CN102917725A - 用于癌症治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于通过增加COMMD1蛋白的核定位来治疗癌症的方法，这与癌细胞增殖的降低或阻断相关。此外，本发明涉及增加COMMD1蛋白的核定位的试剂在制备用于癌症治疗的药物中的用途。除了其他化合物之外，所述试剂尤其可以为肽或蛋白质。本发明还涉及从序列HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW开始进行肽的优化，以增加COMMD1蛋白的核定位，并从而提高所述肽的抗肿瘤效应。

Description

用于癌症治疗的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及癌症治疗的生物医学领域，通过揭示出用于抗癌药物开发的新的治疗靶。所述药物由于其更大的选择性和效力而有助于改进癌症患者的目前治疗。描述了用于通过COMMD1蛋白的核表达和积累来治疗癌症的方法。在肽HARIKPTFRRLKWKYKGKFW的一级结构中所引入的化学修饰增加了COMMD1的核定位并提高了该肽的体外和体内抗肿瘤活性。
现有技术
尽管在癌症治疗方面有着巨大的进展，但是由于肿瘤细胞形成对于目前的抗癌药物的抗性，因而在开发具有新的作用方式的新的抗肿瘤试剂方面存在有大利益。由于其作为重要生物学功能的介体的作用以及其独特的固有特性（这使它们成为特别有吸引力的治疗试剂），因而肽作为新的治疗药物仍然具有大利益。肽显示出高的生物学活性，伴有低的毒性和高的特异性。由于这些特征而造成的益处包括增高的对于所希望的靶标的结合特异性，使药物-药物相互作用最小化，和表现出更小的在组织中的积累，从而降低了由于中间代谢物而引起的并发症的风险（Vlieghe等人,2010,Drug Discovery Today,15:40-56）。目前，存在有这样的抗癌治疗，其使用具有对于特定靶蛋白的结合选择性的肽和/或小分子，所述靶蛋白在癌症发展中具有重要的生物学功能。在第一种情形下，可以将这些治疗导向抑制蛋白质的特定功能，并且作为主要事件而引起癌细胞凋亡，例如：热休克蛋白（HSP）的抑制剂（Subbarao等人,2004,Pharmacology & Therapeutics,101:227-257）；酪氨酸激酶的抑制剂（Garrido等人,2007,Rev MedChil,10:1327-1332）。在大多数情况下，这些蛋白质在恶性过程中是异常的，如果与正常组织相比较。在第二种情形下，药物与靶蛋白相结合，所述靶蛋白在恶性过程中可以是或不是异常的（与正常组织相比较）；在这种情况下，在恶性过程中被激活的信号传导途径受到影响，例如：脱氧核糖核酸（DNA）复制的抑制剂、微管装配的抑制剂和转录因子NFkB的抑制剂。尽管第一种情形在特定的造血系统恶性肿瘤中是高度有效的，但是它们中的大多数在实体肿瘤的复杂性下具有有限的有效性。相反地，第二种情形包括一些在肿瘤学药典中最有效和甚至最具有毒性的药物。为此原因，需要在寻找新药物方面有所前进，所述新药物越来越是选择性的和有效的，从而使其毒性最小化。在这个意义上，鉴定新的治疗靶和了解其在癌症发展中的作用有助于鉴定出新的药物抗性机制，并促进设计出保留更大的活性并可以与现有的药物相组合的新药物，从而降低这些药物的毒性并提高癌症患者的生活质量。
COMMD1蛋白，以前称为MURR1（van de Sluis等人,2002,HumanMolecular Genetic,11:165-173），属于一个新的蛋白质家族，其首字母缩写为COMMD（铜代谢基因MURR1结构域，缩写为COMMD）。该家族的十个蛋白质成员在多细胞生物中是高度保守的并且遍在地表达，然而其大多数成员的生物学功能尚不知晓。该家族的主要特征是存在有保守且独特的COMM结构域（铜代谢Murr1结构域），其包含在C-末端的氨基酸残基110-190之间（Burstein等人,2005,TheJournal of Biological Chemistry,280:22222-22232）。COMMD1牵涉各种不同的生物学过程，例如：铜代谢的控制（Tao等人,2003,Journal of Biological Chemistry,278:41593-41596）；钠的细胞内运输的调节（Biasio等人,2004,Journal of Biological Chemistry,279:5429-5434）；转录因子NFkB的抑制（Maine等人,2007,The EMBOJournal,26:436-447）；由低氧诱导因子HIF-1α所调控的基因的表达的抑制（van de Sluis等人,2007,Molecular and Cellular Biology,27:4142-4156）。
