BR112012030668B1 - Peptídeos, composição farmacêutica, e combinação farmacêutica - Google Patents

Abstract

AGENTE QUE AUMENTA A LOCALIZAÇÃO NUCLEAR DA PROTEÍNA COMMD1 EM UMA CÉLULA CANCEROSA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A TERAPIA DO CÂNCER, COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DO PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE COM CÂNCER E PEPTÍDEO COM A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO PARA O DOMÍNIO COMM. A presente invenção refere-se a um método para o tratamento do câncer por meio do aumento da localização nuclear da proteína COMMD1, a qual está associada com a diminuição ou bloqueio da proliferação da célula de câncer. A invenção também se refere ao uso de agentes que aumentam a localização nucelar da proteína COMMD1 na fabricação de um medicamento para a terapia do câncer. Os ditos agentes podem ser peptídeos ou proteínas, entre outros compostos. A invenção também se refere à otimização de um peptídeo, proveniente da sequência HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW e, dessa forma aumentar o efeito antitumoral do dito peptídeo.

Description

Campo da Técnica

[0001] A presente invenção se enquadra dentro do campo da bio- medicina, em particular com a terapia do câncer, ao revelar um novo alvo terapêutico para o desenvolvimento de fármacos antitumorais. Os ditos fármacos, devido à sua maior seletividade e eficácia, contribuem para a melhora nos tratamentos atuais do paciente com câncer. É descrito um método para o tratamento do câncer por meio da expressão e acumulação nuclear da proteína COMMD1. Modificações químicas introduzidas na estrutura primária do peptídeo HARIKPTFRR- LKWKYKGKFW aumentam a localização nuclear de COMMD1 e incrementam a atividade antitumoral do peptídeo in vitro e in vivo. Estado da Técnica Anterior

[0002] Apesar dos grandes avanços na terapia do câncer, existe um grande interesse no desenvolvimento de novos agentes antitumo- rais com um novo modo de ação, devido ao desenvolvimento de resistência pelas células tumorais para os atuais fármacos anticanceríge- nos. Os peptídeos estão sendo de grande interesse como novos fár- macos terapêuticos, devido ao seu papel como mediadores de importantes funções biológicas e suas propriedades intrínsecas singulares que os tornam agentes terapêuticos particularmente atrativos. Os pep- tídeos exibem uma alta atividade biológica, associada com baixa toxicidade e alta especificidade. Os benefícios devidos a essas características incluem uma elevada especificidade de união ao branco desejado, minimizam as interações fármaco-fármaco e manifestam uma menor acumulação em tecidos reduzindo o risco de complicações devido a metabólitos intermediários (Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56). Na atualidade, existem terapias anticâncer que utilizam peptídeos e/ou pequenas moléculas, com seletividade de união a uma determinada proteína alvo, que tem uma função biológica importante no desenvolvimento do câncer. Em um primeiro cenário, essas terapias podem estar destinadas a inibir determinada função de uma proteína, tal como, por exemplo: Inibidores das proteínas de estresse térmico (conhecidas como HSPs, do inglês Heal Shock Proteins) (Subbarao et al., 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); Inhibidores da tirosina quinase (Garrido et al., 2007, Rev Med Chil, 10:1327-1332) e como principal evento provocam a apoptose da célula de câncer. Na maior parte das situações, essas proteínas são desviadas no processo maligno, se forem comparadas com o tecido normal. Em um segundo cenário, o fármaco se une a uma proteína alvo que pode ou não ser desviada no processo maligno em comparação ao tecido malha normal, e neste caso são afetadas as vias de sinalização que são ativa-das no processo de malignidade, por exemplo: Inibidores da replicação do ácido desoxirribonucleico (DNA), inibidores do ajuste dos microtú- bulos e inibidores do fator transcricional NFkB. Enquanto que o primeiro cenário é altamente eficaz em determinadas malignidades hemato- poiéticas, a maioria tem uma eficácia limitada na complexidade dos tumores sólidos. Por outro lado, o segundo cenário inclui alguns dos mais eficazes e ainda mais tóxicos fármacos da farmacopeia oncológica. Por essa razão, é preciso avançar na busca de novos fármacos que sejam cada vez mais seletivos e eficazes, minimizando a sua toxicidade. Neste sentido, a identificação de novos alvos terapêuticos e a compreensão de seu papel no desenvolvimento do câncer irá ajudar a identificar novos mecanismos de resistência a fármacos e irá facilitar o desenho de novos medicamentos que retenham uma maior atividade e possam ser combinados com aqueles já existentes, diminuindo a toxicidade dos mesmos e aumentando a qualidade de vida do paciente com câncer. A proteína COMMD1, previamente conhecida como MURR1 (van de Sluis et al., 2002, Human Molecular Genetic, 11:165173) pertence a uma nova família de proteínas, conhecidas por suas siglas COMMD (do inglês Copper Metabolism gene MURR1 Domain, abreviado por COMMD). As dez proteínas membros da família são altamente conservadas em organismos pluricelulares e expressas de maneira onipresente, mas as funções biológicas da maioria de seus membros são desconhecidas. A principal característica dessa família é a presença do domínio COMM (do inglês Copper Metabolism Murr1 Domain), conservado e único, compreendido entre os resíduos de aminoácidos 110-190 do extremo C-terminal (Burstein et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280:22222-22232). A COMMD1 foi implicada em diversos processos biológicos tais como: controle do me-tabolismo do cobre (Tao et al., 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596); regulação do transporte intracelular de sódio (Bia- sio et al., 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434); inibição do fator trascricional NFkB (Maine et al., 2007, The EMBO Journal, 26:436-447); inibição da expressão de genes regulados pelo fator induzido por hipoxia HIF-1a (van de Sluis et al., 2007, Molecular and Cellular Biology, 27:4142-4156).

