveis tingidas com AO com seus núcleos verdes e o citoplasma laranja nas transfecções com GFP e GFP-COMMD1. Somente no caso das células transfectadas com a construção GFP-NCOMMD1 foram observadas as célu- lascomo núcleo tingido por B, o que indica que se encontram em uma fase de apoptose tardia.

A Figura 6 mostra o gráfico da porcentagem de células com o núcleo tingido de vermelho de três campos independentes por condi-

ção experimental. São representados os valores e as separações padrão. : Esses resultados demonstram que a introdução de NLS na proteina COMMD1 é suficiente para a indução da apoptose nas linhagens celulares avaliadas. Do mesmo modo, esses resultados demonstram o uso de COMMDI1 como novo alvo terapêutico para fármacos antitumorais, através de compostos que facilitam a sua acumulação e localização nuclear. Desta maneira é demonstrado que a otimização do peptídeo L2, que dá lugar ao peptídeo L552, quanto à acumulação nuclear de COMMD1, está correlacio- nada com um aumento do efeito antitumoral.

Exemplo 7. llustra o efeito da localização nuclear da proteina COMMD1 na sensibilidade ao citostático 5-FU e a estímulos inflamatórios na célula HT-29. . (A) A linhagem celular HT-29 transfectada temporalmente com as construções acima descritas foram semeadas em placas de 96 cavidades . (Custar) a uma densidade de 1 x 10º células/ml no meio RPMI 1640 (Gibco) — suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, o citos- é tático 5-FU foi adicionado ao meio de cultura em um traço de dose entre 0,025 uM e 2.500 uM, em diluições seriais de 1:10. A incubação foi realizada por um intervalo de 48 horas na presença de CO, a 5% e ao término da mesma foi revelada com MTT. Finalmente, foi feita a leitura da placa a uma —absorbância de 492 NM. Cada ponto foi realizado em duplicata, e os experi- mentos foram levados a cabo pelo menos duas vezes de maneira indepen- dente. Os valores de Clso foram obtidos a partir das respectivas curvas de proliferação celular. Os resultados apresentados na Figura 7A demonstram que a expressão da proteina COMMD1 com NLS (GFP-NCOMMD1) provoca uma maior sensibilidade da célula de câncer à ação do citostático 5-FU. É demonstrado neste exemplo por uma redução em Cls9 com respeito às célu- las que expressam GFP ou GFP-COMMD1. Estes resultados também de- monstram o uso de COMMD1 como novo alvo terapêutico para fármacos antitumorais. Além disso, é demonstrado que a localização nuclear de —COMMDI induz quimiossensibilidade aos citostáticos convencionais.

(B) A linhagem celular HT-28 transfectada temporalmente com a construção GFP-NCOMMD1 foi submetida a diferentes estímulos inflamató-

rios tais como, por exemplo, LPS (40 u/mL) e TNF-a (20 ng/ml) durante 30 f minutos. Em seguida Cls, foi avaliado tal! como explicado no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Figura 78. Exemplo 8. llustra o efeito do peptídeo L552 sobre a proliferação celular da —célulade câncer submetida a um estimulo inflamatório.

Para este ensaio, células de leucemia mielocítica aguda de ori- gem humana (THP-1) e células de carcinoma de cólon de murino (CT-26) foram semeadas em placas de 96 cavidades (Custar) a uma densidade de 1 x 10º células/ml no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de So- ro Fetal Bovino (SFB). As células foram mantidas durante 24 horas a 37ºC e com 5% de CO. Passado esse tempo, foi adicionado LPS (40 ug/ml) ou TNF-a (20 ng/ml) durante 30 minutos. A Figura 8 apresenta o cálculo de Clso das linhagens celulares THP-1 e CT-26 na presença ou não dos estímulos DD. acima mencionados. Os resultados demonstram que o peptídeo L552 inibe a proliferação celular nas linhagens de câncer THP-1 e CT-26, na presença de É diversos estímulos inflamatórios. Esse resultado demonstra que o peptídeo L552 é eficaz no bloqueio da proliferação de células de câncer submetidas a diferentes agentes inflamatórios. Exemplo 9. Ilustra o efeito antitumoral do peptídeo L552 em um modelo de —câncerde cólon em ratos BALB/c submetidos a um estímulo inflamatório por injeção com LPS.