COMMD1显现出与转录因子NFkB的RelA(p65)亚基、与因子HIF-1α的催化性亚基-α和与上皮钠通道中的Delta ENaC的物理相互作用。在所有情况下，该相互作用导致这些“客户”蛋白质的降解，其通过涉及遍在蛋白化和经由蛋白酶体的降解的机制。已证明，COMM结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用，不仅对于COMMD1的“客户”蛋白质，而且还对于该家族的成员之间的相互作用。存在有关于COMMD1的N-末端区域的三维结构的提议，但还不存在关于COMM结构域的三级结构（Sommerhalter等人,2007,Journal of Molecular Biology,365:715-721）。
借助于遍在蛋白化和蛋白酶体降解（通过位于COMM结构域中的一系列亮氨酸残基）的过程，在细胞中COMMD1的基础表达受到控制（Maine等人,2009,Biochemical Journal,417:601-609）。最近，描述了COMMD1具有这样的机制，该机制构成通过也位于其COMM结构域中的核输出信号（NES）的细胞质-细胞核转运。已报道，亮氨酸序列的破化和/或抑制蛋白酶体降解的试剂造成在细胞中COMMD1的表达的增加。此外，COMMD1中的NES序列的破坏增强因子NFkB和HIF-1α的转录活性的抑制（Muller等人,2009,Traffic,10:514-527）。
异常的赘生性细胞过表达不同的抗凋亡蛋白质，例如抑制凋亡的蛋白XIAP和簇集蛋白（CLU），其加速非雄激素依赖型前列腺癌的进展。这两种蛋白质都有利于COMMD1的遍在蛋白化和蛋白酶体降解，从而促进NFkB的激活和肿瘤细胞的存活。据报道，蛋白酶体的抑制剂，例如MG132（Shirley等人,2005,Neoplasia,7:1104-1111；Zhou等人,2009,Cancer Research,21:333-339）,具有通过抑制遍在蛋白化和蛋白酶体降解的机制的抗肿瘤效应。与XIAP结合的化合物通过阻断该蛋白质对于胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9激活的抑制效应来诱导凋亡（Vogler等人,Cancer Research,2009,69:2425-2434）。已提出，被设计用于抑制CLU的功能的干扰核糖核酸（iRNA）具有抗肿瘤效应，通过使因子NFkB的细胞质抑制剂（称为I-kB）稳定化（Zoubeidi等人,2010,Molecular Cancer Research,8:19-30）。
在国际专利申请WO 07/095867中，发明的实质涉及源自LALF（鲎抗脂多糖因子）蛋白的32-51区域的肽，其中进行了确保瓦解与细菌脂多糖（LPS）结合的能力的氨基酸置换，并且其具有抗肿瘤和免疫调节效应。这些肽之一为称为肽L2的肽。此外，在另一个发明（国际申请PCT/CU2008/000006）中，揭示了上面所提及的肽穿透入细胞中的能力。然而，在所述发明中，既没有公开也没有暗示这些肽的作用机制。
目前，存在有众多旨在治疗癌症的疗法（化学疗法、放射疗法、免疫疗法等），它们中的许多还处于临床试验阶段中。但是，仍然有着与这些疗法相关的缺点，例如：低选择性、毒性和形成药物抗性。在该领域中要考虑的另一个重要方面是选择可用作药物效力的诊断物和/或预测物的生物标志物。因此，仍存在有研究和发现新分子的需要，所述新分子在癌症的治疗和/或诊断中，以及在具有更低毒性的、越来越选择性和有效的药物的设计中是有用的。
发明描述
本发明通过描述用于通过增加COMMD1蛋白的核定位来治疗癌症的方法而解决了上面提及的问题。所述增加引起癌细胞的增殖的降低或阻断。
在本发明中，首次揭示了，在癌细胞中肽L2（其序列为HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW，SEQ ID No.1）与COMMD1相互作用，并且COMMD1的核定位与癌细胞的的死亡相关。由此，本发明提供了COMMD1蛋白在鉴定具有抗肿瘤活性的化合物中的用途，所述化合物促进COMMD1的核积累和定位。
在本发明中所提供的数据证明，抗肿瘤肽L2与COMMD1相互作用，特别是在包含于COMMD1的氨基酸110-190之间的区域中。此外，肽L2引起COMMD1的核积累。此外，在本发明中首次报道了，携带核定位序列（NLS）的COMMD1蛋白的表达足以诱导癌细胞的死亡。因此，本发明首次证明了COMMD1在癌症的治疗中作为治疗靶的用途。
此外，从肽L2的序列（SEQ ID No.1）开始，优化了肽L552（SEQID No.3），以引起COMMD1在核中的积累并提高所述肽的体外和体内抗肿瘤效应。经优化以促进COMMD1的核定位的在本发明中所描述的肽L552（SEQ ID No.3）具有下述序列：
Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW    SEQ ID No.3。
所述优化基于进行化学修饰，通过在特定位置（其在上面所包括的序列中以小写和粗体来表示）处用非天然氨基酸（D-氨基酸）置换天然氨基酸和借助于乙酰化（在上面所包括的序列中标明为Ac-）的对于N-末端的保护。这些对于肽L2的序列（SEQ ID No.1）所进行的并且导致产生肽L552（SEQ ID No.3）的修饰，确保了COMMD1在核中的更大的积累以及肽L552相对于原始肽L2而言的抗肿瘤活性的提高。因此，肽L552是新的一个类别的分子，其与COMMD1相互作用，从而促进COMMD1的核定位并引起癌细胞增殖的抑制。