[0003] A COMMD1 apresenta uma interação física com a subuni- dade Re1A(p65) do fator transcricional NFkB, com a subunidade catalítica-alfa do fator HIF-1a, e com Delta ENaC nos canais epiteliais de sódio. Em todos os casos essa interação conduz à degradação dessas proteínas "clientes" através de um mecanismo que envolve a onipresença e a degradação via proteasoma. Foi demonstrado que o domínio COMM está envolvido nas interações proteína-proteína, tanto para proteínas "clientes" de COMMD1 quanto para interações entre os membros da família. Existe a proposta de estrutura tridimensional para a região do extremo N-terminal de COMMD1, mas não existe ainda uma estrutura terciária para o domínio COMM (Sommerhalter et al., 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715- 721).

[0004] A expressão basal de COMMD1 é controlada na célula por meio de um processo de onipresença e degradação proteasomal, através de uma série de resíduos de leucina, com a localização no domínio COMM (Maine et al., 2009, Biochemical Journal, 417:601609). Recentemente, foi descrito que a COMMD1 apresenta um mecanismo constitutivo de transporte citoplasma-núcleo através de sinais de exportação nuclear (do inglês Nuclear Export Signals, abreviado como NES) que também fica localizada em seu domínio COMM. Foi relatado que uma quebra nas sequências de leucina e/ou agentes que inibem a degradação proteasomal produz um aumento da expressão de COMMD1 na célula. Além disso, a quebra das sequências NES em COMMD1 incrementam a repressão da atividade transcricional dos fatores NFkB e HIF-1α (Muller et al., 2009, Traffic, 10:514-527).

[0005] A célula neoplásica desviada superexpressa diferentes pro teínas antiapoptóticas tais como, por exemplo, a proteína inibidora da apoptose XIAP e a proteína clusterina (CLU), a qual acelera a progressão do câncer da próstata a andrógino independente. Ambas as proteínas favorecem a onipresença e degradação proteasomal de COMMD1, facilitando a ativação de NFkB e a sobrevivência da célula tumoral. Foi relatado que os inibidores de proteasoma tais como, por exemplo, o MG 132 (Shirley et al., 2005, Neoplasia, 7: 11 04-1111; Zhou et al., 2009, Cancer Research, 21 :333-339), apresentam um efeito antitumoral por inibir o mecanismo de onipresença e degradação proteasomal. Compostos que se unem ao XIAP induzem a apoptose, por bloquearem o efeito inibidor dessa proteína sobre a ativação de caspasa-3 e caspasa-9 (Vogler et al., Cancer Research, 2009, 69:2425-2434). É proposto que o ácido ribonucleico (ARN) de interferência (ARNi) projetado para inibir a função de CLU tem um efeito anti- tumoral, por estabilizar um inibidor citoplasmático do fator NFkB co- nhecido como I-KB (Zoubeidi et al., 2010, Molecular Cancer Research, 8: 19-30).

[0006] No pedido de patente internacional WO 07/095867, a es sência da invenção está relacionada com peptídeos provenientes da região 32-51 da proteína LALF (do inglês, Limulus anti- lipopolisaccharide factor), naqueles em que foram realizadas substituições de aminoácidos que garantem a dissociação da capacidade de união ao lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, e têm efeito antitumoral e imunomodulador. Um desses peptídeos é o renomado peptídeo L2. Além disso, em outra invenção (Pedido de patente internacional PCT/CU2008/000006) é revelada a capacidade de penetração em células dos peptídeos acima mencionados. No entanto, nas ditas invenções não é revelado nem sugerido o mecanismo de ação dos mesmos.

[0007] Na atualidade, existe um grande número de terapias dirigi das ao tratamento do câncer (quimioterapia, radioterapia, imunotera- pia, etc.), muitas das quais se encontram em fase de ensaios clínicos. No entanto, ainda persistem desvantagens associadas a essas terapias, tais como: pouca seletividade, toxicidade e desenvolvimento de resistência ao fármaco. Outro aspecto importante a ser levado em consideração neste campo é a seleção de biomarcadores, úteis como diagnóstico e/ou previsores da eficácia de um fármaco. Portanto, ainda existe a necessidade de investigar e desenvolver novas moléculas que sejam úteis no tratamento e/ou diagnóstico do câncer, e o desenho de fármacos cada vez mais seletivos e eficazes com menor toxicidade.

Explicação da Invenção

[0008] A presente invenção resolve o problema acima menciona do, ao descrever um método para o tratamento do câncer por meio do aumento da localização nuclear da proteína COMMD1. O dito incremento provoca a diminuição ou bloqueio da proliferação da célula de câncer.

[0009] Na presente invenção é revelado, pela primeira vez, que o peptídeo L2 (cuja sequência é HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID No. 1) e COMMD1 interagem em células de câncer, e que a localização nuclear de COMMD1 é associada com a morte da célula cancerígena. Desse modo, a presente invenção proporciona um uso da proteína COMMD1 na identificação de compostos com atividade antitumo- ral que facilitam a acumulação e localização nuclear de COMMD1.

[00010] Os dados apresentados na presente invenção demonstram que o peptídeo antitumoral L2 interage com COMMD1, especificamente na região compreendida entre os aminoácidos 110-190 da mesma. Além disso, o peptídeo L2 produz a acumulação nuclear de COMMD1. Do mesmo modo, pela primeira vez é relatado na presente invenção que a expressão da proteína COMMD1 contendo sequências de localização nuclear (do inglês Nuclear Localization Sequence, abreviado como NLS) é suficiente para induzir a morte da célula cancerígena. Portanto, a presente invenção demonstra o uso de COMMD1, pela primeira vez, como alvo terapêutico no tratamento do câncer.