Nestes ensaios foram utilizados ratos BALB/c fêmeas com ida- des entre 8 e 10 semanas de vida (n = 10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, foram usadas as células CT-26 isoladas de um carcinoma de cólon em ratos BALB/c. Uma quantidade de 7 x 10º células, resuspensas em um volume de 200 ul de PBS 1 X, foram ino- culadas nos ratos por via subcutânea intra-axilar. Passados 11 dias, os ani- mais receberam uma injeção de 10 ul de LPS/rato (serotipo 055:B5, Sigma) em PBS 1X e administrada por via intraperitoneal. Uma vez que os tumores atingiram 100 mm? de volume, um grupo recebeu 5 doses de peptídeo L552 (0,2 mg/Kg do peso) em dias alternados, e outro grupo recebeu 5-FU em doses de 20 mg/Kg do peso. Os parâmetros de interesse avaliados neste experimento foram a sobrevida dos animais e o aumento do volume da mas- 1 sa tumoral. Os resultados apresentados na Figura 9 evidenciam a eficácia do peptídeo L552 em um modelo de carcinoma de cólon no qual foi adicio- nado um cenário inflamatório, por injeção de LPS. (A) Os resultados eviden- ciam que o peptídeo L552 foi mais eficaz no aumento da sobrevida (*p<0,05) dos animais em comparação com o grupo tratado com 5-FU, quando ao de- senvolvimento do tumor é adicionado um cenário inflamatório. A análise es- tatística para determinar diferenças significativas entre os grupos foi feita pelométodo de Log Rank. (B) O peptídeo L552 foi mais eficaz quanto à ca- pacidade de inibir a progressão do tumor. O resultado apresentado neste exemplo demonstra que o peptídeo L552 é eficaz no tratamento do câncer : associado à inflamação.

: Exemplo 10. Ilustra o efeito sinérgico da combinação do peptídeo L552 e da quimioterapia padrão.

: Para este ensaio as células tumorais HT-29 e H-125 foram se- meadas em placas de 96 cavidades (Custar) a uma densidade de 1 x 10º células/ml no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, o peptídeo foi adicionado ao meio de cultura emunm traço de dose entre 9 uM E 300 uM e os citostáticos em um traço de dose que abrangeu diluições seriais de 1:10 por cima e por baixo de seu Clso relatada para cada linhagem celular. A incubação foi realizada em um inter- valo de 48 horas na presença de CO, a 5% e ao término da mesma foi reve- lada com MTT. O efeito do tratamento concomitante peptídeo-citostático foi analisado de acordo com o programa computadorizado CalcuSyn para o es- tudo de combinações de fármacos (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacological Reviews, 58: 621-681). Os dados apresentados na Tabela 2 demonstram que a combinação peptídeo-citostático permite reduzir a quantidade destes últimos, dado pelos valores mostrados no Índice de Redução (IR) do fárma- co. Esses resultados indicam que o peptídeo pode ser administrado em as- sociação com a quimioterapia padrão para proporcionar um tratamento efi- caz (fração de células afetadas entre 89%-94%) com uma menor quantidade do fármaco convencional.

A combinação 5-FU + peptídeo L552 permite uma É redução (IR) do citostático de 20 vezes na linhagem celular HT-29. Para a combinação cisplatina + peptídeo L552 a redução do citostático é de 5 vezes em Hnea celular H-125. Esses resultados indicam que o peptídeo pode ser — administrado em combinação com o tratamento padrão para câncer do pul- mão e câncer do cólon, facilitando uma redução na dose do citostático.