增加COMMD1蛋白的核定位的试剂在制备用于癌症治疗的药物中的用途也是本发明的目标。在促进COMMD1的核积累的试剂或化合物之中，可以包括例如：蛋白质（包括抗体）、突变蛋白、肽、多核苷酸、适体、核酸和有机小分子。这些化合物可以从天然来源分离，以合成或重组方式进行制备，或者它们的任何组合。在一个特别的实施方案中，增加COMMD1蛋白的核定位的试剂为肽L552（SEQ ID No.3）。在本发明的背景下，提高或增加COMMD1的核定位与使COMMD1蛋白在细胞核中积累具有相同的含义。在另一个特别的实施方案中，增加COMMD1蛋白的核定位的试剂可以是核酸类型的，例如哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMD1蛋白的DNA序列。该类型的载体可以用作基因疗法。
此外，用于治疗癌症的药物组合物也是本发明的一部分，所述药物组合物包含增加COMMD1蛋白的核定位的试剂。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的增加COMMD1蛋白的核定位的试剂（通过其半数抑制浓度（IC50）而测定的）以及药学上可接受的赋形剂或载体。该组合物可以通过肠胃外途径或通过局部途径进行施用。
包含增加COMMD1蛋白的核定位的试剂的药物组合物的施用构成了用于治疗或预防受试者中的实体肿瘤的方法，其中该方法包括以有效量施用促进COMMD1的核定位的试剂，以降低或阻断肿瘤细胞的生长。
在本发明的一个实施方案中，可以向白血病（特别是髓细胞白血病）患者施用增加COMMD1蛋白的核定位的试剂，从而阻断癌细胞的增殖，甚至在炎症刺激存在下。
在本发明中证明，可以将肽L552与标准化学疗法相联合地进行使用，以产生协同效应和减少细胞抑制剂（例如，顺铂和5-氟尿嘧啶（5-FU））的剂量。
因此，用于治疗癌症的药物组合也是本发明的目标，所述药物组合包含一种或多种增加COMMD1蛋白的核定位的试剂，以及一种或多种对于癌症的标准化学疗法特异的药物。在本发明的一个实施方案中，所述试剂为肽L552，并且所述对于标准化学疗法特异的药物选自顺铂和5-FU。在所述药物组合中，构成所述药物组合的一部分的所述试剂和所述药物可以在同一治疗过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。
另一方面，炎症与癌症之间的关系是现今已接受的事实。目前，炎症微环境被列为肿瘤的特点，其归类在由Hanahan和Weinbergs（Perwez等人,2007,Int J Cancer,121:2373-2380）所描述的癌症的六个最重要的特征之中。
本发明中所提供的数据表明，在炎症刺激存在下，肽L552在阻断癌细胞生长方面是有效的。同样地，携带NLS的GFP-NCOMMD1蛋白的表达在癌细胞中促进相同的效应。更特别地，结果显示，肽L552在炎症刺激例如LPS和肿瘤坏死因子（TNF-α）存在下促进癌细胞的死亡。同样地，体内实验数据证明了该肽在结肠肿瘤的鼠类模型中的有效性，其中用通过注射LPS而造成的炎症刺激来攻击小鼠。
为此，本发明还提供了用于抑制与炎症相关的肿瘤的发展以及其转移的方法，其包括向有此需要的受试者施用肽L552。在与炎症相关的肿瘤以及其转移中存在有例如下述类型的癌症：结肠直肠癌、食道癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌。
此外，还可以以预防的方式进行肽L552的施用，以预防与慢性炎症（例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、肝硬化等）相关的癌症的发展。因此，用于预防与慢性炎症相关的癌症的方法也是本发明的目标，所述方法的特征在于，向有此需要的个体施用肽L552或包含所述肽的组合物。
关于用包含肽L552（作为增加COMMD1的核定位的试剂）的组合物要遵从的治疗剂量和方案，技术人员可以容易地确定（预防性或治疗性）治疗的剂量和方案。有效量可以依据各个组合物的相对功效而变化，并且可以基于该肽的分子量和在体外或在动物研究中的IC50来进行计算。例如，在知晓所述化合物（化学结构）的分子量和有效实验剂量（IC50）的情况下，可以常规地计算出以mg/Kg体重表示的剂量。通常，所述剂量为0.2-4mg/Kg体重。该肽或包含其的组合物可以每周地或甚至每几个月地施用一次或多次。
本发明还涉及COMMD1作为新的用于癌症患者的预后标记物的用途，通过测定在样品中COMMD1的核定位的存在或不存在。
同样地，肽L552提供了用于治疗疾病的活性试剂，在所述疾病中COMMD蛋白起作用或者牵涉该疾病的进展。这是可能的，例如在那些这样的疾病中，在所述疾病中COMMD家族的一些成员的量增加或减少和/或其活性提高或降低，并且这造成该疾病。肽L552与包含在COMMD蛋白的C-末端的氨基酸残基110-190之间的COMM结构域相结合的能力支持了该肽的治疗活性。
附图简述