[00011] Além disso, o peptídeo L552 (SEQ ID No. 3) é otimizado, a partir da sequência do peptídeo L2 (SEQ ID No. 1), para provocar uma acumulação de COMMD1 no núcleo, e aumentar o efeito antitumoral in vitro e in vivo do dito peptídeo. O peptídeo L552 (SEQ ID No. 3), descrito na presente invenção, que foi otimizado para facilitar a localização nuclear de COMMD1, apresenta a seguinte sequência: Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW SEQ ID No. 3

[00012] A otimização é baseada na realização de modificações químicas, por meio de substituições de aminoácidos naturais por ami- noácidos não naturais (D-aminoácidos) em posições específicas (que são representadas em letras minúsculas e em negrito na sequência incluída acima) e a proteção do extremo N-terminal por meio da aceti- lação (indicada como Ac- na sequência incluída acima). Essas modificações, realizadas na sequência do peptídeo L2 (SEQ ID No. 1), e que dão lugar ao peptídeo L552 (SEQ ID No. 3), garantem uma maior acumulação de COMMD1 no núcleo e um aumento na atividade anti- tumoral do peptídeo L552, com respeito ao peptídeo original L2. Portanto, o peptídeo L552 é uma nova classe de moléculas que interagem com COMMD1, facilitando a sua localização nuclear e produzindo a inibição da proliferação da célula de câncer.

[00013] Um outro objeto ainda da presente invenção é o uso de agentes que incrementam a localização nuclear da proteína COMMD1 na fabricação de um medicamento para a terapia do câncer. Entre os agentes ou compostos que facilitam a acumulação nuclear de COMMD1 podem ser incluídos, por exemplo: proteínas (incluindo anticorpos), muteínas, peptídeos, polinucleotídeos, aptâmeros, ácidos nu- cleicos, e pequenas moléculas orgânicas. Os ditos compostos podem ser isolados de fontes naturais, elaborados de forma sintética ou re- combinante, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma realização particular, o agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 é o peptídeo L552 (SEQ ID No. 3). No contexto da presente invenção, têm o mesmo significado aumentar ou incrementar a localização nuclear de COMMD1 e acumular a proteína COMMD1 no núcleo da célula. Em outra realização particular, o agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 pode ser do tipo ácido nucleico, tal como um vetor de expressão em células de mamíferos que contém uma sequência de DNA que codifica para a proteína COMMD1 contendo NLS. Esse tipo de vetor pode ser empregado como terapia de genes.

[00014] Além disso, faz parte da invenção uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer que compreende um agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1. Em uma reali- zação da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz do agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 (determinada por sua concentração inibidora 50 (CI50)) e excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. A composição pode ser administrada por via parenteral, ou por via tópica.

[00015] A administração de uma composição farmacêutica que compreende um agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 se constitui em um método para o tratamento ou a prevenção de um tumor sólido em um indivíduo, em que o método compreende a administração do agente que facilita a localização nuclear de COMMD1 em uma quantidade eficaz, para diminuir ou bloquear o crescimento da célula tumoral.

[00016] Em uma realização da invenção, o agente que incrementa a localização nuclear da proteína COMMD1 pode ser administrado a pacientes com leucemias, especificamente a leucemia mielocítica, bloqueando a proliferação da célula de câncer, inclusive na presença de estímulos inflamatórios.

[00017] Na presente invenção é demonstrado que o peptídeo L552 pode ser empregado em combinação com a quimioterapia padrão para produzir um efeito sinérgico e reduzir a dose dos citostáticos tais como, por exemplo, cisplatina e 5-Fluorouracila (5-FU).

[00018] Portanto, ainda um outro objeto da presente invenção é uma combinação farmacêutica para o tratamento do câncer que compreende um ou vários agentes que incrementam a localização nuclear da proteína COMMD1, e um ou vários fármacos específicos para a quimioterapia padrão do câncer. Em uma materialização da invenção, o dito agente é o peptídeo L552 e o fármaco específico para a quimioterapia padrão é selecionado entre cisplatina e 5-FU. Na dita combinação farmacêutica os agentes e fármacos que fazem parte da mesma podem ser administrados de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo tratamento.

[00019] Por outro lado, a relação entre a inflamação e o câncer é atualmente um fato aceito. Na atualidade, é catalogado o microambi- ente inflamatório como um traço do tumor, que é classificado dentro das seis características mais importantes do câncer, descritas por Hanahan e Weinbergs (Perwez et al., 2007, Int J Cancer, 121 :2373- 2380).

[00020] Os dados apresentados na presente invenção indicam que o peptídeo L552 é eficaz no bloqueio do crescimento da célula de câncer na presença de um estímulo inflamatório. Da mesma maneira, a expressão da proteína GFP-NCOMMD1 que contém NLS facilita o mesmo efeito na célula de câncer. Mais especificamente, os resultados demonstram que o peptídeo L552 facilita a morte da célula de câncer na presença de estímulos inflamatórios tais como o LPS e o fator de necrose tumoral (do inglês Tumor Necrose Factor α, abreviado como TNF-α). Da mesma forma, os dados experimentais in vivo de-monstram a eficácia do peptídeo em um modelo de murino de tumor do cólon, no qual ratos foram estimulados com um estímulo inflamatório por injeção de LPS.

[00021] É por isso que a invenção também provê um método para a inibição do desenvolvimento de tumores associados à inflamação e sua metástase, o qual compreende a administração do peptídeo L552 a um indivíduo que necessita do mesmo. Dentro dos tumores associados à inflamação e sua metástase encontram-se, por exemplo, os seguintes tipos de câncer: coloretal, esôfago, pulmão, próstata, mama, pâncreas e fígado.

[00022] Do mesmo modo, a administração do peptídeo L552 pode ser empregada, de maneira profilática, para prevenir o desenvolvimento de câncer associado à inflamação crônica tal como, por exemplo, na enfermidade de Crohn, na colite ulcerativa, na pancreatite, na cirrose, etc. Portanto, ainda um outro objeto da presente invenção é um método para a prevenção do câncer associado à inflamação crônica que é caracterizado por compreender a administração do peptídeo L552 ou de uma composição que compreende o dito peptídeo a um indivíduo que necessita do mesmo.