Des- te modo podem ser diminuídos os efeitos adversos associados à quimiotera- pia.

Tabela 2. Sinergismo da terapia combinada entre o peptídeo L552 e os citos- táticos 5-FU e cisplatina, para duas linhagens celulares de tumor humano.

Linha- | Fa (fração | CI Fármaco Fármaco IR (5- IR UEETTEET: celular afetada) 5-FU (uM) | 5-FU (uM) | platina) | (L552) CI < 1 significa sinergismo; CI = 1 significa aditividade; CI >1 significa anta- gonismo.

Além disso, é mostrado o Índice de Redução (IR) do fármaco em combinação.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Agente que aumenta a localização nuclear da proteína COMMD1 em uma célula cancerosa, ou uma composição que compreende o agente que aumenta a localização nuclear da proteina COMMD1 em uma célula cancerosa, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

2. Agente para uso de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que o agente que aumenta a localização nuclear da prote- ína COMMD1 em células cancerosas compreende um peptídeo com a se- quênciade aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.

3. Agente para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que o câncer é um tumor associado a inflamação e me- tástase.

4. Agente para uso de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zado pelo fato de que o tumor associado com a inflamação e metástase está localizado no cólon, reto, esôfago, pulmão, próstata, mama, pâncreas ou fígado.

5. Agente para uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o agente compreende um vetor de expressão de célula de mamífero que contém uma sequência de DNA que codifica a proteina COMMD1 contendo sequências de localização nuclear (NLS).

6. Agente que aumenta a localização nuclear da proteína COMMDA1, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de cân- cer.

7. Agente para uso de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que o agente é uma proteína, um peptídeo sintético, um ácido nucleico ou um vetor para terapia de gene.

8. Agente para uso de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que o peptídeo sintético é um peptídeo com a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.

9. Agente para uso de acordo com a reivindicação 7, caracteri-

zado pelo fato de que o vetor de terapia de gene é um vetor de expressão de célula de mamífero compreendendo uma sequência de DNA que codifica a proteína COMMD1 tendo sequências de localização nuclear (NLS).

10. Composição farmacêutica para a terapia do câncer, caracte- rizada pelo fato de que compreende um ou vários agentes que aumentam a localização nuclear da proteína COMMD1 nas células cancerosas e excipi- entes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- da pelo fato de que o agente que aumenta a localização nuclear da proteína COMMD1 em células cancerosas é um peptídeo com a sequência de ami- noácidos identificada como SEQ ID No. 3.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- da pelo fato de que o agente que aumenta a localização nuclear da proteína COMMD1 na célula cancerosa é um vetor de expressão de célula de mamí- fero compreendendo uma sequência de DNA que codifica a proteína COMMD1 tendo sequências de localização nuclear (NLS).

13. Combinação farmacêutica para o tratamento do câncer, ca- racterizada pelo fato de que compreende um ou vários agentes que aumen- tam a localização nuclear da proteína COMMD1, e um ou vários fármacos específicos para a quimioterapia padrão de câncer.

14. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o agente que aumenta a localização nuclear da proteina COMMD1 compreende um peptídeo com a sequência de ami- noácidos identificada como SEQ ID No. 3 e o fármaco específico para a quimioterapia convencional é selecionado entre cisplatina e 5-FU.

15. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que os agentes e fármacos que fazem parte da combinação são administrados simultaneamente, separadamente ou se- quencialmente no decurso do mesmo tratamento.

16. Método para a determinação do prognóstico de um paciente com câncer, caracterizado pelo fato de que COMMD1 é usado como um marcador de prognóstico, compreendendo a determinação da presença ou ausência da localização nuclear de COMMD1 em uma amostra do referido paciente .

17. Peptídeo com a capacidade de ligação para o domínio COMM, caracterizado pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID No.3.

18. Peptídeo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de doenças onde um membro da família COMMD está envolvido na progressão da doença.