图1.图解说明了肽L2与COMMD1蛋白之间的物理相互作用，其中使用酵母双杂交技术。作为阴性对照，采用用空载体pGBKT7转化的酵母菌株AH109与转化到菌株Y187中的COMMD1片段的每种构建物的交配。为了鉴定相互作用，进行用携带L2序列的载体转化的菌株AH109与转化到菌株Y187中的COMMD1片段的每种构建物的交配。作为阳性对照，采用携带转录因子GAL4的pCL1的交配。如所观察到的，用携带COMMD1基因的完整序列的质粒和包含COMMD1蛋白的氨基酸110-190的构建物，出现相互作用。
图2.（A）图解说明了肽L2与COMMD1的相互作用的验证，通过在SW948细胞中的免疫沉淀技术（pulldown）。在该实验中，添加100μg的总蛋白质（TP）和在大肠杆菌（Escherichia coli）中获得的重组COMMD1蛋白（COMMD1r），MW（分子量标准）。（B）图解说明了在用肽L2处理的SW948细胞中COMMD1的亚细胞定位。在核中COMMD1的表达（N），在细胞质中COMMD1的表达（C），未处理的细胞（NT）。β-肌动蛋白为细胞质级分的对照，hnRNP为核级分的对照。
图3.（A）图解说明了通过经优化的肽L552而引起的更大的COMMD1的核积累。（B）显示了在免疫沉淀（pulldown）实验中，在不同的肿瘤细胞系中L552与COMMD1蛋白之间的相互作用。用滞蛋白7（CUL7）未检测到相互作用。在所述不同的细胞系中，显示了在总蛋白质提取物中β-肌动蛋白的存在。
图4.在不同组织学来源的肿瘤细胞中所述肽的抗增殖效应，
Figure BDA00002497418600081
（从外周血分离的人淋巴细胞）。
图5.在TC-1肿瘤模型中肽L552的抗肿瘤效应。（A）显示了肿瘤块的生长抑制曲线。（B）显示了不同实验组的累积存活百分比。
图6.图解说明了含有核定位序列的COMMD1蛋白的表达足以诱导细胞死亡。显示了在72小时时用溴化乙锭染色的非活细胞的百分比，作为用携带作为阴性对照的绿色荧光蛋白（GFP）的构建物、构建物GFP-COMMD1和核定位构建物GFP-N-COMMD1进行的转染的结果。
图7.（A）显示了在用构建物GFP-NCOMMD1转染的结肠癌细胞HT-29中对于5-FU的化学敏感性。指明了IC50值。（B）图解说明了通过添加LPS和TNF-α而引起的炎症环境对于IC50的影响。
图8.图解说明了在不同的炎症刺激存在下，肽L552对于癌细胞增殖的效应。在用LPS和TNF-α处理的人髓细胞白血病细胞（THP-1）（A）和鼠类结肠癌细胞（CT-26）（B）中测定IC50。
图9.在经历了通过注射LPS而引起的炎症刺激的BALB/c小鼠中，在结肠癌模型中肽L552的抗肿瘤效应。（A）显示了不同实验组的累积存活百分比。（B）显示了关于每个实验组的肿瘤块的体积的平均值。
实施例
实施例1.肽L2与COMMD1之间的物理相互作用。
为了鉴定抗肿瘤肽L2-蛋白质相互作用，使用酵母双杂交系统。为了克隆相应于该肽的序列，设计了下列寡核苷酸：
L2F：
CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGG
GTAAGTTCTGGTAA
L2R：
GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTT
GATTCTAGCGTG
其相应于肽序列L2：HARIKPTFRRLKWKYKGKFW。
为了将这些序列克隆在载体pGBKT7 NcoI-BamHI中，在这些寡核苷酸的末端添加与这些位点互补的序列。通过限制酶切分析和测序来验证携带肽序列L2的重组质粒pGBKL2-1。通过乙酸锂方法来将该质粒转化到酵母菌株AH109中，并接种在SD-Trp培养基中。验证了，当接种在SD-Trp-His平板中时，不能自我激活。为了筛选相互作用，使用转化到菌株Y187中的源自人肝脏cDNA的文库。为了形成二倍体和选择相互作用，使5×108个包含质粒pGBKL2-1的AH109细胞与5×108个包含人肝脏DNA文库的Y187细胞一起在30℃下在YPDA固体培养基中生长4小时。在YPDA培养基平板上，在其表面上添加10ml无菌水，并且用刮刀小心地使细胞重悬浮，并转移至15个SD-Trp-Leu-His-Ade基本培养基平板，并在30℃下生长7天。将所得的74个菌落转移到在96-深孔平板中的SD-Trp-Leu液体培养基中。在观察到在液体培养基中的生长后，进行酵母DNA的纯化。将每一个这些DNA独个地转化到大肠杆菌菌株DH10B中，纯化其DNA并保存于-20℃。将这些独个克隆中的每一个转化到酵母菌株Y187中，并通过与用质粒pGBKT7和pGBKL2-1转化的菌株AH109进行交配来验证相互作用。对阳性克隆的DNA进行测序。通过BLAST程序（Altschul等人,1990.J Mol Biol,215:403-410）的序列分析揭示出，这些克隆之一（L2-21）相应于编码COMMD1蛋白的氨基酸6-190的基因的序列，并且该克隆能够与包含肽序列L-2的质粒相互作用。为了明确地鉴定出负责所述相互作用的COMMD1蛋白的区域，对于质粒pGBKL2-1构建物进行缺失，从而产生克隆pGBKL2(6-110)、pGBKL2(6-70)、pGBKL2(71-190)、pGBKL2(110-190)。如在图1中所看到的，仅在质粒pGBKL2(110-190)中保留了相互作用，该质粒包含负责对于COMMD家族的蛋白质所描述的相互作用的COMM结构域。该结果说明，肽L2与包含在氨基酸110-190之间的区域特异性地结合。