[00023] Quanto à dose e ao esquema de tratamento a seguir com as composições que compreendem o peptídeo L552, como agente que incrementa a localização nuclear de COMMD1, um elemento versado na técnica pode facilmente determinar a dose e o esquema de tratamento (profilático ou terapêutico). As quantidades eficazes podem variar dependendo da potência relativa das composições individuais, e pode ser calculada com base no peso molecular do peptídeo e em CI50 in vitro ou em estudos animais. Por exemplo, quando se tem o peso molecular do composto (estrutura química) e uma dose experimental eficaz (CI50) é possível calcular rotineiramente uma dose em mg/Kg do peso. Em geral as doses são de 0,2-4 mg/Kg do peso. O peptídeo ou a composição que contém o mesmo pode ser administrada uma vez ou várias vezes, semanalmente ou ainda por vários me-ses.

[00024] A invenção também se refere ao uso de COMMD1 como novo marcador prognóstico para o paciente com câncer, por meio da determinação da presença ou ausência de localização nuclear de COMMD1 em uma amostra.

[00025] Similarmente, o peptídeo L552 proporciona um agente ativo para o tratamento de enfermidades onde as proteínas COMMD têm um papel ou intervêm na progressão da enfermidade. Isto é possível, por exemplo, nas enfermidades em que a quantidade de algum membro da família COMMD é aumentada ou diminuída e/ou é aumentada ou diminuída a sua atividade, e isto causa a enfermidade. A capacida- de do peptídeo L552 de se unir ao domínio COMM, compreendido entre os resíduos de aminoácidos 110-190 do extremo C-terminal das proteínas COMMD, sustenta essa atividade terapêutica do mesmo.

Breve Descrição das Figuras

[00026] Figura 1. Ilustra a interação física entre o peptídeo L2 e a proteína COMMD1 utilizando a técnica de dois híbridos de levedura. Como controles negativos foi utilizado o emparelhamento da cepa de levedura AH109 transformada com o vetor vazio pGBKT7 e cada construção dos fragmentos de COMMD1 transformados na cepa Y187. Para a identificação da interação foi realizado o emparelhamento da cepa AH109 transformada com o vetor que contém a sequência de L2 e cada construção dos fragmentos de COMMD1 transformada na cepa Y187. Como controle positivo foi utilizado o emparelhamento pCL 1 que contém o fator de transcrição GAL4. Tal como se observa, a interação ocorre com os plasmídios que contêm a sequência completa do gene para COMMD1 e a construção que contém os aminoácidos 110190 da proteína COMMD1.

[00027] Figura 2. (A) Ilustra a validação da interação do peptídeo L2 com COMMD1 pela técnica de imunoprecipitação (pulldown) em células SW948. No experimento são adicionados 100 μg de proteínas totais (PT) e a proteína COMMD1 recombinante obtida em Escherichia coli (COMMD1 r), PM (patrão de peso molecular). (B) Ilustra a localização subcelular de COMMD1 em células SW948 tratadas com o pep- tídeo L2. Expressão de COMMD1 em núcleo (N), expressão de COMMD1 em citoplasma (C), células não tratadas (NT). Controle por Beta Actina da fração citoplasmática, controle por hnRPN da fração nuclear.

[00028] Figura 3. (A) Ilustra a maior acumulação nuclear de COMMD1 pelo peptídeo otimizado L552. (B) É mostrada a interação entre L552 e a proteína COMMD1 em diferentes linhagens de tumores, em experimentos de imunoprecipitação (pulldown). Não é detectada nenhuma interação com a proteína cullina7 (CUL7). É mostrada a presença da Beta Actina no extrato de proteínas totais nas diferentes linhagens celulares.

[00029] Figura 4. Efeito antiproliferativo dos peptídeos em células tumorais de diferentes origens histológicas, LΦ (linfócitos humanos isolados de sangue periférico).

[00030] Figura 5. Efeito antitumoral do peptídeo L552 no modelo de tumor TC-1. (A) São mostradas as curvas de inibição do crescimento da massa tumoral. (B) É mostrada a porcentagem acumulativa de so- brevida dos diferentes grupos experimentais.

[00031] Figura 6. Ilustra que a expressão da proteína COMMD1 contendo sequências de localização nuclear é suficiente para induzir a morte celular. É mostrada a porcentagem de células não viáveis marcadas com brometo de etídio às 72 horas, como resultado da transfec- ção das construções que contêm a proteína verde fluorescente (do inglês Green Fluorescenf Profein, abreviado como GFP) como controle negativo, GFP-COMMD1 e a construção de localização nuclear GFP- N-COMMD1.

[00032] Figura 7. (A) É mostrada a quimiossensibilidade a 5-FU em células de carcinoma do cólon HT-29 transfectadas com a construção GFP-NCOMMD1. São indicados os valores de CI50. (B) É ilustrado o efeito de um ambiente inflamatório por adição de LPS e TNF-a em relação a CI50.

[00033] Figura 8. Ilustra o efeito do peptídeo L552 sobre a proliferação da célula de câncer na presença de diferentes estímulos inflamatórios. Determinação de CI50 em células de leucemia mielocítica humana (THP-1)(A) e carcinoma de cólon de murino (CT-26) (B), tratadas com LPS e TNF-a.

[00034] Figura 9. Efeito antitumoral do peptídeo L552 em um mode- lo de câncer de cólon em ratos BALB/c submetidos a um estímulo inflamatório por injeção de LPS. (A) É mostrada a porcentagem acumu- lativa de sobrevida dos diferentes grupos experimentais. (B) É mostrada a média do volume da massa tumoral para cada grupo experimental. Exposição detalhada de modos de realização / Exemplos de realização

Exemplo 1. Interação física entre o peptídeo L2 e COMMD1.

[00035] Para identificar as interações peptídeo antitumoral L2- proteínas foi utilizado o sistema de dois híbridos de levedura. Para a clonagem das sequências correspondentes ao peptídeo foram projetados os seguintes oligonucleotídeos: L2F: CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGA- AGTACAAGG GTAAGTTCTGGTAA L2R: GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTT- CTGAAGGTTGGCTT GATTCTAGCGTG que correspondem à sequência peptídica L2: HARIKPTFRRLKW- KYKGKFW

[00036] Para a clonagem dessas sequências no vetor pGBKT7 Ncol- BamHI, nos extremos dos oligonucleotídeos foram adicionadas sequências complementares a esses sítios. O plasmídeo recombinan- te pGBKL2-1, que contém a sequência do peptídeo L2 foi verificado por análise de restrição e sequência. O plasmídeo foi transformado na cepa de levedura AH109, pelo método de acetato de lítio e semeado no meio SD-Trp. Foi verificado que não era capaz de se autoativar ao ser semeado em placas de SD-Trp-His. Para a seleção das interações foi utilizada uma biblioteca proveniente de DNA complementar de fíga- do humano transformada na cepa Y187. Para a formação dos diploi- des e a seleção das interações, 5 x 108 células de AH109 que contêm o plasmídeo pGBKL2-1 foram crescidas com 5 x 108 células de Y187 que contêm a biblioteca de DNA de fígado humano, durante 4 horas no meio sólido YPDA a 30°C. Às placas do meio YPDA foram adicionados 10 mL de água estéril em sua superfície, e as células foram ressuspendidas cuidadosamente com espátulas e transferidas a 15 placas do meio mínimo SD-Trp-Leu-His-Ade e desenvolvidas a 30°C por 7 dias. As 74 colônias resultantes foram transferidas ao meio líquido SD-Trp-Leu em placas de 96 poços profundas. Depois de observar o crescimento no meio líquido, foi realizada a purificação do DNA de leveduras. Cada um dos DNAs foi transformado individualmente na cepa de E. coli DH10B, e seus DNAs purificados e conservados a - 20°C. Foi realizada a transformação de cada um dos clones individuais na cepa de levedura Y187 e foi verificada a interação por meio de de- semparelhamento com a cepa de AH109 transformada com os plas- mídeos pGBKT7 e pGBKL2-1. O DNA foi sequenciado dos clones positivos. Uma análise das sequências pelo programa BLAST (Altschul et al., 1990. J Mol Biol, 215:403-410) revelou que um dos clones (L2-21) corresponde com a sequência do gene que codifica para os aminoáci- dos 6-190 da proteína COMMD1, e que este clone é capaz de interagir com o plasmídeo que contém a sequência do peptídeo L-2. Para iden-tificar especificamente a região da proteína COMMD1 responsável pela interação foram feitas deleções à construção do plasmídeo pGBKL2-1, sendo gerados os clones pGBKL2 (6-110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190). Tal como pode ser apreciado na Figura 1, a interação se mantém apenas no plasmídeo pGBKL2 (110-190) que contém o domínio COMM responsável pelas interações descritas para as proteínas da família COMMD. Esse resultado ilustra que o peptídeo L2 é unido especificamente à região compreendida en- tre os aminoácidos 110-190.

Exemplo 2. Experimentos de imunoprecipitação com o peptídeo L2 e acumulação nuclear de COMMD1.

[00037] Os experimentos foram divididos em dois blocos: (A) O peptídeo sintético L2 (SEQ ID No. 1), sintetizado ao usar um procedimento em fase sólida, foi biotinilado e utilizado como "ceva" unida a uma resina de estreptavidina sefarosa. Como "presa" foi utilizado um extrato de proteínas da linhagem tumoral SW948 (carcinoma de cólon humano). Esses experimentos são conhecidos como "pulldown" (do inglês). O extrato de proteína foi obtido a partir de 2 x 107 células utilizando um tampão de extração (Tritón X-100 0,5%; 25 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 10% glicerol; 1 mM Ditiotreitol (DTT), e um inibidor de proteases. O peptídeo biotinilado (300 μg) foi incubado com 50 μL de resina estreptavidina sefarosa (G Healthcare), durante uma hora e foram realizadas lavagens com tampão de fosfato salino (PBS 1X) mais DTT 1 mM. Em seguida, foram incubados 500 μg de proteínas totais com 50 μL de resina contendo o peptídeo biotinilado, à temperatura ambiente durante 5 horas. Em seguida, a resina foi lavada extensivamente com PBS 1X e DTT 1 mM. As proteínas que permanecem unidas à resina são aquelas que interagem com o peptídeo, e são ressuspendidas em 25 μL de tampão para eletroforese (Tris HCI 62,5 mM; pH 6,9; 0,1 M DTT, Dodecilosul- fato de sódio (SDS) 20%, glicerol 10% e bromofenol azul 0,01%). Para detectar a proteína de interesse foi realizada uma eletroforese em gel de acrilamida (7,5%), seguida pela imunodetecção por "Western blot". Para detectar a proteína COMMD1, foi utilizado um anticorpo monoclonal anti-COMMD1 (Sigma, clone 2A12).

[00038] Foi utilizado um extrato de proteínas totais (100 μg) e a proteína recombinante COMMD1 obtida em E. coli. Os resultados apresentados na Figura 2A demonstram que o peptídeo L2 concentra a proteína COMMD1 no experimento de "pulldown" quando comparado com o extrato de proteínas totais. Isto é indicativo da interação entre L2 e COMMD1. (B) As células SW948 (3 x 106 células) foram incubadas durante 5 horas a 37°C e 5% de CO2 com o peptídeo L2 (50 μM). Em seguida, foi realizado o fracionamento celular das proteínas citosólicas e nucleares, tal como relatado (Vancurova et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276: 19746-19752). A detecção de COMMD1 foi feita por "Western blot", utilizando um anticorpo anti-COMMD1. A Figura 2B demonstra a localização nuclear de COMMD1 em células SW948 tratadas com o peptídeo L2. Para controlar o fracionamento celular foi utilizada a Beta Actina como controle da fração citoplasmática e a ri- bonucleoproteína humana (hnRNP) como controle da fração nuclear.

Exemplo 3. Otimização do peptídeo L552 para a acumulação nuclear de COMMD1.