实施例2.使用肽L2的免疫沉淀以及COMMD1的核积累的实验。
所述实验分为两块：
（A）使通过使用固相方法合成的合成肽L2（SEQ ID No.1）生物素化，并用作结合至链霉抗生物素蛋白琼脂糖树脂的“诱饵”。作为“捕获物”，使用肿瘤细胞系SW948（人结肠癌）的蛋白质提取物。这些实验被称为“pulldown”。使用提取缓冲液（Triton X-1000.5%;25mM HEPES,pH 7.5;100mM NaCl;1mM EDTA;10%甘油;1mM二硫苏糖醇（DTT），和蛋白酶抑制剂），从2×107个细胞获得蛋白质提取物。将所述生物素化的肽（300μg）与50μL链霉抗生物素蛋白琼脂糖树脂（GE Healthcare）一起温育一小时，并用磷酸缓冲盐水（1XPBS）+1mM DTT进行洗涤。然后，将500μg总蛋白质与50μL含有所述生物素化的肽的树脂一起在环境温度下温育5小时。然后，用1XPBS和1mM DTT充分地洗涤所述树脂。保持与树脂相结合的蛋白质是与所述肽相互作用的那些，并且将其悬浮在25μL电泳缓冲液（62.5mM Tris HCl;pH 6.9;0.1M DTT,20%十二烷基硫酸钠（SDS）,10%甘油和0.01%溴酚蓝）中。为了检测目的蛋白质，进行在聚丙烯酰胺凝胶（7.5%）中的电泳，随后通过“Western印迹”进行免疫检测。为了检测COMMD1蛋白，使用抗-COMMD1单克隆抗体（Sigma,clon2A12）。使用总蛋白质提取物（100μg）和在大肠杆菌中获得的重组蛋白COMMD1。在图2A中呈现的结果显示，当与总蛋白质提取物进行比较时，在该“pulldown”实验中肽L2浓缩了COMMD1蛋白。这是L2与COMMD1之间的相互作用的指示。
（B）将SW948细胞（3×106个细胞）与肽L2（50μM）一起在37℃和5%CO2下温育5小时。然后，按照所报道的（Vancurova等人,2001,Journal of Biological Chemistry,276:19746-19752），进行胞质蛋白质和核蛋白质的细胞分级分离。使用抗-COMMD1抗体，通过“Western印迹”来进行COMMD1的检测。图2B显示了在用肽L2处理的SW948细胞中COMMD1的核定位。为了检验所述细胞分级分离，使用β-肌动蛋白作为细胞质级分的对照，和使用人核糖核蛋白（hnRNP）作为核级分的对照。
实施例3.肽L552的优化以用于COMMD1的核积累。
假定肽L2与COMMD1蛋白相互作用并且这与COMMD1的核定位相关，那么从L2（SEQ ID No.1）开始设计不同的肽，其目的是以所述肽变体加强COMMD1的核积累。
使用固相方法来合成本发明的肽。将粗制的肽用30%乙酸溶液进行提取，冻干，然后通过反向色谱法RP-HPLC进行纯化。借助于质谱法来验证经纯化的肽的分子量。所得的制备物对于其在动物和人中的施用来说是非抗原性的、非致热性的和药学上可接受的。如在表1中所显示的，通过在原始肽序列L2（其序列为HARIKPTFRRLKWKYKGKFW（SEQ ID No.1））中在特定位置处引入D-构型的氨基酸，在特定位点处进行置换。在一种情况下，还通过乙酰化封闭了N-末端。
表1.在本发明中所使用的肽的序列
Figure BDA00002497418600121
注：粗体且小写的氨基酸表示改变为D-氨基酸
在该实验中，目的是鉴定产生COMMD1的最大核积累的肽。将SW948细胞（3×106个细胞)）与肽L2、L551、L552、L553和L554（50μM）一起在37℃和5%CO2下温育5小时。然后，如在实施例2中那样，按照Vancurova等人所报道的进行胞质蛋白质和核蛋白质的细胞分级分离。使用抗-COMMD1抗体，通过“Western印迹”来进行COMMD1的检测。图3A显示了在用上面提及的肽进行处理的SW948细胞中COMMD1的核定位。结果表明，肽L552产生了COMMD1在核中的最大积累。此外，在不同的肿瘤细胞系中，借助于免疫检测实验（pulldown）而证明了肽L552与COMMD1之间的相互作用（图3B）。用这些实验，确认了肽L552与COMMD1蛋白之间的相互作用。此外，该相互作用与COMMD1的核积累的促进有关。
实施例4.举例说明在肿瘤细胞系中肽L552的抗增殖效应的增强。