[00039] Tendo como premissa que o peptídeo L2 e a proteína COMMD1 interagem e isto se associa com a localização nuclear de COMMD1, foram projetados diferentes peptídeos a partir de L2 (SEQ ID No. 1), com o objetivo de potencializar a acumulação nuclear de COMM01 nas variantes peptídicas.

[00040] Os peptídeos da invenção foram sintetizados ao usar um procedimento em fase sólida. O peptídeo cru é extraído com uma solução de ácido acético a 30%, liofilizado e em seguira é purificado por meio de cromatografia de fase reversa RP-HPLC. A massa molecular dos peptídeos purificados é verificada por meio de espectrometria de massa. O preparado resultante é não antigênico, não pirogênico e farmaceuticamente aceitável para a sua administração em animais e humanos. As substituições foram realizadas pontualmente, ao introduzir aminoácidos de configuração D em posições pontuais na sequência do peptídeo original L2, cuja sequência é HARIKPTFRRLKW- KYKGKFW (SEQ ID No. 1), tal como é mostrado na Tabela 1. Em um caso, também foi bloqueado o extremo N-terminal por meio de acetila- ção. Tabela 1. Sequência dos peptídeos utilizados na invenção

[00041] Neste experimento o objetivo consistia em identificar um peptídeo que deve produzir a maior acumulação nuclear de COMM01. As células SW948 (3 x 106 células) foram incubadas durante 5 horas a 37°C e 5% de CO2 com os peptídeos L2, L551, L552, L553 E L554 (50 μM). Em seguida, foi realizado o fracionamento celular das proteínas citosólicas e nucleares tal como relatado por Vancurova et al., tal como no Exemplo 2. A detecção de COMM01 foi realizada por meio de "Western blot", ao utilizar um anticorpo anti-COMM01. A Figura 3A demonstra a localização nuclear de COMM01 em células SW948 tratadas com os peptídeos acima mencionados. Os resultados indicam que o peptídeo L552 produziu a maior acumulação em núcleo de COMMD1. Além disso, é demonstrada a interação entre o peptídeo L552 e COMMD1 por meio de experimentos de imunodetecção (pulldown) em diferentes linhagens de tumor, Figura 3B. Com esses experimentos é validada a interação entre o peptídeo L552 e a proteína COMMD1.

[00042] Do mesmo modo, a interação está relacionada com a facili- tação da acumulação nuclear de COMMD1.

Exemplo 4. Ilustra o incremento do efeito antiproliferativo do peptídeo L552 em linhagens celulares de tumor.

[00043] Para este ensaio as células tumorais de origem humana H- 82 (células pequenas de câncer de pulmão), H-125 (células não pequenas de câncer de pulmão), MCF-7 (adenocarcinoma da mama), MDA-MB231 (adenocarcinoma da mama positivo para o receptor do fator de crescimento epidérmico), LS174T (adenocarcinoma coloretal) e HT-29 (adenocarcinoma coloretal resistente à quimioterapia), foram semeadas em placas de 96 poços (Custar) a uma densidade de 1 x 104 células/mL no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, os peptídeos foram adicionados ao meio de cultura em um traço de dose entre 9 μM e 300 μM. A incubação foi realizada em um intervalo de 48 horas na presença de CO2 a 5% e ao término da mesma foi revelada com 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT) (Gray MJ et al., 2008, Natl Cancer Inst, 100: 109-20). Finalmente, foi feita a leitura da placa a uma absorbância de 492 NM. Cada ponto foi realizado em duplicata, e os experimentos foram levados a cabo pelo menos duas vezes de maneira independente. Os valores de CI50 foram obtidos a partir das respectivas curvas de proliferação celular. Os resultados são apresentados na Figura 4. Os resultados demonstram que a acetilação no extremo N-terminal e a substituição por D-aminoácidos, em posições específicas, garantem um incremento no efeito antiproliferativo do peptídeo L552. No entanto, nenhum efeito foi observado em linfócitos humanos isolados de sangue periférico (LΦ humanos). Esse resultado demonstra que o peptídeo L552, objeto da presente invenção, incrementa o seu efeito citotóxico seletivo sobre células tumorais sem provocar aumento da toxicidade em células sadias. Os resultados apresentados demonstram que o peptídeo L552 foi otimizado para interagir com a proteína COMMD1, facilitar a sua maior acumulação em núcleo e aumentar o efeito antiproliferativo seletivo sobre as células de câncer.

Exemplo 5. Efeito antitumoral do peptídeo L552 em um modelo de mu- rino de tumor TC-1.

[00044] Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BU6 fêmeas e com idades entre 8 e 10 semanas de vida (n = 10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, foram usadas as células TC-1 derivadas de células epiteliais do pulmão de C57BU6 malignizadas, as quais foram resuspensas em solução salina (PBS). Uma quantidade de 5 x 104 células em um volume de 200 μL foi inoculada nos ratos por via subcutânea na pata posterior direita. Foram administradas 5 doses dos peptídeos (L2, L552 e L551) com intervalos de 2 dias, por via subcutânea no flanco direito, uma vez que os tumores atingiram 100 mm3 de volume. Nesse ensaio foi avaliada uma dose de 0,2 mg de peptídeo por Kg de peso (4 μg/rato). Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral dos peptídeos de interesse foi a sobrevida dos animais e a massa tumoral, tal como se pode observar na Figura 5A e na Figura 5B. O peptídeo L552 foi mais eficaz quanto à capacidade de inibir a progressão do tumor e aumentar a so- brevida dos ratos com respeito ao peptídeo L2 e L551. Estes resultados evidenciam que as modificações introduzidas no peptídeo da presente invenção (L552) aumentam a eficácia antitumoral em um modelo de tumor sólido. A análise estatística para determinar diferenças significativas entre os grupos foi feita pelo método de Lag Rank. Os resultados evidenciam que o peptídeo L552 aumenta significativamente (t < 0,05) a sobrevida dos animais em comparação aos outros peptídeos ensaiados. Esses resultados demonstram que substituições por D- aminoácidos, em posições específicas, e bloqueio do extremo N- terminal por acetilação, incrementam significativamente a capacidade antitumoral do peptídeo.

Exemplo 6. Ilustra que a expressão da proteína COMMD1 contendo sequências de localização nuclear é suficiente para induzir a morte da célula.

[00045] Para confirmar o papel da localização nuclear de COMM01 na inibição da proliferação celular, foram gerados os plasmídios re- combinantes pGFP-COMM01, que expressam COMMD1 fundida a GFP, e pGFP-NCOMMD1, que contém adicionalmente a sequência peptídica de localização nuclear PKKKRKV. Para a clonagem de pGFP-COMMD1 foi realizada a reação em cadeia de Polimerase ao usar os oligonucleotídeos: CF: TTCTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT

[00046] Para a amplificação do gene que codifica para COMMD1 com a introdução do NLS foram utilizados os oligonucleotídeos: NF: TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGG- CAAACCC CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTT AGGCTGGCTGATCAGTGT.

[00047] Os clones recombinantes foram analisados por restrição e sequência de DNA. Ambas as construções e o controle pEGFP foram transfectados de forma independente nas linhagens celulares HT-29 E HEK293 de forma transiente utilizando Polietilenimina (Sigma, USA) (Boussif, O et al., 1995, Proc Natl Acad Sci, 92: 7297-7301), em placas de 24 poços em duplicata. Às 72 horas um dos poços foi utilizado para avaliar a expressão das proteínas recombinantes ao utilizar um microscópio de fluorescência Axiovert 40 (Zeiss, Alemanha) e uma objetiva APlan 10X. Aos poços restantes foi eliminado o meio de cultura e foi realizado uma marcação com uma mescla de Laranja de Acridina/Brometo de Etídio (AO/BE) a uma concentração de 5 μg/mL em PBS, para a identificação da apoptose (Rible D, et al., 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15), e foram observadas no microscópio Axiovert 40 e na objetiva APlan 40X.

[00048] Com esse tipo de marcação, AO atravessa a membrana das células vivas e tinge de verde os núcleos e de laranja o citoplasma, enquanto que B só penetra as células com perda da integridade das membranas e tinge o DNA nuclear de vermelho. A fluorescência de BE é dominante em relação à fluorescência de AO. A marcaçao de AO/EB mostra as células viáveis marcadas com AO com seus núcleos verdes e o citoplasma laranja nas transfecções com GFP e GFP-COMMD1. Somente no caso das células transfectadas com a construção GFP-NCOMMD1 foram observadas as células com o núcleo marcado por B, o que indica que se encontram em uma fase de apoptose tardia. A Figura 6 mostra o gráfico da porcentagem de células com o núcleo marcado de vermelho de três campos independentes por condição experimental. São representados os valores e as separações padrão. Esses resultados demonstram que a introdução de NLS na proteína COMMD1 é suficiente para a indução da apoptose nas linhagens celulares avaliadas. Do mesmo modo, esses resultados demonstram o uso de COMMD1 como novo alvo terapêutico para fármacos antitumorais, através de compostos que facilitam a sua acumulação e localização nuclear. Desta maneira é demonstrado que a otimização do peptídeo L2, que dá lugar ao peptídeo L552, quanto à acumulação nuclear de COMMD1, está correlacionada com um aumento do efeito antitumoral. Exemplo 7. Ilustra o efeito da localização nuclear da proteína COMMD1 na sensibilidade ao citostático 5-FU e a estímulos inflamatórios na célula HT-29. (A) A linhagem celular HT-29 transfectada temporalmente com as construções acima descritas foram semeadas em placas de 96 poços (Custar) a uma densidade de 1 x 104 células/mL no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, o citostático 5-FU foi adicionado ao meio de cultura em um traço de dose entre 0,025 μM e 2.500 μM, em diluições seriais de 1:10. A incubação foi realizada por um intervalo de 48 horas na presença de CO2 a 5% e ao término da mesma foi revelada com MTT. Finalmente, foi feita a leitura da placa a uma absorbância de 492 NM. Cada ponto foi realizado em duplicata, e os experimentos foram levados a cabo pelo menos duas vezes de maneira independente. Os valores de CI50 foram obtidos a partir das respectivas curvas de proliferação celular. Os resultados apresentados na Figura 7A demonstram que a expressão da proteína COMMD1 com NLS (GFP-NCOMMD1) provoca uma maior sensibilidade da célula de câncer à ação do citostático 5-FU. É demonstrado neste exemplo por uma redução em CI50 com respeito às células que expressam GFP ou GFP-COMMD1. Estes resultados também demonstram o uso de COMMD1 como novo alvo terapêutico para fármacos antitumorais. Além disso, é demonstrado que a localização nuclear de COMMD1 induz quimiossensibilidade aos citostáticos convencionais. (B) A linhagem celular HT-29 transfectada temporalmente com a construção GFP-NCOMMD1 foi submetida a diferentes estímulos inflamatórios tais como, por exemplo, LPS (40 μg/mL) e TNF-a (20 ng/mL) durante 30 minutos. Em seguida CI50 foi avaliado tal como explicado no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Figura 78.

Exemplo 8. Ilustra o efeito do peptídeo L552 sobre a proliferação celular da célula de câncer submetida a um estimulo inflamatório.

[00049] Para este ensaio, células de leucemia mielocítica aguda de origem humana (THP-1) e células de carcinoma de cólon de murino (CT-26) foram semeadas em placas de 96 poços (Custar) a uma densidade de 1 x 104 células/mL no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). As células foram mantidas durante 24 horas a 37°C e com 5% de CO2. Passado esse tempo, foi adicionado LPS (40 μg/mL) ou TNF-a (20 ng/mL) durante 30 minutos. A Figura 8 apresenta o cálculo de CI50 das linhagens celulares THP-1 e CT-26 na presença ou não dos estímulos acima mencionados. Os resultados demonstram que o peptídeo L552 inibe a proliferação celular nas linhagens de câncer THP-1 e CT-26, na presença de diversos estímulos inflamatórios. Esse resultado demonstra que o peptídeo L552 é eficaz no bloqueio da proliferação de células de câncer submetidas a diferentes agentes inflamatórios.