对于该测试，在96-孔平板（Costar）中，将下列人来源的肿瘤细胞以1×104个细胞/mL的密度接种在补充有胎牛血清（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中：H-82（小细胞肺癌）、H-125（非小细胞肺癌）、MCF-7（乳房腺癌）、MDA-MB231（对于表皮生长因子受体来说阳性的乳房腺癌）、LS174T（结肠直肠腺癌）和HT-29（对于化学疗法具有抗性的结肠直肠腺癌）。在24小时之后，将所述肽以9μM至300μM的剂量范围添加到所述培养基中。在5%CO2存在下温育48小时，并且在温育结束时用溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑（MTT）进行揭示（Gray MJ等人,2008,Natl Cancer Inst,100:109-20）。最后，就492nm的吸光度来对平板进行读取。每个点以两次重复来进行，并且所述实验独立地施行至少两次。从各自的细胞增殖曲线获得IC50值。结果呈现在图4中。这些结果证明，在N-末端处的乙酰化和在特定位置处用D-氨基酸进行置换保证了肽L552的抗增殖效应的增强。但是，在分离自外周血的人淋巴细胞（人
Figure BDA00002497418600132
）中，未观察到任何效应。该结果证明，作为本发明的目标的肽L552增强了其对于肿瘤细胞的选择性细胞毒效应，而不引起在健康细胞中的毒性增加。所提供的结果证明，肽L552已被优化以便与COMMD1蛋白相互作用，促进其在核中的更多积累，和提高对于癌细胞的选择性抗增殖效应。
实施例5.在TC-1肿瘤鼠类模型中肽L552的抗肿瘤效应。
在这些测试中，使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠（n=10只动物/实验组）。为了在该模型中植入肿瘤，使用源自恶性C57BL/6肺上皮细胞的TC-1细胞，其重悬浮在盐水溶液（PBS）中。在右后腿中通过皮下途径向这些小鼠接种处于200μL体积中的5×104个细胞的量。一旦肿瘤达到100mm3的体积，就在右胁中通过皮下途径以2天的间隔施用5个剂量的肽（L2、L552和L551）。在该测试中，评价0.2mg肽/Kg体重（4μg/小鼠）的剂量。为了测量目的肽的抗肿瘤效应而评价的参数为动物存活和肿瘤块，如在图5A和图5B中可以观察到的。相对于肽L2和L551而言，肽L552在抑制肿瘤进展和提高小鼠存活的能力方面更为有效。这些结果证明，向本发明的肽（L552）中所引入的修饰提高了在实体肿瘤模型中的抗肿瘤效力。为了确定组之间的显著性差异，通过时序（Log Rank）法来进行统计学分析。结果证明，相比于其他所测试的肽而言，肽L552显著地（*p<0.05）提高动物的存活。这些结果证明，在特定位置处用D-氨基酸进行置换和通过乙酰化来封闭N-末端显著地增强所述肽的抗肿瘤能力。
实施例6.举例说明携带核定位序列的COMMD1蛋白的表达足以诱导细胞死亡。
为了确证COMMD1的核定位在抑制细胞增殖中的作用，产生了重组质粒pGFP-COMMD1，其表达与GFP相融合的COMMD1，和重组质粒pGFP-NCOMMD1，其还包含核定位肽序列PKKKRKV。对于pGFP-COMMD1的克隆，使用下列寡核苷酸来进行聚合酶链式反应：
CF：TTCTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA
CR：CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT。
为了扩增编码引入了NLS的COMMD1的基因，使用下列寡核苷酸：
NF：TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC
CR：CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT。
通过限制酶切和DNA测序来分析重组克隆。在24-孔平板中，以两次重复地，通过使用聚乙烯亚胺（Sigma,USA）（Boussif,O等人,1995,Proc Natl Acad Sci,92:7297-7301），独立地将这两种构建物和对照pEGFP瞬时地转染到HT-29和HEK293细胞系中。在72小时之时，将这些孔之一用于评价重组蛋白质的表达，其中使用Axiovert 40荧光显微镜（Zeiss,Germany）和APlan 10X物镜。从其余的孔中去除培养基并用在PBS中的浓度为5μg/mL的吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合物进行染色以鉴定凋亡（Rible D等人,2005,BMC Biotechnology,5:12-15），并且在Axiovert 40显微镜和APlan 10X物镜下进行观察。
用该类型的染色，AO穿过活细胞的膜并且将核染成绿色和将细胞质染成橙色，而EB仅穿透入丧失了膜完整性的细胞中并且将核DNA染成红色。EB的荧光比AO的荧光占优势。在用GFP和GFP-COMMD1进行的转染中，AO/EB染色显示了具有其绿色核和橙色细胞质的用AO染色的活细胞。只有在用构建物GFP-NCOMMD1转染的细胞的情况下观察到具有被EB染色的核的细胞，这表明它们处于凋亡的晚期阶段。图6所显示的图涉及三个独立视野/实验条件的具有被染成红色的核的细胞的百分比。给出了值和标准偏差。这些结果证明，在COMMD1蛋白中引入NLS足以在所评价的细胞系中诱导凋亡。此外，这些结果还证明了COMMD1作为用于抗肿瘤药物的新的治疗靶的用途，通过促进其核积累和定位的化合物。以这样的方式证明了，在COMMD1的核积累方面，肽L2的优化（其产生肽L552）与抗肿瘤效应的提高相关。