Exemplo 9. Ilustra o efeito antitumoral do peptídeo L552 em um modelo de câncer de cólon em ratos BALB/c submetidos a um estímulo inflamatório por injeção com LPS.

[00050] Nestes ensaios foram utilizados ratos BALB/c fêmeas com idades entre 8 e 10 semanas de vida (n = 10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, foram usadas as células CT-26 isoladas de um carcinoma de cólon em ratos BALB/c. Uma quantidade de 7 x 104 células, ressuspendidas em um volume de 200 μL de PBS 1 X, foram inoculadas nos ratos por via subcutânea intra-axilar. Passados 11 dias, os animais receberam uma injeção de 10 μL de LPS/rato (serotipo 055:B5, Sigma) em PBS 1X e administrada por via intraperitoneal. Uma vez que os tumores atingiram 100 mm3 de volume, um grupo recebeu 5 doses de peptídeo L552 (0,2 mg/Kg do peso) em dias alternados, e outro grupo recebeu 5-FU em doses de 20 mg/Kg do peso. Os parâmetros de interesse avaliados neste experimento foram a sobrevida dos animais e o aumento do volume da massa tumoral.

[00051] Os resultados apresentados na Figura 9 evidenciam a eficácia do peptídeo L552 em um modelo de carcinoma de cólon no qual foi adicionado um cenário inflamatório, por injeção de LPS. (A) Os resultados evidenciam que o peptídeo L552 foi mais eficaz no aumento da sobrevida (*p<0,05) dos animais em comparação com o grupo tratado com 5-FU, quando ao desenvolvimento do tumor é adicionado um cenário inflamatório. A análise estatística para determinar diferenças significativas entre os grupos foi feita pelo método de Log Rank. (B) O peptídeo L552 foi mais eficaz quanto à capacidade de inibir a progressão do tumor. O resultado apresentado neste exemplo demonstra que o peptídeo L552 é eficaz no tratamento do câncer associado à inflamação.

Exemplo 10. Ilustra o efeito sinérgico da combinação do peptídeo L552 e da quimioterapia padrão.

[00052] Para este ensaio as células tumorais HT-29 e H-125 foram semeadas em placas de 96 poços (Custar) a uma densidade de 1 x 104 células/mL no meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao final de 24 horas, o peptídeo foi adicionado ao meio de cultura em um traço de dose entre 9 μM E 300 μM e os citostáticos em um traço de dose que abrangeu diluições seriais de 1:10 por cima e por baixo de seu CI50 relatada para cada linhagem celular. A incubação foi realizada em um intervalo de 48 horas na presença de CO2 a 5% e ao término da mesma foi revelada com MTT. O efeito do tratamento concomitante peptídeo-citostático foi analisado de acordo com o programa computadorizado CalcuSyn para o estudo de combinações de fármacos (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacological Reviews, 58: 621681). Os dados apresentados na Tabela 2 demonstram que a combinação peptídeo-citostático permite reduzir a quantidade destes últimos, dado pelos valores mostrados no Índice de Redução (IR) do fármaco. Esses resultados indicam que o peptídeo pode ser administrado em associação com a quimioterapia padrão para proporcionar um tratamento eficaz (fração de células afetadas entre 89%-94%) com uma menor quantidade do fármaco convencional. A combinação 5-FU + peptídeo L552 permite uma redução (IR) do citostático de 20 vezes na linhagem celular HT-29. Para a combinação cisplatina + peptídeo L552 a redução do citostático é de 5 vezes na linhagem celular H-125. Esses resultados indicam que o peptídeo pode ser administrado em combinação com o tratamento padrão para câncer do pulmão e câncer do cólon, facilitando uma redução na dose do citostático. Deste modo podem ser diminuídos os efeitos adversos associados à quimioterapia. Tabela 2. Sinergismo da terapia combinada entre o peptídeo L552 e os citostáticos 5-FU e cisplatina, para duas linhagens celulares de tumor humano.

Cl < 1 significa sinergismo; Cl = 1 significa aditividade; Cl >1 significa antagonismo.

[00053] Além disso, é mostrado o Índice de Redução (IR) do fárma- co em combinação.

Claims (9)

1. Composição para tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, que aumenta a localização nuclear da proteína COMMD1 em uma célula cancerosa, sendo que o referido peptídeo apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID No. 3.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o câncer é um tumor associado a inflamação e metástase.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o tumor associado com a inflamação e metástase está localizado no cólon, reto, esôfago, pulmão, próstata, mama, pâncreas ou fígado.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos Ac-HARIKpTFRRlKWKYKGKFW.

5. Composição farmacêutica para terapia de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende: um ou vários peptídeos, que aumentam a localização nuclear da proteína COMMD1 nas células cancerosas, e excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis Na- tartarato e trealose, sendo que o peptídeo apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 3.

6. Combinação farmacêutica para tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende: um ou vários peptídeos, como definidos na reivindicação 1, que aumentam a localização nuclear da proteína COMMD1, e fármacos específicos para quimioterapia padrão, selecionados dentre cisplatina e 5-FU.

7. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que: o peptídeo, que aumenta a localização nuclear da proteína COMMD1, apresenta uma sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3, e o fármaco específico para quimioterapia padrão é selecionado dentre cisplatina e 5-FU.

8. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os peptídeos e fármacos, específicos para quimioterapia padrão selecionados dentre cisplatina e 5-FU, que fazem parte da combinação, são administrados simultanea, separada ou sequencialmente durante o curso do mesmo tratamento.

9. Peptídeo com capacidade de ligação ao domínio COMM, caracterizado pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.

Images