实施例7.举例说明在HT-29细胞中，COMMD1蛋白的核定位在对于细胞抑制剂5-FU和对于炎症刺激的敏感性中的效应。
（A）在96-孔平板（Costar）中，将用前面所描述的构建物短暂转染的HT-29细胞系以1×104个细胞/mL的密度接种在补充有胎牛血清（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中。在24小时之后，以1:10系列稀释的0.025μM至2500μM的剂量范围向所述培养基添加细胞抑制剂5-FU。在5%CO2存在下温育48小时，并且在温育结束时用MTT进行揭示。最后，就492nm的吸光度来对平板进行读取。每个点以两次重复来进行，并且所述实验独立地施行至少两次。从各自的细胞增殖曲线获得IC50值。呈现在图7A中的结果证明，具有NLS的COMMD1蛋白（GFP-NCOMMD1）的表达引起癌细胞对于细胞抑制剂5-FU的作用的更大的敏感性。在该实施例中显示了相对于表达GFP或GFP-COMMD1的细胞而言的IC50的降低。这些结果还证明了COMMD1作为用于抗肿瘤药物的新的治疗靶的用途。此外还证明，COMMD1的核定位诱导对于常规的细胞抑制剂的化学敏感性。
（B）使采用构建物GFP-NCOMMD1短暂转染的HT-29细胞系经历不同的炎症刺激（例如，LPS（40μg/mL）和TNF-（20ng/mL））30分钟。然后，如在实施例6中所说明的那样来评价IC50。结果显示在图7B中。
实施例8.举例说明肽L552对于经历了炎症刺激的癌细胞的细胞增殖的效应。
对于该测试，在96-孔平板（Costar）中，将人来源的急性髓细胞白血病细胞（THP-1）和鼠类结肠癌细胞（CT-26）以1×104个细胞/mL的密度接种在补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基（Gibco）中。将细胞在37℃和5%CO2下维持24小时。这段时间过后，添加LPS（40μg/mL）或TNF-α（20ng/mL）并保持30分钟。图8呈现了在前面提及的刺激存在或不存在下细胞系THP-1和CT-26的IC50的计算。结果证明，在各种不同的炎症刺激存在下，肽L552在癌细胞系THP-1和CT-26中抑制细胞增殖。该结果证明，肽L552在阻断经历了不同炎性试剂的癌细胞的增殖方面是有效的。
实施例9.举例说明在经历了通过注射LPS而引起的炎症刺激的BALB/c小鼠中，在结肠癌模型中肽L552的抗肿瘤效应。
在这些测试中，使用8至10周龄的雌性BALB/c小鼠（n=10只动物/实验组）。为了在该模型中植入肿瘤，使用分离自在BALB/c小鼠中的结肠癌的CT-26细胞。通过腋内皮下途径向这些小鼠接种重悬浮在200μL体积的1X PBS中的7×104个细胞的量。在11天过后，使所述动物接受通过腹膜内途径施用的在1X PBS中的10μg LPS/小鼠（血清型055:B5,Sigma）的注射。一旦肿瘤达到100mm3的体积，就让一个组每隔一天地接受5个剂量的肽L552（0.2mg/Kg体重），另一个组接受以20mg/Kg体重的剂量的5-FU。该实验中所评价的目的参数为动物存活和肿瘤块体积的增加。
图9中所呈现的结果证明了肽L552在其中已加上了通过注射LPS而引起的炎症阶段的结肠癌模型中的效力。（A）这些结果证明，当给肿瘤的发展加上炎症阶段时，相比于用5-FU进行处理的组而言，肽L552在提高动物存活方面更为有效（*p<0.05）。为了确定组之间的显著性差异，通过时序法来进行统计学分析。（B）肽L552在抑制肿瘤进展的能力方面更为有效。在本实施例中所呈现的结果证明，肽L552在治疗与炎症相关的癌症中是有效的。
实施例10.举例说明肽L552与标准化学疗法的组合的协同效应。
对于该测试，在96-孔平板（Costar）中，将肿瘤细胞HT-29和H-125以1×104个细胞/mL的密度接种在补充有胎牛血清（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中。在24小时之后，将所述肽以9μM至300μM的剂量范围添加到所述培养基中，和将细胞抑制剂以下述剂量范围添加到所述培养基中，该剂量范围包括高于和低于对于每个细胞系所报道的其IC50的1:10系列稀释。在5%CO2存在下温育48小时，并且在温育结束时用MTT进行揭示。根据用于药物组合的研究的CalcuSyn计算机程序（Ting-Chao Chou,2006,PharmacologicalReviews,58:621-681）来分析肽-细胞抑制剂相伴治疗的效应。表2中所呈现的数据证明，肽-细胞抑制剂组合使得能够减少细胞抑制剂的量，这通过显示为药物的减少指数（RI）的值而给出。这些结果表明，可以以更少量的常规药物，将所述肽与标准化学疗法相联合地进行施用以提供有效的治疗（受影响的细胞的比例为89%-94%）。在HT-29细胞系中，5-FU+肽L552组合允许20倍的细胞抑制剂的减少（RI）。对于顺铂+肽L552组合，在H-125细胞系中细胞抑制剂的减少为5倍。这些结果表明，可以将所述肽与用于肺癌和结肠癌的标准治疗相组合地进行施用，从而促进细胞抑制剂的剂量的减少。以这样的方式，可以降低与化学疗法相关的副作用。
表2.对于两种人肿瘤细胞系，
肽L552与细胞抑制剂5-FU和顺铂之间的联合疗法的协同作用
Figure BDA00002497418600181
CI<1表示协同作用；CI=1表示加和性；CI>1表示拮抗作用。此外，还显示了以组合形式的药物的减少指数（RI）。
Figure IDA00002497419300011
Figure IDA00002497419300031

Claims (21)

1.用于癌症治疗的方法，其特征在于，增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位，这引起所述细胞的增殖的降低或阻断。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，使癌细胞与增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂相接触，或者向受试者施用包含增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂的组合物。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂包括具有标识为SEQ ID No.3的氨基酸序列的肽。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，抑制与炎症相关的肿瘤的发展以及其转移。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述与炎症相关的肿瘤以及其转移位于结肠、直肠、食道、肺、前列腺、乳腺、胰腺或肝脏中。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂包括哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有核定位序列（NLS）的COMMD1蛋白的DNA序列。
7.增加COMMD1蛋白的核定位的试剂在制备用于癌症治疗的药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中所述增加COMMD1蛋白的核定位的试剂为蛋白质、合成肽、核酸或用于基因疗法的载体。
9.根据权利要求8的用途，其中所述合成肽为具有标识为SEQ IDNo.3的氨基酸序列的肽。
10.根据权利要求8的用途，其中所述用于基因疗法的载体为哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMD1蛋白的DNA序列。
11.用于癌症治疗的药物组合物，其包含一种或多种增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
12.权利要求11的组合物，其中所述增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂为具有标识为SEQ ID No.3的氨基酸序列的肽。
13.权利要求11的组合物，其中所述增加在癌细胞中COMMD1蛋白的核定位的试剂为哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMD1蛋白的DNA序列。
14.用于治疗癌症的药物组合，其包含一种或多种增加COMMD1蛋白的核定位的试剂，以及一种或多种对于癌症的标准化学疗法特异的药物。
15.权利要求14的药物组合，其中所述增加COMMD1蛋白的核定位的试剂包括具有标识为SEQ ID No.3的氨基酸序列的肽，并且所述对于标准化学疗法特异的药物选自顺铂和5-FU。
16.权利要求14的药物组合，其中构成所述药物组合的一部分的所述试剂和所述药物在同一治疗过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。
17.用于预防与慢性炎症相关的癌症的方法，其特征在于，增加在细胞中COMMD1蛋白的核定位。
18.权利要求17的方法，其中在细胞中COMMD1蛋白的核定位的增加通过向有此需要的个体施用具有标识为SEQ ID No.3的氨基酸序列的肽或包含所述肽的组合物来实现。
19.用于确定癌症患者的预后的方法，其特征在于，通过测定在所述患者的样品中COMMD1的核定位的存在或不存在，来将COMMD1用作预后标志物。
20.具有与COMM结构域结合的能力的肽，其特征在于，所述肽具有标识为SEQ ID No.3的氨基酸序列。
21.权利要求20的肽用于治疗疾病的用途，其中COMMD家族的成员牵涉所述疾病的进展。
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